Column Chromatography
พุทธรักษา วรานุศภุ ากุล
2302244 เคมีวิเคราะห์ 2
Column Chromatography


เป็ นเทคนิคทางโครมาโทกราฟี ที่มีรูปแบบของการบรรจุเฟสคงที่ในท่อปิ ด
เฟสคงที่และเฟสเคลื่อนที่ใน Column Chromatography



เฟสคงที:่ บรรจุอยู่ในท่อหรื อที่เรี ยกว่าคอลัมน์
เฟสเคลื่อนที:่ ไหลผ่านเฟสคงที่ในคอลัมน์ด้วยแรงดันหรื อแรงโน้ มถ่วง (gravity)
เทคนิคทาง Column Chromatography


Gas Chromatography (GC): ใช้ แก๊ สเป็ นเฟสเคลื่อนที่
Liquid Chromatography (LC): ใช้ ของเหลวเป็ นเฟสเคลื่อนที่
เฟสคงที่
column
2
Gas Chromatography
Gas Chromatography (GC)



ในเทคนิคนี ้สารที่ต้องการแยกจะถูกเปลี่ยนให้ อยู่ในสถานะแก๊ ส แล้ วผ่านเข้ า
คอลัมน์เพื่อเกิดการแยกโดยอาศัยการพาไปของเฟสเคลื่อนที่ทเี่ ป็ นแก๊ ส
แก๊ สที่เป็ นเฟสเคลื่อนทีจ่ ะเป็ นแก๊ สเฉื่อยและไม่ทาปฏิกิริยากับสาร ทาหน้ าที่เป็ นตัวพา
สารให้ ผ่านคอลัมน์ไปอย่างเดียว ดังนัน้ ในเทคนิค Gas Chromatography จึงนิยมเรี ยก
แก๊ สที่เป็ นเฟสเคลื่อนทีน่ ี ้ว่าแก๊ สพา (carrier gas)
แก๊ สโครมาโทกราฟี แบ่งออกได้ เป็ น 2 วิธี คือ


Gas-liquid chromatography (GLC)
 การกระจายตัว (partitioning) ของสารระหว่างแก๊ สพากับเฟสคงที่ของเหลวที่เคลือบอยูบ
่ นผิวของ
solid support หรื อที่ผนังของแคพพิลลารี คอลัมน์
Gas-solid chromatography (GSC)
 เฟสคงที่เป็ นของแข็งที่สามารถดูดซับ (physical adsorption) สารที่เป็ นแก๊ สซึง่ ต้ องการแยกได้ เช่น
molecular sieves, silica gel, alumina, activated carbon เป็ นต้ น
4
องค์ ประกอบของเครื่ อง GC
Injector
Detector
Carrier gas
Column
Recorder
and Data
processing
5
องค์ ประกอบของเครื่อง GC
เครื่ องโครมาโทกราฟ (GC) ประกอบด้ วยส่วนหลักๆ 5 ส่วน คือ
 แก๊ สพา (carrier gas) - มีถงั บรรจุแก๊ สพาและส่วนควบคุมการไหลของแก๊ ส
 ส่วนฉีดสารตัวอย่าง (injector) - ส่วนที่นาสารเข้ าสูค
่ อลัมน์เพื่อทาการแยก
 คอลัมน์ (column) - วางอยูใ่ นตู้อบ (oven) ที่สามารถปรับอุณหภูมิได้ รวดเร็ ว
 ส่วนการตรวจวัด (detector) - ทาการตรวจวัดสารแต่ละชนิดที่ถก
ู แยกออกมา
 ส่วนการประมวลผล (recorder and data processing)
6
แก๊สพา (Carrier Gas)

แก๊ สที่ใช้ เป็ นแก๊ สพาจะต้ องไม่วอ่ งไวต่อการทาปฏิกิริยา
(chemically inert)


การปรับอัตราเร็ วของแก๊ สพา ทาโดยปรับความดันของ
แก๊ สซึง่ ควบคุมด้ วย pressure regulator


แก๊ สที่นิยมใช้ ได้ แก่ He, N2, H2, และ Air
Inlet pressure: 10-50 psi (above room pressure)
อัตราเร็ วของแก๊ ส (volumetric flow) ที่ใช้ ในเทคนิค GC


Bubble flow meter
สาหรับ packed column: 25-150 mL/min
สาหรับ capillary column: 1-25 mL/min
Two-stage gas
regulator
7
ชนิดของแก๊สพา (carrier gas)

เมื่อทาการเปลี่ยนความเร็วหรื ออัตราเร็ วของ
แก๊ สพาที่ผ่านคอลัมน์ ผลกระทบต่อ
ประสิทธิภาพคอลัมน์ในการใช้ แก๊ สพาแต่ละ
ชนิดจะไม่เท่ากัน

ไนโตรเจนเป็ นแก๊ สพาที่ให้ คา่ H ต่าสุด (ได้
ประสิทธิภาพคอลัมน์มากที่สดุ ) แต่ทาได้ ที่
ความเร็วของแก๊ สพาต่าๆ อีกทังช่
้ วงของค่า
ความเร็วแก๊ สที่ทาให้ ได้ ประสิทธิภาพในการ
แยกที่ดีแคบ

ไฮโดรเจนและฮีเลียมให้ คา่ Hopt ที่ความเร็วของ
แก๊ สที่สงู ทาให้ ทาการแยกสารได้ เร็วขึ ้น
8
Choice of carrier gas
Advantages
Hydrogen



Cheap
Gives the most time efficient
separation
Still very efficient at high gas
velocities ie. 60 cm/ sec
Disadvantages



Helium



Nitrogen



Very inert, will not react with
analytes
Gives a very time efficient
separation
Non flammable

Cheap
Very inert, will not react with
analytes
Non flammable



Can form an explosive mixture with
air
Some industries in some countries
have regulated AGAINST the use
of hydrogen
is a reductive gas
Expensive
A non-replenishable resource
Very slow velocity to achieve
good efficiency
Narrow range for maximum
efficiency
9
ความบริ สุทธิ์ของแก๊ ส





Carrier gas should contain less than
1ppm of oxygen, moisture, or other
trace contaminants
Carrier gas impurities can also
contribute to detector noise
Gas grade/Trap
Longer column lifetime
Less GC maintenance
10
เกรดของแก๊ส

Research grade




Trace analysis
< 1 ppm
Ultra-Pure Carrier grade




99.9999% total purity
Total impurities < 1ppm
Complete analysis of all contaminants
99.9995% total purity
total hydrocarbon < 0.5ppm
H2O, O2 each < 1ppm
1-1000 ppm
UHP/Zero grade



99.999% total purity
total hydrocarbon < 0.5ppm
H2O < 3.5ppm, O2 < 4ppm
> 1%
11
Gas Purity
A. Molecular Sieve Trap B. Hydrocarbon Trap C. Oxygen Trap
12
Traps
Molecular Sieve Trap
(moisture trap)
Hydrocarbon Trap
Oxygen Trap
13
Sample Injection System




Introduced as a plug of vapor with
suitable size
Slow injection or oversized samples
cause band spreading and poor
resolution
Microsyringes
Injection ports
14
Injection port

Carrier
gas
Septum

Septum
purge


Heated
injection port

50º C greater than boiling point of
the least volatile component
Sample size: L
Split mode (1:100)
Split/splitless mode
Autosampler
Vent
Inlet liner
Column
15
Vaporization Injectors

Basic design


a glass liner resides inside the heated,
metal injector body
Sample introduction


rapidly vaporizes as of high
temperature
carried by the movement of carrier
gas into the column
16
Microsyringes/ Autosampler
Gas-tight syringe
Microsyringe
Autosampler
17
Inlet Liners
18
Accessories: Vial, Septa and Caps
19
GC Column
20
Packed vs Capillary


Length: 2-50 m or more
Stainless steel, glass, fused silica, or Teflon
Packed Column
Open-tubular Column
(capillary column)
21
Packed Column

Glass or metals
2-3 m long, 2-4 mm i.d.
Densely packed with packing materials or solid support coated with
thin layer of stationary liquid phase
Diatomaceous earth

Size: 60-80 mesh (250-170 m) or 80-100 mesh (170-149 m)



22
Open Tubular Column


Better resolution – efficient mass transfer between gas and SP
Tubing – fused silica, glass, copper, stainless steel
23
Types of Open Tubular Column
Liquid phase
Solid support coated
with liquid phase
Porous
Adsorbent
Wall-coated Open Tubular Support-coated Open Tubular Porous Layer Open Tubular
(WCOT)
(SCOT)
(PLOT)
FSOT: Fused-silica open tubular column
24
Characteristics
Type of Column
FSOT
WCOT
SCOT
Packed
10-100
10-100
10-100
1-6
0.1-0.3, 0.53*
0.25-0.75
0.5
2-4
2000-4000
1000-4000
600-1200
500-1000
Sample size (ng)
10-75
10-1000
10-1000
10-106
Relative pressure
Low
Low
Low
High
Relative speed
Fast
Fast
Fast
Slow
Flexible
Yes
No
No
No
Chemical inertness
Best
Length (m)
ID (mm)
Efficiency (Plate/m)
*Megabore column
Poor
25
Stationary Phases

Low volatility, thermal stability, chemical inertness

Provide k and  within a suitable range

consider the polar characteristics of the analytes and select SP of
similar polarity
‘Like dissolves like’
26
Stationary Phases

Solid phase



Most uses for separation of low MW compounds and gases
Common SP: silica, alumina, molecular sieves such as zeolites, cabosieves,
carbon blacks
Liquid phase


Over 300 different phases are widely available
grouped liquid phases


Non-polar, polar, intermediate and special phases
Polymer liquid phase
27
Stationary Phase Polymers

Siloxane

Arylene

Polyethylene glycol
28
Liquid phases

Non-polar phase




Polar phase




Primarily separated according to their volatilities
Elution order varies as the boiling points of analytes
Common phases: dimethylpolysiloxane, dimethylphenylpolysiloxane
Contain polar functional groups
Separation based on their volatilities and polar-polar interaction
Common phases: polyethyleneglycol
Intermediate phase
29
Bonded and Cross-linked SP
Polymer chains
Cross-linking
Bonding
Fused silica tubing surface

Bonded and cross-linked SP provides long term stability, better reproducibility
and performance.
30
Common stationary phase coating for capillary
column
Composition
Polarity
Applicaitons
Temp limits
100% dimethyl polysiloxane
(Gum)
Nonpolar
Phenols, Hydrocarbons, Amines,
Sulfur compounds, Pesticides,
PCBs
-60oC to
325oC
100% dimethyl polysiloxane
(Fluid)
Nonpolar
Amino acid derivatives, Essential
oils
0oC to 280oC
5% diphenyl 95% dimethyl
polysiloxane
Nonpolar
Fatty acids, Methyl esters,
Alkaloids, Drugs, Halogenated
compounds
-60oC to
325oC
14% cyanopropyl phenyl
polysiloxane
Immediate
Drugs, Steroids, Pesticides
-20oC to
280oC
50% phenyl, 50% methyl
polysiloxane
Immediate
Drugs, Steroids, Pesticides, Glycols
60oC to 240oC
50% cyanopropylmethyl, 50%
phenylmethyl polysiloxane
Immediate
Fatty acids, Methyl esters, Alditol
acetates
60oC to 240oC
50% trifluoropropyl polysiloxane
Immediate
Halogenated compounds,
+Aromatics
45oC to 240oC
Polyethylene glycol – TPA
modified
Polar
Acids, Alcohols, Aldehydes
acrylates, Nitriles, Ketones
60oC to 240oC
Polyethylene glycol
Polar
Free acids, Alcohols, Ethers,
Essential oils, Glycols, Solvents
60oC to 220oC
31
32
Column Dimensions

Column Length: 10 – 60 m

Column Internal Diameter: 0.10 – 0.53 mm

Stationary Phase Film Thickness: 0.10 – 0.25 m
33
Detectors
Purpose of Detector
- Monitor the carrier gas as it emerges from the column
- Generate a signal in response to variation in its composition due
to eluted components.
35
Ideal Detector

Adequate sensitivity 10-8 – 10-15 g solute/s

Good stability and reproducibility

Linear response to analytes

Temperature range from room temperature to at least 400oC

Short response time

High reliability and ease of use

Similarity in response

Nondestructive of sample

Low background noise and ease of operation
36
Classification of Detectors
Concentration vs. Mass flow rate
 Selective vs. Universal
 Destructive vs. Nondestructive

37
Concentration vs. Mass Flow

Concentration-dependent detectors: TCD, ECD




normally non-destructive
can be used in series
make-up gas lower the response
Mass flow dependent detectors: FID, NPD, FPD



signal related to rate of solute molecules enter the detector
destructive
unaffected by make-up gas
38
Selective vs. Universal


Universal detectors: TCD

Detecting all solutes

Beneficial for qualitative screening
Selective detectors: ECD,NPD,FPD

Responds to particular types of compounds


common chemical or physical property
Enhances sensitivity for trace analysis
39
GC Detector
Type
Applicable samples
Typical detection limit
Flame ionization (FID)
Hydrocarbons
0.2 pg/s
Thermal conductivity (TCD)
Universal detector
500 pg/mL
Electron Capture (ECD)
Halogenated compounds
5 fg/s
Mass Spectometer (MSD)
Tunable for any species
0.25-100 pg
Nitrogen-phosphorous (NPD)
N, P compounds
Electrolytic conductivity (ELCD)
Compounds containing
halogens, S, or N
0.1 pg/s (P)
1 pg/s (N)
0.5 pg Cl/s
2 pg S/s
4 pg N/s
Photoionization (PID)
Compounds ionized by UV
Flame Photometric (FPD)
S, P compounds
Fourier Transform IR (FTIR)
Organic compounds
2 pg/C/s
10-100 pg (S)
1-10 pg (P)
0.2-40 ng
40
Flame Ionization Detector (FID)


Selectivity:

Compounds with C-H bonds

A poor response for some non-hydrogen containing organics (e.g.
hexachlorobenzene)
Fewer ions or none in flame


carbonyl, alcohol, halogen, and amine
Insensitive toward noncombustible gases such as H2O, CO2, SO2
and NOx
41
FID Assembly
42
Mass Spectrometer Detector (MSD)
MS with EI ion source, a quadrupole mass analyzer and a
continuous-dynode electron multiplier.
43
MSD Assembly
44
Hyphenated GC-MS
45
Liquid
Chromatography
Partition liquid chromatography
Adsorption liquid chromatography
Ion or Ion exchange chromatography
Size exclusion chromatography
Affinity chromatography
Chiral chromatography
Liquid Chromatography (LC)


สารที่ต้องการแยกผ่านเข้ าคอลัมน์เพื่อเกิดการแยกโดยอาศัยการพาไปของ
เฟสเคลื่อนที่ที่เป็ นของเหลว
Liquid Chromatography ที่ใช้ ในการวิเคราะห์ในปั จจุบนั มีดงั นี ้

Classical LC หรื อ Column LC


ใช้ อนุภาคที่มีขนาดใหญ่ (โดยทัว่ ไปประมาณ 100-250 m) บรรจุในคอลัมน์ที่มีเส้ นผ่าน
ศูนย์กลาง 1-5 เซนติเมตร
High Performance Liquid Chromatography (HPLC)


ใช้ อนุภาคที่มีขนาดเล็ก (โดยทัว่ ไปประมาณ 5-50 m) บรรจุในคอลัมน์ที่มีเส้ นผ่าน
ศูนย์กลาง 1-5 มิลลิเมตร
ใช้ high pressure pump ในการช่วยให้ เฟสเคลื่อนที่ไหลผ่านคอลัมน์
47
Liquid Chromatography (LC)
เทคนิค HPLC นิยมจาแนกตามกลไกการแยก ซึง่ มีดงั นี ้
 Partition liquid chromatography
Based on a partitioning of solutes between mobile phase and stationary phase (solute diffuses into the
interior of stationary phase)
 Adsorption liquid chromatography
Based on an adsorption of solutes onto the surface of solid stationary phase which is called adsorbent.
 Ion or Ion exchange chromatography
Based on an exchange between solute ions in mobile phase and ions of like charge associated with the
stationary phase surface
 Size exclusion chromatography
Based on a physical sieving process
 Affinity chromatography
Based on specificity of analyte-stationary phase interactions
 Chiral chromatography
Based on a chiral selector
48
Partition chromatography


Bonded phase packing: organosilane
Normal phase



Highly polar SP, relatively non-polar MP
Least polar component is eluted first; increasing polarity of MP decreases elution time
Reversed phase


Non-polar SP, relative polar MP
Most polar component eluted first; increasing polarity of MP increases elution time
49
Normal phase
50
Reversed Phase
51
องค์ ประกอบของเครื่อง HPLC
52
องค์ ประกอบของเครื่อง HPLC
เครื่ อง HPLC ประกอบด้ วยส่วนหลักๆ 6 ส่วน คือ
 ภาชนะบรรจุเฟสเคลื่อนที่ (Reservoir)
 ระบบปั๊ มสาร (pumping system) – ควบคุมการไหลของเฟสเคลื่อนที่
 ส่วนฉีดสารตัวอย่าง (injector) – นาสารเข้ าสูค
่ อลัมน์เพื่อทาการแยก
 คอลัมน์ (column)
 ส่วนการตรวจวัด (detector) – ทาการตรวจวัดสารแต่ละชนิดที่ถก
ู แยกออกมา
 ส่วนการประมวลผล (recorder and data processing)
53
เฟสเคลื่อนที่

เฟสเคลื่อนที่ก่อนผ่านเข้ าคอลัมน์จะต้ องทาการไล่อากาศที่
ละลายอยู่




เพราะออกซิเจนที่ละลายอยู่อาจทาปฏิกิริยากับเฟสเคลื่อนที่บางชนิดได้
หรื อแม้ กบั เฟสคงที่ที่บรรจุในคอลัมน์
ลดโอกาสที่จะทาให้ เกิดฟองอากาศในระบบ
เทคนิคที่นิยมใช้ ในการไล่อากาศ
 การผ่านเครื่ อง degasser ก่อนผ่านเฟสเคลื่อนที่เข้ าปั๊ ม
 การ purge ด้ วยแก๊ สเฉื่อย เช่น ฮีเลียม ในภาชนะที่บรรจุเฟสเคลื่อนที่
ระบบของการแยกในเทคนิค HPLC มี 2 mode ตามลักษณะการ
ใช้ เฟสเคลื่อนที่คือ


Isocratic – การแยกโดยใช้ องค์ประกอบของเฟสคงที่แบบเดียวตลอด
การแยก
Gradient elution – การแยกโดยมีการเปลี่ยนองค์ประกอบของเฟสคงที่
ในระหว่างการแยกแบบต่อเนื่องหรื อแบบทีละขัน้ (stepwise)
54
Pumping system





Generate pressure up to 6000 psi
Pulse free output
Flow rates: 0.1-10 mL/min
Flow reproducibility
Resistance to corrosion
Screw-driven syringe pump
Reciprocating pump
Pneumatic pump
55
Pumping System



ปั๊ มที่นิยมใช้ ใน HPLC คือ ปั๊ มแบบชักลูกสูบ
(reciprocating pumps)
หลักการทางานคือ ก้ านสูบ (piston) ของปั๊ ม
จะเคลื่อนที่เข้ าออกตลอดเวลาเมือ่ ลูกสูบ
เคลื่อนที่เข้ าจะเป็ นการดันเฟสเคลื่อนที่ให้ เข้ า
สูคอลัมน์ และเมื่อเคลื่อนออกจะดึงเอาเฟส
เคลื่อนที่จากภาชนะที่บรรจุ (reservoir) เข้ าสู่
ลูกสูบผ่าน check valve
การควบคุมการไหลของเฟสเคลื่อนที่ทาโดย
การปรับอัตราเร็วของการชักลูกสูบ
56
Reciprocating pump
57
Sample Injection System

นิยมใช้ microsampling valve

Sampling loop: 5-500 L
58
Autosampler
59
Columns สาหรับ HPLC

Stainless steel tubing


Micro column


10-30 cm, 2-5 mm i.d., Packing: 3-10 m particle size, 40,000 – 60,000 plates/m
3-7.5 cm, 1-4.6 mm i.d., 3 or 5 m particle size, 100,000 plates/m
Silica particles coated with thin organic films which are chemically or physically
bonded to the surface, alumina particles, porous polymer, ion-exchange resin
60
HPLC Columns
61
Guard Column



Positioned ahead of analytical column
Remove particulate matter and contaminants
Increase the life time of the analytical column
62
Detector

Low dead volume: minimize extra column band broadening







UV-Vis
Fluorescence
Electrochemical
Refractive index
Conductivity
Mass Spectrometry
FT-IR
From column
Light Source
Flow Cell
Detector
To waste
63
UV-Vis Detectors
Diode-Array UV-Vis
UV-Vis
64
Fluorescence Detector
65
Refractive Index
Deflection detector
Reflective detector
66