中性低分子化合物輸送 Neutral low molecular-weight compounds
In addition to water molecule(H2O),
plant aquaporins can transports;
Substrate (researcher/paper)
• CO2 (Kaldenhoff’s group, Katsuhara’s group)
• Silica (Ma’s group)
• Boron (Fujiwara’s group)
• Glycerol (many works)
• H2O2 (JBC 282:1183)
• Ammonia (PMB 54:713)
• Arsenite (Ma, Katsuhara) and more…
CO2固定の律速段階
Limitting steps for CO2 fixation
leaf surface with stomata
Stomatal conductance
気孔透過性
intercellular space
cell walls
Internal conductance
葉内透過性
細胞へ（原形質膜で）の透過
an aquaporin in the plasma-membrane of a
mesophyll cell
cytoplasm
chloroplast
Tissue and cellular structures are not to scale
RuBisCO
炭酸固定酵素の効率
• CO2 permeability (Reported)
• Oocyte + micro-pH electrode
Ulreich et al. 2003 NtAPQ1
PIP cRNA
Micropipette
• Transgenic plants + CO2 conductance
Our group 2004 HvPIP2;1,
gas exchange and carbon isotope (C13/C12) ratio
Carbonicanhydrase:
CA（enzyme)
Micro pH
electrode
Aquaporin
Voltage
electrode
CO2
CO2 → HCO3- + H+ (pH変化検出)
CA
Need high throughput system → New yeast system
3
Screening system to identify aquaporins transporting CO2.
Aquaporin genes (Gal-inducebile)
CA - EGFP
アクアポリン遺伝子
Model examination
80
Acetic acid
70
60
0 min
5 sec
30 sec
1 min
2 min
酵母を用いたCO2 透過性スクリーニン
グ系。ターゲットのアクアポリンがCO2
を透過させれば、カーボニックアンヒド
ラーゼ（CA)が重炭酸イオンを生成して
細胞内が酸性化して、pH感受性GFP
の発光強度変化で検出できる。
RFU
50
40
30
20
10
0
480
500
520
540
560
nm
酢酸添加による細胞内pH低下が
GFP蛍光強度の変化で検出できた
イネ、オオムギ、シロイヌナズナのPIPsをスクリーニング
→ CO2透過活性をもつPIPを網羅的に検出
4
Experimental data
1 sec after addition of NaHCO3
Ｐｏｓｉｔｉｖｅ control (NtAQP1)
Fluorescence
蛍光強度（任意単位） →
Fluorescence
蛍光強度（任意単位） →
500
NaHCO3
F
ΔF
Δt
CA-EGFP
HvPIP2;1
T228M HvPIP2;1
490
480
470
460
450
0
0.6
0.4
0.2
Time (sec)
CA-EGFP
(No aquaporins)
NtAQP1
タバコアクアポリン
Nt-AQP1
(CO2透過性が既知のコントロール）
HvPIP2;1
オオムギPIPの一つ
HvPIP2:1
T228M HvPIP2;1
T228MHvPIP2;1
活性中心の２２８番目のThrをMetに
置換した不活性(inactive form)
0
0.1
0.2
0.3
(ΔF/F)/sec
0.4
0.5
0.6
0.8
1
genes
(ΔF/F)/sec
genes
(ΔF/F)/sec
genes
(ΔF/F)/sec
genes
(ΔF/F)/sec
No PIPs
0.34 ± 0.05
OsPIP2;1
0.43 ± 0.04
HvPIP1;1
0.50 ± 0.06
HvPIP2;1
0.43 ± 0.06
OsPIP2;2
0.37 ± 0.04
HvPIP1;2
0.37 ± 0.07
HvPIP2;2
0.34 ± 0.04
OsPIP2;3
0.33 ± 0.04
HvPIP1;3
0.31 ± 0.08
HvPIP2;3
0.43 ± 0.07
OsPIP2;4
0.34 ± 0.03
HvPIP1;4
0.37 ± 0.02
HvPIP2;4
0.35 ± 0.06
HvPIP1;5
0.35 ± 0.07
HvPIP2;5
0.31 ± 0.04
T228M
HvPIP2;1
0.33± 0.03
0.43 ± 0.05
NtAQP1
イネ(Os)
CO2透過性
オオムギ(Hv)
CO2透過性
OsPIP1;1
0.33 ± 0.05
OsPIP2;5
0.35 ± 0.03
OsPIP1;2
0.32 ± 0.03
OsPIP2;6
0.33 ± 0.04
OsPIP1;3
0.36 ± 0.05
OsPIP2;7
0.38 ± 0.05
OsPIP2;8
0.33 ± 0.04
PIP1;1 PIP1;2 PIP1;3 PIP2;1 PIP2;2 PIP2;3 PIP2;4 PIP2;5 PIP2;6 PIP2;7 PIP2;8 TIP1;1 TIP1;2 TIP2;1 TIP2;2 TIP3;1 TIP4;2 TIP5;1 NIP2;1 NIP2;2 NIP2:3 NIP3;2 NIP3;3
X
X
X
○
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
○
X
X
X
X
X
X
X
X
PIP1;1 PIP1;2 PIP1;3 PIP1;4 PIP1;5 PIP2;1 PIP2;2 PIP2;3 PIP2;4 PIP2;5 TIP1;1 TIP1;2 TIP2;1 TIP2;2 TIP2;3 TIP3;1 TIP4;1 TIP5;1 NIP1;1 NIP1;2 NIP2;1
○
X
X
X
X
○
X
○
X
X
○
X
X
X
X
○
X
X
○
X
X
（CO2透過性アクアポリン遺伝子）／（調べたアクアポリン遺伝子）
イネ ２／２３ オオムギ ６／２１
Future:
High photosynthetic activity via improvements of aquaporins
• Si permeability
(Siは耐病性と収量を向上させる）
Lsi1 →positional cloning→ OsNIP2;1
• Arsenite (As(OH)3) permeabiliyu DAcr3 yeast assay
No As(OH)3
5μM As(OH)3
pYES2
HvNIP1;1
HvNIP1;2
HvNIP2;1
HvNIP2;2
OsNIP1;1
OsNIP2;1
OsNIP2;2
OsNIP3;1
OsNIP3;2
OsNIP3;3
OsNIP4;1
Growth of yeast ΔACR3 expressing various NIP aquaporins
Aquaporins transporting
As(OH)3
As(OH）3
Lethal
Acr3
Oocytes assay (PNAS 105;9931)
LSi1=OsNIP2;1
Lsi6=OsNIP2;2
• H2O2 peramiablity
0 mM H2O2
H2O2 sensitive（Δskn7) yeast assay
0.25 mM H2O2
H2O2 signaling in plants is
essential for response to stress
defense against pathogens and
the regulation of programmed
cell death.
0.5 mM H2O2
0.75 mM H2O2
HvPIP2;4
HvPIP2;3
HvPIP2;5
HvTIP2;2
HvPIP2;2
HvPIP2;1
pYES2
(ベクター）
→ HvPIP2;5 and HvTIP2;2 probably transport H2O2
アクアポリン研究のアウトプット
Possible Applications
Two examples
Enhancement of growth
and stress tolerances
H2O, other molecules
Improving yield/quality in
flowers and fruits
Aquaporins
Crop improvements via aquaporin engineering
(activity, expression regulation…..)
Rice plants overexpressing PIPs
HvPIP2;1
Lpr ↑ but salt sensitive
（PCP 44:1378, 2003）
OsNAC6
RNAi (Rice) against PIP2s
乾燥ストレス（脱水）耐性強化イネ?
PIP2
PIP2
OsPIP2;4 ・・・
Lpr ↑
（Previously descried）
OsPIP1;1 ・・・
salt resistance ↑
seed germination ↑
(PPB 63:151, 2013)
乾燥ストレス誘導的に発現抑制
(PIP2をRNAiで抑制）
PIP expression・・・water uptake
Stress-induced
RNAi
Drought
Down-regulation
Preventing dehydration
Tolerance?
Not Yet Performed (まだできていない）
果実、花卉（Flowers and fruits)
CaM 35S
PIP2
P
生育旺盛に？
P
全身で過剰発現
名古屋大学共同研究
Nagoya university
シロイヌナズに導入
（リン酸化をmimicしたPIP2）
（うまく行かない）
Not good
恒常活性型
PIP2
CaM 35S
全身でに発現抑制
トマトに導入
高糖度で
日持ちの良い果実？
（PIP2のアンチセンス鎖）
恒常抑制型
PIP2
PIP2
InMYB1
花弁特異的に発現抑制
（PIP2をRNAiで抑制）
アサガオに導入
みずみずしい
花持ちの良い花き？
PIP2
PIP2
InMYB1
アサガオInMYB1上流 1 kb
In MYB1 gene
花弁特異的に発現抑制
（PIP2をRNAiで抑制）
「花弁特異的プロモーター」
特願2008-264646
白武勝裕，森本玲奈，
飯田滋，星野敦，森田将裕
Little delay?
PIP2
Knockdown
WT
PIP2
CaM 35S
全身でに発現抑制
（PIP2のアンチセンス鎖）
MicroTom
Model plant for
fruit study
形質転換体
16系統，41個体
No difference to date
Summary and future of aquaporin research
Profiling, physiological analysis
Mutants, transgenic
Hydraulic conductivity
T-DNA
Anti-sense／ＲＮＡｉ
4
HvPIP1;1
2
Relative ratio
HvPIP1;2
Overexpression
1
HvPIP1:3
1/2
HvPIP1;4
HvPIP1;5
Intracellular trafficking
1/4
HvPIP2;1
1/8
HvPIP2;2
HvPIP2;3
1/16
1h
2h
4h
8h
12 h
24 h
はるな二条 200 mM NaCl
Functional analyze
HvPIP2;4
HvPIP2;5
免疫前血清
Anti-OsPIP2;1 Anti-OsPIP2;5
Expression
(mRNA)
Molecular engeneering
OsPIP1;3(根) OsPIP1;3(根) OsPIP1;1(根)
イネの根組織および細胞
CO2 permeability
Si permeability
vs
Homo-tetramer Hetero-tetramer
Interaction
(heteromeriozation)
Expression
(Protein)
• Water stress tolerant crops
Structural analysis • High quality of flowers and fruits
Mutated aqauporins • Improvements of plant functions