Виділення і очищення
плазмідної ДНК
Виконав:
Переключатель слайдів:
Викладач:
Кравець В. С.
Павленко А. К.
Федоренко В. О.
Для виділення ДНК необхідно:
1. Руйнування клітинної стінки лізоцимом
2. Руйнування плазматичної мембрани детергентом
3. Відділення НК від інших компонентів(центрифугування/хімічна
екстракція)
4. Розщеплення РНК з використанням РНКази
Вирощування в рідкому середовищі
+ф. росту,
вітаміни
АК
Пептиди
N
Цукри
орг. і неорг.
Відбирання культури
• У E. coli, коли культура досягає максимальної
щільності(густини)(2-3*109кл/мл)
• Бактерії повинні міститися у чим меншому
об'ємі(культуральна рідина 1000 мл → 10 мл)
Лізис клітини
• ЕДТА (ЕтиленДіамінТетраАцетат) видаляє іони Mg2+, які необхідні
для збереження загальної структури кл. оболонки, а також інгібує
кл. ферменти, які можуть спричинити деградацію ДНК, лізоцим
• SDS(sodium dodecyl sulphate) лізує клітини, а також сприяє
денатурації поліпептидів і нейтралізації заряду молекул
Розділення на основі розміру
• Якщо лізування клітини відбувається
обережно і в контрольованих умовах, то
розриви відбуваються лише у малої кількості
ДНК. Таким чином, розміри хр. ДНК значно
перевищують розміри пл. ДНК, і хр. ДНК
випадає в осад при центрифугуванні, так як
велика частка молекул фізично звязана з
клітинною оболонкою
Розділення на основі
конформації
1. Лужна денатурація
+NaOH – неспіралізована ДНК
денатурує
+кислота – ренатурація
+SDS
2. Центрифугування за градієнтом концентрації
EtBr спричиняє часткове розплітання і зниження густини на цілих 0,125
г/см3 для лінійної ДНК. Зниження густини кільцевої суперспіралізованої
ДНК є меншою(0,085 г/см3), оскільки її розплітання є обмежене.
Зв'язаний EtBr до плазмідної ДНК екстрагують н-бутанолом, а CsCl
видаляють шляхом діалізу.
Ампліфікація плазміди
• Причина: низький вихід пл. ДНК порівняно з хр. ДНК
• Мультикопійні плазміди мають здатність до реплікації за
відсутності білкового синтезу
• За досягнення необхідної щільності клітин додають інгібітор
білкового синтезу і культивують ще 12 год.
• К.-ть пл. ДНК – зростає, к.-ть хр. ДНК – залишається незмінною
Очищення плазмідної ДНК
1.
2.
3.
4.
Преципітація етанолом(ізопропанолом)
Приципітація поліетиленгліколем
Фенол-хлороформна екстракція
Хроматографія
Список використаної літератури
• Brown T.A. Gene cloning and DNA analysis. An Introduction. Chichester : Wiley-Blackwell, 2010 – 320 p.
• Dongyou Liu. Handbook of nucleic acid purification. – Boca Raton :
CRC Press, 2009. – 572 p.
• Clark D.P., Pazdernik N.J. Biotechnology. – Amsterdam : Elsevier Inc.,
2012 – 767 p.
Дякую за увагу!!!