‫بنا م خداوند بخشنده مهربان‬
‫کنترول کیفی آزمایشهای سرولوژی‬
1. Labeled Immunoassay
Enzyme Linked Immuno Sorben Assay ( ELISA )
Radio Immuno Assay ( RIA )
Immuno Flurescent Antibody Technique ( IFAT )
Electrochemilominsance ( ECL )
2.Non Labeled Immunoassay.
Agglutination tests
Precipitation tests
Fluccolation tests
Agglutination Reactions
Ab + particulate Ag
Agglutination (clumping)
Direct agglutination
Passive agglutination
Agglutination inhibition



Direct agglutination
Example # 2 – Using bacteria
(Ag) looking for Ab in serum.

Indirect or Passive agglutination
Results when inert particles
are coated with soluble Ags
which may react with Ab.
Particles include latex, rbc’s,
charcoal, etc.
Example – Ag attached to latex
particle (known) + serum
looking for (unknown) Ab. If
Ab present, you get visible
agglutination.


Reverse passive agglutination
Involves the adherence of Ab
to inert particles which can
then be used to detect the
presence of Ag.
Example – latex particle
coated with Ab (known) +
serum looking for (unknown)
Ag. If Ag present, then you get
visible agglutination. (CRP
test)


Agglutination inhibition - pos
Agglutination inhibition - neg
‫عوامل موثر در واکنشهای آگلوتیناسیون‬
‫‪PH‬‬
‫عوامل موثر در واکنشهای آگلوتیناسیون‬
‫‪Ionic strength‬‬
‫قدرت یونی محیط در حقیقت موالریته نمکهای محلولی است‬
‫که آنتی زن و آنتی بادی در آن محلول قرارمیگیرند‬
‫عوامل موثر در واکنشهای آگلوتیناسیون‬
Amount of lattice
YY
Y
Y
Y
LATTICE
excess antibody
Dilution of antibodies
Y
Y
Y
Y
Y
Y Y
Y
Y
Y
YY
Y
excess antigen
CRP ‫نحوه جلوگیری از منفی کاذب در آزمایش‬
CRP
Serum
< 6 mg / L
6 – 20 mg /L
20 – 200 mg/L
> 200 mg/L
10 uL
_
_
+
+
Serum 50 uL 
_

+

+

_

‫عوامل موثر در واکنشهای آگلوتیناسیون‬
‫‪Temperature‬‬
‫‪Cold agglutinin test‬‬
‫عوامل موثر در واکنشهای آگلوتیناسیون‬
‫‪Incubation time‬‬
Direct Coombs’ Test
Differential Diagnosis
1.
Anti-IgG Positive +

Antibodies to Rh protein, Drug induced warm AIHA (penicillin, methyldopa)
2.
Anti-IgG Positive +

Anti-C3 Negative Anti-C3 Positive +
SLE, idiopathic warm AIHA, rarely drug associated
3. Anti-IgG Negative Anti-C3 Positive +

Cold agglutinin disease, Paroxysmal cold hemoglobinuria, rarely warm
AIHA if low-affintiy IgG
‫عوامل موثر در تفسیر نتایج آزمایشهاي سرولوژي‬
‫‪‬‬
‫سن و سابقه قبلي بیمار ‪ :‬تیتر آنتي بادي بیشتر از افراد تازه بیمار شده‪.‬‬
‫‪‬‬
‫آیا بیمار تاكنون واكسینه شده است‪ :‬تیتر باال مربوط به واكسني كه تازه‬
‫دریافت كرده ‪ ،‬اشتراك آنتي ژن با عامل بیماري جدید‪ ،‬به همان بیماري كه‬
‫واكسینه گشته است‪.‬‬
‫‪‬‬
‫وضعیت جغرافیائي محیط‪ :‬محل شایع و یا آندمیك در این مناطق حد نصاب‬
‫تیتر قابل قبول براي آن بیماري خاص باالتر از سایر مناطق مي باشد‪.‬‬
‫‪‬‬
‫شغل بیمار‪ :‬تماس مكرر تیتر قابل قبول براي آنها با سایر افراد متفاوت‬
‫است‪.‬موقع بیماري عالئم‪ +‬افزایش تیتر‬
‫‪‬‬
‫قرابت یا تشابه آنتي ژني‪ :‬افزایش غیر معمول آنتي بادي‬
‫‪...‬‬
‫‪‬‬
‫نقص در سیستم ایمني بیمار ‪ :‬كاهش گاماگلوبولین ارثي یا اكتسابي یا بیماري‬
‫ثانویه _لوسمي –تومورپیشرفته نتایج آزمایشات منفي‬
‫‪‬‬
‫موسسه تولید كننده آنتي ژن‪ :‬حد نرمال و عدم فریز آنتي ژن ها‬
‫‪‬‬
‫مصرف دارو‪ :‬تجویز بي موقع‪ -‬مصرف كورتون‪-‬پرتو درماني‬
‫‪‬‬
‫مرحله بیماري ‪ :‬اكثر در اواخر هفته دوم بیماري ظاهر مي گردند‬
‫‪‬‬
‫خطا در آزمایشگاه ‪ :‬جواب آزمایش –پي پت آلوده – قرائت نتیجه – مواد‬
‫فاسد و آلوده‬
Trouble Shooting
‫بررسی کیفیت کیت ها‬
TP
Sensitive = ------------- *100
TP+FN
TN
Specificity = --------------* 100
TN+FP
TP
Predictive valve of positive= -----------* 100
TP+FP
TN
Predictive valve of Negative= ------------* 100
TN+FN
Variables that affect the quality of
results
The educational background and training of the 
laboratory personnel
The condition of the specimens 
The controls used in the test runs 
Reagents 
Equipment 
The interpretation of the results 
The transcription of results 
The reporting of results 
The Impact of Prevalence on Predictive
Value
DISEASE
Absent
Present
Positive
TEST
Negative
45
5
a b
c d
5
Sens = 45/50
i.e. 90%
Prevalence = 50%
45
Spec = 45/50
i.e. 90%
Positive predictive
value
a = 45 = 90%
a+b
50
Negative predictive
value
d
= 45 = 90%
c+d
50
Different of Cold Autoantibodies
Ig
Clonality
DAT
Hemolysis
Primary cold
Agglutinin disease
Secondary cold
autoantibodies
Paroxysmal cold
Hemoglobinuria
IgM
Monoclonal
C3
Chronic ,mild
IgM
IgG
Polyclonal
C3
Mono/polyclonal
C3
Self-limited,mild to severe
I,i
Target RBC
antigen
I
Episodic, selflimtied: mild to
severe
P
Cold Auto Antibodies (IgM)
IgM directed against ‘Antigen I’ on red cells
Seen in


Elderly –
Lymphomas –
Infections - EBV, mycoplasma –
DAT (Coombs) - + for C3, negative for IgG
Treat - stay warm


Warm AIHA - Treatment
Folic acid supplementation
Steroids
Splenectomy
Immunosuppressives




Cyclophosphamide –
Azathioprine –
Intravenous immune globumin (IVIG)
Plasmapheresis


Differential Diagnosis
Anti-IgG Positive + Anti-C3 Negative -
.1
Idiopathic Warm AIHA, Drug induced warm AIHA (penicillin, methyldopa)

Anti-IgG Positive + Anti-C3 Positive +
.2
SLE, idiopathic warm AIHA, rarely drug associated

3. Anti-IgG Negative - Anti-C3 Positive +
Cold agglutinin disease, Paroxysmal cold hemoglobinuria, rarely warm

AIHA if low-affintiy IgG
Antibody and antigen can form a lattice
Amount of lattice
YY
Y
Y
Y
LATTICE
excess antibody
Dilution of antibodies
Y
Y
Y
Y
Y
Y Y
Y
Y
Y
YY
Y
excess antigen
c. Applications
These include detection of anti-rhesus factor (Rh) antibodies. Antibodies to the Rh factor generally
do not agglutinate red blood cells. Thus, red cells from Rh+ children born to Rh- mothers, who
have anti-Rh antibodies, may be coated with these antibodies. To check for this, a direct Coombs
test is performed. To see if the mother has anti-Rh antibodies in her serum an Indirect Coombs
test is performed.
patient red cells
+
AHG
=
agglutination
Flocculation tests
Flocculation tests for Ab detection are based on the
interaction of soluble Ag with Ab, which results in the
formation of a precipitate of fine particles. (Ag consists
of lipid type particles)
Examples VDRL & RPR’s. (See syphilis tests – to follow)


Concentration of Ag and Ab
also affects agglutination reactions, both
the first and second stages.
Affinity
• Strength of the reaction between a single antigenic
determinant and a single Ab combining site
High Affinity
Low Affinity
Ab
Ab
Ag
Ag
Affinity = ∑ attractive and repulsive forces
Avidity
• The overall strength of binding between an Ag
with many determinants and multivalent Abs
Keq =
104
Affinity
106
Avidity
1010
Avidity
Cross Reactivity
• The ability of an individual Ab combining site to
react with more than one antigenic determinant.
• The ability of a population of Ab molecules to
react with more than one Ag
Cross reactions
Anti-A
Ab
Anti-A
Ab
Anti-A
Ab
Ag A
Ag B
Ag C
Shared epitope
Similar epitope
‫آب مصرفي آزمایشگاه‬
‫‪‬‬
‫نوع ‪ :1‬هدایت الكتریكي ‪ < o.1‬میكروزیمنس بر سانتي متر مكعب جهت‬
‫كشت سلولي تهیه ‪Standard‬‬
‫‪‬‬
‫نوع ‪ :2‬هدایت الكتریكي ‪ < 1‬میكروزیمنس بر سانتي متر مكعب براي‬
‫آزمایشات‬
‫‪‬‬
‫نوع ‪ : 3‬هدایت الكتریكي ‪ < 10‬میكروزیمنس بر سانتي متر مكعب جهت‬
‫شست وشو و غیره‬
‫‪‬‬
‫دستگاه مربوطه ‪ Conductometer :‬جهت مقاومت هر چه مقاومت‬
‫خالص تر است یعني آبي كه ‪ 10‬مگااهم مقاومت ‪ ،‬داشته‬
‫بیشتر باشد آب‬
‫باشد خالص تر است‪ .‬از ‪ 5‬اهم یا كمتر‬
‫كنترل آب مقطر‬
‫‪‬‬
‫‪ :A‬یك قطره روي الم‬
‫‪‬‬
‫‪ : B‬جهت تشخیص كلر‪ +‬كمي نیترات نقره آب آلوده به كلر كدر میشود‪.‬‬
‫‪‬‬
‫‪ : C‬مواد آلي در یك بالن ژوژ ‪ 500‬میلي لیتري ‪ SO4H2 ، 1CC‬غلیظ ‪+‬‬
‫‪ %3‬از محلول پر منگنات پتاسیم ‪ 10/1‬نرمال اگز بعد از ‪ 1‬ساعت رنگ ثابت‬
‫ماند آب د یونیزه است ولي اگر رنگ پر منگنات از بین رفت آب آلوده به مواد‬
‫آلي است‪.‬‬
‫سانتریفورژ‬
‫‪‬‬
‫نوع ‪ :1‬سطح رسوب افقي است‪ ،‬عیب گرما تولید مي كند‪.‬‬
‫‪‬‬
‫نوع ‪ :2‬سطح رسوب مایل زاویه ‪ 25-40‬درجه سرعت زیادتر از نوع‪ 1‬و‬
‫زودتر مي ایستد‪.‬‬
‫‪‬‬
‫نوع ‪ :3‬اولترا سانتریفوژ ضمنا‬
‫‪‬‬
‫سانتریفوژ با دستگاه تاكامترهر ‪ 3‬ماه یكبار چك مي شود و تا ‪ %5‬خطا اشكال‬
‫ندارد‪.‬‬
‫برنامه هاي اطمینان از كیفیت‬
‫‪‬‬
‫تست باید داراي صحت و دقت كافي باشد‪.‬‬
‫‪‬‬
‫روش كار –سرعت – هزینه –اهمیت و نقش آزمایش در كارهاي كلینیكي‪.‬‬
‫‪‬‬
‫جهت رسیدن به كیفیت مطلوب بایستي با پزشك ارتباط برقرار نمود ‪.‬‬
‫‪ ‬آیا نتیجه تست صحیح است‪.‬‬
‫‪‬‬
‫آیا وقتي تكرار شود نتیجه مناسبي بدست مي آید‪.‬‬
‫‪‬‬
‫آیا براي استفاده پزشك در درمان از سرعت كافي برخوردار است‪.‬‬
‫‪‬‬
‫آیا هزینه و استفاده بیمار جهت درمان منطقي است ‪.‬‬
‫منابع خطا‬
‫‪‬‬
‫فردي –تجربه –آموزش – شرایط استخدامي‬
‫‪‬‬
‫عوامل محیطي فضاي كار – نور – تهویه – دما‪ -‬سروصدا زیاد‪ -‬عدم ایمني‬
‫‪‬‬
‫نمونه ها روش و زمان نمونه برداري –انتقال –ذخیره‪-‬آماده سازي‬
‫‪‬‬
‫حمل ونقل‬
‫‪‬‬
‫مواد آزمایشگاهي –كیفیت مواد‪ -‬ظروف شیشه اي –رنگها‬
‫‪‬‬
‫روش انجام تست (آسان –سخت)‬
‫‪‬‬
‫دستگاه ‪ :‬غیر استاندارد‪-‬نتایج غیرق‬
‫‪‬‬
‫قابل اطمینان مي دهند‬
‫‪‬‬
‫قرائت آزمایش‪ :‬قرائت عجوالنه‬
‫‪‬‬
‫گزارش نتیجه ‪ :‬نظم –تكرار‬
Direct agglutination