프로바이오틱 유산균의 기능성 박명수1, 권 빈1.2, 조상희1, 염은미2, 김남주2, 김혜영2, 지근억1.2, ㈜비피도 연구소 2)서울대 식품영양학과 1) 지근억 배 경 Human large colon : Bacterial fermentor * Cell density = 10 11- 1012 CFU/ml * Volume = 6 Cm diameter x 1.5 m * Total bacterial number = 1014 cfu/ colon * Major products = short chain fatty acids, ammonia, methane, H2, amine, etc. * Host : control of medium * Who is harmful ? * Who is beneficial ? 장내 세균의 중량 : 1.0-1.5kg 장내 세균의 80%는 현재 배양 불가 Dr. Benno, Yoshimi Asian Conference on Lactic Acid Bacteria (2001) 배경 장내세균과 인체와의 관계 장내세균 • 혐기성 미생물의 서식장소 • 영양성분의 섭취 • 적정수준의 독성(예, Bacteroides) 을 발휘하여 인체를 공격 •독성이 강하여 인체에 큰 해를 입히는 균들은 도태 인 체 •세균의 대사산물 (저급 지방산)흡수하여 에너지 획득 (섭취열량의 10-15%) •식품섭취의 부족시 : 득 •식품섭취의 과잉시 : 실 •단백질, 지방 등은 대부분 세균에 의하여 분해되어 독성물질로 변환 •장내세균은 장관벽을 두텁게 하고 면역기 관을 발달 시킴 배경 인체의 대장 = 미생물 발효조 33세 여성의 변 50일된 유아의 변 63세 노인의 변 인체에 대한 장내 미생물의 영향 유해균/독성균 유익균 11 Bacteroides Bifidobacterium 장 부패 촉진 Eubacterium 8 발암물질 생성 Streptococcus 감염증과 설사 유발 C. perfringens Lactobacillus Staphylococcus Proteus 소화 촉진 장 부패 억제 E. coli 6 독성균에 대한 억제 작용 2 Log CFU/g feces 배경 Bacteroides, Eubacterium 11 Log counts / g feces 10 8 Bifidobacterium E. coli, Streptococcus 6 Lactobacillus 4 C. perfringens Birth Infants Maturity Aged 연령에 따른 장내 균총의 변화 (Mitsuoka) 인체에 유익한 비피더스균의 작용 설사 억제 변비 개선 유해균 억제 혈중 콜레스테롤 저하 장내 균총 비타민 합성 B2,B6,B12 비피더스균 유당 불내증 개선 면역 체계 항 종양 효과 소화작용 도움 I : 비피더스, 유산균 벡터 및 유용 유전자 발현 * 비피더스 Secretion 벡터 * 대장균 Secretion 벡터 * Leuconostoc 벡터 CORE TECHNOLOGY MCS GRAS promoter GRAS rep gene Bifidobacterium GRAS-host GRAS selection marker GRAS-vector GRAS : Generally Recognized As Safe BIFIDO Advantages of Bifidus system E.coli system Bifidus system DA AD AD 1. Long research history 1. Cellular toxicity (LPS) 1. GRAS 2. Well defined metabolic 2. Weak acid tolerance 2. Applicable to Food and pathway 3. Full genome-sequenced 3. Inevitable Purification process Pharmaceuticals 3. Purification is an optional step 4. Easy to manipulate 4. Weak secretion 4. Environment-friendly product 5. Mass culture and 5. Environmental 5. Strong secretion system Mass production contamination 6. Inapplicable to Food 6. Weak external protease activity 7. Possible to secure platform DA 1.Short research history 2. Poorly defined metabolic pathway 3. Absence of good expression system 4. Weak molecular breeding technique technology BIFIDO 비피더스 발현 시스템의 활용 예 형질전환 되지 않은 비피더스 형질전환 된 비피더스 BIFIDO Methods & Results Medium : Modified MRS except for phosphate reagent Cell extract : 9.5X concentration , Sonication Supernatant : Centrifugation OD405/ml culture Phytase Liquid Assay : Heinonen-Lahti Method 0.6 94% 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 6% 0.0 Cell Extract Supernatant Released phosphate Figure 1. Phytase assay measuring phosphate released by phytase 유산균 유전체 염기서열 결정 Species Bifidobacterium Breve Bifidobacterium longum Brevibacterium linins Lactobacillus acidophilus Lactobacillus bulgaricus Lactobacillus casei Lactobacillus gasseri Lactobacillus helveticus Lactobacillus johnsonni Lactobacillus plantarum Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus sakei Lactococcus lactis Leuconostoc mesenteriodes Oenococcus oeni Pediococcus pentosaceus Propionibacterium freudenreichii Streptococcus thermophilus No. of Strains Contry 1 2 1 1 3 2 1 1 1 1 1 1 4 2 2 1 1 3 England Swiss, USA USA USA France, USA USA, France USA USA Swiss Netherland New Zealand France France, Netherland,England, USA USA, Korea France, USA USA Netherland Belgium, France, USA 유산균 유전자 재조합체 •유산균을 이용한 건강 기능성 및 치료용 유전의 발현 •저칼로리 감미 소재 생산 균주 개발 - 알라닌, 소비톨, 만니톨, 타가토스 생산 균주 •비타민 생산 균주 개발 - 엽산, 리보플라빈, 비타민 B12 •치료용 유산균 - 염증 치료제인 인터루킨 생산 균주, 병원성 균주에 대한 항원 발현 백신용 균주 등 차별적 핵심 연구, 산업화, 공동 연구 유산균 유전자 벡터 및 발현 기술 의 원천 기술 확보 Bifidobacterium - E. coli shuttle vector Leuconostoc - E. coli shuttle vector E. coli secretion vector 발현 유전자 : cholesterol oxidase, phytase, endostatin, amylase 균체밖으로 90 % 이상 분비 II : 유용 생리활성 유산균 제품 개발 대장암 증가추이 1970년대 7위 1990년대 4위 2000년대 2위 출처 : (한국인 발생 대장암, 서울 삼성병원 연구과제) Probiotic Bifidobacterium Screening Healthy human subjects Selective screening Acid Bile Random screening Oxygen Bacteriocin Growth rate Antimutagenicity Sensory evaluation Immune modulation Intestinal colonization Product development & Evaluation 배 경 • 로타바이러스 : Reoviridae과에 속하며 어린이 및 유아의 급성소아장염유발 원인 바이러스로 1943년 Light와 Hodes에 의해 보고됨. • 서울 지역의 소아 설사군을 대상으로 설사 유발 원인을 조사한 결과 rotavirus가 설사군의 47%에서 검출되어 가장 높은 출현빈도를 나타내고 있으며 이는 세계보건기구의 통계치인 20%의 두배를 웃도는 수치임. • 작년 2001년도에 발생한 경기도 고양시 산후조리원의 영아 집단 사망의 원인은 로타바이러스로 밝혀져 대책이 시급함. • 1999년 미국에서 와이어스社(Wyeth)에 의해 로타바이러스 백신이 개발돼 식품의약청(FDA)의승인을 받은 적이 있지만 백신 투여 후 ‘장중첩 증상’ 등의 부작용이 있어 바로 허가가 취소돼 현재까지 세계적으로 부작용 없는 로타바이러스 백신은 없는 것으로 알려짐. • 최근 장내 유용 미생물을 이용한 로타바이러스의 억제에 관한 연구가 진행되고 있음 : probiotics의 경구투여시 로타바이러스성 설사의 강도와 기간을 줄여줌 현재까지는 백신등의 의약품 차원에서 연구가 되었으나 본 연구에서는 장에 천연적으로 존재하는 비피더스를 이용하여 안전하게 제어하고자 함 Screening for anitrotaviral bifidus 120 47 180 감염저해율 (%) 100 100 Inhibition ( %) 80 80 60 40 20 0 0 60 0.1 0.5 1 2 유산균 농도 (mg/ml) 40 IC50=0.05ug/ml 활성 단백질 분리 정제 20 0 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 Internal sequencing P rotein (mg/m l) PCR-cloning 3 CLA 정의 • Conjugated Linoleic Acid (CLA): Linoleic Acid 의 이성질체 (cis-9, trans-11) • Linoleic Acid 를 화학 합성하여 생산 (cis-9, trans-11; trans-10, cis-12) • Rumen Bacteria에서 의해 합성(cis-9, trans-11) • Linoleic Acid Isomerase 에서 의해 생화학적으로 합성(cis-9, trans-11) CLA 기능 항암 효과: Mouse 피부암, 전위암, 복수암 억제효과 항동맥 경화 효과: Hamster의 대동맥 경화증 발생억제 콜레스테롤 축적 저하 효과: 돼지 및 닭의 콜레스테롤 함량 저하 체지방 감소 효과: 인체의 체중 감소 항균 효과: 곰팡이 Aspergillus와 Rhizopus 생육저해, 식중독균Listeria와 Vibrio균 생육저해 항산화 효과: CLA 함유 돼지고기 및 닭고기에서 Thiobarbituric acid reactive substances(TBARS)의 생성 저하 및 저장성 증가 Continuous production of CLA from LA by immobilized L. reuteri in a packed-bed bioreactor Conjugated linoleic acid (mg/L) 140 120 100 80 60 40 20 0 0 4 8 12 16 Time (h) 50 mM Tris-HCl buffer as pH 7.5 and 0.05% LA at 25oC. CLA production in a packed-bed bioreactor () and replacement reaction in a test tube containing whole cell of L. reuteri (). Conjugated linoleic acid (mg/L) Continuous production of CLA from LA by immobilized enzyme in a packed-bed bioreactor 200 150 100 50 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Time (h) 50 mM Tris-HCl buffer as pH 7.5 and 0.05% LA at 25oC. CLA production in a packed-bed bioreactor of immobilized enzyme() and replacement reaction in a test tube containing free enzyme (). GABA의 작용 억제성 신경전달물질로서 혈압강하, 진정작용 등의 작용을 하고, 외에도 뇌혈류를 증가시켜 산소공급량을 많게 하고 뇌세포 대사기능을 활 발하게 하여 자율신경 실조증, 중풍과 치매예 방, 기억력증진, 불면증 등에도 효과를 인정받 고 있음. 그밖에 간기능 활성과 알콜대사 촉진 기능으로 숙취제거 음료에도 이용. 비만해소작용과 신장 기능 촉진작용도 보고되고 있음. GABA 생물계에서 Gluramate에서 이산화탄소가 빠져나가는 과정을 거쳐 효소로서 생성. 식물계에서는 Glutamate decarboxlyase와 함께 GABA가 널리 존재하고 있음이 오래전부터 알려져 있 었으나 동물에서는 뇌 속에 존재한다는 것이 1950년 에 처음 발견되었고, 특히 포유동물의 뇌 속에만 존재 하는 특이한 아미노산으로 이에 대한 다양한 작용들이 보고되고있음. 대다수의 유산균에서도 GABA가 생성되고 있는 것으 로 보이고, lactococcus lactis, lactobacillius brevis 등이 대표적. 특히 lactobacillius brevis경우 8개 중4 개의 strain이 GABA를 생산한다고 보고됨. Lactobacillus reuteri에 의하여 생산되는 루테린의 항균성 연속 공정에 의한 루테린 생산 Silicon tubing pump Glycerol solution collector Immobilized beads or free cell Incubator Fig.5. Bioreactor for production of reuterin by immobilized L. reuteri using agarose beads. The solution flow rate was about 0.45ml/min. 신제품 개발 사용균주 Bifidobacterium strains BGN-4 E2-18 E-15 JS-9 RD-54 SI SH-2 RD-60 B. bifidum ATCC 2952 CN2 SJ-32 KJ 해준 B. animalis ATCC 2552 B. adolescentis ATCC 15703 SH-5 B. infantis ATCC 15697 B.longum ATCC 15707 M-6 MS-1 Adherent bacteria 500 168 132 84 67 61 47 42 35 30 26 24 23 22 19 17 15 11 10 10 Mean numbers of adhering bifidobacteria per 50 Caco-2 cell 대장암 억제활성 – 균주의 선발 30종의 bifidobacteria 균주를 대상으로 배양액 및 균체의 활성을 측 정한 결과, 가장 뛰어난 대장암 증식저해활성을 가진bifidobacteria BGN4를 획득 Bifidobacterium sp. BGN4 Tumor Growth Inhibition (%) 80 60 40 20 0 l ro nt Co 1 BB 4 BB 5 BB 8 11 B20 B21 B22 B23 B24 B25 B29 B30 B31 B32 B33 B35 B39 B40 B42 B45 B46 B47 B50 B53 B54 B58 B68 B69 BB BB B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B Bifidobacterial Strains Electron scanning morphology of BGN4 • 30개의 bifidobacteria strain 중 가장 활성이 높은 strain으로서 BGN4를 선발 BGN4의 항암활성 80 80 Chang (IC50 (mg/ml) > 100) 60 NIH3T3 (IC50 (mg/ml) > 100) Cell Viability (%) 100 Cell Viability (%) of HT-29 100 60 40 (IC50 (mg/ml) > 100) HT-29 (IC50 (mg/ml) = 23) K-ras (IC50 (mg/ml) = 10) 0 Control 1x10 6 5x10 6 1x10 7 100 0 20 40 60 80 100 Concentration (mg/ml) of BGN4 Cell Extract BGN4 Cell Concentration (cells/ml) Cell Viability (%) of HT-29 40 20 20 0 HeLa IC50 (mg/ml) = 23 80 • BGN4의 whole cells 및 cell extract ; HT-29 colon cancer cell에 대한 증식억제 효과 보임 60 40 • Cell line specificity ; 활성의 세포 간 특이성을 보임 20 0 0 20 40 60 80 100 Concentration (mg/ml) of BGN4 Cell Extract 항종양효과-동물실험 The effect of Bifidobacterium spp RD65 and BGN4 on number and size of aberrant crypt foci Group Control SM2) SM+Protease SM+Bifido3) BGN4 ACF 92.00 ± 90.17 ± 86.50 ± 66.38 ± 85.17 ± 7.04 17.77 9.74 13.88* 14.72 Size +++++ +++++ +++++ +++ ++ 1) All the numbers are expressed as Mean ± SE 2) Soy milk powder 3) Bifidobacterium spp 프로바이오틱스를 이용한 알레르기 예방 •장 면역은 인체 면역중 50% 이상 차지 •장관 항원의 샘플링 : Peyer’s patch •Lamina propria : IgA 생산 및 분비, 소장은 주로 IgA1 대장은 주로 IgA2 •상피 세포 (intestinal epithelial cells) •IEL (intra epithelial T-lymphocyte) •장내 세균이 없는 동물은 알레르기 발생이 증가 •프로바이오틱 유산균은 Th1 세포를 활성화, IL-10, TGF-beta, INF-gamma 생산 촉진 •장관 세포 침투계 정상화, 세균총 정상화, 장관 면역계 조절, 알 레르기 발생 면역 억제 4) 장내 세균과 앨러지 앨러지 보유 유아 : Bifidobacteria 감소, clostridia 증가 Bjorksten et. al. (2001) 앨러지 보유아에서의 bifidobacteria, enterococci 감소 보고 B. bifidum은 정상아에서, B. adolescentis는 앨 러지 보유아에 우세 B. bifidum은 TNF-alpha 생산 감소 시킴. IL-10 증가 시킴 B. adolescentis는 반대 정상아의 B. bifidum은 장세포 부착능 이 좋음. 5) Probiotic의 종류별 효과 Kalliomaki et al. (Lancet 2001) Lactobacillus sp. GG에 의하여 eczema 감소, 피부 감작은 변화 약함. Bifidobacteria 는 피부 감작 줄임 : 현재 선행연구결과 500 PN-specific IgE (ng/ml) 400 G1 : Bif/Pre + PN G2 : Bif/Pre + PN/Bif G3 : PBS/Pre + PN G4 : naive 300 200 100 0 w0 w1 w2 w3 Experimental weeks Simultaneous administration of live Bifidobacteria during peanut-sensitization can reduce the peanut specific serum IgE antibody levels in murine(C3H/HeJ) model of food allergy. G1 : Pretreatment of Bifidus, 14-days-before peanut sensitization; G2 : Pre and simultaneous treatment of Bifidus(total 28days) and peanut sensitization; G3 : Sham-treated peanut sensitization ; G4 : Naïve. 선행연구결과 IFN-r 4500 4000 RPMI PMA pg/mL 3500 Bifidus 100+ PMA 3000 Bifidus 10+PMA 2500 Bifidus 100 2000 1500 1000 500 0 G1 G4 Effect of Bifidobacterium. Sp BGN-4 on production of IFN-r in splenocytes of sensitized C3H/HeJ. 제품의 인체평가 제품 섭취에 따른 균총의 변화 12 Log of CFU/g 10 bifidus bacteroides Lactobacillus Clostridium E.coli total aerobes 8 6 4 2 0 1차 (비섭 취) 2차(섭취) 3차(비섭취) 실험구 4차(섭취) 5차(비섭취) 균주의 산업화 Viable cell counts of Lactobacillus acidophillus in commercial probiotic products Cfu/g Claimed Actual Can provide Benefit H1 Not specified 1.5 X 10E3 No H2 1 X 10E8 1.6 X 10E3 No H3 4 X 10E8 7.3 X 10E2 No H4 Not specified 2.5 X 10E6 No P1 Not specified 4.8 X 10E6 Maybe P2 Not specified 1.3 X 10E8 Yes P3 5 X 10E9 3.2 X 10E9 Yes P4 2 X 10E7 2.2 X 10E3 No Product type Health products(Dry) Pharmaceutical products (Dry) 출처 : Fundamental Food Microbiology, Academic press, 2001, p220 III : 유산균을 이용한 생물전환 비피더스에 의한 대두 이소플라본의 생물전환 200 Genistein Genistin Daidzein Daidzin 이 소 플 라 본 100 농 도 (㎍/㎖) 0 18 시간 0 시간 발효시간 활성화 이소플라본 제품 ㈜ 비피도 연구원 서울대 식품미생물실 연구원