HBV DNA定量检测
上海交通大学医学院
刘湘帆 讲师
PCR基因的原理
一、PCR技术的发展及原理
 1971年，Kleppe等人首次在文章中准确、客
观地阐述了PCR方法。
 1985年，美国PE-Cetus公司的Kary
人发明PCR技术。
Mullis等
PCR原理
 PCR技术的本质是体外核酸扩增，加热使
双链DNA解开螺旋，在退火温度条件下引
物同模板DNA杂交，在Taq DNA聚合酶，
dNTPs，Mg2+和合适pH缓冲液存在条件
下延伸引物，重复 “变性→退火→引物延
伸”过程至25-40个循环，呈指数级扩大待
测样本中的核酸拷贝数。
PCR的基本原理
PCR基因扩增仪的工作原理
PCR基因扩增仪的工作原理
PCR基因扩增仪工作关键是温度控制
荧光实时定量PCR（real-time quantitative
PCR,RQ-PCR）
 技术在PCR反应体系中加入特异性的荧光
染料或探针，荧光信号的变化真实地反映
了体系中模板的增加，通过检测荧光信号，
从而实时监测整个PCR反应过程，最后通
过标准曲线对未知模板进行定量分析。

荧光定量PCR（fluorescence quantitative PCR,FQ-
PCR），又称实时PCR，是目前较精确的进行定量检测
PCR的方法

FQ-PCR通过荧光信号对PCR过程中产物量进行实时监
测，精确计算出PCR的初始模板量

荧光定量PCR是融合了PCR高灵敏性、DNA杂交高特
异性和光谱分析的精确性，直接检测扩增过程中双链
DNA荧光信号的变化以获得定量的结果。

系统内装置有半导体PCR、卤钨灯光源激发荧光信号、
光栅分光、超低温光电耦合器（CCD）摄象机收集荧
光信号、计算机软件分析系统等。

荧光定量PCR检测的是
样本的初始浓度，而
准确测定初始浓度需
要在对数期进行。
荧光定量PCR在每一次循环
后对进行实时监控，因此
能最准确反映出对数期。
确定准确的初始浓度。
软件系统可以进行参
数设定、保存数据和
报告结果，并将结果
自动保存在计算机中。
The software displays the
fluorescence signals in real-time
immediately after each
measurement. Signals from the
samples are obtained as the
machine positions the capillaries
sequentially over the optical unit.
During thermal cycling, fluorescence
can be measured once per cycle for
every capillary and the fluorescence
values are displayed immediately on
the screen and updated after every
cycle (Fig.3). The generated data are
stored for further analysis.
相同模板进行96次扩增的扩增曲线图。

①荧光定量技术要求在低浓度坏境。因为荧光检测定
量原理是在忽略分子间相互作用的情况下建立的。如
果分子浓度高了，影响作用很复杂，而PCR扩增产物是
高浓度的，因此重复性变差也很容易理解。

②由于扩增末期，扩增效率可能因为大量的靶序列而
产生不可控的影响。
Ct值，C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义
是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历
的循环数。Ct值分析实际上就是低浓度的荧光值分析。
由于是低浓度，影响因素小，所以具有良好的重现性。
研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数
的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。
利用已知起始拷贝数的标准
品可作出标准曲线，其中横
坐标代表起始拷贝数的对数，
纵坐标代Ct值。因此，只要
获得未知样品的Ct值，即可
从标准曲线上计算出该样品
的起始拷贝数。
荧光信号的检测方法：
1、DNA结合染料技术
2、水解探针技术（TaqMan probe）技术
3、杂交探针技术
4、分子信标
缺点：存在非特异性产物，
可以与非特异性产物，甚至
引物二聚体结合发出荧光。
可以使用熔点曲线分析进
行鉴别，明显提高诊断的
特异性。（F1通道）
The biggest disadvantage of
SYBR is that it binds to any
dsDNA; the specific product,
non-specific products and
primer dimers are detected
equally well. The LightCycler
Instrument allows melting
curve analysis Once the
melting point of the product
has been determined the
LightCycler Instrument's
flexible programming allows
the user to acquire
fluorescence above the
melting temperature of the
primer dimers, but below the
melting temperature of the
product.
2、TaqMan水解探针技术
杂交探针技术对PCR产物定量又称荧光共振能量转移，FRET
需要一对引物和一对探针，探针A的3`端为荧光染料供体；探
针B的5`端作为荧光染料受体。2个探针首尾相连，仅差一个
碱基。检测在退火时进行。
荧光定量PCR技术的优点
1）定量准确，实时监控
2） 敏感性和特异性高
3）简单快速，30个循环20几分
钟就能够完成。
4）污染可能性小
5）不需要常规的产物后期复杂
处理，直接观测结果
6）可以进行点突变分析，根据
熔点曲线的不同直接分析点突
变的情况。
Advantages of the LightCycler
System
Watch amplification as it occurs:
real-time, on-line fluorescence
allows you to see the results of
every cycle as soon as PCR
proceeds
Save time: extremely rapid PCR,
20 minutes for 30 cycles
Verify
amplicon
specificity:
melting curve analysis provides
differentiation
between
amplification products
Detect mutations: changes in the
melting curve analysis can be
used to identify mutations
Minimize
contamination:
amplification and detection are
performed in the same closed tube
Figure 3. Mutation detection by melting curve analysis. Top panel: melting
curves of amplified gene fragments from wild-type and mutant individuals.
Bottom panel: negative first derivatives of the melting curves showing the
unique melting peak of each genotype. The gene fragment amplified from
the heterozygous individual exhibits a melting curve with both the wildtype and mutant peaks (red plot).
HBV的定量检测
标本：病人血清200μl
检测：HBV病毒核酸载量
检测样本：阳性对照、阴性对照、空白对照
标准品、病人HBV DNA
检测步骤：HBV DNA提取； 荧光定量
PCR； 结果分析
定量PCR方法：TaqMan水解探针技术
标准品扩增曲线
标准曲线
报告结果： HBV DNA拷贝数/ml，
如 6.20×106拷贝数/ml或6.20 E +06
参考范围：最小检测值，5×102拷贝数/ml（5E+02）