Біологія клітини в культурі
1) Freshney RI. Culture of animal cells. “Wiley-Liss”, New York, 2005
2) Фрешни Р. Я. Культура животных клеток. Бином. 2010
3) Фрешни Р. Культура животных клеток. Методы. М. Мир. 1989
4) Freshney RI. Basic Principles of Cell Culture, in Culture of Cells for Tissue Ingeneering, 2006
5) Basic cell culture. A practical approach. Ed. by J. M. Davis. Oxford University Press, 1994
6) Пинаев Г. П. Методы культивирования клеток. Л. Наука. 1988
7) Камерон И. Л., Пул Т. Б. Трансформированная клетка. К. Наукова думка. 1985
8) Биология клетки в культуре. Под ред. А. С. Трошина. Л. Наука. 1984
9) Адамс Р. Методы культуры клеток для биохимиков. М. Мир. 1983
10) Уосли Г. Новые методы культуры животных тканей. М. Мир. 1976
11) Албертс Б. и др. Молекулярная биология клетки. М. Мир. 1994
12) Sambrook J., Russell D. W. Molecular Cloning. CSHL Press, 2001
13) Lanza R. et al. Essentials of Stem Cell Biology. Elsvier, 2006
1. Історія розвитку та головні принципи методу
культивування тваринних клітин і тканин in vitro
Суть методу полягає у забезпеченні таких умов поза організмом, за яких клітини
зберігають свої головні біологічні функції.
in vivo, in situ, in vitro (in cellulo), in silico
1885 – В. Ру (Німеччина) продемонстрував, що клітини курячого ембріона можуть
зберігати життєздатність у спеціальному сольовому розчині поза яйцем
Клітини виживали протягом кількох днів, проте не росли і не проліферували
1907 – Р. Харрісон (США) показав, що фрагменти нервової тканини ембріона жаби,
розміщенні в камері, яка містить лімфу, формують нервові відростки
Довів, що кожний аксон утворюється окремою нервовою клітиною
Клітини не лише виживали, але й росли
Клітини земноводних – не потребують інкубації при 37 0С, хороша регенерація тканин
А. Каррель (Франція/США) - Нобелівська премія 1912 за
роботи з трансплантації кровоносних судин й органів
1912 – Carrel A., On the permanent life of tissues outside
the organism, J. Exp. Med.
За дотримання асептичних умов і забезпеченні
поживними речовинами фрагменти серцевого м‘язу
зберігають здатність скорочуватись місяцями
Maтрас (flask) Карреля
(тканинна культура)
Каррель вважав, що нормальні клітини можуть безкінечно розмножуватись, зберігаючи
свої властивості – ембріональні фібробласти курчати 20 років.
Вдосконалення техніки заморожування клітин (першими заморожували сперматозоїди
для сільського господарства)
Запровадження антибіотиків.
1943 - першa постійна клітинна лінія (лінія L з нормальних фібробластів шкіри миші,
трансформованих обробкою метилхолантреном) (В. Р. Ерл (США) з співавт.)
1948 – В. Р. Ерл з співавт. вперше отримав лінію клітин з однієї окремої клітини лінії L
(L-929) (клон)
Oнкологія
1952 – Д. Гай (США) з співавт. отримав першу постійну лінію клітин людини з
карциноми шийки матки (HeLa; Henrietta Lacks).
Надзвичайна швидкість проліферації. Стандартна лінія
1967 - С. Гартлер (США) – генетичні маркери (18 клітинних ліній - всі заражені HeLa)
American Type Culture Collection (ATCC)
1100 tumor cell lines
HeLa
ATCC® Number: CCL-2™
Price: £295.00
Organism: Homo sapiens (human)
Morphology:epithelial
Growth Properties: adherent
Isolation date: 1952
Organ: cervix
Disease: adenocarcinoma
Спочатку основна галузь широкого практичного використання - вірусологія.
Перший спалах поліомієліту в США в 1894.
В 1916 в США зафіксовано 27000 випадків та 6000 смертей.
В 1952 епідемія досягнула максимуму - 57628 випадків в США
1952 – Д. Селк (США) створив першу ефективну профілактичну вакцину проти
поліомелієту (масові щеплення 1955 - 2 млн., 1961 – 80 млн.).
Це стало можливим завдяки створенню методів нарощування вірусу поліомієліту в
культурах клітин з нирок мавп (1949, Д. Eндерс, T. Веллер і Ф. Роббінс, США,
Нобелівська премія 1954)
До цього для нароблення вірусу використовували мозок хворих на поліомієліт мавп.
1957 – вакцина А. Себіна
(США)
Зараз культури клітин
використовуються
також для отримання
вакцин проти кору,
краснухи, паротиту й
вітряної віспи.
Поштовх до комерційного виробництва апаратури й середовищ для культур клітин
1955 – Х. Ігл (США) вперше систематично дослідив речовини, необхідні для
оптимального росту тваринних клітин in vitro.
Створив культуральне середовище Ігла Eagle's minimal essential medium (MEM) (використовують при додаванні сироватки)
Це середовище в модифікації Дульбекко (Dulbecco's Modified Eagle Medium, DMEM) –
до нашого часу найпоширеніше культуральне середовище
1954 – Р. Леві-Монтальчіні (р. 1909, Італія/США;
Н. пр. 1986) ізолювала протеїновий фактор, що
стимулював диференціювання нейронів в
культурі (фактор росту нервів, NGF)
Поліпептидні фактори росту – новий клас
регуляторів функцій клітин (поряд з гормонами).
1961 – Л. Хейфлік й П. Мурхед (США) довели,
що нормальні фібробласти людини в культурі
завжди гинуть після певної кількості поділів
(приблизно 52 – ліміт Хейфліка)
Явище старішання клітин в культурі
1963 – Д. Тодаро й Г. Грін (США) виявили
явище спонтанної трансформації при
пасажуванні ембріональних фібробластів миші
На початку 1960-х відбувалась розробка методів злиття соматичних клітин (віруси, ПЕГ)
1964 – Д. Літтлфілд (США), досліджуючи фібробласти, запропонував середовище HAT
(hypoxanthine, aminopterin, thymidine), що дає можливість проводити селекцію гібридів
соматичних клітин.
1965 – Г. Харріс і Д. Ваткінс (Велика Британія) створили перші міжвидові гібриди клітин
ссавців (гетерокаріони – ядра, що містять хромосоми людини і миші).
Навіть гібриди тваринних і рослинних клітин.
При культивуванні гібриди втрачають хромосоми одного з двох видів
Дослідження регуляції експресії генів, картування генів на хромосомах.
Iмунологія.
Отримання моноклональних антитіл. Терапевтичне застосування (трансплантація органів,
автоімунні захварювання, рак).
1975 – Г. Келер (ФРН) і С.
Мільштейн (Аргентина/Велика
Британія) (Н. пр. 1984) розробили
методику отримання клітинних ліній
гібридом (злиття спленоцитів
імунізованої миші, що секретують
специфічне антитіло, і клітин
мієломи (В-клітинної лімфоми) миші,
здатних до необмеженого
розмноження).
Соматичні гібриди клітин людини та
китайського хом’ячка
Humster (hamster + human)
snejana maleichenko
1965 – Р. Г. Хем (США) запропонував середовище з визначеним хімічним складом
(Ham‘s nutrient mixtures F10, F12), що давало можливість культивувати і клонувати
клітини CHO (Chinese Hamster Ovary) за відсутності сироватки.
1976 – Г. Сато (США) з співавт. розпочали серію робіт, в яких показали, що різні типи
клітин мають різні вимоги до складу хімічно детермінованих середовищ (гормони,
фактори росту).
1968 – Г. Августі-Точчо і Г. Сато (США) отримали постійну лінію нейробластоми миші,
клітини якої мали риси диференційованих нейронів (утворювали нейрити і реагували на
стимулювання електричним струмом). В 1960-х роках були отримані інші клітинні лінії,
що мали ознаки диференційованих клітин (з печінки, скелетних м‘язів)
DMEM/F12 +
A) Сироватка
B) Без добавок
C) Інсулін,
трансферрин,
прогестерон,
селен,
путресцин
Bottenstein, Sato, 1979
Клітини нейробластоми щура В104
1973 – Ф. Л. Грем (Канада) і А. ван дер Еб (Нідерланди) створили метод трансфекції –
внесення чужорідних молекул ДНК в клітини ссавців (кальцій-фосфатної преципітації).
1977 - М. Віглер і Р. Аксель (США, Н. пр. 2004 за роботи з нейробіології), вдосконаливши
цей метод, експресували очищений ген тимідинкінази (з герпесвірусу) в культурі клітин
миші, що не містили власної тимідинкінази.
Метод котрансформації – в клітини одночасно вносять ген, що кодує необхідний білок, та
селективний маркер. “Патенти Акселя” (до $100 млн. на рік Колумбійському університету
від фармацевтичних і біотехнологічних компаній в 1980-2000 рр).
Бioтехнологія - вироблення
рекомбінантних білків в клітинах
ссавців (використовуються,
зокрема, в лікуванні анемії,
гемофілії, множинного склерозу,
раку, сецево-судинних
захворювань)
Генна терапія - досягнення
посиленої чи пригніченої
експресії генів або in vitro з
подальшим введенням змінених
клітин в організм, або
безпосередньо in vivo.
Найчастіше застосовують вірусні
вектори.
1981 – М. Еванс (Велика Британія, Н. пр. 2007) і Г. Мартін (США) розробили методику
культивування плюрипотентних ембріональних стовбурових клітин з бластоцистів миші.
Можливість генетично модифікувати ембріональні стовбурові клітини призвела до появи
трансгенних та „knockout“ тварин.
„Зелена флюоресцентна миша“
E18: STAT5-/в УФ світлі (Green fluorescent
Дефекти в сигналюванні, індукованому
protein - білок медузи Aequorea
еритропоетином та гормоном росту
victoria)
Мультипотентні клітини дорослого організму.
1991 – А. Каплан (США) запропонував поняття “мезенхімні стовбурові клітини”
P. Ferretti
Нейросфери до та після диференціювання.
1992 – Б. Рейнольдс і С. Вайсс (Канада) розробили методику культивування нейрональних
стовбурових клітин з мозку дорослих мишей у вигляді нейросфер і показали, що за певних
умов ці клітини диференціюються в нейрони й астроцити
1998 – Д. Томсон (США) з співавт. ізолював ембріональні стовбурові клітини з
бластоцистів людини, отриманих в ході запліднення in vitro.
Тканинна iнженерія - методи продукування аналогів тканин in vitro з метою часткової чи
повної заміни відповідних тканин в організмі.
1981 – Створення „живого заміннику шкіри“
методами гістоподібної культури (Ю. Белл
(США) з співавт.)
Apligraf– замінник
шкіри, що містить
фібробласти й
кератиноцити (1998)
1998 – Отримання з допомогою тканинної інженерії хрящової тканини (Й. Айгнер
(Німеччина) з співавт.)
Переваги та недоліки дослідів з клітинами та тканинами in vitro
Переваги:
Вплив специфічних молекул (гормонів, факторів росту) на загальні (проліферація,
диференціювання) або спеціалізовані (синтез сечовини, проведення нервового сигналу)
клітинні процеси
1) Умови проведення досліджень (фізико-хімічні та фізіологічні) легше контролювати
in vitro.
Можливість точно регулювати концентрацію і тривалість дії досліджуваних речовин.
Зокрема, техніка перфузії.
2) Tканинні зразки завжди більш гетерогенні.
Легше характеризувати (імунобарвлення, цитологічні дослідження). Відомі
походження та історія клітинної лінії.
3) Легше отримання паралелей в експериментах, кількісна оцінка результатів.
4) Moжливість дослідження окремих типів клітин або їх взаємодії
(кокультура, кондиціоноване середовище).
Також селекція клітин за певними маркерами (селективні середовища, клонування).
5) Збереження окремих популяцій (заморожування)
6) Дешевизна. Нижчі концентрації реагентів, ніж іn vivo. Швидкий скринінг з
використанням невеликих об‘ємів середовища.
7) Етичні переваги (скринінг фармацевтичних препаратів на токсичність in ctllulo)
8) Придатність до механізації
Робот може здійснювати, наприклад, зміну середовища, збирання зразків та відбір
окремих колоній
Недоліки:
“Властивості хімічної речовини не можуть вивчатись окремо від системи, в якій ця
речовина діє. Субстанції, що впливають на властивості клітин – це одне, а лікарські
препарати, що діють на живий організм – це інше. Якби можливо було виявити ті риси,
що забезпечують речовинам, дослідженим in vitro, ефективність in vivo, відкриття нових
ліків стало б таким само передбачуваним процесом, як і їх виробництво”.
1) Втрата тканинної структури. Пошкодження міжклітинних взаємодій (гомо- й
гетеротипних) і взаємодії з матриксом. Для подолання – вирощування клітин у
тривимірному матриксі.
2) Втрата (повна чи часткова) диференціювання, тобто фенотипічних рис, притаманних
клітинам in vivo. Причини - дедиференціювання, адаптація до росту за умов in vitro або
нерівномірний ріст різних клітинних популяцій. Для подолання – селективні середовища.
3) Генетична нестабільність (анеуплоїдія), що призводить до зростання гетерогенності.
Для подолання – клонування.
4) Дороговизна. Oбладнання для підтримання клітин в культурі, середовища, сироватка,
одноразовий пластик. Отримання порівняно невеликої біомаси клітин in vitro потребує
значних витрат (для Західної Європи - приблизно в 10 разів вищих, ніж для отримання тієї
ж маси in vivo). Є сенс використовувати лише для отримання ≤ 10 г. біомаси.
5) Наявність навченого персоналу (підтримання стерильних умов, уникнення взаємної
контамінації культур, здатність виявляти перешкоди для оптимального росту клітин та
усувати їх).
6) Досліди in vitro не можуть замінити дослідження препататів in vivo перед їх клінічним
використанням.
Haverkamp, 2000
Типи культур.
1) Тканинна культура – культура з експлантату (фрагменту органу чи тканини).
Структура та функції клітин даної тканини in vitro зберігаються протягом нетривалого
часу. Вони втрачаються через міграцію одних та некроз інших клітин.
Клітини, що мігрують за межі експлантату, утворюють так звану зону росту
(outgrowth) і можуть бути далі пасажовані.
Зараз таким методом отримання культури клітин користуються лише у випадку, якщо
об‘єм вихідної тканини дуже малий (наприклад, фрагменти шкіри).
2) Органна культура – культура, в якій ембріони, цілі органи або експлантати
підтримуються in vitro зі збереженням їх структури та функції.
Наприклад, на мембрані на межі поживне середовище – повітря (до 3 тижднів)
Freshney, 2006
3) Клітинна культура – культура початково диспергованих (роз‘єднаних) клітин.
а) Суспензійна культура – культура, в якій окремі клітини існують у завислому стані
в рідкому середовищі (клітини крові, клітини, отримані з деяких злоякісних пухлин, деякі
трансформовані клітинні лінії)
б) Моношарова (адгезивна) культура – культура, клітини якої існують після
прикріплення до твердого субстрату (скло, пластик; інколи – покриті білками
позаклітинного матриксу)
в) Органоподібна (оrganotypic) та гістоподібна (histotypic) культура – культура,
клітини якої ростуть не на 2-вимірних поверхнях, а в 3-вимірному матриксі
(більш нагадує тканину in vivo, ніж клітинна культура, існує триваліший час in vitro, ніж
тканинна культура, можливо “реконструювати” тканину з окремих клітин; але вимагає
правильного підбору необхідних типів клітин і відповідного матриксу)
Freshney, 2006
Основні терміни та поняття
Фрагмент органу чи тканини
Механічна чи ферментативна дисоціація
(або метод міграції клітин з експлантату)
Первинна культура
Первинна культура – культура, джерелом якої є органи, експлантати або клітини,
взяті безпосередньо з організму (до першого пасажування).
Приклад первинної культури
.
Нейрони миші з Е18
Нейрони пофарбовані MAP2 (major microtubule associated protein of brain tissue)
Справа – ядра нейронів, пофарбовані флуоресцентним барвником DAPI
Також присутні астроцити, що фарбуються GAFP (glial acidic fibrillary protein)
Кокультура – змішана культура, що містить об‘єкти (клітини) різного походження.
Фрагмент органу чи тканини
Механічна чи ферментативна дисоціація
(або метод міграції клітин з експлантату)
Нормальна vs. ракова
Доросла vs. ембріональна
Людська vs. тваринна
Первинна культура
Пасажування (субкультивування)
Клітинна лінія
Клітинна лінія – клітинна культура, яка виникає з первинної культури починаючи
з першого пасажу (тобто перенесення з однієї посудини в іншу)
(існує поняття вторинна культура, проте третинна і т. д. не використовуються)
Фрагмент органу чи тканини
Механічна чи ферментативна дисоціація
(або метод міграції клітин з експлантату)
Первинна культура
Пасажування (субкультивування)
Ізоляція окремої клітини
(за певною специф. ознакою)
Клонова лінія
(cell strain)
Клітинна лінія
Імморталізація
(спонтанна або
індукована)
Постійна клітинна лінія
Подальше
пасажування
Старішання
Клітинна лінія з
обмеженим строком життя
(диплоїдні фібробласти, 50-70 поділів)
Постійна клітинна лінія – клітинна культура, яка здатна витримувати необмежену
кількість пасажів („безсмертна клітинна лінія“)
Клон – популяція клітин, яка виникла шляхом мітотичних поділів однієї клітини
(при цьому клітини не обов‘язково залишаються однорідними)
Фрагмент органу чи тканини
Механічна чи ферментативна дисоціація
(або метод міграції клітин з експлантату)
Первинна культура
Пасажування (субкультивування)
Клітинна лінія
Ізоляція окремої клітини
(за певною специф. ознакою)
Клонова лінія
Імморталізація
(спонтанна або
індукована)
Постійна клітинна лінія
Подальше
пасажування
Старішання
Клітинна лінія з
обмеженим строком життя
(диплоїдні фібробласти, 50-70 поділів)
Втрата залежності
від факторів росту
Нетрансформована постійна
клітинна лінія
Трансформована постійна
клітинна лінія
(3Т3 ембріональні фібробласти)
(HeLa)
Приклад трансформованої постійної клітинної лінії
SH-SY5Y
Нейробластома – поліпотентні клітини нервового гребеня.
Ростуть як агрегати недиференційованих клітин, але також можуть формувати
нейрити.
Трансформовані клітинні лінії:
1) Проліферація залежить від факторів росту
2) Потребують для росту прикріплення до твердої поверхні
3) Ріст уповільнюється після зростання густини клітин на чашці
4) Зміни каріотипу і фенотипу мінімальні
5) Не здатні викликати утворення пухлин при введенні їх тваринам
Трансформовані клітинні лінії:
1) Проліферація не залежить від факторів росту
2) Можуть рости без прикріплення до твердої поверхні (в суспензії
або напіврідкому агарі)
3) Втрачено залежність росту від загальної густини клітин в популяції
4) Генетична нестабільність (гетероплоїдія, анеуплоїдія)
5) При введенні тваринам викликають утворення пухлин
Програма
1) Основні уявлення стосовно біології тваринної клітини in vitro
Клітинна адгезія, проліферація клітин, диференціація клітин
2) Організація типової лабораторії клітинних культур
Необхідне обладнання, середовища для культивування, створення асептичних умов
3) Одержання первинних культур клітин
Загальні принципи, приклади окремих первинних культур
4) Підтримання клітин у культурі
Пасажування, кріоконсервація, старішання культур
5) Постійні клітинні лінії
Iмморталізація, слабко- та сильнотрансформовані клітинні лінії
6) Характеризація культивованих клітин
Клітини, що диференціюються in vitro, характеризація походження клітинної лінії
7) Підходи до культивування деяких спеціалізованих типів клітин
Епітеліальні, нейроектодермальні клітини. Органна, гістоподібна та oрганоподібна культури
8) Клонування клітин
Клонування, контамінація
9) Кількісна оцінка властивостей культивованих клітин
Цитотоксичність, проліферація, міграція та інвазiя
10) Специфічні області застосування культури клітин
Злиття соматичних клітин, моноклональнi антитіла, рекомбінантні білки в клітинах ссавців
11) Стовбурові клітини в культурі
Ембріональні стовбурові клітини, стовбурові клітини дорослого організму