Supplementary Information for
Characterisation of novel α-keratin peptide markers for species identification in
keratinous tissues using mass spectrometry
Caroline Solazzo1, 2, 3 *, Marc Wadsley1, Jolon Dyer2, 4, 5, Stefan Clerens2,
Matthew Collins1 and Jeffrey Plowman2
1
BioArCh, Biology (S Block), Wentworth Way, University of York, York YO10 5DD, UK
2
AgResearch, Proteins and Biomaterials, Lincoln Research Centre, Private Bag 4749,
Christchurch, NZ 8140
3
Smithsonian’s Museum Conservation Institute, 4210 Silver Hill Road, Suitland, MD 20746,
USA
4
Biomolecular Interaction Centre, School of Biological Sciences, University of Canterbury,
Private Bag 4800, Christchurch 8140, New Zealand
5
Riddet Institute, Massey University, PB 11 222, Palmerston North 4442, New Zealand
1
Supplementary tables:
S1: List of hair keratins by species available in the public database (NCBI) with accession numbers
and taxonomy. All peptides markers mentioned in the main manuscript were searched with BLAST
(Basic Local Alignment Search Tool from NCBI, http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) for identity
in available species.
Table S2: Some variations in the diagnostic type I peptide compared to the K31 sheep peptide
(in some K31 to K35 proteins of major families).
Table S3: Protein hits in sheep horn, cattle horn, horse hoof, baleen IL and OL, porcupine and
White rhinoceros filaments and shavings (with alkylation of Cysteine +58 Da). Proteins
reported have >2 unique peptides of score >30. Protein name, accession number, species
identified, score, number of peptides score >30 and sequence coverage (%). 1analysis on
maXis: peptide mass tolerance (MS) of 20 ppm and fragment mass tolerance (MS/MS) of 0.1
Da. False positive rate in % of peptide matches above identity threshold.
S4: MS/MS results for baleen, porcupine, rhinoceros horn, sheep horn, cow horn and horse
hoof.
Creation of the theoretical database, p4
Supplementary figures, p18:
S1: sheep horn (top) compared to sheep wool of the Wensleydale breed (reversed spectrum)
with main peaks annotated
H1: horse hoof (to) compared to horse hair (reversed spectrum) with main peaks annotated
Baleen
B1: Peptide GLCGTTGGVSR m/z 533.2464 doubly charged (Mr 1064.4783), from baleen IL (ESI)
B2: Peptide LESEITTYR m/z 556.2750 doubly charged (Mr 1110.5354), from baleen IL (ESI)
B3: Peptide LNVEVDAAPTEDLNR m/z 1655.8431 singly charged (MALDI) from baleen IL
B4: Peptide TVHALEVELQAQHNLR m/z 1857.9356 singly charged (MALDI) from baleen IL
B5: Peptide SQQQDPLVCPNYQSYFR m/z 710.9874 doubly charged (Mr 2129.9402), from baleen
OL (ESI)
B6: Peptide YSSQLAQIQGLIGNVEAQLSEIR m/z 2517.3342 singly charged (MALDI) from baleen
OL
Porcupine
2
P1: Peptide YNTELSLR m/z 498.2405 doubly charged (Mr 994.4664), from porcupine quill (ESI)
P2: Peptide LEAAVTQSEQQGEAALNDAK m/z 1036.9762 doubly charged (Mr 2071.9378), from
porcupine quill (ESI)
P3: Peptide SQQQEPLLCPSYQAYFR m/z 2115.9946 singly charged (MALDI) from porcupine quill
P4: Peptide KSDLEANAEALIQEIDFLR m/z 2175.1758 singly charged (MALDI) from porcupine
quill
P5: Peptide YSSQLSQVQALISNVEAQLAEIR m/z 2547.3854 singly charged (MALDI) from
porcupine quill
P6: Peptide YSSQLSQVQCLISNVEAQLAEIR m/z 2637.3957 singly charged (MALDI) from
porcupine quill
Rhinoceros
R1: Peptide ISSGYSVTR m/z 485.3083 doubly charged (Mr 968.6020), from rhinoceros shavings
(ESI)
R2: Peptide LNVEVDAAPSVDLNK m/z 792.5757 doubly charged (Mr 1583.1368), from rhinoceros
shavings (ESI)
R3: Peptide TVNALEIELQAQQSTR m/z 601.1088 triply charged (Mr 1800.3046), from Rhinoceros
shavings (ESI)
R4: Peptide QVVSSSEQLQSYQVEILEMR m/z 785.2061 triply charged (Mr 2352.5966), from
rhinoceros shavings (ESI)
R5: Peptide YSSQLAQVQGLITSVESQLAEIR m/z 840.9409 triply charged (Mr 2519.8009), from
rhinoceros shavings (ESI)
R6: Peptide YSSQLAQVQGMISNVESQLAEIR + deamidation m/z 851.6142 triply charged (Mr
2551.8207), from rhinoceros shavings (ESI)
R7: Peptide YSSQLAQMQGLITNVEAQLAEIR m/z 855.1359 triply charged (Mr 2562.3859), from
rhinoceros shavings (ESI)
3
Creation of the theoretical database
Based on the ClustalX alignments for type I and type II proteins (see below), tryptic peptides
were created as follow:
Sequence 1
Sequence 2
Sequence 3
Frequency
ABCDK
ACCDK
ABDCK
12221
The frequency is given by the number of observed substitutions at a given position, after
alignment of the keratins from a same family (for instance K31). In this simple example, the
set of residues to work with is [(A)(B,C)(C,D)(D,C)(K)] where we take a letter from each
round bracket in order to build our new sequence. Every possible sequence is built from that
set, redundant sequences are removed and sequences are concatenated to form an entry for
our database representing that position in the alignment for that protein:
>protein1_1
ABCDKABCCKABDDKABDCKACCDKACDDKACCCKACDCK
4
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20
30
40
50
60
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K31 Rattus norvegicu
K31 Mus musculus
K31 Oryctolagus cuni
K31 Homo sapiens
K31 Equus caballus
K31 Canis lupus
K31 Ovis aries
K31_var1 Ovis aries
K31 Bos taurus
1
1
1
1
1
1
1
1
1
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K31 Rattus norvegicu
K31 Mus musculus
K31 Oryctolagus cuni
K31 Homo sapiens
K31 Equus caballus
K31 Canis lupus
K31 Ovis aries
K31_var1 Ovis aries
K31 Bos taurus
61
61
61
61
61
61
61
61
61
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K31 Rattus norvegicu
K31 Mus musculus
K31 Oryctolagus cuni
K31 Homo sapiens
K31 Equus caballus
K31 Canis lupus
K31 Ovis aries
K31_var1 Ovis aries
K31 Bos taurus
121
121
121
121
121
121
121
121
121
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K31 Rattus norvegicu
K31 Mus musculus
K31 Oryctolagus cuni
K31 Homo sapiens
K31 Equus caballus
K31 Canis lupus
K31 Ovis aries
K31_var1 Ovis aries
K31 Bos taurus
181
181
181
181
181
181
181
181
181
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K31 Rattus norvegicu
K31 Mus musculus
K31 Oryctolagus cuni
K31 Homo sapiens
K31 Equus caballus
K31 Canis lupus
K31 Ovis aries
K31_var1 Ovis aries
K31 Bos taurus
241
241
241
241
241
241
241
241
241
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K31 Rattus norvegicu
K31 Mus musculus
K31 Oryctolagus cuni
K31 Homo sapiens
K31 Equus caballus
K31 Canis lupus
K31 Ovis aries
K31_var1 Ovis aries
K31 Bos taurus
299
301
301
301
301
301
301
301
301
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K31 Rattus norvegicu
K31 Mus musculus
K31 Oryctolagus cuni
K31 Homo sapiens
K31 Equus caballus
K31 Canis lupus
K31 Ovis aries
K31_var1 Ovis aries
K31 Bos taurus
359
361
361
361
361
361
361
361
361
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140
150
160
170
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K32 Equus caballus
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K32 Bos taurus
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K32 Rattus norvegicu
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K32 Equus caballus
K32 Canis lupus
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K32 Mus musculus
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K32 Equus caballus
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K32 Homo sapiens
K32 Sus scrofa
K32 Rattus norvegicu
K32 Mus musculus
289
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K32 Equus caballus
K32 Canis lupus
K32 Bos taurus
K32 Oryctolagus cuni
K32 Homo sapiens
K32 Sus scrofa
K32 Rattus norvegicu
K32 Mus musculus
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K33a Ovis aries
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K33b Ovis aries
K33A Bos taurus
K33B Rattus norvegic
K33b Mus musculus
K33A Rattus norvegic
K33a Mus musculus
K33A Oryctolagus_cun
K33a Canis lupus
K33b Canis_lupus
K33a Homo sapiens
K33b Homo sapiens
K33a Equus caballus
K33a Equus caballus
K33b Sus scrofa
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K33b Mus musculus
K33A Rattus norvegic
K33a Mus musculus
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K33b Canis_lupus
K33a Homo sapiens
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K33a Equus caballus
K33a Equus caballus
K33b Sus scrofa
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K33A Bos taurus
K33B Rattus norvegic
K33b Mus musculus
K33A Rattus norvegic
K33a Mus musculus
K33A Oryctolagus_cun
K33a Canis lupus
K33b Canis_lupus
K33a Homo sapiens
K33b Homo sapiens
K33a Equus caballus
K33a Equus caballus
K33b Sus scrofa
141
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141
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141
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K33a Homo sapiens
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K33a Equus caballus
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K33a Mus musculus
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K33a Homo sapiens
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K33a Equus caballus
K33b Sus scrofa
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281
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K33B Rattus norvegic
K33b Mus musculus
K33A Rattus norvegic
K33a Mus musculus
K33A Oryctolagus_cun
K33a Canis lupus
K33b Canis_lupus
K33a Homo sapiens
K33b Homo sapiens
K33a Equus caballus
K33a Equus caballus
K33b Sus scrofa
351
351
351
330
351
351
351
351
351
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K36 Bos taurus
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K36 Bos taurus
K36 Sus scrofa
K36 Equus caballus
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K36 Bos taurus
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K40 Equus caballus
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K40 Equus caballus
K40 Canis lupus
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K40 Homo sapiens
K40 Rattus norvegicu
K40 Mus musculus
K40 Oryctolagus cuni
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201
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K40 Equus caballus
K40 Canis lupus
K40 Bos taurus
K40 Homo sapiens
K40 Rattus norvegicu
K40 Mus musculus
K40 Oryctolagus cuni
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K40 Equus caballus
K40 Canis lupus
K40 Bos taurus
K40 Homo sapiens
K40 Rattus norvegicu
K40 Mus musculus
K40 Oryctolagus cuni
K40 Sus scrofa
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K40 Equus caballus
K40 Canis lupus
K40 Bos taurus
K40 Homo sapiens
K40 Rattus norvegicu
K40 Mus musculus
K40 Oryctolagus cuni
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Alignment of K81 proteins using ClustalX
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K82 Bos taurus
K82 Equus caballus
K82 Mus musculus
K82 Rattus norvegicu
K82 Homo sapiens
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K82 Homo sapiens
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K82 Bos taurus
K82 Equus caballus
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K82 Rattus norvegicu
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119
119
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.
K82 Bos taurus
K82 Equus caballus
K82 Mus musculus
K82 Rattus norvegicu
K82 Homo sapiens
K82 Canis lupus
K82 Sus scrofa
179
179
179
156
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179
179
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K82 Bos taurus
K82 Equus caballus
K82 Mus musculus
K82 Rattus norvegicu
K82 Homo sapiens
K82 Canis lupus
K82 Sus scrofa
239
239
239
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241
239
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K82 Bos taurus
K82 Equus caballus
K82 Mus musculus
K82 Rattus norvegicu
K82 Homo sapiens
K82 Canis lupus
K82 Sus scrofa
299
299
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K82 Bos taurus
K82 Equus caballus
K82 Mus musculus
K82 Rattus norvegicu
K82 Homo sapiens
K82 Canis lupus
K82 Sus scrofa
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359
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K82 Bos taurus
K82 Equus caballus
K82 Mus musculus
K82 Rattus norvegicu
K82 Homo sapiens
K82 Canis lupus
K82 Sus scrofa
419
419
419
396
421
419
419
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K82 Bos taurus
K82 Equus caballus
K82 Mus musculus
K82 Rattus norvegicu
K82 Homo sapiens
K82 Canis lupus
K82 Sus scrofa
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479
479
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474
479
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Alignment of K82 proteins using ClustalX
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K83 Ovis aries
K83 Bos taurus
K83 Sus scrofa
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K83 Ovis aries
K83 Bos taurus
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K83 Mus musculus
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K83 Ovis aries
K83 Bos taurus
K83 Sus scrofa
K83 Homo sapiens
K83 Oryctolagus cuni
K83 Rattus norvegicu
K83 Mus musculus
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180
180
180
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.
.
.
.
.
K83 Ovis aries
K83 Bos taurus
K83 Sus scrofa
K83 Homo sapiens
K83 Oryctolagus cuni
K83 Rattus norvegicu
K83 Mus musculus
240
240
240
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240
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K83 Bos taurus
K83 Sus scrofa
K83 Homo sapiens
K83 Oryctolagus cuni
K83 Rattus norvegicu
K83 Mus musculus
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300
300
301
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.
.
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.
.
K83 Ovis aries
K83 Bos taurus
K83 Sus scrofa
K83 Homo sapiens
K83 Oryctolagus cuni
K83 Rattus norvegicu
K83 Mus musculus
360
360
360
360
361
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. . . .
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. . . .
. . . .
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. . . .
K83 Ovis aries
K83 Bos taurus
K83 Sus scrofa
K83 Homo sapiens
K83 Oryctolagus cuni
K83 Rattus norvegicu
K83 Mus musculus
420
420
420
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K85b Sus scrofa
K85a Canis lupus
K85 Equus caballus
K85 Homo sapiens
K85a Oryctolagus cun
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K85 Mus musculus
K85b Bos taurus
K85b Canis lupus
K85b Oryctolagus cun
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K85 Equus caballus
K85 Homo sapiens
K85a Oryctolagus cun
K85 Rattus norvegicu
K85 Mus musculus
K85b Bos taurus
K85b Canis lupus
K85b Oryctolagus cun
K85a Sus scrofa
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66
66
66
66
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66
66
66
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K85 Equus caballus
K85 Homo sapiens
K85a Oryctolagus cun
K85 Rattus norvegicu
K85 Mus musculus
K85b Bos taurus
K85b Canis lupus
K85b Oryctolagus cun
K85a Sus scrofa
136
136
136
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136
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136
136
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K85 Equus caballus
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K85a Oryctolagus cun
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K85 Mus musculus
K85b Bos taurus
K85b Canis lupus
K85b Oryctolagus cun
K85a Sus scrofa
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206
206
206
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K85b Oryctolagus cun
K85a Sus scrofa
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276
276
276
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K85 Ovis aries
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K85 Equus caballus
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K85 Rattus norvegicu
K85 Mus musculus
K85b Bos taurus
K85b Canis lupus
K85b Oryctolagus cun
K85a Sus scrofa
346
346
346
346
346
346
346
346
346
346
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342
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K85 Ovis aries
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K85 Equus caballus
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K85 Rattus norvegicu
K85 Mus musculus
K85b Bos taurus
K85b Canis lupus
K85b Oryctolagus cun
K85a Sus scrofa
416
416
416
416
379
416
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416
416
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K85 Ovis aries
K85a Bos taurus
K85b Sus scrofa
K85a Canis lupus
K85 Equus caballus
K85 Homo sapiens
K85a Oryctolagus cun
K85 Rattus norvegicu
K85 Mus musculus
K85b Bos taurus
K85b Canis lupus
K85b Oryctolagus cun
K85a Sus scrofa
483
486
486
486
435
486
486
458
486
473
475
469
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K86c Mus musculus
K86d Mus musculus
K86e Mus musculus
K86a Mus musculus
K86 Rattus norvegicu
K86 Canis lupus
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K86c Oryctolagus cun
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K86e Mus musculus
K86a Mus musculus
K86 Rattus norvegicu
K86 Canis lupus
K86a Oryctolagus cun
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K86b Mus musculus
K86c Mus musculus
K86d Mus musculus
K86e Mus musculus
K86a Mus musculus
K86 Rattus norvegicu
K86 Canis lupus
K86a Oryctolagus cun
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Alignment of K86 proteins using ClustalX
17
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Supplementary figures
S1: sheep horn (top) compared to sheep wool of the Wensleydale breed (reversed spectrum)
with main peaks annotated
H1: horse hoof (to) compared to horse hair (reversed spectrum) with main peaks annotated
18
B1: Peptide GLCGTTGGVSR m/z 533.2464 doubly charged (Mr 1064.4783), from baleen IL (ESI),
with carboxymethylation of Cysteine
B2: Peptide LESEITTYR m/z 556.2750 doubly charged (Mr 1110.5354), from baleen IL (ESI)
19
B3: Peptide LNVEVDAAPTEDLNR m/z 1655.8431 singly charged (MALDI) from baleen IL
B4: Peptide TVHALEVELQAQHNLR m/z 1857.9356 singly charged (MALDI) from baleen IL
20
B5: Peptide SQQQDPLVCPNYQSYFR m/z 710.9874 doubly charged (Mr 2129.9402), from baleen
OL (ESI), with carboxymethylation of Cysteine
B6: Peptide YSSQLAQIQGLIGNVEAQLSEIR m/z 2517.3342 singly charged (MALDI) from baleen
OL
21
P1: Peptide YNTELSLR m/z 498.2405 doubly charged (Mr 994.4664), from porcupine quill (ESI)
P2: Peptide LEAAVTQSEQQGEAALNDAK m/z 1036.9762 doubly charged (Mr 2071.9378), from
porcupine quill (ESI)
22
P3: Peptide SQQQEPLLCPSYQAYFR m/z 2115.9946 singly charged (MALDI) from porcupine
quill, with carboxymethylation of Cysteine
P4: Peptide KSDLEANAEALIQEIDFLR m/z 2175.1758 singly charged (MALDI) from porcupine
quill
23
P5: Peptide YSSQLSQVQALISNVEAQLAEIR m/z 2547.3854 singly charged (MALDI) from
porcupine quill
P6: Peptide YSSQLSQVQCLISNVEAQLAEIR m/z 2637.3957 singly charged (MALDI) from
porcupine quill, with carboxymethylation of Cysteine
24
R1: Peptide ISSGYSVTR m/z 485.3083 doubly charged (Mr 968.6020), from rhinoceros shavings
(ESI)
R2: Peptide LNVEVDAAPSVDLNK m/z 792.5757 doubly charged (Mr 1583.1368), from rhinoceros
shavings (ESI)
25
R3: Peptide TVNALEIELQAQQSTR m/z 601.1088 triply charged (Mr 1800.3046), from Rhinoceros
shavings (ESI)
R4: Peptide QVVSSSEQLQSYQVEILEMR m/z 785.2061 triply charged (Mr 2352.5966), from
rhinoceros shavings (ESI)
26
R5: Peptide YSSQLAQVQGLITSVESQLAEIR m/z 840.9409 triply charged (Mr 2519.8009), from
rhinoceros shavings (ESI)
R6: Peptide YSSQLAQVQGLITSMESQLAEIR m/z 851.6142 triply charged (Mr 2551.8207), from
rhinoceros shavings (ESI)
27
R7: Peptide YSSQLAQMQGLITNVEAQLAEIR m/z 855.1359 triply charged (Mr 2562.3859), from
rhinoceros shavings (ESI)
28