Biochemistry Lab
Course Philosophy and Guide
This  document  is  to  serve  as  a  guide  to  help  you  find  your  way  through  this  lab.    It  is  NOT  the  answer  to  “what  do  I  need  to  do   now?”.    That  answer  is  for  you  to  provide,  or  at  least  search  for.    This  guide  is  meant  to  point  you  in  the  right  direction  and  give  you
the  bigger  picture  of  what  your  semester  will  be.    There  are  several  phases  to  the  semester.
:    You  will  form  groups  of  two,  work  as  a  team  to  learn  the  structure,  function  and  important  characteristics  of   malate  dehydrogenase  (MDH).    You  will  research  MDH,  chose  a  clone  of  MDH,  create  a  hypothesis  on  the  structure  or  function  of
MDH,  design  an  amino  acid  mutation  to  test  your  hypothesis,  express  and  purify  your  protein  then  test  your  hypothesis.
Depending  on  the  project  and  progression  of  the  project  you  could  even  publish  your  work!    Although  it  may  take  a  few  semesters   for  that  to  happen.
Over  the  first  few  weeks  you  will  learn  how  to  conduct  typical  modern  biochemical  techniques  in  the  lab  and   in  silico   (computer   analysis).    The  ultimate  goal  of  the  semester  is  for  you  to  learn  to  think  critically,  creatively  and  independently  as  a  newly  minted   biochemist!    You  will  be  provided  a  list  of  affinity  tagged  6XHis-­‐MDH  clones  to  select  from.    What  you  do  will  be  up  to  your  scientific   curiosity.  The  concept  is  to  learn  about  the  enzyme  and  then  using  the  scientific  process,  create  a  hypothesis  and  test  it.    There  are   many  different  possibilities  including  questions  on  the  enzymes’  substrate  specificity,  kinetic  characteristics,  subunit  composition,
and  thermal  stability.    You  will  research  these  aspects  of  MDH,  design  and  mutate  the  MDH  gene  and  test  your  hypothesis.
Block  I:  Basic  skills  and  concepts     o Pipetting,  buffer  preparation,  pH  meters,  dilutions,  laboratory  safety,  statistical  analysis  of  data,  protein  analysis,   spectrophotometric  and  plate  reader  basics…
Block  II:  Bioinformatics  and  structural  training   o Protein  and  gene  database  searching  and  homology  analysis   o Pymol  training  and  workshop  (video  and  independent  work)
Block  III:  Introduction  to  structure  and  function  of  MDH/LDH  hypothesis  and  proposal  design   o MDH  enzyme  assay  introduction  (continuous  and  stop  time).   o Introduce  MDH/LDH  concepts,  literature  searching,  critical  analysis  of  reaction  mechanism  and  critical  amino  acids,   identification  of  other  important  MDH  features  (protein  interaction,  substrate  specificity,  inhibitor  design,  structural   stability…)   o Provide  general  ideas  for  projects  (including  potential  list  of  project  ideas).
Block  IV:  Molecular  Biology  of  MDH/LDG  -­‐  Site  directed  mutagenesis;  design  and  preparation     o Determination  of  oligonucleotides  for  site  directed  mutagenesis   o PCR  mutagenesis  of  MDH  /  LDH   o Bacterial  transformation,  plasmid  isolation  and  analysis
Block  V:  Protein  expression  and  purification   o Workshop  introduction  to  advanced  techniques  in  protein  expression  and  purification   o Students  will  design  expression  optimization  of  MDH  (wt)  in   e.  Coli  using  temp,  time  and  or  induction.    Analysis  using  SDS
PAGE  and  enzyme  assay.    Using  these  results,  students  will  plan  mid  scale  expression  and  purification  of  their  MDH  clones   o Analysis  of  purified  protein,  straight  forward  kinetics,  SDS  PAGE,  Western  blot  and  purification  table
Block  VI:    Independent  Experiment   o Students  will  work  and  meet  with  faculty  mentor  (instructor)  to  set  up  benchmarks  and  minimum  project  expectations   o End  with  presentation/paper/poster  of  the  project.
:  One  of  the  most  difficult  aspect  of  this  semester  will  be  coming  up  with  your   scientific  idea  /  hypothesis.    Remember,  your  work  is  to  be  a  research  project.    Research  can  be  simply  described  as  creating  new   knowledge.    Simply  repeating  what  another  scientist  has  published  is  not  research.    Your  idea  must  be  based  on  a  scientific   observation  (either  your  research  or  a  published  observation(s)).    To  assist  you  with  the  creation  of  your  hypothesis  and  design
your  experiment,  we  have  created  the  following  guidance.

Biochemistry Lab
Course Philosophy and Guide
1)  Background  and  the  scientific  project:
The  first  thing  you  need  to  do  is  to  learn  about  the  protein  you  will  be  working  with.    The  easiest  way  to  do  this  is  to  answer  a   handful  of  questions.       o What  is  MDH?   o What  reaction  does  it  catalyze?/What  is  the  function  of  MDH  in  the  cell?       o What  is  the  molecular  weight  of  the  enzyme?    Is  MDH  a  monomer  or  does  it  have  several  subunits?   o Is  the  enzyme  regulated?   o What  are  the  domains  /  key  amino  acids  for  binding  the  substrate  and  the  reaction?   o Is  there  more  than  one  isozyme?    What  are  the  differences  between  enzymes  from  various  sources?   o What  are  the  aa  and  /  or  nucleotide  sequence  for  the  protein?
Now  you  should  be  asking  yourself,  how  the  heck  do  I  find  this  information?    Information  of  this  sort  isn’t  found  in  a  textbook.    And   that  is  exactly  the  point.    Very  little  of  what  you  need  after  college  is  in  a  textbook.    The  information  comes  primarily  from   publications  and  databases.    There  is  a  ton  of  information  out  there  and  the  strong  will  learn  how  to  separate  and  scan  all  of  the   data.    So  your  first  task  it  to  answer  these  questions  by  searching  pub  med  and  other  literature  and  internet  sources.
Now  that  you  have  already  determined  what  MDH  is,  what  it  does  (both  reaction  and  function  in  metabolism),  it  is  time  to  decide   which  clone(s)  and/or  mutation  you  will  be  working  on  for  the  semester.  The  list  of  available  wild-­‐type  and  mutation  clones  is   posted  on  the  web-­‐site.    Choose  at  least  one  wild-­‐type  and  one  mutant  you  wish  to  create.    If  you  have  a  group  of  three  then  pick   at  least  a  total  of  three.    That  way  each  person  will  have  one  clone  to  work  on  their  own  and  still  work  in  a  group.
QUESTIONS/POINTS  of  CONSIDERATION :    Now  start  thinking  about  what  tests  you  will  perform  to  examine  the  hypothesis  once   you’ve  isolated  the  mutant  and  wild-­‐type  protein.    From  the  papers  and  the  information  you’ve  collected  you  start  the  scientific   process.    Start  with  an  observation  about  the  enzyme(s)  (this  will  come  from  the  literature),  create  a  scientific  question  and  then  a
hypothesis.     Look  up  the  scientific  process !    Now  how  will  you  test  your  hypothesis.    You  should  be  thinking  of  general  ideas  not   minutia  at  this  time.
You  will  be  asked  to  turn  in  your  scientific  question,  hypothesis  and  a  rough  idea  on  how  you  will  test  your  hypothesis.    Select  the
MDH  and  the  mutation  you  will  create  to  test  the  hypothesis.    The  point  is  not  to  get  a  “correct”  answer,  but  rather  to  allow  your   instructor  to  help  you  along  in  the  process.    You  MUST  chose  your  mutation  based  on  published  observations  and  support  your   concept  with  these  observations.
To  finish  the  design  of  your  experiments  and  polish  your  hypothsis  you  will  need  to  understand  the  structural  elements  of  MDH.  To   do  that  you  will  learn  how  to  search  and  align  amino  acid  and  nucleotide  sequences,  find  and  manipulate  three  dimensional
structure  of  the  protein  using  a  web-­‐based  program.    This  will  come  from  an  in-­‐class  tutorial.
2)  Creating  the  Mutant:
Now  it  is  time  to  generate  the  point  mutation(s)  of  your  MDH.    So  that  we  can  get  to  the  expression  and  analysis  part  of  the   laboratory,  we  will  do  this  as  a  “virtual  mutation”.    One  of  the  most  popular  methods  to  create  a  point  mutation  is  to  use  the
Stratagene  Quickchange  kit.    There  will  a  link  on  the  class  page  to  this  manual.
3)  Expression  and  Purification  of  the  wild-­‐type  and  mutant  protein:
In  the  beginning  of  the  semester,  you  will  learn  how  to  transform  e.Coli,  induce  protein  expression,  lyse  cells  and  purify  your   clone(s).    Now  you  will  put  that  information  to  work,  designing  your  own  protocol  to  purify  50-­‐250  ml  of  induced  bacterial  culture   for  each  of  your  clones.  You  will  then  prepare  a  lysate  of  the  soluble  protein,  purify  the  protein  and  then  conduct  your  enzymatic   characterization.    The  enzyme  should  be  highly  expressed  and  enzyme  experiments  can  be  done  with  lysates  and  /  or  purified   protein.    The  ideal  method  is  of  course  to  purify  the  protein  then  do  the  enzymatic  experiments.    However  if  you  are  working  on  a   poster,  and  are  stressed  for  time,  I  have  been  told  that  using  the  lysates  can  give  pretty  good  results.    Go  ahead  and  jump  to  the   next  phase  after  you  have  the  lysates.  You  can  do  the  purifications  after  the  characterization.    Get  authorization  for  this  before
jumping  to  using  lysate  material.
As  you  work  through  this  block,  please  consider  the  following:
What  is  an  inducer?    Why  would  one  want  to  determine  the  conditions  for  expression?
Indicate  a  rough  timeline  and  materials  that  you  will  need.

Biochemistry Lab
Course Philosophy and Guide
Indicate  who  will  do  what?    I  suggest  that  preparation  of  the  materials,  buffers  ect.,  is  broken  out   to   different  members  of  the  group  and  EACH  person  purifies  their  own  enzyme.    In  the  outline  indicate  how  you  will  determine   how  much  enzyme  you  have  purified,  how  you  will  know  where  the  enzyme  is  and  how  you  will  assess  the  purity  of  the   protein.
§ You  should  do  a  protein  assay,  enzymatic  assay  and  or  a  SDS-­‐PAGE  gel  of  each  fraction.    The  protein  assay  and  enzyme   assay  protocols  are  linked  on  the  web  page.    It  is  important  to  ask  what  each  measurement  is  for  and  what  it  tells  you   about  your  sample/prep.    What  is  the  level  of  enzyme  activity  compared  to  total  protein?    How  many  other  proteins  are  in   my  sample?
§ Also  remember  that  the  mutation  that  you  made  may  or  may  not  have  significantly  altered  the  enzymatic  activity.    Be   certain  that  the  first  enzyme  assay  you  do  is  with  a  sample  that  is  known  to  have  activity.    There  will  be  stock  MDH  in  the   freezer  in  small  tubes.    Thaw  one  out  and  use  it  for  the  enzyme  assay.
§ The  concentration  of  enzyme  in  the  induced  lysates  is  very  likely  to  be  very  high.    I  found  I  had  to  dilute  between  100  to
1000  fold  from  the  lysate  before  I  could  get  a  rate  that  was  acceptable.    Read  the  Enzyme  Assay  Guide  for  more   information.
§ I  have  also  prepared  a  solution  of  lysate  that  is  diluted  enough  for  a  good  assay.    Use  that  as  your  assay  check.
§ The  bottom  line  for  this  phase  is  to  have  grown  up  both  the  mutant  and  wild  type  enzymes,  prepare  an  induced  lysate  for   each  and  purify  the  recombinant  protein.
4)  Characterization  of  you  mutant  with  the  wild  type  enzyme.
Now  that  you  have  both  purified  and  crude  extracts  (lysates)  of  your  protein,  it  is  time  to  see  if  your  mutations  did  what  you   hypothesized.  How  will  you  measure  what  you  are  looking  for?    Are  you  looking  for  a  change  in  Km  or  Vmax  for  NADH,  NAD +  OAA   or  Malate?    Are  you  looking  at  substrate  specificity  (fumarate,  lactate,  citrate,  pyruvate  or  other  carboxylic  acids  or  even  NADPH)?
Heat  stability?    What  about  the  ability  of  the  enzyme  to  form  dimers?    How  are  you  going  to  do  this?    First,  look  at  the  papers  that   you  started  with.    There  should  be  plenty  of  information  on  how  they  measured  the  enzymatic  activity.    There  are  also  plenty  of   sources  on  the  web  and  in  the  library.
Finally  -­‐
§ Do  the  experiments!.
§ Don’t  forget  to  review  the  data!    Don’t  fall  into  the  trap  of  analyzing  the  results  later.    You  will  never  know  what  worked  or   didn’t  and  needs  to  be  repeated  this  way.
§ HAVE  FUN,  your  doing  science,  doing  biochemistry!