ΜΑΘΗΜΑ ΕΤΥ-494
«ΕΙΣΑΓΩΓΗ ΣΤΗΝ ΒΙΟΪΑΤΡΙΚΗ ΜΗΧΑΝΙΚΗ»
Τμήμα Επιστήμης και Τεχνολογίας Υλικών, Σχολή Θετικών Επιστημών,
Πανεπιστήμιο Κρήτης
Δρ. Γεώργιος Βλαστός (E-mail: vlastos@materials.uoc.gr)
Ιστοσελίδα Μαθήματος: http://www.materials.uoc.gr/courses/ETY494
Βιοϊατρική Μηχανική Βλαστοκυττάρων. Μέρος Β: Κλινικές Εφαρμογές
Αναπαραγωγικές στρατηγικές οργάνων
2

Έμφυτα βλαστοκύτταρα, όπως αίμα, έντερο, δέρμα, μυϊκός ιστός

Παραγωγή ώριμων κυττάρων, όπως συκώτι, αγγεία

Συνδυασμός των παραπάνω, όπως συκώτι, αγγεία
Η έρευνα στα βλαστοκύτταρα ανοίγει νέους ορίζοντες
στην Αναπαραγωγική Ιατρική και στη Μηχανική Ιστών
3


Η εναπόθεση και καλλλιέργεια κυττάρων πάνω σε ικριώματα (πολυμερή η
φυσικά υλικά), δημιουργεί νέους η αναπαραγάγει ελαττωματικούς ιστούς για
θεραπευτικούς σκοπούς. Η κατασκευή μοσχευμάτων χωρίζεται σε 2 φάσεις:
1η φάση: Δημιουργία σκευάσματος ιστού in vitro με τοποθετώντας τα επιλεγμένα
κύτταρα και το ικρίωμα σε ένα μεταβολικά και μηχανικά υποστηρικτικό
περιβάλλον με θρεπτικό μέσο (βιοαντιδραστήρας), ώστε τα κύτταρα να
πολλαπλασιαστούν και να αναπτύξουν εξωκυτταρικό χιτώνα.

2η φάση: Εμφύτευση του σκευάσμαστος στην αντίστοιχη ανατομική θέση, όπου η
αναδιαμόρφωση in vivo προσβλέπει στην ανάκτηση της κανονικής δομικής
αρχιτεκτονικής του οργάνου η ιστού.

Οι βασικές διαδικασίες που λαμβάνουν χώρα στις παραπάνω 2 φάσεις είναι:
α) Κυτταρικός πολλαπλασιασμός και διαφοροποίηση.
β) Παραγωγή και οργάνωση του εξωκυτταρικού χιτώνα.
γ) Αποδόμηση του ικριώματος.
δ) Αναδιαμόρφωση και δυναμική αύξηση του ιστού
Εφαρμογές βλαστοκυττάρων στην Καρδιοαγγειακή
Μηχανική Ιστών
4




Βαλβίδες καρδιάς
Αγγειακά μοσχεύματα
Μυοκάρδιο
Απ’ευθείας έγχυση βλαστοκυττάρων στην καρδιά
Μηχανικές δυνάμεις και εμβρυακή εξέλιξη
5



Η αλληλεπίδραση μηχανικού και βιοχημικού σήματος φαίνεται να παίζει ένα όλο
και μεγαλύτερο ρόλο απ’ ότι φανταζόμασταν. Ένα παράδειγμα γι’ αυτό είναι το
πρόσφατο εύρημα ότι η ροή του αίματος παίζει σημαντικό ρόλο στην καρδιακή
μορφογένεση του εμβρύου.
Σε έμβρυα ψαριών (zebrafish) βρέθηκε ότι η αποφρακτική ροή στην καρδιά,
επηρεάζει τον καρδιακό κύκλο και την δημιουργία των βαλβίδων.
Οι παραπάνω μηχανικές δυνάμεις ροής μπορεί να προκαλούν καρδιακή
ανεπάρκεια (congenital heart disease ) ακόμα και σ’ ένα γενετικά ομαλό
υπόβαθρο, ενώ είναι γνωστό μέχρι τώρα ότι η καρδιακή ανεπάρκεια σχετίζεται
με γενετικές ανωμαλίες κατά την μορφογένεση.
Ανάλυση της καρδιακής ροής σε έμβρυο με την τεχνική της
ψηφιακής απεικονιστικής ταχυτομετρίας σωματιδίων
6
Digital Particle Image Velocimetry (DPIV) analysis of
fluid flow
(A) A typical 2-D plane of a fluid jet seeded with reflective
particles is illuminated with by a pulsed laser. Note the
2-cm diameter central jet and the way it is rolling up into
a torus.
(B) Velocity vector field representing the cross-section from
A. The warmer (e.g., red) vectors indicate higher velocity
flow and cooler vectors (e.g., blue) low velocity flow. (C–
D) High-velocity blood flow generated by a 4.5-dpf
embryonic zebrafish heart. Pictures are characteristic
confocal sections from a single time series of Bodipyceramide stained embryos.
(C) Atrial systole and ventricular filling.
(D) Ventricular systole leading to refilling of the atrium.
(E–F) Overlay of DPIV velocity fields from real-time, high-speed
imaging.
(E) Complex flow in the filling ventricle with higher velocity
flow at the atrio-ventricular constriction. (F) High-velocity
trans-aortic jet through the ventriculo-bulbal valve during
systole. a, atrium; b, bulbus arteriosus; v, ventricle; vbv,
ventriculo-bulbal valve.
JR Hove, Ped. Res. ,2006
Ενδοκαρδιακά σχήματα ροής σε έμβρυο ψαριού
zebrafish 4.5 ημέρες μετά την γονιμοποίηση 4.5 η.μ.γ.)
7

Υπολογίστηκε ότι οι διατμητικές τάσεις στο
τοίχωμα της καρδιάς του εμβρύου
κυμαίνονται από 2.5 dyn/cm2 27 ώρες (μ.γ.)
μέχρι 76 dyn/cm2 4.5 (η.μ.γ.).

Είναι γνωστό ότι διατμητικές τάσεις
μικρότερες της 1 dyn/cm2 έχουν ανιχνευτεί
σε ενδοθηλιακά κύτταρα in vitro και
αλλάζουν το γενετικό προφίλ των κυττάρων.

Μεγαλύτερες διατμητικές τάσεις της τάξης
των 8-15 dyn/cm2 προκαλούν
αναδιοργάνωση του κυτταρικού σκελετού.

Στην αναπτυσσόμενη καρδιά του εμβρύου
στο πρώιμο και στο αργότερο στάδιο,
ασκούνται διατμητικές τάσεις πολύ πιό
πάνω από αυτές που αισθάνονται τα
καρδιακά ενδοθηλιακά κύτταρα in vitro.

Άρα συμπεραίνουμε ότι οι διατμητικές
δυνάμεις ροής του αίματος παίζουν
σημαντικό ρόλο στην διαδικασία της
καρδιογένεσης του εμβρύου.
JR Hove, Nature 2003 (http://www.nature.com/nature/journal/v421/n6919/suppinfo/nature01282.html)
Η μηχανική κυκλική διέγερση (cyclic stretch) αλλάζει τη μορφολογία και το
φαινότυπο σε πρόδρομα κύτταρα του μυελού των οστών (BMPC) σε
τρισδιάστατο περίβλημα φιβρίνης
8
Σκοπός είναι η δημιουργία
βιοαντιδραστήρων για
διαφοροποίηση αυτόλογων
κυττάρων σε κύτταρα του
λείου μυϊκού ιστού
•Κυκλικό τέντωμα 10%
•Συχνότητα ταλάντωσης 1 Hz
•Διάρκεια: 6 μέρες (μετά από
2 μέρες στατική επώαση)
Nieponice et al. J BiomedMater Res 81A: 523–530, 2007
Συσκευή τεντώματος κυττάρων
FLEXCELL® FX-4000T™ Tension Plus™ System
9
Computer-regulated bioreactor that
applies cyclic or static tensile strains to
cells cultured in vitro.
Uses regulated vacuum pressure to
deform flexible-bottomed culture
plates producing up to 30% substrate
elongation.
Η μηχανική διέργεση ίσως δρα συμπληρωματικά στο βιοχημικό σήμα που από
μόνο του δεν αρκεί για να διαφοροποιήσει τα κύτταρα του μυελού των οστών σε
κύτταρα του λείου μυϊκού ιστού και να διατηρήσει τον συσταλτικό φαινότυπό τους
10
Αύξηση παραγόντων στα κύτταρα
που υποδηλούν διαφοροποίηση
σε λείο μυϊκό ιστό,όπως
κολλαγόνο και smooth muscle αactin και h1-calponin
Nieponice et al. J BiomedMater Res 81A: 523–530, 2007
Figure: Stress filament analysis. Cells within
the free float control group (A) are randomly
organized, while the cells within the static
stress group (B) and cyclic strain group (C)
are aligned parallel to direction of the stress
or strain (arrow) providing an organized
structure with the surrounding matrix.
Quantitative analysis of the F-actin stain (D)
indicates an increase in the stress filament
area per cell in the constrained compared to
the unconstrained samples and constrained/
stretched samples significantly increased
this response (n=4). For (A–C): Green = Factin filaments, Blue=Nuclei,
Magnification=x40, Insets=x100. Scale bar
(white)=10 mm.
Διαφοροποίηση εμβρυονικών βλαστοκυττάρων με τη
μέθοδο των «κρεμάμενων σταγόνων» (hanging drops
method)
11
Dr. A.K. Hatzopoulos,
Vanderbilt University
Τα εμβρυϊκά
σωματίδια (embryoid
bodies) παρέχουν τη
δυνατότητα
επιλεκτικής
διαφοροποίησης
εμβρυονικών
βλαστοκυττάρων
(embryonic stem
cells)
Τα κύτταρα του μυελού των οστών μπορούν να μετατραπούν
σε διάφορους κυτταρικούς τύπους
12
Αιματικά Κύταρα
Νευρικά
Κύτταρα
Ηπατοκύτταρα
Αιματοποιητικά
Βλαστοκύτταρα
(HSC)
Ενδοθηλιακά
κύτταρα
Κύτταρα
σκελετικού
μυϊκού ιστού
Καρδιομυοκύτταρα
Κύτταρα λείου
μυϊκού ιστού
Πηγές και τρόποι έγχυσης βλαστοκυττάρων για
θεραπεία της καρδιάς
13
Sources of cells for cardiac repair, and routes
of their administration.


Dimmeler et al., J. Clin. Invest. 115:572–583, 2005
Cells in current human trials include skeletal
muscle myoblasts, unfractionated bone
marrow, and circulating (endothelial)
progenitor cells. Cells in preclinical studies
include bone marrow MSCs, multipotent cells
from other sources, and novel progenitor or
stem cells discovered in the adult
myocardium.
(B) Existing trials use intracoronary delivery
routes (over-the- wire balloon catheters),
intramuscular delivery via catheters (e.g.,
the NOGA system for electromechanical
mapping), or direct injection during cardiac
surgery.
Κλινικές μελέτες με ενδοστεφανιαία έγχυση προδρόμων
βλαστοκυττάρων σε ασθενείς με έμφραγμα του μυοκαρδίου
14
Dimmeler et al., J. Clin. Invest. 115:572–583, 2005
Κλινικές μελέτες με έκχυση προδρόμων βλαστοκυττάρων
από καθετήρα σε ασθενείς με έμφραγμα του μυοκαρδίου
15
Dimmeler et al., J. Clin. Invest. 115:572–583, 2005
Προβλήματα που έχουν παρουσιαστεί σε κλινικές
μελέτες με χρήση βλαστικών κυττάρων σε ανθρώπους
16

Aρρυθμίες

Σε βάθος χρόνου:

Όχι καλή διαφοροποίηση των βλαστοκυτάρων

Ασβεστοποίηση (calcification)

Αθηροσκλήρωση

Απομακρυσμένο homing των βλαστοκυτάρων
Προοπτικές κυτταρικών θεραπειών της καρδιάς
17
Figure: Current challenges for cell-based therapy in cardiac repair include identifying the origins of the novel cardiac
progenitor and stem cells found within the heart, pinpointing the biologically active cells from bone marrow and other mixed
populations, optimizing cell mobilization and homing, augmenting grafted cells’ survival, defining the cues for cardiac
differentiation, promoting donor cell proliferation ex vivo (or, if safe, in vivo), and exploiting cell therapy as a platform for
secretory signals.
Dimmeler et al., J. Clin. Invest. 115:572–583, 2005
Τα εμβρυϊκά ενδοθηλιακά πρόδρομα κύτταρα (eEPC)
αλληλεπιδρούν με το ενδοθήλιο των όγκων και επικάθονται
κυρίως σε υποξικές μεταστάσεις και όχι σε κανονικά όργανα
18

(A) Tumor blood vessels before cell injection after
contrast enhancement with FITC-conjugated
dextran. Arrows indicate direction of microvascular
blood flow.

(B–E) Intravital microscopic sequence of two
DiIlabeled eEPCs (1 and 2) interacting with the vessel
wall of the identical vascular segment indicated in A.
Cells adhere either permanently (1) or temporarily
(2) to the endothelium. Numbers depict sequential
time points in seconds (top right).
Vajkoczy et al. J. Exp. Med., 2003
Τα εμβρυϊκά ενδοθηλιακά πρόδρομα κύτταρα (eEPC)
συνεισφέρουν μόνο 2%-5% στη δημιουργία νέων αγγείων
19
The contribution of endothelial progenitor cells
to tumor neoangiogenesis opens new ways to
hinder tumor growth. Embryonic endothelial
progenitor cells (eEPCs) show a remarkably
efficient and specific affinity for disseminated
lung metastases without the need of prior
irradiation and bone marrow transplantation.
They particularly targeted hypoxic lung
metastases that are often resistant to
chemotherapy or radiation therapy. Homing of
eEPCs to normal tissues was low and without
adverse effects or formation of
teratocarcinomas. eEPCs can be expanded
indefinitely, are easy to manipulate ex vivo, and
appear to be immunoprivileged.
These results suggest that embryonic EPCs
constitute clinically relevant cellular vehicles for
systemic gene therapy of lung metastases.
Ηοst blood vessels
Donor eEPC
Merge
Wei et al. Cancer Cell, 2004
Ανοσολογική-ιστοχημική ανίχνευση εμβρυϊκών ενδοθηλιακών
πρόδρομων βλαστοκυττάρων σε προκλινική μελέτη έγχυσης
τους σε χοίρους με έμφραγμα του μυοκαρδίου
20
Kupatt et al. Circulation, 2005
Μείωση της στένωσης σε προκλινική μελέτη έγχυσης
εμβρυϊκών ενδοθηλιακών πρόδρομων βλαστοκυττάρων σε
χοίρους με έμφραγμα του μυοκαρδίου
21
Μείωση της στένωσης
Μείωση της φλεγμονής
Kupatt et al. Circulation, 2005
Πως επηρεάζουν τα βλαστοκύτταρα το περιβάλλον
τους;
22

Δημιουργούν νέα αγγεία

Επιδρούν καταλυτικά στην επιδιόρθωση των ιστών μέσω:

Αγγειογένεσης

Μείωσης του κυτταρικού θανάτου

Αύξησης της κυτταρικής επιβίωσης

Μείωσης της φλεγμονής

Αντικαθιστούν τον τραυματισμένο ιστό

Αποκαθιστούν την λειτουργία των οργάνων

Στοχεύουν τον ισχαιμικό ιστό

Βελτιώνουν τοπικά το περιβάλλον τους, δημιουργώντας πρόσφορες συνθήκες γιά
ανάπλαση των ιστών