T lymphocyte apoptosis in HIV infection
Phennapha Klangsinsirikul
Department of Medical Technology
Faculty of Associated Medical Sciences
Chiang Mai University
Powerpoint Templates
Page 1
What is apoptosis?
The term apoptosis is often used
synonymously with programmed cell
death, implying the death results
from the regulated activation of a
pre-existing death program that is
encoded in the genome.
Powerpoint Templates
Page 2
Roles of apoptosis in physiology
• Embryonic development and morphogenesis
– Formation of cavities
– Separation of digits
• Eliminates vestigial structures that once
served a function during embryogenesis.
• Balances cell division, maintaining the
constancy of tissue mass.
Powerpoint Templates
Page 3
Apoptosis in physiology and pathology
Powerpoint Templates
Page 4
Roles of apoptosis in pathology
• Removal of cells injured by genetic defects,
ageing, disease, or exposure to noxious agents.
• Elimination of specific cell populations for
maintaining the normal immune response.
• Excessive or insufficient apoptosis contributes
to the pathogenesis of ischemia,
neurodegeneration, autoimmunity, viral infection
and growth Powerpoint
and regression
of
tumours
Templates
Page 5
http://www.microbiologybytes.com/virology/kalmakoff/baculo/baculohostinteract.html
Powerpoint Templates
Page 6
Goodlett, C.R., and Horn, K.H. Mechanisms of alcohol-induced damage to the
developing nervousPowerpoint
system. AlcoholTemplates
Research & Health 25(3):175–184, 2001.
Page 7
http://ghr.nlm.nih.gov/handbook/illustrations/apoptosismacrophage
Powerpoint Templates
Page 8
Powerpoint Templates
http://www.pharmainfo.net/reviews/p53-gene-therapy-potential-panacea-cancer
Page 9
http://www.bioscience.org/2009/v14/af/3509/fulltext.asp?bframe=figures.htm&doi=yes
Powerpoint Templates
Page 10
Extracellular death signals
• Cellular decision to initiate apoptosis
programs depends on
– Cessation of extracellular signals that
negatively regulate apoptosis, e.g. the
signals are required for survival.
– Receipt of positive signals for cell death
through ‘death receptors’.
Powerpoint Templates
Page 11
Apoptosis signaling by CD95
• CD95 (Fas or APO-1) is a type I
transmembrane receptor that belong to
tumour necrosis factor receptor (TNFR) family.
• It is involved in death transducing
signals and is referred as a ‘death
receptor’.
• CD95-mediated apoptosis is triggered
by its natural ligand, CD95L (FasL)
which is type
II transmembrane
protein.
Powerpoint
Templates
Page 12
Apoptosis signaling by CD95
• Fas and FasL are implicated in
– Peripheral blood deletion of
autoreactive T cells.
– Activation-induced T cell death.
– Cytolytic pathway mediated by CD8+
cytotoxic T cells (CTL).
Powerpoint Templates
Page 13
Cytotoxic T lymphocyte (CTL) killing of target cells
http://www.pathology.unibe.ch/Forschung/apoptosis/TBrunner_res.htm
Powerpoint Templates
Page 14
Intracellular death signals
• Cell can respond to diverse stressful stimuli and metabolic
disturbances by triggering apoptotic programs.
– Drugs, toxins, heat, radiation, hypoxia, viral infection
• Intracellular death signals can activate mitochondria to
release cytochrome C into the cytosol.
• When and how do cells decide to commit suicide when
subjected to stressful stimuli?
– The intensity and the duration of the stimulus determine the
outcome.
– The stimulus needs to exceed a threshold in order to trip the
decision. Powerpoint Templates
Page 15
http://www.dkfz.de/en/immungenetik/Min_group/Min_englisch.html
http://www.dkfz.de/en/immungenetik/Min_group/Min_englisch.html
Powerpoint Templates
Page 16
Powerpoint Templates
http://flipper.diff.org/app/pathways/info/581
Page 17
BCL-2 super family
Pro-apoptotic
Anti-apoptotic
BH3-only proteins Multidomain (BH)
BIK
BAX
BAD
BAK
BIM
BOK
HRK
BOO
BCLG
BCLG
HRK
BCLB
NOXA
BCL-RAMBO
PUMA
others
BCL-2
BCL-XL
BCLW
MCL1
BCLB
viral homolog's
Powerpoint Templates
http://www.biooncology.com/research/apoptosis/pathways/intrinsic/
Page 18
Inhibition of apoptosis
• Inhibition of apoptosis can result in a number of
cancers, autoimmune diseases, inflammatory
diseases, and viral infections.
• It was originally believed that the associated
accumulation of cells was due to an increase in
cellular proliferation, but it is now known that it is also
due to a decrease in cell death.
Powerpoint Templates
Page 19
Hyperactive apoptosis
• Loss of control of cell death (resulting in excess
apoptosis) can lead to neurodegenerative
diseases, hematologic diseases, and tissue
damage.
• The progression of HIV is directly linked to
excess, unregulated apoptosis: CD4+
lymphocytes die at an accelerated rate through
uncontrolledPowerpoint
apoptosis.
Templates
Page 20
HIV progression
• HIV enzymes deactivate anti-apoptotic Bcl-2: primes the cell
for apoptosis should the appropriate signal be received.
• HIV enzymes activate pro-apoptotic procaspase-8, which
directly activate the mitochondrial events of apoptosis.
• HIV may increase the level of cellular proteins which prompt
Fas-mediated apoptosis.
• HIV proteins decrease the amount of CD4 glycoprotein
marker present on the cell membrane.
Powerpoint Templates
Page 21
HIV progression
• Released viral particles and proteins present in extracellular
fluid are able to induce apoptosis in nearby "bystander" T
helper cells.
• HIV decreases the production of molecules involved in
marking the cell for apoptosis, giving the virus time to
replicate and continue releasing apoptotic agents and virions
into the surrounding tissue.
• The infected CD4+ cell may also receive the death signal
from a cytotoxic T cell
Powerpoint Templates
Page 22
Powerpoint Templates
Page 23
Detection of Apoptosis
• Cell morphology
• Annexin V/PI binding
• DNA fragmentation
• Mitochondrial transmembrane potential
• Caspase activity assay
• Procaspase activation
• DNA binding
• Apoptotic gene expression (mRNA)
Powerpoint Templates
Page 24
ึ ษาอัตราการเกิด Apoptosis ของ
การศก
CD4+ T lymphocytes
ื้ เอชไอวี และผู ้ป่ วยเอดส ์
ในผู ้ติดเชอ
Powerpoint Templates
Page 25
ที่มาของปั ญหา
• ผู้ตดิ เชือ้ เอชไอวี และผู้ป่วยเอดส์ ที่รักษาด้ วยยาต้ านไวรั สหลายขนาน
ร่ วมกัน (HAART)
– ปริมาณ VL ลดลงอย่ างรวดเร็วจนถึงระดับที่ตรวจวัดไม่ ได้
– การเพิ่มจานวน CD4+ T lymphocytes ในกระแสเลือด
• ผู้ป่วยที่ล้มเหลวจากการรั กษาด้ วยยาต้ านไวรั ส
– ปริมาณไวรัสในกระแสเลือดสูงขึน้
– ระดับ CD4+ T lymphocytes ลดลงหรือไม่ เพิ่มขึน้ เมื่อเทียบกับก่ อนเริ่มการรักษา
– อาจเกิดจากผู้ป่วยกินยาต้ านไวรั สไม่ สม่าเสมอ ทาให้ เกิดการกลายพันธุ์ของไวรัส
จนเกิดการดือ้ ต่ อยาต้ านไวรั สที่ใช้ รักษาอยู่
Powerpoint Templates
Page 26
ที่มาของปั ญหา (ต่ อ)
• การตรวจทางห้ องปฏิบัตกิ ารเพื่อใช้ ตดิ ตามประเมินผล HAART
– CD4+ T lymphocyte Count
– HIV Viral load assay
– HIV drug resistance test
• การตรวจหาการตายของ CD4+ T lymphocytes โดยขบวนการ apoptosis
ใช้ เทคนิคการตรวจที่ไม่ ย่ ุงยากมากนัก จึงอาจนามาใช้ ร่วมในการติดตาม
ประเมินผล HAART cละอาจใช้ ช่วยพยากรณ์ ผลการรั กษาได้
• การตรวจ Apoptosis assay ด้ วยเครื่ องโฟลไซโตมิเตอร์ เช่ น วิธี Annexin
V ทาได้ ง่าย ไม่ ย่ ุงยาก ห้ องปฏิบัตกิ ารที่ให้ บริการตรวจ CD4+ T cell count
สามารถทาการตรวจได้ Powerpoint Templates
Page 27
การตรวจโดยใช้ Annexin V
http://www.lifesci.dundee.ac.uk/services/flow_cytometry/common_applications/cell-death.html
Powerpoint Templates
Page 28
วัตถุประสงค์
• เพื่อศึกษาความสัมพันธ์ ระหว่ างอัตราการเกิด apoptosis
ของ CD4+ T lymphocytes กับปริมาณ CD4+ T
lymphocytes ในผู้ตดิ เชือ้ HIV และผู้ป่วยเอดส์ ก่ อนและ
หลังได้ รับการรักษาด้ วยยาต้ านไวรัส
• เพื่อศึกษาว่ า apoptosis assay สามารถนามาใช้ ตดิ ตาม
ประเมินผลการรักษาด้ วยยาต้ านไวรัส นอกเหนือจากการ
ตรวจ CD4+ T lymphocytes และ HIV-1 Viral load ได้
หรือไม่
Powerpoint Templates
Page 30
วิธีวิจัยและขอบเขตการวิจยั
• กลุ่มตัวอย่ าง 4 กลุ่ม
– กลุ่มผู้ป่วยก่ อนได้ รับยาต้ านไวรั ส (Naïve) 16 ราย
– กลุ่มอาสาสมัครปกติ (HIV negative) 16 ราย
– กลุ่มผู้ป่วยที่รักษาด้ วยยาต้ านไวรั ส และมี CD4+ T cells > 200
cells/µl 16 ราย
– กลุ่มผู้ป่วยที่รักษาด้ วยยาต้ านไวรั ส และมี CD4+ T cells < 200
cells/µl จานวน 16 ราย
• การวิเคราะห์ ทางสถิติ
– เปรี ยบเทียบอัตราการเกิด apoptosis ทัง้ 4 กลุ่ม
– หาความสัมพันธ์ ระหว่ างการเกิด apoptosis กับปริมาณ CD4+ T
cells ของผู้ป่วยPowerpoint Templates
Page 32
วิธีการตรวจ
• การตรวจหาอัตราการเกิด CD4+ T lymphocyte apoptosis
โดยวิธีโฟลไซโตเมทรี
– ย้ อมเซลล์ เม็ดเลือดด้ วย anti-CD3-PC5 และ anti-CD4-PE เพื่อ
แยกแยะ CD4+ T lymphocytes (CD3+/CD4+) ออกจากเม็ด
เลือดขาวชนิดอื่นๆ
– ย้ อมเซลล์ ด้วย Annexin V- FITC ซึ่งจะย้ อม phosphatidylserine
ที่ผิวของเซลล์ ท่ กี าลังเกิด apoptosis ควบคู่กับการย้ อมด้ วย
Propidium iodide ซึ่งย้ อม DNA ภายในเซลล์ ซ่ งึ ตายแล้ ว
– นาไปวิเคราะห์ ด้วยเครื่อง BC FC500 flow cytometer ซึ่ง
วิเคราะห์ ได้ 4 สีในเวลาเดี
ย
วกั
น
Powerpoint Templates
Page 33
วิธีการตรวจ
(A)
(B)
ภาพแสดงการตรวจการเกิด apoptosis ของ CD4+ T lymphocytes ด้ วยวิธี Flow cytometry,
(A) Dot plot ระหว่ างค่ า SSC and anti-CD3-PC5 เพื่อกาหนดให้ CD3+ T cells อยู่ใน gate
A, (B) จาก gate A มาทา Dot plot ระหว่ าง anti-CD4-PE and anti-CD3-PC5 เพื่อแยกกลุ่ม
เซลล์ เป็ น CD4+ T cells and CD4Powerpoint
T cells Templates
Page 34
วิธีการตรวจ
Necrosis
Late apoptosis
Viable cell
Early apoptosis
ภาพแสดง Dot plot ระหว่ าง PI and Annexin V-FITC จาก gate B เพื่อแยก cells
ออกเป็ น 4 กลุ่ม ปริมาณ cells ที่อยู่ใน quadrant ของ E1, E2, E3 และ E4 หมายถึง
necrosis cells, late apoptosis cells, viable cells และ early apoptosis cells ตามลาดับ
Powerpoint Templates
Page 35
ผลการวิจัย
Powerpoint Templates
Page 36
P = 0.000
%Early apoptosis
P = 0.451
P = 0.008
Naïve
Normal
Treated(CD4<200)
Treated(CD4>200)
ภาพแสดงการเปรียบเทียบ % Early apoptosis แต่ ละกลุ่ม
Powerpoint Templates
Page 37
P = 0.000
%Late apoptosis
P = 0.003
P = 0.000
Naïve
Normal
Treated(CD4<200)
Treated(CD4>200)
ภาพแสดงการเปรียบเทียบ % Late apoptosis แต่ ละกลุ่ม
Powerpoint Templates
Page 38
P = 0.035
%Total apoptosis
P = 0.065
P = 0.001
Naïve
Normal
Treated(CD4<200)
Treated(CD4>200)
ภาพแสดงการเปรี ยบเทียบ % Total apoptosis apoptosis แต่ ละกลุ่ม
Powerpoint Templates
Page 39
ตารางแสดงค่ า p value ในการเปรี ยบเทียบทางสถิตขิ องค่ า %Total apoptosis,
%Early apoptosis, % Late apoptosis ระหว่ างกลุ่มตัวอย่ างแต่ ละกลุ่ม
%Early
apoptosis
%Late
apoptosis
%Total
apoptosis
Naive HIV-infected persons
vs. Normal
0.008
0.000
0.001
Naive vs. Treated (CD4+ T
cells < 200 cells/µl)
0.000
0.001
0.035
Naive vs. Treated (CD4+ T
cells > 200 cells/µl)
0.451
0.003
0.065
Powerpoint Templates
Page 40
%Early apoptosis
P = 0.146
P = 0.661
Naïve(CD4<200)
Naïve(CD4>200)
Normal
Treated(CD4<200) Treated(CD4>200)
ภาพแสดงการเปรียบเทียบ % Early apoptosis
Powerpoint Templates
Page 41
%Late apoptosis
P = 0.016
P = 0.007
Naïve(CD4<200) Naïve(CD4>200)
Normal Treated(CD4<200) Treated(CD4>200)
ภาพแสดงการเปรี
ยบเทียบ % Late apoptosis
Powerpoint Templates
Page 42
%Total apoptosis
P = 0.502
P = 0.236
Naïve(CD4<200) Naïve(CD4>200)
Normal Treated(CD4<200) Treated(CD4>200)
ภาพแสดงการเปรียบเทียบ % Total apoptosis
Powerpoint Templates
Page 43
ตารางแสดงค่ า p value ในการเปรี ยบเทียบทางสถิตขิ องค่ า %Total apoptosis,
%Early apoptosis, % Late apoptosis ระหว่ างกลุ่มตัวอย่ างแต่ ละกลุ่ม
%Early
apoptosis
%Late
apoptosis
%Total
apoptosis
Naive (CD4+ T cells < 200
cells/µl) vs. Treated (CD4+ T
cells < 200 cells/µl)
0.146
0.007
0.502
Naive (CD4+ T cells > 200
cells/µl) vs. Treated (CD4+ T
cells > 200 cells/µl)
0.661
0.016
0.236
Powerpoint Templates
Page 44
วิจารณ์ ผลการทดลอง
• จากผลการทดลองดังกล่ าวแสดงให้ เห็นว่ าอัตราการเกิด apoptosis
ของ CD4+ T lymphocytes สัมพันธ์ กับการลดลงของจานวน CD4+ T
lymphocytes ของผู้ท่ ตี ดิ เชือ้ HIV โดยที่อัตราการเกิด apoptosis ใน
คนปกตินัน้ ก็สามารถพบได้ ในระดับที่ไม่ สูงมากนัก
• พบว่ าในผู้ตดิ เชือ้ HIV ทัง้ ที่ยังไม่ ได้ รับการรักษาและได้ รับการรักษา
ด้ วยยาต้ านไวรัสแล้ ว ในกรณีท่ มี ีปริมาณของ CD4+ T lymphocytes
ที่ใกล้ เคียงกัน มีอัตราการเกิด apoptosis ที่แตกต่ างกัน โดยผู้ท่ ตี ดิ
เชือ้ HIV ที่มีอัตราการเกิด apoptosis ที่สูงกว่ า น่ าจะมีความรุ นแรงใน
การดาเนินโรคที่มากกว่ าผู้ท่ ตี ดิ เชือ้ ที่มีอัตราการเกิด apoptosis ที่ต่า
กว่ าในกรณีท่ มี ีปริมาณของ CD4+ T lymphocytes ที่ใกล้ เคียงกัน
Powerpoint Templates
Page 45
สรุ ปผลการทดลอง
• กลุ่ มผู้ ติดเชื อ้ HIV ที่ยังไม่ ได้ รับการรั กษา มีอัตราการเกิด apoptosis สู งกว่ า
กลุ่มคนปกติอย่ างมีนัยสาคัญทางสถิติ (p < 0.01)
• กลุ่มผู้ตดิ เชือ้ HIV ที่ยังไม่ ได้ รับการรั กษามีอัตราการเกิด apoptosis ต่ากว่ ากลุ่ม
ผู้ตดิ เชือ้ HIV ที่ได้ รับการรั กษาที่มี absolute CD4 count < 200 cells/µl อย่ างมี
นัยสาคัญทางสถิติ (p < 0.05)
• อัตราการเกิด apoptosis ของกลุ่มผู้ตดิ เชือ้ HIV ที่ยังไม่ ได้ รับการรั กษา กับกลุ่ม
ผู้ตดิ เชือ้ HIV ที่ได้ รับการรั กษาที่มี absolute CD4 count > 200 cells/µl ไม่
แตกต่ างกันอย่ างมีนัยสาคัญทางสถิติ (p > 0.05)
• จากผลการศึกษาดังกล่ าวแสดงให้ เห็นว่ าสามารถนาวิธีการตรวจหาการเกิ ด
apoptosis ของ CD4+ T lymphocytes ด้ วย Annexin V-FITC มาประยุกต์ ใช้ ใน
การตรวจเพื่ อ ช่ วยประเมิ น ความรุ น แรงในการด าเนิ น โรค และประเมิ น
ผลการรั กษาผู้ตดิ เชือ้ HIV ร่ วมกับการตรวจนับปริมาณ CD4+ T lymphocytes
Powerpoint Templates
ได้
Page 46
BCL-2 super family
Pro-apoptotic
Anti-apoptotic
BH3-only proteins Multidomain (BH)
BIK
BAX
BAD
BAK
BIM
BOK
HRK
BOO
BCLG
BCLG
HRK
BCLB
NOXA
BCL-RAMBO
PUMA
others
BCL-2
BCL-XL
BCLW
MCL1
BCLB
viral homolog's
Powerpoint Templates
http://www.biooncology.com/research/apoptosis/pathways/intrinsic/
Page 47
การศึกษาเบือ้ งต้ นเกี่ยวกับการ
แสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้ อกับการ
เกิด apoptosis ในผู้ตดิ เชือ้ เอชไอวี
Powerpoint Templates
Page 48
http://www.si.mahidol.ac.th/departme
nt/biochemistry/home/md/MD_faq_co
ntents/MD_faq_14ans.htm
http://www.meduni-graz.at/zmf/946
Powerpoint Templates
Page 49
Crossing point (Cp)
http://www.dnassequencing.com/2010/11/25/real-time-pcr-5/
Powerpoint Templates
Page 50
1. กลุ่มผู้ตดิ เชือ้ เอชไอวี ที่มีปริมาณ CD4+ < 100 cells/µl
จานวน
8
ตัวอย่ าง
2. กลุ่มผู้ตดิ เชือ้ เอชไอวี ที่มีปริมาณ CD4+ > 100 cells/µl
จานวน
7
ตัวอย่ าง
3. กลุ่มคนปกติท่ ีไม่ ตดิ เชือ้ เอชไอวี
จานวน
10 ตัวอย่ าง
รวม
Powerpoint Templates
25
ตัวอย่ าง
Page 51
Bcl-2
Bax
BA
ภาพแสดงค่
า Tm ของ
PCR product
Powerpoint
Templates
Page 52
ภาพแสดงจุ
ด Cp Templates
ของ PCR products
Powerpoint
Page 53
Fold gene expression = 2
Cp (Patient)
Cp (Normal)
Cp
–Cp
= Cp target gene – Cp reference gene
= Cp target gene – Cp reference gene
= Average Cp (Patient) – Average Cp (Normal)
Powerpoint Templates
Page 54
1.39
1.06
0.56
0.27
ภาพแสดงจานวนเท่ าPowerpoint
ของการแสดงออกของยี
Templates น Bax และ Bcl-2
Page 55
สรุปและวิจารณ์ผลการทดลอง
• การศึกษาก่ อนหน้ าพบการสาเหตุของการลดลงของ CD4
ในผู้ตดิ เชือ้ HIV เกิดจากการเกิด apoptosis
• การศึกษาการแสดงออกของยีนอาจทาให้ ทราบถึงกลไก
การเกิด apoptosis
• กลุ่มที่มีค่า CD4<100 cells/ml มีการแสดงออกของ Bax
(pro-apoptotic gene) เพิ่มขึน้ และมีการแสดงออกของ
Bcl-2 (anti-apoptotic gene) ลดลง
• เป็ นการศึกษาใน PBMC ไม่ ใช่ CD4 T cells และจานวน
ตัวอย่ างยังไม่ มากพอที
่ จะสรุ
ป
Powerpoint
Templates
Page 56
Thank You for Your Attention
Powerpoint Templates
Page 57