PENDAHULUAN
KROMATOGRAFI
Oleh :
Nina Salamah, MSc., Apt.
Fakultas Farmasi
Universitas Ahmad Dahlan
1
Menurut Willard et at, (1989), pembagian kromatografi
dapat dibuat bagan sebagai berikut:
Kromatografi
Kromatografi gas
Kromatografi Cair
Gas-cair Gas padat
(GLC)
(GSC)
Fase terikat
Cair-cair
LLC
Eksklusif
EC
Pasangan ion
Cair-padat
LSC
Penukar ion
IEC
2
• Pembagian diatas berdasar jenis fase, ialah cair dan
gas,
• Pembagaian kedua : penukar ion dan eklusif serta
pasangan ion hanya mengetengahkan salah satu
fase diam,
• Willard : kedua kromatografi penukar ion dan eklusif
merupakan kromatografi yang berdasar pada
interaksi antara linarut dan fase diam.
• Berdasarkan kesetimbangan yang terjadi dibedakan
menjadi 2 ialah: adsorbsi, dan partisi yang dapat
terjadi baik dalam kromatografi gas maupun
kromatografi cair.
3
Berdasarkan Proses Pemisahan
a. Kromatografi adsorbsi
b. Kromatografi partisi
c. Kromatografi pasangan ion
d. Kromatografi penukar ion
e. Kromatografi eksklusif
f. Kromatografi afinitas,
C.TEORI PEMISAHAN
Teori dan Mekanisme dari berbagai pemisahan.
1. Pemisahan Adsorpsi
Peristiwa adsorpsi oleh fase diam terhadap fase gerak
dan linarut selalu terjadi kompetitif
Kemampuan fase diam mengadsorpsi keduanya
sangat tergantung pada topografi gugus aktif yang
terdapat pada masing -masing komponen.
Fase diam dari silica yang mempunyai gugas hidroksil
dari silanol (Si-OH) dapat terjadi interaksi dengan
gugus pada linarut maupun pada fase gerak.
5
• Peristiwa adsorbsi umumnya terjadi pada
kromatografi padat cair (liquid solid
chromatography, atau LSC, terjadi pada
KLT).
• Dapat pula terjadi pada Gas solid
chromatography atau Kromatografi gas
(KG) yang berinteraksi antara fase diam dan
linarutnya.
• Fase gerak pada kromatografi gas, tidak
mempunyai gugus aktif yang dapat
berinteraksi dengan fase diam.
6
Rumus Koefisien Distribusi (KD)
• KD =CS/CM
CS menyatakan kadar linarut dalam fase diam
(stationair phase), dan CM kadar linarut dalam fase
gerak (mobile phase).
 Persamaan diatas menunjukkan bahwa linarut X lebih
banyak berinteraksi dengan fase diam karena
indeknya lebih kecil dan jumlah dalam masing-masing
fase juga sangat kecil.
Dengan pedoman tersebut berarti kadar linarut dalam
fase diam selalu lebih kecil dari kadar linarut dalam
fase gerak.
7
dari
Berdasarkan hal di atas maka harga K selalu lebih kecil
1, Tetapi mungkin dapat terjadi yang sebaliknya.
pada:
Adsorpsi linarut oleh fase diam sangat tergantung
D
a. Struktur kimia linarut atau adanya gugus aktif yang
ada
b. Ukuran partikel fase diam, makin kecil ukuran
partikel fase diam makin luas permukaannya sehingga
kontak dengan linarut makin luas.
c. Kelarutan linarut dalam fase gerak, makin mudah
larut linarut dalam fase gerak, linarut makin mudah
lepas dari fase diam.
8
• d. Kemampuan interaksi (isotermik) yang
terjadi antara fasediam dan fase gerak.
Contoh interaksi antara beberapa senyawa
aromatik dengan silica
9
Penggolongan tipe adsorbsi isotermik
Peristiwa adsorbsi isotermik dapat digolongkan dalam
beberapa tipe yaitu :
a.Tipe konkap
terjadi apabila mula-mula linarut tidak kuat
interaksinya. kemudian menjadi lebih kuat sehingga
terikat lama pada fase diam. berarti K < 1
• b. Tipe normal(linier)
Ikatan yang terjadi tetap. Sehingga berupa garis lurus
dan K = 1.
• c. Tipe konvek,
Adsorpsi mula-mula terikat kuat oleh fese diam,
makin lama makin lemah sehingga bentuk kurvanya
menjadi konvek atau harga K>1
10
Penggolongan tipe adsorbsi isotermik
• Puncak berekor
Tipe a dan b tersebut yang sering menyebabkan
terjadinya pelebaran puncak lihat gambar 3.2
11
Contoh gambar adsorbsi isotermik
Gambar:
12
a. Jenis fase diam
• Fase diam untuk kromatografi adsorbsi yang paling
banyak digunakan adalah silica gel
• Partikel fase diam mempunyai bentuk dan ukuran
yang berbeda. Ukuran makin kecil akan makin
memperluas permukaan fase diam, dan
memperluas pula gugus aktif dan fase diam yang
aktif berhubungan dengan linarut
• Bentuk dengan pori yang dalam, bila pori tersebut
sangat banyak akan menaikkan harga K, yang jauh
lebih besar dan 1 dan menimbulkan garis kurva
adsorbsi isotermik yang konkaf
13
• Makin dangkal pori yang ada, makin efisien untuk
pemisahan.
• Pedoman memilih fase diam dengan sebagai
berikut:
• 1).Fase diam yang bentuk pelikuler (pori yang dalam)
akan menambah efisiensi, tetapi menaikkan
kapasitasnya.
• 2). Bentuk pelikuler umumnya dibuat packing
dengan cara kering
•
14
3/. Bentuk mikroporus, dikemas secara basah
(adonan atau slurry, permukaan jadi luas
menambah harga K)
4/. Bila pemisahan antara linarut sukar,
sebaiknya menggunakan mikroporus, karena
efisiensinya makin tinggi, luas permukaan
partikel
makin besar, sehingga kontak
dengan linarut makin banyak (K menjadi
besar).
Kejadian tersebut akan menaikkan
sifat
selektivitas fase diam terhadap linarut, dan
kapasitas fase diam akan menjadi lebih besar.
Tabel I.I Beberapanama adsorben/penjerap dan ukurannya
(Johson dan
Stevenson 1979)
Tipe
Nama
Ukuran(nm)
Sifat
Luas m 2 g
Silica
Pellosil
37-50
Asam- 1-7dan 111
aktif
Corasil
37-44
lemah
HS-4
(HS dan HC
HC-8
Perrisorb A
30-40
14,12,
Vydac
30-44
Alumin Pellumina
a
HS dan HC
Pellidon
LainPerrisorb PA
lain
Diatomeae
Lempung
Celite
37-44
Basa
lemah
45
30-44
non
polar
HS-4 &
HC-8
1
0,5
16
2. Pemisahan Partisi
• Pemisahan cara partisi sangat erat kaitannya
dengan kelarutan senyawa ke dalam pelarut.
• Dalam kromatografi didasarkan pada kelarutan
linarut dalam fase diam maupun fase cair, maka
terdapat istilah koefisien partisi, yang peristiwanya
akan mengembang menjadi koefisen distribusi
yang umumnya berlaku pada kromatografi.
• Koefisien partisi dapat dinyatakan sebagai
perbandingan kadar(kelarutan) linarut dalam fase
diam dengan kadar(kelarutan) linarut dalam fase
gerak.
17
• Sedangkan secara umum adalah perbandingan
kelarutan senyawa dalam oktanol dibanding
kelarutannya dalam air.
• Sifat linarut dalam kromatografi dapat
digambarkan dalam berbagai cara, pada
kromatografi kolom dikenal dengan volume
tambat atau VR.
• VR (sesuai dengan jumlah volume fase gerak yang
digunakan untuk membawa satu linarut keluar
dari kolom).
• Tetapi bila dinyatakan dengan tR (waktu tambat)
menyatakan waktu yang diperlukan fase gerak
membawa linarut keluar dari kolom.
18
• Sedangkan waktu yang diperlukan untuk membawa
linarut bergerak dari satu titik ke titik yang lain dalam
KLT atau elektroforese disebut Rf.
• Satuan ini merupakan perbandingan jarak yang
ditempuh linarut dengan jarak yang ditempuh
pelarut (fase gerak) dalam waktu yang sama
Jarak migrasi sampel
• Rf = 
•
Jarak migrasi pelarut
• Tetapan partisi dengan inial k' (perbandingan kadar
linarut dalam fase diam dibanding dengan kadar
linarut dalam fase gerak).
• Rumusnya adalah: seperti k’= CsVs/ (CmVm)
19
• Kromatografi eksklusif pemisahannya atas
dasar ukuran molekul linarut, utamanya pada
molekul yang besar, sehingga dinamakan pula
kromatografi filtrasi.
• Pada kromatografi filtrasi dapat pula terjadi
pada kromatogarfi gas tetapi dengan ukuran
molekul yang kecil disebut moleculer shiever
• Teori tersebut perlu dibahas terpisah sesuai
dengan topik dan aplikasinya.
20
LIQUID-LIQUID CHROMATOGRAPHY
ODPN (oxydipropionylnitrile)
Normal Phase LLC
Reverse Phase LLC
NCCH3CH2OCH2CH2CN(Normal)
CH3(CH2) 16CH3 (Reverse)
The stationary solid surface is coated with a 2nd liquid (the
Stationary Phase) which is immiscible in the solvent (Mobile) phase.
Partitioning of the sample between 2 phases delays or retains some
components more than others to effect separation.
ION-EXCHANGE CHROMATOGRAPHY
SO3- Na+
Separation in Ion-exchange Chromatography is based on the
competition of different ionic compounds of the sample for the
active sites on the ion-exchange resin (column-packing).
Types of Ion Exchange Resins
Type of
Exchanger
Functional Exchanger Group
Trade Name
Cation
Strong Acid
Sulfonic acid (-SO3-H+)
Dowex 50;
Amberlite IR 120
Weak acid
Carboxyclic acid (-CO2-H+)
Amberlite IRC 50
Anion
Strong base
Quaternary ammonium ion (- Dowex 1;
NR3+OH-)
Amberlite IRA 400
Weak base
Amine group (-NH3+OH-)
Dowex 3;
Amberlite IR 45
Chromatography
Conditions associated with each kind of chromatography
•Ion exchange chromatography
•Organic cation exchange resins involve crosslinked polystyrene containing
either SO3- or COO- functional groups with an associated cation
H H H H
C
C
C
C
H
+
Na SO3
H
-
-
+
SO3 Na
•Organic anion exchange resin involve
•crosslinked polystyrene containing NH3+
•functional groups with an associated anion
H H H H
C
C
H
-
Cl NH3
C
C
H
+
NH3 Cl
-
The affinity of dissolved ions
for the resin varies
with the ion and the
composition of the
solution
• nRzSO3–H+ + Mn+
(RzSO3)nM + nH+
• nRzCO2–H+ + Mn+
(RzCO2)nM + nH+
• nRzNR3+OH-+ An-
(RzNR3)nA + nOH-
MECHANISM OF ION-EXCHANGE
CHROMATOGRAPHY OF AMINO ACIDS
pH2
SO 3
-
Na
+
H3N
+
COOH
Ion-exchange Resin
SO 3
-
H 3N
Na
+
+
COO
-
pH4.5
Chromatography of Amino Acids
Statio nar y P h ase
Mo bile P h ase
H3 N
-
SO 3 Na+
+
COOH
+
Na
SO 3
OH
-
H3 N
+
COOH
Ex ch an ge Resin
-
SO 3 H3N+
COOH
SO 3
p H3 .5
OH
-
H3 N+
+
-
Na
COO
H
+
-
OH = H2 O
+
Na
SO 3
-
H3 N
+
-
COO
H
+
-
OH = H 2 O
-
SO 3Na+
p H4 .5
Some Applications of Ion Exchange Chromatography
• Purifications
a mixed bed cation-anion exchanger remove salts (ex
CaCl2) from water by exchanging them for H2O
:Deionization of water
• Concentrations
The concentration of trace elements in seawater.
• Analytical Separations
Separations of metal ions and amino acid or halide ions
SIZE EXCLUTION CHROMATOGRAPHY
Gel-Permeation Chromatography is a mechanical sorting of molecules
based on the size of the molecules in solution.
Small molecules are able to permeate more pores and are, therefore,
retained longer than large molecules.
SIZE EXCLUTION CHROMATOGRAPHY
• Molecules that can penetrate the gel particles are
separated based on size and shape. Others pass straight
through the column.
• Gel filtration chromatography : mobile phase is water.
• Gel permeation chromatography : mobile phase is an
organic solvent.
• Sephadex is popular molecular-sieve material 4 the
separation of proteins.
Teori pemisahan
Pemisahan yang terjadi dalam sistem selalu
mengalami keseimbangan yang dinamis,
baik pemisahan tersebut karena peristiwa
adsorbsi partisi, penukaran ion, permiasi,
maupun cara afinitas.
32
Resolusi (Daya Pisah)
• Kromatografi digunakan untuk analisis, tetapi tujuan
utama semula adalah untuk pemisahan, sehingga dalam
analisis campuranpun diutamakan pemisahannya. Untuk
mendapatkan harga pemisahan yang dikehendaki
berdasar pada rumus berikut:
(tR2- tR2)
R = —————
0,5(W1+W2)
syarat harga R agar terjadi pemisahan dengan baik
paling tidak 1,25. Kalau hanya 1 masih ada tumpang
tindih sebesar 2% antara puncak 1 dan puncak 2.
33
Applications of Chromatography
• Qualitative Analysis
• Quantitative Analysis
– Analyses Based on Peak Height
– Analyses Based on Peak Areas
– Calibration and Standards
– The Internal Standard Method
– The Area Normalization Method