Biotecnologia Industrial Vol 2 Willibald

111 Coordenadores: WILLIBALDO SCHMIDELL URGEL DE ALMEIDA LIMA EUGÊNIO AQUARONE WALTER BORZANI BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL VOLUME 11 ENGENHARIA BIOQUÍMICA ~ EDITORA EDGARD BLÜCHER LTDA. ' v · · - ' 1 - ' 1 . - J ' - l _ l 1 L J , W _ . , _._ W - .... - .. _____L. '1 __I 1' • • I I - 1 - l l - - - - - . - .... ----.. • • - " - ' - " - I W.., W. Este conjunto de quatro volumes, reunidos sob o título amplo de BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL, é o resultado do trabalho de um grupo de profissionais com vistas à atualização da coleção BIOTECNOLOGIA, cuja publicação foi iniciada em 1975 e terminada em 1983. A experiência acumulada e as muitas mudanças ocorridas nestes últimos vinte anos, ao lado da indiscutível e crescente importância das aplicações da BIOTECNOLOGIA em diversos setores de produção de bens e serviços, justificam plenamente - assim pensam os Coordenadores e o Editor desta nova Coleção - esta primeira atualização, principalmente pelo fato de se destinar ao ensino em cursos de graduação. Nosso primeiro objetivo, nesta Apresentação, é tomar conhecimento do que, hoje, se entende por BIOTECNOLOGIA, e do que vem a ser BIOTECNOLOGIA INDUSTRIAL. A demarcação nítida do campo de atuação de qualquer ramo do conhecimento é sempre tarefa muito difícil, para não dizer impossível. Tanto isto é verdade que, com certa freqüência, tratados relativos a um dado setor do conhecimento atacam diretamente o exame de uma série de temas sem tentar esboçar, preliminarmente, um quadro que, em largos traços, indique os objetivos e as ap!jcações do que vai ser estudado. · Tal maneira de agir, principalmente em cursos de graduação, não nos parece aconselhável. Julgamos importante, no início dos. estudos, a apresentação de um panorama que dê, aos alunos, tima idéia, ainda que não bem definida, daqueles objetivos e aplicações. Não nos parece que seja imprescindível transcrever, aqui, todas as propostas de "definição" do que se deva entender por Biotecnologia. Algumas delas serão suficientes para que seja possível alcançar nosso objetivo. Iniciaremos com a proposta que o Prof. Antonio Paes de Carvalho, em seu trabalho intitulado "Patentes para a Biotecnologia", apresentou, em dezembro de · 1993, em reunião realizada na Academia Brasileira de Ciências: "Entende-se por Biotecnologia o conjunto de conhecimentos, técnicas e métodos, de base científica ou prática, que permite a utilização de seres vivos como parte integrante e ativa do processo de produção industrial de bens e serviços". VI O Office of Technology Assessment, por sua vez, "definiu" Biotecnologia como sendo: "O conjunto de processos industriais que englobam processos biológicos". Por outro lado, a Union Internationale de Chimie Pure et Appliquée, conceituou Biotecnologia como: "Aplicação da Bioquímica, da Biologia, da Microbiologia e da Engenharia Química aos processos e produtos industriais (incluindo os produtos relativos à saúde, energia e agricultura) e ao meio ambiente". Finalmente, o Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), em seu Programa Nacional de Biotecnologia, "definiu" Biotecnologia hos seguintes termos: "A utilização de sistemas celulares para obtenção de produtos ou desenvolvimento de processos industriais". . As poucas tentativas de definição aqui transcritas mostram, nitidamente, que a Biotecnologia tem por base vários ramos do conhecimento que poderiam ser classificados de FUNDAMENTAIS (como, por exemplo, Bioquímica, Fisiologia, Genética, Microbiologia, Virologia, Botânica, Zoologia, Ecologia) ao lado de outros que poderiam ser agrupados sob a denominação genérica de ENGENHARIAS (principalmente a Engenharia Química). Trata-se, portanto, de um campo de trabalho tipicamente multidisciplinar, o que torna absolutamente imprescindível a efetiva colaboração de profissionais atuantes em diferentes setores do conhecimento . . Destaque-se, porém, que essa atividade multidisciplinar não deve ser entendida como resultante de uma simples justaposição de profissionais, cada um deles com sua formação especializada e preocupado apenas com sua área específica. Importa que seja, de fato, um trabalho de vários profissionais efetivamente integrados, de modo que cada um deles tenha conhecimento, obviamente não aprofundado, dos princípios e das técnicas dos campos de atuação dos demais. Assim, apenas para citar um exemplo, caso um microbiologista participe de um grupo que estuda a otimização de um dado processo, é desejável que tenha alguns conhecimentos, mesmo que superficiais, a respeito das estratégias empregadas para a modelagem matemática. Vice-versa, o especialista ein modelagem deve efetuar um esforço adicional para compreender as características do sistema microbiano em estudo, a fim de incorporá-las ao modelo. Somente desta formà a atividade multidisciplinar efetivamente existirá e poderá ser mais eficiente. VIl Se é verdade, por um lado, que a Biotecnologia só passou a ser considerada altamente prioritária há relativamente pouco tempo, também é verdade, por outro, que processos biotecnológicos vêm sendo utilizados na produção de vários bens, principalmente alimentos, desde a mais remota antigüidade. Basta, neste particular, fazer referência ao preparo de bebidas fermentadas a partir de cereais na Babilônia e no Egito (8.000 a 6.000 anos a.C.), à produção de pão, utilizando · fermentos, no Egito (4.000 anos a.C.) e à produção de vinhos na Grécia (2.000 a.C.). A Biotecnologia encontra muitas aplicações importantes nas seguintes áreas de atividade: • Agricultura • Pecuária • Saúde • Preservação do meio ambiente • Indústria Suas aplicações na indústria constitutem o objetivo primordial da Biotecnologia Industrial. A Fig. 1, adaptada de um artigo publicado pelo Prof. Rainer Jonas, é uma boa representação gráfica da "localização" da Biotecnologia Industrial e de sua interação com outros ramos do conhecimento. Figura I cimento. Representação esquemática da interação da Biotecnologia Industrial com outros ramos do con he- VIII Convém, finalmente,,ressaltar que, como ocorre em outros campos de trabalho, as áreas de aplicação da Biotecnologia, anteriormente apontadas, não são "gavetas" estanques. Há entre elas, freqüentemente, fortes interações. Apenas para citar um exemplo, considere-se o caso de uma dada vacina, desenvolvida na área da Saúde. Na etapa final de produção dessa vacina em larga escala surgirão, muito provavelmente, problemas de cunho tecnológico e de engenharia que poderão tomar imprescindível a efetiva participação da Biotecnologia Industrial na busca das soluções mais adequadas. A presente Coleção consta de quatro volumes. No primeiro- FUNDAMENTOS - reúnem-se, como o próprio nome claramente indica, temas fundamentais indispensáveis ao estudo de processos biotecnológicos. O segundo- ENGENHARIA BIOQUÍMICA- focaliza os principais problemas de engenharia envolvidos naqueles processos, ao lado de assuntos correlatos de âmbito mais geral, mas importantes na produção em larga escala. Os dois últimos volumes - PROCESSOS FERMENTATIVOS E ENZIMÁTICOS e BIOTECNOLOGIA NA PRODUÇÃO DE ALIMENTOS - foram dedicados à descrição e discussão de processos biotecnológicos de importância industrial. Todos os temas foram tratados partindo-se do pressuposto de que a obra se destina, primordialmente, a cursos de graduação. A bibliografia indicada no final de cada capítulo poderá servir como ponto de partida pára os que pretenderem um exame mais aprofundado de um ou outro tópico. Os Coordenadores, o Editor e, seguramente, também os Autores, agradecem todas as sugestões relativas à estrutura da Coleção ou de qualquer de suas partes, bem como a identificação de falhas ou incorreções, infelizmente sempre possíveis, que lhes sejam encaminhadas pelo leitor. Literatura Recomendada 1) Anciães, W. & Cassiolato, J.E. Biotecnologia: seus impactos no setor industrial. CNPq, Brasília, 1985. 2) Haelm, H. Bioquímica de las fermentaciones. Aguilar S.A. de Ediciones, Madri, 1956. 3) Jonas, R. GBF -Scientific Annual Report (pp. 35-46). Alemanha, 1990. 4) Paes de Carvalho, A. Patentes para a Biotecnologia. Apresentadó à Academia Brasileira de Ciências em 6.12.1993. IX ACID Cuando la colección "Biotecnologia", editada por los profesores Eugênio Aquarone, Walter Borzani y Urgel de Almeida Lima, apareció en 1975, causó un hondo impacto entre los biotecnólogos latinoamericanos. Se trató de la primera obra sobre el tema escrita y publicada en nuestra región y representá una contribución especialmente valiosa al estudio y ensefianza de esa pujante disciplina. "Biotecnologia" constó originalmente de tres volúmenes: Tecnologia das Fermentações, Tópicos de Microbiologia Industrial y Engenharia Bioquímica, a los cuales se sumó en 1981 Corrosão Microbiológica y luego Alimentos e Bebidas produzidos por Fermentação en 1983. Ahora, pasados ya más de veinte afios, losmismos editores, com la participación del profesor Willibaldo Schmidell, nos brindam la oportunidad de apreciar y disfrutar la nueva colección "Biotecnologia Industrial" como una sucesora natural de "Biotecnologia". El contenido de la nueva obra há sido totalmente renovado y actualizado en concordancia com los notables avances experimentados por el conocimiento en esta área en las últimas décadas,.induyendo las modernas técnicas de la ingeniería genética y el uso de microorganismos recom· binantes en bioprocesos. La nueva colección está dividida en cuatro volúmenes que abarcan los mas variados tópicos relacionados com la biotecnología industrial: Fundamentos, Ingeniería Bioquímica, Procesos Fermentativos y Enzimáticos y Biotecnología en la Produccción de Alimentos. En total son 74 capítulos escritos por distinguidos especialistas brasileros, conteniendo información actualizada acerca tanto de los aspectos básicos como de los aplicados de la utilización de células microbianas y no microbianas para finalidades productivas. El Volumen 1, Fundamentos, entrega un completo panorama del estado del conocimiento en microbiología, genética, bioquímica y enzimología, finalizando com un panorama de las aplicaciones industriales de la biotecnología, abriendo así el camino a los próximos volúmenes. En el Volumen 2, Ingeniería Bioquímica, se exponen los principales aspectos relacionados com la cuantificación de los procesos microbianos y enzimáticos y el disefio y operación de los equipos de proceso requeridos en una instalación industrial. El Volumen 3~ Procesos Fermentativos y Enzimáticos, presenta y discute la aplicación de los microorganismos a la producción de una amplia gama de metabolitos y enzimas de interés práctico, el uso de enzimas como biocatalizadores industriales y la aplicación de los procesos microbianos a diversos sectores industriales y a la descontaminación de efluentes líquidos y resíduos sólidos. Finalmente, el Volumen 4, Biotecnología en la Producción de Alimentos, w.......__ _ _ , ____ _ ._ _ X detalla la aplicación de la biotecnología a una amplia variedad de industrias de ese importante sector. Por su estructura y contenido, y por la indiscutible autoridad de sus editores y autores, estoy cierto que Biotecnologia Industrial está destinada a constituirse en una obra insustituíble para la ensefi.anza universitaria de pre y post-grado, así como también en una valiosa fuente de consulta para el biotecnólogo en la industria. L _________ Fernando Acevedo Profesor Escuela de Ingeniería Bioquímica Universidad Católica de Valparaíso Valparaíso, Chile - - - - - - - , - - -- - - - - - ------------------- XI au a Adalberto Pessoa Junior Professor Doutor Universidade de São Paulo Faculdade de Ciências Farmacêuticas Departamento de Tecnologia Bioquímica-Farmacêutica Av. Prof. Lineu Prestes, 580-Bloco 16 05508-900, São Paulo, SP, Brasil Aberto Colli Badino Jr. Professor Adjunto I Universidade Federal de São Carlos Departamento de Engenharia Química Caixa Postal, 676 13565-905, São Carlos, SP, Brasil Antonio Bonomi .Pesquisador Coordenador Instituto de Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo S.A. Divisão Química , Agrupamento de Biotecnologia Caixa Postal, 0141 01064-970, São Paulo, SP, Brasil Beatriz Vahan Kilikian Professora Associada Universidade de São Paulo Escola Politécnica Departamento de Engenharia Química Caixa Postal, 61548 05424-970, São Paulo, SP, Brasil Deise Maria Fontana Capalbo Pesquisadora Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária EMBRAPA/CNPMA Rodovia SP 340, km 127,5 Caixa Postal, 69 13820-000, Jaguariúna, SP, Brasil - --,. - ... ---- . - ------~---- ----- -------------------, .. - -. -- --· -· ----·· -- 1 Haroldo Hiss Pesquisador Científico Insituto Butantã Av. Vital Brasil, 1500 05503-900, São Paulo, SP, Brasil Iracema de Oliveira Moraes Professora TÚular Universidade de Guarulhos Centro de CiênCias Exatas e Tecnológicas Praça Teresa Cristina, 1 07033-070, Guarulhos, SP, Brasil ·João Carlos Monteiro de Carvalho Professor Doutor Universidade de São Paulo Faculdade de Ciências Farmacêuticas Departamento de Tecnologia Bioquímica-Farmacêutica Av. Prof. Lineu Prestes, 580-Bloco 16 05508-900, São Paulo, SP, Brasil José Geraldo da Cruz Pradella Pesquisador Instituto de Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo S.A. Divisão Química Agrupamento de Biotecnologia Caixa Postal, 0141 01064-970, São Paulo, SP, Brasil Josef Emst Thiemann Pesquisador Sênior Biobrás S.A. Avenida C, 1413- Distrito Industrial Caixa Postal, 377 39404-004, Montes Claros, MG, Brasil. r. . XII Luiz Carlos Urenha Pesquisador Instituto de Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo S.A. Divisão Química Agrupàmento de Biotecnologia Caixa Postal, 0141 01064-970, São Paulo, SP, Brasil Pedro Sérgio Pereiralima Pesquisador . Instituto de Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo S.A. Divisão de Mecânica e Eletricidade Agrupamento de Sistemas de Controle Caixa Postal, 0141 01064-970, São Paulo, SP, Brasil Manuel Filgueira Barrai Pesquisador Instituto de Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo S.A. Divisão Química Agrupamento de Biotecnologia Caixa Postal, 0141 01064-970, São Paulo, SP, Brasil Rafael Almudi Villen Professor Associado Centro Universitário do Instituto Mauá de Tecnologia Escola de Engenharia Mauá Departamento de Engenharia Química e de Alimentos Praça Mauá, 1 09580-900, São Caetano do Sul, SP, Brasil Maria Cândida Reginato Facciotti Professora Titular_ Universidade de São Paulo Escola Politécnica Departamento de Engenharia Química Caixa Postal, 61548 05424-970, São Paulo, SP, Brasil Sunao Sato Professor Titular Universidade de São Paulo Faculdade de Ciências Farmacêuticas Departamento de Tecnologia Bioquímica-Farmacêutica Av. Prof. Lineu Prestes, 580-Bloco 16 05508-900, São Paulo, SP, Brasil Maria Filomena de Andrade Rodrigues Pesquisadora Instituto de Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo S.A. · Divisão Química Agrupamento de Biotecnologia Caixa Postal, 0141 01064-970, São Paulo, SP, Brasil Urgel de Almeida Lima Professor Pleno Centro Universitário do Instituto Mauá · de Tecnologia Escola de Engenharia Mauá Departamento de Engenharia Química e de Alimentos Praça Mauá, 1 09580-900, São Caetano do Sul, SP, Brasil . Michele Vitolo Professor Titular Universidade de São Paulo Faculdade de Ciências Farmacêuticas Departamento de Tecnologia Bioquímica-Farmacêutica Av. Prof. Lineu Prestes, 580-Bloco 16 05508-900, São Paulo, SP, Brasil Vanildo Luiz Del Bianchi Professor Doutor Universidade Estadual Paulista Intituto de Biociê~cias, Letras e Ciências Exatas Rua Cristovão Colombo, 2265 15054-000, São José do Rio Preto, SP, Brasil XIII Walter Borzani Willibaldo Schmidell Professor Pleno Professor Titular Centro Universitário do Instituto Mauá de Tecnologia Escola de Engenharia Mauá Departamento de Engenharia Química e de Alimentos Praça Mauá, 1 09580-900, São Caetano do Sul, SP, Brasil -.,...__.___ . Universidade de São Paulo Escola Politécnica Departamento de Engenharia Química Caixa Postal, 61548 05424-970, São Paulo, SP, Brasil ( XV caN 1 ENGENHARIA BIOQUÍMICA: UMA APLICAÇÃO SUl GENERIS DA ENGENHARIA QUÍMICA .................................................................................... 1 Literatura recomendada ........................... :...................................................... 3 2 MICRORGANISMOS E MEIOS DE CULTURA PARA UTILIZAÇÃO INDUSTRIAL ..................................................................................................................... 5 2.1 Introdução .............................................................................................................. 5 2.2 Fontes de microrganismos de interesse ................... .......................................... 7 2.3 Características desejáveis de microrganismos e meios de cultura para aplicação industrial ............................................................................. :..... 10 2.4 Considerações finais ............................................................ ............................... 18 Referências bibliográficas ·· ········:································· ...···································· 18 ESTERILIZAÇÃO DO EQUIPAMENTO ............................................................... 19 3.1 Introdução ............................................................................................................ l9 3.2 Terminologia e modo de atuação ..................................................................... 20 3.3 Esterilização por agentes físicos .............................. ......................................... 25 3.4 Esterilização e desinfecção por agentes químicos ......................................... 33 Referências bibliográficas ..................................................... :............................ 38 ESTERILIZAÇÃO DE MEIOS DE FERMENTAÇÃO POR AQUECIMENTO COM VAPOR . ...............:: ............................................................ 39 4.1 Introdução ............................................................................................................ 39 4.2 Descrição sumária dos processos de esterilização por calor úmido ........... 40 4.3 Cinética da destruição térmica de microrganismos ....................................... 45 4.4 Destruição de nutrientes do meio corno conseqüência da esterilização .... 51 4.5 Considerações geràis a respeito do cálculo do tempo de esterilização ...... 53 4.6 Cálculo do tempo de esterilização por processo descontínuo ..................... 56 4.7 Cálculo do tempo de esterilização por processo contínuo ........................... 60 Literatura recomendada .................................................................................... 62 ESTÉRILIZAÇÃO DE AR.········ ········· · ·· · ············ · ···· ······ · ··· ·· ····:····· ················ ·~!: ........... 63 5.1 Introdução ...............................:.............................. .............................................. 63 5.2 Aerossóis microbianos ........................................................................................ 64 5.3 Arnostradores ...................................................................................................... 65 5.4 Métodos para a esterilização de ar ................................................................... 75 5.5 Considerações finais .....................................:..................... :............................... 90 Referência.s biliográficas .................................................................... ................ 90 i XVI · 6 CINÉTICA DE PROCESSOS FERMENTATIVOS . ............................................. 93 6.1 Introdução ..............................·.................. ;........................................................... 93 6.2 Parâmetros de transformação ··············································'···························· 95. 6.3 Cálculo das velocidades .................................................................................. 101 6.4 A curva de crescimento microbiano ............................................................... 103 6.5 Classificação dos processos fermentativos ................................................... 107 6.6 Influência da concentração do substrato sobre a velocidade específica de crescimento ............................ .................................................... 110 Apêndice ............................................................................................................ 114 Referências bibliográficas ..................................................... ........................... 121 7 MODELAGEM MATEMÁTICA E SIMULAÇÃO DE PROCESSOS FERMENTATIVOS . ..................................................................................................... 123 7.1 Introdução .......................................................................................................... 123 7.2 Formulação dos modelos matemáticos de processos fermentativos ........ 124 7.3 Ajuste de parâmetros do modelo formulado ............................................... 148 7.4 Avaliação do modelo matemático .................................................................. 164 7.5 Simulação de processos fermentativos .......................................................... 172 Referências bibliográficas ........................................... ,........... ......................... 175 BIORREATORES E PROCESSOS FERMENTATIVOS . ................................. 179 8.1 Introdução .......................................................................................................... 179 8.2 Classificação dos biorreatores ·····························:··········································· 180 8.3 Formas de condução de um processo fermentativo .................................... 185 8.4 Exemplos de comparação de desempenho de biorreatores ....................... 189 Referências bibliográficas ............................................................................. ... 190 FERMENTAÇÃO DESCONTÍNUA. ... ..............:.................................................... 193 9.1 Introdução .......................................................................... ................................ 193 9.2 · Inóculo ................................................................................................................ 194 9.3 Mosto ................................................ .. ...................................... .......................... 196 9.4 Classificação ........................................................................... ........................... 199 9.5 Número de domas ............................................................................................ 200 Referências bibliográficas .........:......................... :············································ 204 FERMENTAÇÃO DESCONTÍNUA ALIMENTADA . ...................................... 205 10.1 Introdução ·:···································································:.................................... 205 10.2 Aplicações .......................................................................................................... 207 10.3 Classificação .. ................................... :................................................................ 210 10.4 Modelos matemáticos ...................... ................................................................. 212 Referências bibliográficas ................................................................................ 216 FERMENTAÇÃO SEMICONTÍNUA ..................................................................... 219 11.1 Definição .............................................. ............. :................................................ 219 11.2 Produtividade do processo semicontínuo .................................................... 220 11.3 Comentários finais ... ..................... .................................................................... 222 Referências bibliográficas ................................................................................ 222 FERMENTAÇÃO CONTÍNUA . ............................................................................... 223 12.1 Conceitos básicos .................................... .......................................................... 223 12.2 Vantagens e desvantagens do p rocesso contínuo em relação ao descontínuo .................................................................................................. 224 8 ·9 10 11 12 L ____ _ _ XVII 12.3 12.4 Formas de operação no sistema contínuo ............... .......................... ;........... 225 Formação de produtos no sistema contínuo ....... .......................................... 242 Referências bibliográficas ............................................................:................... 245 13 FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO.......................................................... 247 13.1 Introdução .......................................................................................................... 247 13.2 História do processo da FSS ........... ........... ................................................. ..... 248 13.3 Microrganisrhos comumente utilizados ............................ ,........................... 250 13.4 Substratos: características e composição ....................................................... 250 13.5 Reatores para fermentação semi-sólida ......................................................... 254 13.6 Controles do processo .................................. .. .................................................. 259 13.7 Vantagens e desvantagens ............................................................................... 264 13.8 Exemplos de casos ·····:················································································· ····· 266 Referências bibliográficas ................................................................... ............. 270 AGITAÇÃO E AERAÇÃO EM BIORREATORES . ........................................:.. 277 14.1 A importância da transferência de oxigênio ............................................. ;... 277 14.2 Sistemas para a transferência de oxigênio .................................................... 279 14.3 Concentração de oxigênio dissolvido em solucões saturadas ................... 281 14.4 Transferência de oxigênio e respiração microbiana ..................................... 284 14.5 Transferência de oxigênio em sistemas agitados e areados ........................ 308 14.6 Considerações finais ......................................................................................... 329 ~) R:ferências bibliográficas ................................................................................ 329 L!..?/ VARIAÇAO DE ESCALA. ...................,.................................................................... 333 15.1 Introdução .......... ,...........................:.................................................................... 333 15.2 Critérios para a ampliação de escala ....................................... ...................... 336 15.3 Comparações entre critérios para a ampliação de escala ......... ;................. 348 15.4 Redução de escala ................................................ ;........... .'................ ~ ............... 351 15.5 Considerações finais ....................................................................................:.... 352 Referências bibliográficas ................................................... ~ ...~ ........................ 353 16 REATORES COM CÉLULAS IMOBILIZADAS . .........................................:.... 355 16.1 Introdução ...... ,................................................... ................................................ 355 16.2 Métodos de imobilização ................................................................................. 356 16.3 Tipos de biorreatores empregados .............................. ,.................................. 360 16.4 Aspectos relativos ao transporte de massa ................................................... 363 16.5 Processos que utilizam células imobilizadas ................................................ 366 . 16.6 Conclusões ......................................................................................................... 370 Referências bibliográficas .................................................... :........................... 371 17 REATORES COM ENZIMAS IMOBILIZADAS ............................................... 373 17.1 Introdução .. ,.......................................;.......................................... ;.................... 373 17.2 Reatores enzimáticos ..................................................... :................................... 374 17.3 Exemplos de processos enzimáticos ........................ ,..................................... 388 Referências bibliográficas ........................................... ;.. :................................. 395 18 AUTOMAÇÃO E CONTROLE DE PROCESSOS FERMENTATIVOS . ... 397 18.1 Introdução ................................................................................ .......................... 397 18.2 Principais instrumentos para monitoração ein linha de processos fermentativos ................................ ..................................................... ................ 398 @ ... . . -- -------- -~- - ----- - - --- -.·- ·---- --- --.........,- -- -- - - ~ -- ---~- --~ -- -~- ..•. ------ ---- --- -·- '.. . XVIII 18.3 19 20 OPERAÇÃO DE INSTALAÇÕES INDUSTRIAIS DE FERMENTAÇÃO . ........................................ :.............................................................. .425 19.1 Princípios gerais para operação ...................................................................... 425 19.2 Condições gerais para a execução de um processo fermentativo ............. 426 19.3 Operação de uma indústria ............................................................................. 429 19.4 Operação de um processo férmentativo asséptico ...................................... 434 19.5 Exemplo de operação de indústria de fermentação ................................... .435 Bibliografia ........................................................................................................ 439 CONSTRUÇÃO DE EQUIPAMENTOS DE FERMENTAÇÃO . .................. 441 20.1 Introdução .......................................................................................................... 441 20.2 Características básicas de reatores para cultivo de bactérias ou células animais .................................................................................................. 442 20.3 20.4 20.5 20.6 20.7 21 22 Controle aplicado a processos fermentativos ............................................... 411 Referências bibliográficas ........................................................ ........................ 423 Construção do fermentador ............................................................................ 448 Cultivo de células animais .............................................................................. 468 Obtenção e manutenção das condições de esterilidade e biossegurança ......................................................................................................470 Válvulas e purgadores de vapor .... ................................................................ 480 Outros tipos de reatores ................................................................................... 485 Bibliografia .................................................................................................... .... 489 PURIFICAÇÃO DE PRODUTO~ BIOTECNOLÓGICOS . ............................493 21.1 Introdução ..............................:.........:...................................................... :........... 493 21.2 Classificação ......................................... :............................................................. 494 21.3 Rompimento de células microbianas ............................................................. 501 21.4 Precipitação ....................................................................................................... 504 21.5 Ultrafiltração ..................................................................................................... 507 21.6 Extração em sistemas de duas fases aquosas ............................................... 507 21.7 Cromatografia ............................ .......... ............................................................. 510 21 .8 Tratamentos finais ............................................................................................514 21.9 Rotinas analíticas .................................................. ............................................ 515 21.10 O processo integrado de purificação ............................................................. 518 Referências bibliográficas ...................................................................~. ~ .......... 520 ASPECTOS ECONÔMICOS . .................................................................................. 523 22.1 Introdução .......................................................................................................... 523 22.2 Considerações sobre as diferentes variáveis e suas relações · existentes em todo o estudo econômico ............................ :........................... 523 22.3 Análise de viabilidade econômica ......................................... :....................... 528 22.4 Aspectos econômicos de processos fermentativos ...................................... 530 22.5 Métodos de avaliação de investimento ...........................;............................. 535 Bibliografia ........................................................................................................ 541 I I· L__.__· ·--·------~---------- ------------------=-========~~~~=-=-=-=·==~~============== Walter Borzani Durante a Segunda Grande Guerra (1939-1945), os então "Aliados" concentraram esforços consideráveis na consecução de um objetivo muito específico: transferir para escala industrial o processo de laboratório, então conhecido, de produção de penicilina por fermentação . Ao lado de profissionais já de longa ~ata envolvidos no estudo de atividades microbianas, passaram então a atuar engenheiros químicos, com vistas à solução de questõesbastante complexás inerentes à desejada ampliação de escala. Foi nesse período que nasceu o ramo da Engenharia Química que, mais tarde, por suas peculiaridades, receberia o nome de Engenharia Bioquímica. Neste praticamente meio século de existência, esse novo ramo da Engenharia Química progrediu rapidamente, conduzindo a muitos resultados de indiscutível importância-prática. O objetivo da Engenharia Bioquímica é a aplicação dos conhecimentos da Engenharia Química na solução de problemas que se apresentam na implantação de processos biotecnológicos em larga escala, e em sua otimização. Segundo AIBA, HUMPHREY e MILLIS: "Biochemical engineering is concerned with conducting biological processes on an industrial scale, providing the links between biology and chemical engineering. The authors believe, moreover, that the heart of biochemical engineering lies in the scale-up and management of cellular processes". BAILEY e ÜLLIS, por sua vez, dizem: "Processing of biological materiais and processing using biological agents such as cells, enzymes or antibodies are the central domain of biochemical engineering. Success in biochemical engineering requires integrated knowledge of governing biological properties and principies and of chemical engineering methodology and strategy. (...) Reaching this objective clearly requires years of careful study and practice" . Convém citar que o primeiro livro dedicado à Engenharia Bioquímica foi publicado em 1958, por STEEL. 2 Engenharia bioquímica: uma aplicação sui generis da engenharia química Os problemas que se apresentam no âmbito da Engenharia Bioquímica são, com alguma freqüência, de difícil solução, dadas as peculiaridades e a complexidade dos sistemas em que se desenvolvem os processos biotecnológicos. O estudo de vários desses problemas constitui o principal objetivo deste volume, mas parece-nos aconselhável, neste primeiro capítulo, comentar alguns deles, com a única finalidade de dar, aos alunos, uma idéia das questões que serão examinadas. Comecemos tecendo alguns comentários a respeito dos balanços materiais em processos fermentativos. A célula microbiana responsável pela transformação que nos interessa em um dado processo realiza, além dessa transformação, um grande número de outras reações com o objetivo, para ela absolutamente primordial, de manter-se viva e multiplicar-se. Isso pode dificultar o estabelecimento de balanços materiais, além de afetar o rendimento do processo considerado. O conhecimento das prováveis vias metabólicas que se desenvolvem nas células é, neste particular, de grande auxílio, fornecendo muitas vezes informações que indicam a maneira mais adequada de conduzir o processo que nos interessa. O fato inevitável, apontado hápouco, de a célula ter a única "preocupação" de manter-se viva e multiplicar-se, também pode acarretar sérios problemas no estudo da cinética da transformação que se tem em vista, uma vez que a velocidade de formação do produto que nos interessa pode ser profundamente afetada pelas velocidades de outras reações integrantes do metabolismo do microrganismo. Isso pode dificultar o estabelecimento de modelos matemáticos, cuja importância na otimização e no controle de processos já foi constatada muitas vezes. A manutenção de um razoável grau de "homogeneidade" no reator, para que todos os agentes da transformação se encontrem, pelo menos aproximadamente, nas mesmas condições (temperatura, pH, concentrações de substâncias do meio), é outro problema a ser considerado, principalmente em reatores industriais. Consideremos, agora, a operação de esterilização de grandes volumes de meio, operação esta muito freqüente em indústrias de fermentação. Como proceder: eliminar os microrganismos por filtração do meio ou destruí-los por aquecimento? Se a esterilização por aquecimento tiver sido escolhida, que processo será utilizado: o descontínuo ou o contínuo? Que temperatura de esterilização será adotada e qual o correspondente tempo do tratamento térmico? Quais serão as dimensões dos equipamentos e os controles necessários em cada caso? O meio, uma vez esterilizado, será encaminhado ao fermentador onde será transformado pela ação das células microbianas. Aqui nos depararemos com muitas alternativas. Serão utilizados microrganismos em suspensão no meio ou células imobilizadas em suportes inertes? Que processo de fermentação será utilizado: o descontínuo, o semicontínuo ou o contínuo? Com ou sem recirculação do microrganismo? Se for escolhido o processo descontínuo, será o descontínuo simples ou o descontínuo alimentado? Se o processo adotado for o semicontínuo, que fração de meio fermentado será periodicamente retirada do reator e substituída por igual volume de meio novo? No caso de se ter optado pelo processo contínuo, adotar-se-á um único reator de mistura, vários reatores de mistura ligados em série, ou um reator pistonado? Quais serão as dimensões e o form~to do reator? Como controlar as condições de fermentação? Como adicionar alguns nutrientes: Engenharia bioquímica: uma aplicação sui generis da engenharia química 3 todos de uma só vez no preparo do meio, ou de maneira programada durante o andamento do processo? No caso de se tratar de um processo enzimático contínuo com enzimas imobilizadas, lançar-se-á mão de um reator de leito fixo, ou de leito fluidizado? Outro tópico a ser lembrado, é o da ampliação da escala de trabalho ("scale-up"): se bons resultado~ foram obtidos, em certas condições, em um reator de pequena capacidade, como operar um reator industrial para que os mesmos resultados sejam alcançados? Finalmente, para não alongarmos demasiadamente estes comentários, nunca será demais ressaltar a importância de que se reveste a escolha dos processos que serão utilizados, tanto na separação dos produtos e subprodutos, como no tratamento, ou no aproveitamento dos resíduos. A solução adequada de muitas das questões com que se defronta a Engenharia Bioquímica passa, necessariamente, pelo estabelecimento de modelos matemáticos, como se constatará ao longo deste Volume. Parece-nos oportuno, por esse motivo, ressaltar a utilidade desses modelos, valendo-nos de um artigo publicado por FREDRICKSON e colaboradores em 1970: "1. Models serve to correlate data and so provide a concise way of thinking about a system or process. 2. Models allow one- within limits- to predict quantitatively the performance of a system or process.-Thus~ they can reduce the amount of experimentallábor necessary to design and/ or optimize a process. 3. Models help to sharpen thinking about a system or process and can be used to guide one's reasoning in the design of experiments, to isolate important parameters and elucidate the nature of the system ór process. That is to say,' the combinations of mathematical modelling and experilllen_~~l research often suggests new experiments that need to be done." Literatura recomendada (1) AIBA, S., HUMPHREY, A.E. & MILLIS, N .F. Biochemical Engineering. University of Tokyo Press, Tóquio, 1973. (2) BAILEY, J.E. & OLLIS, D.F. Biochemical Engineering Fundamentais. McGraw-Hill Book Company, Nova York, 1986. (3) SIMON, P. & MEUNIER, R. Microbiologie Industrielle et Génie Biochimique. Masson et Cie., Éditeurs, Paris, 1970. 5 Willibaldo Schmidell 2.1 - Introdução O objetivo central do presente capítulo reside na descrição das características gerais que microrganismos e meios de cultura devem apresentar, a fim de ser possível utilizá-los em uma operação industrial de grande porte, ou seja, executada em biorreatores com volumes de dezenas de milhares de litros. Apesar de se procurar mencionar, ao longo do texto, alguns exemplos, não há a preocupação em de$crever características particularmente importantes para um determinado processo fermentativo, pois isto tornaria o tema extremamente longo, além de apresentar uma importância questionável, tendo em vista o escopo geral do presente capítulo. Retomando as idéias já abordadas no Capítulo 9 (Vol. 1), na Figura 2.1 encontra-se um esquema geral de um processo fermentativo, na qual buscou-seressaltar alguns pontos essenciais, que permitem um início de discussão dentro do objetivo acima traçado. Conforme se pode observar na Figura 2.1, o sucesso de um dado processo fermentativo depende muito de uma correta definição de quatro pontos básicos: o miCrorganismo, o meio de cultura, a forma de condução do processo fermentativo e as etapas de rec\lperação do produto. Na verdade, esses quatro pilares de um processo fermentativo interagem enormemente, sendo necessário buscar defini-los de forma conjunta, levando em consideração aspectos biológicos e econômicos, o que torna bastante complexa esta adequada definição. Para tornar clara essa idéia, pode-se mencionar que sempre se pretende empregar meios de cultura baratos, mas deve-se lembrar que o microrganismo deve encontrar neste ineio condições adequadas para realizar a conversão pretendida. · ......._____ - --·--·- ---·· ·--·~--·--- -·.----··--~·-- - -·· - --·---- ' ··-- .. · 6 Microrganismos e meios de cu~ura para utilização industrial Em termos de formas de condução do processo fermentativo, seria difícil imaginar a produção presente de etanol no Brasil (algo como 15 bilhões de litros por ano), caso não se operasse os biorreatores em sistema descontínuo alimentado, ou mesmo contínuo, porém com o reciclo das células. Da mesma forma, o grande avanço alcançado pela digestão anaeróbia no tratamento biológico de águas resi.duárias, deveu-se muitíssimo ao surgimento dos reatores contínuos operados com fluxo ascendente e reciclo interno de células. Matérias-primas ! Prei>ãrB71ô' :·- .' lnóculo:;eta.pa lndustriai · ·:. ~iierri:linad9r~~ ·-·"." ,.. --.. .... l. Figura 2.1 - Esquema geral de um processo fermentativo As operações finais para a recuperação do produto (operações de "downstream"), são igualmente da mais alta importância. Sabe-se ' que a melhor forma presentemente para a recuperação do etanol, após uma fermentação alcoólica, é a operação de destilação, mas ela incide significativamente no custo do produto final, em virtude da energia necessária para a sua execução. No entanto, a importância de uma adequada definiçao das operações de recuperação do produto, fica mais clara quando se aborda a produção de produtos de alto valor agregado, como a produção de· antibióticos, enzimas, ou outras proteínas (insulina, hormônios de crescimento, vacinas etcJ Pá'ra esses casos, as operações de recuperação do produto podem ser responsáveis por 50 a 70% do custo do produto final, indicando, claramente, a sua importância em termos de uma adequada definição. Os aspectos relacionados com a forma de condução de biorreatores, assim como as operações de recuperação de produtos, serão abordados em vários capítulos do presente volume . .·_, Fontes de microrganismos de interesse 7 Cabe, portanto, conforme salientado anteriormente, abordar alguma reflexão sobre microrganismos e meios de cultura que podem ser eventualmente empregados em uma operação industrial. 2.2 - Fontes de microrganismos de interesse Microrganismos que possam ter interesse industrial, podem ser obtidos basicamente das seguintes formas: isolamento apartir de recursos naturais compra em coleções de culturas obtenção de mutantes naturais obtenção de mutantes induzidos por métodos convencionais obtenção de microrganismos recombinantes por técnicas de engenharia genética. O isolamento de microrganismos a partir de recursos naturais, tais como solo, água, plantas etc., sempre foi uma atividade de grande importância para a obtenção de novas linhagens de interesse industrial. Trata-se de uma atividade que envolve muito trabalho experimental, significando um custo relativamente elevado, porém pode conduzir ao isolamento de linhagens melhor produtoras de um dado produto, mas, mais importante do que isto, pode conduzir à descoberta de novos produtos, o que confere a esta possibilidade uma relevância inquestionável. Cumpre lembrar que as grandes eni.presas produtoras de antibióticos, ou enzimas, mantêm programas de isolamento de linhagens de recursos naturais, justamente com o objetivo de incrementar a produção de certos produtos, ou com o objetivo de encontrar linhagens produtoras de novos antibióticos por exemplo. É dar() ql.!e o isolamento de linhagens deve ter início com certas premissas, definindo-se o que se pretende obter, pois o simples isolamento poderá levar à disponibilidade de um número inimaginável de culturas, o que dificulta a convergência para o processo ou o produto que se pretende produzir. A compra em coleções de culturas é presentemente bastante viável, tendo em vista a existência de muitas coleções de culturas em vários países. Nesse sentido, STANBURY et al. 1 listam nada menos do que 11 coleções de culturas em vários países, podendo-se ainda acrescentar a Agricultura! Research Service Culture Collection (EUA), também conhecido como NRRL Culture Collection (http:/ /nrrl.ncaur.usda.gov) e a Coleção de Culturas Tropical {Campinas - SP; http:/ /www.cct.org.br). O contato com essas coleções é atualmente muito facilitado, podendo-se utilizar os recursos da Internet para tal tarefa. É de se esperar que o microrganismo utilizado para a produção de um dado antibiótico não estará disponível em uma coleção de culturas, sendo, com muita freqüência, oriundo de programas de melhoramento genético. Como se sabe, quando uma dada célula prolifera, há sempre uma pequena possibilidade de surgimento de mutantes naturais, os quais podem ser isolados e ensaiados objetivando a verificação de sua potencialidade de produção. Conforme 8 Microrganismos e meios de cultura para utilização ·industrial se verá adiante, essas alterações naturais não são, de forma alguma, interessantes do ponto de vista de um processo fermentativo, mas eventualmente podem gerar novas linhagens que apresentem interesse prático. No entanto, aguardar o surgimento de mutantes naturais de interesse prático, poderá significar o dispêndio de muito tempo, razão pela qual prefere-se, há já várias décadas, lançar mão de métodos que forcem o aparecimento de células inutadas, como é o caso de submeter suspensões de células ou esporos a radiações ultravioleta ou a substâncias químicas mutagênicas, como a nitrosoguanidina. Ao se permitir essa exposição ou contato, ocorre uma drástica destruição da maioria das células, recuperando-se, a seguir, aquelas que sobreviveram, verificando-se se mutaram na direção desejada. Essa técnica para a obtenção de mutantes é obviamente aleatória, tratando-se de recuperar as células sobreviventes em meios ou condições específicas, de forma a dirigir este isolamento para as células que se pretende. Tais programas de mutação/seleção costumam ser bastante dispendiosos, mas levaram a várias condições de sucesso descritas na literatura. Um caso bem relatado foi a significativa melhora de linhagens de Penicillium chrysogenum para a produção de penicilina. De fato, na década de 40 obtinha-se teor de penicilina no caldo fermentado da ordem de· 100 unidades/ cm3, passando-se a obter, já por volta de 1976, teores da ordem de 51.000 unidades/cm 3 • Já acréscimos da ordem de 4 vezes foram obtidos entre 1970 e 1985 em uma determinada empresa, 1 o que indica que este progresso costuma-~er muito estimulante, especialmente quando se parte de linhagens naturais. Incrementos semelhantes foram obtidos na empresa Squibb Indústria Química S.A., no período de 1975 a 1992, conforme relatado por SCHMIDELL; FERNANDES. 2 Tais progressos realmente significativos costumam ser atribuídos apenas a esses programas de mutação/seleção, mas é conveniente lembrar o necessário trabalho de adaptação do meio de cultivo, da forma de conduzir o processo.fermentativo e as alterações nas etapas de recuperação do produto, a fim de propiciar o real surgimento das vantagens, em nível de produção industrial, da nova linhagem selecionada. 2 Finalmente, nas últimas décadas, as técnicas de engenharia genética (vide Vol. 1, Cap. 4), também designadas por técnicas ou tecnologia de DNA recombinante, sem dúvida trouxeram um imenso avanço nas possibilidades de se obter células mais produtivas, ou células produtoras de substâncias que normalmente não produzem. Como se sabe, ao lado dessas possibilidades, igualmente trouxeram várias reflexões e inquietudes, cujo teor não será abordado no presente capítulo. A introdução de fragmentos de DNA de certas células em outras, via vetores como os plasmídeos, permite a obtenção de células alteradas geneticamente, porém de forma muito mais dirigida do que as metodologias convencionais anteriormente mencionadas, sendo possível de ser executada não apenas com microrganismos, mas iguàlmente com células animais e vegetais. Para se ter uma idéia da potencialidade dessas técnicas, imaginemos que se conheça a seqüência metaból~ca que leva ao acúmulo de um dado produto de interesse, por exemplo o produto P na seqüência genérica: Fontes de microrganismos de interesse A~B~C~D~ 9 ... ~P Um estudo mais aprofundado dessa seqüência, através da determinação das concentrações dos compostos intermediários (B, C, D etc.), pode levar à determi~ nação da reação limitante da seqüência (aquela que determina a velocidade do fluxo metabólico em estudo, por exemplo a reação C 4 D) e, portanto, da enzima responsável pela reação específica (enzima c). As etapas seguintes são a identificação do gene que codifica 'para a síntese dessa enzima, introduzir este gene em plasmídeos e voltá-los à célula produtora. Com esse procedimento, aumenta-se o número de cópias do gene responsável pela síntese da enzima, o que permite aumentar a velocidade da reação limitante, pela presença de uma maior concentração da enzima responsável (no caso, a enzima c). Essa estratégia foi empregada, por exemplo, no incremento da produção de cefalosporina C por CephaZosporiuni acremonium. 1 Ainda, uma etapa intermediária poderia ser imaginada. Uma vez identificada a enzima responsável pela catálise da reação limitante, esta enzima poderia ser manipulada, através do conhecimento de sua estrutura e alteração de determinados aminoácidos, por técnicas de engenharia de proteínas, objetivando obter uma nova proteína com atividade aumentada. O gene correspondente a essa nova enzima seria, então, introduzido na célula produtora, conforme acima descrito. A potencialidade dessas técnicas é realmente enorme, pois, uma vez solucionado o problema de uma dada reação limitante, outra reação da seqüência metabólica passará a ser limitante, o que permite imaginar a realização de igual estratégia para esta nova reação. Claro está que tais procedimentos não são de simples execução, pois inclusive exigem um amplo conhecimento do material biológico utilizado, mas apresentam um enorme interesse prático. Conforme mencionado, as técnicas de DNA recombinante também podem ser aplicadas para tornar células produtoras de substâncias que naturalmente não são por elas produzidas, ,em virtude da ausência de codificação genética para tanto. Nesse caso, genes de certas células são transferidos, via vetores adequados, a outras células, como é o caso de introduzir a codificação para a síntese de glicoamilase de Aspergillus em células de Saccharomyces cerevisiae, o que passa a permitir a realização da fermenta~ão alcoólica de matérias~primas amiláceas, pela levedura alterada geneticamente. 3' Com esse objetivo, a tecnologia do DNA recombinante tem sido empregada para a obtenção de proteínas heterólogas de alto valor agregado, em particular para uso em saúde humana, como é o caso da produção de hormônio de crescimento humano, insulina, interferons, Fator VIII (tratamento da hemofilia) etc. Como microrganismos receptores da codificação genétiea empregam-se bactérias (Escherichia coZi, Bacillus subtiZis), leveduras (Saccharomyces cerevisiae) ou fungos filamentosos (Aspergillus niger). Igualmente são empregadas células animais (exem.:. pio: BHK - "Baby Hamster Kidney"), particularmente para a produção de proteínas mais complexas e de maior valor agregado, o que explica o crescente interesse das grandes empresas do setor no cultivo de células animais. Presentemente, é inclusive possível imaginar o emprego de um pequeno número de microrganismos, bem conhecidos em termos de necessidades nutricionais e características de crescimento, como é o caso de Escherichia coZi ou Saccharomyces cerevisiae, para a síntese de uma grande variedade de proteínas, no lugar de se ter como problema o cultivo de uma linhagem para cada composto a ser produzido. IO Microrganismos e meios de cultura para utilizaçã~ industrial ···- Claramente isso pode contribuir pa~a uma certa simplificação dos processos produtivos, desde que se consiga obter os mutantes adequados. 2.3 - Características desejáveis de microrganismos e meios de cultura para aplicação industrial Conforme já anunciado, no presente item pretende-se apresentar algumas características gerais que microrganismos e meios devem apresentar, a fim de que seja possível o estabelecimento de processo produtivo em larga escala. Buscar-se-á enunciar as características desejáveis de microrganismos e, em seguida, aquelas relacionadas aos meios de cultivo, lembrando, no entanto, que o desempenho de um dado microrganismo depende muito da composição do meio de cultura em que é colocado. Como se pretende expor características gerais, quando da análise de um dado processo fermentativo, é possível que algumas destas características não se apliquem, enquanto outras,não abordadas no presente texto, poderão ser de grande importância. No entanto, espera-se estabelecer certas reflexões que permitam essa análise crítica. 2.3. I - Características desejáveis de microrganismos Para uma aplicação industrial, espera-se que os microrganismos apresentem as seguintes características gerais: · · • apresentar elevada eficiência na conversão do substrato em produto; • permitir o acúmulo do produto no meio, de forma a se ter elevada concentração do produto no caldo fermentado; • não produzir substâncias incompatíveis com o produto; • apresentar constância quanto ao comportamento fisiológico; • não ser patogênico; • não exigir condições de processo muito complexas; • não exigir meios de cultura dispendiosos; • permitir a rápida liberação do produto para o meio. As duas primeiras características serão discutidas conjuntamente, pois, apesar de serem distintas, concorrem para o mesmo objetivo geral de extrema importância. [)e fato, uma célula deve permitir elevada conversão do substrato em produto, pois, com muita freqüência, as matérias-primas incidem pesadamente no custo do produto final, podendo-se mencionar uma incidência de 38 a 73% do custo total de produção como sendo devido às matérias-primas, em particular a fonte orgânica de carbono.1 Por outro lado, é sempre desejável que o microrganismo permita um elevado acúmulo do produto no meio, sem sofrer inibição mais acentuada em virtude deste acúmulo, pois isto concorre para uma redução nos custos de recuperação, os quais também podem ser muito acentuados. Tome-se como exemplo o caso da fermentação alcoólica, aqui representada simplificadamente pela equação química final (glicose em anaerobiose sendo convertida em etanol e gás carbônico): Características desejáveis de microrganismos e meios de cuaura para aplicação industrial II ..... C 6 H 12 Ü 6 ~ 2C 2 H 5 0H+ 2C0 2 Como se pode observar, o fator estequiométrico é igual a 0,511, ou seja, cada grama de glicose convertida gera 0,511g de etanol, sendo que o Saccharomyces cerevisiae, normalmente empregado nesta fermentação, com freqüência permite obter um rendimento da ordem de 90% deste valor estequiométrico, o que torna este microrganismo o mais importante para Tealizar esta conversão, lembrando que vários outros também podem acumular etanol, a partir da glicose, porém não com este rendimento tão elevado. Obviamente, não se consegue manter um processo de fermentação alcoólica obtendo-se 100% de rendimento, pois as células têm de proliferar, o que significa a síntese de muitos outros compostos intermediários, sendo o acúmulo de etanol a via metabólica que permite a geração de energia na forma de ATP (glicólise). Claro está que esse é um ponto fundamental, pois a matéria-prima incide em algo como 60% do custo do etanol e, desta forma, baixos rendimentos tornariam inviável a produção deste produto de baixo valor agregado. Por outro lado, sabe-se que quando se atinge 8 a 10% (em volume) em etanol no vinho fermentado, já ocorre uma clara inibição da levedura, o que faz com que a velocidade da conversão do açúcar em etanol fique prejudicada, razão pela qual procura-se não ultrapassar estes valores, pelo menos na produção de álcool combustível (não se está aqui comentando o caso de bebidas alcoólicas). Isso significa a necessidade de destilar um líquido que contém apenas 10% de etanol, o que - além do dispêndio de energia - ainda irá gerar 90% de resíduo na forma de vinhaça, que necessita encontrar um destino adequado. O ideal seria encontrar leveduras mais resistentes ao etanol, porém sem que { ocorra queda n. a velocidade da fermentação alcoólica (sem queda na produtividade), o que não é tarefa simples. De qualquer forma, fica claro que a conversão da matéria-prima em produto já é muito elevada, o que não permite visualizar grandes incrementos, lembrando, novamente, a necessidade de manter a viabilidade celular para que a fermentação não seja interrompida. Uma situação bem diversa é a que ocorre com os processos aeróbios, por exemplo,na produção de enzimas ou antibióticos. Nesse caso, a conversão do açúcar pode ser representada esquematicamente da seguinte forma: f Açúcar + 0 2 ~ células + C0 2 + H 20 + Intermediários + Produto Nesse caso, por se operar em aerobiose, a quantidade de células geradas costuma ser muito intensa, em relação ao açúcar consumido, ao lado de uma quantidade relativamente pequena do produto alvo (antibiótico ou enzima). Se, por um lado, o custo da matéria-prima incide menos 'pesadàmente no custo do produto final, as operações de recuperação do produto são necessariamente mais onerosas (chega-se a valores da ordem de 70%), mas o produto alvo é de mais alto valor agregado. Assim, ao se encontrar linhagens que cresçam relativamente menos, ou que acumulem menos compostos intermediários, é possível visualizar grandes incrementos na síntese do produto, conforme mencionado anteriormente para o caso da produção de penicilina. 12 Microrganismos e meios de cultura para utilização industrial · Mesmo permitindo o acúmulo do produto no meio, a célula produtora deve, ainda, contar com a característica de não produzir substâncias que sejam incompatíveis com o produto, pois isto pode levar a uma situação de desinteresse pelo processo produtivo. · Esse é o caso, por exemplo, de se estar interessado na produção de uma dada enzima, ou proteína, mas se utilizar uma linhagem que também seja uma boa produtora de proteases extracelulares. Assim, ao se produzir a enzima, separar as células e armazenar o produto, pode-se ter uma redução sensível da atividade enzimática em virtude da ação das proteases. Um exemplo adicional, mais específico, é sobre a produção de glicoamilase por Aspergillus. Como se sabe, a glicoamilase é a enzima que hidrolisa o amido gerando glicose, sendo pois de muito interesse em várias aplicações, destacando-se o preparo de xaropes de glicose para a indústria de alimentos. Ocorre que alguns microrganismos produtores de glicoamilase também sintetizam a transglicosidase, enzima esta que, quando na presença de glicose, volta a polimerizá-la, gerando moléculas que não são mais hidrolisadas pela glicoamilase. Na realidade, a presente característica desejável em uma célula pode ser bem mais generalizada. Um microrganismo ideal, quanto ao aspecto agora abordado, deve produzir o mínimo de outras substâncias, ao mesmo tempo em que sintetiza o composto pretendido. Isso leva a uma maior disponibilidade de nutrientes para a síntese do produto (voltando-se à discussão anterior), mas também permite vislumbrar uma maior facilidade na recuperação deste produto. ' Uma outra característica, da mais alta importância, refere-se à estabilidade fisiológica da linhagem a ser empregada industrialmente. Isso significa que não basta que se tenha uma linhagem hiperprodutora de uma dada substância de interesse, mas que se conheça as técnicas mais adequadas para a sua conservação e, mais ainda, que ela se mantenha como excelente produtora da substância de interesse ao longo de todas as etapas envolvidas desde sua proliferação em nível de laboratório, germinadores e biorreator principal (Fig. 2.1). Assim sendo; o constante estudo dessas formas de conservação maiS adequadas das linhagens é tarefa das mais importantes, mantendo-se, na indústria, aquelas realmente de interesse, assim como o imediato descarte dos lotes que demonstrem alguma tendência à atenuação quanto ao acúmulo do produto no meio. Para a célula há sempre a tendência em otimizar o crescimento, em detrimento da síntese do produto, motivo pelo qual não basta verificar, em termos de metodologias de conservação, se a célula cresce, mas se ela continua a acumular o produto de maneira eficaz. Conforme já mencionado anteriormente, quando uma célula prolifera, há sempre alguma probabilidade de ocorrerem mutações naturais. Em um processo fermentativo típico, normalmente parte-se de uma massa muitopequena de células nas etapas iniciais de preparo do inóculo (Fig. 2.1), chegando-se a biorreatores de dezenas de milhares de litros, contendo concentrações celulares com freqüência acima de 10 g de matéria seca de células/L, o que significa gerar, em termos de massa de matéria seca, algo em torno de toneladas de células. Isso mostra claramente a necessidade de se operar com material genético que seja estável, a fim de se contar com células competentes em termos de acúmulo do produto._ O emprego de linhagens relativamente instáveis, pode, inclusive, limitar o emprego de sistemas de fermentação mais eficientes, como os processos contínuos, Características desejáveis de microrganismos e meios de cu~ura para aplicação industrial 13 pois poderá ocorrer, ao longo do tempo, a seleção de células que privilegiem o crescimento em detrimento do acúmulo do produto. O fenômeno da atenuação do acúmulo do produto de interesse pode ocorrer tanto com linhagens naturais como, em especial, com as linhagens mutadas. Na literatura1 está bem documentada a viabilidade de se produzir lisina pOr mutantes auxotróficos, em processo contínuo, apenas quando se empregam mutantes auxotróficos em dois aminoácidps e não em apenas um, a fim de evitar os mecanismos de controle da célula e obtér o acúmulo intenso do aminoácido de interesse. Nessa condição, é mais difícil o retorno às características da linhagem original, em virtude de uma maior alteração a que a célula foi submetida. Células recombinantes, por via da introdução de plasmídeos, igualmente podem ser instáveis em virtude da inexistência de replicação do plasmídeo para .as células filhas, ou mesmo devido à destruição do plasmídeo na própria célula hospedeira, ou ainda à expulsão desse plasmídeo. É necessário lembrar que a introdução de novas codificações genéticas pode, eventualmente, significar um ônus adicional para a célula, a qual está interessada em aprimorar o seu crescimento. Inclusive, a integração de uma codificação genética contida em um plasmídeo ao cromossomo da célula, o que poderia conferir a desejada estabilidade, pode ainda não resultar na obtenção de uma hiperprodutora, em virtude da existência de um número limitado de cópias do gene de interesse. A operação de biorreatores de grande porte, conforme mencionado anteriormente, do ponto de vista técnico e econômico, praticamente exige o emprego de microrganismos não patogênicos, os quais possam ser manuseados sem riscos ambientais, particularmente nas etapas seguintes em relação ao término do processo fermentativo. Mesmo durante a fermentação, caso se manuseasse microrganismos patogênicos em reatores de dezenas de milhares de litros, os cuidados teriam de ser bastante -aumentados, particularmente com os gases efluentes, o que incidiria em custos adicionais. O cultivo de patogêil.icos é efetuado, por exemplo, para a produção de vacinas, em reatores_çle pequeno porte (da ordem de centenas ou poucos milhares de litros), porém confinados em câmaras assépticas, tomando-se precauções necessárias para a rião ·ocorrência de contaminação do meio ambiente. Isso, logicamente, significa custo adicional, o qual pode ser justificado no caso de produção de vacinas, mas tornaria inviável a produção de uma enzima ou mesmo um antibiótico. A obtenção de células recombinantes de Escherichia coZi, via a introdução de plasmídeos, é sempre algo muito atraente, pois esta é uma das bactérias mais conhecidas presentemente, mas encontra resistências em termos de uma utilização em instalações de grande porte, justamente por ser uma enterobactéria. Essa é uma das razões (não a única), pelas quais hoje se prefere partir de células de leveduras, ou fungos filamentosos não patogênicos, ou mesmo de células animais, a fim de se obter recorribinantes. Apesar disso, ainda existem discussões a respeito da disposição final dessas células recombinantes, conforme mencionado anteriormente. Um microrganismo também não deve exigir condições de processo muito complexas, por motivos claros de economicidade da produção, sendo que dentro deste tópico muitos aspectos podem ser abordados. Como se sabe, sempre existem valores ótimos d0 pH e da temperatura, por exemplo, em termos do acúmulo do produto. No entanto, também se sabe que o ~--- --· _._ _______ -----·- -· -·-·- -- · -------- ·-- - --- ··---- ·· ---- - - 14 1 i I I Microrganismos e meios de cu~ura para utilização industrial controle preciso do pH e da temperatura apenas é possível em reatores de bancada, sendo que em reatores de grande porte (dezenas de milhares de litros), deverá ocorrer uma certa heterogeneidade ao longo da altura do reator, de forma que a célula deverá manter o seu desempenho, apesar de uma certa flutuação nos valores destas grandezas tomadas como exemplo. Em outras palavras, o ideal é que o microrganismo tenha uma faixa de valores ótimos dessas grandezas e não valores pontuais, particularmente no que se refere ao acúmulo do produto. Nessa direção, são igualmente muito interessantes os microrganismos que conseguem manter um bom desempenho, quando cultivados em baixas concentrações de oxigênio dissolvido. Como ficará claro no capítulo sobre transferência de oxigênio, a necessidade de manutenção de altas concentrações de oxigênio dissolvido traz problemas bastante sérios no tocante a um maior dispêndio de energia, em virtude de uma maior agitação e aeração do meio. Nesse sentido, os microrganismos que crescem de forma aglomerada (forma miceliar, por exemplo), são sempre mais complicados, pois a ·concentração de oxigênio no meio de cultivo terá de ser mais elevada, a fim de que as células mais internas destes aglomerados tenham acesso a este oxigênio, quando comparadas às células que crescem isoladamente. Já foi abordado anteriormente a inconveniência em operar corh linhagens que excretem quantidades exageradas de proteínas para o meio, mas ainda há uma questão adicional, pois a geração de espuma freqüentemente se atribui à presença de proteínas no meio de cultivo, situação ainda mais complexa para os processos aeróbios, devido à necessidade de aerar e agitar.o conteúdo do bioi:-reator. Em geral, a geração de espuma pode ocorrer no início de um processo fermentativo aeróbio, quando se empregam meios de cultivo contendo extratos de carne ou de levedura, ou água de maceração de milho ("com steep liquor"), e nas etapas mais avançadas de um processo em virtude da presença de proteínas. Isso causa sérios problemas, como a necessidade de empregar um menor volume útil do reator, a fim de ter condições de controlar a espuma, além da freqüente necessidade de empregar antiespumantes que, além de onerarem o produto final, ainda podem causar dificuldades nas etapas de recuperação do produto e uma redução na transferência de oxigênio, o que exige o aumento da agitação e da aeração, agravando a situa.ção. Assim, é .importante a seleção de microrganismos que excretem poucas proteínas juntamente com o produto desejado. As características que um meio de cultivo devem apresentar serão discutidas no próximo subitem mas, neste momento, convém mencionar que o microrganismo selecionado para um processo industrial não deve exigir meio de cultura extremamente oneroso, por questões claramente de econorrlia do processo produtivo. Essa é a razão pela qual um maior conhecimento das necessidades nutricionais de uma linhagem é estudo de vital importância, objetivando o fornecimento dos nutrientes apenas necessários. Em algumas circunstâncias esse desconhecimento leva à necessidade da adição de certas substâncias, como extrato de levedura, extrato de carne, peptona etc., as quais costumam ser bastante dispendiosas. Particularmente na área de produção de vacinas, costuma-se utilizar meios de cultura bastante complexos e.onerosos, assim como nos cultivos envolvendo células animais, mas aqui, novamente, os volumes de reação são relativamente pequenos e os produtos gerados podem ser considerados como de alto valor agregado. t Fina lmenhte: codmo com muita freqüênc ia lh ·magina-s e a prodduçl~bo defip~ oduto.s ex race1u 1ares, a to o o interesse em que a 1in agem se1eciona a t ere act e rapt- L.~--- - ----------·--------- ---· -~- 1 Características desejáveis de microrganismos e meios de cultura para aplicação industrial I5 damente o produto para o meio, de onde ele será recuperado nas etapas seguintes ao processo fermentativo . Além do aspecto ligado a uma eventual inibição do próprio microrganismo, pela retenção de um dado produto do metabolismo, ainda cumpre lembrar que, com freqüência, a primeira etapa de recuperação do produto significa a separação do microrganismo (por centrifugação ou filtração), trabalhando, a seguir, com o líquido isento de células e estas descartadas. Assim, se algum produto ainda permanece associado às células, será perdido. Sabe-se que a retenção de certos produtos pelas células depende de uma série de fatores, tais como: da linhagem empregada, da composição do meio de cultivo e das condições impostas (pH, temperatura etc.). Nessa direção, um exemplo interessante foi o apresentado por AGUERO et al} trabalhando no estudo da produção de glicoamilase por Aspergillus niger NRRL 337 e Aspergillus awamori NRRL 3112, sendo esta segunda linhagem, sem dúvida, melhor produtora que a primeira. Esses autores indicaram que, a pH 4, o A . niger reteve cerca de 30% da atividade associada às células, enquanto que o A. awamori apenas algo em torno de 10%, indicando que a linhagem melhor produtora tende a ser mais eficiente na excreção. do produto de interesse. Já a pH 6, as células de A. niger retiveram cerca de 70% da atividade enzimática, enquanto que nas células de A. awamori esta retenção foi da ordem de 40%, em relação à atividade total (soma da atividade enzimática extracelular, encontrada no caldo, e a atividade intracelular, ou seja, a atividade encOntrada nas células - atividades enzimáticas expressas por unidade de volume de amostra), mostrando de forma clara a influência do pH na eficiência da capacidade de excreção das células. Ainda, indicaram que as atividades totais obtidas com cada uma .das linhagens atingiram valores muito próximos, tanto a pH 4 como 6, indicando .que o pH interferiu na excreção, mas não na sjntese propriamente dita. Esses resultados indicam a necessidade de se verificar, com a devida atenção, a retenção do produto de interesse pelas células, quando se procura efetuar trabalhos de seleção de linhagens, ou se esteja estudando diferentes condições de cultivo, mesmo que o interesse resida na recuperação de produtos extracelulares. Caso contrário, corre-se o risco de descartar linhagens, ou condições de cultivo, que poderiam ser potencialmente interessantes. 2.3.2 - Características desejáveis de meios de cultivo Conforme já comentado no início do item 2.3, é sempre muito difícil mencionar as características de microrganismos, sem associá-los a um determinado meio de cultivo. Dessa forma, as características acima indicadas, na verdade em muitos casos, dependem do meio utilizado, de maneira que se poderia repetir, no presente item, características como permitir o acúmulo de produto no meio, não permitir a síntese de substâncias incompatíveis com o produto etc. Claramente isso não teria um maior interesse, além de tornar-se monótono, preferindo-se descrever algumas características mais específicas, mas que agora, obviamente, dependerão do microrganismo a ser utilizado. Igualmente, não será apresentada uma discussão item a item, mas será efetuada uma abordagem mais geral. 16 Microrganismos e meios de cultura para utilização industrial Algumas características gerais, que devem ser consideradas, são: • ser o mais barato possível; • atender às necessidades nutricionais do microrganismo; ' • auxiliar no controle do processo, como é o caso de ser ligeiramente tamponado, o que evita variações drásticas de pH, ou evitar uma excessiva formação de espuma; • não provocar problemas na recuperação do produto; • os componentes devem permitir algum tempo de armazenagem, a fim de estarem disponíveis todo o tempo; • ter composição razoavelmente fixa; • não causar dificuldades no tratamento final do efluente. Todas essas são características importantes, destacando-se o custo do meio de cultura, que deve ser o menor possível, desde que atenda às necessidades do microrganismo selecionado. Justamente essa combinação de atender às necessidades nutricionais do microrganismo, a fim de que o produto possa ser sintetizado, e ser minimamente oneroso, é que, com freqüência, acaba por causar certas complicações, que merecem ser mais detidamente discutidas. Como se sabe, os microrganismos utilizam como fonte de carbono, e freqüentemente de energia, diversos açúcares, tais como:..glicose, sacarose, frutose, ou ainda polissacarídeos, como o amido e a celulose. Como fonte de nitrogênio { são freqüentemente utilizados sais, como o (NH4 hS0 4 (o qual costuma provocar reduções significativas do pH e, em alguns casos, fenômenos de inibição pelo sulfato), o (NH4 ) 2HP04 , ou aminoácidos, ou a uréia (a qual permite reduz,ir os problemas de controle do pH). Como fonte de fósforo utilizam-se os fosfatos solúveis, como o monoamônio fosfato (MAP), ou o diamônio fosfato (DAP), os quais passam a ser fontes de nitrogênio e fósforo simultaneamente. Ainda, necessita-se adicionar outros elementos, como: Na, K, Ca, Fe, Cu, Mg, Mn, Co etc., em concentrações freqüentemente muito reduzidas, na forma de seus sais solúveis. Meios de cultura constituídos apenas por essas substâncias costumam ser chamados de meios definidos, ou meios sintéticos, cuja composição química é sempre muito bem conhecida e pode ser reproduzida a qualquer instante. Por essa razão, para as células que apresentam bom desempenho em meios desse tipo, espera-se a ocorrência de um sistema produtivo muito estável, além de, em geral, não apresentarem problemas quanto à recuperação e purificação do produto final. Esses meios, mesmo sendo mais onerosos, podem ser preferidos, caso realmente permitam uma maior economia nas etapas de recuperação do produto. No entanto, para uma grande variedade de linhagens, há a necessidade da adição de certos "fatores de crescimento", ou seja, alguns aminoácidos específicos ou vitaminas (como biotina, tiamina, riboflavina etc.). Claro está que, quando se conhecem essas necessidades específicas, o que nem sempre é o caso, é possível adicionar essas substâncias puras, a fim de manter o meio em sua forma mais definida, mas o custo destes meios pode tornar-se inviável, particularmente para ins, talações de grande porte, a menos que isto signifique um enorme ganho Características desejáveis de microrganismos e meios de cultura para aplicação industrial 17 econômico na recuperação do produto, ou preserve alguma característica fundamental deste produto, necessariamente de alto valor agregado. Alternativamente, para suprir as necessidades de linhagens mais exigentes e, em geral, com características nutricionais mal conhecidas, pode-se adicionar certos materiais complexos como: extrato de levedura (autolisado de leveduras), extrato de carne, extrato de malte, peptona (hidrolisado de proteínas) etc. Esses materiais (individualmente ou adicionados .conjuntamente) permitem introduzir no meio de cultura os fatores faltantes em um meio definido, mas, além de onerosas, são complexas e de composição variável ao longo do tempo de armazenagem e na dependência do fabricante e do lote empregado. Assim, pode-se imaginar a ocorrência de oscilações no processo fermentativo, além de possíveis dificuldades nas operações de recuperação do produto final, dependendo das características deste produto e das operações de recuperação. É freqüente observar-se, n~s trabalhos básicos de isolamento ou seleção de linhagens, o emprego de meios contendo quantidades muito grandes desses extratos ou hidrolisados (vários gramas por litro, ou mesmo dezenas de gramas por litro). Dessa forma, no desenvolvimento do processo produtivo, uma das tarefas iniciais é verificar a possibilidade da obtenção de iguais desempenhos, porém em meios isentos desses materiais, ou com a adição de quantidades mínimas, tendo em vista o custo envolvido. Na direção dos meios mais complexos e, igualmente, menos onerosos, razão pela qual são empregados na maioria dos processos fermentativos em grande escala, cumpre mencionar o uso de matérias-primas naturais, tais como caldo de cana-de-açúcar, melaços, farinhas diversas (farinha de trigo, milho, soja, cevada), água de maceração de milho ("com steep liquor") etc. · Essas matérias-primas são de composição química desconhecida, podendo-se conhecer os teores dos açúcares disponíveis, nitrogênio, fósforo, mas não se conhecem os teores dos sais minerais, pois certamente há sempre um número muito grande de constituintes. Meios de cultura contendo esses materiais naturais com freqüência são completados com alguns sais (particularmente contendo nitrogênio e fósforo). Claro está qu~ a composição química estará na dependência de uma série de fatores, tais como solo, variedade do vegetal, safra, clima, processamento durante a colheita e estocagem etc. Esses fatos indicam já a expectativa de que possam ocorrer oscilações no processo fermentativo que emprega essas matérias-primas, além de obrigarem as empresas produtoras de antibiótico$, ou enzimas a manterem instalações piloto para o ajuste da composição do meio a cada novo lote de matéria-prima que a empresa recebe (particularmente aquelas que usam a água de maceração de milho), a fim de evitar maiores surpresas nos biorreatores de grande porte. Inclusive essas matérias-primas naturais podem causar problemas adicionais na recuperação e purificação do produto final, assim como problemas nos tratamentos das águas residuárias. No entanto, ainda continuam a ser as matérias-primas preferidas em grande número de casos, pela simples razão de serem as mais baratas. 18 Microrganismos e meios de cultura para utilização industrial 2.4 - Considerações finais A definição adequada do microrganismo a ser empregado, assim como do meio de cultura para este microrganismo, é etapa fundamental para o sucesso de um processo fermentativo. No entanto, é sempre importante lembrar que a definição de um processo fermentativo mais adequado, assim como as preocupações com a recuperação do produto, são etapas da mais alta importância. Em alguns casos, o emprego de microrganismos disponíveis em coleções de cultura pode levar ao desenvolvimento de processos produtivos que sejam atraentes. É necessário lembrar, no entanto, que presentemente se dispõe de muitos recursos para o aprimoramento de linhagens produtivas, o que torna os processos fermentativos cada vez mais promissores. Essas considerações trazem também um importante alerta sobre a constante necessidade de desenvolvimento do processo produtivo já instalado, justamente por essa grande variedade de desenvolvimentos possíveis. Presentemente é bastante difícil imaginar que uma dada empresa disponha do microrganismo "ótimo", ou do meio de cultura "otimizado". É da mais alta importância que essa empresa continue a busca por melhores condições, em termos de microrganismo e meio; caso contrário, poderá ser ultrapassada por outras com ofertas de produtos de menor custo, ou melhor qualidade. Referências bibliográficas (1) STANBURY, P.F.; WHÍTAKER, A.; HALL, S.J. Principies of fermentation Technology. 2.ed. Reino Unido, Elsevier Science Ltd., 1995. (2) SCHMIDELL, W.; FERNANDES, O.L. O aspecto evolutivo dos processos industriais biotecnológicos. Revista Politécnica, n. 209, p. 31-3, 1993. (3) SANTOS, M.G.G.R.; ABOUTBOUL, H.; FARIA, J.B.; SCHMIDELL, W.; SCHENBERG, A.C.G. Genetic improvement of Saccharomyces for et,hanol production from starch. Yeast, v. 5 (Spec. Iss.), p. 11-15, 1989. (4) ABUD, A.K.S.; TAVARES, L.B.B.; FACCIOTTI, M.C.R.; SCHMIDELL, W.; FARIA, J.B.; SCHENBERG, A.C.G. Avaliação do comportamento cinético da levedura Saccharomyces cerevisiae recombinante L36 em biorreator: influência do método de preparo do inóculo. In: XI Simpósio Nacional de Fermentações, São Carlos (SP), 1996. Anais, v.1, p. 1-6, 1996. (5) AGUERO, J.M.Z.; MACEDO, G.R.; FACCIOTTI, M.C.R.; SCHMIDELL, W. Influência do pH na síntese liberação de glicoamilase por Aspergillus awamori NRRL 3112 e Aspergillus niger NRRL 337. Revista de Microbiologia, v. 21, n. 4, p. 355-60, 1990. e 19 ____ E~:I:[~~:~G~ - -- --· '-V ---5_, ...1..-.~~--.'-ft ----. -- · -----~ ----=D~ =-~a - ------ I~V~ -r-~11111; · 111-1-V ---- ---- ·- ~ - - - -- -·- - - -·-· - - - Luiz Carlos Urenha José Geraldo da Cruz Pradella Maria Filomena de Andrade Rodrigues 3.1 - Introdução Esterilizar um equipamento significa eliminar todas as formas de vida de seu interior ou superfície. Em alguns processos biotecnológicos industriais, a eliminação parcial da população microbiana dos equipamentos é suficiente para garantir a qualidade que se deseja no produto. Por exemplo, nos processos onde inibidores de crescimento são produzidos (fermentação alcoólica, produção de vinagre/ ácido acético, ácido láctico ou antibióticos e outros biocidas, etc.) o teor de inibidor impede em maior ou menor grau o crescimento de vários microrganismos. Na indústria de laticínios, os processos de pasteurização destroem a maior parte, mas não todos os microrganismos presentes. 1' 2 A pasteurização é empregada quando uma assepsia mais rigorosa destruiria propriedades importantes do alimento e seus subprodutos . · Assim, desenvolveram-se processos de desinfecção que não esterilizam, mas garantem a assepsia adequada. Essa situação é comum na indústria de alimentos, onde a eliminação de microrganismos patogênicos é levada a efeito por processos não esterilizantes. Nesses casos, a população de microrganismos que não é eliminada é mantida sob controle pela imposição de condições que impedem seu desenvolvimento, como refrigeração ou aplicação de inibidores de crescimento (sais, açúcares em altas concentrações, condimentos, preservantes químicos, biocidas, biostáticos, etc.). Os processos de produção de bens destinados à saúde humana ou animal e os de alimentos enlatados estão entre os mais restritivos com respeito à presença de contaminantes. Nesses casos, a simples presença de uma única célula de contaminante pode pôr a perder todo um lote do produto. Para lidar com essas situações, desenvolveu-se uina série de técnicas para alcançar o tipo adequado de assepsia. Esse assunto será abordado no item 3.2. 20 Esterilização do equipamento A esterilização de equipamentos é feita pela aplicação de métodos físicos ou químicos. Os métodos físicos mais freqüentes são o calor seco, calor úmido, radiação ultravioleta, radiação com partículas ionizantes (gama) e ultra-som. Os métodos químicos consistem na limpeza do equipamento com líquidos ou gases que matam os microrganismos ou danificam irreversivelmente sua capacidade reprodutiva (hipoclorito, fenóis, formaldeído, óxido de etileno, ozônio, dióxido de enxofre, etc.). Reatores bioquímicas e tubulações são, geralmente, esterilizados pela apliw cação de calor úmido (vapor saturado). Equipamentos destinados ao processamento de produtos de fermentação (bombas, filtros, centrífugas, misturadores, separadores, colunas cromatográficas, homogeneizadores, etc.) são preferencialmente esterilizados por calor úmido. Nos casos em que isto não é possível, empregam-se agentes químicos adequados. Material de laboratório utilizado durante o processo é esterilizado por calor úmido (autoclaves), seco (fornos) e mais raramente por radiação ultravioleta. Meios de cultura são esterilizados por calor úmido. Nos casos em que a inativação térmica de nutrientes do meio é significativa (cultura de células animais, vegetais ou de insetos, por exemplo) emprega-se a filtração em membranas ou cartuchos esterilizantes para remover fisicamente os microrganismos. O ar para o processo fermentativo é esterilizado por filtração em cartuchos esterilizantes. Embalagens são em geral esterilizadas por radiação gama, calor úmido, ou por lavagem com produtos químicos adequados. Os métodos de esterilização agem destruindo ou comprometendo estruturas microbianas, como paredes celulares, ácidos nucléicos, etc., ou inativando enzimas, proteínas, etc. O número de microrganismos que sobrevive em qualquer estágio de uma esterilização depende diretamente do número inicialmente presente. Portanto, onde for necessário aplicar esterilização, a limpeza e uma baixa carga inicial de microrganismos interferem fortemente na severidade do processo a ser aplicado. 3 3.2 - Terminologia e modo de atuação 3.2.1 - Esterilização Esterilização é o processo físico ou químico que destrói ou inativa todas as formas de vida presentes em um determinado material, especialmente microrganismos incluindo bactérias, fungos - tanto em suas formas vegetativas como esporuladas - e vírus. O termo esterilização possui um significado absoluto e não relativo, ou seja, uma substância ou material não pode ser parcialmente estéril. Um material estéril é totalmente isento de qualquer organismo ativo. Essa condição deve se manter indefinidamente. 3A' 5' 6 Terminologia e modo de atuação 2I 3.2.2 - Desinfecção Desinfecção é um processo menos rigoroso de eliminação de microrganismos, envolvendo usualmente o uso de um agente químico, denominado desinfetante ou germicida, geralmente líquido e à temperatura ambiente ou moderada. A desinfecção não implica necessariamente na eliminação de todos os microrganismos, sendo direcionada aos mais prejudiciais, principalmente em sua forma vegetativa, que é menos resistente que a forma esporulada. Antisséptico é um desinfetante, aplicável em seres animados (humanos e animais) para eliminar microrganismos patogênicos.3 A Tabela 3.1 apresenta uma relação dos principais termos técnicos relacionados a processos de desinfecção, com seus significados. 3.2.3 - Modo de ação dos agentes esterilizantes Agentes esterilizantes podem ser classificados como agentes físicos oU químicos. Esses agentes podem induzir, por diferentes mecanismos, a formação de substâncias químicas letais no interior das células e/ ou alterações em moléculas essenciais para a manutenção e sobrevivência celular, levando à morte do microrganismo. A morte celular pode ser causada por uma ou mais lesões. Na célula viva normal existem inúmeros alvos possíveis de lesão celular, tais como: (a) enzimas, responsáveis pelos processos metabólicos; (b) membrana citoplasmática, que mantém a integridade do conteúdo celular, controlando o transporte de substâncias entre a célula e seu meio externo, além de ser também o local de algumas reações enzimáticas; (c) parede celular, que proporciona rigidez e resistência mecâiüca aos microrganismos e participa de alguns processos fisiológicos. Uma lesão em qualquer um desses níveis pode desencadear alterações que levam à morte celular. Alternativamente, um dano irreversível a um gene, responsável pela codificação de alguma éniima essencial, também pode levar à morte celular. A seguir descreveremos como agem os principais agentes esterilizantesY'6 Calor úmido A temperatura elevada, associada ao alto grau de umidade, representa um dos métodos mais efetivos para a destruição dos microrganismos. O calor úmido mata os microrganismos, principalmente pela desnaturação irreversível de suas proteínas, destruindo portanto elementos essenciais para a sobrevivência e multiplicação celular, como enzimas ·e membranas celulares. A resistência das proteínas ao calor é uma função da hidratação da célula. Quanto maior a quantidade de água, mais facilmente esta entrará nos domínios internos das moléculas de proteína, causando mudanças conformacionais irreversíveis. Além das proteínas, os carboidratos também sofrem alterações sob o tratamento de calor, sendo muitas vezes caramelizados e gerando produtos tóxicos. Essa degradação exerce, portanto, um papel importante na esterilização. 22 Esterilização do equipamento Tabela 3.1 - Principais termos técnicos utilizados em processos de assepsia e seus significados SIGNIFICADO TERMO ~ "'{=" 1:;': Esterilização Remoção de todas as formas de vida de um objeto ou material. Desinfecção Remoção ou destruição dos organismos vivos capazes de causar danos ou infecções. Agente químico capaz de promover desinfecção. Desinfectante ou germicida _} ~i ~-~\ = ··. ~( 1j ~ ·~ ~-· ! --, ' Agente químico aplicável em pessoas ou animais, com capacidade de eliminar microrganismos patogênicos. Antisséptico Remoção de microrganismos patogênicos ou indesejados. Assepsia .. :! ~; ,-.1 ' ~; ~::.: 1•• if Tratamento térmico (geralmente 62°C por 30 min, seguido de resfriamento :?;' brusco) para redução drástica no número de microrganismos - presentes c}T" .:,.'[ em alimentos, normalmente leite, -u· seus derivados, e bebidas enlatadas . ~? ou engarrafadas. ~ ? :;:;, Processo de esterilização capaz de •.v eliminar esporos altamente resisten~ tes ao calor. Consiste em manter, o material a 100°C por vários minutos, resfriá-lo a temperatura ambiente e incubá-lo por cerca de 24 h. O proce- ~ dimento é repetido várias vezes. Du- r~ rante a incubação, os esporos passam à forma vegetativa, onde são suscep!.:~ tíveis à destruição durante o aqueci.iJ mento seguinte. ~l Pasteurização ~ Tindalização . ~ -'.;~t;~ Agentes capazes de causar a morte de microrganismos. Biocidas ! li i Biostáticos 'h·-- • ' .~, ·~._,_ "'.rt!>.::':.;, . •, ... ...,.~-..... - •. .-s.:J...:.:;,;.; . . •. .,,,..,....,..,_.- ,;,.·. ·.:;-<;.;.r ~·"" Agentes capazes de impedir a repro- :WJ dução de microrganismos, sem neces- I·~ .,li~~ig_J!l~~t~-~-!~-:. . .ow-_. ..., . los.;. . _ .·,F·· ..;:;.._..;:;;· ·..:..:.:.u....,. ..& ..- ~ 11 :! 1 1 , Na esterilização por vapor sob pressão (por exemplo, nas autoclaves), esta tem duas funções principais: uma delas está relacionada com a transferência de calor, que é favorecida pela condensação ocorrida no material, levando a um rápi- l_ ___ :~a~ento-:e~e~~er:~ra-( di~s~:_:e ~alor)-~utra-é amanutenç~o:u_~: __ _ _ Terminologia e modo de atuação 23 menta do nível de hidratação no interior das células, favorecendo portanto a coagulação das proteínas. Calor seco ·O calor seco destrói os microrganismos através da oxidação de seus constituintes químicos . A esterilização por calor seco é muito mais lenta e menos eficaz que por calor úmido. Ao contrário do calor úmido, nesse tipo de esterilização o calor é transferido muito lentamente e o nível de hidratação das células tende a diminuir, conferindo urna certa proteção às proteínas. Apesar de a esterilização pelo calor seco ser principalmente um processo de oxidação, não se pode afirmar que a ação do calor seco seja restrita a isto, pois nem sempre o que ocorre é uma esterilização apenas por calor seco. Dependendo do conteúdo de água na célula, pode oçorrer também a coagulaÇão de proteínas. Irradiação por luz ultravioleta (UV) A radiação UV é absorvida por muitas substâncias celulares, mas de modo mais significativo pelos ácidos nucléicos, onde geralmente ocorrem as lesões. O seu efeito letal é proporcional à dose de radiação aplicada. A região do espectro de UV com ação esterilizante é de 220 a 300 nrn, muitas vezes chamada de região "abiótica". Existe urna relação entre os comprimentos de onda germicidas e aqueles absorvidos por ácidos nucléicos ou seus constituintes. Compostos corno as purinas e pirirnidinas, absorvem UV a aproximadamente 260 nm, bem próximo da radiação mais efetiva que é 253,7 nrn. Os aminoácidos aromáticos, corno o triptofano, fenilalanina e tirosina, absorvem UV a 280 nrn. ·. Dentre os componentes dos ácidos nucléicos, os fosfatos de açúcares não absorvem significativamente UV acima de 220 nrn. As pirirnidinas são muito mais sensíveis ao UV do que as purinas, por isto os efeitos letais e de rnutagênese nos sistemas biológicos são atribuídos a transformações fotoquímicas das bases de pirirnidina. A ação esterilizanté do UV ocorre primeiramente pela produção de ligações cruzadas entre pirirnidinas adjacentes na mesma fita de DNA (ácido desoxirribonucléico), formando dírneros. Essa reação ocorre principalmente entre resíduos de timina, formando dírneros de tirnina, levando à ·perda da integridade do DNA bacteriano (Fig. 3.1). Essas ligações podem causar erro de leitura do código genético, resultando em mutações que prejudicam funções vitais do organismo e conseqüentemente causando a morte celular. Existem mecanismos de reparo, pelos quais a integridade do DNA pode ser recuperada, dependendo do nível de lesão. · uv Timinas Figura 3.1 - Formação do dímero de timina Dímero de .timinas 24 Esterilização do equipamento Dímeros mistos de citosina-timina e citosina-citosina também foram identificados em DNA de organismos irradiados. Apesar de serem menos freqüentes, também podem apresentar efeitos letais. ORNA também pode sofrer ação do UV, que gera dímeros de hidratos e uracila, que podem causar inativação do RNA. I Vários fatores podem influenciar na sensibilidade microbiana a UV. Destacam-se o pH, o estado fisiológico das células (a maior atividade é na fase logarítmica de crescimento) e a constituição genética. Radiação ionizante As radiações ionizantes eletromagnéticas são principalmente alfa (a), beta (p), gama (y), raios X, raios catódicos, além de prótons, nêutrons e elétrons de alta energia. Esse tipo de radiação pode causar uma grande variedade de efeitos físicos e bioquímicas em microrganismos. O principal alvo que leva à perda de viabilidade é a molécula de DNA. Na radiação ionizante, um átomo emite elétrons de alta energia, que ionizam sua molécula. O elétron é ejetado e absorvido por outro átomo, criando uma cadeia de ionizações na substância irradiada. Essa atividade excita grupos químicos no DNA, causando a produção de radicais químicos altamente reativos, os quais podem alterar grupos químicos e até quebrar as· fitas de DNA, causando mutações. A morte celular resulta da formação de uma cadeia de ionização numa porção significativa do DNA. Geralmente, a sensibilidade dos diferentes organismos a radiações ionizantes varia com o volume de DNA. Em geral, formas multicelulares são mais sensíveis à radiação ionizante do que organismos unicelulares, Óxido de etileno Óxido de etileno (EtO) é um éter cíclico que mata as células, agindo como agente alquilante. A sua ação consiste na substituição de um átomo de hidrogênio (através de umareação de alquilação) de grupos funcionais de proteínas, ácidos nucléicos e outras moléculas (carboxila livre, amino oti sulfidrila) pela molécula de EtO aberta (CH 2CH2 0-) como exemplificado na Figura 3.2. Essa reação resulta no bloqueio dos grupos ativos das moléculas. No caso das proteínas, ocorre a desnaturação. Óxido de etileno Enzima inativada Figura 3.2 - ReàÇão de alquilação entre o óxido de etileno e uma enzima Esterilização por agentes tlsicos 25 Glutaraldeído O glutaraldeído age na superfície das células, onde ocorrem interações glutaraldeído-proteínas, gerando diversos produtos. Essa interação aumenta com a elevação do pH, mas os produtos formados são estáveis à hidrólise ácida. O glutaraldeído reage principalmente com os grupos amina livres das proteínas da camada de peptoglicana das bactérias, o que interfere no transporte de aminoácidos de baixo peso molecular. Em vários microrganismos ocorre a aglutinação celular, devido à formação de ligações intercelulares. 3.3- Esterilização por agentes físicos Os principais agentes físicos esterilizantes são: calor seco, calor úmido, radiação ultravioleta, radiação gama e sonicação. Cada um deles encontra aplicação em diferentes partes de um processo de assepsia. 3.3.1 -Esterilização por calor úmido O agente de uso mais freqüente é o calor úmido, fornecido por vapor de água saturado. A facilidade de obtenção, de manuseio, sua eficácia e custo relativamente baixo explicam o uso freqüente. O vapor é obtido em caldeiras e distribuído por dutos de aço galvanizado ou aço inoxidável, isolados termicamente. Pelas altas temperaturas e pressões nas caldeiras, o vapor é considerado estéril. No entanto, em alguns casos mais críticos, utiliza-se filtração em cartuchos esterilizantes imediatamente antes da entrada do vapor no processo. Tubulações e reatores (fermentadores), vazios ou carregados com meio de cultura, são usualmente esterilizados por calor úmido. Esterilização de reatores vazios A esterili:zação de reatores vazios consiste em injetar vapor diretamente em seu interior e promover inicialmente a expulsão de todo o ar presente. Após a expulsão do ar, o reator é fechado e injeta-se vapor até que a temperatura e pressão internas sejam adequadas, comumente 121 oc e 1 atm. A partir desse momento, e por todo o tempo de esterilização, novas injeções só são necessárias para manter constantes a pressão e temperatura. Terminada a esterilização, a entrada de vapor é fechada e ar esterilizado deve ser injetado, para evitar que o resfriamento e a conseqüente condensação do vapor presente no interior do reator gere vácuo, o que poderia provocar danos ao equipamento ou promover a entrada de ar externo contaminado, por eventuais pequenas fissuras em soldas, vazamentos em válvulas, etc. Após o resfriamento e estabilização da pressão interna, o meio de cultura esterilizado externamente, por esterilização contínua ou não, pode ser carregado e a utilização do tanque ser iniciada. Esterilização de reatores com meio de cultura A esterilização de reatores como meio de cultura (esterilização descontínua) é feita em três etapas. Durante todo o processo de esterilização, uma agitação mínima deve ser fornecida ao meio de cultura. ·26 i li il !i !t li li li li" Ir I I ~ ~ M Esterilização do equipamento Inicialmente, circula-se vapor pela serpentina ou camisa até que a temperatura do meio de cultura seja maior que 96 a 97°C. Durante essa etapa, a cabeça do tanque deve receber vapor fluente para expulsão do ar de seu interior. Ao mesmo tempo, as válvulas, filtros e tubulações de entrada e saída do reator também são esterilizadas por vapor fluente. · Na etapa seguinte, injeta-se vapor diretamente no meio de cultura até que este atinja 100°C. A partir desse momento, o reator é completamente fechado e a injeção de vapor continua até que a temperatura e pressão internas sejam adequadas (por exemplo 121 °C e 1 atm). Atingido esse patamar, a injeção direta de vapor pode ser cortada e o controle de temperatura e pressão mantidos através da serpentina ou camisa pelo tempo necessário. O resfriamento é feito pela circulação de água fria na serpentina ou camisa. Quando a temperatura atingir a marca dos 100°C, deve-se injetar ar esterilizado no tanque para evitar formação de vácuo pela condensação do vapor presente. A injeção direta de vapor provoca um aumento no volume de meio de cultura de cerca de 10 a 15%, em função da condensação. Por essa razão, o meio de cultura deve ser preparado concentrado, tendo em vista sua posterior diluição pelo condensado. O tempo de esterilização é função das condições do próprio reator e do processo. Se um reator é usado sempre com o mesmo micrOrganismo, e se ele estiver em bom estado (perfeitamente limpo, sem fissuras, sem vazamentos em válvulas ou conexões de sensores), 20 a 40 minutos a 121 oc e 1 atm devem ser suficientes para sua esterilização. Se for um reator multipropósito, utilizado com bactérias ou fungos formadores de esporos altamente resistentes ao calor, ele deve passar por assepsia química antes da esterilização por vapor. Nesse caso, a manutenção a 121 oc e 1 atm deve se estender por um tempo que pode ser maior que 60 minutos, desde que não prejudique o meio de cultura. Uma etapa crítica é a de aquecimento do· meio de cultura desde a temperatura ambiente até atingir 96 a 97°C, quando o processo é feito por serpentinas ou camisa. Nesse caso, uma relação adequada entre a área de serpentina ou camisa e o volume de meio de cultura favorece o rápido aquecimento. As Figuras 3.3 e 3.4 apresentam curvas de aquecimento de meio de cultura em reatores de volume útil 2 200 1 e 2.000 1 respectivamente. O tanque de 200 1 apresenta 6,5 m de área de troca 3 2 térmica por m de meio de cultura. O tanque de 2.000 1 apresenta 1,8 m de área de 3 troca térmica por m de meio de cultura. Reatores com esterilização programável Equipamentos mais sofisticados, completamente automatizados, trazem incorporada a função de esterilização em seu software de controle. Nesse caso, para proceder à operação de esterilização, basta um comando do operador num painel ou em um rnicrocomputador de controle. Em geral, pode-se escolher. o tempo e a temperatura de esterilização. Esses equipamentos são disponíveis em qualquer capacidade, desde os de bancada até os industriais. \I -'----------- - --- ------ ----- --- ~--·----- - ~-- --------------- - ------- ------ - --- ---- .....____ Esterilização por agentes fisicos o o o o o o o o ., 27 CURVA DE AQUECIMENTO fermentado r de 200 L 120 100 ô ~ 80 ~ B ~ 60 C1l a. E C1l t- 40 20 o o 5. 15 10 20 25 30 Tempo (min) 2 3 Figura 3.3 - Formato do tanque de 200L úteis (6,5 m serpentina/m de meio de cultura), e curva de aquecimento. Caso a auto-esterilização seja feita por injeção de vapor diretamente no meio de cultura, deve-se considerar a diluição de 10 a 15% provocada pela condensação do vapor. A injeção direta de vapor pode, em alguns casos, provocar a formação de espuma em grande quantidade no reator. Se o problema for crítico, a esterilização deve ser levada a cabo apenas através da camisa ou serpentina.2 Esterilização em autoclaves A esterilização por calor úmido de reatores de pequeno porte (até cerca de 30 L) e de vidrarias e outros materiais, inclusive meio de cultura, é em geral feita em autoclaves. A Figura 3.5 apresenta simplificadamente um reator sendo esterilizado em uma autoclave . - ··· 28 Esterilização do equipamento o o o o o o o o CURVA DE AQUECIMENTO fermentado r de 2.000 L 140 120 Ê ~ 100 :J 80 Q) 60 ~ 40 "§ a. E 20 o o 30 60 90 120 150 180 Tempo (min) Figura 3.4 - Formato do tanque de 2.000 L úteis (I ,8 m2 serpentina/m 3 de meio de cultura), e curva de aquecimento Existem autoclaves das mais diversas dimensões, e em geral são verticais ou horizontais. Nas verticais (como na figura), a porta de acesso localiza-se na parte superior. As horizontais podem ter uma ou duas portas de acesso. O aquecimento para geração de vapor pode ser elétrico (mais comum) ou a gás. O vapor pode também ser gerado externamente numa caldeira e em seguida injetado na autoclave. Algumas autoclaves de grande porte podem ter sistemas internos para circulação do vapor e operarem continuamente, em vez da operação tradicional por ciclos. A operação é simples. Se o vapor é gerado internamente, a primeira providência é completar o nível de água até a marca indicada pelo fabricante. Em seguida, o material ou equipamento a ser esterilizado é colocado na autoclave e a porta é fechada. O vapor gerado ocupa todo o espaço interno e deve fluir para o exterior, por uma válvula de descarga, expulsando assim todo o ar contido na autoclave e nos materiais e equipamentos presentes. Após a expulsão do ar (10 a 20 minutos, em geral) a válvula de descarga é fechada e a pressão e temperatura internas devem Esterilização por agentes ffsicos 29 subir até a temperatura e pressão de esterilização (geralmente, 121 °C e 1 atm). Atingida a condição de esterilização, o sistema de aquecimento ou a entrada de vapor devem ser controlados para manter estáveis a pressão e temperatura. A etapa de resfriamento inicia-se com o desligamento do aquecimento ou fechamento da entrada de vapor. A autoclave só deve ser aberta após a temperatura chegar próxima da ambiente, já que uma despressurização brusca pode provocar danos aos sensores colocados nq interior dos reatores, como sondas de pH e de oxigênio dissolvido. Válvula de segurança MANÔMETRO Auto clave Fermentador Figura 3.5 - Esterilização de reator em autoclave Erlenmeyers com meio de cultura, pipetas graduadas, tubos de ensaio, etc., em geral são esteriliZados por 15 a 30 minutos. Reatores necessitam uma esterilização por mais tempo (40 minutos a 1 hora), já que não são agitados durante a esterilização e o seu centro demora para atingir a temperatura adequada. A Figura 3.6 apresenta a curva de aquecimento em autoclave de um reator com volume útil de 10 litros. O sensor de temperatura foi colocado próximo ao centro geométrico do reator. Pode-se notar que cerca de uma hora após o termômetro da autoclave indicar a temperatura de 121 °C, o centro do reator ainda não havia atingido esta temperatura. A esterilização em autoclave não altera significativamente o volume dos líquidos presentes nos frascos ou reatores. 3.3 .2 - Alguns detalhes de projeto de reatores esterilizáveis por calor úmido A Figura 3.7 apresenta alguns pontos a serem considerados quando se projeta um reator a ser esterilizado por calor úmido {vapor saturado). A entrada de ar para o reator (1) deve conter um filtro esterilizante adequado (2) . Toda a linha, incluindo o filtro, deve ser esterilizada por vapor saturado (V). 1/ I.,, 30 Esterilização do equipamento O reator deve ser dotado de uma válvula de segurança e uma quebra-vácuo (3), para evitar pressurização ou despressurização (vácuo) excessivas que possam danificar o equipamento durante o processo de esterilização ou de fermentação. Curva de aquecimento em autoclave 120 Ê ~ 100 ~ <1> 80 E ~ 1--- r- !--"'" .a c. -l1f v v 1-- 60 40 ~,.,...--' v / / 20 o o 10 20 30 40 50 60 80 70 90 100 Tempo (min) Figura 3.6 - Curva de aquecimento em autoclave vertical de um reator com volume útil de I O lrt:ros. O ponto a indica o momento em que o termômetro da autoclave marcou 121 °C. O ponto b indica o momento em que a temperatura da autoclave passou a ser controlada em 121 oc. 4 v 2 11 12 10 o o o o o o~+<r'-------. 7 o o 8 '-+----------9 Figura 3.7 - Alguns detalhes a serem considerados no projeto de reatores esterilizáveis por calor úmido. Esterilização por agentes ffsicos 3.1 A linha de exaustão de gases também deve conter um filtro esterilizante adequado (4), que evite tanto a contaminação do reator por microrganismos do ambiente como a contaminação do ambiente por microrganismos e aerossóis originados no reator. O sistema de agitação do líquido deve preferencialmente ser colocado na parte superior do reator. Dessa maneira, o selo que permitirá a vedação do orifício por onde penetra o eixo ~5) deverá ser projetado para reter apenas gases. Quando for mais conveniente a colocação do eixo pelo fundo do reator, o sistema de selagem deverá ser capaz de reter líquidos. Em geral, selos para gases são mais eficientes e de manutenção mais simples. As linhas de inoculação (6), amostragem (7), e esgotamento (9) devem também ser esterilizadas pela passagem de vapor saturado. A de amostragem deve ser esterilizada após cada retirada de amostra. Um procedimento comum para esterilização descontínua do reator é o seguinte: (a) o reator recebe o meio de cultura e aplica-se uma agitação baixa; (b) aquece-se o meio através da serpentina ou camisa (8, 10) até cerca de 96 a 97°C; (c) simultaneamente ao item b, injeta-se vapor pelas linhas de entrada superior de ar (11) e de inoculação (6), deixando o vapor fluir pela linha de exaustão (4) e se possível pela válvula de segurança (3); (d) inicia-se a aplicação de vapor vivo ao tanque pela linha de entrada inferior de ar (12) e, se necessário, pelas linhas de esgotamento do tanque (9) e de amostragem (7); (e) quando o meio de cultura atingir 100°C, as válvulas de exaustão, de segurança, de entrada superior de ar (12) e de inoculação (6) são fechadas; (f) quando a temperatura e pressão internas atingirem as indicadas para esterilização (em geral, 121 °C e 1 atm), as válvulas de entrada inferior (12), de esgotamento do tanque (9) e de amostragem (7) devem ser fechadas; (g) manter a pressão e temperatura de esterilização pelo tempo necessário através da aplicação de çalor pela serpentina ou camisa; (h) atingido o tempo necessário, iniciar o resfriamento pela aplicação de água fria através da serpentina ou camisa; (i) quando a temperatura do meio de cultura atingir 100°C, iniciar a pressurização do tanque com ar estéril (1, 11), o suficiente para evitar formação de vácuo no reator; (j) quando a temperatura atingir 'cerca de 85°C, abrir a válvula de exaustão de gases (4); (k) continuar o resfriamento do tanque até a temperatura desejada. A manutenção periódica do reator deve incluir a limpeza e eventual substituição de todas as válvulas que tenham contato direto com o reator ou com as linhas esterilizadas (ar, inóculo, amostragem, exaustão, descarga, etc.). Outros pontos sensíveis são o sistema de selagem do eixo do agitador e as soldas e conexões do reator. Pequenos vazamentos em válvulas, selos, conexões e soldas podem ser detectados, fechando-se todas as saídas do reator e pressurizando-o com ar até cerca de 1 atm. Fecha-se o ar e verifica-se se a pressão é mantidapor períodos longos (24 h). Caso haja perda de pressão, deve-se buscar e corrigir os vazamentos. Vazamentos na serpentina ou camisa podem ser detectados, secando-se totalmente o reator e circulando-se água sob pressão no sistema de aquecimento/resfriamento por um período longo (24 h). Se houver vazamento, aparecerá água no interior do reator. · E~erilitação do equipamento 32 3 .3 .3 - Esterilização por calor seco A esterilização por calor seco é empregada para vidrarias, ;metais e sólidos resistentes ao calor. É levada a efeito em fornos ou estufas que atingem temperaturas superiores a 150°C. Na ausência de umidade, a transferência de calor é mais lenta e os microrganismos apresentam maior resistência à inativação. Dessa forma, os tempos de exposição ao calor devem ser muito maiores (cerca de 3 a 4 horas), para garantir a 2 eficiência da operação de assepsia. 3.3.4- Esterilização por radiação ultravioleta Radiação ultravioleta é utilizada para esterilizar materiais sólidos, como vidrarias, utensílios metálicos, embalagens, etc. Os raios ultravioleta agem diretamente sobre o DNA e RNA, alterando a estrutura dessas moléculas e provocando danos ao processo de manutenção e divisão celular. Em função do tempo de exposição, esses danos normalmente levam os microrganismos à morte. Ultravioleta jamais deve ser usado na presença de pessoas ou animais. A fonte de ultravioleta é normalmente uma lâmpada emissora dessa radiação. A emissão diminui com o tempo, exigindo um controle sobre o tempo de vida útil dessas lâmpadas. A esterilização é feita simplesmente expondo os materiais à radiação em ambiente fechado, pelo tempo adequado (várias horas). Como a capacidade de penetração da radiação ultravioleta é muito baixa, apenas a superfície do material exposto eo ar ao redor são esterilizados. 3.3.5- Esterilização por radiação gama Ràdiação gama, em geral produzida por cobalto 60 ou césio 137, tem poder de penetração extremamente alto. O bombardeio de microrganismos por gama gera grande quantidade de alterações nas moléculas de DNA, danificando-as, em geral irreversivelmente. Adicionalmente, inúmeras moléculas internas aos microrganismossão ionizadas (a água, por exemplo), dando origem a espécies tóxicas al4 tamente reativas, como os peróxidos e vários radicais livres. Essas moléculas . desestruturam o equilíbrio bioquímico dos microrganismos, mesmo esporulados. Os materiais expostos à radiação gama não guardam resquícios radiativos, daí ser um método seguro de esterilização. O bombardeio com radiação gama deve ser feito em câmaras especiais, em geral muito grandes. Uma vez posta em operação, não é mais possível impedir a emissão da radiação, de forma que essas câmaras operam continuamente. A esterilização é feita colocando-se o material a ser esterilizado em um contêiner, que por sua vez é colocado em uma esteira que circula pelo interior da câmara de irradiação. O material pode entrar e sair da câmara várias vezes, até atingir o nível de irradiação adequado. - - - - --- --··----- ----------······---- --·------------ -- ------------·· -· -- · --------- ------------- - - - - ------ ------ --- ---- --- - Esterilização e desinfecção por agentes qufmicos 33 Dada a complexidade do método, apenas materiais como vidrarias, metais, e materiais sólidos como pós, solo, alimentos, sementes, embalagens, etc. são submetidos a esse processo de esterilização. A unidade de medida da irradiação no SI é o gray. Materiais pouco contaminados são submetidos a doses de 10 a 30 quilograys. Materiais mais contaminados requerem doses maiores, como 50 a 75 quilograys. O microrganismo mais resistente à radiação chama-se Deinococcus radiodurans e exige cerca de 60 . quilograys para ser inativado. Esporos de Clostridium botulinum demandam 5 a 22 quilograys para serem inativados. O gray substituiu a unidade rad, muito utilizada. Na conversão, 1 gray corresponde a 100 rad. 3.4- Esterilização e desinfecção por agentes químicos 3.4.1 -Germicidas químicos A utilização do calor úmido é, de longe, a técnica mais utilizada para proporcionar a esterilização e a desinfecção de equipamentos dentro de uma indústria de fermentação. Os agentes químicos de esterilização e desinfecção são utilizados quando equipamentos de operações unitárias ou componentes de uma instalação industrial não admitem esterilização pelo vapor de água saturado. Isso pode ocorrer em virtude da incompatibilidade dos materiais de construção desses componentes com temperaturas elevadas (por exemplo, filtros; bombas, centrífugas, secadores, válvulas, linhas de transferências de fluidos e equipamentos de medição, etc.). Nesses casos, para atingir o grau de sanitização necessário a um dado processo, faz-se uso de agentes sanitizantes líquidos denominados germicidas químicos. Diferentemente da esterilização pelo calor, essas substâncias agem à temperatura ambiente, necessitando entretanto tempos maiores de contato para produzir o efeit() _d esejado. Além disso, sua capacidade sanitizante está fortemente relacionada a fatores ligados às propriedades físicas do material a ser tratado (material plástico ou metálico, superfície lisa ou rugosa, porosidade do material, ausência ou presença de locais de difícil acesso) e às características químicas do ambiente (pH, presença de matéria orgânica contaminante, formação de filmes e depósitos no material, dureza da água utilizada na diluição do ·princípio ativo, presença de resíduos de sabão). Todos esses fatores podem afetar negativamente o processo de esterilização ou desinfecção, e somente a prática pode dar ensejo a um procedimento padronizado que conduza a um nível de sanitização adequado a um determinado processo industrial. Em razão dos grandes problemas advindos das infecções em ambientes hospitalares, especialmente pelo fato do surgimento de linhagens bacterianas patogênicas resistentes, responsáveis por doenças como a tuberculose, meningite e pneumonia e de vírus como o da hepatite B e o HIV, promotor da SIDA/ AIDS (Síndrome da Imunodeficiência Adquirida), um grande trabalho de pesquisa e de regulamentação vem sendo dedicado ao uso de germicidas químicos no controle dessas infecções. Como conseqüência, o uso desses compostos tem se transformado em um método bastante conveniente e efetivo de esterilização e desinfecção e iio...____ -- --- - -····· ·---·-·---- --·· --··· ·- ·-·-·····-- ·- --- --- - · --··-·- ... 34 Esterilização do equipamento um grande número de formulações comerciais surgiram no mercado. Até o início dos anos 90, havia nos Estados Unidos, registrados na EP A (Environmental Protection Agency), uma das agências americanas responsáveis pelo registro e legislação sobre o uso desses produtos, cerca de 14.000 formulações comerciais com ação germicida. Baseado na experiência prática, é possível estabelecer-se uma ordem de resistência dos microrganismos à exposição aos germicidas químicos (Tabela 3.2). · Tabela 3.2 - Ordem descendente de resistência a germicidas químicos e nível de atividade requerido para esterilização (adaptado de Favero; Bond 7). TIPO DE MICRORGANISMO BACTÉRIA ESPORULANTE Bacillus subtilis Clostridium sporogenes NÍVEL DE ATIVIDADE REQUERIDO Alto MICOBACTÉRIA Mycobacterium tuberculosis var. bovis Alto a intermediário VÍRUS PEQUENOS OU NÃO LIPÍDICOS poliovírus rhinovírus Alto a intermediário FUNGOS Trichophyton spp. Cryptococcus spp. Candida spp. Intermediário a baixO I BACTÉRIA VEGETATIVA Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Salmonella choleraesuis VÍRUS MÉDIOS OU LIPÍDICOS · vírus da Herpes simplex Citomegalovír~s . Baixo Baixo Esterilização e desinfecção por agentes químicos 35 Essa tabela mostra que as bactérias formadoras de esporos, exemplificadas aqui por Bacillus subtilis e Clostridium sporogehes, são as mais resistentes aos germicidas, enquanto que, em ordem descendente de resistência, os vírus de tamanho médio ou que possuem componentes lipídicos em sua composição tendem geralmente a possuir a mais baixa resistência aos germicidas. Esporos bacterianos necessitam alto nível de atividade germicida para serem destruídos. Essa condíção pode ser conseguida com a utilização de soluções aquosas de glutaraldeído, peróxido de hidrogênio de 6 a 30% e produtos que contêm mistura a baixas concentrações de ácido peroxiacético e peróxido de hidrogênio (0,1% e 1,0%, respectivamente). O dióxido de cloro (Cl0 2 ) pode ser usado a concentrações variadas. Porém, por ser .fortemente oxidante, seu uso é limitado, devido ao efeito altamente corrosivo em superfícies de metal ou de plástico. O uso de formaldeído em soluções aquosas de 6 a 8% é efetivo, embora haja controvérsias devido ao seu possível efeito carcinogênico. Germicidas de nível intermediário não necessariamente causam a destruição de esporos bacterianos, mas devem possuir a característica de inativar Mycobacterium tuberculosis var. bovis, assim como fungos, vírus lipídicos ou não lipídicos e bactérias vegetativas. Exemplos desses germicidas são soluções hidroalcoólicas 70 a 90% de etanol ou isopropanol, compostos clorados com cerca de 500 a 5.000 ppm de cloro livre, solução aquosa de peróxido de hidrogênio 3a 6%, algumas preparações fenólicas e os iodophors (preparações que conseguem carrear 12 à concentração de 40 a 50 ppm de iodo livre). Os germicidas químicos de nível baixo são capazes de destruir formas vegetativas de bactérias, a maioria dos fungos (mas não todos), assim como vírus que contêm lipídios em sua composição. · Esses germicidas não conseguem inativar Mycobacterium tuberculosis var. bovis nem tampouco bactérias esporuladas. Exemplos desses desinfetantes são as formulações de compostos quaternários de amônioà concentração de 0,1 a 0,2%. Como foi dito, a prática de desinfecção/esterilização industrial utilizando-se germicidas químicos depende de uma série de fatores ambientais, que devem ser levados em conta quando do estabelecimento do protocolo de sanitização de um determinado equipamento. De uma maneira geral, um ciclo de desinfecção I esterilização químicà de um equipamento contém as seguintes etapas: a) desmontagem do equipamento (se for o caso); b) limpeza dos componentes, procedendo-se à remoção de todo tipo de resíduos de meio de cultura, biomassa e produtos, fazendo uso de detergentes, se necessário; c) lavagem dos componentes com água com baixo teor de dureza para remoção dos detergentes utilizados; d) montagem do equipamento e introdução da solução aquosa do germicida, propiciando o tempo de exposição preestabelecido para a ação germicida requerida; · e) drenagem da solução germicida do sistema; ij 36 Esterilização do equipamento f) remoção dos resíduos do germicida através de circulação cuidadosa de água ou outro fluido estéril. A Tabela 3.3 descreve algumas utilizações típiCas de germicidas químicos. Existem disponíveis no comércio várias preparações com características semelhantes às descritas nessa tabela. No Brasil, a regulamentação e recomendação do uso · de um germicida particular é realizada por organismos como o INCQS (Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde). A Tabela 3.3, pretende, dessa maneira, ser meramente didática. I Tabela 3.3 - Utilização típica de germicidas químicos (N.A.=nível de atividade, sol.aq.=solução aquosa) GERMICÍDA QUÍMICO ATIVIDADE E CARACTERÍSTICAS UTILIZAÇÃO TÍPICA Compostos quaternários de amônio sol. aq. até 0,2% Bactérias vegetativas, gramnegativas, podem ser resistentes, N.A. baixo Limpeza geral e manutenção Compostos fenólicos, sol. aq. até 5% Pode ser ativo até contra vírus não lipídicos, N.A. baixo a intermediário Desinfecção de áreas de laboratório e produção Sol. aq. etanol ou isopropanol a 70% Bactérias vegetativas, fungos e amplo espectro de vírus, N.A. intermediário Desinfecção de materiais por imersão na solução Sol. aq: 0,5% cloro livre Amplo espectro, pode inativar bactérias esporuladas, limitação de uso pela atividade corrosiva, N.A. intermediário Desinfecção de equipamentos, áreas de laboratório e produção Sol. aq. Formaldeído 4 a 8% Amplo espectro, pode inativar bactérias esporuladas, potencial carcinogênico, irritante, N.A. intermediário a alto Desinfecção de equipamentos Sol. aq. Formaldeído 8% e etanol ou isopropanol a 70% Amplo espectro, ação contra micobactérias e bactérias esporuladas, potencial carcinogênico, irritante, N.A. alto Esterilização de equipamentos, dependendo do tempo de exposição Sol. aq. glutaraldeído 2% e surfactante Amplo espectro, ação contra micobactérias e bactérias esporuladas, iritante, N .A. alto Esterilização de equipamentos, dependendo do tempo de exposição Formulações contendo peróxido de hidrogênio 6 a 10% Amplo espectro, ação contra micobactérias e bactérias esporuladas, N.A. alto Esterilização de equipamentos, dependendo do tempo de exposição Esterilização e desinfecção por agentes químicos 37 Assim, recomenda-se fortemente utilizar as formulações comerciais disponíveis no mercado, segundo a orientação do fabricante, de acordo com seu registro nos órgãos governamentais competentes. Desde que as operações preliminares de limpeza das partes a serem desinfetadas ou esterilizadas tenham sido feitas cuidadosamente, o tempo de exposição para se atingir um determinado nível de destruição microbiana em um dado equipamento vai depender fundamentalmente do germicida escolhido e das características da população microbiana remanescente, ou seja, tipo e número de microrganismos presentes. Embora a temperatura seja um fator relevante nos processos de destruição microbiana, não estamos levando isto em conta, pois supõe-se que o procedimento de desinfecção I esterilização seja realizado à temperatura ambiente. O tempo necessário para se atingir um determinado nível de sanitização, dessa forma, varia bastante. Uma simples desinfecção, com a qual se pretenda destruir a população ativa de bactérias vegetativas, a maioria dos fungos e os vírus lipídicos, rode ser conseguida utilizando-se etanol 70% em água em cerca de 10 8 minutos. Uma população de esporos de bactérias aeróbias bastante elevada (10 esporos) pode ser destruída em 60 minutos com exposição a uma solução de peró8 xido de hidrogênio a 10%. Por outro lado, uma solução de formaldeído 8% e isopropanol 70% pode levar até cerca de 18 h para a eliminação de uma alta 7 população de esporos bacterianos. A escolha de um germicida químico particular vai se basear, dessa maneira, no nível de desinfecção requerido pelo processo e em aspectos econômicos. 3 .4. 2 - Agentes gasosos Agentes gasosos não é o método de escolha em indústrias de fermentação, sendo rara, para não dizer inexistente, sua utilização para esterilização e desinfecção de equipamentos. A assepsia de salas e laboratórios, porém, comumente é realizada com vapores de formaldeído. Os agentes de esterilização gasosos mais importantes são os seguintes: óxido c!e etileno, óxido de propileno, formaldeído e betapropiolactona. O primeiro é utilizado principalmente na esterilização dos mais diversos itens hospitalares, artigos plásticos de laboratório e outros materiais. O processo se dá em câmaras especiais Sf!melhantes a autoclaves de esterilização por vapor. A câmara é carregada com os itens a serem esterilizados, onde a seguir é insuflada uma mistura gasosa do agente ativo e um gás inerte como co2 ou freon (fluoroclorocarbono). Após um determinado tempo de exposição, a mistura gasosa é drenada da autoclave e esta é cuidadosamente limpa pela passagem de ar, para 9 eliminação total de resíduos do óxido de etileno. 10 O óxido de propileno é utilizado na esterilização de alimentos. Vapores de formaldeído e betapropiolactona são utilizados principalmente para desinfecção de câmaras, salas e ambientes onde assepsia é desejável. A resistência de bactérias vegetativas e esporuladas, vírus e fungos aos métodos de esterilização por gases é bastante variável, e depende do agente utilizado, sua concentração, umidade relativa do ambiente e temperatura do processo. 6 Por exemplo, uma população de 10 esporos de Bacillus subtilis v ar. niger pode ser . ...... - ··-··-·-·-- - ------ -- - --- -.-·.- ..... -- ~ -' ... _.... ......_____ - _ 38 Esterilização do equipamento inativada -a 50% de umidade, 47,5°C e 500 ppm de óxido de etileno, em cerca de 50 minutos. Outros microrganismos possuem resistências menores ao óxido de etileno. Detalhes a respeito da utilização de gases como agentes desinfetantes e esten'1'tzantes po d em ser encontra d os em 1'tteratura sob re o assunto. 10'11 Referências bibliográficas (1) BAILEY, J.E.; OLLIS,D.F. Biochem. Engineering FundamentaiS. McGraw-Hill Book Company, Nova York. 1986.965 p. (2) SCRAGG, A.H. Bioreactors in Biotechnology. A Practical Approach. 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No caso da produção de penicilina, por exemplo, os contaminantes podem produzir penicilinase, enzima que decompõe a penicilina, resultando meios fermentados com baixa ou mesmo nula concentração do antibiótico. Outro exemplo que merece citação é o da fermentação acetona-butanólica. A bactéria responsável por ésse processo pode ser rapidamente destruída por vírus bacteriófagos, paralisando completamente a fermentação. Outras vezes os contaminantes afetam negativamente o processo, principalmente pelo fato de consumirem nutrientes do meio, competindo assim com os microrganismos responsáveis pela fermentação desejada. É o que acontece, por exemplo, na produção de enzimas, vitaminas, antibióticos, etanol, etc. Há, porém, casos em que a presença de contaminantes pouco ou nada interfere no processo. Assim, por exemplo, na fermentação lática de hortaliças, no tratamento biológico de resíduos, na produção de vinagres, na lixiviação bacteriana · de minérios, a boa marcha do processo é assegurada pelas próprias condições de trabalho, sendo dispensável eliminar eventuais contaminantes. Entre os dois casos extremos, isto é, aqueles processos em que a presença de contaminantes compromete seriamente o resultado, e aqueles em que os contaminantes praticamente não interferem no bom andamento da fermentação, há um grande número de situações intermediárias. Em resumo, o grau de eliminação de contaminantes com o objetivo de obter bons resultados depende de cada caso. Informações pormenorizadas a respeito desse assunto serão fornecidas, quando necessário, no Volume 3 desta Coleção, ao se estudar vários processos fermentativos industriais. í .. ... .J 40 Esterilização de meios de fermentação por aquecimento com vapor Não podemos deixar de lembrar que, às vezes, a operação de eliminação total de contaminantes pode inviabilizar economicamente o processo, como é o caso da fermentação para produção de etanol a partir de caldo de cana-de~açúcar. No presente capítulo examinaremos apenas os processos de destruição de contaminantes por aquecimento com vapor, também chamados "esterilização por calor úmido". 4.2 - Descrição sumária dos processos de esterilização por calor úmido Consideraremos aqui apenas os dois processos mais importantes de esterilização de meios em escala industrial, utilizando-se vapor como fluido de aquecimento: o processo descontínuo (também chamado processo de batelada) e o processo contínuo. No processo descontínuo, o meio é quase sempre colocado no fermentador e, a seguir, aquecido com vapor. Nessas condições, esterilizam-se simultaneamente o meio e o fermentador. O aquecimento do sistema pode ser efetuado, quer borbulhando-se diretamente vapor no meio (é o chamado aquecimento com "vapor direto"), quer passando-se vapor por uma serpentina mergulhada no meio ou por uma camisa que envol_ve o fermentador (é o aquecimento com "vapor indireto") . Em qualquer dos casos, o meio é agitado mecanicamente, a fim de assegurar, tanto quanto possível, a mesma temperatura em todos os pontos do sistema. O aquecimento com vapor direto acarreta, obviamente, diluição do meio (da ordem de 10 a 15%), como conseqüência da condensação do vapor injetado. Na esterilização descontínua distinguem-se nitidamente três fases (ver Figs. 4.1, 4.9 e 4.10): a) aquecimento, que eleva a temperatura inicial do meio (sempre próxima da temperatura de preparo do meio) até à temperatura de esterilização (geralmente da ordem de l20°C); b) esterilização, na qual a temperatura é mantida aproximadamente constante durante um intervalo de tempo adequado, chamado tempo de esterilização; c) resfriamento, quando, com auxílio de água fria passando pela serpentina ou pela camisa, a temperatura é reduzida até se atingir a temperatura de fermentação. A rigor, a destruição térmica dos microrganismos não se dá apenas na fase chamada "esterilização". No aquecimento, e também durante o resfriamento, enquanto a temperatura for superior à denominada "temperatura mínima letal" (da ordem de 80 a 100°C), também há destruição de microrganismos (ver Fig. 4.1) . Voltaremos a examinar esse assunto mais adümte. Descrição sumária dos processos de esterilização por calor úmido 1.. 4I e -----------~--· II I Ti Algumas horas Tempo Figura 4.1 - Representação esquemática da variação de temperatura do meio durante sua esterilização por processo descontínuo. 1: Aquecimento. 11: Esterilização. 111: Resfriamento. Te: temperatura de esterilização. Ti: temperatura · inicial. T t: temperatura final do meio esterilizado = temperatura de fermentação. T m: temperatura mínima letal. tempo de esterilização. e: Se, por um lado, a esterilização descontínua apresenta a vantagem de esterilizar simultaneamente o meio e o fermentador, reduzindo assim os perigos de contaminação nas operações de transferência do meio para a dorna, ela apresenta, por outro lado, algumas sérias desvantagens, a saber: a) manutenção do meio em temperaturas relativamente altas (acima de 100°C), por períodos bastantes longos (da ordem de algumas horas), favorecendo o desenvolvimento de reações químicas no meio com possíveis alterações indesejáveis em sua composição (decomposição de nutrientes, por exemplo); b) elevados consumos de vapor (no aquecimento) e de água (no resfriamento), conseqüentes da eficiência relativamente baixa do sistema de troca de calor; c) problemas de corrosão ocasionados pelo contato prolongado do fermentador com o meio aquecido; d) tempo "não produtivo" relativamente elevado, uma vez que o fermentador é utilizado apenas como um tanque de esterilização durante o processo de destruição dos contaminantes. Passemos agora ao exame da esterilização por processo contínuo, representado esquematicamente na Figura 4.2.: o meio recentemente preparado é enviado, pela bomba B, ao trocador de calor TCl (de tubos, ou de placas), onde atua como fluido de resfriamento do meio já esterilizado e ainda quente; desse trocador de calor, o meio, agora preaquecido, mistura-se com vapor enviado ao injetor I onde a temperatura sobe quase instantaneamente, até alcançar a temperatura de esterilização; a essa temperatura, praticamente constante, o meio percorre o tubo de re- 42 Esterilização de meios de fennentação por aquecimento com vapor tenção ou de espera TE (quase sempre termicamente isolado), dimensionado de modo a que o tempo de residência do meio no tubo seja igual ao tempo de esterilização; o meio já esterilizado, mas ainda a uma temperatura muito alta, passa pela válvula de redução de pressão V e vai, em seguida, ao trocador de calor TCl já citado; deste último, o meio esterilizado é encaminhado a um segundo trocador de calor (TC2), onde sua temperatUra é reduzida até alcançar o valor desejado; o fluido de resfriamento no trocador TC2 é água fria. Tratando-se, pelo que foi descrito, de aquecimento com vapor direto, haverá diluição do meio, da ordem de 10 a 15%. O mosto esterilizado, e já na temperatura de fermentação, é então enviado ao fermentador. Vapor p TE --------------------------------- -------, I I ,--------------------------------------· I ---------------------------------------. I I Fermenta dor TC1 TC2 ---- ·----- ------- +--------~-- --------------- +---------' '-------+---- ------------- Agua Meio B Figura 4.2 - Representação esquemática de um esterilizador contínuo. B:.bomba. TC I e TC2: trocadores de calor. 1: injetor de vaj)or. T: termômetro. P: manômetro. TE: tubo de retenção ou de espera. V: válvula de redução de pressão. A Figura 4.3 mostra, esquematicamente, a variação da temperatura do meio durante a esterilização contínua. Nesse caso, a destruição de microrganismos ·durante o aquecimento e durante o resfriamento pode ser desprezada. - - - - - - - - -- - ------ ·-·- --------·--·--- -- ---··--- - - - -·~- --~ . --- --- ~ · ·- -.....,.--- -- ------- Descrição sumária dos processos de esterilização por calor úmido 43 e Alguns minutos Tempo Figura 4.3 - Representação esquemática da variação de temperatura do meio durante sua esterilização por procesSo contínuo. Ti: temperatura inicial. Tt : temperatura final do meio esterilizado= temperatura de fermentação. Te: temperatura de esterilização. Tm: temperatura mínima letal. 8: tempo de esterilização. Na esterilização contínua, o aquecimento do meio até à temperatura de esterilização também pode ser efetuado com vapor indireto, substituindo-se o injetor de vapor I (Figura 4.2) por um trocador de calor. Neste caso, não haverá diluição do meio. A Figura 4.4 representa, de maneira esquemática, um tubo de espera. Um tubo de espera çomo o representado na Figura 4.4, desde que adequadamente projetado (o número de ramos em U deve ser sempre maior que o necessá- · rio, para assegurar a esterilização do meio), permite, por um lado, a execução de eventuais reparos sem interromper o processo e, por outro, alterar, dentro de certos limites, o tempo de permanência do meio na temperatura de esterilização sem variar a vazão. Seguem alguns valores numéricos relativos às condições de operação dos esterilizadores contínuos: a) vapor de aquecimento: vapor saturado com pressão de 6,8 a 8,5 atm; b) bomba de recalque do mosto n~o esterilizado: podem ser utilizadas bombas centrífugas, rotativas ou de pistão; c) diâmetro do tubo de espera: 4 a 12 polegadas (10 a 30 em, aproximadamente); d) tempo de enchimento do fermentador: não superior a 8 h; e) velocidade do meio no tubo de espera: 3 a 60 cm/s, sendo mais utilizado o intervalo de 6 a 12 em/ s; f) número de Reynolds no tubo de espera: 36.000 a 80.000; g) temperatura de esterilização: 130 a 165°C. 44 · Esterilização de meios de fermentação por aquecimento com vapor ____ _. c ..,. ____ _ ..,. ____ _ Figura 4.4 - Representação esquemática de um tubo de espera. A: meio à temperatura de esterilização. B: tubos verticais. C: tubos em U dispostos em planos horizontais. D: meio esterilizado. As setas indicam o percurso do meio no tubo de espera com os registros I , 2 e 3 fechados . · Para se colocar em funcionamento um aparelho de esterilização contínua, procede-se do seguinte modo: em primeiro lugar injeta-se em todo o sistema, incluiTI.do o fermentador, vapor a 1 atm (aproximadamente 121 oq durante 2 horas; a seguir, injeta-se ar esterilizado no fermentador de modo a nele se ter uma sobrepressão de 0,3 atm; regulam-se então as c<;>ndições de trabalho utilizando-se água em vez do mosto; quando as condições estiverem ajustadas, começa-se a bombear o meio a ser esterilizado; uma vez eliminada toda a água existente no aparelho, abre-se o registro para o fermentador, que é então carregado com meio esterilizado. O processo contínuo de esterilização apresenta, em relação ao descontínuo, algumàs vantagens, a saber: a) por se trabalhar a temperaturas mais elevadas, e também por serem muito rápidas as operações de aquecimento e resfriamento do mosto, o tempo de permanência do meio em alta temperatura é relativamente pequeno (da ordem de 5 a 15 min), o que acarreta menor destruição de nutrientes (como veremos mais adiante); como conseqüência deste fato, a prática tem mostrado, em vários casos, que a fermentação de um meio esterilizado por processo contínuo apresenta rendimento substancialmente maior do que o obtido na fermentação do meio esterilizado por processo descontínuo (5 a 6 vezes maior na produção de riboflavina, e cerca de 10 vezes maior na produção de vitamina B12, por exemplo); b) pelo fato de ser de dimensões relativamente pequenas, o tubo de espera pode ser construído com ligas especiais, evitando a contaminação metálica (muitas vezes prejudicial à fermentação) do mosto que poderia resultar do ataque da parede do tubo pelo meio; ____ _________ ________ . - - -------. ------~- ------------- -- --- -. .. , -· -- Cinética da destruição ténnica de microrganismos 45 c) quando o meio apresenta densidade ou viscosidade relativamente alta, como no caso de mostos de cereais, o processo contínuo dispensa os motores de potência elevada que seriam necessários para o acionamento dos agitadores no processo descontínuo de esterilização; d) economia de vapor, e de água de resfriamento, em relação ao processo descontínuo, desde que os trocadores de calor e o isolamento térmico da tubulação sejam adequadamente dimensionados; e) os esterilizadores dmtínuos podem ser também utilizados nos processos de cozimento e sacarificação de matérias.:.primas amiláceas. Importa, contudo, não esquecer que as viabilidades técnica e econômica do processo contínuo dependem das dimensões e do regime de trabalho dos fermentadores da instalação industrial. 4.3 - Cinética da destruição térmica de microrganismos A velocidade de destruição pelo "calor úmido" de microrganismos presentes em um dado meio depende de vários fatores, a saber: a) do microrganismo (gênero, espécie, linhagem; idade da cultura, existência ou não de esporos); b) do meio (composição, pH, presença de sólidos em suspensão); c) da temperatura. Imaginemos um experimento em que um determinado microrganismo, em suspensão em um dado meio, é mantido a uma temperatura constante e superior à temperatura mínima letal. Se durante o ensaío determinarmos o número de microrganismos vivos existentes no sistema, como a temperatura é superior à mínima letal esse número de microrganismos vivos será uma função descrescente do tempo. A experiência mostra que, com boa aproximação, os resultados podem ser representados como indica ,a Figura 4.5, z E Figura 4.5 - Representação esquemática da variação do número de microrganismos vivos (N) após um tempo t de manutenção do meio a uma temperatu ra letal constante T · N 0 =número de microrganismos vivos no instante t = O. · -· · •· ___ _ _ _ _ _ _ _j 46 Esterilização de meios de fermentação por aquecimento com vapor Isso nos mostra que, do ponto de vista cinético, a destruição do microrganismo se comporta como se fosse uma reaÇão de primeira ordem, isto é: (4.1) dN -=-k ·N dt sendo N o número de microrganismos vivos existentes no meio após um tempo t de aquecimento do sistema a uma dada temperatura constante. A constante k é denominada constante de velocidade de destruição térmica do microrganismo. O valor de k depende dos fatores citados no início deste item. Para um dado microrganismo em um dado meio, k dependerá apenas da temperatura. Sendo N 0 o número de microrganismos vivos no instante t =O, a eq. (4.1) nos dá: (4.2) lnN=lnN 0 -k ·t equação esta que nos permite, a partir de valores experimentais resultantes de medidas de N para diferentes valores de t, calcular a constante k do microrganismo em estudo, no meio considerado, na temperatura ensaiada. A título de exemplo, consideremos os valores da Tabela 4.1, obtidos de experimentos realizados com esporos de Bacillus stearothermophilus, suspensos em solução tampão de pH = 7,0, à temperatura de 105°C. · · Tabela 4.1 - Destruição térmica de esporos de Bocillus steoro thermophilus a Iosoc. t (minutos) N 25 8,5. 104 50 3,5. 104 100 6,0 ·_103 200 2,0. 102 ~ . ~I~ ~ ~; .. ~ > ~'- .. 250 ~ 40 - ·.- - • lÕi: ~- -~-..'-~· ~ ~t ~ _;- - ... "?}:':"'..~!é~J~ . A partir dos valores da Tabela 4.1, por regressão linear obtemos (ver Fig. · 4.6), no intervalo de tempo 25 mina 250 min: ln N = 12,1626- 0,0341 · t (r= -0,9998) sendo r o coeficiente de correlação. Nesse caso, o valor de k é 0,0341 min- 1 • Se o experimento tivesse sido realizado não a 105°C, .mas a 121 oc, valores de k próximos de 3 min - 1 poderiam ser obtidos, dependendo da variedade do Bacillus i j~----------- Cinética da destruição térmica de microrganismos 47 stearothermophilus utilizada (ver Fig. 4.8). A influência da temperatura no valor de k será considerada mais adiante. 12 8 z E 4 o o 100 200 300 t (min) Figura 4.6- Representação gráfica dos resultados da Tabela 4.1 . Mostra a experiência que os esporos são bastante mais resistentes à destruição térmica do que as células vegetativas. Além disso, observa-se que não há, nesse caso, obediência,à eq. 4.2 no intervalo de tempo inicial de exposição dà suspensão de esporos à temperatura considerada, como indica a Figura 4.7. Não cabe, neste livro, o exame desse problema. Considerando-se, porém, que a destruição térmica de esporos é, na prática, sempre realizada em ·temperaturas elevadas (pelo menos l20°C), e considerando-se que, nessas temperaturas, o desvio da curva experimental em relação à eq. 4.2. é ·geralmente pequeno, pode-se, para fins de cálculos de interesse industriÇtl, considerar aplicável a expressão 4.2. No estudo da destruição térmica de microrganismos, costuma-se definir um outro parâmetro: o tempo de redução decimal, indicado por D . É o tempo necessário para reduzir o número de microrganismos a 1/10 do valor inicial (em outras palavras, para destruir 90% dos microrganismos vivos existentes). Se na equação 4.2 fizermos N = 0,1 · N 0 , teremos, de acordo com a definição de tempo de redução decimal, t = D. Logo: ln(0,1·N 0 )=lnN 0 -k·D e, portanto: D= 2,303 k (4.3) 48 Esterilização de meios de fermentação por aquecimento com vapor z E Figura 4.7- Representação esquemática de curvas de destruição térmica de esporos a diferentes temperaturas (Tl , Tz e T 3) • No caso do exemplo indicado na Tabela 4.1, teremos: D=67,5min isto é, à temperatura de 105°C, 90% dos microrganismos presentes no meio considerado serão destruídos em 67,5 min. A eq. 4.3 mostra, ainda, que os fatores que afetam o valor de k afetam tambémD. ' Uma vez fixados o microrganismo e o meio, vejamos de que maneira a temperatura afeta o valor de k. D11as equações foram propostas com o objetivo de correlacionar k e a temperatura, a saber: a) Equação de Arrhenius k=A·exp(-a I RT) (4.4) onde A é uma constante empírica, R é a constante universal dos gases perfeitos, T é a temperatura absoluta e a é a denominada energia aparente de ativação de destruição térmica do microrganismo (ou simplesmente energia de ativação de destruição do microrganismo). b) Equação de Bigelow k =A' ·exp (!) · T') (4.5) onde A'e!) são constantes empíricas e T' é a temperatura medida em °C ou em °F. -- -- --·--------------- - - - ------· ----------- - Cinética da destruição térmica de microrganismos 49 As eqs. 4.4 e 4.5 conduzem, respectivamente, a: a 1 lnk=lnA--·- (4.6) lnk=lnA'+P·T' (4.7) R T Conhecendo-se os valores de k para diferentes temperaturas, as eqs. (4.6) e (4.7) permitem calcular, por regressão linear, os valores das constantes nelas indicadas. Em particular, a equação 4.6 nos dará o valor da energia de ativação a. A Figura 4.8 mostra a influência da temperatura no valor da constante de velocidade de destruição térmica de esporos de Bacillus stearothermophilus. Observe-se a obediência à eq. 4.4. Neste exemplo, os valores experimentais representados na Figura 4.8 conduzem a um valor de a igual a 68,7 kcal/mol. Para muitos microrganismos encontram-se valores de a entre 65 e 85 kcal/mol. 3 • ~ ";"c 0,5 I.>tt. • 0,1 0,05 255 260 265 10 5/T (K- 1) . Figura 4.8 - Influência da temperatura (T) na constante de velocidade de destruição térmica (k) de esporos de Bacil- lus stearothermophilus. Se aplicarmos as equações de Arrhenius e de Bigelow a um mesmo microrganismo, no mesmo meio e à mesma temperatura, teremos: . A·exp(-a I RT) =A'·exp(P· T') Logo: , 1 A a 1 T =-·ln---·- p .______ A' P·R T (4.8) ~ . 50 Esterilização de meios de fermentàção por aquecimento com vapor Lembrando que A, A', a,~ e R são constantes, a eq. 4.8 nos diz que T' varia linearmente com 1IT, o que é um absurdo, uma vez que T' (expressa em oq é igual a T-273. Acontece, porém, que a equação 4.8 permite, com boa aproximação, calcular T' em função de T, desde que não se considerem intervalos de temperatura muito amplos. Assim, por exemplo, no intervalo de 100 a 160°C, a seguinte ·equação pode ser obtida por regressão linear: (4.9) T' = 532,9 -1,620(10 5 I T) (r = -0,9992) onde T' é a temperatura em °C, T é a temperatura absoluta e r é o coeficiente de correlação. Se considerarmos apenas o intervalo de 120 a 160°C, que do ponto de vista de aplicações práticas é o mais importante, teremos: T' = 552,4 -1,701 (10 5 I T) (4.10) (r =- 0,9995) A Tabela 4.2 mostra, para vários valores de T, ·os valores de T' calculados por T-273 e pelas eqs. (4.9) e (4.10). · Tabela 4.2 - Aplicação das equações 4.9 e 4. 1O. T' (OC) T (K) .. T-273 Eq. 4.9 373 100 98,6 - ::_ 383 110 109,9 - ·.'C I 393 120 120,7 119,6 tf 403 130 130,9 130,3 ·~ 413 140 140,6 140,5 .f ·:. 423 150 149,9 150,3 433 -e · 160 - :,.,. ,_:;.· ·_{"- ·....<;<.."'.:F...:·,., Eq. 4.10 158,8 .,.....,,;::. -•. .:: ....;::4> . . 159,6 ' .~ ·~ - :: t •. "' ~'* L\t.l r~~ ~tJ::· ~· ·:;:;,1i~~ JJ-'1.: :r J1 Explica-se, portanto, levando-se em conta os erros experimentais que afetam os valores de k (principalmente os inerentes às medidas dos números de células vivas), a possibilidade de cqrrelacionar k com a temperatura, tanto pela eq. 4.4 quanto pela 4.5. · i ... . . -----~ --- · ·· --- ---------- --- ----------------------------- · ·-· - - ------------- -------- ----- - - . --------------- --.----- - - - ---------------------:--;--- - ,-------------------·····- ··- ---- Destruição de nutrientes do meio como conseqüência da esterilização 5I 4.4 - Destruição de nutrientes do meio como conseqüência da esterilização O aquecimento de um meio com o objetivo de destruir microrganismos nele existentes acarreta, simultaneamente, alterações em sua composição. Reações indesejáveis (como por exemplo, decomposição de vitaminas e reações entre glicose e aminoácidos), cujas vélocidades aumentam com a temperatura, podem prejudicar a posterior atividade dos microrganismos da fermentação, conduzindo a rendimentos ou produtividades menores do que os esperados. A temperatura escolhida para a esterilização do meio desempenha, nesse particular, papel relevante. A experiência mostra que, quanto mais elevada for a temperatura escolhida para se conseguir a destruição de uma dada quantidade de microrganismos do meio, menor será a destruição de nutrientes existentes nesse meio e, conseqüentemente, melhores serão os resultados obtidos na fermentação posterior. Isso é uma conseqüência do fato de ser a energia de ativação da destruição térmica dos microrganismos (65 a 85 kcal/mol) maior que a da destruição térmica de nutrientes. A Tabela 4.3 mostra valores da energia de ativação de destruição térmica de alguns nutrientes. Tabela 4.3 - Energia de ativação de destruição térmica de alguns nutrientes. Energia de ativação Substância ... (kcal/mol) 1.::. Vitamina C 23,1 {"t: Ácido fólico 16,8 Vitamina 812 23,1 ~~ 14,6 .. Vitamina A . ~ -- f,.,., .. _;,; ,. Vitamina B1 .. · •..;;·.,., ·- - .. - • -. '"""···-.;..,........,........ • • r •• ~~ -_,... 26,0 ' ~. ir ·"!' ~~i .. ~~ :..cJ;,~ Por sua importância prática, tanto na esterilização de meios de fermentação como na esterilização de alimentos, essa afirmativa deve ser demonstrada. Consideremos um dado volume de meio contendo N 0 microrganismos vivos, número esse que deve ser reduzido a N 1 < N 0 • Seja 50 a concentração de um nutriente termolábil no meio, antes do tratamento térmico. Suponhamos que esse tratamento térmico seja realizado a duas temperaturas constantes TI e T2 , com T2 > TI. Sejam: i:..: ti = tempo para reduzir.o número de microrganismos vivos de N o a N 1, quando a temperatura é TI; . t 2 = tempo para reduzir o número de microrganismos vivos de No a Nfl quando a temperatura é Tú ki = constante de velocidade de destruição dos microrganismos à temperatura TI; 52 Esterilização de meios de fermentação por aquecimento com vapor k2 = constante de velocidade de destruição dos microrganismos à temperatura Tz; a = energia de ativação de destruição dos microrganismos; 5 1 = concentração final do nutriente após o tratamento do meio à temperatura T 1; 5 2 = concentração final do nutriente após o tratamento do meio à temperatura T 2; k 1' =constante de velocidade de destruição do nutriente à temperatura T1; kz' = constante de velocidade de destruição do nutriente à temperatura T2; a' =energia de ativação de destruição do nutriente. A eq. 4.2 nos permite calcular t 1 e t 2 : 1 N0 t 2 = - ·l n kz Nf Logo: (4.11) Mas, pela eq. 4.4, temos: (4.12) k 2 =A·exp(-a I R·T2 ) (4.13) Substituindo-se, na eq. 4.11, os valores de k 1 e k 2 dados pelas eq. 4.12 e 4.13, teremos: (4.14) Vejamos, agora, o que aconteceu com a concentração do nutriente. Admitin.do, apenas para simplificar a demonstração, que a destruição térmica do nutriente seja de primeira ordem, teremos: 53 Considerações gerais a respeito do cálculo do tempo de esterilização (4.15) Pela equação de Arrhenius: Logo, a eq. 4.15 nos dá: !.1_ =ln (5 0 I 51) ·exp(~. T2- T1,J t2 (5 0 I 52) R T1 · T2 (4.16) As expressões 4.14 e 4.16 permitem, então, escrever: " (a T1 T1 · T2 exp -· T 2 R - J=ln (5 0 I 5 1) ·exp (a'- · T (5 0 I 52) R T1. T1 · T2 2 - J tf Lembrand? que a >a', teremos: N :.~· Ficando assim demonstrado que a concentração final do nutriente no tratamento térmico do meio, à temperatura T 2 , é maior do que a concentração final do nutriente no tratamento térmico do meio à temperatura T 1 < T 2 , isto é, a destruição do nutriente .é menor quando o meio é termicamente tratado a temperatura mais alta. 4.5 Considerações gerais a respeito do cálculo do tempo de esterilização Já vimos que a eq. 4.2 nos dá: (4.17) 54 Esterilização de meios de fermentação por aquecimento com vapor expressão esta que nos permite, conhecido o valor de k, calcular o tempo necessário para reduzir o número de microrganismos vivos de N 0 até N. A aplicação dessa equação a cálculos de tempos de esterilização não é tão simples como pode parecer à primeira vista. O primeiro problema que se apresenta, decorre do fato que os meios de fermentação a esterilizar não possuem uma única espécie de microrganismo a ser destruída. Nos meios utilizados na prática encontramos microrganismos vivos pertencentes a diferentes gêneros e espécies, alguns esporulados e outros não, que devem ser eliminados para assegurar a inexistência de contaminantes na fermentação posterior. Lembrando que o valor de k depende do microrganismo, a aplicação da eq. 4.17 torna-se praticamente impossível. Contorna-se esse problema escolhendo-se um microrganismo de referência conhecido, altamente resistente ao calor, e admitindo-se que todos os microrganismos existentes no meio a ser esterilizado apresentem uma resistência à destruição térmica igual à do microrganismo de referência. É bastante freqüente a escolha do Bacillus stearothermophilus esporulado como microrganismo de referência. O segundo problema que surge ao tentarmos aplicar a eq. 4.17 a casos reais reside no fato de a constante de velocidade k depender, também, do meio e da temperatura. Uma vez escolhido o microrganismo de referência, é preciso, portanto, conhecer os valores de k desse microrganismo em suspensão no meio a ser esterilizado e a diversas temperaturas, o que pode, com freqüência, implicar na realização de experimentos preliminares de determinação de k. Como primeira aproximação, quando não se conhecem valores de k, pode-se admitir k:.::::: 1 ~in- 1 (a 121 °C) e a :.: : : 75 kcal/ mol. O terceiro problema a ser considerado é conseqüente do fato de, nos meios a esterilizar, as células microbianas a serem destruídas poderem se encontrar na forma de aglomerados, ou ainda protegidas por partículas sólidas em suspensão no meio. Isso acarreta um verdadeiro aumento da resistência dos microrganismos à destruição térmica, aumento esse de quantificação muito difícil. Finalmente, outro problema na aplicação da eq. 4.17 ao cálculo do tempo de esterilização decorre da própria definição de esterilização. De fato, lembrando que a esterilização é a operação que tem por finalidade destruir todos os microrganismos vivos existentes no meio, o número final de microrganismos vivos deverá ser N =O e, neste caso, a eq. 4.17 deixa de ser aplicável. Esse último problema pode, porém, ser resolvido a partir da definição de probabilidade de falha de uma esterilização. Sendo: E, = número total de operações de esterilização realizadas nas mesmas condições; E1 = número de operações de esterilização que falharam, isto é, que não conduziram a um meio esterilizado. Define-se probabilidade de falha (P) dessa esterilização pela relação: (4.18) 55 Considerações gerais a respeito do cálculo do tempo de esterilização Multiplicando-se por 100 essa última fração, a probabilidade de falha será expressa em porcentagem. Suponhamos, para facilitar a exposição, que uma dada esterilização apresente probabilidade de falha igual a 0,03 (ou 3%). Isso significa que, de 100 partidas de meio tratadas termicamente nas mesmas condições, serão obtidas, em média, 97 partidas esterilizadas e 3 partidas não esterilizadas. Se indicarmos por N0 o número de microrganismos vivos em cada partida de meio a esterilizar, o número de microrganismos nas 100 partidas de meio a esterilizar será 100 N0 • Acontece, nesse caso, que 3 partidas não se encontravam esterilizadas após o tratamento térmico do meio. Se considerarmos que a condição necessária e suficiente para que falhe a esterilização de uma partida de meio é que nele exista, após o tratamento térmico, um microrganismo vivo, o número final de microrganismos vivos nas 100 partidas será, no mínimo, igual a 3 (um .em cada partida em que a esterilização falhou). Aplicando-se a eq. 4.17 ao conjunto das 100 partidas, teremos: t=.!_·ln 100No =.!_·ln No k 3 k 0,03 De um modo geral, sendo P a probabilidade de falha, podemos escrever: 1 N0 t=-·lnk p (4.19) Para fixar idéias, consideremos o seguinte exemplo numérico: um dado volume de meio a esterilizar contém 2,5.10 1 0 microrganismos vivos; o valor de k é 3,4 1 min - ; calcular os tempos .de esterilização para que as probabilidades de falha sejam iguais a 0,1 (ou 10%), 0,01 (ou 1%) e 0,001 (ou 0,1 %). Aplicando-se a equação 4.19, teremos: a) para P = 0,1 (10%) t = __!_ ·ln _2;_,5_·_10_1_0 = 7,7 min 3,4 0,1 b) para P = 0,01 (1%) t =_!_ -ln2,5·1010 . ---'----- = 84 ffi1n 3,4 0,01 f c) para P = 0,001 (0,1 %) t = __!_ ·ln 2,5 ·1010 3,4 0,001 = 9,1 min 56 Esterilização de meios de fermentação por aquecimento com vapor 4.6 - Cálculo do tempo de esterilização por processo descontínuo Suponhamos que na esterilização descontínua de um dado volume de meio, a curva da Figura 4.9 represente a variação da temperatura do meio com. o tempo. I I I I I _ _ _ _ _l _ _ _ _ _ _ _ L_ - I' I I I I I N 1 II I I I I I II I I I I I J/'p II I I I I I ---r----~-------r-r----- 1 I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I I Tempo Figura 4.9- Variação de temperatura do meio com o tempo, durante sua esterilização por processo descontínuo. Te: temperatura de esterilização. Tm: temperatura mínima letal. T f: temperatura final do meio esterilizado =temperatura de fermentação. T 0 : temperatura inicial do meio a esterilizar. N 1 : número de células vivas no instante t 1 . P: probabilidade de falha. Para calcularmos o tempo de esterilização (9) precisamos conhecer: a) o número inicial de células vivas no meio (N1); b) a probabilidade de falha (P); c) as curvas de aquecimento e de resfriamento do meio; d) a temperatura mínima letal (Tm); e) a temperatura de esterilização (Te); f) a variação de k com a temperatura. Na Figura 4.9, N 2 e N 3 são, respectivamente, os números de microrganismos vivos no fim da fase de aquecimento e no início da fase de resfriamento. Como veremos logo mais, N 2 e N 3 não precisam ser conhecidos. Tanto no aquecimento como no resfriamento, o valor de k varia como conseqüência da variação da temperatura. Nesses casos, a eq. 4.1 nos dará: Z6 6 57 Cálculo do tempo de esterilização por processo descontínuo a) no aquecimento: N t2 N2 t N t, (4.20) l n -1 =Jk·dt 1 b) no resfriamento: , (4.21) 3 ln=Jk·dt p t 3 Essas integrais podem, por exemplo, ser calculadas do seguinte modo: escolhem-se diversos valores de t na fase de aquecimento (ou de resfriamento); para cada valor escolhido de t, a curva de aquecimento (ou de resfriamento) nos dá a temperatura correspondente; mas para cada valor da temperatura, lembrando que a variação de k com a temperatura é conhecida, calcula-se o correspondente valor de k; teremos, deste modo, a variação de k com o tempo no aquecimento (ou no resfriamento); tendo-se k = f(t), podemos calcular as integrais das eqs. 4.20 e 4.21. Sendo k. o valor de k na temperatura de esterilização, podemos então escrever: N 12 1 ln= ·dt N2 I 1 Jk: N . 1, 3 1n=Jk·dt p I 3 Logo: N 12 I, ln pl =ke ·9+ Jk ·dt+ Jk·dt 11 (4.22) 13 A eq. 4.22 nos permite calcular e. A título de exemplo numérico, consideremos o cálculo do tempo de esterilização de um mosto, sendo dados: a) volume do mosto= 100m3 (10 5 litros); b) concentração de microrganismos vivos no mosto= 7,2 ·10 9 células/litro; 58 Esterilização de meios de fennentação por aquecimento com vapor .c) temperatura de esterilização = l20°C; d) temperatura mínima letal = 80°C; e) probabilidade de falha= 0,001 (ou 0,1 %); f) curvas de aquecimento e de resfriamento= ver Fig. 4.10; g) variação de k (em min- 1) com a temperatura T' (em 0 C): k =6,04 ·10-11 . e 0 , 200 ·T'(equação de Bigelow) 120 / (4.23) T' e Resfriamento 120 T'm ô ~ 80 f:- 40 40 Aquecimento o 40 o o 80 40 80 t (min) Figura 4.1 O - Curvas de aquecimento e de resfriamento do meio (exemplo numérico). A partir das curvas da Figura 4.10 e da equação que relaciona k com a temperatura T', montamos as Tabelas 4.4 e 4.5, que nos permitem representar graficamente a variação de k com o tempo (ver Fig. 4.11) Tabela 4.4 - Valores de k durante o aquecimento do meio (exemplo numérico). t (min) T' ( 0 C) k (min- 1) 20 75 0,0002 30 87 0,0022 40 97 0,016 50 105 0,080 60 112 0,32 70 116 0,72 80 120 1,60 ·"' ... ~.a..':': .. . 6' ::t· , .~.- .::.. ;..; .• ~~.~ ~ !~ ~ . ~~. . r--:~ 59 Cálculo do tempo de esterilização por processo descontínuo Tabela 4.5- Valores de k durante o resfriamento do meio (exemplo numérico). t (min) T ' (0 C) k (min-1) ~-----------------r----------------~----------------~1 ; o 120 2 114 1,60 o/.1 '' 0,48 :t.,.. ~ Ir-------------------~--------------------~-------------------; ' , t-------------------~--------------------~----~--------------11 · 4 109 - ;' 0,18 1 ~: 105 6 0,080 ~ ~-·· ll------------------r------------------+--------------------11.... : 101 8 0,036 :i:' lr-------.10--------r-------9-7------~-------0-,0-16-------i~~ 15 88 0,0026 20 80 0,0005 ll------------------~----------------r--------------~11~ . ,""!· 1,6 1,6 Resfriamento Aquecimento 1,2 1,2 ~ ~ i:: .E ?;! 80 0,8 0,8 20 Jk ·dt fok ·dt 24 0,4 0,4 o 20 60 40 t (min) 80 o 4 8 t (min) Figura 4.11 -Variação de k durante o aquecimento e o resfriamento do meio (exemplo numérico). i...___ --- --. Teremos então: N 1 =10 5 -7,2-10 9 =7,2 ·10 14 p =0,001 . ln (N 1 I P) = 41,12 . 12 o i:: .E ?;! 60 Esterilização de meios de fermentação por aquecimento com vapor 80 Jk·dt~19,40 (ver Fig. 4.11; fase de aquecimento) 24 20 Jk ·dt ~3,23 (ver Fig. 4.11; fase de resfriamento) o Substituindo esses valores na equação 4.22, calculamos e: 41,12 = 1,60 e+ 19,40 + 3,23 e = 11,6 min ~ 12 min Suponhamos, agora, que tivéssemos: a) concentração de microrganismos vivos no mosto= 4,3 · 102 células/litro; b) probabilidade de falha= 0,1 (10%). Nesse último caso: p = 0,1 ln(N 1 I P)=19,88 A equação 4.22 nos daria, então: 19,88 = 1,60 e+ 19,40 + 3,23 9=-1,7min Esse resultado indica que, nesse último exemplo numérico, o aquecimento e o resfriamento são mais que suficientes para conseguirmos a esterilização desejada. 4. 7 - Cálculo do tempo de esterilização por processo contínuo Lembrando que, no processo contínuo, tanto o aquecimento quanto o resfriamento do meio são muito rápidos, as integrais representadas nas eqs. 4.20 e 4.21 podem ser desprezadas, e o cálculo do tempo de esterilização e se resume na aplicação da equação: ------- - ---~-- - - -------- --- - - -- - - --~ Cálculo do tempo de esterilização por processo contínuo Nl ln-=k p e 61 .e Voltemos ao exemplo numérico citado no item anterior, mas com temperatura de esterilização igual a 130°C. Teremos, pela eq. 4.23: ke = 11,8 min -l Logo, o valor de e ser'á: 41)2 =11,8-e :. e =3,5min Resta-nos, finalmente, considerar o dimensionamento do tubo de espera. Sejam: V= volume de meio necessário para encher um fermentador; te = tempo de carga do fermimtador; p = massa específica do meio à temperatura de esterilização; J..l =viscosidade do meio à temperatura de esterilização; e = tempo de esterilização = tempo de residência do meio no tubo de espera; Re = número de Reynolds no tubo de espera; D = diâmetro interno do tubo de espera; v = velocidade de meio no tubo de espera; L= comprimento do tubo de espera. Os valores de V te, p, J..l, e, são conhecidos e, além disso, sabemos que Re e v devem estar compreendidos nos intervalos 36.000 a 80.000 e 3 a 60 em/ s, respectivamente. Interessa-nos calcular D e L, lembrando que o valor de D deve estar contido, aproximadamente, no interv~lo 10 a 30 em. Sendo F = V I te a vazão do meio no tubo de espera, podemos escrever: rr.·D 2 4 F=--·V .. D z ·V=-4 ·F (4.24) Re = D·v ·p :.D· V= JJ.·Re (4.25) . rr. Por outro lado: J..l p As equações 4.24 e 4.25 nos dão: D=4 · F·p __!_ (4.26) · rr.·JJ. Re Para cada valor de Re, a eq. 4.26 permite calcular D e, então, a eq. 4.24 nos dá o correspondente valor de v. Considerando que L ~v· e, calculamos o correspondente valor de L. ~ ---- I l 1 !1 l 62 Esterilização de meios de fermentação por aquecimento com vapor A título de exemplo numérico, imaginemos um caso no qual: 3 V= 100m3 = 1,00.10 8 cm te= 4 h= 1,44.10 4 S p = 1,06 g/cm 3 3 J.l = 0,55 cp = 5,5.10- p e= 3,5 min = 2,1.10 2 s A partir dos valores de V e te calculamos a vazão do meio: F=V !te =6,94 ·10 3 cm 3 /s Com esses valores numéricos, poderemos calcular D, v e L para cada valor de Re (ver Tab. 4.6). A escolha do valor de D (e do correspondente L) dependerá, obviamente, dos diâmetros de tubos existentes no mercado, dos preços desses tubos, de alguma característica peculiar do meio, e de outros requisitos ou limitações inerentes ao projeto global. Por segurança, o projeto poderá prever, no tubo de espera, um "tubo em U" (ver Figura 4.4) suplementar. Tabela 4.6- Valores do diâmetro (D) e do comprimento (L) do tubo de espéra, e da velocidade (v) do meio no tubo de espera para diferentes valores do número de Reynolds (Re ), no exemplo numérico considerado. D (em) Re L (m) v (cm/s) ,:_ 40000 42,6 4,87 10,2 50000 34,1 7,60 16,0 60000 28,4 10,96 23,0 70000 24,3 14,97 31,4 80000 .• :.i~~' 21,3 -- ' c': - ' ~~..,_,4.}:-~ ..,..·'· .... ,. .- . ' . :.~·:· i'" -· ~ "' ·~-~~ -:·-· ?t-· 40,9 19,49 ~ ~-~~r ·' A~. .. _,..... - - . .'·t;:~ ~ 't~ }~." ~.·_.._ ..;. ~;-- L~ 1 ... .._. Literatura recomendada (1) AIBA, S., HUMPHREY, A.E. & MILLIS, N .F. Biochemical Engineering. University of Tokyo Press, Tóquio, 1973. (2) BAILEY, J.E . & OLLIS, D.F. Biochemicai Engineering Fundamentais. McGraw-Hill Book Company, Nova York, 1986. (3) BLAKEBROUGH, N . Biochemicai and Bioiogicai Engineering Science. Academic Press, Nova York, 1967 e 1968. (4) SIMON, P. & MEUNIER, R. Microbioiogie Industrielle et Génie Biochimique. Masson et Cie., Éditeurs, Paris, 1970. (5) SOLOMONS, G.L Materiais and Methods in Fermentation. Academic Press, Londres, 1969. -------- -- - - - - - - ------·------------------ - - · - · --- --- · - ---- - ---~-- - -..,.------ - ----- ----·- - ···- -----· - - .. ------- ----- --~ 63 :: _______________________ , , Willibaldo Schmidell 5.1- Introdução Como se sabe, os processos químicos industriais podem ser divididos, de uma forma simples e global, em processos inorgânicos, orgânicos e biológicos. Assim, um processo químico industrial biológico é aquele no qual o processo de conversão da matéria-prima em produto repousa basicamente em um fenômeno biológico. Esse tipo de indústria apresenta uma série de características próprias, pois freqüentemente trata-se de fazer crescer um certo microrganismo ou, de forma mais geral, uma dada célula, seja microbiana, animal ou vegetal. Esse fato exige a pres,ença, desde o projeto da planta até sua operação em regime, de uma mentalidade própria e particular em relação à existente na indústria química não biológica. É também fato conhecido, que até a Segunda Guerra Mundial não s~ dispunha de tecnologias adequadas para a condução de processos fermentativos em grande escala e em condições de assepsia, motivo pelo qual não havia a possibilidade de se fabricar produtos tais como antibióticos, vitaminas, enzimas, etc. Os produtos elaborados por processos fermentativos eram aqueles cuja geração, no caldo em fermentação, tornassem o meio não adequado para a proliferação de possíveis contaminantes, determinando, desta forma, uma proteção natural ao meio (etanol, acetona, ácidos orgânicos, etc.). O grande avanço observado durante a Segunda Guerra Mundial foi exatamente o desenvolvimento dessas estratégias que permitiram a condução de processos em larga escala em condições de assepsia, em particular a possibilidade , de se efetuar a esterilização de grandes volumes de ar, necessário aos processos biológicos aeróbios. Apenas para se ter uma idéia da importância da: esterilização do ar, imagine-se a necessidade de fornecer ar esterilizado para um reator de 100m3 a uma va- 64 :l !. Esterilização de ar zão específica de 0,5 min- 1 (ou, como freqüentemente mencionado, 0,5 v.v.m., ou seja, volume de ar por volume de meio por minuto). Esse problema, que nada tem de extraordinário, sendo mesmo bastante freqüente, pode ser resumido à necessidade de se esterilizar 50 m 3ar/min. Admitindo-se uma contaminação do ar ambiente da ordem de 103 partículas/m3 (vide item seguinte), caso não houvesse a esterilização do ar, introduzir-se-iam no reator 5x10 4 partículas/min. Lembrando que um processo fermentativo pode freqüentemente ocorrer durante 50 ou 100 horas, isto significaria introduzir um total de 3x10 8 partículas contendo microrganismos, ao longo de 100 horas de fermentação. Esse exemplo torna claro que não se poderá obter sucesso nesse processo, caso o acúmulo do produto desejado dependa da ação isolada do microrganismo responsável pela síntese deste produto. Na verdade, caso se trate de um processo descontínuo de fermentação, os instantes mais problemáticos são os instantes iniciais do processo, pois aí se tem baixa concentração do microrganismo produtor e alta concentração de substratos, o que significa alta potencialidade de contaminação do sistema. Já nos instantes mais avançados tem-se uma alta concentração do microrganismo responsável pelo processo produtivo e uma baixa concentração de substratos, o que torna o caldo em fermentação menos suscetível a contaminações. Isso não significa que se possa conduzir o process<;> de forma menos atenta, pois a ocórrência de contaminações que produzam substâncias que destruam o produto gerado pode _comprometer o . processo, como é o caso de contaminações com células produtoras de proteases em um processo de produção de uma dada enzima. Claro está que o nível de preocupação com a esterilização do ar depende da maior ou menor suscetibilidade do_processo quanto a cúntaminantes. Caso o meio de cultivo, ou as condições impostas ao reator (pH, temperatura), sejam extremamente seletivos, os cuidados podem ser atenuados, mas ainda assim a ocorrência de contaminações pode interferir negativamente no que se refere à obtenção de altos rendimentos, o que geralmente não compensa a economia que se tenha feito, e que não mais permita uma operação asséptica eficiente. No presente capítulo pretende-se descrever certas particularidades sobre os aerossóis microbianos, indicar formas para se estimar a concentração de microrganismos suspensos no ar, apresentar as formas mais freqüentes e disponíveis para se executar a esterilização do ar, sempre com a principal preocupação no fornecimento de ar esterilizado para processos fermentativos aeróbios. 5.2 - Aerossóis microbianos As espécies microbianas suspensas no ar atmosférico, assim como sua concentração, podem ser extremamente variáveis, dependendo de uma série de fatores. Pode-se encontrar microrganismos de maiores dimensões, como bolores (fragmentos de hifas) e leveduras, assim como espécies de menores dimensões como bactérias ou seus esporos. Esses microrganismos são provenientes do solo, ou de plantas, ou ainda de cursos de água, sendo postos ein suspensão pela ---- -- - - - --- - -· -------. - - - - ·----·- ---------- - - ----~-- ------- _..,...._....,. Amestradores 65 movimentação do ar ambiente, sendo os de menores dimensões freqüentemente associados a partículas de poeira. A simples menção desses fatos já indica que, dependendo do clima de urna dada localidade, ou mesmo de um dia para outro em urna mesma localidade, po- , dern-se encontrar diferentes concentrações de microrganismos suspensos no ar, assim corno distintas espécies de microrganismos suspensos. De fato, ao se efetuar a contagem de microrgàni~rnos no ar em um ambiente livre de radiações solares e com umidade relativa elevada, muito provavelmente obtêm-se concentrações elevadas de células vegetativas. Ao contrário, urna determinação feita após longa exposição à luz solar forneceria urna contagem preferencial de espécies mais resistentes, corno ·os esporos de bactérias. Analogamente, a concentração de microrganismos suspensos no ar é drasticamente reduzida após um período de chuvas e extremamente elevada após. um período de ventos fortes. Essas informações permitem refletir sobre o local de onde se deve proceder à captação de ar para processo. Esse local de captação não deve ser entendido corno aleatório, pois podemos estar captando ar de locais II).Uito contaminados, corno seria o caso de se localizar a entrada de ar do sistema de compressão muito próxima do solo, ou ainda voltada para locais particulares e sujeitos a um maior nível de contaminação. No próximo item se buscará descrever sistemas para a determinação da· concentração de microrganismos suspensos no ar, mas já se pode afirmar que, apesar das possíveis variações em urna mesma localidade, ao se efetuar estas deterrnina.ções por longos períodos (um ano por exemplo), obtêm-se valores médios relativa- · mente próximos. Assim, AIBA et al. 1 indicam, para a atmosfera de Tóquio, urna concentração média de microrganismos de 12x103 partículas/rn3, enquanto que GADEN;HUMPHREY 2 indicam, para Londres, um valor de 3 a 9x103 partículas/rn3 • PARIS et al. 3 chegaram a urna concentração média de 1 a 3x103 partículas/rn3, no que se refere à atmosfera da capital de São Paulo, após realizarem amostragens durante o período-de um ano e em diversas localidades. ' Deve-se salientar que as diferenças observadas entre esses diversos dados disponíveis na literatura são devidas às próprias características do fenômeno, conforme discutido anteriormente, mas também em virtude do emprego de diferentes rnetodologias na quantificação. Quanto às dimensões dos microrganismos suspensos no ar, pode-se considerar corno representativos valores da ordem de 0,5 a 1,0 !JID, ou seja, dimensões de bactérias ou seus esporos. Por outro lado, as partículas de poeira, que freqüentemente transportam os microrganismos, apresentam diâmetros freqüentemente superiores a 4 J.liD, sendo que os esporos normalmente não estão associados a estas partículas de poeira. 4 5.3 - Amestradores A determinação da concentração de microrganismos suspensos no ar atmosférico é realizada através do uso de dispositivos designados genericamente por arnostnidores. Esses instrumentos não são apenas importantes por realizarem essa - -- - - ------· _____ _,___ .... ~ - --- ~,. .. ~- -.---...,...,_-- --=- -~...:.....,_., ,.,... __ _ __________ _____ ·--- - - - -- 66 Esterilização de ar tarefa, como também são empregados para a · verificação da efetiva esterilização do ar destinado ao processo, ou na quantificação de eventuais contaminantes e.m áreas ditas estéreis (salas de cirurgia). Essas são as razões pelas quais reveste-se de importância o conhecimento de alguns detalhes sobre .os tipos de amestradores que podem ser empregados, assim como sua forma de operação e limitações. De uma forma geral, todos os amestradores operam de maneira semelhante, pois o princípio básico deles consiste em reter, de alguma forma, os microrganismos suspensos em um determinado volume de ar, dando-se, a seguir, condições para que estas células proliferem, de maneira a tornar possível a contagem de colônias, para a quantificação dos contaminantes no volume de ar amostrado. Tendo em vista essa descrição geral, pode-se concluir que: a) dependendo da forma empregada para reter os microrganismos, não se pode assegurar que esta retenção seja total, podendo-se inclusive imaginar que haja distintas eficiências de coleta para diferentes amestradores; b) ainda na dependência da forma de reter os microrganismos, pode-se também imaginar a possibilidade da ocorrência de destruição de certas espécies; c) lembrando que células microbianas suspensas no ar podem estar associadas a partículas de poeira, podendo ocorrer a existência de mais que uma célula por partícula, por mais que se busque desagregar estes conjuntos, é sempre difícil afirmar que uma colônia tenha tido, obrigatoriamente, origem em uma única célula. Essa é, inclusive, a razão pela qual os resultados são freqüentemente expressos em número de partículas, ou de número de colônias por unidade de volume de ar amostrado; d) conforme indicado, a etapa final da determinàção consiste em contar colônias que se desenvolveram em um dado meio de cultura e, tendo em vista a grande variedade de microrganismos suspensos no ar, torna-se difícil eleger um meio no qual se possa afirmar que todas as espécies se desenvolvam em um dado intervalo de tempo. · Uma primeira conseqüência dos fatos acima apontados/ reside n<J'dificuldade em comparar resultados obtidos pelo uso de diferentes amestradores, ou com um mesmo amestrador~ porém operado de formas distintas. Outra conseqüência clara é a impossibilidade de se obter a concentração, total ou absoluta, de microrganismos suspensos no ar atmosférico. Uma forma de minorar esses problemas, especialmente quando se deseja efetuar testes de efetividade de esterilização de um dado sistema, por exemplo de um dado filtro, consiste em preparar uma suspensão de um dado microrganismo em ar, previamente submetido à esterilização. Esse ar, artificialmente contaminado com o microrganismo usado como marcador, é passado através do filtro, determinando-se a concentração (ou o número) de microrganismos no ar antes e após o elemento filtrante, desde que também se conheça o volume de ar amostrado, medindo-se a vazão de ar e o tempo do ensaio. Pode-se assim quantificar a eficiência de retenção (TJ) do filtro em teste: . TJ = N l ~N z X 100 . (5.1) Nl _, .. ---- · -.- - - - -- - ----- --- - · .... ..... ... ...___.il Amestradores 67 · onde: N 1 =concentração de microrganismos no ar antes da passagem pelo filtro .(partículas ou colônias por unidade de volume) e N 2 = concentração de microrganismos no ar após a passagem pelo filtro,_ (partículas ou colônias por unidade de volume). . O fato de se conhecer o microrganismo empregado para esse tipo de determinação, significa que se conhece perfeitamente o aspecto dÇl.s colônias que se quer contar (formato, apar&ncia, cor), além de se conhecer o meio de cultura e as condições mais adequadas para a sua proliferação. Vários microrganismos têm sido empregados para a realização desses testes, tais como Serratia marcescens,S Pseudomonas diminuta 6'7 e esporos de Bacillus subtilis var. niger. 4 Obviamente esses microrganismos são de pequenas dimensões, como é o caso do Pseudomonas diminuta, que apresenta diâmetros de 0,3 por 0,8 J.Lm. 7 Pretende-se, a §eguir, apresentar algumas características de alguns amostradores mais freqüentemente empregados. Convém salientar que na literatura há a descrição de um número elevado de amostradores, sendo freqüente que um pesquisador, ao trabalhar sobre. o tema, acabe por desenvolver o seu próprio sistema, ou propondo variações sobre os existentes. Isso resulta na geração de dados que são de difícil comparação, a não ser que se empregue sistema idêntico. 5.3.1 - I!Tlpinger O impinger é um dos amostradores mais conhecidos e sobre o qual há inuitas referências. Existem, inclusive, inúmeras versões desse amostrador, sendo um exemplo típico o indicado na Figura 5.1, extr_aída do trabalho de TYLER; SHIPE, 8 sendo conhecido como "all-glass impinger" (AGI). 2 13cm Figura 5.1 - "All-glass impinger" (AGI). (I) Entrada do ar; (2) Saída do ar (bomba de vácuo). - -·-:-- - -~ -- -- ------·· ~-- -·· ·· --· - · ·-·· · · · ------ --· ------ -- - ---~__;_ _______ ~ ---.-- - ·-;- - -·- --- --- · --- -- -- -· - ---- - ---: -- 8 68 Esterilização de ar Esse amostrador consta de um recipiente de vidro que contém 10 mL ·do líquido coletor, que pode ser água destilada, ou determinadas soluções como a solução gelatina-fosfato, constituída de gelatina (2 g/L) e Na 2HPQ4 (4 g/L), à qual se adiciona 0,01 mL de óleo de oliva esterilizado, a fim de evitar a formação de espuma. Antes do início da amostragem, todo o conjunto deve ser esterilizado. Ao se iniciar a amostragem do ar, liga-se a abertura 2, indicada na Figura 5.1, a uma bomba de vácuo, de forina a reduzir a pressão no interior do recipiente. Dessa forma, o ar entrará no amostrador através da abertura 1, borbulhando no líquido coletor através do tubo de vidro, o qual é capilar em sua parte final para gerar bolhas de pequeno diâmetro. Espera-se, portanto, que os microrganismos existentes no ar fiquem retidos no líquido. Terminada a tomada de amostra, o frasco é agitado, a fim de promover a desagregação dos eventuais aglomerados de células, determinando-se, então, a concentração de microrganismos no líquido coletor, através dos métodos usuais de diluições e contagem de colônias em placas. Conhecendo-se a vazão de ar e o tempo de amostragem, conhece-se o volume de ar amostrado, tendo-se, portanto, todos os dados necessários para o cálculo da concentração de microrganismos neste ar. Uma das vantagens desse amostrador consiste no fato de Iião ser necessário o uso de medidor de vazão de ar, uma vez executada a calibração do aparelho, pois o tubo capilar funciona como um "orifício crítico". Essa expressão "orifício crítico" significa uma condição de trabalho na qual a relação entre as pressões reinantes nas extremidades do tubo capilar é suficiente para produzir velocidade do ar igual à do som. Essa velocidade não é mais ultrapassada, mesmo que a pressão do lado do vácuo diminua ou oscile abaixo desse valor crítico. Para o ar, a relação de pressões é de 0,53, significando que se a amostragem for efetuada de um ambiente à pressão de 1 atm, a pressão do lado do vácuo deverá ser inferior a 0,53 atm, podendo inclusive oscilar entre valores abaixo deste e, mesmo assim,' a vazão permanecerá constante. 9 Assim, uma vez construído o instrumento, ele deve ser submetido a uma calibração, para se conhecer a vazão de ar que ele pe/mite, com a devida precisão. No caso do AGI utilizado por TYLER; SHIPE, 8 a vazão de ar era de 12,5 L/min e a distância da extremidade livre do capilar ao fundo do frasco era de 4 mm. Esse impinger apresentou uma eficiência de retenção de esporos de Bacillus subtilis superior a 99%, em comparação com os ·dados obtidos com um amostrador de algodão (vide a seguir) considerado como absoluto, apesar de se saber que ocorre destruição de células neste tipo de amostrador. Em vista desses fatos, os mesmos autores puderam imaginar que haveria retenção de microrganismos no tubo de admissão de ar, assim como poderia ocorrer a destruição de células, em virtude da excessiva velocidade com que as partículas são lançadas no meio, podendo, inclusive, haver choque contra o fundo do frasco. Para demonstrar a ocorrência de retenção no tubo de admissão 'do ar, TYLER et al. 10 empregaram aerossol contendo cristal violeta, sendo que após certo tempo de amostragem efetuavam uma lavagem no tubo de admissão, determinando a concentração daquele corante através de um colorímetro. Demonstraram que não Amostradores 69 apenas ocorre essa retenção, como também que ela depende do tamanho da partícula, observando que para partículas de 20 Jlm ocorre praticamente retenção total. Um dos métodos empregados pelos autores para a determinação da destruição de células vegetativas durante a amostragem, consistiu no uso de células marcadas radiativamente. Para tanto, usaram uma suspensão de Serratia marcescens previamente cultivada em meio glicosado contendo fósforo ou enxofre radioativos. Após a amostragen( determinavam o número de partículas no líquido coletor através de um contador Geiger e as células viáveis pela técnica usual de contagem de colônias em placas. Uma vez constatados esses problemas com o AGI, SHIPE et al. 11 desenvolveram um outro tipo de amestrador, que recebeu a designação de amestrador Shipe, indicado na Figura 5.2. 2 Figura 5.2 - Amostrador Shipe. (I) Oriffcio crítico (entrada do ar); (2) saída do ar (bomba de vácuo). 11 Esse outro tipo de instrumento consiste em um erlenmeyer de 125 mL, sendo a entradado ar feita através de um "orifício crítico". Ele opera de forma similar ao AGI, colocando-se no erlenmeyer 25 mL do líquido coletor e ligando-se a saída de ar a uma bomba de vácuo. Devido à entrada do ar em alta velocidade ser efetuada na superfície do líquido, isto provoca um movimento circular do líquido coletor, sendo importante a localização do orifício de entrada, a fim de evitar uma excessiva umidificação das paredes do frasco. 70 Esterilização de ar Como se pode observar, o amostrador Shipe não conta com o tubo de entrada, e ainda lança as partículas contra a superfície do líquido coletor que está em movimento. Isso evita a mencionada retenção e também reduz :a possibilidade de destruição de células vegetativas, sendo que testes comparativos indicaram cerca de 23% a mais de células viáveis no amostrador Shipe, em relação ao valor obtido no AGI. Os detalhes expostos acima servem para ilustrar os cuidados na construção e operação desses amostradores, para se poder obter resultados satisfatórios e reprodutíveis, mesmo no caso de se utilizar aerossóis contendo células conhecidas. 5.3.2 - Amostragem por filtração Existem vários amostradores cujo princípio básico da amostragem é a filtração, sendo, portanto, distintos dos amostradores mencionados. Consistem em fazer passar o ar através de um elemento filtrante, o qual deverá reter os microrganismos suspensos. Posteriormente, pode-se colocar esse material filtrante em suspensão em um volume conhecido de um líquido adequado, procedendo-se a uma agitação vigorosa, a fim de propiciar a passagem dos microrganismos retidos para o líquido. Finalmente, efetua-se a determinação da concentração de microrganismos no líquido, pelas técnicas usuais de diluições e contagem em placas. Conhecendo-se o volume de líquido sabe-se o número total de microrganismos retidos e, novamente, conhecendo-se a vazão do ar amostrado e o tempo de amostragem, têm-se todos os elementos para o cálculo da concentração de células no ar. Alternativamente, pode-se após a passagem do ar através do elemento filtrante dar condições para que as células proliferem no próprio coletor; efetuando-se então a contagem de colônias. Esse procedimento, quando possível, evita o trabalho adicional de suspender as células em um líquido para posterior contagem. Um amostrador típico dessa categoria é o amostrador de algodão, esquematizado na Figura 5.3. Após a sua montagem ele deve ser submetido a esterilização, preferencialmente por meio de calor seco (estufa), a fim de evitar o umedecimento das fibras e a conseqüente perda de eficiência de retenção de microrganismos. A amostragem é realizada conectando-se a extremidade 2 (Fig. 5.3) a uma bomba de vácuo, intercalando-se um sistema para a medida da vazão de ar. Após o tempo de amostragem, o chumaço de algodão é retirado do amostrador e assepticamente transferido para um recipiente contendo um volume conhecido de água esterilizada. Procede-se, então, a uma vigorosa agitação, objetivando a passagem dos microrganismos retidos nas fibras para o líquido, efetuando-se a determinação da concentraÇão de microrganismos no líquido por contagem de colônias em placas. Esse amostriidor apresenta uma série de inconvenientes, como a dificuldade em suspender os microrganismos retidos, além de provocar a destruição de células vegetativas, conforme apontado por TYLER; SHIPE.8 Alternativamente pode~se eiilpregar lã de! vidro, mas de ' qualquer maneira a obtenção de altas eficiências de coleta depende de se ter o material fíltrante muito bem compactado, de forma a se observar uma perda de carga, no leito filtrante, relativamente elevada e da ordem de 0,5 kg* /em. · · -~- ----- ----__. Amestradores 71 2 13 em 8 Figura 5.3 - Amostrador de algodão. (I) Entrada do ar; (2) Safda do ar (bomba de vácuo). Uma forma mais conveniente de se efetuar amostragens por filtração consiste no emprego do amostrador proposto pela Millipore Ind. e Com. Ltda. Esse amostrador consiste em urri suporte em aço inoxidável, o qual abriga membranas Millipore de 4Zmm de diâmetro e poros de 0,22 J..lm ou 0,8 J..lm, devendo ser previamente esterilizado. O sistema dispõe de uma bomba de vácuo, que succiona o ar, ·obrigando-o a passar através da membrana e tà:mbém através de um orifício crítico,. a .Jim de se ter uma vazão constante e conhecida. Terminada a amostragem, a membrana deve ser retirada assepticamente e colocada sobre a superfície de um meio de cultura em pequenas placas de Petri. Após tempo adequado de incubação, contam-se as colônias que aparecem sobre a membrana, obtendo-se, assim, a concentração de microrganismos no ar amostrado. PARIS et al} cujos resultados foram meru::ionados anteriormente, efetuaram determinações com o emprego desse tipo amostrador. Ao que tudo indica, o desenvolvimento de amostradotes que operam por filtração através de membranas, teve seu início com o trabalho de TQRLONI; BORZANI,12 empregando um sistema cujo elemento filtrante qmsistia em papelfiltro Whatman 40 e 42. Esse original sistema, esquematizado na Figura 5.4, era constituído de um funil de alumínio, ao qual se adapta uma folha de papel-filtro apoiado em uma grade de aço inoxidável. Entre a grade e a folha de papel colo· ca-se uma camada de algodão hidrófilo. de 72 .Esterilização de ar entrada __ do ar Figura 5.4 - Amostrador de papel filtro. 12 Após a esterilização do sistema, ao se efetuar a passagem de ar através da folha de papel-filtro, o que poderia ser feito acoplando-se um segundo cone após o elemento filtrante e este ligado a um orifício crítico e a uma bomba de vácuo, os microrganismos devem ficar retidos sobre esta folha. Terminada a amostrél,gem, o sistema pode ser desmontado, adicionando-se a seguir um meio de cultura ao algodão hidrófilo, de forma a permitir, após um certo período de incubação, a contagem de colônias surgidas na superfície do papel-filtro. A partir dos resultados obtidos pelos mencionados pesquisadores, 12 com o amostrador proposto pode-se estimar a concentração de microrganismos no ar atmosférico da cidade de São Paulo como estando entre 4 a 6x10 3 partícttlas/m3, valor este perfeitamente de acordo com os dados anteriormente mencionados. 5.3.3 - Amestradores de fenda ou orifício O princípio básico de funcionamento desses amostradores consiste em se fa- .· zer com que o ar amostrado incida, a uma dada velocidade, sobre a superfície de um meio de cultura sólido, havendo, em virtude de uma brusca mudança de direção do ar, o choque das partículas suspensas que não acompanham as linhas de corrente, ocasionando a retenção destas partículas nesta superfície. ·A Figura 5.5 mostra esquematicamente o amostrador de fenda desenvolvido por Bourdillon e descrito por TORLONI. 9 Como se nota, consta de uma placa de Petri, contendo um meio de cultura sólido preso a um disco horizontal giratório, estando todo este conjunto no interior de uma caixa metálica, provida de uma janela que permite fechamentó hermético. O ar entra por um tubo vertical que possui, na extremidade inferior, uma fenda através da qual as partículas em suspensão no ar - Amestradores 73 são lançadas contra a superfície coletora. Uma vez esterilizado todo o conjunto, a saída de ar é conectada a uma bomba de vácuo, intercalando-se um sistema para a medida da vazão de ar. ! 3 4 Figura 5.5 - Amostradorde fenda. (I) Placa de Petri; (2) Disco giratório; (3) Tubo e fenda (entrada do ar); (4) Saída do ar para o medidor de vazão e bomba de vácuo; (5) Caixa metálica. Durante o período de amostragem, o disco gira com velocidade angular regulável, em função da contaminação do ar que se está tomando como amostra, podendo-se imaginar valores desde 0,1 rpm até cerca de 2 rpm. Após a amostragem, a placa de Petri é retirada do amestrador, fechada em condições de assepsia e incubada. Decorrido um intervalo de tempo adequado, conta-se -o número de colônias que àparecem sobre ·o meio de cultura. Conhecendo-se a velocidade de rotação da placa; a vazão de ar e o número de colônias sobre o meio, ou parte de sua superfície, têm-se todos os elementos para quantificar a contaminação do ar amostrado. Note-se que não há como proceder à desagregação dos aglomerados de células, o que também ocorre com os sistemas, anteriormente descritos, nos quais se efetua a contagem diretamente sobre a superfície coletora. Isso significa que cuidados devem ser observados, especialmente quando se trabalha com aerossóis de microrganismos definidos, a fim de evitar a presença de aglomerados, que podem ser aleatoriamente desfeitos sobre a superfície coletora durante a amostragem, gerando contagens igualmente aleatórias. Os autores também indicaram que a eficiência de retenção de aerossóis depende da vazão do ar, assim como da distância da fenda ao meio de cultura. De-' terminaram um valor máximo de 95% de retenção, quando empregavam vazões superiores a 28 L/mine 2 mm de distância da fenda ao meio. Essa retenção dimi----------- · 74 Esterilização de ar nuía sensivelmente quando se reduzia a vazão do ar, sendo que obtiveram retenções inferiores a: 70%, operando corri urna vazão da ordem de 56 L/rnin e urna distância de 6 rnrn entre a fenda e o meio sólido. · Para amostragens muito prolongadas pode ocorrer ainda o inconveniente da perda de água do meio de cultura sólido, com a conseqüente abertura de fendas no meio, o que inutilizaria o ensaio efetuado. Apesar dos inconvenientes e cuidados apontados no que se refere a esse tipo de arnostrador, ele apresenta certas vantagens sobre os demais. De fato, pode-se imaginar a realização de teste de um determinado sistema para a esterilização do ar, corno por exemplo o teste de um determinado material filtrante, determinando de forma contínua a eficiência de esterilização ao longo do tempo de operação do sistema. Pelo emprego de urna suspensão de um dado microrganismo conhecido, marca-se no meio de cultura a posição da fenda no instante inicial. Após a incubação, pode-se proceder à contagem do número de colônias existentes em determinados setores da placa, os quais corresponderão a certos intervalos de tempo conhecidos, desde que se conheça a velocidade de rotação da placa. Corno se conhece a vazão, sabe-se o volume de ar amostrado em cada setor da placa e, portanto, a correspondente concentração de microrganismos no ar que passou pelo elemento filtrante em teste. Pode-se, assim, determinar a variação da eficiência de retenção em função do tempo de amostragem, ou de operação do sistema de esterilização. É evidente que outros amestradores também perrni~ern esse tipo de determinação, porém executada de forma intermitente, pois a cada amostragem há a necessidade de substituição do sistema de coleta do arnostrador, para a realização da contagem de partículas. No caso do arnostrador em questão, isso:não é necessário, bastando providenciar a substituição da placa, após um giro completo, por outra esterilizada. Na verdade, esses testes de sistemas de esterilização de ar, destinados a processos ferrnentativos, são de grande importância, tendo em vista a ne~ssidade de alta confiabilidade. Um sistema desse tipo foi empregado por AIBA et al.,5' 13' 14 para a realização de testes em filtros de materiais fibrosos e filtros de placas porosas, empregando porém um orifício no lugar de urna fenda. Na Figura 5.6 encontra-se esquematizado o sistema empregado pelos mencionados pesquisadores, observando-se que o ar passa por medidores de vazão e, após a nebulização de urna suspensão do microrganismo utilizado corno marcador (no caso Serratia marcescens), ele vai para os amestradores. Quando a válvula A estiver aberta, a B deve estar fechada, efetuando-se, nestas condições, a determinação da concentração de microrganismos no ar a ser filtrado. Feito isso fecha-se o registro A e abre-se oB, perrnitindo~se que o ar atravesse o filtro. Encontram-se naliteratura vários outros esquemas imaginados para a realização de testes de efetividade de sistemas para a esterilização do arY·15 Deve-se, no entanto, acrescentar que testes em linha deveriam ser executados, efetuando-se amostragens periódicas, ou até mesmo contínuas, de ar esterilizado ao longo do Métodos para a esterilização de ar 75 tempo em que o processo fermentativo esteja ocorrendo, a fim de verificar a eficiência da esterilização do ar, tendo em vista os altos custos envolvidos na perda de partidas em virtude de contaminações. Isso normalmente não é realizado, assim como outras medidas nessa direção, o que torna sempre muito difícil a descoberta das causas de contaminações em processos. Derivação para ensaio em branco Câmara de vidro esterilizada Placa de Petri t Rotâmetro Termômetro de bulbo sec'o e úmido Compre~ de ar Rotâmetro t ----.....L.-_....:;;._ __. Figura 5.6 - Sistema de teste de materiais filtrantes , empregando u~ amestrador de fenda.5 5.4 - Métodos para a esterilização de ar A esterilização de ar pode ser realizada por diversos processos. No entanto, a filtração é, sem dúvida, a solução mais conveniente, motivo pelo qual se dará a ela maior ênfase . . 5.4.1 - Esterilização por aquecimento Sabe-se que a resistência à destruição de microrganismos, quando submetidos ao calor seco, é bem superior quando comparada à resistência ao calor úmido. Por esse motivo, a esterilização do ar pelo calor seco exige temperaturas relativamente elevadas, assim como tempos de permanência nestas temperaturas também elevados. Ainda, o transporte de microrganismos por partículas sólidas de poeira, em virtude da possibilidade de alguma proteção térmica, acaba contribuindo para a necessidade de condições de esterilização mais drásticas. 76 Esterilização de ar Quando se raciocina em termos de aplicação industrial, constituída de reatores de grande porte, há a necessidade de vazões de ar bastante elevadas (observe o que foi descrito na Introdução). Isso dificulta imaginar o aquecimento de todo esse ar para atingir essas elevadas temperaturas, assim como é impossível projetar tubos de retenção ou de espera suficientemente longos, a fim de se contar com os tempos de residência prolongados a essas temperaturas. Devido a esses problemas, a esterilização de ar por calor seco encontra apenas aplicação para pequenas instalações, como é ó caso da esterilização do ar para equipamentos de laboratório ou escala piloto. Acrescente-se, ainda, que com o surgimento de sistemas de esterilização muito confiáveis, como é o caso das membranas filtrantes (vide adiante), a esterilização por aquecimento tornou-se alternativa muito pouco utilizada. Para se ter uma idéia mais concreta a respeito da possibilidade do uso dessa técnica, pode-se citar o trabalho de DECKER et al./ 6 que determinaram as condições de esterilização, trabalhando com esporos de Bacillus globigii e usando um esterilizador de ar por resistores elétricos. Os resultados obtidos pelos citados pesquisadores encontram-se na Tabela 5.1. Tabela 5.1 - Esterilização de ar por calor seco. Ensaios com esporos de Bacillus globigii. Temperatura CC) Tempo de permanência* (s) 218 24 246 10 274 5 .. 300 :;;;...-~ ~ *Para destruição superior a 99,9999% l:a'ltl.oi." - o.: r. -~ ~ ).~ -~ ·~ g 3 r:~ 16 ~ • Conforme pode ser observado, apenas temperaturas relativamente elevadas permitem tempos de exposição da o:r:.d em de alguns segundos, o que claramente limita a utilização dessa técnica, em se tratando de elevadas vazões de ar. Em virtude da facilidade de construção e de controle, a esterilização de ar por aquecimento através de resistores elétricos ainda encontra possíveis aplicações, para o caso de ar de exaustão de câmaras assépticas, especialmente quando se trabalha com microrganismos patogênicos, ou para o fornecimento de ar esterilizado para instalações de laboratório ou plantas piloto de pequenas dimensões. O processo consiste em forçar a passagem do ar através de resistores elétricos, onde o ar é aquecido e, através de sistema adequado, obrigá-lo a permanecer o tempo necessário a altas temperaturas. Um exemplo desse tipo de equipamento 7 é o proposto pela New Brunswick Sei. Co./ que permite vazões de até 200 litros de ar/min, o que poderia satisfazer a necessidade de um reator de 100 litros aerado com até 2 min·. É também possível esterilizar o ar que sai do reator, fazendo-o passar por um segundo sistema, o que pode ser de interesse quando se trabalha com patogênicos. -·-·------~- ·· · -····-~ Métodos para a esterilização de ar 77 Na Figura 5.7 encontra-se um desenho esquemático de um equipamento desse tipo, observando-se que o ar ao entrar no sistema é preaquecido pelo ar que deixa o equipamento, sendo, a seguir, conduzido para o contato direto com os resistores, atingindo temperaturas da ordem de 370°C. O ar esterilizado, além de trocar calor com o ar que entra, ainda é resfriado por água em uma serpentina adicional. Resistências Controle de temperatura Resfriamento Saída de a=r--~ Figura .S.7 - Equipamento para a esterilização de ar por aquecimento através de resistores elétricos. 17 Todo o trajeto do ar deve ser inicialmente esterilizado por vapor. Quando em operação, o sistema é controlado por p·a res termelétricos que comandam válvulas solenóides, que apenas permitem a passagem do ar para o. tanque, ou a descarga de gases para a atmosfera, caso a temperatura das câmaras de esterilização _se mantenha em valores adequados. Um aspecto interessante a ser abordado neste momento, em se tratando de reatores de grande porte, diz respeito à necessidade de se comprimir o ar que é en2 viado aos reatores, até pressões efetivas da ordem de 3 kg* I cm , a fim de vencer uma série de perdas de carga como a existente nos filtros para a esterilização do ar, no dispersar do ar no fundo do reator, altura da coluna líquida de meio de cultivo e a sobrepressão mantida na "cabeça" do reator (da ordem de 0,2 a 0,5 kg* /em\ a fim de evitar a entrada do ar ambiente que proporcionaria contaminações (entende-se por "cabeça" do reator o volume interno acima do líquido) . ........._____ ... . - ----- - ---·-------- ------ - . __ __,_ ---. -·- -- - -- -- --·-- ----- ----- --------- 78 Esterilização de ar Essa compressão obrigatória do ar provoca inevitavelmente um aquecimento do ar, atingindo-se valores que não são desprezíveis. Assim, um compressores~ tacionário, tipo helicoidal, provoca, para uma vazão de ar de 170 m 3 /min e descarga a 3 kglcm 2, um aquecimento do ar de 20°C a cerca de 180°C, além de ser necessária uma certa filtração do ar, na entrada do compressor, para evitar um maior desgaste de suas partes móveis. · Justamente por esse motivo é necessária a instalação de um sistema deresfriamento do ar após a compressão, para evitar a circulação do ar aquecido, assim como evitar a introdução de ar quente nos reatores, o que complicaria o controle de temperatura, além de possivelmente causar gradientes de temperatura ao longo da altura da coluna líquida em fermentação : Esse resfriamento é efetuado logo à saída do compressor, de forma que o ar permanece aquecido por um pequeno intervalo de tempo (freqüentemente inferior a 1 segundo). Conforme já mencionado, temperaturas inferiores a 200°C são pouco efetivas para a obtenção de ar esterilizado. Sabe-se, no entanto, que as temperaturas citadas são suficientes para inativar células vegetativas, apesar do baixo tempo de permanência, restando desta maneira os esporos e as células que possam estar protegidas de alguma forma . Por outro lado, caso se imaginasseatingir temperaturas da ordem de 300°C, a fim de obter ar esterilizado em poucos segundos de permanência (videTab. 5.1), significaria, dependendo do tipo de compressor e da vazão de ar necessária, comprimir o ar a pressões bem mais elevadas (da ordem de 10 a 12 kg* I cm2 ), o que traria um encarecimento ex~essivo tanto do equipamento, quanto no que se refere ao consumo de energia, não sendo portanto uma solução de interesse. PARIS et ai} efetuaram a determinação da concentração de microrganismos após a compressão e o resfriamento do ar, determinações estas efetuadas em uma instalação industrial dotada de um compressor helicoidal, operando, à vazão de 145m3 lmin e pressão de descarga de 2,5 kg* I cm2, o que permitia atingir cerca de 160°C. Esses autores obtiveram valores médios da ordem de 1 a 2 partículas/m3 . Assim sendo, a redução observada . é extremamente significativa, quando comparada ao valor da concentração de microrganismos suspensos no ar (vide item 5.2), o que sugere que o ar, após a compressão em instalações de grande porte, deve ser manuseado com certos cuidados, tendo em vista sua razoável desinfecção, evitando~se que novamente venha a ser contaminado pelo ar atmosférico. Outra sugestão seria efetuar, quando possível, o resfriamento do ar ein local n\ais próximo de sua utilização final e não imediatamente após a compressão, aumentando-se o tempo de residência a altas temperaturas. Existe, inclusive, menção na literatura a respeito da condução de processos fermentativos com sucesso, sem a presença de sistemas para a esterilização do ar, contando-se apenas com essa destruição de contaminantes durante a compressão.18 Isso, de forma alguma, deve significar que essa idéia deva ser generalizada e que seriam dispensáveis os sistemas adicionais para a esterilização do ar, especialmente quando se está diante de processos de longa duração e empregando condições e meios de cultivo pouco seletivos. _ - ~--- ------ ______ _.... Métodos para a esterilização de ar 79 5.4.2 - Esterilização por radiações Teoricamente, muitos tipos de radiações podem ser utilizadas para a esterilização do ar. Entretanto, o emprego de urna determinada radiação deve levar em conta urna série de importantes fatores, tais corno: a eficiência na destruição de microrganismos, o custo envolvido na obtenção da radiação, a periculosidade ou os efeitos colaterais de sua '.Itilização. Assim excluem-se para esse tipo de aplicação as partículas a., prótons e nêutrons, por serem excessivamente dispendiosos quanto à sua obtenção e aplicação prática, o mesmo ocorrendo com as radiações y. Quando se visa a esterilização de ar, apenas as radiações ultravioleta encontram aplicação prática. Em virtude de seu baixo poder de penetração, os raios ultravioleta necessitam de tempos de exposição relativamente longos, fato este que, novamente, impede o uso deste tipo de radiação para a esterilização de ar para um processo ferrnentativo. Em se tratando do fornecimento de ar esterilizado para câmaras assépticas, imaginou-se instalar lâmpadas ultravioleta em certos trechos do duto que leva o ar para a câmara. No entanto, mesmo para esse caso, dependendo das dimensões dessa câmara, as vazões de ar já podem ser muito elevadas, não permitindo tempo suficiente de exposição ao ultravioleta, havendo, assim, a necessidade da instalação de sistemas adicionais (filtros) para a efetiva esterilização do ar. Com freqüência observa-se a i'nstalaçãode lâmpadas ultravioleta no interior de salas assépticas, especialmente sobre os locais de trabalho, visando a esterilização do ar circundante e das superfícies das mesas e instrumentos empregados (por exemplo, no preenchimento asséptico de medicamentos). Corno o ar que se introduz nessas câmaras é previamente esterilizado e corno se procl,lra manter o ar o menos movimentado possível, o emprego da radiação ultravioleta, para este caso, é mais efetivo. 5.4.3 :. .: Esterilização por filtração A esterilização do ar por filtração é, sem dúvida, a solução mais adequada para a obtenção de altas vazões de ar esterilizado, em virtude dos baixos custos envolvidos nesta operação, além de se dispor, presentemente, de filtros bastante confiáveis. Por esses motivos, a filtração é encontrada em praticamente todas as instalações industriais, tendo também dominado as aplicações em instalações de pequeno porte, corno é o caso de instalações piloto ou de laboratório. Historicamente, muitos materiais filtrantes foram empregados, tais corno carvão, algodão ou papel. Posteriormente esses materiais foram substituídos por outros materiais fibrosos, corno é o caso de filtros de lã de vidro. Estes últimos encontraram enorme aplicação, constituindo-se na solução mais adequada até rneados .ou o final da década de 70. Mesmo no início dos anos 70 surgiram os filtros de materiais sinterizados, ·corno o vidro, metais (bronze, aço ,inoxidável) e materiais cerâmicos, aparecendo também os filtros de membranas ou placas porosas de materiais polirnéricos, tais corno o náilon, o teflon ou ésteres de celulose. 80 Esterilização de ar De fato, era possível prever, em meados da década de 70, que os filtros de membranas polirnéricas porosas poderiam dominar essa operação/ 9 o que de fato acabou ocorrendo, havendo urna gradual substituição dos filtr.os de lã de vidro pelos filtros de membranas hidrofóbicas, especialmente a partir de meados da década de 80. Mencionando-se o passado e o presente, poder-se-ia também imaginar que, no futuro, possivelmente se passe a empregar membranas seletivas, ou seja, membranas que além de esterilizar o gás a ser introduzido no reator, também possam provocar um enriquecimento do gás em oxigênio. 20 Na verdade, o principal objetivo da aeração, em reatores aerados e agitados, consiste na transferência do oxigênio da fase gasosa para a fase líquida, não tendo sentido a introdução no reator de enormes quantidades de nitrogênio. Assim, o uso de membranas poliméricas (corno o polietileno ou o silicone), além do possível emprego de membranas líquidas, poderá significar um enorme avanço nesse campo, corno já ocorre presentemente no cultivo de células animais. Antes de se passar ao detalhamento dos filtros disponíveis, convém alertar q'!le, qualquer que seja o sistema de esterilização do ar que se pretenda empregar, deve-se prever um filtro para cada reator, não se devendo optar, no projeto da instalação, por um sistema centralizado de esterilização, seguido da distribuição do ar para os vários reatores. Esse procedimento centralizado não é conveniente, independentemente das dimensões dos reatores e, portanto, das vazões de ar necessárias, pois coloca-se em risco todo o conjunto de reatores, caso ocorra a falha do sisternâ de filtração. A eventual economia que se possa fazer, quanto ao investimento inicial, não justifica o risco que se irá correr ao longo da operação da planta. 5.4.3.1 - Filtros de materiais fibrosos Apesar de se observar urna aplicação industrial menos intensa, os filtros de materiais fibrosos, particularmente os filtros de lã de vidro, ainda são ,encontrados em algumas instalaçõesi razão pela qual serão descritos no presente item. Nesses filtros observa-se que os poros ou interstícios e~.1tre as firtras, através dos quais ocorre a passagem do ar, são de dimensões maiores do que o diâmetro das fibras, empregando-se normalmente fibras com diâmetro médio da ordem de 3 f.lnl, ou até mesmo fibras de 19 f.lnl. Por esse motivo a retenção dos microrganismos suspensos no ar não ocorre apenas por impacto direto, ou retenção mecânica, havendo a participação de diver- · sos outros mecanismos para a observada eficiência global da camada fibrosa filtrante.19Tarnbérn por essa razão a operação é designada corno filtração em profundidade, pois as partículas são retidas ao longo de toda a altura da camada filtrante. Na Figura 5.8 encontra-se o desenho esquemático de um filtro de lã de vidro, assim corno alguns detalhes necessários para sua instalação. Corno se observa, consiste simplesmente num recipiente, normalmente em aço inoxidável, com dimensões da ordem de 2 a 3 rn de altura e 1 a 1,5 rn de diâmetro, dimensões estas que são variáveis, dependendo da quantidade de lã de vidro que deve acomodar. Na parte inferior conecta-se a tubulação de entrada do ar e, na parte·superior, a de saída para o ferrnentador. . --~ - - ____. ·-·- ---.·-···· .. - .. __ Métodos para a esterilização de ar 81 Ar esterilizado - Entrada do ar Salda de condensados . Figura 5.8 - Esquema de um filtro tradicional de lã de vidro para a esterilização do ar. A camada filtrante ocupa a parte central do recipiente, apresentando dimensões variáveis dependendo de uma série de fatores, tais como vazão de ar e diâmetro do recipiente (a eficiênçia de coleta de aerossóis depende da velocidade de passagem do ar através do leito filtrante e, portanto, depende da vazão do ar e do diâmetro do recipiente), compactação da camada filtrante (massa de fibras novolume de filtração), diâmetro da fibra e eficiência de retenção desejada. 19 Apenas para se ter uma idéia a respeito da espessura de um leito filtrante desse tipo, podem-se mencionar alturas da ordem de 1,3 a 1,8 m . A camada de lã de vidro é sustentada por uma grade de ferro e comprimida por uma segund~_ grade, colocada na parte superior da camada filtrante . Após o preenchimento do recipiente com a lã de vidro, coloca-se a tampa que veda perfeitamente o sistema. Nessa tampa existem hastes que servem para fixar a grade superior, impedindo que ocorra a movimentação da camada · filtrante, quando submetida a elevadas vazões de ar. O preenchimento do filtro com a lã de vidro deve ser feito de forma muito cuidadosa, procurando-se distribuí-la uniformemente em todo o volume disponível, buscando evitar a ocorrência de zonas contendo menos fibras, o que propiciará a formação de caminhos preferenciais para a passagem do ar. Obviamente esses caminhos preferenciais, com menor perda de carga, poderão comprometer a eficiência do filtro. Nesse sentido, um cuidado todo especial deve ser dedicado à zona próxima às paredes do recipiente, local especialmente propício para a formação destes caminhos preferenciais. · Justamente para diminuir a possibilidade de formação de càminhos preferenciais, busca-se trabalhar com camadas filtrantes bastante compactadas e, por isso mesmo, de menor espessura (menor altura da camada filtrante). Ainda, no caso de serem necessárias camadas filttantes muito ·espessas, pode-se providenciar a colocação de grades intermediárias ao longo da altura do leito filtrante . ......_______ ·-· - ·-···· -- -·-· ·--- ---- ~ ~---------------~------~----~------------~.--·----------- 82 I ! I I j_ EsterilizaÇão de ar A fim de evitar o deslocamento de fibras, há a possibilidade do uso de lã de vidro embebida em resinas e cornpactada em mantas de pequena espessura (por exemplo, mantas de cerca de 0,5 em de espessura). O emprego dessas mantas torna o leito filtrante bem menos espesso, em virtude da maior compactação, obtendo-se urna camada filtrante bem mais regular. Essas mantas são colocadas em recipientes corno o esquematizado na Figura 5.8, se bem que de menores dimensões, sendo também comprimidas corno no caso anterior. Para evitar o problema da zona periférica, existem sistemas de vedação através de flanges, de forma a impedir a passagem do ar. Quando se trabalha com filtros de lã de vidro, sempre se busca fazer com que o ar passe através da camada filtrante a urna temperatura superior à ambiente, de forma a manter a camada aquecida e evitar a condensação de umidade. Sabe-se que urna camada fibrosa umedecida apresenta urna menor eficiência de retenção de aerossóis, provavelmente em virtude de urna menor contribuição do rnecani~rno de retenção devido à atração eletrostática (cargas elétricas distintas entre aerossóis e as fibras, causando atração que contribui para o choque das partículas contra as fibras e sua retenção). Por esse motivo, o ar aquecido pela compressão normalmente é resfriado de forma a passar pelo leito filtrante a 40 ou 50°C. Alternativamente pode existir na parte inferior do recipiente, que contém o leito filtrante, um conjunto de resistores elétricos, com a finalidade de aquecer o ar. Esses resistores podem também ser empregados para a esterilização do filtro por calor seco, empregando-se, para esta finalidade, temperaturas da ordem de 180 a 200°C durante 2 horas. Corno seria de se esperar, antes de iniciar o fornecimento de ar para o reator, o filtro deve ser submetido a urna esterilização, a fim de evitar que microrganismos aderidos às fibras possam ser arrastados para o tanque. Apesar de existir a possibilidade de executar essa esterilização por calor seco, conforme mencionado acima, o que evita o umedecimento das fibras, na maioria das instalações esta operação é executada através de vapor saturado, empregando-se vapor a urna pressão efetiva de 1 kg* I crn 2 durante 2 h, ou vapor a 3 kg* I crn 2 durante 1 h. Nesse caso~ fecha-se a comunicação entre o filtro e o reator e o registro de entrada do ar, introduzindo-se o vapor pela parte superior do recipiente (vide Fig. 5.8), deixando-se o registro de saída de condensados inicialmente aberto. Após a completa expulsão do ar, operação esta de fundamental importância para o sucesso da esterilização, fecha-se esse último registro, permitindo que as condições mencionadas sejam atingidas. Terminada a esterilização, passa'-se ar aquecido através da camada filtrante, a fim de secar completamente b leito fibroso, obtendo-se desta forma o filtro erri condições de operação. A esterilização pelo vapor pode causar urna certa contração do leito filtrante; especialmente no caso de filtros cjue tenham sido pouco cornpactados. Para esse caso, antes de iniciar o fornecimento de ar estéril para o processo, convém proceder-se à abertura do recipiente e observação da camada, cornpletando.;se com quantidade adicional de lã de vidro, caso seja necessário. Obviamente o filtro · deve ser submetido a urna nova esterilização. Métodos para a esterilização de ar 83 Além desse problema, existem outros associados ao uso de vapor. Normalmente o filtro deve ser esterilizado ao final de cada processo fermentativo, de forma a se iniciar o processo seguinte em perfeitas condições de segurança. Com isso os filtros são esterilizados com muita freqüência (da ordem de uma vez por semana), ocorrendo uma deterioração da lã de vidro, a qual vai se tornando opaca e quebradiça, havendo um nítido aumento da perda de carga e diminuição da eficiência de coleta da camaida filtrante (formação de canais preferenciais). Esses fatos também ocorrem com as fibras impregnadas com resinas. A ocorrência de fibras quebradiças causa também o arraste de pequenos pedaços de fibras, juntamente com a corrente de ar. A perda de eficiência, o aumento da perda de carga e esse arraste, obrigam a se providenciar a troca completa da camada filtrante após algum tempo de operação. Esse tempo depende das condições de utilização do filtro, mas pode-se citar, como intervalo razoável, a troca do leito filtrante a cada 4 meses, quando se executa uma esterilização do filtro por semana. Essa operação de troca do material filtrante é sempre complicada na indústria, pois, como se deve contar com um filtro para cada reator e freqüentemente dispõe-se de vários reatores, se estará manuseando lã de vidro com muita freqüência, o que não é apreciado pelos operários incumbidos desta tarefa, aumentando as possibilidades de uma operação não adequada, o que coloca em risco a condução asséptica do processo. Todos esses problemas permitiram o surgimento de filtros mais adequados, no caso os filtros de membranas poliméricas~ porosas, que serão abordados no item seguinte. Tais filtros encontram hoje grande aplicação, conforme já salientado anteriormente . .Por essa razão não se pretende, no presente texto, apresentar mais detalhes sobre os vários mecanismos de coleta de aerossóis por materiais fibrosos, assim como não serão detalhad'os os procedimentos para o dimensionamento dos filtros de lã de vidro. Tais detalhes podem ser encontrados, caso o leitor tenha necessidade, no texto anterior a respeito desse tema. 19 5.4.3.2 - Filtros de membranas Os filtros de membranas microporosas, elaboradas a partir de materiais poliméricos, em geral apresentando carac.t erísticas hidrofóbicas, prç>porcionam aretenção dos aerossóis microbianos na superfície do elemento filtrante, havendo portanto a retenção apenas por impacto qireto das partículas contra o filtro, o qual apresenta poros de dimensões menores do que os microrganismos a serem retidos. Normalmente·utilizam-se membranas com poros de 0,2 ou 0,22 ~m, ou ainda membranas de 0,45 ~m. Essa é a razão pela qual esses filtros são também chamados de filtros absolutos. Na realidade, no início do surgimento de alternativas aos filtros de materiais fibrosos, uma série de outros materiais foram empregados, como é o caso de metais sinterizados (como o bronze e o aço inoxidável), materiais cerâmicos e vidro sinterizado. No entanto, com o decorrer do tempo; praticamente os materiais poliméricos dominaram esse tipo de aplicação, encontrando-se especialmente filtros esterilizantes elaborados a partir do politetrafluoretileno (PTFE _,__ "teflon"). 21 ---·-- ·· · - .. --------·---·-- -·,----·· ··--·- ·· -.-··--·.····-·- ·····-···--.. .. . I 84 Esterilização de ar O emprego de materiais poliméricos hidrofóbicos é aspecto de importância, pois estes filtros também devem ser esterilizados por vapor, antes do início da operação de esterilização d_o ar, havendo ainda a possibilldade da presença de umidade no ar a ser esterilizado.-Assim; essa água não deve permanecer no filtro, pois isto poderia causar o crescimento de microrganismos na superfície do elemento filtrante, colocando em risco a obtenção de ar esterilizado, além de provocar um certo bloqueio à passagem do ar pelos poros, o que significaria um aumento inconveniente da perda de carga.6 Normalmente, esses filtros são fornecidos na forma de discos, ou, mais freqüentemente, para o caso de filtros para a esterilização do ar para instalações de grande porte, na forma de cartuchos contendo a membrana filtrante montada so~ bre uma estrutura de polipropileno. A Figura 5.9 ilustra a proposta desses filtros na forma de discos ou, cartuchos. ' Figura 5.9 - Filtros de membranas poliméricas mieroporosas(gentileza de CUNO INC. - Com. lntertech do Brasil Ltda.) ·~ . ~ ---- ---~- ______ _______ _ . :.. .,. ~-.- · - - --- ---- ·--··-·---- Métodos para a esterilização de ar 85 Conforme se pode observar, os elementos filtrantes são acomodados no interior de recipientes em aço inoxidável, sendo que estes recipientes são construídos a fim de abrigar um número variável de elementos esterilizantes e, ainda, de dimensões distintas. Como se nota na Figura 5.9, o recipiente maior é destinado a abrigar vários cartuchos, cada um deles montados unindo-se três cartuchos de 25,4 em (10") de comprimento. O ar entra e sai pela parte inferior do recipiente, sendo que a entrada é feita pela parte externa dos cartuchos, sendo o ar forçado a atravessar o elemento filtrante, saindo pela parte interna dos cartuchos. Tratando-se de filtros absolutos, em princípio, a retenção dos microrganismos independe da velocidade de passagem do ar, ao contrário dos filtros de camadas fibrosas, mas o aumento da velocidade superficial do ar acarreta um aumento da perda de carga no elemento filtrante. Além disso, velocidades excessivas podem provocar vibrações inconvenientes, comprométendo os sistemas de vedação. O dimensionamento de um sistema: de filtração é tarefa bastante simplificada, pois sabendo-se a vazão máxima de ar a ser empregada no processo (lembrando sempre a necessidade de se prever .um filtro para cada reator), pode-se especificar um ntJ.mero adequado de elementos filtrantes (cartuchos), que deverão ser acomodados no filtro, definindo desta forma uma área adequada de passagem deste ar, a fim de se ter baixa velocidade superficial e, portanto, baixa perda de carga no filtro (lembrando, também, que a pressão do ar, na descarga do compressor, deve ser suficiente para vencer a coluna:. líquida no interior do reator, a sobrepressão na cabeça do reator e, ainda, as perdas de carga distribuídas nas válvulas e tubulações). Dessa forma, essa perda de pressão no filtro deve ser a mínima possível, através da manutenção de v~locidades relativamente baixas (Q = V5 .S, onde: Q=vazão de ar, V5 =velocidade superficial do ar e S=área do(s) elemento(s) filtrante(s) para a passagem do ar). As várias empresas capacitadas para fornecerem esse tipo de filtro já dispõem de propostas adequadas para as necessida~es de uma determinada planta, indicando-se nas Figuras 5.10 e 5.il alguns dados a respeito desta perda de pressão, em função da vazão de ar, para elementos filtrantes de 25 em (10") ou 100 em · (40") de comprimento, respectivamente. 22 Conforme fica evidente nessas figuras, as perdas de carga são realmente reduzidas, e o aumento do comprimento do elemento filtrante, o que significa aumentar a área de passagem do ar, permite o emprego de vazões mais elevadas com menores perdas de carga. Observa-se, também, em ambas as figuras, que um aumento da pressão de entrada do ar para uma mesma vazão, acarreta uma menor perda de pressão, o que é devido a um aumento da densidade do gás com o aumento da pressão. A Figura 5.12 permite uma idéia simplificada a respeito da forma de instalar um filtro de membrana em uma linha de fornecimento de ar esterilizado para .um biorreator. Normalmente, com a finalidade de aumentar a vida útil do filtro, sugere-se a instalação de pré-filtros, construídos com materiais mais grosseiros e de baixo custo, a fim de retirar do ar partículas de poeira de maiores dimensões . ...________ -- ---~-·-···-------~--,--.----~-~----·- -·--- - - ---· - - ···- ·· 86 Esterilização de ar Perda de carga (mbar) 600 r-------~~~------~----------------. 500 400 300 200 100 50 100 150 200 250 Vazao de ar (Nm 300 %> 350 400 Figura 5.1 O - Perda de carga em função da vazão de ar (expressa em metros cúbicos de ar, nas condições normais, 2 por hora), para filtro tipo cartucho de I O", da Millipore Co. 400 Perda de carga (mbar) 300 200 100 o o tO O 200 300 400 Vaza o de ar (Nm 500 600 %> 700 800 Figura 5.11 - Perda de carga em função da vazão de ar, para fiH:ro tipo cartucho de 40" de comprimento, da Millipore~.n o Como se pode observar, deve-se prever a entrada de vapor a fim de esterilizar o filtro, devendo este vapor ser devidamente filtrado, para evitar o acúmulo de sólidos na superfíCie do elemento filtrante. Nos instantes iniciais, a válvula de dreno do recipiente que contém o filtro (detalhe 1 na Fig. 5.12), deve ser mantida aberta para a expulsão do ar, para que se possa atingir a temperatura adequada de esterilizaÇão. Também, após a esterilização, passa-se ar peio sistema, permitindo que este ar saia pelo dreno de linha (detalhe 2 na Fig. 5.12), a fim de drenar a água que tenha ficado retida. Finalmente, pode-se fechar esse dreno e abrir a válvula que comunica o filtro com o reator. o Métodos para a esterilização de ar 87 Válvula Reator FiHro absoluto Figura 5.12 - Esquema geral para a instalação de um filtro de membrana polimérica (absoluto). Não se procede à esterilização de pré-filtros. Os filtros existentes no mercado são bastante resistentes à esterilização, havendo menções da possibilidade de efetuar ·algo como 150 esterilizações a 145°C por 30 min. Novamente, supondo-se a execução de uma esterilização por semana, isto significaria algo como 3 anos de operação. No entanto, encontram-se sugestões na literatura6' 15'23 segundo as quais se deve providenciar a troca dos elementos filtrantes uma vez por ano, o que significaria algo como 50 esterilizações. Claramente há a possibilidade de operações mais prolongadas, mas deve ocorrer um aumento da perda de pressão nos elementos filtrantes, aumento este que depende da qualidade do ar que chega à membrana esterilizante. A troca dos elementos esterilizantes é muito simples, . requerendo pouco tempo para a sua realização. No entanto, tal operação deve ser efetuada com todo cuidado, a fim de não se ,danificar a membrana filtrante, além de posicionar adequadamente os anéis de vedação do sistema. Após a operação de troca de cartuchos, deve-se efetuar testes de manutenção de pressão interna, a fim de verificar a existência de vazamentos, assim como é recomendável a realização de testes de efetiva obtenção de ar esterilizado, através do uso de amostradores. As diversas empresas fornecedoras desse tipo de filtros, normalmente garantem a integridade dos seus produtos, pois efetuam testes antes da entrega do material, de forma que falhas eventuais, mais freqüentemente, são atribuídas a um manuseio não adequado dos elementos filtrantes. 5.4.3.3 - Filtros HEPA Os filtros HEP A ("High Efficiency Particulate Air") são os filtros especialmente empregados em câmaras assépticas, ou áreas limpas. São placas de acetato de celulose, apresentando 24 uma eficiência de 99,97% na remoção de partículas de diâmetro médio 0,3 ,.tm, ou ainda elaborados a partir de fibra de vidro, apresentando21 eficiência superior a 99,97% na remoção de partículas superiores a 0,5 ,.tm. Normalmente esses filtros são montados com vários elementos filtrantes separados por folhas de alumínio, de forma a se obter uma grande área para a passa- 88 Esterilização de ar gem do ar e, desta forma, possibilitar o uso de ventiladores, evitando a necessidade de compressores, em virtude da baixa perda de pressão através do leito filtrante . Conforme salientado, esses filtros são empregados especialmente em câmaras assépticas, registrando-se que presentemente predominam as chamadas câmaras de fluxo laminar, ou seja, câmaras nas quais a velocidade de circulação do ar é baixa, de forma a se contar com um fluxo em regime laminar. Dessa forma, imagina-se que os contaminantes gerados no interior da câmara possam ser retirados deste ambiente pelo próprio fluxo de ar, impedindo que um fluxo turbulento possa causar um acúmulo de contaminantes. Um exemplo de uma câmara desse tipo está indicado na Figura 5.13, a qual ilustra um sistema com circulação vertical de ar. O ar penetra pelo teto da câmara, saindo pelo piso da mesma, circulando a uma velocidade da ordem de 50 cm/s. 24 filtro HEPA ventilador grade pré-filtro ventilador 24 Figura 5. 13 - Câmara asséptica com fluxo laminar vertical de ar. • Existem muitas outras idéias a respeito do assunto, conforme o tipo de trabalho a ser executado. Assim, existem câmaras de fluxo horizontal, nas quais o ar entra por uma das paredes e sai pelo lado oposto. Em uma câmara de fluxo laminar, não se deve contar com a presença de um número exagerado de equipamentos, ou mesmo de pessoas circulando, pois é fácil compreender que qualquer obstáculo provoca turbilhões no ar, não se obtendo um fluxo em uma determinada direção. Por esse motivo, nas câmaras onde se executá a embalagem de produtos com assepsia, não se podeimaginàr um fluxo laminar em toda a câmara, em virtude de suas dimensões. Em alguns casos, tanto quanto possível, introduz-se no interior de uma câmara convencional, no local onde se executa uma determinada operação mais delicada, um gabinete ou capela de fluxo laminar, o que torna a operação mais segura. Tais capelas de fluxo laminar de ar, São presentemente muito comuns em laboratórios que manuseiam culturas puras de microrganismos, ou mesmo para a ··-·- - · - - - - - - ·- - · - - · - - - ; -- -- - .-- - - - ·- - .-'-----------·-··--- ···--___,. Métodos para a esterilização de ar 89 execução de transferências de meios de cultura previamente submetidos à esterilização. Na Figura 5.14 indica-se um esquema geral de uma capela desse tipo. 24 Em instantes anteriores à utilização da capela, recomenda-se efetuar uma desinfecção das superfícies, empregando-se etanol ou outras soluções desinfetantes, permitindo-se ainda que a capela permaneça fechada durante algum tempo e, adicionalmente, ligando-se uma lâmpada ultravioleta para a desinfecção do seu interior. Ao iniciar a oper~ção asséptica, desliga-se a lâmpada ultravioleta, aciona-se a circulação do ar, tomando-se sempre a precaução de evitar um excesso de movimentação no interior da capela. O conceito de fluxo laminar encontrou várias aplicações, havendo diferentes sistemas operando em distintas condições, como é o caso de operar com velocidades de circulação do ar muito baixas, da ordem de 0,1 m/s e até 0,075 m/s. 25 ventilador vidraça corrediça ventilador Figura 5.14 - Capela de fluxo laminar. 24 Pode-se, inclusive, contar com câmaras de fluxo laminar portáteis, ou seja, que podem ser facilmente deslocadas pp.ra locais da indústria onde seja necessária uma dada operação asséptica. Essas câmaras são fechadas por uma cortina de material plástico, havendo no teto um sistema de distribuição do ar. Esse ar é fornecido por uma unidade colocada ao lado da cabine, unidade esta que contém o filtro HEPA. Dessa forma o ar circula verticalmente, saindo pela parte de baixo das cortinas. Quando adequadamente operados, esses sistemas portáteis permitem a obtenção de ambientes protegidos, em princípio em qualquer lugar da indústria. · ...._____ .. - ·-· ··-·· .. ··-·---·------------ - · -----------··· ·------·-- ---- ······- ... ... . 90 Esterilização de ar 5.5 - Considerações finais Conforme descrito anteriormente, a esterilização do ar para processos ferrnentativos que exigem urna rigorosa condução em condições de assepsia, sem dúvida encontrou solução mais adequada com o surgimento dos filtros de membranas polirnéricas hidrofóbicas, que substituíram os filtros de lã de vidro anteriormente empregados. No entanto, . deve-se lembrar que esses filtros devem ser adequadamente projetados, evitando-se o emprego de velocidades excessivas de ar através da membrana esterilizante, a fim de se contar com baixas perdas de pressão. Igualmente, deve haver todo o cuidado com a instalação, buscando urna efetiva vedação do sistema, para que não ocorra contato entre o ar esterilizado e o ar atmosférico (perfeita vedação do recipiente que contém os cartuchos, perfeita instalação dos cartuchos no recipiente, empregar cartuchos íntegros, utilizar registros apropriados no trajeto do ar esterilizado, etc.). É sempre útil o emprego de pré-filtros, os quais deverão ser substituídos com urna maior freqüência, a fim de ampliar o tempo de operação da membrana esterilizante. Deve-se, inclusive, lembrar que tanto os pré-filtros corno os filtros deverão ser substituídos, havendo a necessidade de um fácil acesso ao sistema, a fim de que esta operação possa ser rápida e efetuada com segurança. No caso dos processos ferrnentativos contínuos, nos quais espera-se operação ininterrupta por várias semanas, é interessante a instalação de dois filtros em paralelo para cada reator. Dessa forma, pode-se providenciar a esterilização de um filtro após certo tempo de operação (urna ou duas semanas, por exemplo), sem interromper o processo. Finalmente, cumpre destacar a expectativa do surgimento de novos materiais que permitam: a operação de separação dos contarninantes do ar atrno~férieo, mas também proporcionem um enriquecimento desse gás, permitindo a passagem preferencial do oxigênio, o que já é possível conforme salientado no textt>; seria porém desejável que pudessem ser aplicáveis em instalações de grande porte. Referências bibliográficas (1) AIBA, S.; HUMPHREY, A.E.; MILLIS, N.F. Biochemical engineering. 2.ed. Tóquio, University of Tokyo Press, 1973. (2) GADEN, E.L; HUMPHREY, A.E. Fibrous filters for air sterilization. Ind. Eng. Chem., vol. 48, n .12, p .2172, 1956. (3) PARIS, R.G.; SCHMIDELL, W.; BORZANI, W. Destruction of airborne microorganisms by the heat generated during air compression. Biotechn. Tech., vol.l, n.2,_p.141-2, 1987. 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Tais valores experimentais de concentração (X, P e S respectivamente), quando representados em função do tempo, permitirão os traçados das curvas de ajuste, conforme ilustrad'o na Figura 6.1 e indicados por X=X(t), P=P(t) e S=S(t). Xo So ~~~~------~--~ ~, .. o Figura 6.1 - Curvas de ajuste dos resultados de uma experiência idealizada de fermentação. X, P e S são as concentrações do microrganismo, do produto e do substrato residual no meio, respectivamente. ~------------ - --- ----- ~ ---·- -- ···· ----- --- ·- ··- -·--· 94 Cinética de processos fermentativos Dentre os produtos formados, escolhe-se para o estudo cinético, o produto de interesse econômico. Quanto aos substratos, adota-se o denominado substrato limitante (comentado no subitem 6.2.3). Quando as conclusões sobre um cultivo forem baseadas unicamente em dois valores de X, S 0\1 P (como é comum, por exemplo, sobre valores finais e iniciais), não se pode afirmar que um estudo cinético do processo tenha sido realizado; é necessário, outrossim, o conhecimento dos valores intermediários, que permitam definir os perfis dÇts curvas ou a forma matemática destas, para uma análise adequada do fenômeno sob o ponto de vista cinético. Assim, tais perfis representam o ponto de partida para a descrição quantitativa de uma fermentação como, por exemplo, a identificÇtção da duração do processo, geralmente baseada no instante em que X e P apresentam valores máximos (Xm e Prrv na Fig. 6.1). Uma vez que esses valores representam parte de um conjunto de dados, necessários ao dimensionamento de uma instalação produtiva, fica evidente que sem o conhecimento da cinética torna-se inviável a transposição de um experimento de laboratório para a escala industrial. Além desse aspecto, cabe mencionar que a cinética possibilita também uma comparação quantitativa entre as diferentes condições de cultivo (pH, temperatura, etc.), por intermédio de variáveis, como: as velocidades de transformação (subitem 6.2.1) e os fatores de conversão (subitem 6.2.3), obtidos também a partir das curvas de ajuste X = X (t), P = P (t) e S =S (t). Afirmar que um determinado valor de pH, por exemplo, é melhor que um outro, equivale a dizer que o fator de conversão (substrato em produto, por ~xem plo) é maior no primeiro que no segundo caso. O mesmo pode ser afirmado quan~ do se comparam os desempenhos de cultivos sob diferentes temperaturas, diferentes variedades de uma dada espécie de microrganismo, diferentes composições de meio, etc. Convém frisar, entretanto, que os critérios de comparação entre diferentes condições são relativos, isto é, dependem do que se espera obter de um determinado processo fermentativo. Assim, quando o tempo de duração da fermentação for de primordial importância por razões econômicas, as produtividades (subitem 6.2.1) devem ser empregadas como referências numéricas, em vez de algum fator de conversão. Outro aspecto que merece atenção é que os métodos comumente utilizàdos para a medida da concentração celular X, a saber: turbidimetria ou espectro~oto metria, biomassa seca, número total de células, número de células viáveis ou unidades formadoras de colônias, volume do sedimento obtido por centrifugação, teor de um componente celular etc., representam uma informação muito simples do que ocorre em um fenômeno biológico. O microrganismo ou agente ativo promove a transformação dos componentes do meio em produtos, graças às atividades de milhares de enzimas que, por sua vez, são sintetizadas pelo próprio microrganismo. Sendo essas sínteses controladas pelo meio externo (fenômenos de indução e repressão), torna-se.assim muito difícil, senão impossível, identificar qual medida ou medidas são realmente representativas da transformação em estudo. Parâmetros de transformação 95 Essa dificuldade ocorre mesmo nos sistemas mais homogêneos, quando o meio de fermentação for límpido, com as células isoladas umas das outras e quando só uma dada espécie de microrganismo estiver suspensa no meio aquoso. A questão se complica ainda mais quando o sistema for constituído por uma cultura mista e, além disto, contiver sólidos em suspensão (alêm do microrganismo), como nos processos biológicos de tratamento de resíduos domésticos e industriais. Nesse caso, medidas de sólidos suspensos voláteis, durante tal processo, são adotadas como uma avaliação indireta da biomassa presente. Os substratos a serem decompostos são simplesmente avaliados pelas determinações conhecidas como demandas química e biológica de oxigênio (DQO e DBO, respectivamente). Outros sistemas de fermentação, onde as medidas de biomassa são problemáticas, compreendem: células suspensas em meio aquoso, porém sob forma de flocos ou células filamentosas; células imobilizadas na superfície de materiais inertes ou biodegradáveis contidas no biorreator; células na presença de meio, conhecido como semi-sólido, onde a matéria-prima é constituída por .m,aterial amiláceo, por exemplo. Neste último caso, a presença do microrganismo, traduzida pela concentração de algum componente do mesmo (como proteína total), não pode ser interpretada como se a célula estivesse suspensa no meio aquoso. Finalmente, se o material a ser transformado pelo microrganismo (substrato) for parcialmente insolúvel no meio aquoso, como hidrocarbonetos líquidos ou sólidos, polímeros, minérios, etc., a concentração do substrato não possui significado. Juntamente com essa variável será necessário avaliar a área de interface do material insolúvel com o meio aquoso, bem como a sua variação, à medida que o microrganismo promove a degradação do mesmo. Trata-se de um aspecto até agora não resolvido satisfatoriamente, a despeito de alguns método's propostos. 1 6.2 -:- Pa~âmetros de transformação 6.2.1 - As velocidades instantâneas de transformação A Figura 6.1 ilustra as definições das velocidades instantâneas de crescimento ou reprodução do microrganismo, consumo de substrato e formação de produto, traduzidas respectivamente pelas seguintes expressões, para um tempo t: ~ -- dX dt (6.1) rx=- (6.2) dP dt (6.3) fp = - - ·- -- ·----- ····-~ - - -----··· · ____ ---·- ----- -------- ___, .:__ __·_-- .... --...--,.....-.-.-------------- - - -- ----- ----~---- ---;---- ------- ------ -.:·-· ... - - --------------- --- ------------- .... - -. -- - -·-·· -- ···- 96 Cinética de processos fermentativos Tais velocidades, traduzidas pelos valores das inclinações das tangentes às respectivas curvas (Fig. 6.1) são também conhecidas como velocidades volumétri3 cas de transformação, cujas unidades correspondem a (massa) x (comprimentor x 1 (tempor • No item 6.3 é apresentado um exemplo de cálculo dessas velocidades. Uma definição especial de velocidade, cujo interesse prático está na avaliação do desempenho de um processo fermentativo, é a produtividade em biomassa, definida por: · - Xm -Xo Px- (6.4) tf Os termos dessa equação, definidos na Figura 6.1, mostram que a produtividade representa a velocidade média de crescimento referente ao tempo _total ou final de fermentação, tf. A mesma definição pode ser aplicada à concentração do produto, denominada produtividade do produto: · (6.5) onde tfp não é necessariamente igual a tf. A concentração inicial do produto é geralmente desprezível frente ao valor final ou máximo, Pm· 6.2.2 - As velocidades específicas de transformação Devido ao fato de que a concentração microbiana X aumenta durante um cultivo descontínuo, aumentando conseqüentemente a concentração do complexo enzimático responsável pela transformação do substrato S no produto P, é mais lógico analisar os valores das velocidades instantâneas (eqs. 6.6, 6.7 e 6.8) com relação à referida concentração microbiana, ou seja, especificando-as COwJll respeito aovalor de X em um dado instante, conforme indicam as expressões: (6.6) (6.7) ___,.)= -1 ·dP(Jlp --X dt (6.8) Essas são denominadas velocidades específicas de crescimento,_consumo de substrato e formação de produto respectivamente, tendo sido GADEN 2 o autor destas definições. ----~------------------------------~-~ Parâmetros de transformação 97 6.2.3 - Os fatores de conversão e os coeficientes específicos de manutenção Com referência à Figura 6.1, considerando um determinado tempo t de fermentação, os correspondentes valores de X, Se P podem ser relacionados entre si, através dos fatores de conversão definidos por: ~ ' ~ ~~ ~ -X -Xo ~,,~,."'::is -s ,J "'- o Yfti> = " '))!_ / X-X (6.9) ' o (6.10) Y~'rs = - o t'..t1;>_ 5 -S (6.11) P-Po P-P 0 Se tais fatores permanecerem constantes durante ó cultivo, o que não ocorre com freqüência, as três expressões ~nteriores podem ser aplicadas também no tempo final de fermentação, ondà ~-X~, ·~~ S d ó, resultando: (6.12) - Xm -Xo p -P y X/ P- Yr;s = m (6.13) o Pm -Po (6.14) so Eliminando-se a grandeza X 0 , pela combinaÇão das eqs. (6.9) e (6.12), obtém-se: ~ Yi·!X:/S• = x ms~x .··. (6.15) ·' como uma forma alternativa para a definição deste fator . A'·eq: (6.15) poderá ser conveniente para a avaliação de Y X I S' tendo em vista que as medidas de X 0 apresentam, na maioria dos casos, erros experimentais mais elev ados do queXm:; Entretanto, nem sempre o substrato se esgota completamente quando a concentração celular apresentar seu valor máximo, podendo ainda existir uma ~mais ...___--:- --.---·- --- ---·. ------.,......------- - -~.:...---...,..-~-~- ....~---~--..-------------- - ---------------------·-------- -----.--- ------ --- ' - -·· ---·---··- --------- --· ------ 1 98 ,. ; . Cinética de processos fennentativos concentração residual daquela súbstância no meio de cultura, ao término da fermentação. Isso ocorre porque à medida que o microrganismo se reproduz, são formados produtos do metabolismo que inibem o crescimento celular, sem mencionar o próprio substrato, que pode dificultar a atividade microbiana (item 6.6). O fator de conversão Y XIS foi originalmente definido por MON00,3 tendo sido útil na análise de alguns processos.como, por exemplo, na produção de proteínas unicelulares a partir de carboidratos ou hidrocarbonetos. Desde que seu valor seja conhecido, é possível calcular o valor de X, a partir de um valor conhecido de S e vice-versa. Igualmente útíl é o emprego do referido fator na definição do substrato, denominado limitante. Como o próprio nome indica, é o valor da sua concentração inicial S0 que definirá a concentração máxima Xm da população microbiana. Em outras palavras, em uma outra experiência de um cultivo descontínuo, onde a concentração S0 seja inferior à precedente, porém com concentrações idênticas dos demais componentes (incluindo a concentração inicial da biomassa, X0 ), resultará um valor de Xm proporcionalmente menor, no final do cultivo. ' Isso equivale a colocar a expressão (6.12) sob a forma: r---.. . -....,. ~ \. . ---~ \~)= Yx;s ·Só' + X 0 (6.16) No decurso de um cultivo descontínuo, sob condições especiais (meio tamponado, concentração de S não muito elevada, agitação perfeita do meio), é possível verificar experimentalmente a constância do valor de Y XIS com o auxílio da expressão (6.15) sob a forma: ----._, . . (' ( ., ~,·· . . ~-· ! '·E5\'xm•\ Y XI S :,~ ) (6.17) .._ ·-- , _. " ., .' I Uma representação dos valores experimentais de X, em função dos valores experimentais de S, deverá resultar em uma reta, com coeficiente angular igual à Y XIS e a ordenada na origem igual à Xm. As mesmas considerações se aplicam aos demais fatores (eqs. 6.10 e 6.11). Contudo, se Y XIS' Y XIP ou Y p IS não forem constantes, então somente seus valores instantâneos deverão ser levados em conta, ou seja: dX Yx;s =-·- · (6.18) dX Yx;P = dP (6.19) dP Yp; s = - - (6.20) -àS -àS -- --·-··· -··-.-· ·---------- 99 Parâmetros de transformação Considerando as definições de velocidades (eqs. 6.1, 6.2 e 6.3) e velocidades específicas (eqs. 6.6, 6.7 e 6.8), resultam as seguintes relações: . rx rs Jlx rx (6.22) rp Jlx Jlp rp Jlp (6.23) rs Jls (6.21) Yx;s =.- = Jls Yx; r = - = - Yr; s = - = -. Ainda, dessas expressões ou das igualdades (6.9),(6.10) e (6.11), tem-se: y XI S = y X/P . y P/ S (6.24) Em fermentações industriais, dificilmente são observados valores constantes desses fatores de conversão. Embora dependam da espécie do microrganismo, com relação a um determinado substrato, não dependem somente da natureza deste; os demais componentes do meio também exercem influência sobre tais conversões, bem como o tempo de mistura e a transferência de oxigênio do sistema de agitação do biorreator.3 Além dessas influências, há de se considerar o fenômeno em que as células utilizam a energia de oxidação do substrato, não somente para o crescimento, mas também para finalidades de maimtenção. Em outras palavras,' um determinado consumo de substrato (5 0 -S), não produzirá sempre um aumento proporcional na biomassa (X-X0 ), sendo que uma parcela da energia, proveniente daquele consumo, é destinada à manutenção das funções vitais do microrganismo. Essas funções vitais compreendem: o trabalho osmótico para manter os gradientes de concentração de substâncias entre o interior da célula e o seu meio ambiente, as modificações de componentes celulares que requeiram energia e a mobilidade celular. 4 Esse conceito, introduzido por PIRT, através do consumo específico para manutenção m: m = (rs)m (6.25) X onde (rs)m é a velocidade de consumo de substrato devida a manutenção, permite combiná-lo -c om o balanço material · (6.26) no que resulta L ._. ... . . . . . . . . .. . . -.---·----·-.---.-·-.·---~---~--------·--~- . .---- -·----·--·--..-·----- - --·--.__. . . . . . . . ._ I 00 Cinética de processos fermentativos rs =(rs)c +m ·X (6.27) onde (r5)c se refere ao consumo do substrato, destinado somente ao crescimento ou reprodução microbiana. r 5 é o consumo global observado, tàl como é definido pela expressão (6.2). Com a definição de um novo fator de conversão: rx , Y. X/S = - · (6.28) (rs)c e sua introdução na eq. (6.27), tem-se rs · rx = - ,-+m·X (6.29) Yx;s ou, de acordo com as eqs. (6.6) e (6.7): Jls Jlx =--+m YX:;s (6.30) Note que se m=O, Y'x;s coincide com a definição de Yx;s da eq. (6.21). Esse fator, definido pela eq. (6.28) é algumas vezes denominado fator de conversão "verdadeiro". Se Y'x;s em forem constantes, a relação entre Jls e Jlx deverá ser linear. Esta - nova definição do fator de conversão, aliada ao coeficiente específico de manutenção, é mais geral do que a eq. (6.21), possibilitando assim que ~m maior número de processos fermentativos apresentem valores constantes de Y'x;s em. Uma generalização mais ampla ainda, 5 pode ser introduzida no balanço da eq. (6.26), ao ser considerada mais uma parcela de consumo de substrilto, ou seja, na formação de produto, (rg)p: (6.31) onde (rs)cp e (rs)!nP são as velocidades de consumo de substrato para o crescimento e manutenção, respectivamente levando em conta a formação de produto. Introduzindo: , - rp Y P/S - - - .·· (6.32) (rs}p e um novo coeficiente específico de manutenção · mp = (rs)mP X bem como um novo fator de conversão para o crescimento (6.33) Cálculos das velocidades " rx Y XI S = - - - I OI (6.34) (rs)cp · resulta, com a (6.31): . rx rp ·' 's =--+--+mp ·X Yx;s (6.35) Yr;s ou, com as equações 6.6, 6.7 e 6.8: f.lx f.lr f.ls =--+--+mp Yx;s Yr;s (6.36) Uma regressão linear múltipla com três variáveis {f.ls, f.lx e f.! r) poderá ser verificada, se os fatores e o novo coeficiente mp forem constantes ou se este último for desprezível. · Pode-se, enfim, estender o balanço com a inclusão de termos adicionais, referentes a outros produtos do metabolismo (incluindo aqueles presentes nos gases de saída do biorreator), cujos valores experimentais sejam conhecidos, resultando com isto novos valores dos fatores de conversão e do coeficiente de manutenção. Do exposto, verifica-se assim que as conclusões a respeito de um determinado cultivo dependem muito da quantidade de dados experimentais disponíveis sobre o sistema. · 6.3 - Cálculos das velocidades Pelas definições apresentadas nos subitens 6.2.1 e 6.2.2, conclui-se que os cálculos das velócidades e velocidades específicas ' de transformação necessitam, em primeiro lugar, dos traçados das curvas a partir dos pontos experimentais (Fig. 6.1). Esses traçados ou ajustes podem ser realizados manualmente, com programas de computador ou através de curvas representadas por equações conhecidas. Iniciaremos pelas considerações referentes aos traçados manuais, ficando os comentários dos ajustes com equações para o final deste item. O traçado manual exige um bom conhecimento do processo em estudo. Como uma experi~ncia inicial, deve-se ter em mente que para um grande número de casos os perfis apresentados na Figura 6.1 são característicos, isto é, as curvas de formação do microrganismo (X= X(t)) e do produto (P = P(t)) exibem a forma "S" ou sigmoidal crescente, enquanto a do substrato residual no meio (S = S(t)) se caracteriza pelo perfil em "S" decrescente. ~··cu::•:~~:;;~::~:_n_:_mx_:=,-~_~.:~~_:_:~;~~:~~::.ocoinci:r, istoé,:m:s j I l ! 1 j I ·! _.J I 02 Cinética de processos fermentativos 100+"·· - - - 40 s 80 20 ::::J s· 0.. o x· 4 40 3 20 2 ·o 2 4 s 6 Tempo (h) 8 10 Figura 6.2 - Resultados obtidos em uma fermentação alcoólica. S, concentração de açúcar; P, concentração de etano!; X, concentração de levedura (expressa em gramas de matéria seca por litro), segundo BORZANI. 6 Para exemplificar o cálculo das velocidades (eqs. 6.1, 6.2 e 6.3) e velocidades específicas (expressões 6.6, 6.7 e 6.8), estão representados na Figura 6.2 os resultados experimentais obtidos em uma fermentação alcoólica descontínua. 6 ' Para t = 5 horas, por exemplo, a velocidade de consumo de açúcar é calculada pela inclinação da reta tangente AB à curvaS= S(t), a saber: _ dS = 100-70 = 30g I L = 7, 9 g I L. h dt 7,1-3,3 3,8h • onde os valores numéricos de cada parcela co.r respondem às coordenadas dos pontos arbitrários A e B, escolhidos sobre a reta. De modo semelhante, para as velocidades de produção de etanol e crescimento da levedura, no instante t = 5 h tem-se, respectivamente: dP = 20-0,0 =20giL = 4 ,0giL·h dt 8,3-3,3 5,0h dX dt 4,0-2,0 6,2-1,8 2 ,0giL =045 IL · h 4 4h g I I calculadas com as coordenadas dos pontos arbitrários sobre as retas C,D e E,F respectivamente. · A curva de cresdmento microbiano I03 Por outro lado, para t = 5,0 h tem-se X= 3,5 g/L (Figura 6.2). Assim, os valores das velocidades específicas de consumo de açúcar, produção de etanol e crescimento da levedura, no instante t = 5 h, serão, respectivamente: J.l. 5 = 7,9 =2 3h-1 i 3/5 I -4,0 -llh-1 Jlp - 3,5- I - 0,45- o13h-1 e J.l.x- 3,5 - ' Esses cálculos, aplicados em cada instante de fermentação, permitem determinar as formas das funções J.l.s = J.l.s (t), J.l.p = J.l.p (t) e J.l.x = J.l.x (t), cuja utilidade será comentada no item 6.5. Cumpre frisar que o cálculo das mesmas depende não somente dos ajustes manuais efetuados (Fig. 6.2), mas também do traçado das retas tangentes, em um dado instante t do cultivo, Essa última operação, tão subjetiva quanto os ajustes manuais, pode ser efetuada por outros métodos, que devem atenuar as discrepâncias entre os resultados de cálculo de um mesmo conjunto de dados experimentais, provenientes de operadores diferentes. O leitor interessado poderá consultar a bibliografia específica a respeito dos _ métodos gráficos para o traçado das tangentes/o método geométrico 8 e os ajustes baseados em equações, cujas derivadas possibilitam também os cálculos das velocidades de transformação e velocidades específicas.9' 10 Os critérios estatísticos . para a escolha dessas equações, 11 ' 12' 13 bem como os erros que afetam as medidas dessas velocidades, 14' 15' 16 são encontrados na literatura. No final deste capítulo, encontra-se no Apêndice um exemplo de cálculo através do método geométrico} com auxílio de uma planilha eletrônica. 6.4 - A curva de crescimento microbiano Após a inoculação de um meio de cultura, favorável ao desenvolvimento do em estudo, sob temperatura controlada e agitação adequada, observa-se um comportamento nos valores da concentração celular, conforme indica a Figura 6.3. As seguintes fases no crescimento são observadas: Fase 1 -Conhecida como fase "lag" ou de latência, que se segue imediatamente após a inoculação do meio com o microrganismo em questão. Trata-se de um período de adaptação durante o qual a célula sintetiza as enzimas necessárias ao metabolismo dos componentes presentes no meio. Purante essa primeira fase, não há reprodução celular e, assim, X = X0 = constante. A duração dessa fase varia principalmente com a concentração do inóculo (e . portanto com o valor de X0 ), com a idade do microrganismo (tempo de pré-cultivo) e com o seu estado fisiológico. · · mi~rorganismo ./ i-_-~ - - -- ---- ---- ----- - ---- --- -~ -----~~-- -----------'----~----------:- - - --------c~----------- ----- --- --- ---------··-··----:--:----:----- I 04 · Cinética de processos fennentativos X .................................................. m X ....................................... d • A Xc ............................ . X;················, i Xo o 1 i 2" i i 3 4 i 5 j 6 xm ················<···········r·······r·········-"'--- xc : : -~ ········r ······r········· l :~ 7 . B l +I o Figura 6.3 - Curva de crescimento do microrganismo em cultivo descontínuo, representada em ordenadas lineares (A) e semilogarítmica (8). As sete fases estão descritas no texto. Com efeito, se as células forem pré-cultivadas em um meio de. composição diferente, o tempo referente ao fenômeno de indução podê ser apreciável; caso . . contrário, é possível que tal fase não exista. Fase 2 -:- Essa é a fase de transição (Fig. 6.3) em que se observa o início da reprodução microbiana propriamente dita. Há um aumento gradual, tanto da velocidade de reprodução (eq. 6.1) como da velocidade específica de crescimento (eq. 6.6), onde nem todos os microrganismos completam a fase anterior simultaneamente. No fim dessa fase, a população inteira começa a se dividir em um intervalo regular médio de tempo (eq. 6.41). Fase 3 - É denominada fase logarítmica ou exponencial onde a velocidade específica de crescimento (J..tx =J..tm) é constante e máxima. Nessas circunstâncias, a eq. 6.6 permite concluir que a velocidade de crescimento é diretamente proporcional à concentração X, isto é: dX -=J..t · X dt m (6.37) A curva de crescimento microbiano I O5 Uma integração da equação 6.37, entre o início dessa fase (de coordenadas (ti, Xi), Fig. 6.3) e um instante arbitrário t, compreendido entre ti e te resulta em: ' X ln11 o(t- t 1.o) (6.38) X - = rm I ou (6.39) Desse modo, pela expressão 6.38, uma representação sem:ilogarítmica da concentração celular com o tempo de cultivo deverá resultar em uma reta (Fig. 6.3.:B), válida até te, também denominado tempo crítico. Ao lado da velocidade específica f.!m, a fase exponencial também é caracteriz~~a freqüentemente pelo tempo de ge:ação tg, que é o intervalo de tempo necessano para dobrar o valor da concentraçao celular. · Aplicando esta definição na eq. 6.38, tem-se: 2·X · l n - -1 X- :::::11 rm ·t g (6.40) I ou ln2 0,693 tg tg (6.41) f.!m=--=-- Da equação (6.41), conclui-se que o tempo de geração é constante, pelo fato de f.!m ser constante nesta fase. Para certas bactérias o tempo de geração é relativamente curto, como no caso da Escherichia coli, que pode apresentar um valor da ordem de 20 minutos na temperatura de cultivo em 37°C. Outras bactérias, do tipo termófilas, cultivadas a 55°C, chegam a apresentar um tempo de geração de cerca de 15 minutos. Para as leveduras, o valor mínimo está compreendido entre 1,5 e 2 horas. Uma interpretação para a existência da fase logarítmica ou exponencial de . crescimento, é apresentada no subitem 6.6.1. Fase 4 - Conhecida como fase linear de crescimento, por apresentar a veloci- · dade de reprodução constante(rx = rk, na eq. 6.1). Essa fase pode ocorrer sem a prévia existência da fase logarítmica, como é o caso de microrganismos filamentosos, onde h á limitaçdão no tfra~dsporh~ de nutrient~s ddo ~~i~pdara o inf terio(dr da céludla. d 1ntegran o a re en a equação a partu o rmcw essa ase e coor ena as (te, Xc), Fig. 6.3) e um instante arbitrário t, compreendido entre te e td, tein-se: lo..__~- - ·- ....... --- · -- .... - -------- --· .--------------- - -·---------'------~--·-- · ............ ............... ' .. ----... --- . .. - c· ........ --- - - -- -- --- - ·- - - - I l I (64~-- J I06 · Cinética de processos fennentativos ou (6.43) Da equação 6.43, deduz-se que a concentração celular X é uma função linear do tempo de cultivo t (Fig. 6.3-A), justificando-se assim a denominação de crescimento linear para esta fase. Contrariamente à fase exponencial antes comentada, a velocidade específica de crescimento não é constante na fase linear, conforme se pode deduzir das equações 6.6 e 6.43: 2_ dX=~= X dt X rk rk ·t+Xc o -rk (6.44) ·te De acordo com essa equação, a velocidade específica decresce com o aumento da concentração celular e, portanto, com o tempo t de cultivo. A existência do crescimento linear indica, conforme mencionado, a presença de certas limitações no transporte de nutrientes à interface microrganismo-meio como, por exemplo, com respeito ao oxigênio dissolvido no meio. REUSS e WAGNER10 verificaram que um aumento no coeficiente volumétri- · co de transferência do oxigênio dissolvido, entre o meio e a citada ·interface, provocava o desaparecimento do crescimento linear. Outro caso de limitação do transporte de nutrientes ao microrganismo ocOrre quando este se desenvolve na forma de um biofilme, imobiliz~do na superfície da parede do reator, ou sobre partículas sólidas em suspensão, empregadas como suporte. Modelos que interpretam o crescimento celular nesses _sistemas são encontrados na literatura.10 • Fase 5 - Desaceleração. Devido ao esgotamento de um ou mais componentes do meio de cultura, necessários ao crescimento e, também, devido ao acúmulo de metabólitos inibidores, ambas as velocidades (de crescimento, eq. 6.1 e específica, eq. 6.6) diminuem até se anularem, no tempo tf. Durante essa fase, o tempo de geração aumenta no decurso do cultivo, pois nem todos os microrganismos se reproduzem em intervalos regulares de tempo. Fase 6- Estacionária. Nessa fase, X atinge o valor máximo e constante Xm (Fig. 6.3), onde há um balanço entre a velocidade de crescimento e a velocidade de morte do microrganismo, ocorrendo também modificações na estrutura bioquímica da célula. Fase 7- Declínio ou lise. O valor da concentração celular dimiimi a uma velocidade que excede a velocidade de produção de células novas. Pode-se observar, às vezes, entre a fase anterior e a de declínio, um período de transição apresentando uma diminuição logarítmica na referida concentração. Ocorre, durante o declínio, uma "lise" celular, autólise ou rompimento dos microrganismos, provocado pela ação de enzimas intracelulares. Classificação dos processos fermentativos I 07 6.5 - Classificação dos processos fermentativos Os comportamentos relativos das funções f.1 = f.l(t), fornecem a base para uma importante classificação dos processos fermentativos proposta por GADEN 2 (subitem 6.2.2). As Figuras 6.4, 6.5 e 6.6 representam, esquematicamente, a variação das velocidades específicas para t;rês tipos característicos de fermentações . No primeiro caso (Fig. 6.4), as velocidades específicas de consumo de açúcar (f.ls) ~a produção de etanol (f.lp), apresentam perfis semelhantes, correlacionando-se assim muito bem. A veloc;idade específica de crescimento (f.lx) do microrganismo apresenta, aproximadamente, o andamento das outras duas curvas. Diz-se então que a formação de produto (o metabólito primário) está associada ao crescimento. Essa configuração representa o caso em que o produto formado (o metabólito primário) está diretamente ligado às reações do catabolismo ou decomposição do substrato (os açúcares) . Consumo de açúcar ~ Crescimento Tempo Figura 6.4 - Variação das velocidades específicas em uma fermentação alcoólica. As produções de certas vitaminas e aminoácidos também se enquadram nesse tipo de cinética de fermentação. No segundo caso (Fig. 6.5), observam-se duas fases distintas: uma 1ª- fase, onde a velocidade específica de consumo do açúcar está diretamente relacionada à de crescimento do microrganismo, não havendo praticamente formação do produt~ (ácido cítrico); uma segunda fase, em que há uma boa semelhança entre os perfís das três velocidades específicas e que portanto se correlacionam bem. Esse é o caso conhecido como formação do produto parcialmente associada ao cresCimento; sua formação não está diretamente ligada ao caminho metabólico produtor de energ"ia. ·· · 1 . I 08 Gnética de processos fermentativos Produção de ácido ~ / &;:::: u Q) c. C/) Q) Q) -o ro -o ·c:; o ~ Tempo Figura 6.5 - Variação das velocidades específicas em uma fermentação cítrica. B <+= 'õ Q) o. Ul Q) Q) • 'C . lll 'C "õ o ~ Tempo Figura 6.6 - Variação das velocidades específicas em uma fermentação penicilínica. Curva I -produção de antibiótico; curva 2 - consumo de açúcar; curva 3 - consumo de oxigênio; curva 4 - crescimento do microrganismo. Além da produção do ácido Cítrico por fermentação, pode-se incluir a do ácido lático comopertencente a este grupo. Neste particular foi obtida uma expressão empírica por LUEDEKING; PIRET/7 que relaCionaram a velocidade específica de formação do ácido lático (J.lp), Classificação dos processos fermentativos I 09 com a velocidade específica de crescimento do microrganismo (~x), na produção descontínua desta substância pelo Lactobacíllus delbrueckii em pH consta_t1te, a saber: · .· ·· · Jlp=a·~x+~ (6.45) Essa equação, onde 0; e ~ são constantes empíricas funções do pH, indica a existência de dois mecanismos de produção de ácido lático: um deles associado à reprodução de bactérias (representado pela parcela a · ~ x) e outro independente do crescimento do microrganismo (representado pelo termo~). Finalmente, no terceiro caso, se enquadram as fermentações complexas, aqui exemplificadas pela produção de penicilina (Fig. 6.6). A máxima velocidade específica de produção do antibiótico ocorre quando as demais velocidades específicas, indicadas na Figura 6.6, sofreram uma redução significativa. No começo da fermentação predominam transformações produtoras de energia com formação de biomassa, sendo que o antibiótico é formado quando o metabolismo oxidativo se encontra atenuado. Obviamente, nesse grupo de fermentações não há uma associação clara entre as referidas velocidades que permita estabelecer alguma relação cinética definida, como no caso da eq. (6.45). O produto formado é historicamente denominado como metabólito secundário. Além dos antibióticos, as toxinas microbianas pertencem a esse grupo. É importante frisar que esta classificação não enquadra, de um modo absoluto, um determinado processo fermehtativo em um dos três grupos antes citados. Como exemplo, merece ser comentado novamente o caso da fer~entação alcoólica onde, dependendo das condições de operação, a produção do etanol poderá não estar inteiramente associada à reprodução do microrganismo e ao consumo de açúcar, enquadrando-se' assim no segundo caso 18 (Fig. 6.5) em vez de no primeiro (Fig. 6.4). Caso semelhante é observado na produção do butanodiol por Klebsiella pneumoniae, em cultivo contínuo 19 a partir da glicose onde, dependendo do valor da velocidade específica de crescimento (abaixo ou acima de 0,18 h-l),o processo é do tipo inteiramente associado ao crescimento ou independente do mesmo, respectivamente. Outra classificação, baseada nas associações entre formação do r,roduto ·com mic~~mismos em reprodução ou não, é devida a KONO; ASAI/0' 2 ' 22 que apresentam três grupos característicos: • processos em que a formação de produto está associada apenas à atividade de células em reprodução como, por exemplo, na produção de sorbose. • processos em que a formação de produto está associada à atividade de todas as células, em reprodução ou não, citando-se como exemplo a produção de ácido lático. • processos em que a formação de produto está associada apenas à atividade das células que não se reproduzem, como no caso da produção de ácido cítrico e novobiocina. ii ......_____ _ .. ··-------···----------- ------------·-·-·-,--·--'---------·-··- ---·:-· --··--· -----.-·- -·-- - - - - - - - - ·- ·---------·- :- -· . ·; ; __ :li I IO Cinética de processos fermentativos . . 6.6 - 6.6. I - Influência da concentração do substrato sobre a velocidade específica de crescimento A equação de Monod: interpretação da fase exponencial de crescimento A seguinte equação empírica, proposhipor MONOD/3 tem sido comumente empregada para explicar a relação entre a concentração 5 do substrato limitante no meio, com a velocidade específica ~xde reprodução do microrganismo: . (6.46) onde ~m representa a máxima velocidade específica de crescimento ou reprodução, e K5 a constante de saturação, cujo significado será comentado a seguir. Na Figura 6.7 está representada a eq. de Monod. O significado de Ks pode ser deduzido fazendo-se 5 = Ks na eq. (6.46). Resulta imediatamente que: ·~X = ~m/2, isto é~ a referida constante representa a concentração do substrato na qual a velocidade específica de crescimento é a metade do seu valor máximo. ~m ---------- ----- ----- - ----------------- ~ --- - 0,10 o~.--.-.-.~.-r-.-.--.-.---- 0 ·Figura 6.7 - 0,50 S(mg/L) 1,00 . Equação 6.46 para Jlm = O, 14 h-1 e Ks = 0,60 mg/L (valores hipotéticos). Esta condição está assinalada na Figura 6.7 onde, para Ks = 0,60 mg/L, tem-se ~X= ~m/2 = 0,07 h~l. A expressão de Monod é formalmente igual à expressão de Michaelis-Menten (capítulo 7, volume I). No início do cultivo, onde 5 é alto, o microrganismo apresenta uma velocidade específica próxima à máxima, podendo a mesma situar-se nesta região durante uma boa parte do processo, mesmo que o metabolismo celular provoque · uma diminuição apreciável no valor de S. ·-·-···- ·--·· ·· - ----~-____. Influência da concentração do substrato sobre a velocidade específica de crescimento III _ Quanto menor for o valor da constante de saturação K5, tanto mais amplo será este ·" patamar" quase horizontal da curva e que se encontrará mais próximo do valor de f.lm, conforme ilustra a Figura 6.8 (curva A). Embora, a rigor, pela equação 6.46, nunca seja atingido o valor de f.lm, por mais alta que seja a concentração inicial S, na prática, os valores experimentais podem ser considerados como tal, tendo em vista os erros que afetam os valores cal. culados da velocidade espe.cífica de crescimento. 15' 16 . . Nessas circunstâncias, a curva · apresentada pela velocidade específica de crescimento em função do tempo (Figura 6.9), poderá apresentar um trecho máximo constante (AB), após um curto período inicial de transição ou adaptação do microrganismo ao meio. Essa fase inicial do crescimento (O a 4 horas, Fig. 6.9), corresponde à fase 1 ("lag") e à fase 2 (de transição) da Figura 6.3, não previstas pela expressão de Monod. A citada expressão (6.46) considera f.lx elevado e próximo do valor máximo, logo que o microrganismo é colocado na presença de um meio, com uma concentraçap inicial de substrato relativamente elevada. O microrganismo é, nessas circunstâncias, considerado adaptado. Uma baixa constante de saturação Ks implica em uma maior duração da fase exponencial, conforme ilustra a Figura 6.8: para Ks = 0,60 mg/L, os valores de f.lx logo se distanciam de f.lm, à medida que o substrato vai sendo consumido; para K5 = 0,030 mg/L, f.lx é praticamente igual à f.lm para uma mesma variação de S (entre 1,20 e 0,50 mg/1). Assim, a duração do "patamar" AB (Fig.-6.9), dependerá da magnitude desta constante de saturação, ----------------------------------------------------A 0,10 ~mn- --- --------------- --·-· : ' ' KsA o "" o j Kss 1,00 0,50 S(mg/L) . Figura 6.8 - Equação 6.46 para os valores hipotéticos de: Jlm =O, 14 h- 1, K5 = 0,60 mg/l. (curva 8), Ks mg/l.(curva A). · ~ --- -- -.. ------ ---- -- -----~---- - --: ____ ____ _: __~~---------~-- - ---- ~ ~--~,-------.----------------- =0,030 -- ---· ....... . ----------------·--:·-- .. :... ~ _j I 12 Cinética de processos fermentativos. flx A tg (h) B (h-1) 50 0,10 o~----~~~--~~o o 4 8 12 t (h) Figura 6.9 - Variação da velocidade específica de crescimento (1-lx) e do tempo de geração (tg), no cultivo descontínuo. 6.6.2 - Outros modelos A expressão de Monod (eq. 6.46) é um modelo que não leva em conta o efeito inibidor, tanto pelo substrato como pelo produto formado. Essa, porém, não é a única interpretação referente a uma tal condição ideal de cultivo. Outras equações foram propostas 10 e que merecem ser citadas: • equação de Teissier (6.47) • Moser (6.48) s • Contois e Fujimoto • Powell fl x • s = ~ m . -(K_s_+_K_o_)_+_S (6.48) (6.50) Há pelo menos mais seis outras expressões, propostas por outros autores, também citadas na mesma referência 10 e que não levam em conta ofenômeno da inibição. A ausência da inibição é, na verdade, uma situação pouco comum na prática, principalmente durante um cultivo descontínuo, onde há um crescente acúmulo de metabólitos que acabam interferindo desfavoravelmente sobre o metabolismo e crescimento microbianos. O problema poderia ser atenuado se fosse, por exemplo, utilizado um valor inicial relativamente baixo da concentração de substrato e que assim resultasse em baixas concentrações de produtos inibidores. Influência da concentração do substrato sobre a velocidade específica de crescimento I 13 Essa é, entretanto, uma alternativa pouco interessante do ponto de vista industrial, onde baixas concentrações de produtos acarretariam custos elevados, na fase posterior de separação e purificação da substância de interesse. Nessas circunstâncias, a inibição pelo substrato é um fenômeno que não pode ser ignorado. O efeito do substrato se manifesta quando um valor alto da concentração inicial S pode, ao invés de áproximar flx de flm (como nas Figs. 6.7 e 6.8 ), provocar um efeito contrário, ocasionando uma inibição no crescimento celular. Este fenômeno está ilustrado na Figura 6.10, onde se pode verificar que a expressão de Monod (eq. 6.46) somente se aplica para valores relativamente baixos de S, menores ou iguais a K 5 . Acima deste, onde a inibição pelo substrato se manif~s~, a curva tende para flm até um certo valor de S, para depois se afastar, a partu .deste valor. ,...m - - - - - :... =- -=- --- - A ks ..J k~ . kl,s kí.s I .I S Figura 6.10 - Cinética de inibição pelo substrato (curva A) e sem inibição(---; eq. 6.46). I I Com o objetivo de explicar essa redução na velocidade específica de crescimento (!lx), provocada pelos altos valores iniciais da concentração de substrato (S), uma modificação na expressão de Monod (eq. 6.46), foi proposta:10 S KI,s· flx =flm. Ks +S KI,S +S (6 .51) Nessa nova expressão, que traduz o andamento da curva A (Fig. 6.10), K 5 é a constante de saturação definida pela eq. (6.46). K1 5 , por outro lado, é a constante de inibição pelo substrato que se refere, como K~, ao valor de S para o qual flx = flm/2, porém para um valor de S que provoque a inibição, sendo assim superior ao correspondenteS da equação de Monod. Para uma melho; compreensão da influência do valor de K1,5 sobre o efeito inibidor do substrato, é oportuno analisar o fator K1,5 / (K1,5 + S), da equação 6.51 sob a forma: 1 1+ - (6.52) s- Kr,s -------- -.- ----~----~---- --- ~-- ----- ---- I I 14 ' . '' ~ . · Cinética de processos ferrnentativos Se K1,s >> S, então: SI K 1,s =O e a equação anterior se reduz à unidade. Conseqüentemente a eq. 6.51 se transforma na 6.46, não existindo assim o efeito inibidor do substrato sobre o crescimento. Em outras palavras, um valor relativamente alto dessa constante (K1,5 ) requer igualmente valores muito altos de S para que o efeito inibidor se manifeste (eq. 6.52, menor do que um), ou seja, a inibição pelo substrato poderá ser pouco pronunciada. Inversamente, valores baixos de K1,5, representam um substrato muito inibidor perante uma dada espécie de microrganismo. Quanto à inibição pelo produto, um equacionamento semelhante foi realizado por JERUSALIMSKY e NERONOV A: 10 . s Kl,P f.lx =f.lrn. K +S Kl,P +P (6.53) 5 sendo que as considerações prévias, referentes à eq. (6.52), também se aplicam nesta expressão, mas levando em conta unicamente o efeito inibidor pelo produto, representado pela sua concentração P, n,o meio. Mais informações sobre as expressões (6.51) e (6.53), assim como outros modelos de inibição, poderão ser encontrados na literatura. 10 Agradecimentos O autor agradece aoEngenheiro (Mestre em Engenharia Química) Andreas Karoly Gombert pela elaboração do Apêndice e à Engenheira (Mestre em Engenharia Química) Júlia Baruque Ramos, pelo trabalho de datilografia. Apêndice Andreas Karoly Gombert . Para ilustrar uma forma bastante prática e simples de calcular velocidades específicas a partir de dados experimentais de cultivos de células, será apresentada uma planilha em Microsoft Excel que contém as equações do método geométrico de cálculo de derivadas proposto por LE DUY; ZAJIC. 8 O objetivo não é apresentar detalhes sobre esse método, mas apenas ilustrar como o mesmo pode ser utilizado; para obter detalhes do método, sugere-se consultar a referência original. Apêndice I I5 A) Apresentação da planilha No artigo original escrito por LE DUY; ZAJIC,8 é apresentada uma sub-rotina em Fortran para o cálculo de velocidades específicas. No entanto, em função da facilidade e praticidade no uso de planilhas eletrônicas, como é o caso do Microsoft Excel, torna-se bem mais simples calcular velocidades específicas lançando mão --~deste tipo de planilha. No Quadro 6.1, são apresentadas as equações de uma plani, ·lha que executa o cálculo de velocidades específicas. Alguns cuidados devem ser tomados para o bom funcionamento da planilha: 1) A primeira linha de equações é diferente das outras. A partir da segunda linha de equações, existe repetição das mesmas. Portanto, basta copiar a segunda linha de equações para o número de linhas que forem necessárias ao número de dados de entrada disponíveis. 2) Deve-se manter uma linha em branco após a última linha de entrada de dados, sendo esta a forma utilizada pela planilha para que possa ser calculada aderivada no último ponto. · 3) A coluna B deverá conter sempre dados de concentração celular. A coluna C poderá conter dados de concentração celular, caso se deseje calculara velocidade específica de crescimento; dados de concentração de substrato, caso se deseje calcular a velocidade específica de consumo de substrato; dados de concentração de produto, caso se deseje calcular a velocidade específica de formação deste produto. 4) Após a entrada das equações (conforme Quadro 6.1), pode-se iniciar a utilização da planilha, devendo-se utilizar apenas as colunas A, B e C para entrada de dados numéricos. A velocidade específica para cada instante aparecerá automaticamente na coluna E. 5) Os dados de 1-ls aparecerão com sinal negativo na planilha, por causa do sinal negativo da derivada dS I dt. No entanto, como 1-ls deve assumir valores positivos, deve-se fazer a correção necessária, multiplicando-se os valores obtidos na plàri.~lha por -1. Sugere-se acompanhar o seguinte exemplo de caso para verificar o bom funcionamento da planilha. ,. B) Exemplo de caso: dados de um cultivo descóntínuo de Saccharomyces cerevisiae Na Tabela 6.1 são apresentados os dados de concentração celular, de substrato e de produto obtidos num cultivo descontínuo de Saccharomyces cerevisiae.24 Esses dados, obtidos ao longo do cultivo a cada 4 horas e sujeitos a alguma flutuação experimental, devem ser ajustados a uma tendência que represente bem o fenômeno em questão, ajuste este que pode ser denominado "alisamento". O alisamento dos pontos experimentais, que pode ser realizado por ajuste manual em papel milimetrado ou pelo ajuste por uma ou mais equações polinomiais, deve ser feito anteriormente ao cálculo das velocidades específicas de crescimento, de consumo de substrato e de formação de produto. Os dados resultantes do alisamento dos pontos apresentados na Tabela 6.1 encontram-se na.Tabela 6.2 (no caso, foi feito um ajuste por polinômios de 4. o grau) . I 16 Cinética de processos fermentativos Tabela 6 ..1 - Dados experimentais de um cultivo descontínuo de S. cerevisiae. 24 Tempo (h) X (g/L) S (g/L) p (g/L) o 0,91 106,9 0,0 4 0,91 106,9 0,0 8 1,61 96,8 6,2 12 2,42 83,6 15,0 16 3,59 59,9 23,5 20 4,71 31,6 34,3 24 5,51 10,6 42,2 ro'Jol' ~t '·~1 1 • .' ';:J i . ' ...,_ ~~f, ;. ~-, ~ ....:. ~· • .. ... ~\ •. ~ ~-. ,,;.· ~"'·~~{~<~ ,.oá\~{!;~tf ;r •; . '11. • • ~ #.' .. • ' ~-.· • ~ .:;-· •. •• ·-. ....,, -• m ~-t ' ~ ....... . ·>·.-.:·"-;.S;r'.ry·{'··• >''ó• ~· "~;'' ·~q<p < 'Jt)~~f • " • • ' • .. • , • • .... ~ . 1~-~• \íi' • Tabela 6.2 - Dados resultantes do alisamento de dados experimentais de um cultivo descontínuo de S. cerevisiae (ver Tabela 6. 1). · Tempo (h) X (g/L) S (g/L) p (g/L) 0,00 15 3,31 65,7 21,8 106,9 0,00 16 3,60 59,2 24,4 0,89 106,9 0,00 17 3,89 52,5 27,0 3 0,91 106,3 0,04 18 4,18 45,7 29,6 4 0,97 105,6 0,68 19 4,45 38,9 5 1,07 104,6 1,59 20 4,71 32,2 34,4 6 1,19 103,1 2,76 21 4,95 25,9 36,6 7 1,35 101,1 4,17 22 5,17 20,0 38,6 8 1,52 98,6 5,80 23 5,35 14,8 40,3 9 1,73 95,6 7,65 24 5,49 10,5 41,7 10 1,95 91,9 9,68 25 5,57 7,4 42,7. 11 2,20 87,7 11,9 26 5,57 7,0 42,8 12 2,46 82,9 14,2 27 5,57 7,0 42,8 13 2,73 77,6 16,7 28 5,57 7,0 42,8 14 3,01 71,9 19,2 Tempo (h) X (g/L) S (g/L) o 0,89 106,9 1 0,89 2 .P (g/L) • 32,1 I j ----·-~·--·- . . ·- -- · -- , , . . "~""'~ Apêndice / - I 17 É importante observar que o intervalo de tempo entre dois pontos consecutivos resultantes do alisamento, os quais serão utilizados no cálculo das_velocidades específicas, deve ser adequado ao caso em estudo. No presente exemplo, foram utilizados dados de 1 em 1 hora, pois verificou-se que este intervalo é suficiente para que fossem obtidas boas curvas de velocidades específicas. Utilizando os dados da Tabela 6.2 para o cálculo de velocidades específicas, obtêm-se os dados constarites da Tabela 6.3. Para ilustrar o aspecto da planilha no momento de sua utilização, é apresentado no Quadro 6.2 o cálculo das velocidades específicas de crescimento (dados de concentração celular na coluna C) . Tabela 6.3 - Velocidades específicas de um cultivo descontínuo de S. cerevisiae . Tempo (h) J.lx (h-1) J.ls (h-1) J.1p (h-1) Tempo (h) J.lx (h-1) J.ls (h-1) J.lp (h-1) o 0,00 0,00 0,00 15 0,09 1,92 0,79 1 0,00 0,11 0,00 16 0,08 1,83 0,72 2 0,01 0,33 0,02 17 0,07 1,74 0,67 3 0,04 0,58 0,32 18 0,07 1,63 0,61 4 0,08 0,85 0,78 19 0,06 1,52 0,54 5 0,10 1,11 0,96 20 0,05 . 1,38 0,48 0,12 1,43 1,07 21 0,05 0,42 7 0,12 1,63 1,12 22 0,04 1,23 1,07 0,35 8 0,12 1,78 1,14 23 0,03 0,87 0,29 9 0,12 1,90 1,12 24 0,02 0,64 0,21 10 0,12 2,01 1,09 25 0,01 0,12 0,07 11 0,12 2,03 1,03 26 0,00 0,03 0,01 12 0,11 2,04 0,97 27 0,00 0,00 0,00 ' 0,00 t. - 6 13 0,10 14 0,10 .t ·-f: ' :,. 2,01 0,92 1,97 0,85 ....... i'l'l·.,..., -,;- ~·-..-:•':i\wr-, ;. -: ~-- ~ --- --- - .. . . . . . - P""",--- ·--- - -- 0,00 0,00 28 ~- "":,ilr-t' --- - ·-- --. r- •.l. l».,,"~-~- ;~,:~ 1:_:;__;: I< ' l~t: :~~ -~ ·' - _;. ,. I 18 Cinética de processos fermentativos Quadro 6.1 - Organização da planilha para cálculo de uma determinada velocidaae específica (observe também o Quadro 6.2). A) Para deixar um espaço razoável para a caracterização dos cálculos que serão efetuados, imagina-se a entrada de dados a partir da linha 8 da planilha: · · Célula da Planilha Dados de entrada Tipo AS tempo (h) texto 8S X (g/L) texto :i>A ...,, CS M (g/L) texto ~ DS dM/dt texto llM texto '' M: ~~· ~ f :'I :"'j ~ i~ . r, ES FS i texto GS mAB texto HS mBC texto IS dCX · texto JS mNO texto KS nNO texto LS mMO texto MS nMO texto -~ -• > '" ·~ '~ Aj, r~ :l·~ ~ ~ -~ -r~ ~· ~l ,,., I~ C• ~~- 1~--------------+---------------~---------------i 1~------: --:------~r-------:x-~-~------_,----~-:-:-:-::--. . ~--~~ ~ 1~------------~------------~--------~.~ ----~~J PS dX/dt texto ~ !C:;;.&. .&i~$.;.~.-;.". ;;i::~,._ ":..:)!1Z.~~·~~~'~fél; ~.!:·~''·"'·' ~~ B) Para os cálculos relativos ao primeiro ponto, o método obtém a derivada traçando uma reta entre o segundo e o primeiro ponto, devendo-se, portanto, entrar com os seguintes dados na linha 9: Célula da Planilha Dados de entrada Tipo A9 tempo inicial número 89 concentração celular inicial número C9 concentração inicial do composto M número 09 = +(ClO - C9) I (AlO - A9) equação E9 = +09/89 equação F9 1 número ---~----··--'--------------------- ---- ------ --- -------------------- ·----·---·-- . - ·-..-. -~ Apêndice I 19 C) Para os demais pontos, o cálculo é feito através das equações abaixo (estão indicadas as entradas da linha I0). Quando da utilização da planilha, após a entrada dos dados numéricos (resultantes do alisamento) nas colunas A, B e C, deve-se preencher as colunas D a P copiando as células da linha IOaté a última linha de entrada de dados: 1 , Célula da Planilha Dados de entrada Tipo AlO segundo dado de tempo número BlO segundo dado de cone. celular número C lO segundo dado de cone. do composto M número 010 =SE (ABS (GlO-HlO) <=0,001 ; IlO;PlO) equação ElO =+DlOIBlO equação FlO =+F9+1 equação GlO =+ (Cl0-C9) H lO =+ (Cll-ClO) 110 =SE (A11<>0;0,5* (GlO+HlO); (Cl0-C9) JlO =SE ( (Cll-Cl0)<>0; (AlO-All) KlO =0,5* (ClO+Cll)- (Jl0*0,5* (Al0+A11) ) LlO =SE ( (Cl0-C9) <>0; (A9-Al0) MlO =0,5* (C9+Cl0)- (L10*0,5* (A9+Al0) ) equação NlO = (KlO-MlO) / (LlO-JlO) equação 010 =+LlO*NlO+MlO equação PlO =SE (All<>O; (NlO-AlO) I (A10-A9) equação I (All-AlO) equação I (Al0-A9)) I (Cll-ClO) ;99000000000) I (Cl0-C9) ; 99000000000) I (Cl0-010); (C10-C9) I (Al0-A9)) equação equação equação equação equação I .I I L. -- - -- -- - · ·--·. .·- ---· ---- ---- --- . --------- ---- ---- ------------- ---------- -- ------ Quadro 6.2 - Exemplo de cálculo de velocidade específica de crescimento para dados de um cultivo de S. cerevisiae. A 1 2 I B I I c D E F G K I H I I I L I L Planilha para o cálculo de velocidades específicas pelo método proposto por LE DUY; ZAJIC8 I I tempo (h) X(g/L) M(g/L) dM/dt o 0,00 0,00 1 1 2 3 4 5 6 7 0,89 0,89 0,00 . 10 11 12 13 14 15 16 0,89 0,89 0,00 0,01 0,04 0,08 0,10 0,12 0,12 0,12 0,12 0,12 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 0,89 0,91 0,97 1,07 1,19 1,35 1,52 1,73 1,95 2,20 0,01 0,04 0,08 0,11 0,14 17 18 19 20 0,89 0,91 0,97 1,07 1,19 1,35 1,52 1,73 1,95 2,20 2,46 2,73 3,01 3,31 3,60 3,89 4,18 2,46 2,73 0,26 0,27 0,11 0,10 3,01 3,31 3,60 3,89 4,18 4,45 4,71 4,95 5,17 5,35 5,49 5,57 5,57 5,57 5,57 4,45 4,71 4,95 5,17 5,35 5,49 5,57 5,57 5,57 5,57 0,29 0,29 0,29 0,29 0,28 0,26 0,25 0,23 0,202 0,16 0,11 0,04 0,00 0,00 0,00 0,10 0,09 0,08 0,07 0,07 .. 0,06 0,05 33 34 35 36 37 N I I o I p I I 9 27 28 29 30 31 32 . I Entrar somente com os dados de temp_o (coluna A), de concentração celular (coluna B) e de concentração do coml"'sto M• (células, substrato ou produto), cuja velocidade específica de consumo ou de produção se desea determinar (coluna C): 8 23 24 25 26 M Exemplo de aplicação; dados de um cultivo descontínuo de S. cerevisiae 3 4 5 6 7 21 22 I 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 0,16 0,19 0,21 0,23 0,25 i 11m 8 9 10 11 12 13 0,12 ·., 0,05 0,04 0,03 0,02 .. 0,01 0,00 0,00 0,00 . 14 15 16 17 18 19 20 2L 22 23 24 25 26 27 28 29 mAB mBC dCX mNO nNO mMO nMO t(c) exc r dX/dt 0,00 0,00 0,02 0,06 0,00 1E+11 -50,00 -16,67 1E+11 0,10 0,12 0,16 0,08 0,11 -1E+11 125,90 59,27 46,02 46,96 41,90 45,55 42,10 45,02 44,08 46,56 48,89 -5E+10 -1E+11 125,90 59,27 46,02 46,96 41,90 45,55 42,10 45,02 44,08 46,56 #DIV /0! 1,50 2,00 1,99 -{),57 2,43 -9,95 3,08 -13,49 1,74 -16,16 #DIV /0! 50,90 25,96 26,!'4 51,68 26,69 104,08 27,43 106,36 37,13 108,71 #DIV /0! 0,01 0,04 0,08 0,11 0,14 0,16 0,19 0,21 0,23 0,25 -16,36 -16,58 -1,72 47,07 #DIV /0! 109,48 110,30 0,26 0,27 57,22 -105,39 0,00 0,02 0,06 0,10 0,12 0,16 0,17 0,21 0,22 0,25 0,26 0,27 0)8 0,30 0,29 0,29 0,29 0,27 0,26 ·o,24 0,22 0,18 0,14 0,08 0,00 0,00 0,00 0,01 0,04 0,17 0,21 0,14 0,17 0,19 -10,00 -8,33 -6,25 -5,88 -4,76 0,22 0,25 0,26 0,22 0,24 0,26 -4,55 -4,00 -3,85 0,27 0,27 -3,70 0,28 0,30 0,29 0,29 0,29 0,27 0,28 0,29 0,30 0,29 0,29 0,28 0,26 0,24 0,22 0,18 0,14 0,08 0,00 0,00 0,00 0,20 0,27 0,25 0,23 0,20 0,16 0,11 0,04 0,00 0,00 0,00 -3,57 -3,33 -3,45 -3,45 -3,45 -3,70 -3,85 -4,17 -4,55 -5,56 -7,14 -12,50 1E+11 lE+ll 1E+11 -5,03 51,08 51,49 56,90 60,64 64,38 72,83 79,58 90,25 102,79 130,26 173,28 311,78 -3E+12 -3E+12 -3E+12 73,16 1E+11 -50,00 -16,67 -10,00 -8,33 -6,25 -5,88 -4,76 -4,55 -4,00 -3,85 -3,70 -3,57 -3,33 -3,45 -3,45 -3,45 -3,70 -3,85 -4,17 -4,55 -5,56 -7,14 -12,50 lE+ll 1E+11 1E+11 48,89 51,08 51,49 56,90 60,64 64,38 72,83 79,58 90,25 102,79 130,26 173,28 311,78 -3E+12 -3E+12 - 3E+12 33,10 -49,75 47,36 33,28 33,11 27,20 27,10 25,85 25,50 IIDlV /OI #DIV /0! 27,50 -102,57 0,29 0,29 #DIV /0! 0,29 0,28 0,26 -48,42 -47,70 -20,84 -20,30 -11,39 -6,97 IIDIV/0! IIDIV /0! -65,08 0,25 0,23 0,20 0,16 0,11 0,04 IIDIV/01 #DIV/01 0,00 - - #DIV /0! ~ Referências bibliográficas 121 Referências bibliográficas (1) BORZANI, W.; SANCHEZ PODLECH, P. A. An empirical correlation between the oil drop size distribution in hydrocarbon-water systems, oil concentration, and impeller speed. Biotechnology Bioengineering, vol. 18, p. 141, 1976. (2) GADEN, E.L.Jr. Fermentation kinetics and productivity. Chemistry and Industry, February 12, p .154-9, 1955. (3) MOSER, A. STOICHIOMETRY OF BIOPROCESSES. IN: REHM, H.J. REED, G. VOLUME EDITOR: BRAUER, H. Biótechnology- A comprehensive treatise in 8 volumes. Weinheim, V.C.H. Verlagsgesellschaft, 1985. V.2, p. 227-241. (4) PIRT, S. J. Principies of Microbe and Cell Cultivation. 1 ed. Nova York, A Halsted Press Book, John Wiley & Sons, 1975. (5) SINCLAIR, C.G.; CANTERO, D. Fermentation modellfng. In: McNeil, B. Harvey L.M. Fermentation- a Praticai Approach. 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V. 2, p . 243-283. · (11) SPIEGEL, M.R. Estatística. 2.ed. Trad. de Pedro Cosentino. Rio de Janeiro. Ao Livro Técnico S.A. 1969. Cap. 13, p. 362-400: Ajustamento de curvas e o método dos mínimos quadrados. (12) LEME, R.A.S. Curso de estatística 11. São Paulo, S.P. Escola Politécnica. USP, 1958. Cap.13, p. 59-68: Análise de regressão: determinação do grim de polinômios. (13) LEME, R.A.S. Curso de estatística - elementos. 3.ed. Rio de Janeiro. Ao Livro Técnico S.A., 1967. p .265. (14) BORZANI, W. Avaliação do erro que afeta o valor da velocidade calculada a partir da curva de variação da concentraÇão com o tempo. Arquivos de Biologia e Tecnologia, vol.28, n.4, p. 553-555, 1985. (15) BORZANI, W. Evaluation of the error that affects the value of the maximum specific growth rate . Journal of Fermentation Technology, vol. 58, n. 3, p. 299-300, 1980. (16) BORZANI, W. A general equation for the evaluation of the error that affects the value of the maximum specific growth rate. 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Dessa forma, a modelagem matemática de processos fermentativos pode ser definida como a tentativa de representar, através de equações matemáticas, os balanços de massa para cada componente no biorreator, associados às complexas transformações bioquímicas que ocorrem no processo e às velocidades com que essas transformações se processam. Em razão da complexidade do processo real (que envolve leis físico-químicas, bioquímicas e genéticas), somadà às limitações matemáticas, os modelos são baseados, geralmente, na idealidade e, em geral, fornecem uma repre1 sentação fiel de apenas algumas das propriedades do processo. A formulação de um modelo matemático deve, segundo os autores, possuir um comprom~timento entre grau de complexidade razoável e solução (esforço computacional) economicamente desejável. Por sua vez, a simulação do processo corresponde à sua análise (por exemplo, s':la otimização) através da utilização do modelo matemático proposto. Do ponto de vista da engenharia bioquímica, o desenvolvimento da modelagem matemática dos processos fermentativos permite atingir, entre outros, os seguintes objetivos: organizar informações desconexas a respeito dos fenômenos biológicos num conjunto coerente; pensar (e calcular) logicamente a respeito de quais componentes e interações são importantes num sistema complexo; descobrir novas estratégias para explicar b comportamento das células submetidas a determinados ambientes; corrigir falhas eventualmente 124 Modelagem matemática e simulação de proc~ssos fermentativos existentes no entendimento convencionado de determinados fenômenos e, finalmente, entender as características qualitativamente essenciais de determinados processos. 2 O objetivo principal da modelagem matemática e simulação, como ferramenta do desenvolvimento tecnológico de processos fermentativos, é prever o comportamento dinâmico e estacionário do processo, inclusive em condições não testadas empiricamente, possibilitando a determinação das condições operacionais economicamente ótimas do sistema, auxiliando no projeto e ajuste de algoritmos de controle, no qual o modelo matemático formulado passa a ser parte integrante do mesmo. 3 Os processos fermentativos incorporam uma série de características que os diferenciam dos processos químicos, o que pode explicar as dificuldades encontradas na formulação de modelos matemáticos que representem adequadamente estes processos, ao contrário do que ocorre com os processos químicos convencionais. Entre essas características podem ser citadas as seguintes: baixas concentrações e baixas velocidades de reação, como resultado da utiliZação de um meio diluído; complexidade da mistura reagente e capacidade do sistema (células microbianas) de sintetizar seu próprio catalisador; conhecimento insuficiente de vários dos fenômenos limitantes das velocidades de produção e falta de sensores para automação on-line; problemas de esterilidade, segurança e eventualmente da toxicidade dos processos fermentativos. 4 Neste capítulo serão apresentados os principais tipos de modelos empregados para representar os processos fermentativos, destacat:tdo as estratégias empregadas na formulação dos modelos matemáticos conhecidos como fenomenológicos, não estruturados, bem como as metodologias utilizadas no ajuste desses modelos a um conjunto de experimentos realizados . Posteriormente, serão introduzidas e aplicadas técnicas estatísticas, que permitem discriminar diversos modelos ajustados, definindo sua validade. Finalmente, será discutida . brevemente a utilização dos modelos matemáticos visando otimizar um processo, através da definição de uma função objetivo e o emprego de diversas técnicas de otimização. . ~ 7.2 - Formulação dos modelos matemáticos de processos fermentativos · Inicialmente, deve-se reconhecer que, num processo fermentativo, estão envolvidos dois sistemas que interagem continuamente: a fase biológica (ou biótica) composta pela população microbiana ou pela cultura de células animais ou vegetais e a fase ambiental (ou abiótica) ou o meio de cultura, como é comumente conhecido e que contém os substratos e produtos do processo. A Figura 7.1 resume os principais parâmetros, fenômenos e interações que influenciam o comportamento cinético de uma população microbiana ou de células na presença do seu meio de cultura. 5 · ··---~---"--- -·-···-'·-·· .. -----~ Fonnulação dos modelos matemáticos de processos fennentativos AMBIENTE POPULAÇÃO (meio de cultura) (células) Multicomponentes .. Nutrientes/Substratos Reações em solução Equilíbrio iônico Multicomponentes Heterogeneidade entre células Produtos M ultirreações Controle interno pH, T, ... variáveis Propriedades reológicas variáveis (viscosidade) 125 Calor Sistema multifase (G-L; L-L; G-L-L; G-L-S) Adaptabilidade Sistema estocástico Interações Mecânicas Não uniformidade Variações genéticas Figura 7 .I - Esquema das principais características da interação população microbiana/células animais ou vegetais e o meio de cultura. As células consomem nutrientes e convertem substratos do ambiente em produtos. As células geram calor, que é dissipado para o meio e, em contrapartida, a temperatura do meio define a temperatura das células. Interações mecânicas ocorrem através de pressão hidrostática, de efeitos do fluxo do meio para as células, de choque entre partículas (células ancoradas em suportes) e de mudanças na viscosidade do meio em função do acúmulo de cél~las e de produtos metabólicos. Há .que se considerar ainda que as características de operação do processo fermentativo empregado, tais como: • batelada, contínuo, batelada alimentada, etc.; • submerso e semi-sólido; • alta densidade celular (reciclo, imobilização de células, etc.); entre outras, permitem interferir na relação população microbiana - ambiente, no sentido de controlar e, se possível, aumentar as velocidades e os rendimentos desta interação. Pelo exposto, fica claro que num desenvolvimento de processo, quando se utilizam as técnicas de modelagem matemática e simulação para o projeto e dimensionamento de biorreatores otimizados, dever-se-á analisar, da forma mais abrangente e integrada possível, os principais fenômenos que caracterizam as interações população microbiana- meio ambiente- tipo de processo fermentativo. A seguir listamos alguns desses fenômenos característicos: ...__ __ - ·-----· -·· ... --------------------------------:----- - -.------- -- - - - - - - ' 126 Modelagem matemática e simulação de processos fermentativos • influência da "história" da população microbiana no processo (fase lag e de adaptação, mutações, perda de viabilidade, etc~); · • influência da composição do meio de cultivo nas velocidades de crescimento ou de produção da população microbiana (um único ou múltiplos substratos limitantes, substratos inibitórios, substratos que provocam os fenômenos de indução e repressão, etc.); • consumo de substratos para crescimento e também, na maioria dos casos, para manutenção da vjabilidade celular; • geração de produtos associada ou não ao crescimento celular; • transferência de substratos do meio para o interior das células e de produtos da célula para o meio; • velocidades de respiração em processos aeróbios (transferência de oxigênio da fase gasosa para a fase líquida através da agitação e aeração do biorreator); • tipo de processo (submerso ou semi-sólido, batelada ou batelada alimentada ou contínuo, com e sem reciclo, células imobilizadas ou livres, uma ou múltiplas fases de processo, etc.); • influência de variáveis físico-químicas no processo (temperatura~ pH, pressão interna do biorreator, viscosidade, densidade, umidade do meio de cultivo, umidade relativa do ar, etc.); • influência das variações na síntese dos componentes celulares- necessidade de incluir "estrutura" nos modelos matemáticos dos processos; • homogeneidade ou heterogeneidade do processo; • influência das condições operacionais na morfologia da população microbiana. Admite-se, idealmente, que a modelagem de uma fermentação deveria predizer o r~sultado das milhares de transformações químicas que ocorrem pela ação de uma população microbiana, ou de uma cultura de células animais ou vegetais. Sem dúvida, uma descrição completa de todas as vias e intera~ões metabólicas pertinentes ao desenvolvimento microbiano seria extremamente complexa e mesmo impossível. Felizmente, sabe-se que, ao menos na área das ciências exatas, muitos problemas podem ser estudados usando uma média das várias propriedades das diversas entidades em questão. Nesse sentido, é importante lembrar que o modelo ainda pode ser válido se somente um número limitado de mecanismos governantes são considerados em detalhe. Portanto, na elaboração . de modelos de processos fermentativos são, geralmente, introduzidas simplificações, de maneira a se obter modelos passíveis de serem manuseados e generalizados.6 . 7.2.1 - Classificação dos modelos matemáticos de processos fermentativos Vários autores apresentam classificações para os diversos tipos de modelos comumente usados em engenharia bioquímica. 5' 6' 7 Iniciaremos essa ~lassificação pela definição de dois grandes grupos de modelos matemáticos de processos fermentativos, definidos a seguir. · · ~~ .. - - - - --'-----·-'---·. __ ___....... Formulação dos modelos matemáticos de processos fermentativos 127 Modelos fenomenológicos: baseiam-se na formulação de hipóteses e correlações teóricas ou empíricas para explicar os fenômenos e o comportamento das variáveis do processo observados experimentalmente; Modelos entrada-saída: estabelecem relações empíricas para correlacionar o efeito de lr'ariações nas variáveis de entrada ou manipuláveis (caso, por exemplo, das concentrações iniciais em sistemas operados em batelada ou das concentrações e vazões de alimenta~ão nos sistemas operados de forma contínua) nos valores das variáveis de saída ou medidas do processo (caso do perfil de concentrações possíveis de serem medidas no interior do biotreator, ou no seu efluente, ao longo do tempo). 7.2.1.1. Modelos fenomenológicos Um modelo fenomenológico é constituído por um conjunto de relações matemáticas entre as variáveis de interesse do sistema em estudo. É desejável que os modelos sejam, na medida do possível, fundamentais, ou seja, baseados nas equações de conservação de massa, energia e quantidade de movimento e em princípios físico-químicos, uma vez que isto confere maior confiança em interpolações e extrapolações, quando comparado com modelos puramente empíricos. Entretanto, mesmo em modelos fundamentais, é freqüente que o cálcu. lo de um ou mais parâmetros seja baseado em equações empíricas. Na formulação de um modelo matemático fenomenológico convencional são, normalmente, utilizadas equações que podem ser classificadas em: • equações de balanço ou de conservação (de massa, energia, quantidade de movimento), baseadas em princípios físico-químicos f';lndamentais; • equações de velocidade, que podem ser: (a) equações' de velocidade de transporte de massa, energia e componentes ou espécies químicas, através das fronteiras do 's istema considerado ou (b) equações de velocidade de geração ou consumo de espécies dentro do sistema; as equaçÕes de velocidade são normalmente equações empíricas, construídas a partir do conhecimento advindo de ensaios realizados no laboratório; • equações termodinâmicas, que relacionam propriedades termodinâmicas · do sistema (pressão, temperatura, densidade, concentração), por exemplo, equações de estado e relações de equilíbrio termodinâmico (como é o caso da lei de ·Henry para transferência de oxigênio da fase gasosa para a fase líquida). ~- Enquanto as equações de balanço, de velocidade de transporte e termodinâmicas são passíveis de pàdronização através de estudos teóricos de fenômenos de transporte e termodinâmica aplicados há décadas na engenharia química, as equações de velocidade de transformação, ou equações cinéticas, são específicas para os processos fermentativos e constituem os chamados modelos cinéticos. Freqüentemente, em processos com células livres; as informações sobre a cinética de fermentação são obtidas a partir de ensaios em laboratório realizados em reatores operados de forma descontínua, descontínua alimentada ou contínua. Na proposição de um modelo Cinético para um processo fermentativo, diversos níveis L . . . - - - ·--- .- - - - - - ------------- - - - - --- - - :- - -----'-- - ,_. ._ _ _ _ _ _ _- - - - --- -:- - . . . - j ---- - - --- - - - - . -- - - ------- 128 Modelagem matemática e simulação de processos fermentativos de detalhamento podem ser adotados. Algumas das aproximações, permitem simplificar a representação da cinética dos processos ferrnentativos: • consideranili>-se que, na formulação do meio de cultura, todos os componentes, rri.enos um número preestabelecido, estão em concentrações suficientemente elevadas (mas não inibitórias), de modo que apenas as concentrações destes outros componentes, previamente escolhidos, sejam limitantes e/ ou inibitórias-para a velocidade do processo; eventualmente, é necessário incluir no equacionarnento outros componentes do meio, por exemplo, um produto inibidor que se acumula no meio de cultura ao longo do processo; • considerando-se, em geral, que alterações em outras variáveis detectadas num experimento de um processo típico não afetam significativamente a cinética no intervalo de tempo escolhido para a modelagem; além disso, controles do biorreator podem regular e manter constantes alguns parâmetros do ambiente, por exemplo, pH, temperatura e concentração de oxigênio dissolvidO'; • introduzindo-se no modelo, se necessário, urna descrição rnulticornponente e rnultivariável da população rnicrobiana ou de células, para representar adequadamente o comportamento cinético desejado. Os modelos cinéticos de processos ferrnentativos podem ser classificados, quanto ao número de componentes usados na representação celular, em dois tipos, conforme se detalha a seguir. Modelos não estruturados: o material celular é representado por urna úniça variável, por exemplo, a massa celular ou o número de células, sem considerar variações . de componentes intracelulares, ou usar tais variações ria previsão do comportamento cinético do processo; Modelos estruturados: as células são descritas com maiores detalh~s, considerando, por exemplo, componentes intracelulares, perrnitindo~descrever o estado das células e sua adaptação às mudanças do meio ambiente. · • Quanto à heterogeneidade da população rnicrobiana, os modelos cinéticos também são classificados em duas categorias, descritas a seguir. Modelos não segregados: a população celular é considerada homogênea, isto é, todas as células apresentam o mesmo comportamento; Modelos segregados: as células são consideradas discretas, corno indivíduos de urna população heterogênea, com distribuição de idade, de tamanho e de pro- · priedades celulares. Obviamente, os modelos segregados e estruturados oferecem urna descrição mais detalhada do comportamento cinético do processo ferrnenhitivo que os não segregados e os não estruturados, mas à custa de maior complexidade e maior esforço computacional requerido- em muitos casos a qualidade e a reprodutibilidade dos resultados obtidos não justificam a complexidade e a perda de generalidade introduzida. É possível encontrar na literatura algumas tentativas de generalizar a modelagem matemática de processos ferrnentativos, utilizando proposições não estru. , __ ___... '· Formulação dos modelos matemáticos de pr~sso5 fermentativos 129 turadas de modelos, visando a utilização em módulos da etapa de fermentação em simuladores de processo. 8 Verifica.:se, entretanto, que essas proposições, por não acoplarem etapas de ajuste de parâmetros e de otimização de processo, são extremamente limitadas, urna vez que exigem do usuário um conhecimento aprofundado do processo o que, geralmente, não ocorre; 7.2.1.2 - Modelos entraqa-saída ....' ~ Denomina-se modelo entrada-saída de um processo à correlação que permite calcular urna ou mais respostas do sistema (suas saídas), a partir de um número definido de variáveis de entrada medidas. O principal exemplo de modelos entrada-saída, muito estudado hoje para representar sistemas complexos (caso dos processos ferrnentativos), são as redes neurais. Essas redes foram concebidas a partir de urna analogia com o funcionamento do cérebro humano. Neste, a informação é processada em unidades chamadas neurônios. Cada neurônio recebe a informação proveniente de inúmeros outros neurônios através de terminais de entrada chamados dendritos. Essas informações são sintetizadas no núcleo e, se forem ·suficientemente fortes, produzirão um sinal que se propaga através do axônio até seus terminais de saída, chamados de sinapses. Finalmente, estas se ligarão a urna nova camada de neurônios. As redes neurais artificiais têm urna estrutura análoga à descrita, sendo que a síntese das informações de entrada é feita por urna ponderação dos diversos sinais, através de ajustes de coeficientes e urna posterior transformação não linear, comumente do tipo sigrnóide. Há diversas proposições de corno interconectar os diversos neurônios, cada urna definindo urna arquitetura de rede. A escolha de qual arquitetura, bem corno o número de neurônios e de camadas intermediárias, será feita sempre ernpiricarnente a partir dos resultados fornecidos pela rede. 9 A rede passa a descrever o sistema corretamente quando o erro entre o resultado medido e o_calculado por ela, a partir dos mesmos dados de entrada, estiver dentro do especificado. Para urna predição correta é 'necessário que se forneça antes à rede um conjunto casado entrada-saída, onde se faráo ajuste dos coeficientes descritos anteriormente. Esse ajuste, que terncorno critério a rninirnização do erro medida-predição, é também designado por fase de treinamento. Finda essa etapa, faz-se sua validação submetendo-se à análise um conjunto de dados ainda não apresentados à rede. Devido ao escopo introdutório do presente capítulo, não se pretende apresentar em detalhe a aplicação de redes neurais à modelagem de processos ferrnentativos. O leitor interessado poderá encontrar na literatura várias aplicações: SYU; TSA0/ 0 na modelagem do crescimento de células em processo batelada; WILLIS et al., 11 na modelagem da produção de penicilina via fermentação; BHAT et al., 12 no controle de urna torre de destilação; ZORZETT0, 13 na utilização de redes neurais híbridas para modelar a: etapa ferrnentativa do processo de produção de vitamina C e SIMUTIS et al./ 4 na utilização de diferentes redes neurais para representar fases distintas da fermentação alcoólica na produção de cerveja. L~. . .,.- - ------ · -·----~------ . ·------ ---~-~-- - -------------.--. ---- - -- -- - - - ---- ----_- i !( 130 Modelagem matemática e simulação de processos fermentativos 7.2.2 - Formulação dos modelos fenomenológicos não estruturados O primeiro passo na formulação de um modelo matemáticç fenomenológico é o estabelecimento das variáveis de estado dó processo, isto é, aquelas variáveis que definem em cada instante o estado do sistema (por exemplo, concentrações de substratos e produtos). Inclui-se também na definição do estado de um processo fermentativo a capacidade (velocidade) das células presentes de executar suas funções vitais, quais sejam: o crescimento ou morte celular, a geração de produtos e o consumo de substratos. Em sistemas mais complexos o estado de processos fermentativos pode incluir a fração de células que preservam a capacidade de gerar um determinado produto (capacidade esta introduzida, por exemplo, através de técnicas de engenharia genética e que pode ser perdida em função da instabilidade do microrganismo gerado), a concentração de um substrato necessário ao crescimento celular e que é gerado pela ação de uma enzima introduzida no processo, a ação de populações mistas de células, entre outros fenômenos. Para estudar a dinâmica de um processo fermentativo, deve-se buscar: . • identificar os processos que alteram o estado das populações envolvidas (crescimento celular, reprodução celular, manutenção da viabilidade celular, morte celular, lise celular, motilidade celular, alterações morfológicas das células, como é o caso da formação de esporos e finalmente os processos físicos que incluem entre outros a aderência das células a superfícies sólidas); • identificar os fenômenos ambientais que afetam as velocidades de alteração do estado das populações; • identificar como as velocidades de alteração do estado das populações são afetadas; • identificar como o ambiente é afetado pelos processos de alteração do estado das populações. • 7.2.2.1 - Equações de balanço As equações de balanço do processo devem ser formuladas para cada variável de estado e para o volume de controle do sistema em estudo. Para os processos fermentativos realizados em biorreatores homogêneos, o volume de controle corresponde ao próprio volume útil do biorreator. Como a formulação e detalhamento das equações de balanço será vista nos capítulos que tratam dos biorreatores, será apresentada apenas a equação geral do balanço a título de revisão: Velocidade de acúmulo no volume de controle Velocidade de entrada no volume de controle Velocidade de saída do volume de controle Fonnulação dos modelos matemáticos de processos fennentativos I 3I Termos de entrada: • fluxo global através das fronteiras geométricas; • difusão através das fronteiras geométricas (importante apenas para biorreatores heterogêneos, onde os volumes de controle são infinitesimais); • transporte através das fronteiras entre fases (caso do transporte de oxigênio da fase gasosa para a fase líquida); I • geração dentro do volume de controle (geralmente crescimento celular e produção de produtos metabólicos). Termos de saída: • fluxo global através das fronteiras geométricas; • difusão através das fronteiras geométricas; • transporte através das fronteiras entre fases; • consumo dentro do volume de controle (geralmente morte celular ou consumo de substratos). Dessa forma, para um processo fermentativo homo§êneo, as equações de balanço podem ser escritas na seguinte forma generalizada: 5 1 d (Vy) --- = v dt Lrger - Lrcons + Dye - yDy (7.1) onde: V ... volume de controle; y ... concentração da variável de estado no biorreator; rger ... velocidades de 9eração do componente representado pela variável de estado; rcons ... velocidades de consumo do componente representado pela variável de estado; D ... vazão específica de alimentação; Ye ... concentração na alimentação; r ... relação entre a vazão de alimentação e de retirada do biorreator. Em função dos balanços de conservação de massa, os modelos matemáticos fenomenológicos de processos fermentativos podem ser constituídos pelos seguintes tipos de equações: • equações algébricas: neste caso, os modelos representam apenas os estados estacionários de sistemas homogêneos; • equações diferenciais ordinárias: neste caso, os modelos representam o comportamento dinâmico de sistemas homogêneos ou os estados estacionários de sistemas heterogêneos numa única direção do espaço; • equações diferenciais parciais: neste caso, os modelós representa!Jl o comportamento dinâmico de sistemas heterogêneos. 132 Modelagem matemática e simulação de processos fermentativos 7.2.2.2 - Identificação do sistema de reações metabólicas Inicialmente, para a construção das equações de balanço de massa do processo e posteriormente na elaboração das equações cinéticas, que representam a influência das variáveis de estado nas suas velocidades de geração e de consumo, é fundamental identificar o sistema de reações metabólicas inerente ao processo em estudo. 16' 17 Por sistema de reações metabólicas entende-se o conjunto simplificado de reações que permite correlacionar os substratos consumidos aos produtos gerados (entre os quais está incluída a população microbiana). Considere-se, a título de exemplo, um processo fermentativo no qual foram identificadas, a partir de um conjunto de experimentos realizados, 6 variáveis de estado: a concentração celular (X), as concentrações de 3 substratos (5 1, 5 2 e 5 3) e as concentrações de 2 produtos (P1 e P 2). Pode-se formular 3 proposições de modelo de reações metabólicas, conforme indicado a seguir. Proposta 1 Nesta proposta assume-se que o substrato 5 1 é consumido pela população microbiana para crescer e, juntamente com o substrato 5 2, produzir o produto metabólico P 1; o substrato 53 é consumido pela população microbiana para produzir o produto P 2 • Os parâmetros k1 a k4 representam os coeficientes estequiométricos desse sistema de reações metabólicas, que é ilustrado a seguir: k 1S 1 ~X kzSl + k3S2 ~ P1 k4S3~P2 Nas propostas 2 e 3, detalhadas a seguir, são apresentadas outras duas alternativas para o sistema de reações metabólicas representativas do processo. • Proposta 2 k 1S 1 + k 2S 2 ~X k 3S 1 + k 4 S 2 + k 5S3 ~ P1 k6S3~P2 Proposta 3 k 1S1 + k 2S 2 + k 3 S 3 ~X k4S1 + ksSz ~ P1 k 6 S 3 ~P2 Para as 3 propostas de modelo de reações metabólicas elaboram~se. os balanços para os 3 substratos. · !~ j Formulação dos modelos matemáticos de processos fermentativos 13 3 Proposta 1: dS 1 dX 1 dP 1 -= - - - - - - - - -1 dt Y x/51 dt (7.2) Y Pl/51 dt dS dt 1 Yp 1152 dP dt dS 3 1 dP2 dt YP2/S3 dt 1 - 2= - - - - (7.3) ·l (7.4) -=---- e integrando as eqs. (7.2) a (7.4) do instante "O" até o instante "i" correspondente a um ponto experimental, obtém-se: Proposta 2_: dS 1 dX 1 dP Yx/51 dt YPl/51 dt 1 dX 1 dP 1 -= - - - - - - - - -1 dt dS 2 1 -= --------- dt Y x/52 dt (7.8) ' ·j (7.9) Y Pl/52 dt I ', dS 3 1 dP1 1 dP2 -=-------- dt Y Pl/53 dt (7;10) Y P2/S3 dt e integrando, novamente, as eqs. (7.8) a (7.10) do instante "O" até o instante "i" correspondente a um ponto experimental, obtém-se: (7.11) ~·~- ~ - ...... -- .. -~-- -· --· ··-- '· '\ i 134 Modelagem matemática e simulação de processos fermentativos Proposta 3: dS 1 dX 1 dP 1 -= = - - - - - - - - -1 dt dS Y x/ 51 dt , 1 dX 1 dP 2 -= = - - - - - - - - -1 dt dS Y x/52 dt 1 dX Y X/53 dt (7.15) Y Pl/52 dt 1 dP 3 -= = - - - - - - - -2 dt (7.14) Y Pl/ 51 dt (7.16) Y P2/ 53 dt e integrando, mais uma vez, as eqs. (7.14) a (7.16) do instante "O" até o instante "i" correspondente a um ponto experimental, obtém-se: Para cada proposta e para cada uma das 9 eqs. lineares (7.5) a (7.7), (7.11) a (7.13) e (7.17) a (7.19), obtidas para as 3 propostas de modelo metabólico formuladas, calcula-se a regressão linear ou multilinear, dependendo do caso, obtendo-se os coeficientes de correlação para cada ensaio e para o conjunto de ensaios disponíveis. Escolhe-se, como a mais apropriada, a proposta que apresenta o melhor conjunto de coeficientes de correlação, analisando as duas situações (por ensaio e global). · Formulação dos modelos matemáticos de processos fermentativos 13 5 EXEMPLO NUMÉRICO Será desenvolvido ao longo deste capítulo, como estudo da modelagem matemática de processos fermentativos, a modelagem do processo de produção de etanol a partir de hidrolisado de mandioca. 18' 19 Nesse processo foram identificadas 3 variáveis de estado: a concentração de leveduras (X), a concentraçã9 de etanol (P) e a concentração de substrato limitante, a glicose de hidrolisado do amido de mandioca (S). São apresentados na Tabela 7.1 os dados experimentais obtidos em 4 ensaios realizados no laboratório, num biorreator operado em batelada, partindo de diferentes concentrações iniciais de açúcares redutores.' Observe-se que esses dados experimentais foram ligeiramente modificados, em relação aos originais (reportados nos trabalhos referenciados), com o intuito de tornar mais didáticos alguns aspectos dos exemplos apresentados ao longo deste capítulo. EXEMPLO NUMÉRICO-ETAPA 1 Considerem-se duas propostas de modelo de reações metabólicas para representar o processo em estudo: Proposta 1: k 1 S~ X k 1 S~P Nessa primeira proposta, considera-se que a glicose é consumida pela levedura para crescer e para produzir etanol. Proposta 2: k 3 S ~ P Nessa segunda proposta, as leveduras não consomem glicose para o seu crescimento (crescem a partir de outra fonte de carbono não limitante no processo e portanto não incluída como variável de estado caso, por exemplo, do extrato de levedura). ·. Elaborando os balanços de massa do substrato S para as 2 propostas de modelo metabólico, obtém-se: Proposta 1: ó.S = -aflX - MP Proposta 2: ó.S =-eM Realizando a regressão multilinear para ó balanço de massa obtido com a Proposta 1 e a regressão linear para a Proposta 2 com os dados experimentais apresentados (Tab. 7.1), obtém-se o resultado sintetizado na Tabela 7.2. Essas regressões são realizadas considerando, em cada instante de tempo "i", o substrato consumido e as células e produto produzidas desde o instante "O" até o instante "i". - - ------------ --- .,.- -· . ··- .. ----- - ·c-----·--- -· --·· -- · - ··- -- - --- ---- ------ -.......... ,.. ~- - - -- - ----· 136 Modelagem matemática e simulação de processos fermentativos Tabela 7.1 - Dados experimentais(•) do processo de produção de etano! a partir de hidrolisado de mandiocaExemplo numérico. Ensaio 2 Ensaio 1 t (h) X (g/L) p (g\L) S (g/L) t (h) X (g/L) p (g/L) S (g/L) 0,0 0,378 1,92 20,8 0,0 0,845 2,44 85,1 1,0 0,652 2,54 17,6 1,0 1,08 2,88 76,8 2,0 1,17 3,54 14,8 2,0 ' 1,88 3,54 76,3 3,0 1,54 4,65 10,3 3,0 2,98 5,34 74,8 4,0 1,84 5,96 5,80 4,0 3,92 7,52 56,9 5,0 2,36 6,64. 2,34 5,0 5,77 10,5 42,2 6,0 2,20 7,19 0,512 6,0 7,14 17,6 28,8 7,0 2,23 6,74 0,088 7,0 10,6 22,8 7,65 8,0 10,3 24,7 0,198 9,0 7,70 24,4 0,002 Ensaio 3 Ensaio 4 t (h) X (g/L) p (g/L) S (g/L) t (h) X (g/L) 0,0 0,410 2,71 136 0,0 1,12 - 2,02 227 1,0 0,819 2,78 130 1,0 1,29 2,56 236 2,0 1,14 3,06 131 2,0 2,29 2,90 221 3,0 1,72 3,43 134 3,0 2,68 3,82 213 4,0 2,57 4,78 130 4,0 4,36 4,44 198 5,0 4,01 6,78 120 5,0 6,18 6,69 198 6,0 4,68 8,34 106 6,0 7,70 9,31 195 7,0 6,60 11,7 100 7,0 11,1 11,3 178 8,0 9,51 15,4 69,8 8,0 13,6 15,2 160 9,0 12,6 23,0 47,5 9,0 18,3 21,0 123 10,0 12,3 28,1 18,3 10,0 18,6 31,2 76,4 11,0 14,2 38,2 0,812 11,0 22,3 39,4 46,2 12,0 15,2 37,7 0,003 12,0 29,9 53,8 11,9 13,0 25,2 54,4 0,054 . p (g/L) S (g/L) (*) Dados experimentais foram gerados considerando um erro experimental aleatório obedecendo uma· distribuição normal (média = 0,0 e desvio padrão = I ,0) de I 0% para as medidas de X e 5% para as medidas de S e P. Fonnulação dos modelos matemáticos de procêssos fennentativos 137 Pelos resultados obtidos, verifica-se que a Proposta 1 é a mais adequada, pois todos os coeficientes de correlação obtidos para cada ensaio são melhores ou · iguais (caso do Ensaio 1), o mesmo ocorrendo com o coeficiente de correlação obtido quando é considerado o conjunto dos 4 ensaios. A discrepância dos valores de a e b obtidos para o Ensaio 1 (estimativas de 1/Yx;s e 1/Yp;s respectivamente) em relação aos outros· 3 ensaios é explicada pelo erro experimental introduzido nos dados. Urna possível estimativa preliminar dos valores de Yx;s e Yp;s num futuro ajuste de um modelo matemático aos dados apresentados na Tabela 7.1, serão os valores de a e b ajustados na regressão obtida com o conjunto de 4 ensaios. Deve-se destacar que, na presente análise, considerou-se que o erro experimental e as ineficiências do processo estão distribuídas entre X e P, o que explica porque o valor de Yp;s obtido não é o valor estequiornétrico 0,511. Tabela 7.2 ·- Resultado das regressões multi linear e linear para as 2 propostas do Exemplo numérico - Etapa I. ENSAIO 1 2 PROPOSTA I PROPOSTA2 ô.S=-aô.X-btl.P ô.S=-ctl.P a = 0,745; b = 3,66 c= 3,95 R= 0,992 R= 0,992 a = 2,31; b = 2,94 c= 3,90 R= 0,987 R= 0,983 4 ... Global r~"i _\.;·,. ':'i:. ·r th ·#f .~·,C; .:-rJ) .') f]~ R= 0,994 c= 4,11 R= 0,989 J)l 1 ~11 a = 2,39; b = 3,19 c= 4,53 I ~·( R= 0,993 R= 0,988 .· a = 2,81; b = 2,88 c= 4,33 R= 0,993 R= 0,987 ~~ ~~ a = 2,73; b = 2,84 3 •.. ~·'!= ·<:7)\W .., r:;;•,··r ,'~!';_ •. :f~li":_'!fdJ/•·:·,' ; :' • •,'1: "'·"·· ~ 1 ~1. "'.. , ....~. ' ":1 ~ . ~ ~. . ~)):': r.~· 7.2.2.3 - Equações cinéticas Conforme já indicado anteriormente, é na construção das equações cinéticas que reside toda a dificuldade e, portanto, toda a arte da formulação dos modelos fenomenológicos dos processos ferrnentativos. São as equações cinéticas que indicam corno as variáveis de estado do processo em estudo interferem nas velocidades de crescimento e morte celular, de geração de produtos metabólicos e de consumo de substrato. Para formular os modelos cinéticos, a partir de dados experimentais, é necessário executar três etapas básicas, descritas a seguir. Tratamento dos dados experimentais Entende-se por tratamento dos dados experimentais, medidos em laboratório, a correção ou transformação dos mesmos buscando adequá-los à análise dese- 138 Modelagem matemática e simulação de processos ferrnentativos jada. Quando os ensaios são conduzidos em processos batelada e contínuo, a volume constante, deve-se tratá-los, por exemplo, desprezando pontos experimentais que apresentem erros grosseiros, podendo-se, geralmente, trabalhar na análise dos dados experimentais com base nas concentrações dos componentes (ou seja, as próprias variáveis de estado medidas). Em processos fermentativos, onde se obtêm altas concentrações celulares de microrganismos em biorreatores, são empregados processos operados em bateladas sucessivas ou bateladas alimentadas (volume variável) e, neste segundo caso, costuma-se tratar os dados, medidos em concentração, transformando-os em massa. Para o cálculo das velocidades específicas e dos fatores de conversão, utiliza-se, efetivamente, a massa consumida ou produzida ao longo do processo. Normalmente, quando é realizada uma correção dos valores medidos, corrige-se apenas o volume do reator considerando ovolume evaporado, alimentado, da amostragem e da adição de ácido ou base para o controle de pH. Contudo, não é considerado que, com a retirada de meio para amostragem, ocorram modificações no estado do processo, pois as massas de todos os componentes do biorreator (substratos, produtos e células) são alteradas. Para tanto, necessita-se corrigir os valores experimentais das variáveis de estado, reproduzindo uma situação de ausência de perturbações, ou seja, a situaÇão na qual nenhuma massa de produto, substrato e célula estivesse sendo retirada. Por meio de balanços de massa, aplicados a cada variável de estado inerente ao processo, obtêm-se os valores em massa destas variáveis, já devidamente corrigidos. TAKANO et al. 20 mostram em seu trabalho que, quando ocorrem grandes perturbações do sistema, deve-se corrigir os dados experimentais antes de proceder ao cálculo das velocidades específicas e dos fatores de conversão, pois o erro destes parâmetros do processo torna-se significativo, podendo causar problemas quando da formulação e do ajuste dos parâmetros do modelo matemático, ou quando estes parâmetros do processo forem utilizados para o projeto do biorreator em escala industrial. Uma vez tratados os dados experimentais, procede-se à identificação do sistema de reações metabólicas, obtendo-se uma primeira estimativa do~ fatores de conversão, conforme ilustrado na Etapa 1 do exemplo numérico. Cálculo das velocidades específicas Nessa etapa são calculadas as velocidades específicas de crescimento e de geração de produtos necessárias para identificar o comportamento cinético da população microbiana; o cálculo das velocidades específicas de consumo dos substratos limitantes do processo é importante para identificar possíveis consumos desses substratos para manutenção. O cálculo das velocidades específicas de crescimento e produção é o primeiro passo para uma boa formulação é ajuste de um modelo matemático de processos fermentativos. Sua importância reside fundamentalmente em dois aspectos: • formulação de relações cinéticas que, juntamente com os balanços de massa, são a base para a construção do modelo; • obtenção de estimativas preliminares dos parâmetros por meio de simplificações e linearizações do modelo a serem usadas, posteriormente, como ponto de partida nas metodologias para ajuste de parâmetros/l Fonnulação dos modelos matemáticos de processos fennentativos IJ 9 Dessa forma, caracteriza-se a importância do cálculo cuidadoso das velocidades específicas de crescimento e de produção de produtos metabólicos a partir dos dados experimentais, cálculo este que é dificultado pela forte influência que pequenas alterações das variáveis exercem sobre o cálculo da sua velocidade. A seguir são listadas as etapas de uma metodologia que pode ser empregada para o cálculo da velocidade específica de crescimento. 22 (a) Detecção da fase de l:rescimento exponencial. Traça-se o gráfico (ln X) vs. (t) para diferentes limites iniciais e finais de tempo, determinando-se, através do melhor coeficiente de correlação, o início e a duração da fase exponencial de crescimento; o coeficiente angular da melhor correlação fornecerá o valor de 1-lm - velocidade específica máxima de crescimento. (b) Aprimoramento da curva de (X) vs. (t). Recuperando-se os valores de X que satisfazem a regressão linear escolhida na etapa anterior, aprimora-se a curva de (X) vs. (t) durante a fase exponencial. (c) Cálculo da velocidade especifica de crescimento. Com a nova curva (X) vs. (t) obtém-se a curva da velocidade específica de crescimento, utilizando-se um dos três métodos descritos a seguir: Método de ajuste polinomial. Ajusta-se um polinômio de grau n no tempo aos valores de X disponíveis, obtendo-se, desta forma, a função de X com o tempo. Análises visuais e quantitativas (através do coeficiente de correlação) definem o grau do polinômio a ser ajustado. Obtido o polinômio, sua derivada fornece os valores da velocidade de crescimento, permitindo o cálculo das velocidades específicas no instante. 23 Método "splíne". Existem diferentes métodos ditos "spline" na literatura técnica. Um dos métodos "spline" que pode ser empregado ajusta um polinômio de grau n a um intervalo de dois pontos de X, incorporando um número de pontos "à frente" do intervalo a ser definido; além disto, o método obriga a que a derivada do polinômio _a justado no intervalo anterior seja igual à derivada do polinômio ajustado no novo intervalo, no ponto de intersecção (característica dos métodos "spline"). Através de testes visuais define-se o grau do polinômio a ser ajustado, bem como o número de pontos "à frente" incluídos no ajuste. 24 Método geométrico. Esse método calcula a circunferência que passa por três pontos (o valor de X correspondente ao instante de tempo no qual se quer calcular a velocidade de crescimento, o anterior e o posterior). A derivada é calculada pela tangente à circunferência no ponto 25 -vide; neste mesmo volume, o Adendo ao Capítulo 6: Cinética de Processos Fermentativos . Para o cálculo das velocidades específicas de geração de produtos metabólicos, utiliza-se um procedimento semelhante ao descrito para o cálculo da velocidade específica de crescimento. É .evidente que, quando a geração do produto não é totalmente associada ao crescimento, não é possível realizar as I' ~ :~~i:,~~=~;~d~;~~i!::I::~:~·-~resc•m.en.to,.na medida em .qu~~ã~ exiSte... --·~ 140 Modelagem matemática e simulação de processos fermentativos EXEMPLO NUMÉRICO-ETAPA 2 Será exemplificado o cálculo da velocidade específica de crescimento para o Ensaio 1, cujos dados foram fornecidos na Tabela 7.1. Sendo que 'o Ensaio 1 é, dos quatro ensaios fornecidos, aquele em que a quantidade de produto formada é menor, será também o ensaio com possibilidade de apresentar o mais próximo de uma fase exponencial de crescimento. A seguir, serão aplicadas as três etapas descritas anteriormente para o cálculo da velocidade específica de crescimento. (1) Determinação da fase exponencial de crescimento- regressão linear dos dados de (ln X) vs. (t)- Figura 7.2. Ensaio 1 • • • • • 0,5 o >< .f: o 4 8 6 -0,5 y -1 =0,5649 X- 0,9795 R2 =0,9996 -1,5 Tempo (h) Figura 7.2 - Definição da fase exponencial de crescimento para o Ensaio I (X= concentração celular em g/L) . . Para a definição da fase exponencial de crescimento assumiu-se que ela tem início no instante t =O h, na medida em que o Ensaio 1 foi realizado com 50 baixo, portanto, sem inibição pelo substrato. Assumiu-se também como desprezível a fase de adaptação. . ·A Tabela 7.3 apresenta o resultado da determinação da fase exponencial de crescimento. • Tabela 7.3 - Resultados da determinação da fase exponencial de crescimento para o Ensaio I (Tabela 7.1 ). Duração da fase exponencial (h) llm (h- 1 ) R 2 0,565 0,9998 3 0,480 0,989 ; ~ I~ 1~·. : "l;: 4 0,402 0,975 5 0,358 0,973 t ~:" ·i;~;-.~: ·.:t~:"' ~~t.i,k,;i . ~ ... ~~ .'!.:..:. rtcc <-:--!..:-'"· ~ 'P~'·"'· -;;~.:,_.,~~ar. ~,~,.J.: D Pelos resultados apresentados na Tabela 7.3, é evidente que uma possível fase exponencial para o Ensaio 1 tem a duração de 2 h e uma estimativa preliminar . de flm é 0,565 h -1. Formulação dos modelos matemáticos de processos fermentativos 14 I (2) Determinação da curva de (X) vs. (t), obtendo-se um melhor detalhamento ao longo da fase exponencial, utilizando sua definição (regressão linear) obtida na etapa anterior. O gráfico de (X) vs. (t) é apresentado na Figura 7.3. 3 2,5 :::::;- :9 >< 2 1,5 1 0,5 o o 2 4 6 8 Tempo (h) Figura 7.3 - Gráfico de X em função do tempo, onde (•) representa, além dos valores experimentais, os valores obtidos da definição da fase exponencial (Fig. 7.2) e(-) representa a curva traçada visualmente. (3) A partir dos dados de (X) vs. (t) obtidos com base na curva traçada na Figura 7.3, é obtido o gráfico de (/l) vs. (t), utilizando o método geométrico, descrito anteriormente, utilizando a planilha apresentada no Adendo ao Capítulo 6 deste volume. A Figura 7.4 apresenta o resultado dos valores de ll calculados, verificando-se a concordância da fase exponencial previamente definida, com o valor de Jl = llm (patamar da Fig. 7.4). 0,7 0,6 0,5 :ê' ..-- ··- :( 0,4 0,3 0,2 0,1 o o 2 4 6 8 Tempo (h) Figura 7.4 - Gráfico da velocidade específica de crescimento calculada a partir da curva de X (Fig. 7 .3) utilizando o Método Geométrico2s. Identificação dos fenômenos . Nessa etapa busca-se definir os principais fenômenos que interferem no processo produtivo em análise: limitações e inibições por substratos, principalmente no que se refere à existência e ao número de substratos limitantes e/ ou inibidores, tipo de produto gerado- existência ou não de associação com o crescimento, entre outros. 142 Modelagem matemática e simulação de processos fermentativos Uma vez obtidos gráficos que permitem analisar o comportamento das velocidades específicas de crescimento, de geração de produto metabólico e de consumo de substratos, é possível identificar os principais fenômenos él serem incluídos na construção de um modelo matemático não estruturado de processos fermentativos. O Quadro 7.1 sintetiza os modelos cinéticos mais empregados para representar os fenômenos comumente identificados em processos fermentativos, alguns dos quais já foram abordados em detalhe no Capítulo 6: Cinética de Processos Fermentativos. EXEMPLO NUMÉRICO- ETAPA 3 Com o intuito de exemplificar a identificaçãb dos fenômenos, necessária à construção do modelo matemático, será identificado qual tipo de inibição do crescimento celular pelo produto (etanol) ocorre na fermentação alcoólica utilizada como caso estudo neste Capítulo. A Tabela 7.4 apresenta os dados de f.lx e P obtidos (por interpolação) para os ensaios definidos na Tabela 7.1, no instante em que a quantidade de 5 residual no biorreator é igual para todos os 4 ensaios - foram consideradas duas situações 5 = 20,0g/L e 10,0 g/L. Quadro 7 .I - Modelos cinéticos não estruturados, descritos na literatura, para representação de diversos fenômenos identificados em processos fermentativos. (1) Crescimento num único substrato limitante: (MONOD) - J.lrnsn f.lx- K~ +Sn f.l x = (MOSER) 26 (7.20) 27 (7.21) • (CONTOIS) J.lrnS 28 (7.22) K 5 X+S (2) Morte celular: (SINCLAIR; KRISTIANSEN) 15 (7.23) f.lct =-Kct (3) Crescimento num único substrato limitante e inibidor: 1-lx = . l-las 5 2 K +5+s K- • (ANDREWS/ 9 (7.24) 143 Formulação dos modelos matemáticos de processos ferrnentativos Quadro 7.I - (continuação) (WU et al/ 0 (7.25) (4) Crescimento com múltiplo substrato limitante (uso preferencial de 51): (5) Crescimento com múltiplo substrato limitante (uso simultâneo de 5 1 e (MEGEE et al.) (TSAO; HANSON) 32 33 (7.27) (7.28) (6) Consumo do substrato limitante para manutenção: (PIRT) 1 Jl s =-- Y x/ s J.l X +m +Ll s S -5* K * +S - S * max - - - - J.l s 34 (ZENG; DECKWER) (7.29) 35 (7.30) (7) Produção de produto metabólico associado e não associado ao crescimento: (LUEDEKING; PIRET modificado) 36 (7.31) 144 ·Modelagem matemática e simulação de processos fermentativos Quadro 7.1 -(continuação) (8) Produção de produto metabólico inibitório: (7.32) I s K' f.!=~ p P K'+SK'+P s p (AIBA; SHODA) 37 (7.33) (7.34) f.! - f.!~S P- K's +5 e-K·P p (AIBA et al.) 38 (7.35) (7.36) f.! P - f.!~S K~ +S (1 - P:n J p (GHOSE; TYAGI) onde: f.!x .. ... velocidade específica de crescimento f.!ct .. ... velocidade específica de morte f.!p ..... velocidade específica de produção f.!s ..... velocidade específica de consumo de substrato S, Sv 5 2, 5 3 •••• concentrações de substratos limitantes 5* .... . concentração de S para manter f.!x X ..... concentração celular P ..... concentração de produto Yx/s ... fator de conversão de substrato em células m• ..... consumo de substrato para manutenção f.!m, K., n, Kct, f.!a, K;, f.!m1' f.!mz, K.v K.z, K.3, f.!o, f.!I, f.!z, l1f.! :;ax, K*' O., J3m, K~., KP, f.!~' ~ . 't"lCOS , K'p, Pmt P'rn ... . .. param K s, e t r os Cine • 39 (7.37) 145 Formulação dos modelos matemáticos de processos fermentativos Tabela 7.4 - Valores de llx e P quando Sresidual = 20 e IOg/L ,_ Sresidual = 20,0 g/L Ensaíos p (g/L) f.!x (h- Sresidual 1 = 10,0 g/L p (g/L) ) f.!x (h- 1 ) 1 2,12 0,565 4,78 0,255 2 1&',0 0,219 21,2 0,161 3 30,0 0,129 33) 0,0901 50,5 0,0523 54,7 -· 4 -~- ' ' "' -- ' '-· 1 '- ,. '.:r,..· 7•· 0,0364 .· ,. ·--.- ,,. As Figuras 7.5 a 7.7 apresentam a representação das formas linearizadas das 3 diferentes alternativas de modelo para a inibição do crescimento celular pelo produto consideradas neste Capítulo (vide Quadro 7.1). (1) Inibiâo hiperbólica: 37 1 1 1 - = - + --- P 1-L x 1-Ls• 1-Ls*K p (7.38) onde (2) Inibição exponencial: 38 (7.39) (3) Inibição linear: 39 • 11 r- x =li•- r-s 1-Ls P p (7.40) m Pelos resultados apresentados nas Figuras 7.5 a 7.7, é evidehte que o modelo cinético de inibição do crescimento microbiano pelo produto, que representa adequadamente os dados experimentais de fermentação alcoólica, é o modelo de ini· _ bição exponencial38 (Fig. 7.6). 146 Modelagem matemática e simulação de processos fermentativos (B) S = 20 g/L (A) S = 10 g/L 30 25 y = 0,4773x- 1,4723 R2 20 :2 ....... . .f 25 • = 0,8937 ;s 15 R2 = 0,9277 15 X ~ 10 10 • 5 o • y = 0,3597x - 0,745 20 o 5 20 oo 60 40 • 20 p (g/L) 60 40 p (g/L) 37 Figura 7.5 - Tentativa de representação da inibição pelo produto através do modelo hiperbólico. (A) S,esidual = I 0,0 g/L e (B) S,esidual = 20,0 g/L. (B) S = 20 g/L (A)S=10g/L 3,5 3,5 3 3 ~ 2,5 2 ' 1,5 c ~ .E: 2,5 2 1,5 1 y = 0,0397x + 1 ,094 R2= 0 ,5 00 0,9897 40 20 y = 0,0486x + 0,5484 R2 = 0 ,9933 0,5 00 60 20 p (g/L) 60 40 p (g/L) 38 Figura 7.6 - Tentativa de representação da inibição pelo produto através do modelo exponencia1. (A) S,. ,;dual = I 0,0 g/L e (B) Sresidual = 20,0 g/L. (A) S = 10 g/L (B) S 0,6 0,3 • 0,25 y =-0,0044x + 0,2615 0,5 R2 = 0,9612 0,4 0,2 ,s 0,15 X ~ ,s 0,3 X 0,2 ~ 0,1 • =20 g/L y =-0,0101 X+ 0,496 R2 = 0,8325 0,1 0,05 o • o 60 20 o o -0,1 p (g/L) • 20 40 p (g/L) Figura 7.7 - Tentativa de representação da inibição pelo produto através do modelo linear (A) S,.,;dual = I 0,0 g/L e (B) S,.,;dua = 20,0 g/L. 39 60 Formulação dos modelos matemáticos de processos fermentativos 147 7.2.2.4 - Modelos fenomenológicos não estruturados com culturas mistas A existência de múltiplas populações de microrganismos num processo fermentativo provocará o aparecimento de interações, nas quais uma população exercerá algum efeito sobre as outras. Considerando duas espécies microbianas A e B, três tipos de interações poderão ocorrer entre elas: um efeito positivo(+) (benéfico), um efeito negativo(-) ou um efeito neutro (0). O Quadro 7.2 ilustra as diferentes alternativas de interações entre as diversas populações microbianas presentes num processo fermentativo. A formulação dos modelos não estruturados com culturas mistas segue a mesma estratégia já apresentada para os modelos com culturas puras, sendo a óbvia e única dificuldade adicional a necessidade de medir e identificar os fenômenos inerentes a cada população integrante do sistema. O leitor interessado poderá encontrar mais detalhes sobre modelos não estruturados com culturas mistas em FREDRICKSON; TSUCHIYA. 7 Quadro 7.2 - Diferentes interações entre populações microbianas. População microbiana Tipo de interação A B Neutralismo o o Mutualismo + + o + + o Competição Comensalismo Parasitismo ou Predação + + Amensalismo o o 7.2.3 - Modelos fenomenológicos estruturados Entende-se por crescimento balanceado o crescimento microbiano no qual a velocidade de produção de um componente da biomassa por unidade de biomassa é constante, igual para todos os componentes da biomassa e igual à velocidade específica de crescimento da própria biomassa. Somente nessa condição de crescimento é que a formulação de modelos não estruturados é perfeitamente justificada. Na prática o crescimento balanceado só ocorre no estado estacionário em fermentações contínuas e durante a fase exponencial de crescimento em fer- ! ~ II ·- .. J 148 Modelagem matemática e simulação de processos fennentativos mentações em batelada. Dessa forma, na maioria dos casos, a caracterização da atividade biológica simplesmente pela concentração total de biomassa é insuficiente para uma representação adequada de dados experimentais ·pelo modelo matemático formulado. 40' 41 ' 42 Vários experimentos têm mostrado que a composição da biomassa de uma população microbiana varia em resposta a alterações nas condições do ambiente. Variações na composição da biomassa são acompanhadas por alterações na natureza de processos subcelulares. Essas variações na atividade da biomassa por unidade de concentração de biomassa podem ser causadas por: • perda de plasmídeos; • indução e repressão de genes; • variação no conteúdo de RNA da célula microbiana; • variação no conteúdo enzimático da célula microbiana; • acúmulo de materiais de reserva da célula microbiana; • alterações morfológicas, por exemplo ramificação de organismos filamentosos, relação volume/superfície de células de leveduras e bactérias, etc. Essas variações na atividade e composição da biomassa microbiana requerem uma descrição mais complexa do metabolismo celular e uma estratégia mais estruturada para modelar a cinética microbiana. Em geral, é muito difícil obter experimentalmente um conhecimento mecanístico, a respeito do metabolismo celular, para o desenvolvimento de um modelo estruturado "realista". A estimativa de parâmetros pode ser muito difícil e a aplicação de métodos numéricos complexos pode facilmente levar a resultados sem significado físico. Por esse motivo, modelos estruturados de processos fermentativos raramente são utilizados com vistas à utilização no projeto de biorreatores e na implementação de uma estratégia de controle. Além das dificuldades acima expostas, um cuidado adicional deve ser tomado na formulação dos modelos estruturados, quando da montagem das equações de balanço para os componentes intracelulares - deve ser considerado um termo • de diluição do componente provocado pelo crescimento celular. 43 Não serão apresentados mais detalhes dos modelos estruturados de processos fermentativos, em função da sua complexidade e das questões práticas já apontadas, que dificultam sua utilização. O leitor interessado poderá encontrar na literatura especializada excelentes revisões e textos que lhe permitirão aprofundar seus conhecimentos nessa categoria de modelos.43 7.3 - Ajuste de parâmetros do modelo formulado Em um processo fermentativo, conduzido num biorreator homogêneo, o modelo formulado, conforme detalhado no item anterior, é representado por equações matemáticas do tipo equações diferenciais ordinárias de condição inicial (EDO). O ajuste do modelo aos dados é feito pelo cálculo do melhor conjunto de parâmetros, que tornam mínima a diferença entre os dados previstos pelo modelo e os dados experimentais. O problema de estimação de parâmetros em EDO pode ser resolvido, em princípio, por duas abordagens distintas:44 Ajuste de parâmetros do modelo formulado 149 • diferenciação dos dados experimentais, para obtenção direta dos valores das velocidades de reação; neste caso, transforma-se o problema em um de estimação com equações algébricas- é o chamado "método diferencial"; dependendo do modelo, as equações podem ser linearizadas, facilitando a obtenção dos parâmetros (vide item 7.3.1); • integração analítica (quando o modelo é simples) ou numérica das EDO do modelo, ajustando-se o modelo aos dados diretamente medidos- é o chamado "método integral indireto" (vide itens 7.3.2 e 7.3.3). A primeira técnica é conceitualmente simples, mas apresenta um inconveniente bastante sério na operação de diferenciação de dados experimentais. Essa operação costuma ampliar drasticamente os erros experimentais, levando a valores pouco confiáveis das derivadas, especialmente se o conjunto de dados não for denso e se a dispersão dos dados não for pequena. A segunda técnica é conceitualmente mais adequada, mas requer maior esforço computacional. 7.3.1 - Linearização do modelo Essa técnica, conceitualmente simples, de ajuste de parâmetros de um modelo matemático de um processo fermentativo, exige a diferenciação dos dados experimentais, obtendo-se valores das velocidades específicas de crescimento e/ ou produção. Se for tomado como exemplo um crescimento microbiano num biorreator operado em batelada e que obedece à cinética de Monod, obtém-se o seguinte modelo matemático: (7.41) dS 1 dt = ; Yx;s dX dt (7.42) Nesse modelo existem 3 parâmetros a serem ajustados a um conjunto de dados experimentais: Jlm, K 5 e Yx;s· Esse ajuste pode ser obtido através de 2 regressões lineares. A primeira correlaciona o inverso da velocidade específica de crescimento (1/J.t)o com o inverso da concentração de substrato (1/5) 0 no instante inicial, conhecido como o gráfico de Lineweaver-Burk, onde o coeficiente angular é igual a (K5 /Jlm) e o coeficiente linear a (1/J.tm) (Fig. 7.8) . Geralmente, sugere-se construir o gráfico de Lineweaver-Burk a partir de valores iniciais de 1 I Jl e 1 I S obtidos para diferentes ensaios (nos quais é determinada a velocidade específica de crescimento inicial para diferentes valores de S no instante inicial), visando reduzir possíveis efeitos inibitórios de produtos metabólicos gerados durante o crescimento microbiano, na velocidade específica calculada. É claro que, se o intuito for determinar a existência ou não desses efeitos, é interessante traçar o gráfico de Lineweaver-Burk a partir de um ou mais ensaios, mas considerando relações entre 1/Jl e 1/S em diferentes tempos de crescimento. L ___ _ I SÓ Modelagem matemática e simulação de processos fermentativos A partir do gráfico da Figura 7.8 é possível obter a estimativa dos valores de 1 Jlm e Ks. 25~--------------------------~ 20 ~ 15 .! ..... 10 y = 1,7112x + 3,3244 R2 = 0,992 5 o+--------.-------.---------l o 10 5 15 1/S (Ug) Figura 7.8 - Gráfico de Lineweaver-Burk para o cálculo de 1-lm e Ks para o crescimento em batelada segundo o modelo cinético de Monod. Os dados do gráfico são apenas ilustrativos, não refletindo valores obtidos experimentalmente. Jlm = 1 =0 301 h-1 3 3244 1 I ' Ks =1 17112 *Jlm =01515g/L A segunda regressão linear para ajuste dos parâmetros do modelo proposto correlaciona os dados disponíveis de X produzido em relação ao consumo de S para diferentes intervalos de tempo. O coeficiente angular dessa correlação é igual ao parâmetro Yx;s (Fig. 7.9). A regressão linear representada no gráfico da Figura 7.9 permite obter o va. lor de Y x;s: Yx;s = 01545g I g • obtido sendo que o coeficiente linear da regressão deveria ser nulo; o valor 0 076 reflete imprecisões do modelo e erro experimental inerente a dados obtidos em laboratório. 1 120 100 ::J :§ 80 o 60 X ' >< 40 y = 0,545x + 0,076 20 o R2 = 0,991 o 100 200 300 SO- Si (g/L) Figura 7.9 - Gráfico para obtenção de Yx;s· Os dados do gráfico são apenas ilustrativos, não refletindo valores obtidos experimentalmente. Ajuste de parâmetros do modelo formulado I5 I DOWD; RIGGS 45 avaliaram estatisticamente qual a melhor forma de linearizar a equação de Michaelis-Menten para a cinética enzimática, aplicável, por analogia, ao ajuste do modelo de crescimento segundo Monod. Propuseram 3 formas diferentes de linearização: (7.43) (7.44) (7.45) Nesse estudo estimativas de K5 e J.lm, obtidas a partir de "dados experimentais" (construídos introduzindo um erro aleatório em dados simulados), são comparadas em cada caso com os seus valores verdadeiros (utilizados na simulação para obtenção dos dados sem erro), de modo que o comportamento das transformações (7.43) a (7.45) foi avaliado. O resultado dessa análise pode ser assim sintetizado: • obter estimativas de J.lm e K5 pelo método de Lineweaver-Burk (3." transformação) eram destacadamente as menos confiáveis, qualquer que fosse o erro na determinação de J.t; . • plotar (SI J.l) contra (S) é ligeiramente melhor do que plota~ (J.t) contra (J.t/ S), quando o erro nos valores de J.l é pequeno, mas o inverso ocorre quando o erro de J.l é grande (situação que geralmente ocorre nos processos fermentativos); • plotar (J.t) contra (J.t/ S) tem a vantagem adicional de avisar o pesquisador quando os seus dados desviam da relação teórica visto que, normalmente, este ajuste exagera esse desvio; • utilizar a transformação de Lineweaver-Burk leva à obtenção de um bom ajuste, mesmo com pontos não confiáveis - esta pode ser a justificativa para a popularidade desta transformação. EXEMPLO NUMÉRICO- ETAPA 4 Ajuste para o modelo de fermentação alcoólica 18.1 9 a partir de hidrolisado de mandioca em um sistema batelada. O modelo matemático não estruturado, proposto após a identificação dos principais fenômenos envolvidos no processo (vide discussões nas etapas 2 e 3), é composto pelas eqs. (7.46) a (7.50). (7.46) 'I r 'r I I I :i I, 'l I I 52 Modelagem matemática e simulação de processos fermentativos dS= dt {1 1 ) (7.47) --flxX +--flpX Yx;s Yr;s dP (7.48) -=flpX dt onde: (7.49) fl p = flraS -K' P (7.50) 52 e " K 5' +5+K~ I A seguir será exemplificada a obtenção da estimativa preliminar dos parâmetros através da linearização e simplificação do modelo, e seu ajuste aos dados experimentais (Tab. 7.1). (1) Estimativa de KP e K~ A partir das equações (7.49) e (7.50), obtém-se: • (7.51) (7.52) onde: f.!: e fl~· são os termos funções de Sem flx e f.!p, quando Sé constante. Para um valor de S constante, por exemplo, S = 10g/L (utilizando o mesmo procedimento exemplificado na Etapa 3 para identificação do tipo de inibição pelo produto) são traçados os gráficos de ln(f.!x) vs. P (Fig. 7.6(A)- Etapa 3) e ln(f.!p) vs. P (Fig. 7.10) com os dados de flx, flp e P correspondentes a esse valor de S nos 4 ensaios disponíveis. Os coeficientes angulares das retas ajustadas são as estimativas de KP e K~. Pela metodologia proposta, torna:-se evidente que a estimativa obtida será tão mais precisa quanto maior for o número de ensaios disponíveis. 153 Ajuste de parâmetros do modelo formulado 0,8 . , - - - - - - - -- -----, 0,7 0,6 ~ 0,5 ~ 0,4 0,3 • 0,2 ~ .0, 1 y = 0,0142 X + 0,0219 R2 = 0 ,9674 o+----.~~~~~-~ o 20 40 60 p (g/L) Figura 7 .I O - Gráfico para obtenção da estimativa de K~ . (2) Estimativa de 1-lxa, K5, 1-lPa e K ~ Para um ensaio com valores de 5 suficientemente baixos (Ensaio 1, por exemplo), é possível desconsiderar a existência dos termos de inibição das velocidades específicas de crescimento e produção pelo substrato (eqs. 7.49 e 7.50, termos 5 2 I K; e 5 2 I Ki). Dessa forma, é possível linearizar essas equações. e -KPP Ks 1 1 --=---+-1-l x 1-lxa 5 1-l xa (7.53) Ks e -K~P 1· 1 - - = - - - + -1-lp 1-l Pa 5 1-l Pa (7.54) Com os valores de KPe K~ estimados no item ,anterior, é possível traçar os gráficos de (e-K PP I 1-lx) vs. (1/5)- Fig. 7.11(A) e (e -KPP /~-t p ) vs. (115)- Fig. 7.11(B), com os dados de P, 5, 1-lx e 1-lP disponíveis para o Ensaio 1. Os coeficientes lineares e angulares das retas ajustadas fornecerão as estimativas de 1-lx., K5, 1-lPa e K ~. (A) 160 140 120 )( ~ 100 a.. a. 80 60 a. )( 40 Ql 20 (B) 70 g 60 fl-~ Q.OJ li:::-- 40 l~ f o n. ~ a. )( Ql y = 8,3514x + 2,2624 R2 = 0,9975 o 10 50 30 20 y = 3,3837x + 0,9144 R2 = 0,9978 10 20 o o 1/S (Lig) 1/S (Lig) Figura 7 .li - Gráficos para obtenção das estimativas de (A): f.!x. e 10 Ks e (B): f.!ra e K~. 20 Modelagem matemática e simula~o de processos fermentativos 154 (3) Estimativa de Ki e Ki Para um ensaio com valores de S suficientemente elevados (início do Ensaio 4, por exemplo), é possível desprezar os valores de K5 e K~ nas equações das velocidades específicas (eqs. 7.49 e 7.50). Dessa forma, é possível linearizar essas equações. e ~KP P 1 f.lx Kifl xa --- 1 S+- (7.55) f..lxa e -K~ P 1 1 --=--5+f.lp Kif-lPa (7.56) flPa Com os valores de Kp e K~ estimados anteri9rmente, é possível traçar os gráficos de (e -K.P I f.l x) vs. S - Figura 7.12(A) e (e -K.P I f.lp) vs. S - Fig. 7.12(B) com os dados de P, S, f.lx e f.lp disponíveis para valores elevados de S no início do Ensaio 4. Os coeficientes angulares das retas ajustadas fornecerão as estimativas de Ki e Ki, considerando os valores de f.lxa e f.lra estimados novamente através dos coeficientes lineares das retas ajustadas. (B) (A) 3 ;s ~ 2,5 >< ~ 2 ~ 1,5 11.. a. :I. ~Oi ~:c; ...!.,.. iCl a. ~~ X Q) y = 0,0037 X + 1 ,6498 R2 = 0,9541 0,5 o o 100 200 300 a. X Q) 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 . o o S (g/L) /. y = 0,0123x + 0,6599 R2= 0,9151 100 200 300 S (g/L) Figura 7.12 - Gráficos para obtenção das estimativas de (A): K; e (B): Kí . (4) Estimativa de Y x1s e Yp1s Na construção do modelo assumiu-se que Yp 15 é um parâmetro fixo e igual a 0,511 (conversão estequiométrica de glicose em etanol) . Dessa forma, todas as "ineficiências" do sistema estarão incluídas no valor de Yx 1s estimado. A estimativa de Y x1s é obtida correlacionando o L1X produzido com o l1Sx consumido (substrato consumido para produzir X, obtido descontando do total de substrato consumido o substrato consumido para produzir P) para os 4 ensaios disponíveis. Ajuste de parâmetros do modelo formulado 155 A Figura 7.13 apresenta o gráfico de (L1X) vs . (L1Sx), cujo coeficiente angular da reta que passa pela origem, fornece a estimativa de Yx;s· A Tabela 7.5 apresenta o resultado da estimativa dos parâmetros para o modelo matemático da fermentação alcoólica do hidrolisado de mandioca operada em batelada, ajustado preliminarmente aos dados experimentais disponíveis (Tab. 7.1). i ~ -9 ô >< ' 8. 35 • 30 25 20 15 10 5 o y = 0,2158 X R2 = 0,9399 o 100 50 (S 0 - 150 S;).(g/L) Figura 7.13 - Gráfico para obtenção da estimativa de YXJS · 7.3.2 - Integração analítica do modelo Essa técnica para estimativa de parâmetros só é aplicável para casos em que o modelo matemático é bastante simples, permitindo uma integração analítica do seu sistema de equações diferenciais ordinárias. ONG46 desenvolveu o ajuste de parâmetros para um crescimento microbiano num biorreator operado em batelada e que obedece à cinética de Monod (eqs. 7.41 e 7.42). Integrando a eq. (7.42) obtém-se: (7.57) X=X 0 +Yx;s (5 0 -S) Substituindo as eqs. (7.41) e (7.57) na eq. (7.42), rearranjando e integrando, obtém-se: s s J t Ks+ dS=-J.lm Jdt s o S[Xo +Yx; s(So -S)] Yx; s o !1n~ = b t 50 {In [1 + a(S 0 - S)]} _ d (7.58) (7.59) t onde: Yx;s a=-Xo (7.60) 156 Modelagem matemática e simulação de processos fermentativos b =1 + _(X_o_+_Yx--';-_sS_o_) Yx;sKs (7.61) d = llm (Xo + Y x;sSo) (7.62) Yx; sKs Portanto, b e d podem ser obtidos por regressão linear (da eq. 7.59) desde que se conheça a. Tabela 7.5 - Estimativa preliminar dos parâmetros do modelo obtidos por linearização e simplificação do modelo. Parâmetro Valor estimado llxa (h-1) 0,524(a) J.lra (h-1) 1,305(a) Ks (g/L) 3,69 K's (g/L) 3,70 Ki (g/L) 446 ' K'1 (g/L) 53,7 l5. KP (L /g) 0,0442 K'p (L /g) 0,0142 Yx/s (g/g) 0,216 ·'" Yp/s I;' I I'<" ~ ~~ 0,511 (fixo) (g/g) ,. (a) Média dos valores estimados quando da estimativa .. de K5 , K~ .. e Ki, Kj. - ' ' .•,; -. " c Estatisticamente, uma regressão linear pode ser avaliada pelo valor do coeficiente de correlação r, dado por: (7.63) onde: n ... número de pares de pontos (x, y) a serem ajustados ln [1 +a(5 0 - S)] X= - - - - - - = - - t . (7.64) Ajuste de parâmetros do modelo formulado ln (S- 5 0 ) y=--_____;;- I 57 (7.65) t A solução do ajuste de parâmetros do modelo (J..lm, K5 e Yx;s) reduz-se, então, à solução do seguinte problema de otimização: "Minimizar a função objetivo: -r2 = f (a), sujeita às condições a > Oe eq. (7.64) e (7.65)". Os valores de b e d sãb obtidos pelas equações: b = (nLxy- LXLY) nLx 2 -(LX) 2 d = (Ly- bLx) n (7.66) (7.67) Assim como o método de ajuste do modelo por linearização, esse método por integração também deve ser utilizado com muito cuidado, pois também resume o problema de estimativa de parâmetros numa linearização por transformação de variáveis. Há alguns sérios inconvenientes em usar transformações de variáveis, entre os quais podemos destacar: • as faixas de variações de logaritmos (por exemplo, utilizados na transformação de variáveis) podem ser muito diferentes das faixas de variações das variáveis de origem (no caso dos logaritmos, muito menores); • ao utilizar a equação linearizada, o que estará sendo minimizado é a diferença quadrática (quando esta for a forma de cálculo dos resíduos) entre a forma transformada "experimental" e a calculada; os parâmetros assim obtidos não serão 'necessariamente ótimos em relação aos desvios da variável original; . · - -. • as variáveis transformadas podem não preservar as propriedades da distribuição de erros das variáveis originais do problema, o que pode constituir uma objeção muito séria sobre a validade do procedimento. 47 AUGUSTO et al. tentaram utilizar o ajuste de parâmetros por regressão linear a partir da integração do modelo, aplicado ao crescimento microbiano obedecendo à cinética de Andrews, sem conseguir bons resultados pelos motivos expostos acima. 7.3.3 - Integração numérica e ajuste por regressão não-linear A estimação de parâmetros recai, na grande maioria dos casos, em problema ~ de regressão não-linear, envolvendo o uso de métodos numéricos de minimização da função objetivo através de procedimentos iterativos. 48 No caso do ajuste de parâmetros, a função objetivo a ser minimizada reflete o resíduo calculado entre os valores experimentais e os valores simulados das variáveis de estado. Os problemas freqüentemente encontrados ao efetuar regressões não-lineares são: • aproximação numérica de derivadas parciais; 158 Modelagem matemática e simulação de processos fermentativos • obtenção de uma estimativa inicial adequada dos parâmetros; • existência de mínimos locais na função objetivo, isto é, a função resíduo apresenta · diversos valores mínimos, que atraem a solução do método de regressão empregado, dificultando a convergência para o mínimo absoluto; • a própria escolha da função objetivo mais adequada (mínimos quadrados, máxima verossimilhança, etc.); • interação entre parâmetros, o que pode levar a grandes intervalos de confiança dos parâmetros. Este último problema é ainda mais acentuado quando o modelo contém expressões hiperbólicas, e este é freqüentemente o caso em processos fermentativos -por exemplo, modelos derivados da expressão de MONOD. 49 Entre os métodos disponíveis para resolver problemas de ajuste de parâmetros por regressão não-linear podem ser citados: 50' 51 • Métodos de ordem "0". Métodos que não exigem o cálculo das derivadas das EDO em relação aos parâmetros do modelo. O método de ordem "O" mais utilizado é o de Nelder & Mead ou método dos poliedros flexíveis. • Métodos de 1." ordem. Métodos que necessitam do cálculo das derivadas das EDO em relação aos parâmetros do modelo. Os métodos de t.• ordem mais conhecidos são os de Gauss-Seidel, Gradiente e Marquardt, 52 sendo este último o mais empregado no ajuste de parâmetros de modelos matemáticos pela sua alta eficiência computacional. Entretanto, o método de Nelder & Mead tem se mostrado mais efetivo em comparação ao método de Marquardt, quando o número de parâmetros a serem estimados é muito grande, casá c:,ios modelos matemáticos de processosfermentativos. Por es~e motivo, será detalhado apenas o método de Nelder & Mead de otimização para estimativa de parâmetros por regressão não linear. • 7.3 .3. 1 - Métodos dos poliedros flexíveis (NELDER & MEAD?' Há muito tempo sabe-se que determinar o mínimo de funções de n variáveis pelo conceito mais simples- caso do estabelecimento de uma rede de pontos em e valorando-se a função em cada ponto desta rede, ou a busca de um mínimo através de movimentos randômicos - é extremamente ineficiente. O método de Nelder & Mead é um método simplex geométrico flexível, conhecido como o método dos poliedros flexíveis. O método dos poliedros flexíveis minimiza uma função de n variáveis independentes, usando (n+l) vértices de um poliedro no espaço En ~ Cada vértice é definido por um vetor x (neste caso, por um conjunto de parâmetros). O vértice em que fornece o maior valor da função objetivo (neste caso o maior resíduo entre as variáveis calculadas e as variáveis experimentais) é projetado através do centro de gravidade dos vértices remanescentes. Melhores (menores) valores da função objetivo são obtidos, substituindo, sucessivamente, o ponto com maior valor de f(x) por pontos melhores, até se obter o mínimo de f(x). e e I 59 · Ajuste de parâmetros do modelo formulado Sejam: i=1, ... ,n+1 i-ésimo vértice em f e no k-ésimo estágio da busca [!~k) ] valor da função objetivo no vértice <k) !~~)2 centro de gravidade de todos os vértices excluído !hk) x<k) . - n+2,J =_!_~(~x~k))-x<~>] n L. IJ hJ j = 1, ... , n (7.68) i=l onde o índice "j" designa cada coordenada do vértice. O procedimento para obter um vértice em En no qualf(x) tem um valor "melhor", envolve 4 operações descritas a seguir. (1) Reflexão: Refletir !hk) através do centro de gravidade !~~)2 x<k) = x<k) +a(x(k) - x<k)) -n+3 - n+2 -n+2 (7.69) -h onde a > O ... é o coeficiente de reflexão. x<k) =x(k) +y(x(k) -x(k ) ) -n+4 - n+2 -n+3 (7.70) -n+2 onde y > 1 ... é o coeficiente de expansão. Se f [!~:_>4 ]<f [!\k) 1 substituir!~) por !~l 4 e continuar do passo (1) com k = k+l. Caso contrário, substituir!~) por !~l 3 e continuar do passo (1) com k = k+l. ~-. ·-·· -o- -· ---··- ----- --,--~-- --- -· -·-:--- -- --------- -- -........ ,, ______ .. - •. .-·-. I I I _______j I 60 Modelagem matemática e simulação de processos fermentativos (3) Contração: Se f L!.~:l ]>f [!~k) 1 para todo i =t h, contrair o vetor (!hk) - !~:)2 ), calculando: 3 x(k) -n+S = x(k) -n+2 + A(x(k) _ x(k) 1-' -h -n+2 (7.71) ) onde O f[!hk)] reduzir todos os vetores (!~k) -!\kl), n+1, por um fator de meio, a partir de !\k), calculando: x\k) =x(k) -1 -1 +0 S(x\kl -x(k)) I -1 -1 i= 1, ... , n+1 i= 1, 2, ... , (7.72) e continuar do passo (1) com k = k+l. O critério usado por Nelder & Mead para término da busca, consiste em verificar se: (7.73) isto é, a convergência ocorre se a raiz quadrada da média dos quadrados das diferenças entre a função objetivo calculada em cada vértice e a função objetivo calculada no centro de gravidade for menor que um determinado valor s. A Figura 7.14 apresenta um fluxograma que ilustra a aplicação do método dos poliedros flexíveis para a solução de um problema de otimização. Os valores de a, p e y recomendados por Nelder & Mead são: a = 1, p = 0,5 e y = 2. Na prática observa-se, entretanto, que seria necessário ajustá-los caso a caso. PICCOLI et al. 53 estabeleceram os seguintes valores ao ajustar modelos com 9, 13 e 24 parâmetros: a= 1,0, p = 0,8 e y = 1,5. 47 Trabalho recente de AUGUSTO et al. buscou comparar a aplicação do método de regressão não-linear sem cálculo de derivadas (poliedros flexíveis de Nelder & Mead), e com cálculo de derivadas (Marquardt), ao ajuste dos parâmetros de dois modelos de processos fermentativos. Para um processo descontínuo de crescimento microbiano com um único substrato limitante e inibitório (modelo com 4 parâmetros), a metodologia de Marquardt levou a um ajuste satisfatório para um maior número de casos (por "caso" entendem-se diferentes formas de cálculo do resíduo e diferentes estimativas iniciais dos parâmetros) em relação ao método dos poliedros flexíveis; no que se refere ao tempo de processamento, o método de Marquardt, como era de se esperar, mostrou ser muito mais eficiente na grande maioria dos casos testados. Para um processo que, além dos fenômenos descritos no caso anterior, apresenta também a formação de um produto metabólico associado e não associado ao crescimento, e que inibe o processo (modelo com 8 parâ- Ajuste de parâmetros do modelo fonnulado 161 metros), quando a mesma forma de cálculo dos resíduos for empregada, o método dos poliedros flexíveis produziu um maior número de ajustes satisfatórios em relação ao método de Marquardt. Como os modelos matemáticos de processos fermentativos têm, geralmente, um número de parâmetros maior do que 8, a metodologia apresentada para ajuste, por regressão não linear, dos parâmetros (poliedros flexíveis), está de acordo com este resultado. maior F.O. = Pior vértice menor F. O. = Melhor vértice Parâmetro 0,1 <Beta< 0,9 Substituir o pior vértice pelo vértice da reflexão N FIM Figura 7.14 - Fluxograma ilustrativo do método dos poliedros flexíveis I 1 li Um aspecto que se tem mostrado crucial no ajuste de parâmetros por diferentes métodos de regressão não linear é o da definição da função objetivo, isto é, j -l ..J 162 Modelagem matemática e simulação de processos fermentativos a forma de calcular o resíduo entre os valores calculados pelo modelo e os valores experimentais. 54 A Tabela 7.6 apresenta várias formas possíveis para o cálculo dos resíduos entre os valores calculados e os valores experimentais indicando, quando for o caso, os problemas observados quando da sua utilização. Na Tabela 7.6 são indicadas as fórmulas para cálculo dos resíduos que apresentaram melhores resultados. Sabe-se, entretanto, que a melhor fórmula para cálculo do resíduo depende do método de ajuste e também da estimativa inicial dos parâmetros empregada. Tabela 7.6 - Diferentes fórmulas para cálculo dos resíduos . Fórmula de cálculo Número Variáveis com elevado valor absoluto privilegiadas no ajuste. 1 R= LÜli 2 R = L ( _jfj__jfj_r - i i -yY (yi )m Problemas na utilização (y; )m Tendência a ajustar melhor as variáveis próximas aos valores máximos. 3 R=L(Yi:Y;r i Yi Resíduos muito elevados para valores muito pequenos da variável calculada 4 R=L(yi-Yir i Yi Resíduos muito elevados para valores muito pequenos da variável experimental. R= 5 [ J y~ -yi ~ <y?') Resíduos elevados para valores muito pequenos e diferentes das variáveis calculada e experimental. 6 Idem fórmula "5", R só é calculada quando Yi > e(yi )m - 7 R =:E /r -1/ +:E/a -1/ (r e a são calculados para cada variável e para cada ensaio) - 8 R =/r -1/+ /a-1/ (r e a são calculados com todas as variáveis normalizadas e todos os ensaios ajustados por uma única reta.) - R ... resíduo Yi ... valor experimental da variável Yi ... valor calculado da variável (yi)m ... máximo valor da variável experimental r ... coeficiente de regressão linear entre as variáveis experimentais e calculadas a ... coeficiente angular combinado entre as variáveis experimentais e calculadas. ' Ajuste de parâmetros do modelo formulado 163 EXEMPLO NUMÉRICO-ETAPA 5 Nessa etapa do exemplo é apresentado o ajuste, por regressão não-linear, utilizando o método dos poliedros flexíveis, do modelo matemático (eqs. 7.46 a 7.50- etapa 4 do exemplo numérico) da fermentação alcoólica de hidrolisado de mandioca em um sistema batelada. O modelo é ajustado simultaneamente ao conjunto de 4 ensaios experimentais, ilustrados na Tabela 7.1. O ajuste global dos ehsaios 1 a 4 (Tabela 7.1) será realizado pelo método de regressão não-linear de ordem "O" - método dos poliedros flexíveis, utilizando um software desenvolvido em linguagem Fortran. As principais características do ajuste realizado e o resultado obtido são listados a seguir. (1) Parâmetros do método: • a= 1,0 • f3 = 0,8 • y = 1,5 • e< 10-5 (convergência). (2) Parâmetros ajustados: 9 (J.tx., J.lr., K5, K~, Ki, Kj, KP, K~, Yx 15 ). (3) Parâmetros fixos do modelo: 1 (Yr 15 ). (4) Estimativa inicial dos parâmetros empregada: resultado do ajuste preliminar dos parâmetros (Tab. 7.5). · (5) Fórmula de cálculo do resíduo empregada: "fórmula 6" (Tab. 7.6). (6) Valor do resíduo com a estimativa preliminar dos parâmetros - condição inicial do programa de ajuste: • Resíduo= 24,1 • Coeficiente angular da regressão linear entre todos os valores calculados e experimentais = 0,923 • Coeficiente de correlação da regressão linear entre todos os valores calculados e experimentais= 0,928. (7) Resultado do ajuste obtido: • Número de iterações = 971 • Resíduo = 1,43 • Coeficiente angular da regressão linear entre todos os valores calculados e experimentais = 1,00 • Coeficiente de correlação da regressão linear entre todos os valores calculados e experimentais = 0,990. • Valores dos parâmetros (Tab. 7.7) A Figura 7.15 ilustra a qualidade de ajuste obtido para o Ensaio 4. Para os outros 3 ensaios o resultado é semelhante, como pode se:r atestado pelo valor do resíduo obtido. · '!!ri lj fi I ~ J:j 1 j 1 li J:J fl r1 ''i 11 I! I' d ii [I lj I i ' l 164 Modelagem matemática e simulação de ·processos fermentativos Tabela 7.7 - Valores dos parâmetros do modelo obtidos por regressão não -linear aplicando o método dos poliedros flexíveis. Valor estimado Parâmetro 1 ) 0,672 ) 2,08 K5 (g/L) 6,16 ..j Ks (g/L) 7,88 fl K; (g/L) Ki (g/L) KP (l/g) 347, { 37,4 ~i J..lxa (K 1 J..lpa (h- I' )! 0,0153 0,215 Yx;s (g/g) ,.,,,.... , '"'}.:!? 15 (g/ g) .. "·' •1 0,0436 K~ (l/g) , .. ~i..... . ' .. 0,511 (fixo) .. ·;.,·,;r;,· '"''' '.\·;'_·- ~- - ' . _;(" -,'.1.1;::.1 7.4 - Avaliação do modelo matemático A última etapa do processo de formulação e ajuste de um modelo matemático fenomenológico consiste na realização de uma análise estatística que visa validar o modelo, seguida da identificação da necessidade de realizar novos experimentos no laboratório, para aprimorar o conhecimento do processo, visando melhorar a qualidade do modelo. Ensaio 4 :::J :§ [l_ x 70 60 50 40 30 20 10 250 200 150 :::J 100 (/) :§ • 50 5 10 15 o Tempo (h) Figura 7 .I S - Resultado do ajuste global dos ensaios (Tab. 7 .I) utilizando o método dos poliedros flexíveis ilustrado para o Ensaio 4. Os pontos indicados são os pontos experimentais (+ X , .Â. P, S) e as curvas foram traçadas utilizando o modelo (equações 7.46 a 7.50) com os parâmetros indicados na Tab. 7.7. * 7.4. I - Análise estatística O ajuste dos parâmetros do(s) modelo(s) proposto(s) a um conjunto de ensaios experimentais é normalmente avaliado e considerado satisfatório ou não, por simples inspeção visual do conjunto de ensaios, além da análise do resíduo mínimo obtido (conforme descrito no item anterior deste capítulo). Essa avaliação é Avaliação do modelo matemático 1·65 tanto mais válida, na medida em que for levada em conta a falta de reprodutibilidade e o grande erro experimental inerente aos processos biológicos. Apesar dessa constatação, é importante submeter os ajustes obtidos a uma análise estatística específica, com dois objetivos básicos: • verificar se é possível discriminar um ou mais modelos propostos em relação aos outros, nos casos em que foi possível ajustar mais de um modelo matemático ao conjri.nto de dados experimentais disponíveis (teste do x2 de Bartlett); • verificar se o(s) modelo(s) remanescente(s) representam adequadamente o conjunto de dados experimentais disponíveis (teste F e teste de randomicidade). 7.4.1 . 1 - Teste do X2 de BARTLETI55 Para saber se há modelos não adequados, entre um conjunto de modelos ajustados, testa-se a homogeneidade das estimativas do erro experimentat ou seja, testa-se se o valor da variância de algum modelo é estatisticamente diferente dos demais. Isso é feito usando o teste do x2, calculando o x ~ale através da fórmula de Bartlett: 2 2 Xcalc = 1+ onde: m I m ln(s ) ~)d. f.L - ~)d.f. )i (st) i=l i=l 1 ! - 1 _ m 1 3(m -1) i=l (d.f.L ~(d.f.)i I (7.74) sf ... estimativa da variância do Modelo "i" y <k) ... valor experimental y~k) ... valor calculado (Mod."i") 52 •• • estimativa combinada da variância m L(d.f.)isf 52 = .: . i=-=1_ __ m L:<d.f.)i i=l (d.{); = n- p; ... graus de liberdade Modelo "i'; n ..... número de pontos experimentais i I I I I .I 'U 166 Modelagem matemática e simulação de processos fermentativos Pi .... número de parâmetros Modelo "i" m ..... número de modelos ajustados. Se X~ale > x~ab (a, m - 1) ... o modelo ao qual corresponde o maior valor de s ~ é descartado, e assim sucessivamente, até restar apenas 1 modelo; o valor de X~ab(a, m-1) é obtido em tabelas estatísticas 56 onde é o nível de significância escolhido (geralmente 5%). Se x ~ale <X ~b (a, m -1) ... nenhum dos modelos pode ser descartado; faz-se novos experimentos, até ser possível definir a não adequação de algum modelo pelo critério do x2 • 7.4.1.2 - Teste F51 A análise estatística realizada no item anterior não garante que o(s) modelo(s) aprovados representem satisfatoriamente o conjunto de ensaios ajustados. Para obter esse resultado utiliza-se o Teste F, que se baseia na obtenção do chamado "erro experimental", obtido a partir de uma série de repetições do mesmo ensaio (ensaio padrão). Essa estimativa do "erro experimental" deve levar em conta, entre outros, a falta de reprodutibilidade de processos fermentativos (devida principalmente à influência da "história" da população microbiana), a dificuldade em manter condições homogêneas dentro do biorreator e os próprios erros analíticos e de amostragem corriuns na atividade laboratorial. Para a avaliação do erro experimental, deve ser feito um certo número de experimentos repetidos, em pelo menos uma condição experimental. Assim, definindo~se Fcaic como a relação entre o erro obtido pela falta de ajuste e a estimativa do erro experimental, obtém-se para a formulação do Teste F: (7.75) • onde: s~ ... estimativa da variância do erro do Modelo n ... número de pontos por variável v ... número de variáveis (concentrações de células, produtos e substratos) (nv) c ... número de pontos ajustados (para todos os ensaios e variáveis) p ... número de parâmetros do Modelo ·yij ••• valor da variável calculado pelo Modelo y ij ... valor experimental da variável. Avaliação do modelo matemático 167 s; ... estimativa da variância do erro experimental v n LL(Yii s 2 -yJ 2 i=l j=l =------ (nv)e-v e (nv)e ... número de pontos experimentais (para todos os ensaios repetidos yi ... e variáveis) média da variável para os ensaios repetidos. Como o valor da distribuição F, Ftab[a,(nv)c -p,(nv)e -v]~1 (quando a= 5%, (nv)c ~ oo e (nv)e ~ oo) 56 uma vez que (nv)c e (nv)e são, normalmente elevados, então para que o modelo represente adequadamente os dados experimentais ajustados (ou, em outras palavras, não apresente falta de ajuste), é necessário que: ou 7.4.1.3 - Teste de randomicidade 57 O teste de randomicidade é útil na verificação de eventuais tendências no ajuste de um modelo matemático a um conjunto de dados experimentais. Os resíduos verificados entre os dados experimentais e os dados do modelo podem ser positivos ou negativos, mas se eles são verdadeiramente aleatórios, o sinal dos mesmos deve mudar de maneira randômica. Essa randomicidade, ou ausência da mesma, pode ser detectada visualmente plotando, por exemplo, os resíduos versus a variável independente (tempo), ou versus as variáveis dependentes (variáveis de estado). A seguir, revisaremos alguns conceitos estatísticos necessários para o entendimento do teste. Distribuição normal: distribuição contínua de probabilidades, também chamada de distribuição gaussiana; é dada por: _ - 1- e -(y-y)' /2cr f( y) - 2 (7.76) cr-fbr onde: y ... média da distribuição cr ... desvio padrão da distribuição. Variável Z: variável padronizada correspondente a y; que possui média O e desvio padrão 1 e, portanto, é dada por: y-y Z=-cr (7.77) 168 Modelàgem matemática e simulação de processos fermentativos Nível de significância: ao testar uma hipótese, a probabilidade máxima com que desejamos arriscar um erro do tipo 1 (rejeitamos a hipótese quando ela deveria ser aceita) é chamada nível de significância do teste; na prática costuma-se adotar um nível de significância de 0,05 ou de 0,01, embora outros valores possam também ser usados; no caso do teste de randomicidade será adotado um valor de 0,05 para o nível de confiança. Região crítica: conjunto de valores de Z exteriores ao intervalo de -1,96 a 1,96. Região de aceitação: conjunto de valores deZ interiores ao intervalo de -1,96 a 1,96. A randomicidade dos resíduos entre os valores das variáveis calculadas, utilizando o modelo ajustado e os valores experimentais é quantificada, medida e testada segundo o procedimento descrito a seguir. Definindo: N 1 ••. número de resíduos positivos (Ycalc > Yexp); N 2 ••• número de resíduos negativos (Ycalc < Yexp); R ... número de vezes que a sequência de resíduos muda de sinal. A distribuição de R é então aproximada pela distribuição normal. A média e o desvio padrão desta distribuição são calculados através das eqs. (7.78) e (7.79), apresentadas a seguir. (7.78) (7.79) 2N 1 N 2 (2N 1 N 2 -N 1 -N 2 ) 2 (N 1 +N 2 ) (N 1 +N 2 -1) • A forma padronizada (Z) da variável (R) é dada então pela eq. (7.80) Z=R-R (7.80) crR sendo distribuída com média Oe desvio padrão 1. Para testar a hipótese de que os desvios são randômicos, Z é comparada com a distribuição normal padrão. Se o valor de Z é muito baixo, b modelo é inadequado; por outro lado, se o valor deZ é muito alto, os dados experimentais contêm oscilações que precisam ser consideradas pelo modelo. Se o valor de Z cair na região de aceitação, então a hipótese de randomicidade pode ser aceita. Dessa forma, existem 3 casos possíveis exemplificados a seguir. Caso Randômico: N 1 = 21; N 2 = 30; R= 29; R= 25,7; crR = 3,42 Z = 0,965 (dentro da região de aceitação)- ajuste satisfatório. Avaliação do modelo matemático 169 Caso Oscilante: N 1 = 26; N 2 = 25; R = 50; R = 26,5; crR = 3,5 Z = 6,7 (fora da região de aceitação) . À primeira vista, esse seria um bom ajuste. Entretanto, um exame mais criterioso detectaria urna oscilação padrão do resíduo em relação a zero. A adição de um termo que introduza comportamento oscilatório ao modelo em questão, poderia melhorar consideravelmente o ajuste do modelo aos dados experimentais. Caso positivo/negativo: N 1 = 32; N 2 = 19; R= 3; R= 24,8; crR = 3,3 Z = -6,6 (fora da região de aceitação). Clara tendência dos resíduos de positivo para negativo ou vice-versa, detectada pelo fato de R ser baixo. Por exemplo, para baixos valores da variável independente, o resíduo é positivo e para altos valores da variável independente, o resíduo é negativo. O modelo deve ser corrigido para minimizar essa distorção. EXEMPLO NUMÉRICO-ETAPA 6 Nessa etapa é apresentada a análise estatística do modelo ajustado (Etapa 5) para a fermentação alcoólica de hidrolisado de mandioca em um sistema batelada ao conjunto de 4 ensaios (Tab. 7.1). Na medida em que existe um único rnoqelo ajustado aos dados experimentais, serão aplicados apenas os testes estatísticos para verificar a adequação deste modelo. (1) Teste F. Para aplicar o Teste F é calculada a estimativa do erro do modelo ajustado na Etapa 5 deste exemplo numérico (Tab. 7.7 e Fig. 7.15). Calcula-se a estimativa da variância do erro do modelo (s~) comparando os valores das variáveis de estado obtidas pelo modelo ajustado em relação aos dados experimentais disponíveis: v n LLÜlij- Yij) 2 = 3023,74 i=l j=l (nv)c = 135 (número total de variáveis de estado medidas nos 4 ensaios) p = 9 (parâmetros ajustados do modelo) s2 C = 3023,74 = 24 0 135-9 I Na medida em que não se dispõe de urna medida precisa da estimativa do erro experimental, urna vez que não foram fornecidas repetições de um mesmo ensaio, a partir das quais esta estimativa seria obtida, a aplicação do teste F será modificada, calculando-se o erro experimental que, se ·existente, garante que o modelo ajustado representa adequadamente os dados experimentais disponíveis. .L 170 Modelagem matemática e simulação de processos fermentativos Para tanto obtém-se, a partir dos valores das variáveis de estado medidas experimentalmente, a somatória do quadrado de todas elas: (nv)e = 135 v= 3 (número de variáveis de estado) e a estimativa da variância do erro experimental (s;) é dada então, por: 2 8e 58155& 2 =_1_3_5___3_ onde t ... estimativa do erro experimental. Como é necessário para que o modelo seja adequado para representar os dados experimentais disponíveis, que s~ < s;, então: t> 24,0 * (135- 3) >o 074 581555 ' O resultado obtido indica que, se o erro experimental dos dados disponíveis for maior do que 7,4%, o modelo ajustado é adequado, segundo o teste F modificado. Na medida em que 7,4% é um erro experimental baixo para variáveis medidas em processos fermentativos (principalmente se for levada em conta a falta de reprodutibilidade inerente a estes processos), conclui-se que ó modelo ajustado é adequado. (2) Teste de Randomicídade. Para aplicar o teste de randomicidadE!, descrito em detàlhe neste capítulo, verifica-se o número de resíduos <Ycak - Yexp) positivos e negativos além do número de vezes em que o resíduo troca de sinal (nesta análise, considerou-se o resíduo "O" equivalente a uma troca de sinal em relação aos resíduos positivos e negativos). Várias formas de aplicação desse método são possíveis- na presente etapa do exemplo numérico verifica-se a randomicidade das 3 variáveis de estado do processo (X, P e S) separadamente, considerando-se, na análise de cada uma a seqüência de 4 ensaios da Tabela 7.1. Repete-se o teste para as 3 variáveis de estado de forma conjunta, ainda seguindo a seqüência de ensaios da Tabela 7.1. A Tabela 7.8 apresenta o resultado dessa análise. Pelo resultado apresentado na Tabela 7.8, pode-se concluir -na medida em que o valor deZ caiu na região de aceitação (-1,96 < Z < 1,96) em todos os casosque a hipótese de randomicidade dos desvios entre os valores das variáveis de estado do processo calculadas pelo modelo e os valores medidos experimentalmente pode ser aceita, indicando, mais uma vez, a adequação do modelo formulado e ajustado. 17 I Avaliação do modelo matemático Tabela 7.8 - Resultados do teste de randomicidade. Teste por variável de estado N 1 =24 Teste conjunto s p X N 1 = 26 N 1 = 14 N 1 =64 N 2 = 16 N 2 =114 N 2 = 25 N 2 =55 "O"= 5 "O"= 5 "O"= 6 "O"= 16 R= 18 R= 16 - - R= 17 R =18,9 R= 53 R= 60,2 R= 20,2 <JR = 2,99 z = -0,736 R =19,2 <JR = 2,83 <JR z = -1,13 z = -0,67 .. .. 7.4.2 -Projeto de experimentos ·~ - ~ ~ .:;1:,· -'· ..:.•:. ' = 2,83 ,. ,, . \, :~. <JR ··· ': .. = 5,4 z = -1,33 ·-~,~:: . •.,· '': ·. :·. : . _,'.'. ' ·' .· -~ : ,~ 1~1 .\..i ~;; i~ ~·. -i·" : .. Esta técnica relaciona o procedimento para estimar parâmetros e o trabalho experimental de obtenção das medidas a serem usadas naquele procedimento, bem como na própria proposição e principalmente confirmação dos modelos matemáticos. "Projetar" um experimento significa escolher, de forma organizada e sistemática, as condições experimentais que serão usadas nos experimentos, visando um dado objetivo. Esse planejamento de experimentos pode ser feito a priori, como no projeto fatorial, ou seqüencialmente (e iterativamente) com os experirpentós, como no projeto seqüencial. No projeto de experimentos, o que se procura fazer é otimizar o trabalho experimental, ou seja, minimizar o número de experimentos necessários para se obter uma dada informação. Portanto, procura-se diminuir o esforço de experimentação e os custos envolvidos na sua execução (sejam estes realizados em laboratório, em planta piloto ou no equipamento industrial). A técnica permite também planejar experimentos sob condições tais que levem a uma melhora na informação procurada. O mais utilizado dentre esses projetos é o planejamento fatorial, seja como um planejamento fatorial completo, quando o número de variáveis do processo a serem testadas é relativamente pequeno, ou como um planejamento fatorial fracional, quando o número de variáveis é maior. 58 ' 59 ' 60 Essa técnica não será detalhada neste texto, pois existem várias publicações especializadas que tratam esse assunto em grande profundidade, e a sua utilização não apresenta qualquer especificidade para o caso dos processos fermentativos. 61 O projeto seqüencial é feito iter:ativamente com a experimentação, ou seja, a escolha das condições do próximo experimento é feita a partir da análise de todos i I I I li I I 1 • ! r ~ r -.(~;:~;~sq~!~e~~~~:c~~:~~:1~~~e::ê~~i~~~·~~~::::,:::.~=~~~~?o~:::~. . . -· J 172 Modelagem matemática e simulação de processos fennentativos mação obtida em cada ensaio é adicionada às informações anteriores e toda a análise é refeita, para projetar o novo experimento. O objetivo a ser buscado pode ser: • a discriminação entre modelos rivais; • a estimação precisa dos parâmetros de um dado modelo. Na elaboração de um modelo matemático são testados vários possíveis modelos cinéticos para os processos em estudo, buscando-se aquele que melhor represente as · condições reais na faixa operacional de interesse. Para o modelo cinético mais adequado, busca-se então que seus parâmetros sejam estimados com a máxima precisão possível. As ferramentas estatísticas envolvidas em um projeto seqüencial de experimentos são: . • um critério de projeto, isto é, como escolher adequadamente as condições do próximo experimento; • um critério de parada, ou seja, quando o programa de experimentos pode ser interrompido em virtude de já se ter atingido o objetivo desejado. As técnicas de projeto seqüencial de experimentos foram aplicadas principalmente no estudo da cinética de reações catalíticas heterogêneas. No entanto, têm sido pouco exploradas no âmbito dos processos fermentativos, onde poderiam ser muito úteis, dado o grande esforço envolvido na parte experimental do estudo destes processos. 62 Exemplos de aplicação dessas técnicas, apresentadas por FROMENT; BISCHOFF;51 FROMENT; HOSTEN55 e HIMMELBLAU, 50 entre outros, mostram uma redução significativa (em torno de 50%) no número de experimentos necessários para a discriminação entre modelos rivais ou para a estimação precisa dos parâmetros. 7.5 - Simulação de processos fermentativos Simular, nada mais é do que utilizar os modelos gerados, de man~ira que os mesmos reproduzam o comportamento real do sistema, com vistas à sua otimização e ainda permitam extrapolações válidas deste comportamento. A simulação por computador pode ser de dois tipos, conforme definido a seguir. · Simulação analógica. É feita por meio de circuitos eletrônicos. Tem como vantagem a facilidade com que resolve equações diferenciais, produzindo uma saída em forma gráfica. Tem como grande desvantagem a velocidade de processamento lenta. Foi muito utilizada nas décadas de 50 e 60. 63 Simulação digital. É feita por meio de computadores digitais. Tem como grande vantagem em relação à analógica a velocidade de processamento e uma grande capacidade de memória. Torna possível a abordagem de problemas muito mais sofisticados. Tem como desvantagem a necessidade de se implementar ou criar técnicas numéricas de integração, diferenciação, convergência, etc. Atualmente, todo o trabalho de simulação é, praticamente, feito em computadores digitais. Dessa forma, quando alguém se refere à simulação em computador, está sempre se referindo à simulação digital. 63 Avaliação do modelo matemático 173 Do ponto de vista do problema matemático a ser resolvido, existem dois tipos básicos de simulação, descritos a seguir. Simulação estática. Simulação estática refere-se a sistemas que estão operando em regime permanente, isto é, independentes do tempo. Por exemplo, a simulação ou o projeto de uma planta de processo ou de um equipamento (biorreator), operando em regime contínuo, são realizados em regime permanente, ou seja, através de uma simulação es1tática. Simulação dinâmica. Neste caso, a preocupação é com a representação de sistemas que variam no tempo. Normalmente, trabalha-se com equações diferenciais or- · dinárias no tempo para biorreatores operando em batelada ou durante o transiente de sistemas contínuos; pode-se trabalhar, ainda, com equações diferenciais parciais no tempo e no espaço, quando é analisado o comportamento de biorreatores tubulares ou mesmo de biorreatores completamente heterogêneos. Evidentemente, a qualidade da simulação realizada vai depender dos seguintes aspectos: • qualidade dos modelos utilizados na simulação; • confiabilidade das propriedades físicas e biológicas empregadas na formulação dos modelos; • bom senso na seleção dos métodos numéricos a serem empregados, bem como com a análise dos resultados de uma simulação - muitas vezes os modelos são confiáveis, as condições operacionais são adequadas, mas um problema numérico qualquer gera res~ltados inconsistentes. 7.5.1 - Técnicas matemáticas Na simulação de processos fermentativos homogêneos e heterogêneos, existem 4 técnicas matemáticas de cálculo numérico largamente empregadas e que são adequadas para resolver a maioria dos problemas a serem enfrentados: • métodos de solução de equações algébricas não lineares (métodos de convergência);64 65 • métodos de solução de sistemas de equações algébricas não lineares; • métodos de solução de sistemas de equações diferenciais ordinárias de 1. • ordem - problemas de valor inicial/6 • métodos de solução de sistemas de equações diferenciais parciais - método de colocação ortogonal. 57 Por fugirem do escopo deste capítulo, não serão detalhadas essas técnicas, mas o leitor interessado poderá encontrar as informações necessárias à sua adequada utilização na solução de problemas de simulação, nas referências apresentadas: 7.5.2 ~ Otimização de processos fermentativos Muitas vezes a etapa de fermentação é a crítica no estabelecimento dos parâmetros econômicos de um processo biotecnológico; entretanto, isto nem sempre é verdadeiro, o que complica sobremaneira a definição da função objetivo a ser otimizada. Entende-se por função objetivo a representação através de uma função matemática do objetivo a ser buscado na operação do processo em estudo. Po- I iI '1 -- .. ~- 174 ·Modelagem matemática e simulação de processos fennentativos · de-se, então, definir uma função com objetivo técnico (maximizar a produtividade, por exemplo) ou econômico (maximizar o lucro, por exemplo) ou, ainda, mis67 turando critérios técnicos e econômicos. Uma vez definida essa,função, é preciso um método de otimização de funções (ou otimização de parâmetros ou otimização estática), para obter-se um ponto máximo ou mínimo. Existem vários méto68 dos de otimização descritos e periodicamente melhorados na literatura. Esses métodos podem, ou não, fazer uso de derivadas (da função objetivo ou do modelo) em relação às variáveis de otimização, sendo usualmente preferidos os métodos que não usam derivadas -chamados métodos de pesquisa direta- pela facilidade da sua execução. Nesta categoria de métodos de otimização destaca-se o métod~ dos poliedros flexíveis de Nelder & Mead, já utilizado para o ajuste de parâmetros. EXEMPLO NUMÉRICO-ETAPA 7 Nessa etapa é apresentada a otimização da produtividade da fermentação alcoólica de hidrolisado de mandioca operada num sistema em batelada, utilizando o modelo ajustado no Etapa 5. No caso do sistema operado em batelada as variáveis operacionais possíveis de serem manipuladas, com vistas a maximizar a produtividade, são as concentrações iniciais de células e substrato, fixada a concentração inicial de produto produzido durante a fase de preparo do inóculo. Entretanto, uma análise do processo, a partir do seu modelo, permite concluir que a produtividade, função objetivo escolhida, é monotonicamente crescente com a concentração inicial de células, isto é, a produtividade do processo cresce indefinidamente com o aumento de X0 • Na medida em que, operacionalmente, existem limitações quanto à concentração inicial de células que pode ser empregada, serão considerados valores fixos de X0 (X0 = 2,0 g/L) e P 0 (P0 = 2,0 g/L) e variaremos apenas 5 0 na busca do valor máximo da produtividade. Dessa forma, o problema de otimização proposto é resolvido, integrando o sistema de equações diferenciais, que compõem o modelo do processo para diferentes valores de 5 0, até se obter a produtividade máxima correspond~nte a cada operação. A Figura 7.16 apresenta o resultado dessas simulações, sendo possível concluir que a produtividade máxima do processo estudado é de 5,26 g/L.h, obtida numa operação com 5 0 = 260,0 g/L. 6 oc ~ E 5 4 • Q)~ Q).c: -o ....I 3 :~ 2 ~s "5 r / •• • • • • • "O e 0.. o o 200 400 600 S0 (g/L) Figura 7.16 - Produtividade em etanol em função da concentração inicial de substrato num processo em batelada. Referências bibliográficas (1) VOLESKY, B. and VOTRUBA, J., 1992. Modeling and. on Processes. Elsevier Science Publishers, Amsterdã. · (2) BAILEY, J.A., 1998. Mathematical modeling and ana. ring: past accomplishments and future opportunities. Biotechnol (3) HEINZLE, E. and SANER, U., 1991. Methodology for p development. In: Pons, M.N. (Ed.). Bioprocess Monitoring and ( (4) ENGASSER, J.M., 1988. Bioreactor engineering: the de: tors with living cells. Chemical Engineering Science, v. 43(8), p. (5) BAILEY, J.A. and OLLIS, D.F., 1986. Biochemical Enj Edition, McGraw-Hill, Inc., Nova York. 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Assim, logo de início, pode-se classificar os biorreatores em dois grandes grupos: Grupo 1: Biorreatores nos quais as reações ocorrem na ausência de células vivas, ou seja, são tipicamente os "reatores enzimáticos"; Grupo 2: Biorreatores nos quais as reações se processam na presença de células vivas". Embora não seja totalmente generalizado, há alguns autores, porém, que utilizap:t a denominação "reatores bioquímicas" para se referirem apenas ao primeiro grupo, restringindo assim a denominação "reatores biológiCos" apenas aos reatores que operam com células vivas. Com relação aos reatores com células vivas, pode-se afirmar que os mais amplamente conhecidos e com uso bastante difundido, são os reatores com microrganismos, os quais vêm sendo empregados desde a década de 1940 para a produção industrial de uma grande diversidade de produtos, tais como enzimas, antibióticos, vitaminas, ácidos orgânicos, solventes, ou ainda no tratamento de resíduos orgânicos industriais ou domésticos. Embora se fale globalmente em "reatores com microrganismos", é muito importante destacar que, do ponto de vista da engenharia, dependendo do tipo de microrganismo utilizado, tais reatores podem ter caraCterísticas bastante distintas no que se refere aos fenômenos de transporte que ocorrem no reator (calor, massa e quantidade de movimento). Assim, por exemplo, reatores que operam com orga- I 80 Biorreatores e processos fermentativos nismos unicelulares como bactérias e leveduras possuem, em geral, um comporta~ menta reológico bastante distinto .daqueles que empregam fungos filamentosos (bolores). Deve~se mencionar ainda os biorreatores que operam com elevadas concen~ trações celulares ("high cell density cultures"), o que propicia altas velocidades de conversão do substrato em produto. Um exemplo dessa situação é a fermentação alcoólica, na qual se opera com cerca de 30g células/litro de meio (matéria seca). Particularmente, no caso de biorreatores que empregam microrganismos i"ecombi~ nantes, em virtude de uma possível baixa produção específica da proteína heteró~ Ioga de interesse, busca~se operar com concentrações celulares da ordem de lOOg/L/ o que e?<ige condições especiais de operação. Outro campo de recente desenvolvimento é o cultivo de células animais e ve~ getais, tendo alcançado rápido progresso nos últimos dez anos, constituindo~se hoje num dos grandes temas de aplicação da Biotecnologia Moderna. Assim, pode~se ci~ tar o emprego de biorreatores com células animais para a produção de uma série de produtos ligados à saúde humana e animal, tais como vacinas virais, anticorpos monoclonais, hormônios e fatores de crescimento.2' 3' 4 No que se refere às células ve~ getais, há exemplos de produção de princípios ativos de medicamentos, como mor~ fina e quinina, e outros produtos de utilização na indústria cosmética.5 Os reatores que empregam células animais ou vegetais, em geral possuem várias particularida~ des, tendo em vista as diferentes características apresentadas por este tipo de célu~ las em relação às células microbianas, destacando~se entre elas a elevada sensibilidade ao cisalhamento, característica que, em casos extremos, leva à nec~ssi~ dade da utilização de biorreatores não~convencionais, como reatores "air~lift", ou ainda os reatores com membranas, nos quais não se tem agitação mecânica e, canse~ qüentemente as tensões de cisalhamento são menores. 6' 7 8.2 - Classificação dos biorreatores • Encontram~se indicadas na literatura várias formas possíveis de classificar os biorreatores, como por exemplo: • quanto ao tipo de biocatalisador (células ou enzimas); • quanto à configuração do biocatalisador (células/enzimas livres ou imo~ bilizadas); • quanto à forma de se agitar o líquido no reator. Dentre as várias classificações encontradas nos livros~textos que abordam o tema biorreatores, uma das mais abrangentes é a de KLEINSTREUER, 8 que apresen~ ta. uma classificação mista, com base no tipo de biocatalisador empregado (enzi~ ma, microrganismo aeróbio ou anaeróbio) e na configuração deste (livre, imobilizado ou confinado entre membranas). Considerando~se, pois, as várias propostas usualmente encontradas, pro~ põe~se no presente capítulo uma classificação mista, a qual pretende ser mais abrangente que as anteriormente citadas, conforme esquematizado a seguir. Classificação dos biorreatores 18 I CLASSIFICAÇÃO GERAL DOS BIORREATORES (I) Reatores em fase aquosa (fermentação submersa) (1.1) Células/enzimas livres • Reatores agitados .p1-ecanicarnente (STR: "stirred tank reactor") • Reatores agitados pneumaticamente . • Coluna de bolhas ("bubble colurnn") • Reatores "air-lift" • Reatores de fluxo pistonado ("plug-flow") (1.2) Células/enzimas imobilizadas em suportes • Reatores com leito fixo • Reatores com leito fluidizado • Outras concepções · (1.3) Células/enzimas confinadas entre membranas • Reatores com membranas planas • Reatores de fibra oca ("hollow-fiber") (11) Reatores em fase não-aquosa (fermentação semi-sólida) • Reatores estáticos (reatores com bandejas) • Reatores com agitação (tambor rotativo) • Reatores.com leito, fixo • Reatores com leito fluidizado gás-sólido Conforme se pode verificar, a partir da classificação proposta, há uma grande variedade de configurações possíveis para os biorreatores mas, no entanto, pode-se afirmar que os mais amplamente empregados são os · reatores agitados mecanicamente (STR), conhecidos também como reatores de mistura, constituindo cerca de 90% do total de reatores utilizados industrialmente. A capacidade dos biorreatores é bastante variável, conforme o processo em questão, podendo-se distinguir três grandes grupos no que se refereà escala de produção industrial. Reatores da ordem de algumas centenas de litros até 1 a · 2 rn 3 de capacidade, são empregados no cultivo de microrganismos patogênicos, ou para o crescimento de células animais ou vegetais, em geral objetivando a produção de produtos ligados à área de saúde. Urna escala intermediária, na qual se opera com reatores da ordem de algumas dezenas de metros cúbicos até 100 a 200 rn 3; é especialmente empregada na produção de enzimas, antibióticos e vitaminas. Finalmente, para processos ·q ue exigem poucos ou até mesmo nenhum cuidado de assepsia, como é o caso da fermentação alcoólica ou do trata'-- ---- ·--·-----..- - - -- - ' 182 Biorreatores e processos fermentativos rnento biológico de resíduos, pode-se atingir reatores com alguns milhares de metros cúbicos de capacidade. 9 Conforme indicado na Figura 8.1(a), o reator do tipo STR consiste em um tanque cilíndrico, no qual são comuns relações entre a altura e o diâmetro de 2:1 ou 3:1. 10 Normalmente o reator é equipado com chicanas ("baffles"), cuja função é evitar a formação de vórtice durante a agitação do líquido. O agitador é montado num eixo central ao ferrnentador, possuindo, ao longo de sua altura, urna série de turbinas, as quais podem ser de diferentes tipos, sendo porém a mais amplamente utilizada a turbina de pás planas ("flat blade"), também conhecida corno turbina "Rushton". As razões que fazem com que este tipo de turbina seja a mais amplamente empregada em processos ferrnentativos, serão discutidas adiante, no Capítulo 14. Os reatores agitados pneumaticamente se caracterizam basicamente pela ausência do agitador mecânico, sendo a agitação do líquido efetuada apenas pelo borbulharnento de um gás (normalmente ar) no reator. Corno conseqüência da ausência do agitador mecânico, resultam, nesse tipo de reator, menores tensões de cisalharnento, o que os torna atraentes para o cultivo de células animais e vegetais. 6' 7 Há na literatura urna considerável diversidade de nomenclaturas para designar os reatores agitados pneumaticamente, não havendo urna clara diferenciação entre eles. Segundo MERCHUK, 11 a diferenciação básica entre os reatores coluna de bolhas ("bubble colurnn") e os reatores "air-lift", é que nestes últimos tem-se urna movimentação cíclica do fluido, bem definida, através de dispositiyos e arranjos internos construídos especialmente para este propósito, enquanto que na coluna de bolhas tem-se um movimento aleatório do líquido no reator. As Figuras 8.1(b) e 8.1(c) ilustram esquematicamente tais tipos de reatores, os quais possuem urna grande variedade de configurações. 12' 13' 14 Convém ainda mencionar que os reatores tipo coluna de bolhas são freqüentemente chamados de reatores tipo · torre, enquanto que os reatores "air-lift" são designados "loop reactors". • Nos reatores de fluxo pistonado ("plug-flow"), conforme indicado esquematicamente na Figura 8.1(d), o inóculo e o meio de cultura são misturados na entrada do sistema, sendo que idealmente a cultura flui com urna velocidade constante, sem ocorrer mistura longitudinal ("backrnix"). 15' 16 Há, portanto, urna variação da concentração dos nutrientes e das células ao longo do comprimento do reator, sendo este sistema comparável a um processo contínuo realizado em múltiplos ·e stágios, com um elevado número de reatores ligados em série, conforme será visto no Capítulo 12. · Conforme indicado na classificação geral dos biorreatores, apresentada anteriormente, é possível dispor de reatores nos quais o biocalisador se encontra imobilizado em um suporte inerte, corno, por exemplo, alginato, K-carragena, pec· tina, ou ainda materiais cerâmicos, vidro, sílica e outros. 17 A finalidade básica do emprego de células imobilizadas num biorreator é a manutenção de elevadas concentrações celulares, podendo-se atingir, conseqüentemente, elevadas produtividades no processo em questão. Dependendo da movi- Classificação dos biorreatores ·183 rnentação relativa das partículas ("pellets"), distinguem-se os reatores de leito fixo, onde a movimentação é praticamente inexistente, e os de leito fluidizado, onde há urna movimentação intensa das partículas, sendo qúe a fluidização do leito pode ser provocada pela injeção de ar, ou de um gás inerte, ou ainda pode ser obtida por urna corrente de recirculação de líquido no reator. As Figuras 8.1(e) e 8.1(f) ilustram as configurações mencionadas. Deve-se mencionar, ainda, o desenvolvimento recente de alguns biorreatores que empregam células e enzimas co-imobilizadas, corno descrito por exemplo no trabalho de GIORDANO, 18 no qual se empregou a co-imobilização de glicoarnilase e células de Saccharomyces cerevisiae para a produção contínua de etanol. Por sua vez, os reatores com lâminas de membranas planas e os reatores de fibra oca ("hollow-fiber"), caracterizam-se por manterem as células confinadas entre membranas semipermeáveis ("entrapped biocatalyst"), as quais permitem o fluxo de líquido, mas não a passagem de células. ~ Esse tipo de reator normalmente prevê a separação entre os fluxos de nutrientes e produtos metabólicos, conforme se pode visualizar nas Figuras 8.l(g) e 8.l(h), o que permite imaginar urna primeira operação de separação do produto desejado, podendo contribuir para a simplificação das etapas de purificação do produto ("downstrearn"). Corno ocorre a passagem de nutrientes e produtos através de membranas, esse tipo de reator costuma ser designado por "reator de perfusão". No entanto, o termo reator ou sistema de perfusão, tem sido empregado de forma mais genérica, incluindo a situação de um reator STR com reciclo externo de células por filtração em membranas, ou ainda, simplesmente designando ti.rn reator com células irnobilizadas.21 Nesse tipo de reatores com membranas, as tensões de cisalharnento são mínimas, inferiores àquelas obtidas nos reatores "air-lift", o que os torna indicados para utilização com alguns tipos de células animais extremamente sensíveis ao cisalharnento. Comparativamente aos típicos reatores com células imobilizadas em suportes inertes, fein-se neste tipo de reatores menores obstáculos difusionais, podendo-se igualmente rnan~er elevadas concentrações celulares. 22 Particularmente, · o reator de fibra oca consiste em um feixe de fibras capilares de material semipermeável, no interior das quais ocorre escoamento laminar do meio de cultura, permanecendo as células retidas na região anular entre as fibras, conforme indicado na Figura 8.l(h). · Todos os tipos de reatores mencionados até o presente são ditos reatores em fase aquosa, ou seja, empregados nos processos de fermentação submersa. Entretanto, há ainda os reatores em fase não-aquosa, empregados para os processos de fermentação semi-sólida, os quais se caracterizam pela ausência de "água livre", podendo o teor de umidade variar de 30 a 80%, dependendo das características de retenção de água do substrato sólido empregado, embora o processo semi-sólido apresente urna série de dificuldades, especialmente no que se refere ao controle das condições de operação; por outro lado, este processo apresenta urna série de aspectos interessantes, os quais podem torná-lo, em alguns casos, mais econômico do que o tradicional processo subrnerso. 23' 24 Dentre os itens que necessitam de um maior desenvolvimento, encontra-se o estudo de novas concepções de reatores 19 20 184 Biorreatores e processos fermentativos para a fermentação semi-sólida, encontrando-se na literatura um grande número de trabalhos nos quais se emprega o "reator de bandejas" ("stationary trays"), o qual é bastante limitado no que se refere às condições de transferência de oxigênio e controle das condições ambientais. Nesse sentido é possível obter-se uma melhoria, quando se procede à agitação do meio de cultivo, por exemplo, empregando-se tambores rotativos. 25' 26 Mais- recentemente, foram propostos os reatores de leito fixo ou de leito fluidizado gás-sólido/7' 28 nos quais se promove a passagem de ar ou de um gás inerte através de um leito de partículas sólidas. No caso do leito fluidizado, a vazão do gás é suficientemente elevada, de maneira a propiciar a suspensão dos sólidos na corrente gasosa, promovendo desta maneira, uma melhor condição de transferência de massa no sistema (nutrientes, oxigênio) e ainda auxiliando no controle da temperatura. : ...... . : . :. : ... : ···.·.. ··.·.·. .. .... . ~::: :::. :- .. : ... :. ·.. : .. . :~ .::;,:.~ .... : ----1 ----1 (b) (a) Meio >-1 ;u~ ~·:~\·; ~l~~;ki:_,:: ___..J inóculo fi:' : :"f.j) ·.· : .. ...: .. . :.:... . : . .. .. :. :-:·. ·:.: :·. :. :: ::·. ·. : :·. ·.-:: :·:·. :·: :·. ·. :: :·:·.... : :·. :·:: ~ (d_)_ __ _ J L __ _ _ (c) "b""60"b~6ob-6 o o o o o o o o o o o·o o o o o o o o o o ç o o o o o o o o o o o o o o o o o o o 000000000 00000000 000000000 00000000 000000000 00000000 000000000 00000000 000000000 Meio 00000000 Q9_0_QQ9_<~Q9 • (e) (f) 00000000000000 I-- 00000000000000 00000000000000 1-'1'- 00000000000000 00000000000000 1-'1'- 00000000000000 lo o o o o o o o o o o o o o 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 f--' looooo ooo o o ooo ooo oooooo ooooo f--' (h) (g) Produto Produto Figura 8.1 - Tipos de biorreatores (a) STR; (b) coluna de bolhas; (c) "air-lift"; (d) "plug-flow" ; (e) com células imobilizadas (leito fixo); (f) com células imobilizadas (leito fluidizado); (g) reator com mell)branas planas; (h) "hollow-fiber". Formas de condução de um processo fermentativo 185 Conforme visto no presente item, há uma grande diversidade possível de biorreatores a serem empregados em um determinado processo fermentativo, sendo que a melhor opção dependerá das características do processo em questão, bem como do microrganismo utilizado. Convém salientar que alguns dos tópicos abordados no presente item serão melhor detalhados em outros capítulos, tais como: · • Capítulo 13: Fermentação em estado sólido • Capítulo 16: Reatores com células imobilizadas • Capítulo 17: Reatores com enzimas imobilizadas No item seguinte pretende-se mostrar que existem numerosas opções quanto à forma de condução do processo, ou seja, quanto à forma de operação de ·um dado biorreator, e que a forma ideal de operação, isto é, aquela que conduzirá a um desempenho ótimo do processo, será função novamente das partiCularidades do material biológico empregado. 8.3 - Formas de condução de um processo fermentativo Quando se pensa em executar um processo fermentativo, normalmente se imagina preparar um certo meio de cultura que seja adequado à nutrição e desenvolvimento do microrganismo, bem como ao acúmulo do produto desejado; colocar este meio de cultura em um biorreator (fermentador); adicionar o microrganismo responsável pelo processo biológico (inocular) e aguardar que o processo ocorra, Após um determinado tempO de fermentação, imagina-se retirar o caldo fermentado do reator e executar as operações unitárias necessárias para a recuperação do produto. A descrição acima é aquela típica de um processo descontínuo simples, ou descontínuo tradicional, q~e é tamb,é m designado como processo em batelada. No entanto, essa descrição é também típica de pessoas não ligadas à Engenharia Bioquímica, ou com experiência em processos fermentativos, pois, sem querer recair em_afirmações dotadas de extremo exagero, pode-se dizer que existem infinitas formas de se conduzir um reator biológico, dependendo das características próprias do microrganismo, meio de cultivo e dos objetivos específicos do processo que se pretende executar. Inclusive, ao se imaginar o descontínuo comó única alternativa para a condução do processo fermentativo, pode-se incorrer no engano de concluir, precocemente, sobre a inviabilidade do processo produtivo, em virtude de sua baixa produtividade. Com base nessas considerações iniciais, fica clara a necessidade de uma maior reflexão sobre os reatores biológicos, tendo em vista sua enorme flexibilidade de operação, bem como sua incidência imediata quanto à economicidade de um dado processo fermentativo. Pode-se afirinar que, a partir da década de 1950, ocorreu um maior desenvolvimento da área de reatores, encontrando a mesma, desde então, um formidável avanço, sendo responsável pelo sucesso de muitos processos fermentativos, obviamente ao lado dos demais desenvolvimentos das áreas mais básicas, como por exemplo a microbiologia destes processos. ~·;-·•. 186 Biooeatores e processos fermentativos Não é objetivo do presente texto abordar todas as formas de operação de um biorreator, mesmo porque isto seria inviável, tamanha a diversidade hoje observada, dependendo das características próprias de cada processo. O que se pretende é abordar as formas mais gerais, entendendo que tal estratégia permitirá as particularizações que se fizerem necessárias. Com essa idéia em mente, pode-se dizer que, de uma forma geral, um reator biológico pode ser operado das seguintes formas: -Descontínuo • com um inóculo por tanque • com recirculação de células - Semicontínuo • sem recirculação de células • com recirculação de células - Descontínuo alimentado • sem recirculação de células • com recirculação de células -Contínuo • executado em um reator (com ou sem recirculação de células) • executado em vários reatores (com ou sem recirculação de células) O processo descontínuo simples, ou seja, aquele efetuado com um inóculo por tanque, já foi descrito no início deste item. No entanto, cabe ainda acrescentar que esse processo é o mais seguro quando se tem o problema de manutenção de condições de assepsia, pois ao final de cada batelada imagina-se que o reator deverá ser esterilizado juntamente com o novo meio de cultura, recebendo pm novo inóculo, o qual poderá sofrer todos os controles necessários, a fim de assegurar a presenÇa única do microrganismo responsável pelo processo. Deve-se salientar que o conhecimento do processo descontínuo simples significa o conhecimento básico da cinética do processo, sendo, portanto, de extremo interesse, não se recomendando o estudo dos reatores alternativos sem que se domine razoavelmente bem o descontínuo, mesmo porque as demais alternativas pressupõem este conhecimento cinético. Nessa direção, o Capítulo 6 é justamente dedicado ao estudo da cinética de processos fermentativos . · Por outro lado, no nível de aplicações práticas, pode-se dizer que, para um processo fermentativo razoavelmente evoluído, dificilmente ele será conduzido como um reator descontínuo simples, havendo com muita freqüência alguma elaboração adicional. O descontínuo será sempre a base para as comparações de eficiências atingidas nessas elaborações, mas a sua baixa eficiência estimula o surgimento das formas alternativas. A primeira dessas alternativas é, quando o microrganismo permite, recircular as células, ou seja, ao se encerrar a batelada efetua-se a separação das células Formas de condução de um processo fennentativo 187 por centrifugação ou mesmo sedimentação no interior do próprio reator, enviando apenas o líquido fermentado para a recuperação do produto. Com isso se busca evitar o preparo de um novo inóculo para cada batelada, o que sempre significa custo adicional para o processo, além de significar também um certo tempo para a obtenção de altas concentrações celulares no reator, bem como consumo de substrato para isto. Essa estratégia de operação é freqüentemente designàda como batelada repetida. Assim, a idéia de se recircular as células, mesmo para um processo descontínuo, é .possível e mesmo interessãnte, desde que se possa manter as condições de assepsia, e igualmente se possa manter o microrganismo suficientemente ativo para a síntese do produto. Se um processo descontínuo é entendido como um sistema fechado, devido às suas características, um processo contínuo, por outro lado, é o exemplo típico de um sistema aberto. No processo contínuo procura-se estabelecer um fluxo contínuo de líquido através do reator, ou reatores dispostos em série. Claro está que, caso o processo assim o exija, o meio a ser introduzido no reator deve ser devidamente esterilizado, assim como se deve manter as condições de assepsia nestas operações de alimentação e retirada do.produto fermentado. A opção pela operação de um sistema contínuo, constituído por vários reatores em série, no qual a alimentação de um dado reator da série é o efluente do reator anterior, visa freqüentemente o estabelecimento de diferentes condições nos vários biorreatores da série. Inclusive, nessa opção de operação, abre-se a possibilidade de distribuir a alimentação do meio de cultura inicial entre reatores da série, o que pode justamente contribuir para o aparecimento destas diferentes condições entre os vários reatores. Ainda, o reator contínuo permite visualizar o reciclo de células. De fato, o líquido fermentado, efluente de um dado reator, pode ser submetido a um sistema· de separação dos microrganismos (por sedimentação, centrifugação ou ,separação por membninas), -õs quais podem ser retornados ao volume de reação, sendo o líquido enviado para a recuperação do produto. Em .se tratando de reatores em série, essa operação pode ser efetuada em qualquer reator da· série, retornando-,se o microrganismo para o fermentador mais adequado, evidenciando, assim, a enorme flexibilidade de operação disponível. O reator descontínuo alimentado ("fed batch") é aquele no qual se imagina inicialmente introduzir o inóculo, o qual deverá ocupar uma fração do volume útil da ordem de 10 a 20%, iniciando-se então a alimentação com o meio de cultura, empregando uma vazão adequada, sem ocorrer a retirada de líquido fermentado. Essa operação prolonga-se até o preenchimento do volume útil do reator, quando então inicia-se a retirada do caldo fermentado para a recuperação do produto. Essa forma de operação é típica da área de Engenharia Bioquímica, e foi praticamente desenvolvida para os processos fermentativos, sendo muito pouco freqüente para os reatores químicos não biológicos. A descrição acima para o reator "fed batch", consiste- na verdade- na forma mais simples de operação deste reator. Pode-se imaginar a separação das células e retorná-las ao volume de reação, a fim de se iniciar um novo período de 188 Biorreatores e processos fennentativos alimentação, o que evita o preparo de um novo inóculo. A idéia acima também sugere que se alimente o reator com vazão constante, o que não é necessariamente obrigatório. As alternativas mencionadas indicam a grande flexibilidade de operação, que também se observa para o "fed batch", a exemplo do reator contínuo. No entanto, cumpre destacar que se pode ainda, ao terminar o preenchimento do reator, proceder-se à retirada de uma certa fração do líquido fermentado, iniciando-se então um novo período de alimentação. Essa alternativa é freqüentemente indicada na · literatura· como descontínuo alimentado repetido. Novamente convém esclarecer que esse estilo de condução do reator depende fundamentalmente das características do microrganismo, que deverá permanecer suficientemente ativo no sistema. Caso o microrganismo apresente .sintomas de atenuação quanto à sua capacidade de síntese do produto, o processo deverá ser interrompido, para se reiniciar com um novo inóculo. Assim, é fácil compreender que o interesse por um processo contínuo, ou descontínuo alimentado repetido, depende da possibilidade de se prolongar ao máximo o tempo de operação, mantendo-se o processo em condições de elevado desempenho, quanto ao produto desejado e isento de contaminações. Finalmente, o sistema de reação semicontínuo, diferencia-se do descontínuo alimentado, pelo fato de se retirar o líquido fermentado e se proceder ao preenchimento do reator empregando-se uma vazão muito elevada, de forma a se imaginar que o reator esteja sendo preenchido instantaneamente. Ao final do novo período de fermentação, procede-se novamente à retirada de uma dada fração do volume (30 a 60%, por exemplo) e se preenche o reator instantaneamente. ' Na verdade, como- do ponto de vista prático- trabalhando-se com reatores de dezenas de milhares de litros, este preenchimento dificilmente pode ser efetuado instantaneamente, com freqüência acaba-se recaindo no reator descontínuo alimentado, motivo pelo qual alguns autores não utilizam a designação de semicontínuo. De qualquer maneira, trata-se de uma técnica distinta, n~ qual está embutida a idéia da operação por choques de carga de substrato, o que pode ser interessante em algumas situações, como na produção de enzimas sujeitas ao controle por indução. · Da mesma forma, um reator descontínuo alimentado, dependendo da vazão empregada, que po_ssibilite um certo acúmulo do substrato limitante quando do término do período de alimentação do reator, pode ter seu tempo de fermentação concluído em sistema descontínuo, a fim de que o substrato residual possa ser totalmente consumido. Essas últimas considerações pretendem alertar para as possibilidades de utilização de misturas de conceitos (descontínuo, contínuo, descontínuo alimentado), a fim de se conseguir o máximo de desempenho de um dado sistema biológico. Elas também reforçam a idéia sobre a enorme flexibilidade que se dispõe para a operação de um biorreator. Alguns processos tradicionais servem como exemplo dessa afirmação, çomo é o caso da fermentação alcoólica executada segundo o processo Melle-Boinot. Nesse processo; ao término de UII).a fermentação, o vinho é centrifugado, retornan- Exemplos de comparação de desempenho de biorreatores 189 do-"se as células ao reator após tratamento adequado. A seguir inicia-se a alimentação do mosto a ser fermentado (na verdade, a introdução do inóculo e a alimentação de mosto ocorrem simultaneamente desde o início do processo), operando-se grande parte do tempo na forma de um reator descontínuo alimentado. Quando as dornas encontram-se preenchidas, aguarda-se tempo suficiente para o consumo dos açúcares fermentescíveis, operando-se, portanto, na forma descontínua. Os sistemas de tratamento de resíduos também podem ser considerados como exemplo, pois os enormes volumes de reação, freqüentes nesta área, exigem que sejam preenchidos de forma controlada segundo o sistema descontínuo alimentado, mesmo que sua operação em regime seja obrigatoriamente em sistema contínuo. Freqüentemente a operação em descontínuo alimentado é importante, pois espera-se atingir o completo preenchimento do reator contando-se com um sistema biológico equilibrado, a fim de se poder iniciar a operação contínua em condições de estabilidade (ausência de matéria orgânica acumulada, ou de produtos intermediários não completamente convertidos a gás ou biomassa). Cabe, finalmente, comentar que as diferentes formas de operar um certo biorreator são, em princípio, aplicáveis a qualquer tipo de reator dentre os mencionados no item 8.2, ficando esta flexibilidade mais ou menos evidente, dependendo do tipo de reator considerado. Analogamente ao indicado no item anterior, vários conceitos aqui introduzidos serão melhor detalhados em capítulos seguintes, tais como: • Capít_ulo 9: Fermentação descontínua • Capítulo 10: Fermentação descontínua alimentada • Capítulo 11: Fermentação semicontínmi. • Capítulo 12: Fermentação contínuà . .. .,8 .4 - Exemplos de comparação de desempenho de biorreatores Encontram-se na literatura alguns trabalhos recentes, os quais apresentam estudos comparativos do desempenhei de biorreatores, como por exemplo, o trabalho de MANOLOV, 29 relativo à produção de ribonuclease por Aspergillus clavatus, onde se empregou um reator tipo coluna de bolhas com células imobilizadas, tendo-se obtido produtividades em enzima significativamente superiores ao se conduzir o processo tanto na forma de bateladas repetidas, bem como na forma contínua, em comparação com o descontínuo tradicional. Da mesma forma, o trabalho de Guo et al.,30 sobre a produção de alfa-amilase por Bacillus subtilis em reator "air lift", indica a obtenção de uma produtividade em enzima cerca de 5 vezes superior à do descontínuo, quando se operou o .reator na forma contínua com elevados valores da vazão específica de alimentação. Por sua vez, o artigo de MOSER 31 apresenta dados comparativos na produção de etanol, em reatot:: agitado operado de forma contínua (CSTR) e em reator tubular ("plug-flow"), indicando situações em que se obtêm produtividades mais elevadas para o reator tubular em relação ao CSTR. 190 Biori-eatores e processos fermentativos Já no trabalho de MULLIGAN et al.32 encontram-se dados comparativos sobre a produção de lactato de amônio por Streptococcus cremoris, em sistema contínuo em múltiplos estágios, com ou sem reciclo de células, em relação ao descontínuo. Pode.;.se citar ainda o artigo de BAYER et al./3 relativo à produção de cefalosporina em reatores "air lift", comparando-se o desempenho deste reator com aquele obtido em reator agitado mecanicamente (STR). O trabalho de RANE et al./ 4 por sua vez, compara a produção de ácido cítrico por Candida lypolitica em reator tipo STR, operando-se o mesmo na forma contínua com reciclo de células e na forma descontínua alimentada. Deve-se mencionar ainda os trabalhos de SCHMIDELL; F ACCIOTII/5 37 38 6 FACCIOTTI et al./ KILIKIAN e TONS0, os quais se referem ao estudo da síntese de amiloglicosidase por Aspergillus sp em diferentes tipos de processos, como o descontínuo simples, contínuo, semicontínuo e descontínuo alimentado, em reator tipo STR, buscando-se comparar as produtividades em enzima obtidas. Assim, verificou-se a possibilidade de obtenção de uma produtividade em glicoamilase cerca de 2,5 vezes superior no processo contínuo em relação ao descontínuo, ao se empregar elevados valores da vazão específica de alimentação. 35 Já no caso do reator semicontínuo, dependendo da fração de corte empregada, bem como da concentração de polissacarídeo alimentada no instante de realização dos cortes, conseguiu-se obter produtividades em enzima aproximadamente o dobro da obtida no descontínuo, mantendo-s~ praticamente a mesma atividade enzimática no caldo. 36 Já no caso do reator descontínuo alimentado, verificou-se igualmente a possibilidade de obtenção de uma produtividade em enzima cerca do dobro da obtida no descontínuo mas, diferentemente do processo semicontínuo, em decorrência do aumento da atividade enzimática no caldo fermentado/ 7 o que é altamente interessante do ponto de vista das operações de recuperação e purificação da enzima ("downstream''). Assim, conforme se verifica a partir dos exemplos citados, a forma de operação do biorreator é de fundamental importância no desempenho de um determinado processo fermentativo, devendo-se destacar, ainda, que todos os trabalhos acima mencionados são relativamente recentes (de 1989 a 1996), indicando, portanto, uma grande atualidade do tema abordado no presente capítulo. Referências bibliográficas (1) RIESENBERG, D.; SCHULZ, V.; KNORRE, W.A.; POHL,H.D.; KORZ,D.; SANDERS, E. A.; ROSS,A.; DECKWER,W.-D. High cell density cultivation of Escherichia coli at controlled specific growth rate. Journal of Biotechnol., n .20, p .l7-28, 1991. (2) NILSSON, K. ProducÜon of biomolecules by immobilized animal cells. In: MOO-YOUNG, M. Immobilized Enzymes and Cells:Fundamentals and Applications, 1.ed., Nova York, Elsevier Applied Science Publishers Ltd., p.95-9, 1988. (3) MARTIN, N.; BRENNAN, L.D.; DENOME, L.; SHAEVITZ, J. High productivity in mammalian cell culture. 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São também conhecidas por fermentações por batelada ou processo descontínuo de ferme;::ç!.:'~do de operação pode ser descrito assim' no instante inicial a solução nutriente esterilizada no fermentador é inoculada com microrganismos e incubada, de modo a permitir que' a fermentação ocorra sob condições ótimas. No decorrer do processo fermentativo nada é adicionado, exceto oxigênio, no caso de processos aeróbicü;:; (na forma de ar), antiespumante, e ácido ou base para contro1 le do pH. Terminada a fermentação, descarrega-se a dorna, e o meio fermentado segue ara os tratamentos finais. Então, deve-se lavar adorna, esterilizá-la e recarregá-la P com mosto e inóculo. Algumas variações dessa definição, no entanto, podem ocorrer e serão comentadas no item "Classificação". . Conclui-se, pela descrição acima, que se não houver adição de soluções para controle. do processo, nem perda de líquido por evaporação, o volume no decorrer da fermentação permanece constante, o que pode ser considerado mais uma das características do processo descontínuo de fermentação. A fermentação descontínua pode levar a baixos rendimentos e/ ou produ tividades, quando o substrato adicionado de uma só vez no início da fermentação exerce efeitos de inibição, repressão, ou desvia o metabolismo celular a produtos que nãfo interessdam. Além disso,dapresednta "tempos mo~tosf", ou seja, tempos em que o ermenta or não está sen o usa o para o processo ermentativo propriamente dito, tais como tempo de carga e descarga de doma e período correspon- ~d::te :lav:~~~e este~Iiz:::_~fe~=:n:d:~ ._ ....... __ . _ , :;1 \ 1~ ~ 1 ;:· • ·.··. ·:!.· , 1 ! 11 'ia ~~ i!j ~~ !~ .·~·. ~.~.· .·. 1!~1 1 :1 jjll ;1 l l ·I :11; __I i 194 Fermentação descontínua Por outro lado, apresenta menores riscos de contaminação (se comparados com processos contínuos de fermentação), grande flexibilidade de operação, devido ao fato de poder utilizar os fermentadores para a fabricação de diferentes produtos, a possibilidade de realizar fases sucessivas no mesmo recipiente, condição de controle mais estreito da estabilidade genética do microrganismo, assim como a capacidade de identificar todos os materiais relacionados quando se está desenvolvendo um determinado lote de produto, o que é vital para a indústria farmacêutica.2 . Ademais, é o mais utilizado na indústria de alimentos. Alguns dos alimentos e bebidas produzidos por esse processo fermentativo são iogurte, chucrute, picles, cerveja, vinho, entre outros. Neste capítulo abordaremos alguns itens ·que julgamos oportuno destacar, quais sejam: inóculo, mosto, classificação das diferentes modalidades de processo descontínuo, bem como o número de domas de uma indústria de fermentação. 9.2 - lnóculo Chama-se inóculo, pé-de-cuba ou pé-de-fermentação um volume de suspensão de microrganismo de concentração adequada capaz de garantir, em condições econômicas, a fermentação de um dado volume de mosto. 3 Para que se obtenha um inóculo com capacidade produtiva elevada, deve-se dar condições para que o microrganismo desejado seja propagado, que incluem desde sua manutenção até a propagação propriamente dita. Há muitas técnicas para o armazenamento de microrganismos, 4' 5 sendó que cada uma delas pode ser indicada levando em conta a cepa do microrganismo e as condições laboratoriais disponíveis para mantê-la. Têm por finalidade conservar a cepa viável e com capacidade produtiva, mantendo-a, portanto, dentro do possível, com o mínimo de divisões celulares, 1 uma vez que, quando estas ocorrem, há possibilidade de haver mutações .. Algumas delas são: secagem de micrm;ganismos em terra, areia, sílica ou outro material sólido, conservação em ágar inclinado ou outras que limitem o metabolismo e respiração microbiana (aqui se incluem congelamento em congeladores ou em nitrogênio líquido, e manutenção de esporos ou células em água) e remoção da água de células ou esporos por liofilização e manutenção do material seco sob diferentes condições. A recuperação do microrganismo é feita de diferentes maneiras, dependendo da técnica que se adotou para preservá-lo.1' 4 Tão importante é a manutenção da cepa, que muitas empresas de fermentação possuem centros especializados que têm esta função, distribuindo os microrganismos para suas fábricas localizadas nacionalmente ou, mesmo, internacionalmente. Paralelamente, fazem testes de viabilidade, de estabilidade genética, além de empregar metodologias para melhoramento genético. Dessa forma, garantem a qualidade e a reprodutibilidade das cepas microbianas, o que não significa que as fábricas não tenham o seu próprio controle na propagação desses microrganismos. Durante a fase de propagação do inóculo deve-se tornar cuidados especiais de modo a evitar contaminação, pois comprometeria a produção industrial. Nessa lnóculo 195 fase, em processos aeróbios, um foco potencial de contaminação é o ar fornecido ao sistema, o qual deve ser esterilizado. Quando o microrganismo produtor é uma espécie mutante, se ele for auxotrófico, deve-se garantir o suprimento de substâncias requeridas para ó crescimento no meio durante a propagação do inóculo. 6 Além disso, deve-se acompanhar se os microrganismos continuam com capacidade produtiva durante a fase de propagação, pois mutações não são sempre estáveis e eles podem perdê-la, deixando de apresentar capacidade produtiva. O volume de inóculo introduzido no fermentador de produção está comumente ao redor de 10% de sua capacidade útil. No entanto, pode variar de 0,5 a 50%, como assinala BORZANe Afirma, ainda:, que a técnica de preparo do inóculo compreende duas fases: a de laboratório e a industrial (ver Fig. 9.1) . .~/g~ ~~~~·~~ Cultura pura Volume de meio = V1 i ' lncubaçao Volume de meio= V2 >V1 11 l I Volume de -~ ~ ~ !. laboratório ------------- - ---- ~ ------- ~--- :------------------------------i"-----Fase industrial ~1 li [!~ !i f!Í i~ !I i~ lfll -----+Doma I'ii{'· ~~ !:: í I! tl:i Volume de meio= V4>V3 ;;[i!' Volume de meio= V5 >V4 Figura 9.1 - Representação esquemática do preparo do inóculo. 3 A partir da cultura estoque, propaga-se o microrganismo por meio de metodologia conveniente. Normalmente na fase inicial passa-se do meio sólido, em condições assépticas, para um tubo de ensaio contendo meio líquido .e sterilizado, adequado para o desenvolvimento microbiano. Após incubação por um determi- :ri· :~ ~~ fl ~ ~~ . . _._____. . --...,......... --· -.. . __. .. . . . . .. . . _,__., _-~. --.-·. _! 196 Fermentação descontínua nado tempo, que depende do tipo de microrganismo cultivado (pois cada espécie microbiana possui velocidade de crescimento diferente), transfere-se o conteúdo desse tubo a frascos apropriados para agitadores rotativos ou reCíprocos- "shakers"- contendo meio esterilizado (podem ser erlenmeyers lisos ou chanfrados, sendo que estes são utilizados quando se têm microrganismos mais exigentes quanto à aeração). · Após incubação, transfere-se a suspensão microbiana para frascos maiores contendo meio nutriente esterilizado. O número de transferências vai depender do volume útil do pré-fermentador (germinador). Todas as transferências devem ser feitas em condições assépticas (cujos cuidados variam com o processo fermentativo que se deseja realizar) e os frascos devidamente fechados, mas permitindo entrada de ar para microrganismos aeróbios, de modo a evitar contaminação. Dependendo do volume do fermentador de produção, poderá ser necessário mais de um germinador. A cada passo, os organismos devem crescer rapidamente, sendo as transferências feitas na fase logarítmica de crescimento. Apenas na fase que corresponde ao inóculo que será adicionado ao fermentador de produção, pode-se deixar que a cultura atinja a fase de declínio de velocidade de crescimento, caso seja interessante iniciar a fase de produção com células de um estágio mais avançado da curva de crescimento microbiano . . Sugestões para relação entre volume que receberá a suspensão microbiana e o volume desta nas várias etapas de propagação de inóculo são da ordem de 10 vezes/ 20 vezes, 8 mas há indicações para valores possíveis de 100 a 200 vezes. 6' 9 Muito importante, pois, é desenvolver um protocolo para a propagação do in óculo. PARTON; WILLIS 4 apresentam casos interessantes, mostrando que determinados autores conseguiram o aumento de produção de um metabólito secundário quando utilizaram. um pré-fermentador para inocular o fermentador de produção, em vez de utilizar inóculo oriundo de cultivo em agitador rotativo. Também relataram que outros autores conseguiram produzir mais cé]ulas num cultivo para obtenção de biomassa quando utilizaram, como inóculo do fermentador de produção, células na fase logarítmica de crescimento, em vez daquelas em estado de autólise. Assim, o protocolo para propagação, desenvolvido para cada processo, indicará qual a melhor metodologia para se obter o inóculo no menor tempo possível e que leve a maiores rendimentos e/ ou produtividades no processo industrial. 9.3 - Mosto Como já se sabe, cada microrganismo possui condições ótimas de cresCimento tais como: temperatura, pH, nível de oxigênio dissolvido, entre outras. O meio de cultivo, por sua vez, tem influência marcante nesse processo. Em microbiologia, é chamado de meio de cultura. Aqui, na área de fermentações industJ;iais, é chamado de mosto ou meio de fermentação. Deve possuir nutrientes requeridos para o crescimento celular, que PIRT, 10 à parte das fontes de energia, classifica nos seguintes grupos: a) fontes dos elementos "principais" -C, H, O e N; b) fonte dos ~lementos "secundários" -'--'- P, K, S, Mg; c) vitaminas e hormônios; d) fontes Mosto 197 de "traços" de elementos, ou seja, requerimentos de elementos em quantidades mínimas para o crescimento microbiano (por exemplo, Ca, Mn, Fe, Co, Cu, Zn são freqüentemente essenciais para o crescimento microbiano). Na formação de um meio de fermentação (mosto) deve-se levar em conta a necessidade desses nutrientes, lembrando que o meio, além de propiciar o desenvolvimento microbiano, deve favorecer a formação do produto que se deseja. W ANG et al. 11 sugerem! que a formação de um meio de cultivo leve em conta a composição celular, o requerimento energético e a necessidade de substâncias específicas. A composição elementar de uma célula microbiana depende de muitos fatores, como condições de cultivo, espécie do microrganismo, e até mesmo do substrato utilizado para seu crescimento. Porém, a título de orientação, é apresentada na Tabela 9.1 a composição elementar típica de um microrganismo. Tabela 9.1 - Composição elementar típica de microrganismos. 11 ELEMENTO PORCENTUAL DA CÉLULA SECA Carbono 50 Nitrogênio 7-12 Fósforo 1-3 0,5-1,0 Enxofre 198 .Fermentação descontínua Portanto, sua quantidade no meio de cultivo será uma função de quanto se deseja produzir de microrganismo, ou de produto, levando em conta a relação estequiométrica entre substrato e quantidade possível de se produzir de células ou de produto. No entanto, é conveniente lembrar que não se pode ter um mosto com concentrações elevadas de substrato, pois, nestas condições, pode se tornar inibitório para o crescimento microbiano. Quanto ao oxigênio, de importância fundamental às células aeróbias, considerado como um nutriente especial devido às suas particularidades, será comentado em separado (Capítulo 14). Sabendo quais os componentes que devem estar presentes num meio, pode-se lançar mão de dois procedimentos para obtê-lo: a partir de extratos de plantas ou animais, chamados de meios "naturais" (suco de uva, leite, água de maceração de milho, etc.), ou a partir da elaboração de meios quimicamente definidos, chamados de meios "sintéticos". Com a finalidade de elucidar efeitos nutricionais, à medida do possível, estes devem ser os escolhidos, pois aqueles têm a desvantagem de seremde composição indefinida e variável. 10 Por outro lado, podem ser meios bastante ricos e que geralmente não necessitam de complementação para sua utilização como mosto. Do ponto de vista industrial, vários fatores devem ser considerados.12 O custo do substrato pode ser crucial, devendo também ser levada em conta a quantidade de carbono disponível, bem como as exigências para sua fermentação (por exemplo, o fornecimento de oxigênio ao sistema deve ser aumentado, caso utilize um substrato de cadeia carbônica em menor grau de oxidação, como na utilização de hidrocarbonetos como fonte de carbono). O custo é o fator limitante da utilização de meios sintéticos em escala industrial. Outros fatores incluem: suprimento do substrato (a maioria das empresas opta por comprar o substrato no mercado aberto, com possibilidade de comprar de vários fornecedores), disponibilidade (onde se considera se a matéria-prima é sazonal ou não e a possibilidade de seu armazenamento), variabill.dade na composição da matéria-prima, condições de armazenamento, dificuldades de esterilização do mosto, fermentescibil\dade (aqui se deve lembrar que uma aparente não fermentescibilidade não é necessariamente uma restrição se microrganismos alternativos puderem ser encontrados), exigência de tratamentos para tornar o substrato presente na matérii:1-prima fermentescível (por exemplo, num processo de fermentação alcoólica com levedura como inóculo, materiais amiláceos devem ser hidrolisados a fim de se obter açúcares de pequena cadeia carbônica, que serão fermentados) e comportamento do mosto durante e após a fermentação (por exemplo, produção excessiva de espuma e possibilidade de reciclar água residuária). Ainda é .importante destacar que o melhor substrato para uma indústria não é necessariamente o melhor para outra que produz o mesmo produto, pois cada uma tem seu microambiente, onde o custo de transporte, combustível e potência, disponibilidade de água, entre outras, d~ter minam a escolha do substrato. Alguns dos substratos e/ou matérias-primas, possíveis para utilização em cultivos microbianos, são: açúcares, melaços, soro de leite, celulose,. amido, resíduos como liquor sulfítico e ágúa de maceração de milho, metanol, etanol, alcanos, óleos e gorduras, etc. Classificação 199 9.4 - Classificação Em escala industrial, muitos processos são adaptados com vistas a otimizar a produção. O processo descontínuo, por sua vez, também foi sendo adaptado de modo a atender ao objetivo de diferentes indústrias. BORZANI3 classifica os processos descontínuos em três grandes grupos: aqueles em que cada dorna recebe um inóculo, processos com recirculação do microrganismo e processo por meio de cortes. · O primeiro grupo consiste na inoculação de uma dorna com um microrganismo que foi propagado a partir de uma cultura pura, como já comentado anteriormente. Oferece poucos riscos de contaminação se a propagação do inóculo foi feita em boas condições de assepsia. Nas fermentações em que o meio é rico e o microrganismo é altamente suscetível a contaminação, a utilização deste processo é indicada, a menos que o substrato adicionado de uma só vez no início da fermentação leve a resultados insatisfatórios. Os processos com recirculação do microrganismo, como o próprio nome indica, reaproveitam como inóculo o microrganismo da batelada anterior. Para tanto, ou se espera que o microrganismo sedimente no fermentador (como é o caso de cervejarias), ou se centrífuga o meio fermentado, separando assim as células e reutilizando-as. Esse procedimento é comum em destilarias de álcool. No entanto, como há tendência de aumentar o número de contaminantes a cada nova batelada, as usinas normalmente empregam uma metodologia com vistas a eliminá-los. Consiste num tratamento do leite de lêvedo (suspensão de leveduras altamente concentrada, obtida a partir da centrifugação do meio fermentado) com água e ácido sulfúrico. Deixado nessas condições, sob agitação por 2 a 3 horas, proporciona a eliminação de contaminantes, bem como de células que já se apresentem em fase de degeneração. O último grupo da classificação apresentada é assim descrito: 3 "Na fermentação por meio de cortes, opera-se do seguinte modo: inicia-se o trabalho inoculando-se uma dorna (que será chamada de dorna A) com pé-de-cuba; quando a fermentação atinge um estágio apropriado, passa-se parte do conteúdo do fermentador A para um fermentador vazio (que será chamado de dorna B) e, em seguida, enchem-se as duas dornas com meio a fermentar. Essa operação recebe o nome de corte. Diz-se que a dorna A foi cortada para a dorna B ou, ainda, que B recebeu um corte de A" . Esses cortes podem ser feitos na fase de crescimento mais intenso quando se deseja propagar o inóculo, ou após o término do processo fermentativo. A sucessão de cortes pode acarretar sérias quedas no rendimento, principalmente quando se trabalha com meio não esterilizado. Além disso, o número de cortes sucessivos não pode ser. previsto, sendo que o controle do rendimento poderá indicar em que momento deve-se suspender o trabalho por meio de cortes e se iniciar nova fermentação com inóculo novo. 3 No entanto, a produção de cada produto tem suas particularidades e a experiência adquirida ao longo do tempo na fábrica leva o pessoal a decidir quais as modificações que devem ser feitas no processo, aumentando, dia após dia, o rendimento e/ ou a produtividade do mesmo. I . 200 Fermentação descontfnua 9.5 - Número de dornas Tendo em vista o alto custo de um fermentador, bem como o espaço que ocupa, desnecessário é justificar a importância para uma empresa determinar o número de fermentadores que necessita para produzir o que deseja. BORZANe sugeriu uma metodologia para o cálculo do número de fermentadores, a qual pode ser utilizada como caminho para se chegar ao número ideal de fermentadores numa empresa que trabalha com processo descontínuo e que será transcrita a seguir. As pequenas modificações, em relação a seu trabalho original publicado, são, basicamente, algumas passagens matemáticas que serão aqui apresentadas. Consideremos uma instalação de fermentação, funcionando por processo descontínuo, que deva fornecer, de maneira ininterrupta, líquido fermentado ao setor encarregado dos tratamentos finais. Suponhamos, ainda, para simplificar, que não esteja sendo utilizado o processo de cortes. Sejam dados: F = vazão média de líquido fermentado que deve ser fornecido ininterruptamente ao setor de tratamentos finais; t 1 = tempo necessário para que o conteúdo de uma dorna fermente completamente; · V= capacidade útil de cada dorna; D =número de domas, de capacidade útil V, necessário para garantir a vazão F de líquido fermentado; td = tempo necessário para se descarregar uma dorna; te = tempo necessário para se' limpar e carregar uma dorna. O valor da vazão F depende dos seguintes fatores: a) da quantidade de produto final que se deseja obter na unidade de tempo; b) do rendimento dos tratamentos finais que devem conduzir ao produto desejado; · c) da concentração do produto final no líquido fermentado que, pÔr sua vez, é função do processo de fermentação. Se indicarmos com Ma massa de produto final que interessa prpduzir em um tempo t, com r o rendimento dos tratamentos finais e com C a concentração de produto final no líquido fermentado, teremos: t, l/ Ú{ 1,1' ) J; Vjf MJ F=~ C ·t·r 4 / ) ft\, J: : ) 5 ~t MMe ? I i / O valor médio de t1, por sua vez, depende do /;ocesso de fermentação, enquanto que o tempo de descarga td ~o?e-se-r~lcu~o por: , t,d =V ·~ - IF (9.1) . A capacidade útil de cada dorna, ~ã -prática, não pode ser escolhida de maneira completamente arbitrária. Há fabricantes que fixam os tamanhos de domas . Número de domas 20 I que podem oferecerdentro de sua linha normal de trabalho. Há, por outro lado, experiência relativamente pequena na construção de fermentadores de grandes capacidades (diversas centenas de metros cúbicos), principalmente nos processos que exigem borbulhamento de ar e agitação mecânica. Torna-se muito difícil estabelecer, nesse caso, recomendações gerais. A experiência já adquirida no funcionamento de instalações análogas constitui critério mais seguro de escolha de um valor adequado de V dentr~ os possíveis. O valor de te (tempo necessário para limpar uma doma descarregada e carregá-la novamente) varia de caso para caso. Quando se pretende, no dimensionamento de uma instalação, calcular o número de domas, toma-se como ponto de partida: te =td Essa igualdade, totalmente arbitrária, facilita a avaliação de D e pode ser, em muitos casos, obedecida na prática industrial. Feitas essas observações iniciais, necessárias para que se possam interpretar com cautela os resultados obtidos no cálculo de D, passemos a esse cálculo. Consideremos uma doma, que será chamada de doma número 1, em início de trabalho; no intervalo de tempo te·= td, ela será limpa e carregada; decorrido um intervalo de tempo t1, o líquido nela contido estará completamente fermeptado e, após outro intervalo de tempo td, ela seencontrará vazia e em condições de reiniciar seu ciclo de trabalho. Para que não haja interrupção de fornecimento de material fermentado ao setor dos tratamentos finais, quando terminar a descarga da doma número 1 deverá existir uma outra (que será indicada por doma número 2) pronta para ser descarregada. Quando a doma número 2 tiver sido descarregada, deverá existir uma terceira em condições de iniciar sua descarga. Essa seqüência de operações pode ser visualizada na Figura 9.2. Figura 9.2 - Cronograma de funcionamento de dornas em umprocesso descontínuo. (I) Início do preparo da dorna; (2) fim da carga; (3) fim da fermentação; (4) fim da descarga. 202 Fermentação descontínua Deverá existir, portanto, um intervalo de tempo td separando o início de ftmcionamento de duas dornas consecutivas. Nessas condições, tomando-se convencionalmente como instante zero o·início de trabalho da dorna número 1, a doma D deverá começar a funcionar no instante (D-l)td. Por outro lado, comó-indiéa a Figura 9.3, a doma D deverá iniciar seu funcionamento no instante td + tf. Logo, podemos escrever: (D -1) ;td =td +tf (D;;:: 3) :.D=2+tf /td :. D = 2 +(F· tf I V) (9.2) expressão que nos permite calcular o número de domas, desde que conheçamc_>s F, V e tf. (4) ------------------ - - - (3) --------------------- :------f--------------' n"1 (2) ----------------' • Figura 9.3 - Cronograma de funcionamento das domas número I e número D. (I) Início do preparo da doma; (2) 3 fim da carga; (3) fim da fermentação; (4) fim da descarga. Ao procurarmos dimensionar uma instalação, os valores de F e de t são conhecidos, mas os de V podem variar em intervalos muitos àmplos. Surge, portanto, a necessidade de escolher um valor de V para podermos dar andamento ao projeto que nos interessa. Desde que não exista um critério que nos leve a atribuir a V determinados valores, poderemos, com o objetivo de iniciar o dimensionamento que temos em vista, calcular o chamado número econômico de dornas, definido como sendo o número de dornas de custo total mínimo capaz de atender às necessidades da instalação. Esse número econômico, indicado por E, pode ser calculado como segue: sendo p o custo de um fermentador de capacidade útil V, é válida a equação empírica Número de domas p=k·Va 203 (9.3) sendo k e a dois parâmetros que dependem das condições econômicas locais no momento considerado, e O< a< 1. Indicando com P o custo de D fermentadores, temos, combinando as Eqs. (9.2) e (9.3): (9.4) Derivando essa equação e igualando a derivada a zero, obtém-se o ponto de mínimo (menor valor de P), caso em que D é, por definição, igual a E. Como os termos k, F, t1 e a são constantes, pode-se substituí-los por K, que é uma constante fruto das operações que envolvem as constantes acima. Portanto, chega-se a: P = K ·DI (D- 2)a (9.5) Derivando a Eq. 9.5, tem-se: dP dD K·D·a·(D-2)a- 1 -(D-2)a ·K (D -2)2a Considerando (dP!dD) =O, obtém-se: D =E= 2 I (1- a) (9.6) Substituindo a Eq. 9.6 na Eq. 9.2, calcula-se a capacidade útil de cada um dos E fermentadores (V.). Ou seja, Ve =F·tf ·(1-a)l2a (9.7) Pode-se também avaliar o número econômico de dornas, sem determinar os parâmetros da correlaçãq empírica (Eq. 9.3), da seguinte maneira: tendo-se uma lista de preços de domas de diversas capacidades, calcula-se, para cada valor de V desta lista, o correspondente D pela Eq. 9.2; tendo-seDe o preço unitário, calcula-se o preço das D dornas; escolhe-se então, entre os diversos valores calculados, o valor de V, e conseqüentemente de D, que tenha conduzido ao custo total mínimo. Convém salientar que o valor de E poderá não atender a outros requisitos do processo. Quando tal fato acontecer, escolher-se-á então um valor de D que satisfaça a esses outros requisitos e que se situe tão próximo de E quanto possível. Finalizando, as dimensões comumente utilizadas industrialmente para alguns processos fermentativos são apresentadas na Tabela 9.2. 204 Fermentação descontfnua 1 Tabela 9.2 - Dimensões de fermentadores para alguns processos fermentativos VOLUME DO FERMENTADOR (m 3 PRODUTO ) ( Enzimas de diagnóstico, substâncias para biologia molecular. 1-20 t ....~-~ ~~ 40-80 Algumas enzimas e antibióticos. : Penicilina, antibióticos aminoglicosídicos, proteases, amilases, transformação de esteróides, aminoácidos. 100-150 450 .. ·· .. ···::·; :~· y • Aminoácidos (ácido glutâmico). ;..:;.·t~~~-.f, ~ • ~ '\;; ..... '-1 ,, ,. .•L • 1. •. • • : •· . •r -· :: ~ i,,~' Referências bibliográficas (1) CRUEGER, W.; CRUEGER, A. Biotecnhnology: A Textbook of Industrial Microbiology. Madison, Science Tech, Inc., 1984. cap. 5. · (2) BUSHELL, M.E. Aplicación de los princípios de microbiologia industrial a la Biotecnologia. In: WISEMAN, A. Principios de Biotecnologia. Trad. de Carlos Gómez - Moreno Calera. Zaragoza, Editorial Acribia S.A., 1986. p.l14-19. (3) BORZANI, W. Fermentação descontínua. In: BORZANI, W.; LIMA, U.A.; AQUARONE, E. Enge"'haria Bioquímica. São Paulo, Edgard Blücher, 1975. v. 3, p.l05-11. (4) PARTON, C.; WILLIS, P. Strain preservation, inoculum preparation and development. In: MCNEIL, B.; HARVEY, L.M. Fermentation: a practical approach. Oxford, Oxford University Press, 1990. p.39-64. (5) PERLMAN, D.; KIKUCHI, M. Culture maintenance. In: PERLMAN, D.; llfSAO, G.T. Annual Reports on Fermentation Process. Nova York, Academic Press, Inc., 1977. p.41-8. (6) CASIDA JR, L.E. Industrial Microbiology. Nova York, John Wiley and Sons, Inc., 1968. p.l36-141. (7) BLAKEBROUGH, N. Industrial Fermentations. In: BLAKEBROUGH, N. Biochemical and Biological Engineering Science. Nova York, Academic Press, 1967. v. 1, p.25-8. (8) BROWN, C.M.; CAMPBELL, I; PRIEST, F.G. lntroduction to Biotechnology. Oxford, Blackwell Scientific Publications, 1987. p .57. (9) GLICK, B.R.; P ASTERNAK, J.J. 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Embora a utilização desse processo venha desde cerca de 1900 para regular crescimento de Saccharomy~es cerevisiae} os primeiros . a utilizarem o termo "cultura por processo descontínuo alimentado" a título de catalogação foram YOSHIDA et al.,Z para se referirem a uma fermentação descontínua continuamente alimentada com meio nutriente. F mosto Figura I O. I - Esquema ilustrativo do modo de operação de uma fermentação descontínua alimentada. -· . .. · ·-·· -·· .... inóculo ~·- ··--·----- ··- -- ··- - - -·· -"~---~~--- - . ·---~~- ~ ·· ·······- --·-····---~--·· --·----- ·- --~------·- ----·----'-----' 206 Fermentação descontínua alimentada Basicamente, o processo descontínuo alimentado é definido como uma técnica em processos microbianos, onde um ou mais nutrientes são adicionados ao fermentador durante o cultivo e em que os produtos aí permanecem até o final da fermentação. Em alguns casos, todos os nutrientes são gradualmente alimentados à dorna 3 (Fig. 10.1). Adicionalmente, outros ~utores 1 A estendem esse conceito para o acréscimo de aditivos, tais como precursores de produtos. A vazão de alimentação pode ser constante ou variar com o tempo, 5 e a adição de mosto pode ser de forma contínua ou intermitente. Mudança de volume pode ou não ocorrer, dependendo da concentração de substrato e da taxa de evaporação do sistema. Devido à flexibilidade de utilização de diferentes vazões de enchimento de dornas com meio nutriente, é possível controlar a concentração de substrato no fermentador, de modo que, por exemplo, o metabolismo microbiano seja deslocado para uma determinada via metabóli,_ca, levando ao acúmulo de um produto específico: Cada condição de trabalho pode levar a diferentes perfis de concentração não só de substrato, mas também de células e produto. Uma representação esquemática de um comportamento possível para o processo pode ser observada nas Figuras 10.2 e 10.3. Num cultivo, sabe-se que é crescente o número de microrganismos ao longo do tempo, o que leva ao aumento da massa celular na dorna. No entanto, a concentração de microrganismos pode ter um perfil decrescente durante o período correspondente ao enchimento da dorna (Fig. 10.2). Isso pode ocorrer, pois a concentração celular não depende somente da massa de microrganismos, mas também da variação de volume decorrente da adição de mosto à dorna. Por outro lado, deve-se lembrar que, após a fase de enchimento da dorna, o processo passa a ter caraCterística de processo descontínuo clássico (sem entrada ou saída de fluido da dorna) e a fermentação termina no instante a partir do qual a massa de produto na dorna permanece constante (Fig. 10.3). • X. X t TE t TF Figura I 0.2 - Massa celular (Mx) e concentração celular (X) em função do tempo para um proceso descontínuo alimentado (curvas hipotéticas, pois X, por exemplo, poderia ser constante ou crescente no período de enchimento da doma). 207 Aplicações Deve-se salientar que parte do desenvolvimento do processo descontínuo alimentado tem se dado empiricamente em escala industrial,6 e estas informações, quase sempre determinantes da viabilidade da produção industrial, constituem segredo industrial e dificilmente são divulgadas . . ' v' ,Vf Figura I 0.3 - Volume de meio (V), concentração de substrato (S) e massa de produto (Mp) na doma em função do tempo para um processo descontínuo alimentado (curvas hipotéticas, neste caso, com vazão constante de alimentação). Ao longo deste capítulo, abordaremos alguns casos onde a aplicação do processo descontínuo alimentado possa ser indicada, bem como uma classificação e alguns modelos matemáticos para representá-lo. I 0.2 - Aplicações Antes de 1940 a maioria dos processos fermentativos envolvia a conversão de carboidratos a outros compostos orgânicos simples. Seguindo o sucesso da aplicação das fermentações, descontínuas alimentadas para produção de levedura, tentou-se a utilização destas (com adição de um ou mais componentes necessários ao metabolismo do microrganismo) para a produção de glicerol, acetona, butanol, ácido lático e outros materiais, resultando, em muitas ocasiões, em um melhor controle do processo de fermentação e mais eficientes utilizações dos componentes do meio. 4 Esse êxito se deve a inúmeros fatores, discutidos amplamente na literatura, que podem agir isoladamente ou em conjunto para os mais diversos tipos de produtos e/ ou células obtidos por fermentação . Algumas das finalidades ao se empregar as fermentações descontínuas alimentadas são relacionadas a seguir. I 0.2.1 - Minimização dos efeitos do controle do metabolismo celular Para que um microrganismo tenha sua sobrevivênciagarantida no meio ambiente, ele tem necessariamente de ser eficiente, ou seja, não deve desperdiçar energia. Devido a isso, dispõe de mecanismos regulatórios em seu metabolismo, que previnem que não haja superprodução de um determinado produto ou síntese de uma enzima desnecessária, entre outros. A utilização do processo descontínuo ; I ! .[ ----- ~- • ·- ---- -- ···-·· - -·- - --- -·-- -· ~ ______ _:._.L 208 Fennentação descontínua alimentada alimentado de fermentação pode ser útil quando se procura contornar alguns desses mecanismos. Em microrganismos, glicose ou outras fontes de carbono rapidamente metabalizáveis reprimem a expressão de genes qU:e codificam enzimas relacionadas ao metabolismo de outras fontes de carbono. Esse fenômeno é conhecido como repressão catabólica. 7 Muitas enzimas, especialmente aquelas envolvidas em caminhos catabólicos, estão sujeitas a essa regulação repressiva. Uma importante técnica p~ua superar repressão catabólica na biossíntese de enzimas é a cultura por batelada alimentada em que a concentração de glicose no meio em fermentação é mantida baixa, onde o crescimento é restringido, e a biossíntese de enzima desreprimida.3,8 Na produção de levedura de panificação procura-se minimizar o efeito glicose através da utilização de diversas técnicas de alimentação de domas/ mantendo-se baixos os níveis de concentração de açúcar no meio em fermentação. Evitando que esse substrato seja deslocado para produção de etanol, aumenta-se a eficiência de transformação da fonte de carbono em células. Muito ligado à repressão catabólica está um mecanismo de regulação denominado indução. Também é chamado de desrepressão, uma vez que os genes que . codificam a síntese de enzimas induzidas estão usualmente reprimidos e, em presença de um substrato e/ ou indutor, são desreprimidos, liberando a síntese da respectiva enzima. Diversas enzimas do catabolismo têm sua biossíntese regulada desse modo. 10 Por exemplo, em processos fermentativos cujo produto seja uma proteína recombinante, a indução de proteases se dá quando ocorre a diminuição da concentração de nitrogênio no meio. 11 Trabalhando com E. coli recombinante para produção de somatotropina bovina, YOON et al. 11 conseguiram evitar que esta fosse degradada por proteases, por meio da adição de extrato de levedura como fonte de nitrogênio orgânica, o que evitou a indução (desrepressão) dos genes que controlam a formação de proteases. Repressão catabólica também tem influência na produção de metabólitos secundários. Glicose tem efeito repressor na formação de alcalóides de ergot, cefalosporina C, indolmicina, bacitracina, estreptomicina, neomicina, novobiocina, penicilina, entre outras. 10 Também nesses casos a utilização do processo descontínuo alimentado com a finalidade de manter baixas concentrações de glicose pode ser indicada, em vez de se utilizar uma fonte de carbono que não seja repressora. Como normalmente as maiores velocidades de crescimento microbiano ocorrem com valores de concentração de substrato no meio em fermentação maiores que aqueles onde os efeitos de repressão catabólica são minimizados, há sugestão que se conduza o processo fermentativo em duas fases: a primeira, onde se forneça mais substrato e se obtenha o aumento da biomassa e outra, onde se diminua o fornecimento de substrato de fal.forma a linütar a concentração de substrato e a velocidade do crescimento celular, de modo que haja desrepressão e a enzima e/ou produto desejado seja produzido. 8 Essa técnica permite, portanto, que alguns processos fermentativos, principalmente aqueles em que a formação de produto não seja associada ao crescimento, sejam estendidos, trabalhando por um período maior com as células em condições onde ocorra a produção do produto desejado. Aplicações 209 Outro mecanismo de regulação que a célula rnicrobiana possui, especialmente útil no anabolisrno, é a ,inibição por "feedback" (retroinibição). Muitas enzimas biossintéticas são inibidas por produtos finais.10 Um meio de reduzir a formação de produtos finais indesejáveis (que exercem inibição e/ ou repressão das enzimas que levam à formação do produto desejado) é trabalhar com rnutantes auxotróficos (rnutantes nutricionais), controlando a alimentação do nutriente requerido para seu crescimento. Essa técnica é comumente utilizada na produção industrial de arninoácidos. 3 I 0.2.2 - Prevenção da inibição por substrato ou precursores Nutrientes tais corno metano!, etanol, ácido acético e compostos aromáticos inibem o crescimento de microrganismos, mesmo a concentrações relativamente baixas.3 Por outro lado, qualquer fonte nutriente pode se tornar inibitória, dependendo de sua concentração no meio, do ·m icrorganismo e das condições de fermentação. Por exemplo, muitos pesquisadores concordam, de um modo geral, que a inibição pelo substrato começa a ~er significativa para valores superiores a 100 g/L em fermentações alcoólicas com Saccharomyces cerevisiae e glicose corno . 1mente, em rnmtas . ferrnentaçoes, d eve-se a d Icwnar .. su b strato. 121314 ' ' Ad.Icwna precursores para se obter maior quantidade de produto, os quais, muitas vezes, são tóxicos para a microrganismo a partir de determinadas concentrações no caldo de cultivo. Em todos esses casos, o controle da vazão de alimentação permite que se evite o trabalho em condições inibitórias, melhorando a produtividade e/ou rendimento desses processos ferrnentativos . I 0.2,3 - Minimização da formação de produtos de metabolismo tóxicos A produção de produtos de metabolismo tóxicos é particularmente crítica em processos onde se deseja a obtenção de altas densidades celulares. Alguns dos casos onde se visa tais níveis de concentrações ceh.~lares são fermentações com microrganismos recornbinantes e com células animais, urna vez que, geralmente, esses agentes de fermentação produzem pouco produto . O aumento do número de células compensaria essa deficiência. Para se conseguir tal objetivo é necessário restringir a velocidade de crescimento devido a limitações de transferência de oxigênio, bem corno transferência de calor. 15 Em E. coZi, fonte de carbono em excesso, mesmo em aerobiose, leva à formação de ácido acético 16 (inibidor de crescimento), que de certa forma está relacionada ao aumento da velocidade de crescimento do rnicrorganisrno. 11 Por outro lado, no cultivo de células animais, os produtos tóxicos mais comuns são lactato e arnônia. 17 Em ambos os casos acima, o controle da velocidade de fornecimento de substrato ao sistema permite que se mantenha a velocidade de crescimento celular em intervalos desejados e/ ou minimize a formação de produtos tóxicos para as células, possibilitando que se consiga altas concentrações destas e, também, aumentei na quantidade de produto formado . ~ .. 2 IO Fermentação descontínua alimentada I 0.2.4 - Superação de problemas freqüentes de estabilidade em processo contínuo Contaminação, mutação e instabilidade de plasmídeo são algumas das dificuldades de manter estável um processo contínuo. Nesses casos, utiliza-se o processo descontínuo alimentado com a finalidade de superá-las. 1 I 0.2.5 - Adequação do processo fermentativo a condições operacionais No Brasil, o aumento da capacidade de produção de etanol das unidades industriais forçou o aumento da capacidade volumétrica e do número de fermentadores.18 Apesar de grande parte das instalações industriais anteriormente virem trabalhando com o processo descontínuo clássico, não foi mais possível mantê-lo, devido a problema de intensa formação de espuma, que era menos significativo quando se operava com domas de pequena capacidade volumétrica, sem levar em conta efeitos de inibição pelo substrato, que pode ocorrer quando a concentração de substrato atinge maiores valores no meio de fermentação . Surgiu, então, a aplicação do processo descontínuo alimentado para contornar esses problemas. Em estudo de vazões de enchimento de dornas, vazões decrescentes levaram a maiores produtividades em etanol. 19'20'21 '22 AQUARONE et al.19 concluem que vazões decrescentes levam a maiores produtividades em etanol e minimizam problemas com espuma, pois a velocidade de adição de açúcar é máxima no início, quando se têm menores volumes de meio em fermentação e ainda não há inibição por etanol, e mínima no final da fase de enchimento. No caso de ter-se um nutriente que seja instável nas condições de fermentação, e cujo custo justifique sua utilização, ele pode ser usado, desde que seja adicionado aos poucos, ajustando a velocidade de adição à velocidade de consumo pelo microrganismo. Também em processos aeróbios de períodos mais extensos, tais como em fermentações de antibióticos (1 a 2 semanas), pode-se incorporar o substrato a ser adicionado no líquido de reposição de perda por evaporação. 3'23 Aqui o processo descontínuo alimentado concatena dois objetivos: repõe líquido que o sistema perde e alimenta-o com o substrato. I 0.2.6 - Estudo de cinética de processos fermentativos Processo descontínuo alimentado é útil para o estudo de cinética de processos fermentativos, pois permite a manutenção de baixos níveis de substrato por longo período de tempo, que é favorável à estimação de parâmetros cinéticos}4 permite manter concentração celular constante e controlar velocidade de crescimento em condições transientes. Ademais, há evidências que as máximas velocidades de alguns processos podem ser encontradas somente nessas circunstâncias. 25 I0.3 - Classificação Devido à diversidade de aplicações do processo descontínuo alimentado, algumas variações podem decorrer com a finalidade de ajustá-lo à produção de di- Classificação 2I I versos produtos obtidos por fermentação, sendo qualificados na literatura por terminologias complementares. Processo descontínuo alimentado ,r.ep.eti-tUm-é aquele em que uma fração constante de volume de cultura é removida a intervalos de tempo fixos, podendo ser mantido indefinidamente. 6' 26 Em outras palavras, de tempos em tempos, retira-se rapidamente um determinado volume de meio fermentado da doma (o qual será destinado à separação do produto fermentado), sendo recomposto até seu va27 lor máximo através da adição de mosto com vazão de alimentação conveniente. Terminada a fermentação, repete-se o procedimento, que será interrompido se cair a produtividade e/ ou rendimento do sistema, que podem ocorrer, por exemplo, se houver contaminação. Enchimentos e esvaziamentos repetidos de volumes específicos resultam numa operação cíclica de variação de volume/8 sendo designado por estes autores como processo descontínuo alimentado cíclico, como assinalam MOR! et al. 29 Esse tipo de processo tem sido utilizado industrialmente para produção de levedura e de antibióticos/8 com o intuito de aproveitar como inóculo o microrganismo que está crescendo com alta velocidade de crescimento e de trabalhar com as células que estão na fase produtiva por mais tempo, respectivamente, levando ao aumento de produtividade do sistema. ·Processo descontínuo alimentado -~t~ndido descreve o modo de operação em que a concentração de substrato limitante é mantida constante no meio em fermentação pelo suprimento contínuo do nutriente.30 ' 31 Como o próprio nome sugere, tem por finalidade estender o período de fermentação; mantendo níveis de · concentração de substrato no reator adequados para que as células continuem com atividade fermentativa direcionada para a formação do produto desejado. Tanto a fermentação descontínua alimentada como a descontínua alimentq.da estendida usualmente cobrem somente um ciclo de operação e diferem do processo descontínuo alimentado repetitivo 32 (cíclico) quanto à duração da periodicidade aplicada à cultura. O processo descontínuo alimentado pode ser dividido em dois grupos, baseados no fato de a adição de substrato ser ou não controlada por um mecanismo de retroalimentação 1' 3 (Tab. 10.1). I No modo de operação com controle por retroalimentação, o fornecimento de substrato pode ser controlado em função da concentração deste no meio de fermentação (controle direto) ou em função de outros parâmetros (controle indireto), tais como densidade óptica, pH, quociente respiratório, entre outros. Por outro lado, o suprimento de substrato ao sistema é feito intermitentemente ou de forma ininterrupta· até o final da fase de enchimento da doma nos processos não sujeitos ao controle por retroalimentação. Além disso, pode-se alimentar com vazões constantes ou variáveis. Em ambos os modos de operação, o que se visa é a otimização dos valores da concentração de substrato no fermentador, com vistas a aumentar o rendimento e/ ou produtividade do processo fermentativo. Há casos em que se visa manter uma determinada concentração de nutriente no caldo em fermentação e outros em que se deseja que ela oscile de acordo com um perfil definido, considerado como ótimo.U 212 Fermentação descontfnua alimentada Tabela I 0.1 - Classificação de técnicas de processo descontínuo alimentado. EXEMPLO TÉCNICA Condição Com controle por retroalimentação Método Substrato/ aditivo Produto Indireto Quociente respiratório Melaço Levedura ' h I: !! Adição com taxa constante :.-~···j·· ·;,·-~,:~~~·;:·,· ·_:.·:·""/i'·~ •. ,';'~e· Etanol Nenhum Ácido fenilacético Penicilir1a Glicerol P-galactosidas e Etanol Proteína microbiana Nenhum Nenhum .... I ~i Proteína microbiana Etanol Direto Adição com taxa exponencial I0.4 - .... ' t Parâmetro de controle In termi tente ou incrementos Sem controle por retroalimentação 1 , .. ,,.J-J r..,.. ,:I • «. -' .f:, • ,;• rl .. {;·. , 1. •' -·: ., -~..-: 1· .... .'! Modelos matemáticos A utilização de equações que representam um processo pode permitir a estimação de parâmetros, bem como sua otimização. Consideraremos aqui modelos que foram desenvolvidos para fermentadores agitados (homogêneos), alimentados com mosto constituído de um substrato limitante.33 • I 0.4.1 - Modelo para células Tem-se que a velocidade de variação de massa de células no reator corresponde à massa celular formada decorrente do crescimento microbiano. Algebrica~ mente: (10.1) dMx dt --=j.i·V ·X (10.2) d(V . X) = ll · V · X (10.3) dt Modelos matemáticos dV dX - . X + - . V = J.! . V. X dt dt 213 (10.4) Considerando que a variação de volume na doma deve-se exclusivamente à alimentação: dX F·X+-·V=J.!·V·X (10.5) F dX -·X+-=J.!·X v dt (10.6) dX :.D·X+-=J.l·X (10.7) dX -=(J.t-D)·X dt (10.8) dt dt Notar, pela eq. 10.8, que se não houver variação da concentração celular no decorrer do tempo, isto é, dXI dt =O, tem-se a igualdade J.! = D. Nessa condição, a velocidade específica de crescimento celular é numericamente igual à vazão específica de alimentação. Exemplificando: Num processo onde o volume varie de V; a Vf e se alimente a dorna com vazão constante F ternos que V= V;+ F· t. Assim, D decresce com o tempo de acordo çorn a expressão: (10.9) D =F I (Vi +F . t) Desta forma, se dXI dt =O, J.! = D =F I (V; + ·F· t), decrescendo, neste caso, ao longo do tempo. I 0.4.2 - Modelo para substrato A velocidade de variação da massa de substrato no ferrnentador corresponde à diferença entre a massa de substrato adicionada por tempo e a utilizada para o crescimento celular. Pode ser representada pela expressão: dMsr =F ·S - dMsc dt m dt d(V. ·S) =F·S dt . (10.10) dM s_c · ___ - · - (10.11) dt m · 0-- -000 o o -- • ••••o - - · - ·- -- -- - 2 14 Fermentação descontínua alimentada dV dS _ d.Msc -·S+-·V=F·S dt dt m dt (10.12) Considerando que a variação de volume na dorna deve-se exclusivamente à alimentação: ~ - f+-dS =.f .s _..!._ d.Msc V dt V m V dt dS D ·S+-=D·S -rs dt m onde: rs (10.13) (10.14) =velocidade de consumo de substrato dS=D ·(S -S)-r dt .m s. Sabendo que Yx/s (10.15) = rxfrs , chega-se a: dS 1 - =D ·(S - S ) - - · r dt m Yx;s X dS 1 -=D·(Sm -5)--·J..L·X dt Yx;s (10.16) (1q.17) A eq. 10.17 é uma equação simplificada, estando de acordo com trabalhos descritos na literatura. Há autores, entretanto, que sugerem equações mais completas, onde consideram que uma parcela do substrato vai para crescimento celular e outra para a manutenção,3.6 e até parcela que considera substrato deitinado à formação de produtos complexos. 34 Também aqui, vale lembrar que o valor de D é variável com o tempo, diferenciando a equação acima daquela proposta para balanço de substrato de um processo contínuo com doma única/5 onde o valor de D é fixo. I 0.4.3 - Modelo para produto A velocidade de variação de massa de produto no fermentador depende da massa que é formada devido ao metabolismo microbiano. Ou seja: (10.18) d(V . P) = ll dt .V . X p . (10.19) Modelos matemáticos 215 Considerando que a variação de volume na doma deve-se exclusivamente à alimentação, tem-se: · dP dt F·P+-·V=~p · V·X (10.21) ·X (10.22) ·X-D·P (10.23) dP dt D · P+-=~p dP dt -=~p onde: ~p ·X = rp Nomenclatura: D: Vazão específica de alimentação (h-1) F: Vazão volumétrica de alimentação (L/h) MP: Massa de produto no fermentador (g) M .c: Massa de substrato consumida pelo microrganismo (g) M.r: Massa de substrato (residual) no fermentador (g) M,: Massa celular no fermentador (g de matéria seca) P: Concentração de produto no fermentador (g/L) rP: Velocidade de formação de produto (g/L.h) r.: Velocidade de consumo de substrato (g/L.h) r,: Velocidade de crescimento celular (g de ~atéria seca/L.h) S: Concentração de substrato residual no fermentador (g/L) Sm: Concentração de substrato no mosto de alimentação (g/L) t: Instante t (h) TE: Tempo de enchimento do fermentador (h) TF: Tempo de fermentação (h) V: Volume de meio no fermentador (fase líquida+ fase sólida) (L) V;: Volume de inóculo (L) Vf: Volume final de meio no fermentador (máximo valor de V)(L) . X: Concentração celular no fermentador (g de matéria seca/L) 1 ~:Velocidade específica de crescimento celular (h- ) 1 ~P: Velocidade específica de formação de produto (h- ) Y, 1.: Fator de conversão de substrato limitante em células (g de massa celular seca formada/ g de substrato consumido) 2 16 Fermentação descontínua alimentada (dMP/dt): Velocidade de variação da massa de produto no fermentador (g/h) (dMP/ dt)c: Velocidade de formação de produto em termos mássicos (g/h) (d.M.cl dt): Velocidade de consumo de substrato em termos mássicos (g/h) (d.M.rfdt): Velocidade de variação da massa de substrato residual no fermentador (g/h) (dMx/dt): Velocidade de variação de massa celular seca no fermentador (g de matéria seca/h) (dMxfdt)c: Velocidade de crescimento celular em termos mássicos (g de matéria seca/h) (dP /dt): Velocidade de variação da concentração de produto no fermentador (g/L · h) (dS/dt): Velocidade de variação da concentração de substrato residual no fermentador (g/L · h) (dV I dt): Velocidade de variação de volume na doma (L/h) (dX/ dt): Velocidade de variação da concentração celular no fermentador (g de matéria seca/L ·h) Referências bibliográficas (1) BROWN, A. 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São Paulo, Edgard Blücher, 1975, p .l17. • 219 ·_-_-_--·==-==-=-==--=============== --- --------- - - - - - - Walter Borzani I 1.1 - Definição O processo ferrnentativo recebe a denominação de sernicontínuo quando, urna vez colocados no reator o meio de fermentação e o inóculo, as operações que se seguem obedecerem à seguinte ordem: Operação n. 0 l-Aguarda-se o térrnino .da fermentação. Operação n. o 2 - Retira-se parte do meio fermentado, mantendo-se, no reator o restante de mosto fermentado. Operação n. 0 3 - Adiciona-se ao reator um volume de meio de fermentação . igual ao volume de ineio fermentado retirado na Operação n. 0 2. O meio de fermentação adicionado na Operação n .0 3 encontra, no reator as células rnicrobianas existentes no meio fermentado que nele foi mantido. Em outras palavras, o meio fermentado não retirado do ferrnentador na Operação n .0 2 serve de inóculo ao meio de fermentação adicionado na Operação n. 0 3. Reinicia-se, desse modo, a seqüência de operações acima descrita, que será repetida enquanto não houver queda da produtividade do processo. Em alguns casos o meio fermentado retirado do ferrnentador (Operação n. o 2) é submetido a urna centrifugação, para separar os microrganismos nele existentes, microrganismos estes que voltam ao reator juntamente com o meio de fermentação citado.na Operação n. 0 3. Um processo corno o aqui descrito chama-se sernicontínuo, porque são intermitentes tanto o fluxo de entrada do meio no reator quanto o de saída de material ferrnen ta do. O antigo processo de fabricação de vinagres a partir de vinho, conhecido corno processo lento (ou processo francês ou, ainda, processo de Orleans), é um exemplo típico de processo sernicontínuo (ver Vol. 4, Capítulo 6). 220 Fermentação semicontínua I 1.2 - Produtividade do processo semicontínuo A produtividade de um processo fermentativo depende de muitos fatores, tais como: microrganismo utilizado, método de preparo do inóculo, concentração microbiana no fermentador, composição do meio, temperatura, pH, fornecimento de oxigênio e de nutrientes durante o desenvolvimento da fermentação, e outros mais. Nosso objetivo neste momento, é, porém, bastante específico. Para definir esse objetivo de maneira a não deixar margem a dúvidas, chamemos de V o volume total de meio inoculado existente no reator e já completamente fermentado (Operação n . 0 1), e de a· V (sendo O< a< 1) o volume de meio fermentado retirado do reator na Operação n. o 2. Interessa-nos saber de que maneira a fração a afeta a produtividade do processo. Não é difícil mostrar que a afeta a produtividade. Para tanto, indiquemos por: 5 0 = concentração do substrato principal (geralmente, a fonte de carbono) no meio de fermentação, substrato este que será totalmente consumido. N 0 = concentração de outro nutriente importante para a atividade vital do microrganismo (como a fonte de nitrogênio, por exemplo) no meio de fermentação. P1 =concentração do produto no meio fermentado. N 1 = concentração, no meio fermentado, do outro nutriente importante para a atuação do microrganismo. xf = concentração microbiana no meio fermentado. Se, na Operação n .0 2, o volume de meio retirado do reator é a· V, o volume de meio remanescente será (1-a)V. Conseqüentemente, na Operação n. 0 3 serão misturados um volumf (1-a)V de meio fermentado e um volume a ·V de meio de fermentação. Podemos então calcular, na mistura resultante: a) concentração do substrato principal (S;): (11.1) b) concentração do outro nutriente já citado (Ni): (11.2) c) concentração microbiana (Xi), admitindo-se que não haja retorno, ao reator, dos microrganismos existentes no volume de meio fermentado a · V: · (11.3) Produtividade do processo semicontínuo 22 I d) concentração do produto (PJ (11.4) O tempo para se completar a fermentação da mistura resultante da Operação n. 0 3 (e, conseqüentemente, a produtividade do processo) depende: a) do valor de Xil porque quanto maior for a concentração microbiana inicial, menor será o tempo de fermentação. b) do valor de S;, uma vez que quanto maior for a concentração inicial do substrato, maior será o tempo necessário à sua transformação em produto; c) do valor de N;, pois se a concentração inicial do outro nutriente já referido não for adequada, as células microbianas trabalharão mais lentamente; d) do valor de Pv porque o produto da fermentação é, muito freqüentemente, um inibidor da atividade microbiana, o que pode acarretar maior tempo para se atingir fermentação completa. Mas as eqs. (11.1) a (11.4) nos mostram que S;, N;, X; e P; dependem de a. Logo, a afetará a produtividade do p~ocesso. A Figura 11.1 mostra, esquematicamente, de que maneiras a pode influir na produtividade. · a Figura 11.1 - Representação esquemática de possíveis influências de a na produtividade do processo semicontínuo. Não cabe, em um curso de graduação, examinar pormenorizadamente os resultados representados na Figura 11.1. Os interessados poderão, contudo, consultar a literatura indicada no final deste Capítulo. Duas situações particulares, porém, devem ser comentadas, a saber: a) Se a = 1, isto é, se na Operação n. o 2 retirarmos todo o meio fermentado existente no reator e o substituirmos por meio de fermentação, não se processará mais qualquer transformação, porque não haverá células microbianas para servi- 222 Fermentação semicontínua rem de inóculo ao meio adicionado. Em outras palavras, a produtividade será nula. b) Se a. se aproximar de zero, o volume de meio fermentado periodicamente retirado do reator (Operação n. o 2) será muito pequeno quando comparado com o volume de meio fermentado remanescente, e o processo semicontínuo se aproximará do contínuo. I 1.3 - Comentários finais Em que pese o fato de o processo semicontínuo apresentar relativamente poucas aplicações, seu emprego, principalmente quando o volume de produção é relativamente pequeno, pode apresentar algul}las vantagens significativas, destacando-se: a) possibilidade de operar o fermentador por longos períodos (às vezes, alguns meses) sem que seja necessário preparar um novo inóculo; b) possibilidade de aumentar a produtividade do reator apenas modificando-se o cronograma de trabalho; c) possibilidade de, uma vez conhecidas as melhores condições de operação, conseguir produtividade significativamente maior do que a obtida em processo descontínuo. 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A manutenção de volume constante de líquido no reator é de primordial importância, a fim de que o sistema atinja a condição de estado estacionário ou regime permanente ("stead,y state"), condição na qual as variáveis de estado (concentração de células, de substrato limitante e de produto) permanecem constantes ao longo do tempo de operação do sistema. De fato, o processo contínuo caracteriza-se fundamentalmente por ser um sistema que pode operar por longos períodos de tempo em estado estacionário, decorrendo desta situação uma série de vantagens em relação ao processo descontínuo tradicional, conforme será visto adiante. Entretanto, á manutenção de volume constante no reator significa teoricamente a necessidade de se contar com vazões idênticas de alimentação e de retirada de meio, o que é praticamente impossível de se obter na prática. Por essa razão, utilizam-se em geral sistemas de retirada de líquido por transbordamento ("ladrão"), de forma a manter o nível de líquido constante ou, ainda pode-se empregar bombas de alta vazão na saída, acionadas intermitentemente, de forma a manter uma massa constante no reator. Para essa finalidade, alguns fermentado. res de làboratório mais modernos contam com um sistema automático de controle da massa do reator, através da manutenção do mesmo sobre uma balança, a qual comanda o acionamento das bombas de alimentação e de retirada de líquido. Outro problema que pode igualmente comprometer a manutenção de volume constante, principalmente em processos aerados, é a formação intensa de espu...--~ .. - ·- - · · -----·--·--- ·------·-···--·-- - - - - -- ---~------ -- ------ - -- 224 Fermentação contínua ma, que deve ser evitada, seja através da utilização de antiespumantes apropriados, ou através de sistemas mecânicos de quebra de espuma. Tais problemas tornam-se particularmente críticos quando se opera ~m reatores de pequena capacidade, onde se torna de vital importância a precisãb no estabelecimento das vazões de alimentação e de retirada do caldo fermentado .. · 12.2 - Vantagens e desvantagens do processo contínuo em relação ao· descontínuo Conforme mencionado anteriormente, as principais vantagens apresentadas pelo processo contínuo de fermentação, em relação ao descontínuo tradicional, são decorrentes da operação em estado estacionário, podendo-se destacar: ·• aumento da produtividade do processo, em virtude de uma redução dos tempos mortos ou não-produtivos; • obtenção de caldo fermentado uniforme, o que facilita o projeto das operações de recuperação do produto de interesse ("downstream"); • manutenção das células em um mesmo estado fisiológico, o que torna o processo contínuo uma excelente ferramenta para estudos de mecanismos de regulação metabólica 1' 2 ou, ainda, para estudos de otimização da com. - d e melO . d e cultura; 3'4'5'6 postçao • possibilidade de associação com outras operações contínuas na linha de produção; • maior facilidade no emprego de controles avançados; • menor necessidade de mão-de-obra. Entretanto, ao lado das inúmeras vantagens apontadas, o processo contínuo de fermentação apresenta também algumas desvantagens ou problemas práticos, que podem limitar o emprego deste tipo de sistema em escala industrial, para alguns processos fermentativos. Assim, podem-se destacar: • • maior investimento inicial na planta; • possibilidade de ocorrência de mutações genéticas espontâneas, resultando na seleção de mutantes menos produtivos; • maior possibilidade de ocorrência de contaminações, por se tratar de um sistema essencialmente aberto, necessitando pois, de manutenção de condições de assepsia nos sistemas de alimentação e retirada de meio, desde que o processo assim o exija; • dificuldades de manutenção de homogeneidade no reator, quando se trabalha com baixas vazões, ou quando o caldo adquire comportamento pseudoplástico, como é o casodo cultivo de fungos filamentosos; \!] dificuldades de operação em estado estacionário em determinadas situações (formação de espuma, crescimento do microrganismo nas paredes do reator, ou ainda, nos sistemas de entrada e saída de líquido). Apesar dos problemas acima mencionados, a utilização do processo contínuo de fermentação encontra grande aplicação prática, podendo-se citar como exemplo típico a fermentação alcoólica, onde se utiliza normalmente, em escala Formas de operação no sistema contínuo 225 industrial, o processo contínuo com reciclo de células ou, ainda, o processo contí-. nuo em múltiplos estágios/ permitindo, desta forma, a obtenção de elevados rendimentos, bem como elevadas produtividades do processo. Outro importante exemplo de utilização do processo contínuo em larga escala é o tratamento biológico de resíduos, em reatores de fluxo ascendente (tipo UASB), empregados para o tratamento de uma grande variedade de efluentes industriais, tais como os oriundos de fábricas de cerveja~ e refri~erantes, de fábricas de laticínios e de indústrias alimentícias de um modo geral. 8' 9' 0 Deve-se ressaltar que ambos os casos de emprego da fermentação contínua acima citados, são processos não assépticos, nos quais se empregam reatores de enormes capacidades, podendo chegar a até alguns milhões de litros. Por outro lado, para processos exigentes em termos de manutenção de condições de assepsia, como é o caso da produção de enzimas e antibióticos, o processo contínuo encontra ainda aplicação restrita, devido principalmente à possibilidade de ocorrência de contaminações, conforme mencionado anteriormente. 12.3 - Formas de operação no sistema contínuo O processo de fermentação contínua normalmente tem início em um processo descontínuo, ou seja, carrega-se inicialmente o reator com meio de cultura, procede-se à inoculação com o microrganismo responsável pela conversão, sendo que, após algum período de operação descontínua, inicia-se a'alimentação de meio de cultura e retirada de caldo, dando-se início efetivamente ao processo contínuo. Dependendo do instante em que se inicie o processo contínuo propriamente dito, bem como da vazão de alimentação empregada, o sistema poderá convergir com maior ou menor rapidez à situação de estado estacionário. Assim, recomenda-se usualmente que se inicie a alimentação com o cultivo em fase exponencial, e contendo uma concentração celular a mais elevada possível. O sistema contínuo de fermentação é extremamente versátil quanto às suas várias possibilidades de operação, tais como: • Contínuo em um único estágio (um único reator): • sem reciclo de células • com reciclo de células • Contínuo em múltiplos estágios (n reatores em série): • com uma única alimentação (com ou sem reciclo de células) • com múltiplas alimentações (com ou sem reciclo de células) Cada uma dessas diferentes opções irá resultar em distintos comportamentos das variáveis de estado (concentràção de células, de substrato e de produto) nos diversos estados estacionários possíveis, podendo-se, assim, definir faixas ideais de operação do sistema, tendo como objetivo básico a obtenção de elevadas produtividades do processo. Nos subitens seguintes, focalizar-se-á, com detalhes, cada uma destas diferentes formas de operação no sistema contínuo. 226 Fennentação contínua 12.3.1 - Equacionamento para o reator contínuo ideal sem reciclo de células A Figura 12.1 mostra, esquematicamente, um sistema empregado para a realização de um cultivo contínuo em um único estágio, sem recirculação de células. O meio de cultura contendo o substrato limitante em uma determinada concentração, é alimentado a uma vazão constante. Admite-se agitação perfeita, de forma que o reator possa ser considerado como homogêneo. Assim, portanto, admite-se que cada porção de meio alimentada no reator seja instantaneamente misturada no volume de reação, de forma que o líquido efluente possuirá as mesmas concentrações de células, substrato e produto, que aquelas existentes no meio de reação. F X,S,P Figura 12.1 - Sistema contínuo em um único estágio, sem reciclo de células Definem-se, pois, as seguintes variáveis: F= vazão volumétrica de alimentação de meio (L/h) V= volume de meio no reator (L) X= concentração de células no reator (g/L) • X0 = concentração de células no meio de alimentação (g/L) S =concentração do substrato limitante no reator (g/L) So = concentração do substrato limitante no meio de alimentação (g/L) P = concentração do produto P no reator (g/L) Po= concentração do produto P no meio de alimentação (g/L) f..l =.velocidade específica de crescimento = (1 I X)· (dX I dt) (h -l) · f..lp= velocidade específica de produção do produto P genérico = (g produto I g células· h ou simplesmente g/ g ·h) f..ls= velocidade específica de consumo de substrato = (1 I X) · (-dS I dt) (g substrato/ g célula· h ou simplesmente g/ g ·h) Yx;s =fator de conversão substrato a células= .:1X/(.:1S)101a 1 (g célula/g substrato ou simplesmente g/g) Assim, pode-se escrever o seguinte balanço material para o microrganismo, considerando o reator como volume de controle: 22 7 Formas de operação no sistema continuo (Variação da massa de células no reator) (Massa de células que entra) (Massa de células que sai) + (Massa de células que aparece devido ao crescimento) Portanto, considerando-se volume constante, tem-se: VdX -. =FX 0 -FX +V (dX) dt dt crescimento (12.1) A velocidade global instantânea de crescimento, por sua vez, pode ser expressa corno: dX) =J..!X (dt crescimento (12.2) Define-se a "vazão específica de alimentação" (D) ("dilution rate"), corno sendo a relação entre a vazão volumétrica de alimentação e o volume de meio no reator. Assim, tem-se que: D =f_ (h -l) (12.3) v sendo que (1 I D)= tempo de residência hidráulico no reator. Assim, substituindo-se as equações (12.2) e (12.3) na equação (12.1) obtém-se: dX -=D(X 0 -X)+J..!X dt (12.4) Corno freqüentemente se procede à alimentação de meio de cultura esterilizado, tem-se normalmente Xo =O. Assim, tem-se: dX (12.5) -=f.lX-DX dt Considerando, pois, que se tenha atingido urna situação de estado estacionário no reator, na qual a concentração celular permanece constante (e, portanto, dX/ dt = 0), obtém-se que: (12.6) ou, ainda: (12.7) J.l=D As equações acima são de fundamental importância na !lnálise do processo contínuo de fermentação, pois indicam que, na condição de regime permanente, a - --- - ----- I _ _ _____I _[ 228 Feimentação contínua concentração celular se mantém constante graças a um equilíbrio entre a velocidade de crescimento celular e a velocidade de retirada de células do fermentador e, ainda, que a velocidade específica de crescimento (Jl) é igual à vazão específica de alimentação (D). Ou seja, significa que através da imposição de uma determinada vazão de alimentação ao reator, consegue-se controlar a velocidade específica de crescimento das células, significando que é possível, em princípio, fixar o estado fisiológico das células, o que é sem dúvida de primordial importância. De forma análoga ao que foi efetuado para o microrganismo, pode-se equacionar os balanços materiais para o substrato limitante e para o produto P genérico, de forma a se obter as expressões a seguir: · d5 . J.!X -=D(5 0 -5)-Jl 8 X=D(5 0 - 5 ) - - dt Yx;s dP -=D(P0 -P)+JlpX dt (12.8) (12.9) Deve-se observar que, na eq. (12.8), o último termo representa a velocidade de consumo do substrato para crescimento das células, sendo que não se considerou o consumo de substrato para a manutenção destas, assunto o qual será abordado no item 12.3.2. Por outro lado, na eq. (12.9) o último termo representa a velocidade global de síntese do produto P pelas células. Conforme será visto adiante, no item 12.4, dependendo da cinética de formação do produto, dada por diferentes correlações entre f.lp e Jl, poder-se-ão ter distintos comportamentos da concentração de produto no reator. Deve-se esclarecer, ainda, que também não se considerou que haja decomposição ou degradação do produto, o que eventualmen~ poderá ocorrer e, obviamente, nestes casos, será necessário incluir um termo adicional na eq. (12.9). Considerando-se, pois, a eq. (12.8) em estado estacionário (dS/ dt = 0), pode-se escrever: J.!X = Y x;sD(50 -5) (12.10) Assim, fazendo-se Jl = D, obtém-se a expressão: X=Yx;s(5 0 -5) (12.11) No que se refere à operação do biorreator em regime contínuo, é da mais alta importância que se procureconhecer o comportamento das variáveis de estado X, 5 e P, em estado estacionário, em função da vazão específica de alimentação D, a fim de que se possam estabelecer faixas ideais de operação do sistema, tendo em vista a obtenção de altas produtividades do processo. Formas de operação no sistema contínuo 229 Nesse sentido, torna-se necessário o conhecimento da cinética do processo, o que significa dispor de uma correlação entre a velocidade específica de crescimento (f..l) e a concentração do substrato limitante (S). Como se sabe, embora existam várias propostas na literatura, o modelo cinético de MONOD 11 é o mais amplamente empregado, adequando-se para um grande número de processos fermentativos. Por essa razão, é de grande interesse obter-se as curvas de X e S em estado estacionário, quando se considera válido o modelo de Monod, dado pela equação abaixo: (12.12) onde: f..lmax =velocidade específica máxima de crescimento (h- 1 ) K5 =constante de saturação de Monod (g/L) Assim, fazendo-se f..l = D e isolando-se S, obtém-se: S= KsD (12.13) f..lmax- D Substituindo-se a eq. (12.13) na eq. (12.11), obtém-se a seguinte equação para X em função de D: X= Y x;s(so -_K---'s'-D-) -D (12.14) f..lmax Por outro lado, a produtividade em células, no sistema contínuo sem reciclo de células, é dada por: s;~ = DJf = DYx;s (so -_K__::s::._D_) (12.15) f..lmax -D Dessa forma, a partir das eqs. (12.13), (12.14) e (12.15), pode-se prever o comportamento de X, S e Px, em função da vazão específica de alimentação D, conforme indicado na Figura 12.2, onde se apresentam as curvas obtidas por simulação das citadas equações. A partir da Figura 12.2, observa-se que os valores de X permanecem praticamente constantes em uma grande faixa de valores de D, ocorrendo uma brusca queda até o valor zero, quando D se aproxima do valor de f..lmax· Por outro lado, a equação (12.13) indica que quando D = f..lmax' o valor de S tende ao infinito, o que na prática signífica tender para o máximo valor possível, ou seja, o valor 50 , isto é, a concentração do substrato na 'alimentação. Nesse caso, quando S =50 observa-se, a partir da eq. (12.14), que se obtém um valor nulo para a concentração celular em estado estacionário. Tal condição de ope- 230 Fermentação contínua ração é conhecida como "estado estacionário de lavagem", ou simplesmente "lavagem" (liwash-out"), situação na qual ocorre um arraste das células do reator. O valor da vazf!o específica de alimentação no qual se tem a máxima velocidade específica de crescimento é denominado "D crítico"(Dc)· X,S(g/L) Px(g/L.h) 6 . - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - . , 3,0 X 5 2,5 4 2,0 3 1,5 2 1,0 0,5 1 o s o 0;2 0;1 0,3 0(1/h) Figura 12.2 - Sistema contínuo em um único estágio, sem reciclo de células (simulação das equações 12. 13 1 a 12.15, com J.Lmax= 0,5 h- ; Ks = 0,1 g/L; YXIS = 0,5; 50 = lO g/L) Assim, a condição de lavagem do reator permite estabelecer a faixa de operação do reator contínuo que, no caso do reator ideal, sem reciclo de células, está entre zero e Jlmax' obedecendo-se, portanto, à condição D <De. Entretanto, dentro dessa ampla faixa de operação, verifica-se, a partir da Figura 12.2, que os mais altos valores de produtividade em células são obtidos quando D está muito próximo a Jlmax' ou seja, numa região de grande instabilidade de operação do reator, pois uma flutuação mínima na vazão específica de alimentação, poderá ocasionar a lavagem do reator. Por essa razão, caso o objetivo do processo seja produção de células, recomenda-se a operação do reator em valores um pouco menores de D (em torno de 10 a 15% menor), obtendo-se assim uma produtividade em células menor que a máxima, porém ainda suficientemente elevada. O arraste das células, embora obviamente indesejável quando se está operando um reator contínuo, é usualmente empregado para a determinação da velocidade específi<;a máxima de crescimento (Jlmax), sendo esta técnica conhecida como "método dinâmico de determinação de Jlmax" sendo amplamente descrita na · literatura.12 Essa técnica consiste em, partindo-se de um dado estado estacionário com Jl = D, impor-se uma vazão específica de alimentação nitidamente superior a Jlmax' de forma a se obter um decréscimo da concentração celular no reator, conforme pode ser verificado a partir da eq. (12.5), reescrita abaixo: a dX = (Jlmax - D)X dt - (12.16) Formas de operação no sistema continuo 23 I Assim, integrando-se a equação acima entre t0 a t, sendo to o instante em que se fez D > f.lmaXI no qual se tinha uma concentração celular igual a Xi, tem-se: (12.17) Assim, plotando-se ln(X/Xi) em função do tempo, obtém-se uma reta, cujo coeficiente angular é igual a (f.lmax- D). Como D é conhecido, calcula-se assim o valor de f.lmax· A Figura 12.3 ilustra o procedimento descrito. Convém ainda, aproveitar a Figura 12.2 para colocar as definições de "quimiostato" e "turbidostato", freqüentemente mencionadas na literatura. Por quimiostato entende-se um reator contínuo operando na região de valores de D para os quais X varia pouco e, portanto, é um processo cuja composição química é mantida constante (X e S constantes), através da introdução de substrato pela alimentação. Por turbidostato, por outro lado, designa-se o processo contínuo operando na região de grande variação de X, isto é, na região de D próximo a f.lmax· Nesse caso, ajusta-se a vazão de alimentação de forma a manter X constante, o que em alguns casos, corresponde a manter a turbidez do meio constante. Para finalizar o presente item, convém mencionar que, no caso do tratamento biológico de resíduos, deve-se operar o reator com baixos valores de D, pois o objetivo, neste caso, é obter um efluente com baixos valores da concentração do substrato. Nessa situação de baixos valores de S, todavia, tornam-se críticos certos fenômenos, tais como, metabolismo endógeno, lise celular e consumo de substrato para manutenção, cujas conseqüências para o desempenho do reator serão analisadas no próximo item. o -2 -4 -6 -8 -10 -12 -14~---L----~--~----~----L---~--~ o 2 4 6 8 10 12 14 Tempo (h} Figura 12.3 -Método dinâmico de determinação de f-lmax• (simulação da equação 12.17, com J..lmax 1 I ,5 h- ; X;= 5,0 g/L; ta= O) = 0,5 h- 1; O = 232 Fennentação contínua 12.3.2 - Desvios do comportamento ideal devido à manutenção e ao decaimento celular No desenvolvimento apresentado no item anterior, considerou-se um reator contínuo ideal, sem levar em consideração o consumo de substrato para manutenção, bem como sem considerar a possível ocorrência de decaimento celular ("decay"), seja como conseqüência do metabolismo endógeno, ou ainda, resultante de lise celular. 13 No presente item pretende-se, pois, verificar quais os tipos de alterações resul. tantes no comportamento das variáveis de estado X e S, em função da vazão específica de alimentação, quando se levam em consideração os aspectos mencionados. Assim, as equações de balanço material para o microrganismo ~ para o substrato limitante, adquirem o seguinte formato: (12.18) J (12.19) -=D(S dS f..1 0 -S)- ( -+m 5 X dt YG onde: kd =velocidade específica de decaimento celular (h-1) 12 Y c= fator de conversão verdadeiro substrato a células (g/ g), PIRT m. =coeficiente de manutenção (h-1) Considerando-se as equações (12.18) e (12.19) em estado estacionário e admitindo-se válida a cinética de Monod, obtêm-se as seguintes expressões para X e S: X= y cD(So -S) Ycms +(D+kd) S= Ks(D+kd) f-lmax -(D+kd) • (12.20) (12.21) sendo que, em estado estacionário, tem-se f..1 = D + kd: Assim, na Figura 12.4 apresentam-:se as curvas de X e S obtidas por simulação das eqs. (12 .20) e (12.21), nas quais se considerou diferentes valores parakd e m 5 • Conforme se pode verificar através dessa figura, as alterações mais significativas no comportamento da concentração celular ocorrem na região de baixos valores de D e, portanto, onde se têm baixas concentrações de substrato, situação na qual o substrato é utilizado preferencialmente para manutenção da viabilidade celu~ar. Formas de operação no sistema contínuo 233 Portanto, em processos nos quais se trabalha com baixas vazões específicas de alimentação, cujo exemplo típico é o tratamento biológico de resíduos, nos quais se opera na região de baixos valores de S, há necessidade de se tomar uma certa cautela no estabelecimento da vazão de operação, pois se poderá obter, em estado estacionário, concentrações celulares significativamente inferiores às previstas quando não se considera o decaimento celular e o consumo de substrato para manutenção. Deve-se mencionar, ainda, que nas simulações apresentadas na Figura 12.4, considerou-se kd e m. constantes. Entretanto, para um tratamento mais rigoroso, se poderia considerá-los como sendo funções de S e, portanto, variáveis com D, conforme indicam algumas propostas na literatura. 13' 14 Convém mencionar, ainda, que uma série de conseqüências importantes são observadas, quando se analisa a ocorrência de perda de viabilidade celular no reator contínuo, conforme apontado em trabalho recente, por FACCIOTTI; SCHMIDELL. 14 12.3.3 - Sistema contínuo com reciclo de células A operação do sistema contínuo com recirculação de células tem como objetivo a obtenção de alta densidade celular no reator, aumentando-se assim consideravelmente as velocidades e, portanto, em última análise, a produtividade do processo. O reciclo de células pode ser interno ou externo ao reator. Por recirculação interna entende~se a situação na qual uma fração das células é mantida no reator, seja através de uma simples sediment~ção, ou através do emprego de um filtro na saída de líquido do reator. No caso do reciclo externo o líquido efluente circula através de urtl "separador de células" (sedimentador, centrífuga ou sistema de filtração por membranas), de maneira que uma corrente concentrada em células retoma ao fermentador, enquanto uma outra (filtrado ou permeado), sai praticamente isenta de células. X(g/L) S(g/L) 6.----------------------------------.-.----. 10 S(Kd=O; m.=o ou0,03) 8 / 6 4 2 0,4 0,5 o Figura 12.4 - Influência da manutenção e do decaimento celular no sistema contínuo em um único estágio, sem recido de células (simulação das equações 12.20 e 12.21 ,com flmax = O,Sh-I; K; = O, I gtl; YG = 0,5; 50 = IOgtl) 234 Fermentação contínua Deve-se ressaltar que a recirculação interna de células representa uma situação comparativamente mais segura em termos de manutenção de condições de assepsia, quando comparada com o reciclo externo, sendo por esta razão mais adequada no caso de processos exigentes em termos de assepsia, como é o caso da produção de enzimas e antibióticos. Por outro lado, o reciclo externo torna-se uma alternativa bastante viável no caso de processos em que esta preocupação não seja tão intensa, ou até mesmo não exista, como por exemplo na fermentação alcoólica, ou, ainda, no tratamento biológico de resíduos (processo de lodos ativados), os quais são exemplos práticos de utilização do processo contínuo com reciclo externo de células em escala industrial, com reatores de grandes capacidades, podendo-se chegar a até alguns milhares de metros cúbicos. 12.3.3.1 - Sistema com reciclo interno Considerando-se o sistema contínuo com reciclo interno de células indicado na Figura 12.5, no qual a retenção de células ocorre através do emprego de uma filtração interna do líquido efluente, definem-se os seguintes parâmetros: c= fração do líquido efluente removida diretamente do fermentador, sem passar pelo filtro ("purga") h= fator de diluição da concentração celular obtido no líquido filtrado F S0 cF X,S (1-c) F r,===:!~=f=4=A hX,S • Figura 12.5 - Sistema contínuo em um único estágio, com reciclo intemo de células. Assim, pode-se escrever a seguinte equação de balanço material para o microrganismo no fermentador, considerando-se X0 = 0: dX V-= V11X -cFX -(1- c)F ·hX dt (12.22) Deve-se observar que o segundo termo do membro direito da equação acima representa a massa de células que é removida através da purga, enquanto que o último se refere à massa de células removida através do efluente filtrado, com uma vazão (1 - c)F e com uma concentração de células igual a hX. À primei~a vista pode parecer estranho o fato de se considerar a existência de uma "purga", conforme representado na Figura 12.5. De fato, a sua existência não é estritamente necessária. E;ntretanto, conforme será visto adiante, essa saída Formas de operação no sistema contínuo 235 direta de caldo fermentado, sem filtração, permite uma maior controlabilidade do processo em termos de manutenção do estado estacionário neste sistema. A seguir, dividindo-se os termos da eq. (12.22) pelo volume de meio no reator (V), obtém-se, após alguns rearranjos: . dX = {J.t-D[c +h(1- c)]}X dt (12.23) A=[c+h(1-c)] (12.24) - Seja: Assim, pode-se escrever que: dX dt -=(J.t-AD)X (12.25) Portanto, em estado estacionário (dX/ dt = 0), obtém-se: J.l=AD (12.26) A eq. (12.26) indica ·que, em estado estacionário, não é mais válida a igualdade entre J.l e D, conforme ocorre para o sistema contínuo simples sem reciclo de células. Além disso, pode-se observar que A será sempre menor do que 1, pois considerando-se as duas situações extremas possíveis, quais sejam: h=O (retenção total de células através do, filtro) e h = 1 (retenção nula de células, recaindo portanto, no sistema sem reciclo), verifica-se que c< A< 1, significando portanto, que J.l < D. Essa desigualdade possui um significado prático de grande importância, pois indica que, para esse sistema, o valor de D no qual ocorrerá a lavagem, isto é, D crítico, será superior ao valor de J.lmax' pois: D = llmax c A (12.27) Significa, portanto, na prática, uma ampliação na faixa de operação da vazão específica de alimentação, podendo-se operar com valores de D superiores a J.lmax· · Com relação à equação de balanço material para o substrato limitante, pode-se verificar que não há alteração desta em relação à anteriormente desenvolvida para o sistema sem reciclo de células (eq. 12.8). Assim, considerando-se válida a cinética de Monod, obtém-se em estado estacionário: X= Yx;s (So - S) A (12.28) 236 Fermentação contínua S= K 5 AD (12.29) J.lmax -AD Px =ADX (12.30) Através das equações acima, torna-se possível verificar algumas conseqüências práticas adicionais advindas do reciclo de células, além da ampliação da faixa de operação da vazão específica de alimentação, discutida anteriormente. Dessa maneira, pode-se observar, comparando-se as eqs. (12.28) e (i2.29) com as eqs . (12.11) e (12.13), que no sistema com recirculação de células tem-se, em estado estacionário, uma maior concentração de células, ao lado de uma menor concentração de substrato, sendo que a concentração celular no sistema com reeielo é aproximadamente igual à do sistema sem reciclo, multiplicada pelo fator (1/ A) . No que se refere à produtividade em células, verifica-se que para valores de D inferiores a J.lmax' a produtividade no sistema com reciclo é praticamente igual à do sistema sem reciclo. Já para valores de D superiores a J.lmax' verificam-se elevadas produtividades no sistema com reciclo, enquanto que obviamente se observam valores nulos no sistema sem reciclo, devido à ocorrência de lavagem de células. Pode-se concluir, portanto, que caso o objetivo do processo seja a produção de células, então o sistema com reciclo oferecerá vantagens realmente efetivas em relação ao sistema sem reciclo, isto é, maiores valores de X e Px. apenas caso se opere na região de valores de D superiores a J.lmax' até o limite de J.lmaxf A , conforme se pode verificar através da Figura 12.6, na qual se apresentam as curvas de X e Px, obtidas por simulação das eqs. (12.28) e (12.30) {Xc; rec e Pxc!rec ), bem como se indicam ainda, as curvas respectivas para o sistema sem reciclo (Xs!rec e Pxs!rec) · Por outro lado, no caso de tratamento de resíduos, onde o objetivo é a degradação da matéria orgânica, pode-se observar que, comparativamente ao sistema sem reciclo, é possível a obtenção de concentrações residuais de substrato ainda bastante baixas, para valores mais altos de D, significando desta maneira uma sensível redução no tempo de residência necessário para se atingir a degradação ·desejada da matéria orgânica do resíduo. Com relação ao acúmulo de um determinado produto de interesse, a faixa ideal de operação em termos de D irá depender da cinética de formação desse pr~ duto, o que será abordado separadamente no item 12.4. Convém ressaltar que nas equações desenvolvidas para o sistema com reeielo de células, não se considerou a ocorrência de decaimento celular, bem como o consumo de substrato para manutenção celular~ os quais podem ser . particularmente críticos quando se empregam valores muito baixos de D, conforme discutido anteriormente no item 12.3.2. Formas de operação no sistema contínuo 23 7 Px(g/L.h) r-----------------------------------------•16 12 Px c/rec 8 4 ~------~------~~----~~----~~----~~0 1 ,O 1 ,5 2,0 2,5 0(1/h) Figura 12.6- Sistema contínuo em um único estágio, com reciclo de células (simulação das equações 12.28 e -I 12.30, com flmax = 0,5 h : Ks = O, I g!L; YXIS = 0,5; 50 = I Og!L; c = O; h = 0,2). Um aspecto adicional que merece ser comentado, diz respeito à importância da existência da "purga" no sistema contínuo com reciclo, isto é, de uma saída direta de líquido efluente do reator, sem passar pelo filtro. Caso essa não exista, tem-se c = O, podendo-se observar, a partir das eqs. (12.24) e (12.26) que, em estado estacionário, a velocidade específica de crescimento será igual ao parâmetro h, o qual depende diretamente da eficiência do filtro empregado. Assim, caso ocorra um entupimento desse filtro, o que significa ter-se h = O, isto r~sulta teoricamente na impossibilidade de se atingir uma condição de estado estacionário, conforme se pode verificar através da eq. (12.28), pois tem-se A= O e X= oo. No entanto, se houver uma purga, mesmo que se tenha h = O, ter-se-á A ~ O e, portanto, torna-se possível atingir a condição de estado estacionário. Para finalizar o presente item, convém esclarecer que, no caso de se executar o reciclo de células através da sedimentação de células no reator, conforme indicado na Figura 12.7, as equações de balanço material para este tipo de situação são as mesmas desenvolvidas, considerando-se a filtração interna das células, sendo que neste caso, entretanto, o volume V refere-se ao volume da "zona de reação" ou "zona de crescimento" apenas. 12.3 .3 .2 - Sistema com reciclo externo A Figura 12.8 representa esquematicamente um sistema contínuo com reeielo externo de células, definindo-se os seguintes parâmetros adicionais: F 5 = vazão de saída do líquido efluente (L/h) a = fração da vazão do líquido efluente que é reciclada g = fator relativo ao incremento da concentração celular obtido no "separador" (centrífuga, sedimentador ou filtro de membranas), sendo g>l. Os parâmetros c e h possuem significado análogo ao visto anteriormente para o sistema com reciclo interno de células. 238 Fermentação contínua zona de sedimentaçao zona de reação 50 X,S Figura 12.7 - Sistema contínuo com sedimentação interna de células. (1-c) F hX,S cF gX,S gX,S Figura 12.8 - Sistema contínuo em um único estágio com reciclo externo de células. Tem-se, pois: • F5 =F +aF5 (12.31) F Fs=-(1-a) (12.32) Portanto: Assim, efetuando-se um balanço material para as células, considerando-se o reator como volume de controle, obtém-se: dX V -=V~J.X+aF 5 dt . ·gX-F5 X (12.33) Assim., dividindo-se ambos os membros da equação acima por V, e ainda utilizando-se a eq. 12.32, obtém-se após alguns rearranjos: Formas de operação no sistema contínuo Seja: 23 9 ~~ ={~-[~11~a;)J}x (12.34) l-ag B=-l-a (12.35) Assim, pode-se escrever que: dX dt=(~-BD)X (12.36) Deve-se, pois, observar que a equação (12.36) acima, é formalmente idêntica à equação (12.25), desenvolvida anteriormente para o sistema com reciclo interno de células e, conseqüentemente, serão obtidas para o sistema com reciclo· externo, conclusões análogas àquelas discutidas anteriormente. Assim, em estado estacionário tem-se: ~=BD (12.37) X= Yx;s (Sõ -5) B (12.38) S= K 5 BD ~max -BD Px =BDX (12.39) (12.40) O valor de D crítico nesse sistema será, portanto: D c = ~max B (12.41) Verifica-se, pois, que as eqs. (12.37) a (12.41) são análogas àquelas previamente desenvolvidas para o sistema contínuo com reciclo interno de células, sendo que formalmente tem-se a variável B em vez de A . Conseqüentemente, o comportamento de X, S e Px ein estado estacionário, em função da vazão específica de alimentação, será o mesmo visto anteriormente no item 12.3.3.1. En.tretanto, deve-se salientar que como (1- ag) < (1- a), significa que B < 1, ou seja, significa que necessariamente se deve ter o produto ag < 1, pois ag = !indicaria uma situação hipotética,na qual todas as células estariam sendo recicladas ao reator, não sendo possível atingir-se a condição de estado estacionário. 240 Fermentação contínua Convém esclarecer ainda que, no sistema esquematizado na Figura 12.8, considerou-se a existência de uma purga após o processo de separação de células. Todavia, poder-se-ia imaginar a alocação dessa purga diretamente no reator, da mesma forma como foi efetuado para o sistema com reciclo interno de células, sendo que obviamente se teria uma alteração nas equações de balanço material desenvolvidas. De fato, em alguns textos encontra-se a mencionada situação, sendo que alguns autores optam ainda por fazer os balanços materiais considerando-se conjuntamente o reator mais o separador como volume de controle. Tais estilos diferentes de abordagem conduzem, no entanto, às mesmas conclusões indicadas no presente texto, com relação ao desempenho do processo de fermentação contínua com reciclo externo de células. 12.3.4 -:---- Sistema contínuo em múltiplos estágios Quando se imagina a operação do sistema contínuo em múltiplos estágios, isto é, com n-reatores acoplados em série, conhecido também como sistema em "cascata", diversas são as opções de conduÇão do processo, podendo-se ter: • sistema com uma única alimentação ("single-stream multi-stage") • sistema com múltiplas alimentações ("multi-stream multi-stage") • sistema com reciclo de células, com uma ou com múltiplas alimentações Essas diferentes possibilidades estão esquematizadas nas Figuras 12.9 e 12.10, onde se observa que no caso do sistema com uma única alimentação tem-se a alimentação de meio esterilizado apenas no primeiro estágio, enquanto que nos demais reatores a alimentação é o líquido efluente do reator imediatamente anterior a este. Já no caso do sistema com múltiplas alimentações tem-se, num ~ado reator intermediário, duas alimentações, sendo uma o meio de cultura esterilizado e a segunda o efluente do fermentador anterior. F Figura 12.9 - Sistema contínuo em múltiplos estágios, com uma única alimentação e com reciclo. Formas de operação no sistema continuo 24 I Figura 12.1 O - Sistema contínuo em múltiplos estágios, com múltiplas alimentações e com reciclo. No caso do sistema com reciclo de células, embora nas Figuras 12.9 e 12.10 esteja representado esquematicamente o reciclo do último para o primeiro estágio, pode-se ter na realidade inúmeras outras possibilidades, imaginando-se por exemplo a existência de reciclos intermediários entre os estágios, caso esta'-eot}figuração seja interessante em termos de permitir urna melhoria no desempenho do processo. Tais sofisticações, entretanto, em nível do arranjo dos reatores, nern .sernpre são de fácil implantação e execução em nível industrial, podendo acarretar custos adicionais consideráveis. Por essa razão, a utilização do sistema contínuo em múltiplos estágios encontra ainda aplicação restrita, apresentando, no entanto, urna grande potencialidade, em vista da grande versatilidade do sistema e das vanta- · gens que pode apresentar no que se refere ao desempenho do processo. De um modo geral, os sistemas em múltiplos estágios proporcionam diferentes ambientes para o desenvolvimento das células, ao se mudar de um estágio para outro, aproximando-se assim de um: reator de fluxo pistonado ("plug-flow") e, permitindo, portanto, que se empreguem condições otirnizadas distintas nos vá-, rios reatores. Assim, por'exemplo, no caso da produção de um determinado metabólito, cuja cinética de formação seja não-associada ao crescimento, pode-se imaginar a utili.:Zação de dois reatores em série, sendo que no primeiro se poderia otimizar as . condições de cultivo de forma a se maximizar o crescimento celular, enquanto que no segundo se poderiam empregar condições que levassem a urna rnaxirnização da produção do produto de interesse. Um outro exemplo de aplicação do sistema contínuo em múltiplos estágios, freqüentemente mencionado na literatura, é a sua utilização para processos com inibição pelo produto, corno é o caso da produção de etanol. Nesses casos, tem-se normalmente elevadas velocidades de conversão nos estágios iniciais, pois as concentrações do produto são ainda relativamente baixas, ao passo que nos estágios finais têm-se baixas velocidades, sendo denominados de estágios de "polimento", nos quais se verifica o consumo do residual da fonte de carbono e se atingem, portanto, elevadas concentrações do produto inibitório. Convém esclarecer que. o equacionarnento para um sistema de múltiplos estágios deve seguir a mesma estratégia utilizada nos itens anteriores, sendo que, para os reatores intermediários da série, se deverá considerar; no balanço material para as células, um termo relativo à entrada de células, provenientes do efluente do reator anterior a este. 242 Fennentação contínua 12.4 - Formação de produtos no sistema contínuo · Neste item será abordada a formação de produtos no sistema contínuo sem reciclo de células, considerando-se a classificação de GADEN} 5 com equacionamento correlacionando as velocidades específicas de crescimento (J.l) e de produção (J.lp), conforme proposto originalmente por LUEDEKING e PIRET} 6 como especificamos a seguir: • Produção associada ao crescimento: J.lp =UJ.l (12.42) • Produção não-associada ao crescimento: (12.43) • Produção parcialmente associada: J.lp =UJ.l +~ (12.44) onde a e p serão considerados constantes. Considerando-se a eq. (12.9) de balanço material para o produto, desenvolvida no item 12.3.1: fazendo-se Po =O, obtém-se a seguinte expressão para a concentração do produto P em estado estacionário (dP I dt = 0): P=J.lpX D (12.45) Por outro lado, a produtividade deste produto será dada por: (DP) =J.lpX (12.46) • e lemSubstituindo-se, pois, as eqs. (12.42) a (12.44) nas eqs. (12.45) e (12.46), brando que J.l = D, obtêm-se as seguintes expressões para a concentração do pro~ duto (P) e a sua produtividade (DP), em estado estacionário, em função ~e D: • Produção associada: P=aX (12.47) (DP) = u(DX) = aPx (12.48) • Produção não-associada: (12.49) Formação de produtos no sistema continuo (DP) = J3X 243 (12.50) • Produção parcialmente associada: (12.51) (DP) =X (a.D + J3) (12.52) As Figuras 12.11 a 12.13 indicam as curvas de P e (DP) obtidas por simulação das eqs. (12.47) a (12.52). Dessa maneira, conforme se pode observar a partir da Figura 12.11, bem como através das eqs. (12.47) e (12.48), no caso de produção associada ao crescimento, o comportamento matemático de P e (DP) é análogo ao observado para X e Px, respectivamente, obviamente multiplicados por um fator a, aqui considerado constante. Portanto, interessa nesse caso a operação do sistema contínuo em valores relativamente elevados de D, situação na qual se poderão obter, ao mesmo tempo, elevada concentração do produto, bem como elevada produtividade deste. No caso de produção não-associada ao crescimento, conforme indicado pelas eqs. (12.49) e (12.50), bem como pela Figura 12.12, observa-se que a concentração do produto P varia inversamente com D, ao passo que a produtividade (DP) é proporcional a X, ou seja, permanece praticamente constante para uma ampla faixa de variação de D, decaindo bruscamente próximo a f.lmax' isto é, próximo à lavagem. Conclui-se, portanto, que neste caso é interessante trabalhar-se com valores relativamente baixos de D, no sentido de se conciliar altos valores de P e (DP). Por últimó, no caso de produção parcialmente associada ao crescimento, pode-se verificar através das eqs. (12.51) e (12.52), bem como através da Figura 12.13, que P varia inversamente com D, enquanto que a produtividade (DP) é constituída pela soma de dois termos, sendo um deles a produtividade em células multiplicada por a., e o outro o termo J3X; o qual é aproximadamente constante para uma ampla faixa de valores de D, desde que J3 seja constante. Dessa forma, conforme se verifica na Figura 12.13, a região de operação mais favorável situa-se na faixa de valores intermediários de D. O tratamento apresentado no presente item indica, portanto, que dependendo do tipo de cinética de formação do produto, haverá determinadas faixas mais adequadas de operação do sistema contínuo, de forma a se buscar a obtenção de elevadas concentrações e produtividades do produto de interesse. Deve-se destacar ainda, que as curvas apresentadas nas Figuras 12.11 a 12.13 são válidas, desde que a cinética de Monod seja adequada para representar o processo, uma vez que esta hipótese foi considerada no desenvolvimento do presente capítulo. 244 Fermentação contínua X,P(g/L) Px,(DP)(g/L.h) 10.-------------------------------~ 6 p 5 ar------------------------- 4 X 3 2 Figura 12.11 - Produção associada ao crescimento (simulação das equações 12.47 e 12.48,com Jlmax = 0,5h-I; Ks = 0,1 g!L; Yx;s = 0,5; So = IOg/L; a= 1,6g/g) X,P(g/L) Px,(DP)(g/L.h) 3,0 80 (DP) 2,5 60 2,0 1,5 40 1,0 20 0,5 0,2 0,3 0,4 0,5 o 0(1/h) Figura 12.12 - Produção não-associada ao crescimento (simulação das equações 12.49 e 12.50, com Jlmax = 0,5h- 1; Ks = O, I g!L; YXJS = 0,5; So = IOg!L; 13 = 0,5 g/g.h). X, P(g/L) 70 • Px,(DP)(g/L.h) 5 Figura 12.13 - Produção parcialmente associada ao crJscimento (simulação das equações 12.SI e 12.52) (Jlmax = 0,5h - I; Ks = O, I g/L; YXiS = 0,5; 50 = IOg!L; a = I ,83 g/g; 13 = 0,155 g/g.h). Referências bibliográficas 245 Claro está, portanto, que caso outro modelo cinético seja mais adequado para a descrição do processo, tais como as propostas de Teissier, Contais, Andrews e outros,17 este deverá ser introduzido no conjunto de equações, no lugar da equação de Monod, (eq. 12.12), de maneira que assim se possam obter os novos perfis de concentração celular, concentração de substrato e produto, e de produtividades, em função da vazão específica de alimentação, de forma a se definir as faixas ideais de operação do sistema contínuo para cada caso específico. Referências bibliográficas (1) MARTINI, G.; MIGNONE, C.; ERTOLA, R. Studies in beta-galactosidase production in transient operation cultures. Biotechnol.Lett.,v. 11, n.8, p.545-50, 1989. 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Use of the upflow sludge blanket (UASB) reactor concept for biological wastewater treatment, specially for anaerobic treatment. Biotechnol.Bioeng., v.22, p.699-734, 1980. (9) CRAVEIRO, A.M; SOARES, H.M.; SCHMIDELL, W. Technical aspects and costs estimations for anaerobic systems treating vinasse and brewery I soft drink wastewater. Wat.Sci.Technol.,v. 18, n.12, p.123-34, 1986. (10) SCHMIDELL, W. Introdução aos Reatores Biológicos. In: 11 Curso de Tratamento Biológico de Resíduos, Instituto de Pesquisas Tecnológicas do Estado de São Paulo, 1993. (11) MONOD, J. Recherches sur la Croissance des Cultures Bacteriennes. Paris, Hermann & Cie., 1942. (12) PIRT, S.J. Principies of Microbe and Cell Cultivation. Nova York, John Wiley & Sons, 1975. (13) MOSER, A. Continuous Cultivation. In: REHM, H.J.; REED, G. Biotechnology: a Comprehensive Treatise in Eight Volumes, l.ed., Wien, Springer Verlag, VCH, v. 2, cap.15, p.285-309, 1985. (14) FACCIOTTI, M.C.R.; SCHMIDELL, W. 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Iracema de Oliveira Moraes Deise Maria Fontana Capalbo 13.1 - Introdução Quem nunca viu uma laranja coberta por uma camada verde ou negra de mofos? Um pão embolorado? Ou mesmo um sapato mofado após ter sido deixado em um lugar úmido? Pois bem, esses exemplos citados, que acontecem com freqüência na natureza, ocorrem principalmente devido a determinadas condições ambientais e alimentação propícias ao crescimento desses microrganismos. Porém, esse desenvolvimento microbiano indesejável pode ser, se houver um controle do processo, uma ferramenta potencialmente interessante na obtenção de diversos produtos, tais como enzimas, biomassa microbiana, inóculos, além de alimentos, medicamentos, pigmentos, etc. . Essa forma de processo é denominada "fermentação em estado sólido", "fermentação em substrato sólido", "fermentação em meio semi-sólido" ou simplesmente "fermentação semi-sólida". Como forma abreviada, pode ser utilizada também a sigla FSS (embora, menos freqüentemente, alguns pesquisadores prefiram usar as siglas FMS e FES). Esse processo, comumente empregado em países do Oriente e do continente africano visando a elaboração de alimentos, vem ganhando adeptos em sua utilização, ano após ano, entre pesquisadores da Europa e do continente americano, devido a peculiaridades que serão enfocadas nas páginas seguintes. Tomando por base a definição utilizada por DURANT et al. 1 , na qual também se enquadram algumas outras extraídas da literatura/'3' 4 ' 5 mas ressalvando que o substrato não tem de ser necessariamente insolúvel em água e, desta forma ser sólido, pois ocorrem exemplos em que o substrato líquido (solução de sacarose e de sais nutrientes ou melaço) está umedecendo uma matriz sólida inerte (sabugo de milho ou bagaço de cana), 6' 7' 8 a fermentação em estado sólido pode ser definida como "processos que referem-se a cultura de microrganismos sobre ou dentro de partículas em matriz sólida (substrato ou material inerte), onde o con- 248 Fermentação em estado sólido teúdo de líquido (substrato ou meio umidificante) ligado a ela está a um nível de atividade de água que, por um lado, assegure o crescimento e metabolismo das células e, por outro, não exceda à máxima capacidade de ligação da água com a matriz sólida". Por essa definição, eliminam-se também algumas confusões criadas por determinados autores/ que colocam erroneamente os sistemas de filtro biológico aeróbio utilizados em processos de tratamento de águas residuárias e o sistema de fermentação acética para obtenção de vinagre, onde, em ambos os casos, há a percolação de nutrientes líquidos através de uma matriz sólida inerte e insolúvel, na qual estão imobilizados os microrganismos, como processos de fermentação em estado sólido. O termo fermentação em superfície, às vezes utilizado para referir-se à cultura em substrato sólido, deve ser evitado, pois esta denominação diz respeito ao processo em que há o crescimento microbiano sobre a superfície líquida estática de um substrato, tal como a antiga forma de produção de vinagre em barris. Outro erro que não deve ser cometido é confundir esse processo com a cultura em meio sólido ou semi-sólido utilizando agar, usualmente empregada em microbiologia para a seleção e manutenção de microrganismos. Nesse capítulo serão descritos, de maneira sucinta, tópicos de interesse à compreensão desse processo, mais especificamente tipos de microrganismos, características dos substratos, formas de reatores e principais controles comumente utilizados, as vantagens e desvantagens inerentes ao sistema em relação ao processo submerso, além de exemplificar alguns casos relatados por pesquisadores em diversos artigos científicos. Porém, dentre todos os assuntos analisados, o estudo sobre produção de cogumelos comestíveis, pela quantidade de material bibliográfico existente, mesmo empregando os meios em estado sólido para o crescimento e produção enzimática, não será examinado neste capítulo, pois merece uma atenção à parte. No item "Referências bibliográficas" será apresentado um vasto oomero de títulos de artigos científicos utilizados neste capítulo, visando facilitar a procura de material bibliográfico para aqueles que quiserem iniciar uma pesquisa envolvendo esse processo. 13.2 - Histórico do processo da FSS Pelos primeiros exemplos citados neste capítulo, pode-se concluir que a ocorrência da fermentação em estado sólido é, com certeza, mais antiga que o próprio homem, sendo, portanto, muito difícil precisar o início desta prática pela atividade humana. Sabe-se, contudo, que várias formas de alimentos utilizando esse processo microbiano fazem parte da dieta de diversos povos há muitos séculos. São citados exemplos de alimentos que necessitavam, de alguma forma, da fermentação em estado sólido há milênios. Como, por exemplo, na China, a produção de molho de soja em 1.000 a.C. e a de "chiang" (similar ao "miso") entre 2.500 e 500 a.C./' 10 os quais são obtidos a partir da modificação enzimática do meio utilizando-se o "koji". O "koji" consiste numa massa umidificada de um Histórico do processo da FSS 249 cereal cozido (na maior parte dos casos, arroz) na qual houve o crescimento de Aspergillus oryzae e a conseqüente produção de um complexo enzimático com atividade diastática. 10' 11 Uma das primeiras referências que se tem sobre o processo em meio sólido no Ocidente, além de uma citação da obtenção de queijo roquefort em 100 d.C./ está associada, no início deste século, nos Estados Unidos, ao nome do pesquisador Takamine na produção de "mold bran", similar ao "Koji", que consiste basicamente no emprego do farelo de trigo no lugar do arroz e de outros fungos para a obtenção do complexo enzimático. Esse estudo visava substituir o malte na indústria de destilados. 2' 5' 10 Segundo HESSELTINE/ 0 UNDERKOFLER et al. 12' 13 continuou este trabalho de 1937 a 49, no objetivo de produzir álcool etílico a partir de milho. Utilizaram-se para esse processo fermentadores do tipo tambores rotativos, tambores estáticos ou simples bandejas, sendo estudadas as vantagens e desvantagens de cada um destes reatores. Assim, até a metade deste século, e sempre se referindo a esta parte do planeta, dominaram, para o caso de fermentação em estado sólido, as pesquisas em torno da produção de enzimas microbianas. Porém, principalmente para agilizar a produção de penicilina, durante o período da Segunda Guerra Mundial, houve a opção de desenvolver os processos que envolviam a fermentação líquida em tanques profundos, negligenciando os processos em estado sólido. 10' 11 Dessa forma, as pesquisas voltaram-se quase que exclusivamente para o projeto de desenvolvimento de fermentadores para os processos em fase líquida, com muito poucos estudos empregando a fermentação em substrato sólido. Apenas para exemplificar, há citações de experiênciaspara produção de ácido cítrico em fermentação em estado sólido até 1936, retornando novamente o in· teresse nesses e;tudos somente em 1975. 14 No Japão, contudo, o processo tradicional, que era realizado em bandejas de madeira ou bambu, onde os cereais, tais como arroz e trigo ou trigo e soja eram inoculados e fermentados com o "koji", foi sendo aperfeiçoado. Projetaram-se incubadoras automatizadas com inoculação, controle das condições ambientais, agitação controlada do meio e recuperação do produto final, utilizando-se também linhagens mutantes melhoradas. 10 Esses fatos conduziram o Japão à obtenção de uma tecnologia cada vez mais avançada, em termos de produção por fermentação em estado sólido. Nos países do Ocidente, nos dias de hoje, diversos estudos estão sendo realizados utilizando-se substrato sólido, tanto na obtenção de bioprodutos como no desenvolvimento de reatores ou conhecimento do metabolismo e condições do processo. Porém, em níveis industriais, o processo submerso continua sendo o principal sistema de geração deprodutos obtidos via fermentação, sendo insignificante o número de empresas que empregam a fermentação em estado sólido para estes fins. 250 Fennentação em estado sólido 13.3 - Microrganismos comumente utilizados P ANDEY 15 indica que os processos por fermentação em esta <;lo sólido podem utilizar tanto microrganismos em seu estado natural, como por exemplo nos casos de ensilagem ou compostagem, 16 como na forma de culturas puras individuais, em que se enquadram a maior parte das pesquisas nesta área, ou, mais raramente, na forma de culturas mistas. 17 Devido aos baixos níveis de água no sistema, os fungos filamentosos têm recebido a maioria das atenções nas pesquisas, pois apresentam melhor capacidade de crescimento nestas condições. 2 Assim, um vasto campo de estudos tem se vislumbrado utilizando estes microrganismos. Como exemplos, podem ser citados, dentre muitos outros, o uso de culturas de Rhizopus, Trichoderma, Penicillium ou Aspergillus para obtenção de enriquecimento protéico e produção de enzimas, Mucor ou Rhizopus na produção de renina microbiana, Penicillium para a fsrodução de penicilina e Fusarium ou Giberella para a obtenção de ácido giberélico. 5 Porém, outros microrganismos têm obtido espaço nesse tipo de sistema, como a produção de esporos de Bacillus thuringiensis 1 para a produção de bioinseticidas, de o.-amilase por linhagens de Bacillus} 9 e de álcool por Zymomonas mobilis 2'6.21 ou por 1eve d uras tra d tcwnats. · Ou seja, como todo o processo fermentativo, a escolha do microrganismo adequado é uma peça .chave no sucesso da produção desejada. Por exemplo, a o.-amilase pode ser produzida por, no mínimo, 28 tipos diferentes de culturas microbianas. Já a cultura de Aspergillus niger tem a capacidade de produzir nada menos do que 19 tipos diferentes de enzimas, dependendo da indução e/ou do substrato utilizado.15 Neste sentido,a fermentação em estado sólido tem se mostrado apta a realizar vários tipos de transformações, seja ela por fungos, leveduras ou bactérias, e o que irá determinar a escolha da linhagem mais apropriada, durante a fase de seleção de microrganismos, será o estudo detalhado do processo, visando obter o melhor meio de cultura e as melhores condições ambientais da fermentação, principalmente no que se refere à temperatura e à umidade do sistema. o o • 13.4 - Substratos: características e composição Ao iniciar este item;· antes de tudo é necessário comentar que o termo fermentação em estado sólido remete à idéia de dois tipos de materiais insolúveis em água, sobre os quais os microrganismos irão crescer: quando o suporte sólido atua ele próprio como fonte de nutrientes e no caso em que os nutrientes são solúveis em água e os microrganismos estão aderidos a uma matriz sólida, inerte ou não, que irá absorver o meio de cultura líquido. A maioria dos processos revistos em literatura utilizam o principio em que o suporte sólido atua também coino fonte de nutrientes. Em relação ao segundo caso existem, dentre outras, as citações da produção de esporos de Aspergillus niger em sabugo de milho umedecido com solução de sacarose para a formação de Útóculo na produção de ácido cítrico/ do emprego de Substratos: caracteristicas e composição 25 I uma solução de glicose e de nutrientes umedecendo bagaço de cana para a produção de ácido lático, 22 de partículas de polpa de madeira fornecendo umidade e permitindo melhor ventilação em meio de arroz ou farelo de trigo para produção de enzimas 23 e a obtenção de álcool etílico em bagaço de cana umedecido com melaçoY É possível notar, pelos exemplos citados, que o substrato pode estar tanto na forma natural como na fdrma sintética, dependendo do processo que se deseja realizar, da facilidade de se obter determinadas matérias-primas ou dos resultados que se deseja conseguir. Bagaço de cana pode ser abundante em determinadas regiões, assim como o sabugo de milho ou a palha de arroz pode ser em outras. · Já para estudos de cinética das fermentações, cita-se o exemplo da utilização de partículas de argila 24 ' 25 como matriz sólida inerte insolúvel, que não exercem influência sobre o consumo de substrato e facilitam a separação entre a massa microbiana e o meio de cultura. Porém, de forma geral, os materiais utilizados são provenientes de matérias-primas, produtos e/ ou resíduos agroindustriais, sendo que, logicamente, dependendo do produto que se deseja obter, estes últimos têm tido a preferência nas pesquisas, devido ao baixo ou nenhum valor comercial. Pode-se também incorporar solução nutriente ao substrato sólido, visando adequá-lo melhor às condições nutricionais do microrganismo para a fermentação desejada. Como o estudo realizado para a produção de a-galactosidase por Aspergillus niger/6 no qual ao meio composto de farelo de trigo foram adicionados uréia (como fonte de nitrogênio), água de maceração de milho (como fonte de fatores de crescimento), farinha de soja ou farinha guar (como indutores da enzima) e ácido cítrico (que favorece a produção da enzima desejada). Ou, no caso de enriquecimento protéico, quando se introduz fontes de nitrogênio tais como amônia, uréia, triptona e caseína 27 ou s~luções sintéticas como sulfato de amônia. O substrato (ou a matriz sólida) deve ter algumas características que possibilitem o maior rendimento do processo. A principal peculiaridade é o alto grau de acessibilidade do microrganismo a todo o meio e, para tanto, de suas características mais importantes destacam-se a porosidade, o tamanho e o formato das partículas. Em relação ao tamanho da partícula, um problema se apresenta: se, por um lado, quanto menor o tamanho maior a área superficial e, conseqüentemente, maior o grau de transformação, por outro lado o processo necessita ter uma granulome~ tria própria visando permitir a circulação do ar por entre a massa e a dissipação de gases e calor produzidos, os quais poderiam vir a prejudicar o rendimento do processo. Esse item é importante para a definição da altura do substrato e da granulometria do meio que deve ser empregada no processo. Por exemplo, segundo estudo de P ANDEY et al}8 partículas de farelo de trigo e farinha de milho (a uma proporção de 9:1) com diâmetros entre 425-500 J..tm e 500-600 J..tm, respectivamente, resultaram em uma maior produção de amiloglicosidase, embora tenha sido notado que partículas de diâmetro entre 180 J..tm e 1,4 mm tenham apresentado rendimentos similares. 252 Fermentação em estado sólido ECHEVARRIA et al. 29 obtiveram o melhor rendimento de enriquecimento protéico de Aspergillus niger utilizando partículas de cana-de-açúcar com 1,4 mm. Já BUDIATMAN; LONSANE30 utilizaram resíduo fibroso do processamento de mandioca com diâmetro entre 3,0 e 5,0 mm para a produção de pectinase. A Figura 13.1 apresenta a velocidade de fermentação, avaliada pela porcentagem de co2 produzida no decorrer do processo, em função do tamanho das partículas do meio sólido. Pode-se observar que, conforme diminui o tamanho das partículas, aumenta a quantidade de gás carbônico produzido, assim como diminui o tempo em que o processo atinge o máximo de produção de C02 • 10 ~ N o() 00 8 o o.-,-a---<> 2,0mm 8,0mm 6 12,0mm 4 2 o o 5 10 15 20 25 30 35 40 Tempo de fermentaçao (horas) Figura 13.1 .- Influência do ?manha das ~Jlrtículas na velocidade de fermentação de açúcar de beterraba por Zymomonas mobd1s para a produçao de etanol. · Quanto à porosidade, a principal qualidade desta característica é a capacidade de absorção de água, que facilita o transporte de enzimas e metabólitos por entre o meio e os microrganismos. Embora alguns autores citem como aspecto importante a simplit:idade do meio de cultura utilizado no processo, em boa parte dos estudos o substrato necessita de um pré-tratamento para se adequar às condições necessárias ao crescimento e à produção de metabólitos pelos microrganismos. Assim, para facilitar a atuação dos microrganismos sobre o meio, podem ser empregados os processos de: • esmagamento, quebra, moagem e peneiramento, visando adequar o meio à granulometria mais adequada do processo; • suplementação de nutrientes e correção de pH, para suprir a falta de algum nutriente ou adequar às melhores condições de crescimento microbiano; • hidrólise ácida ou alcalina de material celulósico, visando facilitar a atuação enzimática; • embebição, para regular o teor de umidade inicial do processo;_ • vaporização ou aquecimentó, visando a gelatinização ou inchamento do substrato; 6 Substratos: características e composição 253 • adição de agente seqüestrante; com o objetivo de retirar íons metálicos do meio, que podem diminuir o rendimento do processo; 31 • processo de esterilização, que visa a diminuição ou eliminação de possíveis contaminações. Nesse último caso, porém, além de ser uma etapa de consumo muito grande de energia, a esterilização pelo calor pode causar uma modificação nas características do substrato, tais coino textura ou qualidade nutricional, que refletem na formação de uma massa compacta ou granular, um ressecamento da massa e, às vezes, uma adesão da massa à parede do fermentador. OSHIMA32 cita a modificação da textura de diferentes meios após a esterilização. Felizmente, alguns autores mostram que, a partir da adição de uma quantidade grande de inóculo que visa evitar ou abrandar o problema de contaminações, a não esterilização do meio não afeta a produtividade, como por exemplo na obtenção de penicilina33 e de etanoi.34 Diversas matérias-primas e, dentre estas, principalmente diversos tipos de resíduos agroindustriais, podem ser empregadas na fermentação em estado sólido. A escolha de cada meio, logicamente, irá depender do produto final que se deseja obter. Pode-se exemplificar os seguintes materiais: • celulose, hemicelulose e lignina oriundas de biomassa vegetal e/ ou esterco de animais para a produção de compostos orgânicos;35' 36 • farelo 37'38 e palha de trigo} farinha e farelo de soja/9 farinha, manipueira e resíduos sólidos do processamento da mandioca} 0 palha e quirera de ar- d e enzimas; · roz, 4o'41 b agaço d e cana42'43 e me 1aço para pro d uçao • sorgo/ polpa de ,beterraba/0' 21 "grits" de milho/ 2 bagaço de maçã, bagaço de uva, quirera de arroz, melaço e cana-de-açúcar8 para a produção de álcool; • resíduos de banana, farinha, 44 manipueira e resíduos sólidos do processamento de mandioca, espiga de milho, ba?aço de laranja,45 cana-de-açúcar/9 bagaço de cana, bagaço de maçã, 1 melaço, vinhaça, farelo e palha de trigo, 46 grão-de-bico, beterraba, polpa de café,47 polpa de batata-doce/ arroz cozido, 40 folha de "maple" 36 para a obtenção de enriquecimento protéico; • bagaço de cana, água de maceração de milho, lactose, sacarose 33 e farelo de trigo 48 para a produção de antibióticos; • grãos de milho, 49 alfafa e aveia/0 grãos de sorgo, soja, trigo, amendoim, - d e pro d uçao - d e t oxmas; . m1'Ih o w e arroz1051 ' para a ven'f'1caçao 52 4 31 • farelo de trigo/ beterraba, bagaço de cana e melaço ' para a produção de ácidos orgânicos; · • soja ("hamanatto", "tempeh", "miso", "natto", "shoyu"), pasta de amendoim ("ontjom"), peixe ("katsuobushi") e mandioca ("gari", "kokonte", "lafun") para a elaboração de alimentos e condimentos orientais 2' 11 ' 53 e africanos;9 254 Fermentação em estado sólido • sacarose, polpa de beterraba .e grãos de argila/4' 25 farinha de mandioca e solução nutriente 54 para a determinação das cinéticas do processo. · Um problema que pode surgir quando da atividade em larga escala para a obtenção de um bioproduto por FSS é o descarte ou o aproveitamento do resíduo gerado. Segundo ROUSSOS, 55 tem-se sugerido a utilização do reSíduo na geração de biogás, de ração animal, disposição em aterro sanitário e de fabricação de chapas e papéis, sem, porém, haver urna pesquisa concreta da viabilidade de cada aplicação. Foi, então, realizado um estudo de ensilagern com o resíduo proveniente da produção de celulase por Trichoderma harzianum em meio de bagaço de cana, farelo de trigo e solução nutriente. O resíduo foi prensado e ajustado a urna umidade entre 33 e 45%. Após a adição de bactérias lácteas, soluções ácidas e melaço de cana, a massa foi colocada em sacos plásticos perfurados a 23-28°C. Depois de 6 meses, verificou-se que o resíduo mantinha as mesmas qualidades iniciais. 13.5 - Reatores para a fermentação semi-sólida Para iniciar a discussão sobre os tipos de reatores comumente empregados, é interessante analisar quais as formas de processo que são utilizadas para a realização de urna fermentação em estado sólido. A forma empregada em praticamente todos os estudos revistos diz respeito ao processo em batelada no qual, basicamente, o meio é adicionado ao reator, ocorrendo então a inoculação do substrato e a incubação do mesmo por um determinado período de tempo. · A seguir, o produto obtido pode ser extraído por suspensão do meio com água, soluções-tampão ou solventes (corno no caso de enzimas, ácidos, álcool, ... ) ou então, simplesmente, secado e armazenado (corno para a produção de bioinseticidas ou proteína rnicrobiana). Porém, outros processos são citados na literatura. • Efetuou-se urna fermentação sernicontínua para a produção de ácido cítrico, em que há, por cinco vezes consecutivas no máximo, a extração do produto e areintrodução do meio de cultura à matriz inerte e microrganismos para urna nova fermentação, permanecendo assim a /matriz sólida junto com a massa rnicrobiana durante 20 a 25 dias dentro do reator ernpregado. 31 No caso da produção de ácido giberélico/ 4 cita-se o processo em batelada alimentada, no qual há a adição de porções iguais de sacarose ao meio no terceiro, quarto e quinto dia de fermentação, visando diminuir o efeito inibidor ocasionado por este substrato à massa rnicrobiana. Nos anos 40, há urna citação de produção em escala industrial de enzimas fúngicas, por Aspergillus oryzae, por processo contínuo. 56 O método, baseado no sistema de bandejas, consistia na esterilização, resfriamento, alimentação e inoculação do substrato por meios mecânicos, fermentação e secagem através da passagem das bandejas, colocadas em urna espécie de estantes rolantes; por túneis aclirnatados, finalizando com moagem e empacotamento mecânicos. Reatores para a fermentação semi-sólida 255 Um outro item que deve também ser analisado refere-se à escolha dos fermentadores e, neste caso, deve-se. levar em conta os objetivos da fermentação,57 a análise econômica dos custos iniciais e operacionais do processo,l,57 a manipulação simplificada do sistema (carga/recarga, limpeza, manutenção)! e a possibilidade de monitoramento e controle de diversos parâmetros, se houver necessidade.l,57 · Para a ampliação de escala do reator, deve-se verificar, primeiriun,ente, em escala de laboratório, se os objetivos foram alcançados,57 e observar parâmetros que, em pequena escala, não são compatíveis com a escala industrial (como os efeitos da espessura da camada, da compactação do substrato, da taxa de aeração e da dissipação de calor).l Dos diferentes tipos de reatores encontrados na literatura, segue~se como exemplos de alguns dos mais comumente empregados: • Reatores de vidro: logicamente, por ser um processo ainda não muito difundido, quando se fala em fermentação em estado sólido deve-se pensar antes de tudo em pesquisas que são realizadas, em nível de laboratório, através deste método. Assim, os primeiros reatores que devem ser citados são os de vidro, comumente utilizados em laboratório. Erlenmeyers são os primeiros a serem lembrados, devido à facilidade de manuseio durante as pesquisas. Frascos de Fembach58 também são bastante utilizados, inclusive em nível industrial, para a produção de esporos, devido à ampla área superficial entre o substrato e a atmosfera que o mesmo fornece para o desenvolvimento dos microrganismos. Garrafa~ de cultura também são muito empregadas pelos mesmos fatos expostos acima. Esses "reatores", embora excelentes para o início de uma pesquisa, deixam a desejar quand~ se pensa em uma ampliação de escala do processo. Dessa forma, diversos tipos de reatores têm sido propostos para amenizar os problemas de aeração, troca de calor, umidade, entre outros. Figura 13.2 - Reato res de vid ro: pe la o rdem, frasco de Fe mbach de 2500 ml, garrafa de cultu ra, tubular vertical, erle nmeyer de 250 ml, e rle nmeyer de 2800 ml. 256 Fermentação em estado sólido • Bandejas: as primeiras a surgirem foram as bandejas rasas. Construídas em estrutura de madeira,59 bambu/ alumínio 59 ou outros materiais,6 de diversos tamanhos (mas, com a altura do meio variando basicamente entre 2 a 7 cm2' 9), elas podem possuir seu fundo intacto, o que significaria uma atuação muito parecida .com a dos erlenmeyers, porém com uma área superficial de troca e uma capacidade de alocar meio de cultura muito maior. Podem também ter seu fundo substituído por uma tela perfurada, o que lhes confere uma maior eficiência na circulação de ar por todo o meio, e não somente na parte superior exposta ao ambiente. Para a disposição das bandejas, deve-se ter um local apropriado para o desenvolvimento da fermentação. Podem ser utilizadas simplesmente salas comestantes, fazendo-se uso de ar natural ou aeração forçada (passando antes por umidificadores), desde que haja o controle de temperatura e umidade. As bandejas, perfuradas, por outro lado, podem ser também dispostas em estufas que possuam uma adaptação para a entrada de aeração forçada pelo fundo do equipamento. CANNEL; MOO-YOUNG 2 citam o exemplo de utilização de grandes bandejas (1,4 a 4,5m 2 ) com fundo de tela, para a produção de "koji" em processo mecanizado, que são colocadas em câmaras de incubação tendo a temperatura ajustada pela passagem de ar por entre o substrato. Nesses casos, o substrato é aspergido por uma solução de inóculo. Instalações desse tipo requerem um elevado número de trabalhadores, além de o número de bandejas manipuladas diariamente ser igualmente elevado. • Figura 13.3 - Reatores tipo bandeja: pela ordem, com meio de cultura e vazio com fundo perfurado. • Tanques circulares: pode ser visto, na Figura 13.4, o exemplo de um equipamento em cultura estática, em nível industrial. TOYAMA60 indica um equipamento, denominado produtor de "koji" automático estacionário, que consiste de dois tanques rotatórios de 7 ril . de diâmetro, dotados de um agitador helicoidal, dentro de uma câmara de condições controladas. Podem ser processados, a cada batelada, cerca de 2 a 3 toneladas de meio de cultura, com alimentação, esterilização, inoculação e retirada do produto realizados automaticamente. Reatores para a fermentação semi-sólida Figura 13.4 - Tanques circulares 257 5 • Esteira rolante: este sistema é uma variante do férmentador de bandejas. As etapas de inoculação e incubação do material esterilizado são realizadas em longas esteiras de fundo perfurado por onde circula ar úmido. De acordo com as necessidades de cada produto, pode ser realizada também uma agitação ocasional. 5 I I t r- r- Figura 13.5 - Esteira rolante 5 • Tubular horizontal: neste processo, também denominado tambor rotativo, o substrato é este'r ilizado e resfriado diretamente no tambor. A rotação do reator p()de ser ocasionada tanto por um eixo central como pela movimentação de roletes sobre os quais o fermentador esteja montado. A rotação pode variar de 1 até 180 rpm. Carga 1 [T Água [T,['I~~~L 5 Figura 13.6 - Reator tubular horizontal com agitação interna A agitação do substrato pode ser realizada pela simples rotação do reator ou por agitador central contendo número variável de pás; neste segundo caso, o processo é denominado por fermentador tubular com agitação interna. 258 Fermentação. em estado. sólido. A aeração da massa é realizada pela passagem de ar esterilizado e umidificado através do reator, objetivando também o controle da temperatura interna. Esse equipamento apresenta como dificuldades a serem sup'l antadas o custo relativamente elevado para o volume de material produzido, a manutenção da integridade do micélio devido à agitação do sistema, além das dificuldades de ampliação de escala do processo. 5 Utilizou-se esse tipo de reator para a produção de ocratoxinas, 61 tendo 33 em de diâmetro, quatro chicanas internas e uma rotação a uma velocidade de 1 a 40 rpm. Estabeleceu-se que, para permitir a formação das hifas, a fase inicial deveria ser realizada em processo estático. TOYAMA60 citou, também, o exemplo de um tambor rotativo automático, em escala industrial, para a produção de "koji", em que todas as etapas do processo são realizadas automaticamente. Em nível laboratorial, o tambor rotativo foi utilizado por NISHI062 (capacidade de dois litros) e SILMAN58 (capacidade para 150 g de meio) para a produção de extrato enzimático a partir de Aspergillus. • Tubular vertical: também denominado fermentador tipo coluna, tem sido o reator utilizado em pesquisas quando se deseja obter o controle do processo . Esses reatores podem ser construídos em vidro 63 ou aço inox/ com dimensões de 2 a 40 em de diâmetro por 20 a 180 em de altura1'44'62'63'64, permitindq uma capacidade entre 10 g e 8 kg 33'54 '63'64 a cada batelada. O controle da temperatura deve ser feito através da passagem de ar por entre o meio, embora alguns pesquisadores indiquem a existência de jaquetas em torno do reator. 63 Porém, devido à baixa condutividade térmica do material sólido utilizado, somente a utilização de jaquetas não é suficiente para controlar a temperatura interna do reator. Dentro dessa categoria, encontra-se o reator Zymotis, projetado pela ORSTOM-França, que possui capacidade para receber 21 kg de meio.65 • Esse tipo de reator apresenta, como vantagens, um espaço reduzido, a rapidez de carga e descarga e uma relação volume total/volume útilpróximo a 1. Como desvantagens, a compactação da massa, a dificuldade de dissipação de calor e um grau de umidade da massa não uniforme ao longo do equipamento.5 Visando superar algumas das desvantagens apresentadas, se inclui também o denominado reator de leito fluidizado ar-sólido que, segundo pesquisadores,66 fornece um melhor controle de temperatura, de umidade e maior homogeneidade do sistema. • Sacos plásticos: na verificação de produção de tempeh,S 9 de toxinas 49 e pesticidas, 67 foram utilizados sacos de polietileno autoclaváveis, com dimensões de 20,0 x 38,0 cm 59 e 30 5 x 61,0 cm .49 Também utilizaram-se tubos plásticos de 10,0 em de diâmetro. 59 Cita-se que é necessário perfurar os sacos após um certo período, para permitir a aeração do meio .49,S9 . . 1 Controles do processo 259 13.6 - Controles do processo Como em todo processo fermentativo, o controle de determinados parâmetros se faz necessário para a obtenção de produtos com características constantes e uniformes. Em relação aos conhecimentos de engenharia bioquímica, importantes à compreensão desse item, ~AMANA MURTHY et al. 68 apresentam uma resenha arespeito de transferência de massa, transferência de calor, cinética das reações, medi. das experimentais de crescimento de biomassa e controle de temperatura e concentração de gases, além da influência do substrato e do biorreator no processo fermentativo . O controle da umidade, da temperatura e do pH do meio, a velocidade e freqüência de agitação, as condições de transferência de oxigênio e de nutrientes, as características do substrato, além das características e estimativa de crescimento e da automação do processo são os parâmetros mais freqüentemente analisados em diversos estudos revistos. • Umidade: o teor de umidade do substrato é um dos principais parâmetros que influencia o sucesso de uma fermentação em estado sólido. A natureza do substrato, as necessidades do microrganismo utilizado e o tipo de produto final desejado são os principais fatores que determinam o grau de umidade que o substrato deverá ter no início e ao longo da fermentação .4' 5 Um substrato apropriadamente umedecido deve ter um filme superficial de água visando facilitar a dissolução e a transferência de massa de nutrientes e de oxigênio. Porém, entre as partículas devem existir canais que permitam a difusão de gases e a dissipação de calor. 16 Assim, se o nível de umidade for elevado, implicará no d~créscimo de porosidade do substrato e irá resultar em uma menor difusão de oxigênio no interior do meio e conseqüente decréscimo de trocas gasosas, além de aumentar o risco de contaminação, principalmente a bacteriana. 4 Para níveis de umidade menores que o necessitado, haverá maior dificuldade na difusão de nutrientes, resultando em um crescimento do microrganismo menor do que o possível e esperado e, conseqüentemente, com menor produção do produto desejado (lembrando ~ue, a um teor de umidade abaixo de 12%, não há . desenvolvimento microbiano). 6 O teor de umidade na FSS pode variar entre 18 e 85%, sendo ele estipulado em função do poder de absorção do substrato. Como exemplo, pode-se citar o processo "koji" (cultura de fungos sobre arroz cozido) onde o substrato é moderadamente umedecido durante o cozimento pelo vapor (35 a 40% de água), e mantido úmido pela passagem de ar com 80 a 90% de umidade relativa, para o desenvolvimento de determinados fungos em sua superfície. Para a produção de toxinas, é necessário apenas um teor de umidade entre 18 a 30%, 61 ' 63 enquanto que para o crescimento de microrganismos, tendo a lignocelulose como substrato, os níveis variaram entre 70 a 80%. Quando o microrganismo utilizado é uma bactéria, a umidade costuma ser sempre superior a 60%. A Figura 13.7 apresenta a taxa de produção de proteínas de Aspergillus niger de acordo com a umidade inicial do meio de cultura. Pode-se observar que, con- 260 Férmentação em estado sólido forme há o aumento da umidade do meio de 35% para 55%, aumenta-se a produção de proteínas no processo, assim como diminui o tempo em que se dá a fase logarítmica e o ponto máximo de obtenção do bioproduto desejado. ~ .s ~ 14 .c ijl 12 Cl o o 10 ~ .., 8 i! 6 c: e Q. 4 2 o -5 5 15 25 35 45 Tempo de fermentaçao (horas) 44 Figura 13.7 - Influência do teor de umidade no crescimento de Aspergillus niger. Durante a fermentação, haverá uma perda de umidade devido à evaporação e às atividades metabólicas microbianas. Essa perda poderá ser reposta ou evitada, pela adição de água esterilizada em intervalos constantes de tempo, pela manutenção da umidade atmosférica entre 90-97% de umidade relativa através de injeção contínua de ar úmido no ferment_a dor ou com a instalação de umidificadores.4 • Atividade de água: este parâmetro fornece a quantidade de água não ligada viável à disposição dos microrganismos . Ela é definida como a razão entre a pressão de equilíbrio de vapor do substrato em•relação à água pura, à mesma temperatura. A atividade de água (aw) influencia o desenvolvimento microbiano e os processos bioquímicos. Assim, cada microrganismo tem um nível de aw mínimo para que possa efetuar suas atividades metabólicas. Em termos gerais, por exemplo, os fungos possuem uma aw mínima de 0,7, enquanto que para as leveduras o valor situa-se em 0,8 e para as bactérias, 0,9. 68 Em PANDEY/ 5 são citados exemplos em que, durante uma fermentação em estado sólido para fungos filamentosos, altas atividades de água favorecem a esporulação, enquanto que para baixas atividades há o favorecimento de crescimento micelial ou germinação dos esporos. A atividade da água influencia a produção de aromas em queijos, sendo encontrado que o ponto ótimo de produção situa-se na faixa de aw = 0,98. NARAHARA 40 cita que o desenvolvimento de Aspergillus oryzae em arroz cozido cessa .a valores inferiores a aw = 0,90. YANG/ 0 para .o enriquecimento protéico de resíduos de batata-doce com leveçluras amilolíticas, indica valores de aw= 0.98-0,99. Controles do processo 261 • Temperatura: devido às atividades metabólicas dos microrganismos e dependendo da altura da camada de substrato, uma grande quantidade de calor pode ser produzida durante o processo fermentativo. Por exemplo, RATHBUN, SHULER71 indicam um gradiente de 3°C a cada centímetro de meio em um reator, sem dissipação de calor, com uma camada de substrato de 6,5 em de profundidade, para a produção de tempeh. Como a temperaturá afeta direta~ente a germinação dos esporos, o crescimento e a esporulação dos microrganismos e a formação de produto, o calor produzido deverá ser imediatamente dissipado, para que o aumento da temperatura não prejudique a fermentação desejada. Isso pode ser efetuado com a introdução de ar comprimido através do meio de cultura, com o controle da temperatura da sala ou do equipamento onde ocorre a fermentação, ou pelo sistema de camisas em torno do fermentador com circulação de água refrigerante. 4 No processo de compostagem, que utiliza grandes leiras de difícil oxigenação interna, a temperatura interior chega a atingir níveis de. 60 a 70°C. 57 Já em um exemplo de produção de etanol, a temperatura ótima situou-se na faixa de 35°C, sendo que foi observada a produção de sorbitol a temperaturas pouco maiores (39°C) e a formação de levana a temperaturas mais baixas (25°C). 21 A Figura 13.8 apresenta a taxa de produção de proteínas de Aspergillus niger em relação à temperatura empregada no processo. Pode-se observar que, embora a temperatura de 40°C tenha apresentado um menor tempo em que ocorre a fase logarítmica, o processo à temperatura de 35°C obteve os maiores valores de produção protéica. Observa-se também que a temperatura de 45°C apresentou uma perda sensível na eficiência do processo. .....- 14 .9 12 ~ iií .o :::J rn 10 C) o 8 s 6 o .... 111 c ~ 0.. 4 2 oo 5 Tempo de fermentação (horas) Figura 13.8 - Influência da temperatura no crescimento de Aspergillus niger. 44 Quanto ao controle de temperatura, NARAHARA 40 reporta que para a produção de enzimas proteolíticas utilizando-se Aspergillus oryzae ein arroz cozido, a 262 Fennentação em estado sólido temperatura ideal situa-se na faixa de 30°C, sendo que, visando o crescimento do microrganismo, a temperatura deve ser mantida a 38°C. • pH: o controle do pH durante a fermentação em estado sólido, embora este seja um dos parâmetros mais críticos, dificilmente será conseguido devido à heterogeneidade e à consistência do material. Corno tentativa de amenizar o efeito de urna variação brusca do potencial hidrogeniônico, utilizam-se substratos com boa capacidade tarnponante ou a adição de soluções-tampão durante a etapa de urnidificação do substrato. 4 • Aeração: para um bom rendimento e urna rápida fermentação em substrato sólido, é necessário o uso de urna grande área superficial do meio de cultura, no qual o microrganismo pode se desenvolver em contato com o ar. Na maior parte dos processos, tanto em nível laboratorial corno em nível industrial, a oxigenação do meio é realizada pela introdução de aresterilizado sob pressão no equipamento de fermentação. Dependendo do valor da taxa de aeração introduzida, pode ser ocasionada urna perda de umidade devido à exaustão do ar, provocando urna secagem não desejada do substrato. Assim sendo, torna-se sempre necessário, nesses casos, a presença de urnidificadores de ar antes da introdução do mesmo ao reator. Há diferentes maneiras para se obter urna melhor movimentação do ar por entre o substrato, permitindo assim uma melhor transferência de oxigênio, quer seja pela utilização de material poroso rnedianamente granulado ou fibroso, pelo uso de pequena espessura da camada de substrato, pela utilização de bandejas perfuradas ou reatores com fundo composto por uma tela de arame, pela agitação do substrato ou ainda pelá introdução de ar forçado estéril dentro do reator. 4 . Essa quantidade de ar estéril a ser introduzida no processo fermentativo vai depender da natureza dos microrganismos, da quantidade de calor metabólico a ser dissipada do processo, da espessura da camada de substrato, da quantidade de C02 e outros metabólitos voláteis a serem eliminados e da necessidade de oxigênio para a síntese dos produtos. 4 · Em comparação com a fermentação submersa, esta necessita de quâtro a cinco vezes mais oxigênio que a fermentação em estado sólido. 5 Para se avaliar a taxa de consumo de oxigênio e de formação de outros gases, pode-se utilizar tanto um analisador de 0 2 e C02, assim como um cromatógrafo a gás, capazes de analisar os gases existentes na atmosfera do reator. 62 ' 72 • Agitação: o emprego da agitação em um processo em estado sólido pode vir a fornecer uma melhor homogeneização quanto à distribuição dos inó. culos e do umidificante, impedir a formação de agregados e favorecer tanto a transferência gasosa pela exposição de partículas de substrato à atmosfera do fermentador como a troca de calor dentro do meio. 4 A agitação, porém, devido à fragmentação mecânica do rnicélio, pode interferir na formação dos esporos e no desenvolvimento natural do microrganisrno.58 Pode causar também a compactação do meio e a danificação das hifas .5 • Estimativa e car;::tcterística de crescimento: a seqüência de cresCimento rnicrobiano em meio de cultura, em condições ótimas, envolve a germinação --- ------- - ----- ------. ------·---- -- ---------------- - ---·- Controles do processo 263 nas primeiras horas, seguida de um aumento gradual de temperatura devido ao início das atividades metabólicas, urna taxa crescente das atividades metabólicas, a fase estacionária e de declínio. A duração de cada etapa vai depender das condições de fermentação, do microrganismo empregado e do produto que se deseja obter. 4 O fungo filamentosp tem a capacidade de penetrar nos espaços inter e intragranulares por meios mecânicos ou enzimáticos, com a firme fixação das hifas na superfície do substrato e posterior intensa ramificação e penetração na parede celular do substrato pela atuação de enzimas extracelulares produzidas e excretadas pelos microrganismos. Alguns estudos têm sido realizados visando determinar as cinéticas de crescimento do microrganismo, de consumo de substrato e de geração do produto. Contudo, é muito difícil estimar diretamente a biomassa rnicrobiana no processo em estado sólido, 69 assim corno separar, em muitos casos, o rnicélio do substrato. Dessa forma, são utilizados métodos indiretos, tais como extração alcalina da proteína micelial do complexo celulose-fungo; estimativa da quantidade de ATP ou glicosamina 24 ' 25' 62 do microrganismo; estimativa da quantidade de proteínas por infravermelho 1 ; determinação da atividade da lacase extracelular; determinação contínua da quantidade de C02 e 0 2 presentes na atmosfera do fermentador por analisadores de gases/' 23' 24 ' 40' 72 ' 73 ' 74 ou por absorção do C0 2 em Na0H. 54 • Extração de produtos: existem poucas informações disponíveis em literatura relacionadas a estudos de extração de produtos obtidos por FSS. Por exemplo, para extração de enzimas extracelulares, em geral, apenas é citada a utilização de um diluente, corno água corrente, água destilada, solução diluída de sais ou solução-tampão. RAMAKRISHNA et aC 5 realizaram urna pesquisa visando recuperar arnilo- glicosidase, produzida por Aspergillus niger em meio de farelo de trigo, farinha de milho e solução nutriente, utilizando os métodos de percolação e recuperação em sistemas multiestágios em contracorrente. Concluíram, por esse estudo, que: a) para a percolação, o rendimento da extração é o mesmo, tanto utilizando a proporção 1:10 como 1:100 entre meio e diluente. Nesse caso, o rendimento máximo de extração foi de 80 a 82%. b) A recuperação com agitação é cerca de 8% maior em relação ao processo estático. Ainda assim, tende a restar 17% da enzima produzida retida na matriz sólida. c) a utilização de solução de sais, na faixa de 0,5% a 5%, não afetou a taxa de extração. d) o sistema utilizando cinco estágios, com o diluente circulando continuamente por entre eles, mostrou-se mais vantajoso, devido ao fato de o extrato enzimático obtido estar mais concentrado, eliminando, por vezes, a necessidade de concentração que poderia interferir na atividade enzimática. 264 ·Fermentação em estado sólido 13.7 - Vantagens e desvantagens O processo em estado sólido apresenta as seguintes vantagens operacionais em relação ao processo submerso: • apresenta uma aceleração na taxa de reação devido ao díreto contato entre 21 . . o sub strato e o mtcrorgamsmo; • pode eliminar etapas de pré-tratamento do substrato, como no caso da produção de etanol, no qual não há a necessidade do processo de extração · do caldo de cana/ 1 • vários estudos apontam que o substrato utilizado é relativamente simples, necessitando, em muitos casos, somente de adição de água ou uma pequena correção do meio com a introdução de fontes de nitrogênio e de outros nutrientes minerais; 2' 9' 11 ' 76 • devido à menor quantidade de água empregada, o volume do reator deve ser sempre bem menor que a operação similar em processo submerso, o que irá reduzir os custos de operação e de capital investido assim como o , .. 2 7 9 11 21.76 espaço ocupa d o necessano ao processo; '' ' ' ' • essa baixa quantidade de água empregada também deve reduzir os custos de capital investido e de energia consumida na recuperação do produto, como no caso da produção de álcool; 2' 21 • a utilização de agitação contínua raramente é necessária, podendo ser empregada, ocasionalmente, apenas uma leve mistura do substrato; 2 • a aeração, natural ou forçada, é facilmente acessível aos microrganismos, devido aos interstícios existentes entre as partículas do substrato; 2' 9' 76 • os baixos teores de umidade empregados, somados à alta concentração de inóculo incorporado ao meio, reduzem, ou muitas vezes até eliminam, o problema de contaminação por outros microrganismos indesejáveis;2' 7,33' 34' 76 • as condições de crescimento empregadas são, em geral, similar<ts às condições naturais de crescimento dos fungos filamentosos, o que possibilita, em muitos casos, maiores rendimentos na obtenção de produtos de utilização industrial/6 • também esse fato permite o estudo de casos que somente ocorrem em condições semelhantes à fermentação em estado sólido, como a produção de toxinas por determinados fungos filamentosos em grãos/6 • o produto final encontra-se mais concentrado, o que permite, em alguns casos, como na produção de bioinseticidas ou ração animaV0 o processo direto de secagem e embalagem do produto final obtido, ou mesmo a utilização direta, como para alguns alimentos orientais; 2' 76 • quando for necessária a recuperação do material obtido, a concentração do mesmo facilita esta etapa, pois permite a utilização de menores quantidades de solventes empregados para extrair o produto; 76 • há uma menor produção de resíduos líquidos a serem tratados ou dispostos, o que reduz também os custos de capital investido e de operação da Vantagens e desvantagens 265 planta de tratamento construída, além de resultar em urna redução nos problemas ambientais originados pelo processo; 2' 7' 76 • assim corno o processo submerso, a fermentação em estado sólido pode ser realizada de modo contínuo, sernicontínuo ou em batelada, e os equipamentos empregados em laboratório, planta-piloto ou em escala industrial por este sistema não são mais complexos em comparação com aqueles utilizados na fermentação tradicional; • sendo necessária urna área de estocagern do produto serniprocessado ou final, esta deverá ser bem menor que a similar em processo submerso} • em diversos casos, obteve-se um rendimento do processo maior que em comparação à fermentação subrnersa. 76 Contudo, o processo apresenta também as seguintes limitações, que devem ser conhecidas para futuros estudos visando urna possível resolução destes problemas: • dependendo das características do meio e do tipo de reator empregado, pode haver dificuldade em dissipar tanto o calor produzido corno os gases gerados durante o processo, o que irá conduzir, para o primeiro caso, a urna elevação da temperatura em pontos localizados, e, no cômputo geral, resultará em quedas sensíveis no rendimento} • devido à heterogeneidade do substrato, dissipação de calor e gases gerados, manipulação do meio e do produto final e do monitoramento e controle do processo, poderá haver dificuldades intrínsecas quando se desejar realizar a ampliação de escala do sistema; • se for necessário o emprego da agitação do meio em fermentação, a energia despendida deverá ser bem maior que em processo subrnerso; 11 ' 76 • embora estejam sendo realizados estudos para a suplantação desses problemas, ainda há urna dificuldade no acompanhamento e controle de parâmetros operacionais, tais corno ~H, temperatura, umidade, aeração e crescimento de rnicrorganisrnos/' 5' 9' 6 • para evitar a esterilização do meio e visando obter o máximo de rendirnento, há a necessidade de incorporar urna grande '\uantidade de inóculo ao substrato e posterior hornogeneização do sistema; '11 • assim corno, para alguns estudos, somente essa forma de processo pode ser utilizada, para outros casos, principalmente quando há o envolvirnen. to de bactérias, a exclusividade cabe ao processo submerso; • da mesma forma que a fermentação tradicional, há a necessidade do pré-tratamento dos substratos, e, em alguns casos, mais custoso, adequá-los à fermentação desejada; 76 • há urna dificuldade de coleta de amostras representativas durante o processo, devido à não homogeneidade da massa em fermentação/ • de acordo com o processo, pode haver a necessidade de um controle mais rigoroso das condições ambientais nos locais de acesso à fermentação, principalmente quando houver a produção de esporos de fungos filamentosos, visando preservar a saúde das pessoas envolvidas com o sistema; 266 Fermentação em estado sólido • embora seja um fato que vários estudos têm sido realizados, notando-se um crescente interesse nessa área por pesquisadores do Ocidente, ainda há uma reduzida oferta de publicações técnicas 2 e de exemplos concretos que possam ser observados e vivenciados. 13.8 - Exemplos de casos Este item é dedicado à apresentação de alguns estudos referentes à exploração da fermentação em estado sólido para a obtenção de bioprodutos por diversos autores, publicados nos mais importantes periódicos da área de biotecnologia e bioprocessos. Não se trata de esgotar o tema, e sim de dar subsídios para quem quiser começar a utilizar esse processo em suas pesquisas. PRODUÇÃO DE ÁLCOOL ETÍLICO Foram três as principais linhagens de microrganismos estudadas na produção de álcool etílico via FSS: a tradicional Saccharomyces cerevisia/'8' 12' 34 e Schwanniomyces castelli, 64' 77 dentre as leveduras, e a bactéria Zymomonas mobilis. 20' 21 O emprego de cada uma delas dependeu principalmente do substrato a ser utilizado: no caso de Saccharomyces e Zymomonas, o meio de cultura deve ser composto basicamente por açúcares (cana-de-açúcar, 8 beterraba/0' 21 sorgo/ vagem de alfarroba34) ou amido pré-sacarificado (milho e cevada 12); já para Schwanniomyces castelli, pode ser utilizado amidó diretamente/'8 uma vez que estes microrganismos apresentam enzimas com capacidade amilolítica. No caso, ós autores utilizaram amido solúvel embebido em bagaço de cana. O teor de umidade do meio, nos diferentes estudos, variou de 70,0 a 77,3%, a temperatura de 25 a 35°C e o pH de 4~0 a 5,7. O etanol pôde ser obtido em um período entre 16 a 30 horas, a partir de inóculos variando de 1,0 x 107 a 7,5 x 108 células/ g meio. Utilizaram-se partículas de tamanho desde 0,5 a 5,0 mm, sendo que a eficiência de conversão a etanol situou-se na faixa de 80 a 95%. • PRODUÇÃO DE ÁCIDOS ORGÂNICOS a) Ácido láctico: a produção pode ser obtida a partir de Rhizopus oryzae, dentre os fungos 78 e ·pelas bactérias Lactobacillus casei, Lactobacillus helveticus e Streptococcus thermophilus.22 Utilizaram-se, como meio de cultura, soluções de glicose e de carbonato de cálcio embebendo partículas de bagaço de cana de tamanho entre 0,8 a 2,0 mm ou torta de filtro (resíduo da indústria de álcool) simplesmente. Em uma comparação com o processo em meio líquido, SOCCOL et aC 8 apontaram um rendimento na faixa de 77% para ambàs as fermentações. b) Ácido giberélico: esta produção foi realizada utilizando-se linhagens de Gibberella fujikuroi em meio de cultivo composto basicamente de farelo de trigo, amido solúvel e solução de nutrientes minerais, com o teor de umidade sendo estabelecido a partir da proporção de duas partes de meio sólido para uma de líquido. Manteve-se a temperatura a 28°C e a produção efetuou-se por um período de 6 a 7 dias, utilizando-se os processos de fermentação em estado sólido; tanto em batelada como em batelada alimentada. 14 Exemplos de casos 26 7 c) Ácido cítrico: o microrganismo utilizado para esta produção foi, em todos os estudos, Aspergillus niger. 6' 31'52'79'80 Os meios de cultura podem ser melaço (junto com a adição de solução de nutrientes à base de nitrogênio, fósforo e potássio) em bagaço de cana/ 1' 52 torta de filtro do processamento de cana-de-açúcar, 80 bagaço de maçã 79 ou sacarose,52 com o teor de açúcar variando de 8,5 a 14,0%. A temperatura situou-se na faixa de 28 a 30°C, com o meio tendo um teor de umidade em torno de 65 a 88%,, e valores de pH entre 5,5 e 5,8. Inoculando-se com uma suspensão de 2,0 x 106 e~poros/~ meio, após 4 a 6 dias, obteve-se uma conversão de 80%. A adição de metanol52' 7 e/ou hexacianoferrato 31' 80 (agente seqüestrante) ao substrato aumentou o rendimento do processo. PRODUÇÃO DE ENZIMAS a) Fitase: para a redução de níveis de ácido fítico em farinha de semente de colza e de canola (subprodutos do processamento de óleo a partir destas matérias-primas), utilizou-se uma cultura de Aspergillus carbonarius em meio composto por farinha de canola e fosfato inorgânico. 81 O período de fermentação foi de 72 horas, a um teor de umidade de 53-60%? A adição de oleato de sódio (1 %) e Tween-80 ao meio aumentou a produtividade do processo. 83 b) cx-amilase: para a produção desta enzima termoestável, utilizaram-se diversas linhagens de Bacillus, como Bacillus coagulans/ 1 Bacillus megaterium, 84 Bacillus Iicheniformis 85 e Bacillus sp.,86 em meio de farelo de trigo/ 1 com partículas de diâmetro entre 0,4 e 0,8 em, pH inicial 7,0 a 40°C. 84 Foi mostrado que a atividade enzimática é reduzida em até 85% caso o teor de umidade inicial do meio varie de 65% a 95%. LONSANE; RAMESH 19 mostram um resumo desta produção em FSS por bactérias. Já por fungos, verificou-se a produção por Rhizopus oryzae em meio à base de mandioca. 87 , c) Pectinase: foram emgregadas culturas de Aspergillus sp } 0 Aspergillus carbonarius88 e Aspergillus riiger 3 em meio de resíduo fibroso de processamento de mandioca/ 0 far~lo de trigo e sais, 88 pectina mais sacarose, glicose ou ácido galacturônico embebidos em suporte de bagaço de cana.43 Um dos meios consistiu de partículas de tamanho entre 3-5 mm, 30 a uma umidade de 70%/ 0.4 3 e a 30°C. 88 Foi constatado que, em termos de atividade enzimática, a fermentação em estado sólido foi onze vezes superior à fermentação submersa. 43 d) Ce1ulases: Foi observada a atividade celulolítica de extratos enzimáticos obtidos a partir de Trichoderma reesei/ Trichoderma viride,42'89 PeniCillium citrinum,41 Penicillium chrysogenum e Fusarium oxysporum, 42 tendo como substrato 89 palha de trigo/ bagaço de cana seco ao sol/ 2 cascas de arroz 41 e fibra de coco. Foram utilizadas, como condições do processo, um pH inicial de 5,8 a uni. teor de umidade de 80% e temperatura de 25°C 42 e 30°C/ durante um período de 7-14 dias. 41' 42' 89 Observou-se, também, que a produção em meio sólido foi três . . a' su b· mersa. 42 vezes supenor . e) Enzimas proteolíticas: verificou-se a produção de enzimas proteolíti39 cas a partir de Bacillus amylolique[.aciens / 0 Aspergillus awamori, e Aspergillus 39 91 4 90 37 oryzae/ 0' à temperatura de 30°C ' e 37°C, inicial de 7,9 e um teor de 91 umidade de 35%, 40 utilizando arroz cozido, 4 farelo de trigo e farinha de soja. 39 fH 268 Fermentação em estado sólido f) amiloglicosidase: estudou-se a produção por Rhizopus oryzae}7 Aspergillus oryzae/3 e Asperf.sillus niger/ 5' 28' 37' 38' 92 em meio à base de farinha de mandioca,S7 farelo de trigo 28' 38' 7 ' 92 e farelo de arroz. 15 Empregou-se, como cond~ções de cultivo, uma temperatura entre 28 e 30°C, 15' 23' 38' 92 a valores iniciais de umidade de 55% e pH 4,7. 92 Mostrou-se que a ~rodutividade em meio sólido foi 32 vezes superior à produção em meio líquido. 7 Meio de cultura à base de farelo de trigo umedecido, esterilizado com vapor Resfriamento e inoculação com esporos de Aspergillus Mistura e colocação em bandejas ou tambores rotativos Incubação a 20-4s•c de 1 a 7 dias Extração da enzima com água ou solução-tampão Secagem e moagem da cultura Extrato enzimático Farelo enzimático 57 Figura 13.9 - Uma seqüência típica de um processo de produção de enzimas pelo método de cultura sólida. PRODUÇÃO DE TOXINAS Observou-se que diferentes espécies de Fusarium são potenciais produtores de toxinas, tais como a fusarina C/3 a fumonisina, 49 deoxini"talénol e 3-acetildeoxinivaleol,51 tendo como substrato arroz 51 ou milho. 49 Da mesma forma, Aspergillus produzem aflatoxina e ocratoxina, principalmente por Aspergillus Jlavus, Aspergillus parasiticus e Aspergillus ocraceus. 10.so.61 '94' 95 Os estudos foram conduzidos em uma faixa de temperatura entre 25 a 29°C, teor de umidade entre 18 a 31 %, 61 ' 63 utilizando-se como meio sólido forragens de alfafa e aveia, 10'50' 94 grãos de sorgo, . t ngo, . .amen d mm, . m1'lho e arroz. 10So95 SOJa, · · PRODUÇÃO DE ANTIBIÓTICOS a) Penicilina: a utilização de Penicillium chrysogenum, em meio de bagaço de cana umidificado com solução nutriente à base de glicose, lactose e água de maceração de milho, obteve maior produtividade volumétrica e maior rendimento em menor período de fermentação, quando comparado com o processo submerso. Para tanto, foi introduzido no processo um inóculo com 5,0 x 106 esporos por grama de meio, à temperatura de 26°C, pH inicial de 5,5 e um teor de umidade inicial de 70 a 73%, durante um período de 46 horas .33 Exemplos de casos 269 b) Iturina: para a produção deste antibiótico antifúngico por Bacillus subtilis, utilizou-se farelo de trigo, verificando-se que a produção em meio sólido foi de cinco a seis vezes maior que a similar em meio líquido. 48 PRODUÇÃO DE BIOPESTICIDAS a) Foram produzidos esporos do fungo entomopatogênico Beauveria brongniartii em grãos de /milho pré-tratados, alcançando um rendimento de 4,8 x 108 conídios por grama de grãos;67 b) Estudou-se a atuação do farelo fúngico, obtido a partir da fermentação de Stilbella aciculosa em farelo de trigo, contra Rhizoctonia solani; 96 c) Esporos de Coniothyrium minitans, inibidor da germinação de Sclerotinia sclerotiorum, foram produzidos em diferentes tipos de substratos, alcançando um rendimento na faixa de 1,9 a 9,3 x 108 esporos por grama de meio de cultura; 97 d) Verificou-se a produção de esporos de Bacillus thuringiensis a partir de resíduos de indústria de processamento de mandioca, alcançando um alto rendimento no processo, bem superior à cultura submersa. 18 PRODUÇÃO DE ESPOROS Efetuou-se a obtenção de esporos de Trichoderma harzianum (potencial gerador de celulases, biopesticidas, antibióticos, compostos flavorizantes e proteína microbiana) em suporte inerte (bagaço de cana) e substrato çomposto por farinha de mandioca e solução nutriente, a 29"C, com um teor de umidade de 75%, durante um período de 6 dias a uma taxa de aeração de 300 litros de ar por quilograma de meio por hora. A partir de um inóculo de 3,0 x 10 7 esporos/g meio, foram gerados até 5,0 x 10 10 esporos/ g de meio, 5 vezes mais que a produção em • mew agar. 98 ENRIQUECIMENTO PROTÉICO Visando obter um enriquecimento protéico,microbiano, foram estudadas as linhagens de Aspergillus niger/9' 44,45 ,47 Trichoderma reesei/' 46 Rhyzopus sp., 45 Rhizopus oligosporus/9 Aspergillus oryzae/0 Saccharomyces diastaticus e Saccharomyces sp. 70 Os meios empregados foram cana-de-açúcar e nutrientes/9 polpa de batata-doce/'70 arroz cozido/0 farinha de mandioca e solução salina,44 "grits" de milho/ 9 polpa de café/7 bagaço de laranja, 45 palha de trigo e solução nutriente, 45 com uma concentração inicial de 2 a 5 x 107 esporos por grama de meio. 29,44 Verificou-se que as variáveis do processo observadas foram as mais diversificadas dentre todas as aplicações da fermentação em estado sólido revistas. Como exemplos, os estudos foram conduzidos a um pH inicial de 2,5/ 3,5,47 3,8/ 3,5-4,3,45 4,2/9 4,5 70 e 5,0/6 a teores de umidade de 40%, 40 50-55%/4 60%/9 65%/0 69%/9 70% 45,46 e 80%/ 7 temperaturas de 28°C/ 29"C,46 30°C,45 ' 70 33-36°C/9 35°C,44' 47 37°C/9 e 38°C/ 0 com taxas de aeração de 4,3 29 e 8,047 litros por quilograma de meio por minuto. Também foram realizados estudos a Rartir de resíduos agrícolas celulósicos (palha de centeio<35 l, folha de "maple"<36 ), com pré-tratamento com H 2S04 e 270 Fermentação em estado sólido NH 40H, 35 ou NaOH 36 a 121°C para hidrólise do matei.-ial. Após essa etapa, adicionou-se solução salina e inoculou-se com Candida utilis, Aerobasidium pululans, Trichoderma viride 35 e Chaetomium cellulolyticum/6 a um teor de umidade de 75%-78% e temperatura ambiente 35 ou a 37°C. 36 ALIMENTOS ORIENTAIS Como exemplo, foi estudada a produção de tempeh, um tradicional alimento da Indonésia, a partir de Rhizopus oligosporus 100 e Rhizopus sp., 59 em meio à base de trigo 100 ou soja, 59 a 31 °C por 20-24 horas. 59' 100 Por esse processo, o sabor desagradável da soja torna-se mais aceitável, o alimento é mais facilmente digerível devido à ação das enzimas lipolíticas, proteolíticas e amilolíticas produzidas, · além de aumentar os níveis de niacina e riboflavina ao longo da fermentação. 100 Referências bibliográficas (1) DURAND, A., DE LA BROISE, D ., BLACHERE, H. Laboratory scale bioreactor for solid state processes. Journal of Biotechnology, v. 8, p.59-66, 1988. (2) CANNEL, E., MOO-YOUNG, M. Solid-state fermentation systems. 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Igualmente, o cultivo de células animais, 'v isando a produção de produtos ou a posterior infecção por vírus para a obtenção de vacinas, são processos aeróbios. · Dessa forma, os processos fermentativos envolvendo o cultivo de células aeróbias ou aeróbias facultativas, visando a produção de produtos como os acima exemplificados, ou ainda para a realização do tratamento biológico de águas residuárias, têm todos o aspecto comum de exigirem um adequado dimensionamento do sistema de transferência de oxigênio, ou seja, da operação de dissolução do oxigênio contido na fase gasosa (normalmente o ar, ou ar enriquecido com oxigênio) para a fase líquida, de onde o microrganismo irá consumir este oxigênio para a respiração. Como se sabe, do ponto de vista bioquímica, o oxigênio é o último elemento a aceitar elétrons, ao final da cadeia respiratória, s~ndo então reduzido a água, permitindo que ocorra a reoxidação das coenzimas que participam das reações de desidrogenação (ao longo da glicólise e do ciclo de Krebs) e, ainda, permitindo o armazenamento de energia através da passagem das moléculas de ADP para ATP. Estas últimas, por sua vez, irão participar necessariamente nas reações de síntese de moléculas, para a sobrevivência das células e para o surgimento de novas células, no processo de proliferação da biomassa microbiana, para as quais é fundamental a introdução de energia. 278 Agitação e aeração em biorreatores Assim sendo, um cultivo que seja altamente eficiente, ocorrendo com elevadas velocidades de crescimento celular, significa altas velocidades de consumo da fonte de carbono, a fim de que haja abundância de elétrons transportados na cadeia respiratória (geração de ATP), mas significa também, obrigatoriamente, a necessidade da existência de oxigênio dissolvido, a fim de que estes elétrons sejam drenados ao final desta cadeia. A equação estequiométrica de oxidação completa da glicose ilustra bem esta situação: ou seja, para que ocorra a oxidação de 1 mol de glicose, é necessário o consumo de 6 mols de 0 2 . Essas considerações tornam óbvia a co~preensão sobre a necessidade de se agitar e aerar um meio de cultivo, para que se possa efetuar um processo fermentativo aeróbio. No entanto, ainda resta entender a necessidade de executar essa operação ao longo de todo um processo fermentativo e não apenas em seus instantes iniciais. Para que essa necessidade fique clara, é preciso lembrar que é sempre possível dissolver quantidades significativas das fontes de carbono, nitrogênio, fósforo e demais nutrientes necessários. De fato, sabe-se que a glicose é bastante solúvel em água, sendo possível solubilizar centenas de gramas por litro de solução, sem maiores dificuldades. Igualmente, para os outros nutrientes necessários, é sempre possível encontrar espécies quírrücas razoavelmente solúveis, de forma a se colocar à disposição dos microrganismos dezenas de gramas por litro. Para o oxigênio, no entanto, essa situação é bastante distinta, pois este elemento é muito pouco solúvel em água. De fato, a concentração de oxigênio dissolvido na saturação é apenas da ordem de 7 mg0 2 /L (7 ppm), ao se borbulhar ar atmosférico à pressão de 1 atm e a 35°C. Conclui-se, portanto, que de nada adiantaria dissolver centenas de gramas de glicose por litro, além das quantidades necessárias dos demais nutrientes, para que se imaginasse efetuar um processo fermentativo descontínuo aeróbio, sem que se imaginasse igualmente introduzir, ao longo do processo, o oxigênio necessário para suportar a condição de aerobiose, tendo em vista a baixíssima capacidade de armazenar o 0 2 na solução. Exatamente por essa razão é que se costuma afirmar que a extensão de um processo descontínuo aeróbio e, por conseguinte, a obtenção de elevadas concentrações do produto desejado, depende enormemente da capacidade de se transferir o 0 2 para a fase líquida, especialmente nos instantes mais avançados do processo, onde a concentração celular pode ser elevada. Da mesma forma, no que se refere aos processos contínuos e qescontínuos alimentados, o emprego de elevadas vazões de alimentação de nutrientes só será efetivo caso se tenha sistemas bem dimensionados de transferência de oxigênio. Sistemas para a transferência de oxigênio 279 Em outras palavras, pode-se ter situações em que a capacidade de transferência de oxigênio é que ditará as condições de operação. · Como se sabe, existem vários trabalhos publicados nos quais se indicam as vantagens em se operar reatores com altíssimas densidades celulares (algo como 100 g/1) e empregando-se células mantidas em altas velocidades específicas de crescimento e, por decorrência, com elevadas velocidades específicas de respiração (conforme será vistd mais adiante). Tais situações devem ser observadas com certa cautela, pois será sempre muito complicado efetuar-se a ampliação de escala dessas situações, justamente tendo em vista as enormes capacidades de transferência de oxigênio que seriam necessárias. Igualmente, sabe-se das freqüentes críticas elaboradas com relação aos sistemas aeróbios de tratamento de resíduos, os quais são sempre muito mal monitorados e controlados, tendo em vista não pertencerem especificamente ao sistema produtivo da unidade industrial. Deve-se, antes, buscar explicações no dimensionamento do sistema de transferência de 0 2 (freqüentemente se superestima ~sta capacidade, a fim de reduzir o tamanho dos reatores), ou observar a forma de dperar, a qual deve ser compatível com a capacidade de manter o sistema biológico em condições de aerobiose. Essas considerações caracterizam a necessidade de se entender a·s bases fundamentais da transferência de oxigênio, objetivo central do presente texto, o qual é complementado com as considerações do capítulo seguinte (Capítulo 15: Variação de Escala). 14.2 - Sistemas para a transferência de oxigênio Tendo em vista a importância da operação de transferência de oxigênio, é de se esperar que existam muitas formas de executá-la, obviamente umas mais eficientes do que outras. Aquelas menos eficientes, em termos de transferência de oxigênio, podem ser interessantes sob outros aspectos, como, por exemplo, a de submeterem as células a um menor cisalhamento. Na Figura 14.1 estão indicadas algumas possibilidades de se transferir oxigênio em biorreatores. Os esquemas indicados por (1) e (2) na Figura 14.1, indicam o que se costuma chamar de aeração superficial (designação não apropriada, pois toda transferência ocorre em uma superfície). O esquema (1) procura ilustrar a operação de bandejas, ou lagoas de oxidação para o tratamento biológico de resíduos, nas quais a transferência de oxigênio ocorre por simples difusão no líquido em contato com o ar atmosférico. Já o esquema (2) sugere a transferência de oxigênio em reatores com células imobilizadas (aderidas) em um leito fixo, constituído por cavacos de madeirà, no caso de reatores para a produção de vinagre, ou cascalho, no caso de filtros aeróbios para o tratamento de águas residuárias. As demais ilustrações da Figura 14.1 referem-se à chamada aeração em profundidade, ou seja, aquelas nas quais se procura transferir oxigênio através do borbulhamento de ar. :: · 280 Agitação e aeração em biorreatores Os detalhes (3) e (4) sugerem a possibilidade de se transferir oxigênio apenas por borbulhamento de ar. O reator indicado com o número (3), também conhecido co'mo coluna de bolhas, utilizado ainda para a produção de fermento, consiste simplesmente numa serpentina localizada no fundo do reator, através da qual devem surgir bolhas de pequeno diâmetro que sobem toda a altura do reator, provocando agitação e transferindo oxigênio. Uma alternativa a esse sistema de serpentinas pode ser a colocação de calotas de aço sinterizado, para dentro das quais se faz fluir o ar, o qual passa para o líquido na forma de pequenas bolhas (sistema "air-blown"), em virtude dos poros diminutos do elemento s~nterizado. Já o esquema (4) ilustra a forma mais convencional dos reatores conhecidos como "air-lift" (existem muitas variantes deste tipo de reator), nos quais o ar é introduzido em uma chaminé no interior do reator, através de um metal ou material cerâmico sinterizado de pequenos poros, o que provoca uma intensa agitação no líquido, dependendo da vazão de ar empregada. Esses reatores são bastante interessantes para o cultivo de células que apresentem grande sensibilidade ao cisalhamento, como é o caso do cultivo. de células animais. ' Gases Gases Entrada meio Ar .. z.· ;·-:-:·, 11 lif)! .~eft (1) Entrada ar (2) (5) I_;\,JJ Ar · Gases Gases o8<6~oogocPog 0 o o oOoooocS'oo ,oo~;r~ ·, eooo o 8oo o goJ> '?ij,Ooo ~o~ 'li o 8 0 oo0 ó'oO (3) o O 'l>o O o o o ~OO~O ~ 0 ogg~'b'õogcl'"ooJ o o o~}>0o 0 oooeo 8 8 o%0o0 'õ8o"g oó o O : ~ oo ~-~ ~~ o o (4) (6) oOQ 0 8.:o0 o.0 o Ar : C©) Ar Ar Figura 14.1 - Sistemas diversos para a transferência de oxigênio em biorreatores. (I) bandeja ou lagoa; (2) reator de leito fixo; (3) coluna de bolhas; (4) "air-lift"; (5) tanque agitado e aerado; (6) "draught-tube". Concentração de oxigênio dissolvido em soluções saturadas I 281 Esses reatores apenas aerados têm merecido muita atenção, 1' 2 não apenas pelo menor cisalhamento, mas também por evitarem o emprego de sistemas de agitação, o que simplifica a construção do biorreator, além de também permitirem uma eventual economia de energia. Por outro lado, esses reatores normalmente exigem vazões de aeração mais elevadas, a fim de manterem um bom nível de agitação e transferência de oxigênio, o que significa um maior dispêndio de energia na compressão do ar. Apenas para se ter uma idéia, eles são operados com vazões específicas próximas a 1 min-1 (ou, como comumente mencionado, l v.v.m.- volu~e de ar por volume de meio por minuto), enquanto que os aerados e--agílãdos ficam mais próximos de 0,5 min- 1 • Outro detalhe importante é que os reatores apenas aerados costumam ser projetados com uma alh.tra bem superior ao diâmetro do tanque, contrariamente aos agitados e aerados, a fim de permitirem um maior tempo de residência do ar em contato com o líquido. Finalmente, os esquemas indicados com. ~s números (5) e (6), na Figura 14.1, referem-se justamente aos reatores agitados e aerados. O detalhe (5) ilustra o tradicional tanque agitado, que continua sendo o tipo de reator mais freqüente na indústria, responsável por cerca de 93% das aplicações. 2 O reator tipo tanque agitado e aerado, entendido como padrão, apresenta altura do líquido igual ao diâmetro do tanque, sendo agitado por um impelidor tipo turbina com 6 pás planas ("flat-blade turbine"), apresentando um diâmetro igual a l/3 do diâmetro do tanque. A fim de evitar a formação de vórtice, usa-se um sistema de 4 chicanas, diametralmente opostas, apresentando cada uma largura de l/10 ou l/12 do diâmetro do tanque. Conforme já salientado no Capítulo 8, apesar de existir a descrição desse tanque padrão, na verdade raramente verifica-se uma perfeita obediência a essas relações geométricas, observando-se, freqüentemente, tanques com altura maior do que o diâmetro, assim como turbinas de dimensões superiores à indicada, além do emprego de múltiplas turbinas. Justifica-se tal procedimento pela necessidade de se obter maior homogeneização do conteúdo do reator, assim como transferência de oxigênio mais efetiva. Esse fato dificulta um correto dimensionamento da transferência de oxigênio, por ausência de dados em geometrias distintas, conforme se verá mais adiante. O esquema indicado com o número (6), propõe a colocação do impelidor no interior de um duto, objetivando a formação de vórtice no interior desta chaminé e, com isto, ampliar a efetividade na transferência de oxigênio. O sistema "draught-tube" de fato encontra alguma aplicação industrial, mas é entendido como o sistema que causa maior cisalhamento nas células, em relação ao tanque agitado e aerado convencional. 14.3 - Concentração de oxigênio dissolvido em soluções saturadas Conforme apontado anteriormente, o oxigênio é muito pouco solúvel em água, o que acaba causando a necessidade de se fornecer este elemento ao longo de todo o processo fermentativo. 282 Agitação e aeração em biorreatores Na Tabela 14.1 encontram-se alguns dados a respeito da solubilidade do oxigênio, na condição de saturação, para diferentes temperaturas, pressão parcial de oxigênio na fase gasosa e presença de sais dissolvidos. 3 A observação dos valores contidos na Tabela 14.1 evidencia a baixa solubilidade do oxigênio, pois a concentração de saturação em água é de apenas 7 mg/L a 35°C, quando em equilíbrio com o ar atmosférico, o qual apresenta uma fração molar ou volumétrica de 20,9% de oxigênio, ou seja, a uma pressão total de 1 atm apresenta uma pressão parcial de oxigênio de 0,209 atm. 3 Tabela 14.1 - Valores da concentração de oxigênio dissolvido na saturação, em diferentes condições. Temp (OC) ". Cone, NaCl (M) P. Pare. 0 2 (atm) Cone. 0 2 na . sat. (mg / L) Cte. Henry (mg/L. atm) 25 - 0,209 8,10 38,8 35 - 0,209 6,99 33,4 25 - 1,0 40,3 25 0,5 1,0 34,2 25 1,0 1,0 28,5 25 2,0 1,0 22,7 t·~ i··· r·e -· -- .. "• ' .. ; ~ J-·:;., · :h-· . . ,.. ~ - ·-· ~ "Í', ~I ~ .:•' }"\. . . . .-.,, ~ -~ Observa-se que a concentração de oxigênio dissolvido diminui com o aumento da temperatura, assim como diminui com o aumento da concentração de um sal dissolvido. Por outro lado, a concentração de 0 2 aumenta com o aumento da pressão parcial de oxigênio na fase gasosa, como seria o caso de saklrar água com oxigênio puro (pressão parcial de 0 2 de 1 atm), atingindo-se 40,3 mg/L no equilíbrio a 25°C. Os números apontados na Tabela 14.1 permitem refletir sobre alguns pontos importantes, considerando a necessidade de se ter valores da concentração na saturação mais elevados. Em primeiro lugar, o abaixamento da temperatura não seria solução mais adequada, pois na . maioria dos processos fermentativcis de importância trabalha-se na faixa mesofílica de temperaturas, ou seja, da ordem de 35°C. · A operação com pressões parciais de oxigênio no gás mais elevadas, é de fato uma alternativa interessante, sendo mesmo praticada através do enriquecimento do ar atmosférico com oxigênio. No entanto, essa operação deve ser efetuada com muito cuidado, pois grande parte dos microrganismos aeróbios apresenta tendência à inibição por elevadas concentrações de oxigênio dissolvido, inibição esta observada para valores não muito distintos da concentração de saturação com o .ar atmosférico. Há até mesmo indícios de inibição, para algumas espécies, para valores da ordem de 7 a 8 mg/L, ou mesmo inferiores. 4 Concentração de oxigênio dissolvido em soluções saturadas 283 O fato de se observar uma redução da concentração de oxigênio dissolvido, quando se dissolvem outras espécies químicas em um líquido, permite lembrar que sempre se fermenta soluções de nutrientes, o que significa a presença de muitas substâncias dissolvidas, as quais, no cômputo final, reduzem a concentração de saturação do oxigênio em relação ao valor observado para a água. Esse problema é ainda agravado, lembrando-se que o microrganismo consome esses nutrientes, ad longo do tempo, lançando no meio produtos de metabolismo. Isso significa que a composição química do meio de cultura é alterada a cada instante do processo, o que causa alteração na concentração do oxigênio dissolvido na saturação. Por esse motivo existem na literatura 5 propostas para o cálculo da concentração de saturação, a partir do conhecimento da composição química do meio a cada instante, o que, além de conduzir a cálculos relativamente tediosos, ainda exige determinações analíticas detalhadas, não muito freqüentes em processos fermentativos. Existe também proposta para essa determinação experimentaV que apresenta particular utilidade para o conhecimento da concentração de saturação pelo menos no instante inicial. Em se tratando de uma solução bastante diluída, para este caso é aplicável a lei de Henry, segundo a qual a concentração de oxigênio dissolvido no equilíbrio (saturação) é proporcional à pressão parcial de oxigênio no gás, ou seja: Cs =H ·pg (14.1) onde: Cs =concentração de oxigênio na saturação (g0 2 /m 3 ) H= constante de Henry (g0 2 /m3 • atm) pg =pressão parcial de 0 2 na fase gasosa (atm) = x02 .P x02 = fração molar ou volumétrica do 0 2 no gás P =pressão total do gás (atm) Dessa forma, ao variar a composição químiCa de um dado líquido, o que varia é a constante de Henry e, portanto, a concentração de saturação para um dado valor da pressão parcial do oxigênio no gás. Na Tabela 14.1 encontram-se alguns dados para essa constante de Henry. É necessário lembrar que a concentração de oxigênio dissolvido, durante um processo fermentativo, é normalmente monitorada através de eletrodos (polarográficos ou galvânicos - para maiores detalhes sobre eletrodos, sugere-se a leitura da revisão escrita por LEE;TSA0). 7 Esses eletrodos são calibrados no instante inicial, antes de se efetuar a inoculação do reator, saturando-se o líquido com oxigênio através de agitação e aeração, fixando-se na escala do aparelho o valor 100%. Caso não se conheça a constante de Henry para o líquido em estudo, também não se conhece o valor absoluto da concentração de saturação, sendo que durante o processo fermentativo o eletrodo indicará valores intermediários entre zero e 100%, o que significa, para um dado instante, a concentração de oxigênio dissolvido em relação à saturação. · 284 Agitação e aeração em biorreatores Como esses eletrodos respondem à pressão parcial do oxigênio, para efetuar medidas confiáveis, deve-se manter constante a pressão no interior do reator pois, caso ela varie, o eletrodo indicará variações que não são devidas ao fenômeno biológico que está ocorrendo. Igualmente, deve-se lembrar que o eletrodo não indicará variações em virtude de alterações na composição do meio, sendo, portanto, um dado valor indicado sempre correspondente a uma porcentagem do valor inicial da saturação. Dessa maneira, é possível ocorrer a indicação de valores superiores a 100%, caso ocorra um aumento de pressão no reator, ou caso se introduza oxigênio na corrente gasosa. Tendo em vista as dificuldades apontadas, alguns autores preferem, quando há a necessidade do conhecimento do valor absoluto da concentração de oxigênio dissolvido, supor que se trata de água, utilizando então valores existentes em manuais. Também existem alguns trabalhos nos quais se observam concentrações de oxigênio dissolvido expressas em pressão parcial de oxigênio (mmHg), lembrando-se que para o ar, a 1 atm de pressão total, tem-se 159 mmHg para a pressão parcial do oxigênio. 14.4 - Transferência de oxigênio e respiração microbiana O objetivo central de um sistema de agitação e aeração é o fornecimento de oxigênio para a manutenção de uma dada atividade respiratória de um certo conjunto de células. Assim, o que se visa é transferir o oxigênio da fase gasosa para o líquido, fazer com que este oxigênio dissolvido chegue às células suspensas, penetre nestas células e, finalmente, seja consumido na reação. É, portanto, possível imaginar que existam muitas resistências associadas a . esse transporte do oxigênio da fase gasosa até oseu consumo final. Na Figura 14.2 busca-se ilustrar algumas dessas possíveis resistências. • Peliculas . - - - - - - - estagnadas Reçao bioqulmica Meio de cultivo 4 :' ____ .,._ ..... Célula ' __ ..... '' ' ' Interface gás-liquido Figura 14.2 - Resistências associadas à dissolução e ao consumo do oxigênio. Transferência de oxigênio e respiração microbiana 285 Conforme sugere a Figura 14.2, essa questão pode ser dividida em três problemas distintos. O primeiro diz respeito à dissolução, ou transferência do oxigênio do gás para o líquido, o segundo à eventual difusão do oxigênio até a célula e, finalmente, o problema do consumo do oxigênio . No que se refere à resistência 4, ou seja, aquela associada à difusão do oxigênio até as células, espera-se que o líquido seja suficientemente agitado, a fim de que possa ocorrer o transporte convectivo e, desta forma, imagina-se que esta resistência possa ser desprezada. No caso de líquidos extremamente viscosos essa hipótese pode não se verificar. No caso da transferência do oxigênio do gás para o líquido, pode-se imaginar uma primeira resistência (resistência 1 - Figura 14.2) devido a uma película gasosa estagnada, através da qual o oxigênio deve difundir. A seguir, pode-se imaginar uma resistência na interface gás-líquido (resistência 2) e, finalmente, a resistência associada à película líquida estagnada ao redor da bolha de gás (resistência 3). Dados existentes na literatura permitem imaginar que a resistência do lado da fase gasosa pode ser desprezada, em virtude da intensa movimentação das moléculas de oxigênio. Da mesma forma, a resistência devido à interface é comumente considerada desprezível, a menos que se empregue substâncias que possam aderir a essa superfície e, desta forma, provocar um aumento nesta resistência, como é o caso de alguns antiespumantes. Conclui-se, portanto, que a resistência dominante refere-se àquela associada à película líquida, resistência esta que é funÇão da difusividade do oxigênio no líquido, assim como devido à espessura desta película. No lado do consumo do oxigênio, pode-se imaginar uma resistência devido à película líquida em torno da célula (resistência 5- Figura 14.2), outra devido à resistência imposta pela membrana celular (resistência 6), a resistência devido à difusão do oxigênio no citoplasma (7) e, finalmente, aquela associada à velocidade da reação de consumo final deste oxigênio (resistência 8). Tendo em vista as diminutas dimensões das células, assim como a enorme área exposta ao meio líquido, a resistência 5 pode ser desprezada. Da mesma forma, a resistência 6 pode ser desprezada, pois a membrana celular não deve opor resistência à difusão do oxigênio, sendo hoje entendido que o oxigênio penetra na célula por simples difusão, não havendo sistemas de transporte para este elemento,4.8 fato inclusive que justifica a possibilidade de inibição da atividade de células, quando expostas a elevadas concentrações de oxigênio no meio líquido, conforme apontado anteriormente. No que se refere à resistência 7, pode-se também considerá-la pouco significativa, tendo em vista novamente a elevada área exposta pela célula ao meio ambiente. No caso de células eucarióticas, poder-se-ia imaginar alguma dificuldade para o oxigênio atingir as membranas internas das mitocôndrias, onde estão localizados os sistemas enzimáticos e as proteínas responsáveis pela respiração. 8 No caso de bactérias, a localização desses sistemas é na !Tiembrana citoplasmática, motivo pelo qual não há realmente razão para considerar essa resistência. 286 Agitação e aeração em biorreatores Dessa forma, do lado do consumo, a resistência mais significativa ficaria por conta da velocidade da reação enzimática da respiração (resistência 8), ou seja, na dependência da atividade e concentração dos complexos enzimáticos e protéicos que efetuam esta reação, além de toda a atividade biológica da célula, o que incide na disponibilidade de elétrons a serem transportados pela cadeia respiratória, com a concomitante utilização do ATP gerado para a síntese de novas moléculas. No que tange à atividade e concentração dos complexos protéicos responsáveis pela respiração, não se tem condições simples de interferência, a não ser que se imaginasse alterações genéticas o que, apesar de extremamente atraente, ainda é, presentemente, tarefa relativamente complicada. Claro está que no caso de microrganismos que crescem em aglomerados, como é o caso de fungos filamentosos que crescem na forma de micélios, ainda se poderia considerar uma resistência adicional em termos da difusão do oxigênio para as células mais internas dos aglomerados. A partir dessa discussão, pode-se perceber que a tarefa de projetar adequadamente um sistema de transferência de oxigênio, reside em obter-se uma eficiente dissolução do oxigênio no meio líquido, deixando então para as células a situação de não limitação de oxigênio, para que elas possam consumir este substrato de forma plena, dentro das características biológicas próprias de cada espécie. 14.4. I - Transferência de oxigênio Dentre as várias teorias que permitem o equacionamento da transferência de oxigênio, a de maior utilidade para a presente questão é exatamente aquela que considera a existência de duas películas estagnadas. Na Figura 14.3 busca-se ilustrar, com maiores detalhes, a interface líquido-gás com as mencionadas películas. Conforme salientado no item anterior, ao se imaginar uma bolha. de ar suspensa em um meio líquido, pode-se também supor a existência de uma película gasosa estagnada, entre o seio gasoso (homogêneo com pressão parcial de 0 2 constante) e a interface gás-líquido, película na qual se localizaria a resistência ao transporte do oxigênio, caracterizada pelo inverso do coeficiente de transferência · da película gasosa (kg), coeficiente este definido pela relação entre a difusividade do oxigênio e a espessura da película estagnada. A transferência ocorreria apenas por efeito difusional e, portanto, depende da existência de um gradiente entre a pressão parcial de 0 2 no interior homogêneo da bolha (pg) e a pressão parcial de 0 2 na interface (p;). Igualmente pode-se supor, na fase líquida, a existência de uma película estagnada ao redor da bolha, na qual se localizaria a resistência ao transporte do oxigênio, caracterizada pelo inverso do coeficiente de transporte na película líquida (kL) . Aqui também o fluxo de oxigênio depende, além do coeficiente de transferência, da existência de um gradiente entre a concentração de 0 2 na interface (CJ e a concentração de 0 2 no seio líquido (C). 287 Transferência de oxigênio e respiração microbiana Gás Pelfcula lfquida Lfquido Figura 14.3 - Interface gás-líquido com as películas estagnadas. Admitindo que o sistema esteja em estado estacionário, em termos da transferência de oxigênio, assim como a existência de um perfil linear da concentração de oxigênio no interior das películas, pode-se escrever: n gradiente resistência =-=---02 onde: n 0 = fluxo de oxigênio por unidade de área interfacial 2 (g0 2 /m2 • h) resistência = inverso do coeficiente de transferência ou seja: (14.2) onde: kg =coeficiente de transferência de massa da película gasosa (m/h) kL = coefi~iente de transferência de massa da película líquida (m/h) pg =pressão parcial de 0 2 no seio gasoso (atm) Pi =pressão parcial de 0 2 na interface (atm) p1 = pressão parcial de 0 2 em um gás que estaria em equilíbrio com a concentração de oxigênio C no líquido, segundo a lei de Henry (atm) H= constante de Henry (g0 2 /m3 • atm) Cs =concentração de 0 2 dissolvido no líquido em equilíbrio com pg, segundo a lei de Henry (g0 2 /m3) Ci =concentração de 0 2 dissolvido em equilíbrio com pi (g0 2 /m 3 ) C= concentração de oxigênio no seio líquido (g0 2 /m3) Como se observa na Eq. 14.2, introduziram-se como gradientes as diferenças entre as pressões parciais de 0 2, ou estas traduzidas em concentrações através da lei de Henry. 288 Agitação e aeração .em biorreatores Na verdade, não há condições de se conhecer os valores relativos à interface gás-líquido, podendo-se determinar os valores das concentrações no seio do gás e do líquido. Assim, prefere-se trabalhar com um coeficiente global de transferência de oxigênio (o qual corresponderia à soma das resistências das duas películas). Ou, ainda, lembrando que a resistência devido ao filme gasoso pode ser desprezada, tendo em vista a resistência do filme líquido, pode-se considerar pg =pie, como decorrência, ci = c•. Assim, a Eq. 14.2 pode ser escríta: (14.3) Tendo em vista que esse fluxo de oxigênio está definido por unidade de área interfacial de troca de massa, área essa de difícil quantificação quando se tem um enorme número de bolhas suspensas em um líquido, pode-se definir: área interfacial de transferência de massa (m 2) a=--------------------------------~--~ volume total de líquido (m3 ) Assim, pode-se escrever: (14.4) onde: n 02a =velocidade de transferência de oxigênio (g0 2 lm3 · h) kLa =coeficiente volumétrico de transferência de 0 2 (h-1) finalmente, caso não se esteja em estado estacionário em termos de fluxo de 0 2, mas esteja ocorrendo uma variação da concentração de 0 2 dissolvido (C) no tempo (t), pode-se escrever que n 02 a =dC I dt(gü 2 I m 3 ·h), ou seja: • dC -=kta(C -C) dt s (14.5) Essa equação, apesar de ser extremamente simples, permite uma exata compreensão de todas as formas de que se dispõe para o controle da concentração de oxigênio dissolvido em um certo meio. De fato, caso se enriqueça em 0 2 o gás de entrada de um: reator (aumento de pg), ou se aumente a pressão de cabeça do fermentador (aumento de P), incrementa-se o gradiente (C5 - C), para um dado valor de C em um certo instante, pois se estaria aumentando o valor de C5 • Igualmente, aumentando-se a freqüência de agitação, se estaria rompendo e dispersando mais as bolhas de ar (aumento de a) e reduzindo a espessura do filme líquido (aumento de kL) . Por outro lado, o aumento da vazão de aeração, significa tim maior acúmulo de bolhas de ar no seio líquido (aumento de a), ao mesmo tempo em que se promove um maior arraste do co2 produzido (aumento de pg). Transferência de oxigênio e respiração microbiana 289 As Eqs. 14.4 e 14.5 permitem ainda entender que a máxima capacidade de transferência de oxigênio de um dado sistema de agitação e aeração é dada pelo produto kLaC., ou seja para a situação de concentração de 0 2 nula no meio. Tal situação não tem interesse, no que se refere ao cultivo de um dado microrganismo aeróbio, mas é interessante para a caracterização de um dado sistema de transferência. Na realidade, ao se desenvolver uma dada equação que pretende descrever um certo fenômeno, sempre ocorre a necessidade da introdução de certos parâmetros, os quais necessitam ser determinados experimentalmente, a fim de que a equação desenvolvida possa ter utilidade prática. Igualmente, a caracterização de um dado sistema de transferência de oxigênio, conforme descrito pela Eq. 14.5, significa determinar os valores do parâmetro kLa, o que é possível através de diversas metodologias. A mais antiga dentre elas é o chamado método do sulfito, que consiste em transferir oxigênio para uma solução de sulfito de sódio na presença de um sal de cobre como catalisador. Essa metodologia está muito bem descrita no trabalho publicado por COOPER et aC Coloca-se no reator uma solução de sulfito de sódio, adiciona-se sulfato de cobre e estabelece-se a aeração desejada. Em um dado instante colhe-se uma amostra e determina-se a concentração de sulfito por iodometria (adiciona-se à amostra uma solução de iodo, que oxida o sulfito a sulfato, e titula-se o iodo em excesso por uma solução de tiossulfato). Após um certo intervalo de tempo em que se mantêm constantes as condições de aeração, colhe-se uma nova amostra e determina-se novamente a concentração de sulfito remanescente. Através da estequiometria da reação de oxidação do sulfito a sulfato pelo oxigênio, imaginando-se que todo o oxigênio dissolvido reage instantaneamente, pode-se conhecer a velocidade de dissolução do oxigênio, ou seja: Dessa forma, conhecendo-se a massa total de oxigênio que foi transferido para o volume total de reação, durante o intervalo de tempo entre as duas amostras, têm-se todos os dados para o cálculo da grandeza n 0 , a da Eq. 14.4. Como, em princípio, a concentração do oxigênio dissolvido, na solução relativamente concentrada de sulfito, pode ser desprezada, pode-se escrever: n 0 , a=k 1 a·H·pg =KvPg (14.6) 3 onde: Kv= coeficiente de absorção (g0 2 /m ·h· atm) Assim, prefere-se efetuar o cálculo desse coeficiente de absorção, o qual engloba a constante de Henry para a solução submetida à aeração, ou seja, evita-se a necessidade de conhecer a concentração de oxigênio na saturação. Caso a concentração de oxigênio dissolvido não seja nula, logicamente na Eq. 14.6 n 02a deve ser dividido por (pg- p1), sendo p1 determinado a partir do sinal de um eletrodo. · 290 ·Agitação e aeração em biorreatores Uma dúvida adicional seria quanto ao valor de Pg a ser utilizado para o cálculo de Ky . Realmente, o gás que entra no reator é diferente do gás que sai do sis. tema, pois oxigênio foi transferido ao líquido. Uma forma seria considerar o reator como homogêneo e determinar a fração volumétrica de oxigênio no gás efluente, o qual seria representativo do gás que está trocando massa com o meio. Essa hipótese de homogeneidade é difícil de ser aceita, especialmente para reatores de grande porte, sendo mais conveniente calcular a média logarítmica entre as pressões parciais de oxigênio na entrada e saída do reator, ou seja: lO (14.7) onde: =pressão parcial de 0 2 no gás de entrada (atm) =pressão parcial de 0 2 no gás de saída (atm) Novamente a Eq. 14.7 foi escrita supondo o caso mais comum de se ter p1 =O Pge Pgs atm. Na Eq. 14.7 tem-se: Pge = (14.8) Xoze(p + HL ) 10,3 onde: x02• = fração molar ou volumétrica de 0 2 no gás que entra no reator (0,209 para o ar) P =pressão interna no reator (pressão atmosférica+ sobrepressão na cabeça) (atm) HL = altura da coluna líquida (m) Pgs = Xoze (1- E)P • (14.9) Na Eq. 14.9 E representa a eficiência da transferência de oxigênio, ou seja: E= oxigênio transferido oxigênio total introduzido (14.10) onde: V= volume de reação (m3 ) Q = vazão de aeração (CNTP) (m3 /h) Nesse método do sulfito é necessário lembrar que se está agitando e aerando uma solução de sulfito de sódio, a qual tem características distintas de um meio de cultura que se pretende fermentar. Possivelmente a diferença mais importante é que se emprega solução salina relativamente concentrada, o que significa um meio não coalescente. Ou seja, as bolhas de ar, em seu trajeto entre o fundo e o topo da coluna líquida, não se juntam, o que significa a possibilidade de manter uma elevada área de transferência de massa (a), o que pode não ocorrer em um meio de cultura. Com isto, de uma forma geral, obtêm-se valores da velocidade de transferência maiores do que os observados durante um processo fermentativo (este ponto será novamente abordado mais adiante). Transferência de oxigênio e respiração microbiana 291 Além disso, deve-se salientar que o método do sulfito permite a determinação da máxima capacidade de transferência de oxigênio, pois se imagina nula a concentração de oxigênio na solução. Esse fato tem muita importância quando se empregam dados de transferência obtidos pelo método do sulfito, no projeto de sistemas de agitação e aeração, para os quais se terá C t: O.. Mais recentemente, têm surgido algumas alternativas ao método do sulfito tradicional. Urna delas consiste em se dispor, no reator, de um eletrodo para a determinação da concentração de oxigênio dissolvido. Coloca-se no reator a solução do catalisador, praticando-se a aeração e a agitação a ser estudada, o que permite calibrar o eletrodo na posição 100%. Ao se adicionar a solução de sulfito de sódio, mantendo-se a agitação e a aeração, ocorre um rápido decréscimo no sinal da sonda, até um valor próximo a zero. O sinal da sonda permanecerá baixo enquanto existir sulfito não oxidado no reator. No instante em que a sonda indicar um rápido sinal ascendente, isto será devido ao término do sulfito de sódio. Dessa forma, conhecendo-se a massa de sulfito adicionada e o tempo para a sua completa oxidação, tem-se o dado necessário para o cálculo de Kv, havendo a vantagem de não se necessitar colher amostras e realizar as titulações com iodo. Outro avanço recente do método do sulfito foi o proposto por IMAI et al. 11 Esses autores imaginaram efetuar o método do sulfito em processo contínuo, ou seja, alimentam o reator, submetido a aeração e agitação, com urna solução de sulfito de sódio e catalisador em urna dada vazão, de forma a manter constante urna certa concentração de oxigênio dissolvido indicada por um eletrodo. O balanço material, no estado estacionário, para o sulfito de sódio, conhecendo-se as concentrações de sulfito na entrada e na saída do reator considerado h9rnogêneo, permite o cálculo de kLa ou de Kv. Sem dúvida essa proposta de processo contínuo significa um av anço significativo para ~mé todo do sulfito, pois permite o emprego de baixas concentrações do reagente, o que incide em economia para o processo, quando imaginado para grandes reatores, além de se obter v alores mais compatíveis com os sistemas reais, nos quais ocorre coalescência de bolhas, conforme mencionado anteriormente ~ Outra estratégia existente para a determinação experimental de kLa é a que utiliza apenas o sinal de resposta de um eletrodo imerso no líquido submetido à aeração. O ensaio típico para a determinação de kta, pelo emprego de um eletrodo específico para a medida da concentração de 0 2 em um meio líquido (método dinâmico), consiste em inicialmente borbulhar nitrogênio no líquido, a fim de eliminar todo o Oi dissolvido, até que a sonda indique o valor zero. A seguir, em um dado instante, inicia-se a aeração e a agitação do meio líquido, nas condições em que se pretende obter o v alor dekLa, passando-se então a registrar o sinal da sonda . Esse sinal sairá do valor zero, aumentando até atingir a saturação, ou seja, até que o eletrodo indique o valor 100% (sonda previamente calibrada no líquido saturado em 0 2 ) . - --- -~ -- , ---- ------ - ----------- -- ~----~-----......-- ---- - ------ --- - - - - - -- - - - - - --- --- 2 92 ·Agitação e aeração em biorreatores Nessas condições a Eq. 14.5 pode ser integrada, conhecendo-se a condição inicial (t =O; C = 0), pois é possível separar as variáveis: dC = kLa ·dt, ou integrada (Cs -C) (14.11) ou ainda: _S_ =(1 - cs e - kla·t) (14.12) Observa-se pela Eq. 14.11 que ao se plotar ln(1- C/C 5 ) em função do tempo (t), a partir dos dados experimentais obtidos pelo ensaio descrito, deve-se obter uma reta cujo coeficiente angular fornece o valor de kLa. Observa-se também que não há a necessidade do conhecimento da concentração de saturação (C 5 ) , mas das frações (C/C5 ), ou seja, o sinal da sonda previamente calibrada no intervalo de zero a 100%, o que simplifica o cálculo da grandeza desejada. Na verdade, o valor de kLa estaria correto, caso a sonda apresentasse um perfeito acompanhamento do aumento da concentração de 0 2 no líquido, o que pode não ocorrer em virtude do atraso no sinal. Esse atraso é devido à necessidade de o 0 2 dissolvido no seio líquidoter de se difundir através da membrana do eletrodo, que isola o meio líquido da superfície do catodo (onde o oxigênio é reduzido gerando o fluxo de elétrons), além de se poder considerar, ainda, um filme líquido estagnado, dependendo da condição de agitação empregada (e, portanto, da velocidade de passagem de líquido pela superfície do eletrodo), através do qual o 0 2 deve se difundir. Justamente com o objetivo de corrigir esse atraso da sonda, AIBA•et al. 10 propuseram que o sinal da sonda (Cp), varie no tempo proporcionalmente à diferença entre a concentração real de0 2 (C) e o sinal (Cp), ou seja: dCP ili =kp (C -CP) (14.13) onde: CP= sinal do eletrodo (CP= O para t =o e CP= C5 para t = oo) kP =constante de atraso do eletrodo (h-1) Introduzindo-se na Eq. 14.13 o valor de C em função do tempo, obtido a partir da Eq. 14.12 e, agora, integrando-se a equação resultante, obtém-se: (14.14) Observa~se, na Eq. 14.14, que para valores de kP muito maiores do que kLa, esta equação retoma à Eq. 14.12, ou seja, não haveria a necessidade de corrigir o sinal do eletrodo Transferência de oxigênio e respiração microbiana 293 De qualquer forma, é possível ajustar a Eq.14.14 aos dados experimentais (CP= f(t)), obtendo-se o valor correto de kLa, desde que se conheça o valor de kp. Essa constante de atraso do eletrodo pode ser determinada através de um ensaio em degrau, ou seja, equilibrando-se a sonda em um líquido submetido a borbulhamento com nitrogênio (sonda indicando o valor zero) e, a seguir, retirando-se a sonda deste líqÚ.ido e introduzindo-a imediatamente em um líquido saturado em 0 2 (caso se pretenda determinar apenas o atraso da sonda sem a interferência do filme líquido, este deve estar intensamente agitado, ou, ainda, pode-se equilibrar a sonda em atmosfera de nitrogênio gasoso e, a seguir, expô-la ao ar atmosférico). Nessas condições tem-se desde o instante t =O do degrau que C= c. e, portanto, na Eq. 14.13 fica-se com: a qual integrada fornece: (14.15) A Eq. 14.15 mostra que plotando-se os valores de ln(1 - Cp/C.), em função do tempo, obtidos no ensaio em degrau, deve-se obter uma reta; cujo coeficiente angular permite a obtenção do valor de kP. É bastante freqüente contar-se, como informação do fabricante do eletrodo, que uma sonda razoavelmente rápida permite a obtenção de 90% da resposta em 20 segundos, no teste em degrau. Ora, essa informação pode ser entendida como atribuir-se, na Eq. 14.15, o valor (C~ / C.)= 0,9 para t = 20 s (lembrando-se que a reta passa pela origem, pois (Cp/C.)= O para t = 0), o que permite a tradução da informação para o valor de kP = 0,12 s- 1, ou kP = 414,6 h-1 • Apenas como ilustração, é possível simular as Eqs. 14.12 e 14.14, a fim de se observar a variação da concentração real de 0 2 dissolvido (C) e da concentração prevista pela sonda (Cp), em função do tempo, para determinados valores de kLa e kP. Tais simulações estão indicadas na Figura 14.4, na qual se pode ter uma clara idéia a respeito da importância de se efetuar esta correção. Assim sendo, é possível, a partir das equações anteriores, gerar curvas semelhantes às da Figura 14.4 para distintos valores de kLa. Tal procedimento permite concluir que, ·com uma sonda que apresente um kP da ordem de 400 h- 1, pode-se estimar, com uma razoável precisão, sem a necessidade de efetuar correções, valores de kLa inferiores a 200 h- 1 . Acima desses valores de kLa, os erros tornam-se muito elevados, exigindo que se efetue a correção proposta pela Eq. 14.14. 294 Agitação e aeração em biorreatores C/Cs; Cp/Cs 1,2.-~~------------------------------------· 1,O kLa= 400 1/h kp= 414,6 1/h Cp/Cs 20 10 30 40 Tempo (s) Figura 14.4 -Variação no tempo da concentração real de 0 2 dissolvido (C/C,) e sinal do eletrodo (CpiCJ durante a execução do método dinâmico. 14.4.2 - Respiração microbiana No item anterior buscou-se abordar as bases teóricas que permitem o estudo da transferência do oxigênio do ar para o meio líquido, havendo agora a necessidade de abordar o problema do consumo do oxigênio dissolvido, ou seja, da respiração microbiana. Inicialmente é necessário definir o que se entende por velocidade específica de respiração(Q 02 ), como sendo: (14.16) • onde: Q02 = velocidade específica de respiração (g0 2 / gcel · h) X= concentração celular (gcel/m 3 ) (d02 /dt)=velocidade de consumo de 0 2 {g02 /m3 ·h) Na verdade, esta grandeza Q02 introduz, na presente discussão, a característica biológica do sistema em estudo, pois ela depende do microrganismo empregado, assim como da composição do meio e das condições de fermentação (pH, temperatura, etc.). O valor de Q02 , para um dado microrganismo, é função da concentração de oxigênio dissolvido no meio líquido (C), seguindo uma equação tipo Monod, ou seja: Q02 .= Q02max K c o+ C (14.17) 29 5 Transferência de oxigênio e respiração microbiana onde: Q02 máx = máximo valor de Q02 (g0 2 / gcel.h) 3 K 0 =constante de saturação para o 0 2 (g0 2 /m ) A Figura 14.5 ilustra a variação de Q02 com a concentração de oxigênio dissolvido no meio, segundo o proposto pela Eq. 14.17. C(mgOt'L) Figura 14.5 - Representação esquemática da variação de Q02 com C, segundo a equação de Monod. Nessa figura observa-se que acima de uma dada concentração de 0 2 dissolvido, definida como concentração crítica (Ccri 1), o valor de Q02 é constante e máximo. Isso significa que o dimensionamento de um sistema de agitação e aeração, caso tenha como objetivo, permitir a máxima velocidade específica de respiração (situação muito freqüente), deve buscar a manutenção da concentração de 0 2 dissolvido acima da concentração crítica, a fim de que o 0 2 não seja limitante. Alguns valores de Ccrit existem na literatura, como os exemplificados na Tabela. 14.2. 3 Tabela 14.2 - Valores da concentração crítica de 0 2 dissolvido para alguns microrganismoP>. Temperatura (°C) Ccrit (mg/L) ; Escherichia c.oli 37,8 0,26 Serratia marcescens -, ,,·, 31,0 0,48 Levedura 34,8 0,15 24,0 0,70 30,0 0,29 Microrganismo P. chrysogenum Aspergillus oryzae ~'$C.P; •,,, 30,0 ,- ' • .RI ~...... 0,64 < ,,;::._...... --~~.. · ~L c~.:·· j,~ .,1 I·.,~ 1.~ ~· 296 . Agitação e aeração em biorreatores Como se pode observar, os valores de Ccrit situam-se entre 0,3 e 0,7 ppm, ou seja, valores abaixo de 10% da concentração de saturação (da ordem de 7 ppm, a 35°C e 1 atm, empregando-se ar atmosférico- Tabela 14.1). São valores portanto extremamente baixos, o que indica igualmente valores muito baixos para a constante de saturação (K0 ). Caso a produção de um dado produto seja máxima para condições de limitação de oxigênio dissolvido (entre zero e 10% da saturação), isto significa uma certa dificuldade no controle da concentração de 0 2 dissolvido dentro destes limites bastante restritos. Normalmente esse tipo de condição é obtido naturalmente, através da imposição de uma transferência de 0 2 sabidamente insuficiente para a manutenção de Q02max · É necessário mencionar que esses valores de ccrit são característicos de células que crescem isoladamente. No caso de microrganismos que crescem na forma de grumos, ou "pellets", como é o caso de fungos filamentosos, essa concentração crítica pode atingir valores da ordem de 30 a 50% da concentração de saturação. Obviamente, para esses casos, a situação é também mais complicada, pois para se poder manter altas velocidades específicas de respiração, são necessárias altas concentrações de 0 2 dissolvido, a fim de que o 0 2 possa ser transportado para o interior dos flocos ou grumos. Conforme comentado anteriormente, não é apenas a concentração de 0 2 dissolvido que interfere em Q02, mas também as demais condições de cultivo. Portanto, mesmo intuitivamente, pode-se entender que células que estejam crescendo em altas velocidades têm de apresentar elevadas velocidades de consumo da fonte de carbono, assim como elevadas velocidades de respiração, conforme indicado anteriormente. Essa reflexão permite concluir que deve existir uma relação entre a velocidade específica de respiração (Q 02 ) e a velocidade específica de crescimento (J.t). Normalmente admite-se a existência de uma relação linear, conforme svgerido por PIRT( 12>, ou seja: (14.18) onde: m0 = coeficiente de manutenção para o 0 2 (g0 2 / gcel · h) Y 0 =fator de conversão de 0 2 para células (gcel/ g02 ) 1 Jl = (1/X)(dX/dt) =velocidade específica de crescimento (h- ) X= concentração celular (gcel/L) Esse coeficiente de manutenção (m 0 ) significa a velocidade específica derespiração para Jl = O, ou seja, a velocidade específica de consumo de 0 2 para manter as células viáveis. Um exemplo cie aplicação da Eq.14 .18 foi propiciado por FACHINI, 13 durante cultivos descontínuos de Aspérgillus awamori NRRL 3112 em distintas Transferência de oxigênio e respiração microbiana 297 condições de transferência de oxigênio. Esse autor obteve um valor médio para m0 da ordem de 2 mmol0 2 / gcel · h e 1,55 gcel/ g02 como representativo de Y 0 . No entanto, deve-se salientar que os valores de m0 variaram de 1,5 a 4,1 mmol0 2 / gcel · h para os diferentes cultivos, enquanto que os valores de Y 0 apresentaram uma maior constância, sugerindo que os valores maiores de m0 foram observados para as condições de transferência de oxigênio mais intensas. 14.4.3 - Análise co'njunta da transferência e consumo do oxigênio Durante o cultivo de um dado microrganismo, efetua-se a transferência de oxigênio da fase gasosa para a fase líquida, enquanto que, simultaneamente, o microrganismo consome o 0 2 dissolvido. Assim sendo, o equacionamento mais adequado surge através de um balanço de oxigênio no meio líquido, ou seja: (14.19) A Eq. 14.19 indica que a variação da concentração de oxigênio dissolvido no líquido (dC/ dt) é o resultado da diferença entre a quantidade de 0 2 que se consegue dissolver (kLa (C.- C)) e o oxigênio consumido pelas células (Q 02 X). No caso de um processo fermentativo contínuo, dever-se-ia ainda considerar o 0 2 que entra no reator com o meio de alimentação (DC., onde D = vazão específica de alimentação) e o 0 2 que sai do reator com o líquido fermentado (DC). No entanto, estas parcelas adicionais são freqüentemente desprezadas, pois são muito pequenas em relação às demais. É necessário lembrar que a cinética de um dado cultivo está amplamente contemplada na Eq.14.19, pois X irá variar com o tempo e Q02 varia com fl (Eq. 14.18). Dessa forma, considerando um processo fermentativo descontínuo, é fácil compreender que, no instante inicial, tem-se uma baixa concentração celular (X0 ) e, como o cultivo -poderá contar com uma fase lag (f.l=Ü), ter-se-á também o mínimo valor para Q 02 (= m0 ), o que significa a necessid~de de baixàs transferências de 0 2 a fim de satisfazer a esta pequena demanda (m 0 X0 ) . No entanto, com o decorrer do tempo X irá aumentar, ocorrendo o mesmo com o valor de Q02 , o qual atingirá o seu máximo valor na fase exponencial (f.l = f.lmáx). A seguir, Q02 deverá diminuir com o valor de fl, mas ainda se observará um aumento em X, devendo, portanto, ainda ocorrer um aumento na demanda Q02 X, a qual deverá atingir o máximo valor para instantes posteriores à fase exponencial, passando então a decrescer. Claro está que o sistema de transferência de 0 2 deverá ser dimensionado de forma a atender à máxima demanda, caso se pretenda manter o cultivo em condi. ções não limitantes em termos de oxigênio dissolvido. Dentro dessa idéia, a Figura 14.6 procura ilustrar duas possibilidades de operação, devendo-se informar que esta figura foi elaborada a partir de dados experimentais13 obtidos durante o cultivo de Aspergillus awamori, durante o qual não se observou fase exponencial, sendo os valores de Q02 calculados a partir da Eq. 14.18. Ainda, saliente-se que as escalas foram tornadas relativas, pois os valores absolutos não são necessários dentro da presente discussão. 298 . Agitação e aeração em biorreatores O primeiro estilo de operação seria imaginar a existência de um eletrodo para a medida da concentração de 0 2 dissolvido, sendo o seu sinal empregado para uma ação de controle, a fim de manter constante esta concentração (variando a freqüência de agitação e a vazão de aeração). Nessa situação, na Eq. 14.19 como C é constante dC/ dt é nulo, podendo-se escrever: (14.20) onde: Cc =valor constante estipulado para C (exemplos Cc = 0,2 14.6, ou CC= ccrit) (g02/m3 ) c. conforme Fig. ou ainda: (14.21) Observa-se, pela Eq. 14.21, que para manter C= Cc deve-se variar kLa proporcionalmente a Q02 X, tendo em vista que a grandeza c. - Cc é constante, desde que não se varie a pressão parcial de 0 2 no gás empregado na aeração. Isso pode ser verificado na Figura 14.6, na qual também pode-se observar que o máximo valor de kLa é atingido para o máximo valor de Q02 X. 1,2 X,~ot, Q02X,C (esc . rei.) C(kla cte) + 0,8 0,8 0,6 0,6 • 0,4 0,2 Tempo (escala rei.) Figura 14.6 - Ilustração de duas possíveis formas para projetar um sistema de transferência de 0 kLa variável, ou com kLa = cte. e C variável com o mínimo fixado em 0,2 (vide texto). c. 2: com C = cte. e A conseqüência imediata dessa estratégia de operação é a necessidade de investimento em sistema de controle, ao lado de uma evidente economia de energia, a fim de manter o processo na condição desejada. De fato, no início dever-se-á agitar e aerar muito pouco, pois a demanda é baixa, conforme indicado anteriormente. Apenas se utilizaria a máxima energia no instante da máxima demanda. Transferência de oxigênio e respiração microbiana 299 A segunda opção seria calcular o valor de kLa para o instante de máximo valor de Q02 X, através da Eq. 14.21, praticando este valor (traduzido por um certo valor da freqüência de agitação e uma dada vazão de aeração) desde o início do processo. Nesse caso, C variará com o tempo, atingindo o valor mínimo (Cc) no instante de máximo Q02 X (Fig. 14.6). De fato, a partir da Eq. 14.19, desprezando-se o valor de dC/ dt, pode-se escrever: ~ = 1 _ Qo, X C5 (14.22) kLaC 5 Essa Eq. 14.22 indica a variação de C (ou C/C.) em função de Q02 X, ou seja, em função do tempo, com um valor constante de kLa. Obviamente, nessa segunda opção se estaria gastando mais energia e, por outro lado, investindo menos em controle. Na realidade, dificilmente observa-se um valor constante de kLa ao longo de um processo fermentativo, mantendo-se fixas as condições de aeração e agitação, pois a atividade microbiana vai provocando alteraçõesnas características do meio (por exemplo, aumento da viscosidade), o que freqüentemente contribui para uma redução de kLa (diminuição da difusividade do 0 2, aumento da espessura do filme líquido estagnado e aumento da tendência de coalescência de bolhas). Por outro lado, a necessidade da adição de antiespumantes freqüentemente contribui para a redução de kLa, em virtude de introduzir uma resistência adicional na interface gás-líquido. Todos os fatos apontados indicam a clara necessidade de se determinar os valores de kLa e Q0 2 durante um processo fermentativo, a fim de se contar com dados confiáveis para o correto dimensionamento de um sistema de transferência de Üz. 14.4.4 - Determinação de kLa e Q 02 durante o processo fermentativo As metodologias descritas no item 14.4.1 para a determinação de k1 a sem a presença de microrganismos, encontram importância especialmente quando se pretende comparar o desempenho de diferentes sistemas de agitação e aeração. No presente item há a preocupação em descrever alguns métodos para a quantificação de k1 a e Q02 durante um processo fermentativo, ou seja, na presença de microrganismos. Um dos métodos mais utilizados para realizar essa tarefa, é o que emprega uma sonda para a determinação da concentração de 0 2 dissolvido, conhecido como método dinâmico.14 Nesse método, em um dado instante de um processo fermentativo (t 0 ), interrompe-se a aeração, de forma a anular a transferência de oxigênio, conforme ilustrado na Figura 14.7. Recomenda-se também reduzir a freqüência de agitação, a fim de reduzir ao máximo a transferência de 0 2 na superfície do líquido, mas isto deve ser executado com cautela, pois esta redução pode causar uma baixa velocidade de líquido na superfície do eletrodo, o que pode causar um atraso exagerado de sinal. --------·--- ~-~-- -. -- --------.....,..--·-: --.- - ·----- --------- --- -----.. ~- --- . -.-~ ------ -,----------- -~-- ------ --;------·-------------------:--·-- --- ------------- --------·---- ··---. 300 Agitação e aeração em biorreatores Cone. 02 dissolv.(c Co Co 1----r---. Co1 -------- '' ------------------ 1to t1 Tempo Figura 14.7 - Variação da concentração de 0 2 dissolvido" com o tempo, durante a execução do método dinâmico. Como se observa na Figura 14.7, a concentração de 0 2 dissolvido C0, que estava ocorrendo no instante inicial, começa a diminuir, sendo que o sinª-1 da sonda deve ser registrado continuamente. Ao se atingir um certo valor C01 (instante t1 ), retoma-se a agitação e a aeração, nas condições que estavam sendo praticadas, observando-se, então, o aumento da concentração de 0 2 dissolvido, até atingir-se novamente o valor anterior C0 • Tal procedimento deve levar um tempo relativamente curto, não demandando mais do que alguns minutos para sua execução, tempo este que depende obviamente do instante da fermentação, ou mais propriamente da concentração celular existente. Assim sendo, dentro desse curto intervalo de tempo, pode-se supor que não haja alteração da concentração celular (X), assim como deve ser mantido constante o valor de Q 02, não permitindo que a concentração de 0 2 atinja valores abaixo da concentração crítica (deve-se manter c> ccrit). Nessas condições, para o trecho sem aeração, deve-se observar, a.partir da Eq. 14.19, que: · dC (14.23) -=-Q02X dt Conforme comentado anteriormente, o produto Q02 X deve ser constante durante esse intervalo de tempo, o que permite a integração da Eq. 14.23, obtendo-se: (14.24) A Eq. 14.24·prevê que a partir do instante t0 (C= C0 ), deve ocorrer uma variação linear de C com o tempo, reta esta cujo coeficiente angular é igual a (-Q02 X), resultando, assim, determinado o valor de Q 02 conhecendo-se o valor de X neste instante. Conforme se pode observar na Figura 14.7, não ocorre relação linear desde o instante da interrupção da aeração, pois há um certo período em que ainda existem bolhas de ar no seio líquido e, portanto, ainda ocorre alguma transferência de 0 2 • Transferência de oxigênio e respiração microbiana 30 I Uma vez conhecido o valor de Q02 X, é possível efetuar o cálculo de kLa de duas formas distintas. A primeira delas consiste em imaginar que a concentração de 0 2 dissolvido ao longo do processo fermentativo, varia muito lentamente, esperando-se que ao final da aplicação do método dinâmico, a concentração de 0 2 dissolvido volte ao valor original C0 • Assim, supondo estado estacionário em relação a C, pode-se fazer novamente (dC/dt) =O na Eq. 14.19, o que significa considerar a Eq. 14.21 e, portanto: (14.25) Essa metodologia de cálculo apenas deve ser aplicada para os instantes · em que já se tenham valores de C0 razoavelmente abaixo de C5 (por exemplo valores de C0 < 0,8 C5 ), caso contrário passa-se a obter valores de kLa absurdamente altos, pois se está dividindo Q02 X por valores muito baixos e, ainda, possivelmente afetados por erros de medida . A segunda forma para o cálculo de kLa, e a mais adequada, consiste em empregar os dados obtidos no trecho ascendente da concentração de 0 2 dissolvido, durante o qual a Eq. 14.19 aplica-se na íntegra. Assim, rearranjando a Eq. 14.19 obtém-se: (14.26) Admitindo-se, nova~ente, estado estacionário na Eq. 14.19, no patamar que antecede a interrupção da aeração (C= C0), pode-se demonstrar que: (14.27) Introduzindo-se a Eq. 14.27 na Eq. 14.26, fica-se com: dC = kta(Co -C) dt - (14.28) Essa equação pode ser integrada, lembrando que para o instante inicial de retomada da agitação e aeração, ou seja, para t = t 1 tem-se C = C011 obtendo-se: (14.29) -·---:-.------ --~ ---- .- --- --:---~-- -------------- -- -- - ... ...._......... --- - - - - -~ --- -- 302 Agitação e aeração em biorreatores Dessa forma, plotando-se C = J(t), conforme proposto pela Eq. 14.29, obtém-se urna reta, cujo coeficiente angular permite o cálculo de kLa. Na realidade, aqui também ocorrerá um certo período transitório, no qual as bolhas de ar ainda não estão ocupando o volume total de reação, de forma a se verificar a relação linear apenas para instantes ligeiramente posteriores à retornada da aeração. Note-se também que a Eq. 14.29 pode ser usada justamente para explicitar C em função do tempo. Deve-se observar que nas considerações anteriores não se levou em consideração o possível atraso na resposta do eletrodo, conforme efetuado na determinação de kLa na ausência do microrganismo. É óbvio que essa abordagem adicional é agora mais complicada, mas pode ser realizada de algumas maneiras distintas. Inicialmente, ao se empregar o trecho descendente para o cálculo de Q02 X, é possível· imaginar que o atraso da sonda possa causar determinações afetadas de erro. No entanto, desde que se empregue sondas em boas condições e suficientemente rápidas, está demonstrado na literatura (e também será visto mais adiante) que a reta obtida com o sinal da sonda CP =J(t) é paralela à reta da concentração real C= J(t) e, portanto, o coeficiente angular continua a fornecer o valor correto de Q02X. Para verificar essa informação, sugere-se a leitura dos artigos de KOIZUMI;AIBA 15 e de YANG et al. 16 Alternativamente, pode-se raciocinar segundo proposto por BADINO Jr. et al., 17 que consiste em retornar a sugestão de equacionarnento proposta por AIBA et al., 10 considerando que a resposta do eletrodo possa ser descrita segundo a Eq. 14.13. Para tanto, retornando a Eq. 14.24 e fazendo-se t 0 = O (instante inicial da interrupção da aeração) e introduzindo o valor de C na Eq. 14.13, fica-se com: (14.30) • Essa equação pode ser integrada, fornecendo: 1 Cp =C 0 -Q02 X[t- _!__ k +k k·t p p *CP l (14.31) onde: C0 = Cpo = concentração real de 0 2 antes da interrupção da aeração, coincidente com o sinal do eletrodo. A Eq. 14.31, a qual obviamente leva em conta a constante de atraso da sonda, porém não considera o transiente antes mencionado (existência de bolhas de ar nos instantes irnediatarnenteposteriores à interrupção da aeração), prevê que para tempos elevados no ensaio (o termo 1 I kPekp.t seria desprezível), obter-se-ia urna reta paralela à representada pela Eq. 14.24, podendo-se portanto estimar o valor de Q02 X através do sinal do eletrodo (CP = f(t)). Igualmente, para valores elevados de kP (sonda rápida), as Eqs. 14.24 ~.14.31 ~eriarn coincidentes. Transferência de oxigênio e respiração microbiana 303 Na Figura 14.8 indica-se o ajuste da Eq. 14.31 a dados experimentais, durante o cultivo de Aspergillus awamori, assim corno a reta prevista pela Eq. 14.24. Corno se pode notar, o ajuste é excelente, apesar de não se considerar o período transitório. A fim de efetuar o cálculo de kLa, levando em conta o atraso da sonda, pode-se empregar estratégia semelhante à descrita acima, considerando o trecho ascendente da concentração qe 0 2 dissolvido. CP (mmoL I L) 0,20 ,-------,------,,------.-----.--.------.---,-----, 0,15 Eq .14.24 Eq .14.29 " "-" 0,10 - 0,05 - Eq .14.31 /. - - - - I "-"' "-. - - Ar Ar desligado ligado I, Eq .14.33 oo, Ponto de inflexao - I_ -'- ' to o o,ooL---L-~L--~~~~-~--L--L--~ o 20 40 60 80 Tempo (s) Figura 14.8 - Dados experimentais do método dinâmico (o), aplicado em um dado instante de um cultivo de Aspergil/us ONamori. As curvas traçadas correspondem às equações indicadas (vide texto) . . De fato, retornando a Eq. 14.28 e efetuando-se a integração a partir do instante t 2 =O, cuja concentração de 0 2 dissolvido é C02, fica-se com: (14.32) Pode-se agora substituir este valor de C na Eq.14.13 e, em seguida, integrar a equação resultante, obtendo-se: C -C P 02 e · P -kp ·t k (C -C 02 ) ( -kp·t + C 0 (1 -e -kp·t) + p o * e -e -kl a·t) k p -k L.a (14.33) onde: Cpoz = sinal dá sonda no instante t 2 = Oconsiderado para a integração C02 = concentração real de 0 2 no instante t 2 = O C0 = Cpo = concentração de 0 2 antes da interrupção da aeração (a concentração real coincide com o sinal do eletrodo) A Figura 14.8 mostra o ajuste da Eq. 14.33 aos dados experimentais obtidos durante um ensaio de cultivo de Aspergillus awamori, a partir do qual pode-se estimar os valores de kLa e C02 (a qual não é conhecida, pois é a concentração real), 304 · . Agitação e aeração em biorreatores conhecendo-se os valores de kp (determinado previamente com ensaio em degrau), C0 e CP 02 . O ajuste pode ser realizado através da rotina de Marquardt para a estimativa de parâmetros, sendo o instante inicial de integração escolhido (t 2) o correspondente ao ponto de inflexão da curva ascendente de Cp=f(t), a fim de evitar o período transiente já mencionado. Observe-se, também, a partir da Eq.14.33, que o valor de kLa pode ser determinado diretamente a partir do sinal do eletrodo, sem a necessidade do conhecimento de C5 , pois todos os termos desta equação podem ser divididos por C5 . Outra interessante forma de se efetuar a determinação de kLa e Q02, através do método dinâmico levando em conta o atraso do eletrodo, é mediante a proposta elaborada por MIGNONE;ERTOLA 18 e MIGNONE, 19 a qual deve ser examinada pelo leitor interessado em aprimorar este tipo de metodologia. De qualquer maneira, para a aplicação do método dinâmico, há a necessidade de se contar com valores relativamente elevados da concentração de oxigênio dissolvido no meio no instante em que se pretende aplicar o método (C 0 ). Isso ocorre, pois não se deve permitir que esta concentração caia abaixo da concentração crítica, a fim de manter constante o valor de Q02 das células presentes. Esse fato limita a aplicação dessa metodologia, para instantes adiantados de urna fermentação, quando o 0 2 dissolvido já esteja baixo e, assim, não se pode cortar a aeração, sem o risco de se ter C<Ccrit· Além disso, todos os métodos que empregam eletrodos têm o inconveniente de se colocar este eletrodo em urna dada posição no interior do reator. Assim sendo, a determinação efetuada é válida para o ponto de medida e, normalmente, extrapola-se o valor de kLa para todo o reator. No caso de reatores de pequenas dimensões, essa extrapolação é bastante razoável, tendo em vista a possibilidade de considerá-lo corno homogêneo. No entanto, para reatores de porte rnécl,io ou grande (milhares de litros), a consideração de reator homogêneo difiCilmente é verdadeira, o que torna estas metodologias • passíveis de críticas. Urna alternativa aos eletrodos imersos no líquido é a realização de medidas nos gases afluente e efluente do reator, o que permite a execução de balanços gasosos e o cálculo de kLa e Q02 . Para tanto, necessita-se monitorar com precisão as vazões de entrada e saída de gases no reator, além do teor de 0 2 e C0 2 nestes gases. Normalmente empregam-se os analisadores pararnagnéticos para a monitoração de 0 21 e os analisadores infravermelho para a medida do C02 • Alternativamente, pode-se também empregar sondas para medir o teor de 0 2 em um gás efluente, o que conta com a vantagem de serem equipamentos de baixo custo, mas às vezes questionados quanto à sua precisão. Em todo caso, as medidas efetuadas nos gases efluentes são, em princípio, mais recomendáveis, pois podem ser feitas sem assepsia, permitindo as freqüentes calibrações e manutenções dos instrumentos de medida, o que obviamente não é possível com os sensores imersos no meio líquido. Transferência de oxigênio e respiração microbiana 305 Imagine-se um reator de volume útil V, que esteja recebendo uma dada vazão de ar, podendo-se medir o teor de oxigênio na entrada e na saída deste reator. O balanço para o oxigênio no gás, fornece: Xo2e~ge -Xo2s ~gs =kLa(C s -C)V (14.34) onde: x02e = fração molar ou volumétrica de 0 2 no gás de entrada ~ge =vazão molar de gás na entrada (mol gás/h) xa2s = fração molar ou volumétrica de 0 2 no gás de saída ~gs =vazão molar de gás na saída (mol gás/h) V = volume de líquido no reator Por outro lado, já se sabe que o balanço de 0 2 no líquido fornece: (14.35) Introduzindo-se a Eq.14.34 na Eq.14.35, obtém-se: (14.36) Na Eq. 14.36 pode-se novamente imaginar que a variação da concentração de 0 2 dissolvido em função do tempo seja pequena ao longo do processo, o que significa escrever que (dC/dt)=O (hipótese esta que a rigor não é necessária, desde que se disponha do registro de C=f(t) e se calcule o valor de dÇ/ dt no instante da realização do balanço), obtendo-se então: (14.37) As vazões molares podem ser convertidas em vazões volumétricas, lembrando-se que: ~=QP RT onde: Q =vazão volumétrica do gás (m 3 / h) P = pressão total do gás (atm) R= constante universal dos gases (m3.atm/mol.K) T = temperatura absoluta do gás (K) Assim, na Eq.14.37,fica-se com: (14.38) 306 , Agitação e aeração em biorreatores onde: P. =pressão do gás na entrada do reator (atm) T. = temperatura do gás na entrada do reator (K) Qge =vazão volumétrica de gás na entrada do reator (m 3 /h) P. =pressão do gás na saída do reator (atm) T. = temperatura do gás na saída do reator (K) Qgs =vazão volumétrica de gás na saída do reator (m3 /h) Através da Eq. 14.38 é possível calcular Q 02 X, desde que se disponha das grandezas nela indicadas. Particularmente, deve-se salientar que na entrada do gás (onde x02.=0,209, caso se esteja empregando ar atmosférico sem enriquecimento com 0 2 ) a pressão total (P.) consiste na somatória da pressão atmosférica, da pressão na cabeça do reator e da pressão exercida pela coluna de líquido no reator, conforme indicado na Eq. 14.8. Essa coluna líquida, que pode ser desprezada para pequenos reatores de bancada, não pode ser desconsiderada para reatores de grande porte, para os quais pode-se ter vários metros de altura (8 m, por exemplo). Caso se possa admitir que as vazões molares de entrada e saída sejam iguais (o que significa imaginar que cada molde 0 2 consumido gere um moi de C02, ou seja, que o coeficiente respiratório RQ=(Qco2 /Q 02 )=1, onde Qcoz=(1/X).(dC02 /dt), sendo que experimentalmente com freqüência observam-se valores superiores à unidade, como por exemplo 1,1, ou mesmo superiores), além de se admitir que os gases de entrada e saída estejam na mesma temperatura e pressão (desprezando-se' a coluna líquida), então resulta igualdade das vazões volumétricas e, portanto, na Eq. 14.38 fica-se com: (14.39) • É óbvio que a Eq. 14.39 é bem mais simples do que a Eq. 14.38, mas é preciso prestar atenção nas simplificações introduzidas. Caso se esteja utilizando ar atmosférico e se possa dispor da medida da fração molar de 0 2 no gás efluente (x02.) e, simultaneamente, da fração molar de C02 neste gás (xc 02.), pode-se efetuar um balanço de nitrogênio (componente inerte), obtendo: onde: = fração molar de N 2 na entrada =fração molar de N 2 na saída <D.r =vazão molar de ar na entrada do reator (mol/h) xN2e XN2s Transferência de oxigênio e respiração microbiana 307 ou, ainda, pode-se escrever: e, finalmente: (14.40) onde: X CO , S = fração molar de C02 na saída. Logo, é possível calcular ~gs' desde que se disponha adicionalmente de xc 025 , não havendo assim a necess1dade de medir esta vazão. Saliente-se, ainda, que a disponibilidade de xc 025 (considera-se, normalmente, desprezível o teor de C02 no ar de entrada) permite a realização do balanço gasoso para o co2 e, portanto, o cálculo de Q02t desde que se admita coeficiente respiratório RQ igual a um, conforme discutido acima . Essa é uma alternativa possível, lembrando a maior robustez dos analisadores de C02 . Quanto à determinação de kLa, esta é realizada imaginando-se estado estacionário para C, ou seja, através da Eq. 14.25, lembrando a restrição acima mencionada sobre a necessidade de se contar com um_a concentração de 0 2 dissolvido razoavelmente distinta da concentração de saturaÇão, a fim de não se superestimar o valor de kta · O emprego do balanço gasoso é uma ferramenta bastante conveniente, pois além das vantagens acima indicadas sobre a efetivação da medida fora do reator, ainda se está analisando o reator como um todo e não efetuando uma leitura em um certo ponto do reator. Adicionalmente, essa metodologia não interfere na operação do reator, pois nadá é alterado em termos de sua condução, não havendo necessidade d~ alterar vazão de ar ou freqüência de agitação. Trata-se, portanto, de uma medida "on-line", que conta com o inconveniente, como as anteriores, de se necessitar do conhecimento de X para se saber o valor de Q 02 . No entanto, o valor da grandeza Q 02 X já é extremamente útil, em termos de controle do processo. · Um outro problema dessa metodologia refere-se à quantificação das diferenças entre as frações molares de 02 e co2 dos gases de entrada e saída do reator, para os instantes iniciais do processo fermentativo. De fato, para esses instantes, normalmente a concentração celular é baixa, havendo um baixo consumo de 0 2 e, por conseguinte, um gás efluente com composição muito próxima ao gás de entrada. Isso dificulta uma boa estimativa de Q02 X, o que, ao lado da problemática da determinação de baixas concentrações celulares, impede que se obtenha bons valores para Q 02 . · Essa observação é de importância para o emprego do balanço gasoso de uma forma geral, pois o uso de elevadas vazões de aeração pode também expandir essa dificuldade para todo o processo fermentativo recomenda-se empregar baixas vazões específicas de aeração (=relação Q/V), como, por exemplo, 0,2 vvm (volume de ar por volume de meio por minuto), em vez de 1,0 vvm como é usual em pequenos reatores de bancada. 308 i1 !i Agitação e aeração em biorreatores Claro está que se a estimativa de Q02 X é ruim, por se ter gases de entrada e saída muito semelhantes, isto freqüentemente também significa ter C:C5 , o que inviabiliza as estimativas de kLa . Deve-se lembrar que, quando se discutiu o método dinâmico (uso de eletrodos no líquido), um sério problema residia em haver dificuldades para os instantes adiantados do processo fermentativo, quando a concentração celular fosse elevada, pois a concentração de 0 2 no líquido pode atingir valores reduzidos. No entanto, para os instantes iniciais tem-se baixos valores de X e elevados valores de C, o que permite a realização do método dinâmico, com relativa facilidade. Adicionalmente, os baixos valores de X, causam um decréscimo lento da concentração de 0 2 dissolvido, quando se interrompe a aeração, o que facilita o monitoramento de C através do sinal do eletrodo CP. Quando se retoma a aeração, no entanto, verifica-se um rápido aumento em C, o que continua a exigir o emprego das metodologias para a correção do sinal do eletrodo. De qualquer maneira, o exposto acima permite concluir que o método dinâmico e o balanço gasoso, enquanto duas metodologias distintas para as determinações de kLa e Q02 , são na realidade complementares. O método dinâmico aplica-se bem no início de um processo descontínuo, ou para processos com baixa concentração celular, enquanto que o balanço gasoso encontra melhor aplicação para concentrações celulares mais elevadas. ;. !i !I i[ il li!j i,I' ,,!I li ,,I! !! 14.5 - Transferência de oxigênio em sistemas agitados e aerados Sabendo-se como é possível determinar experimentalmente os valores de kLa durante um processo fermentativo, surge naturalmente o interesse em correlacionar os valores deste coeficiente de transferência com as condições de agita• ção e aeração empregadas, objetivando sempre o atendimento da demanda Q02X, conforme amplamente discutido no item 14.4.3. Essa tarefa exige que se aborde, em um primeiro momento, a operação unitária de agitação (ou mistura), a fim de se contar com algumas informações fundamentais sobre esta operação, a qual objetiva estudar a transferência de energia a um líquido submetido à agitação, o que permite o dimensionamento desta operação muito freqüente na indústria química. 14.5.1 - Agitação de líquidos newtonianos . Os objetivos de uma operação de mistura podem ser tornar (ou manter) homogênea uma solução, manter sólidos em suspensão, ou, ainda, tornar eficientes os transportes de calor e massa. Esses objetivos podem ser atingidos na medida em que se busque movimentar o líquido no interior de um recipiente, ou seja, procura-se transmitir potência (energia/tempo) ao líquido, através de um sistema de agitação. Transferência de oxigênio em sistemas agitados e aerados 309 A determinação dessa energia transmitida pode ser efetuada pelo emprego de dinamômetros, "strain-gage", ou por balanço térmico, lembrando-se, no entanto, que sempre se busca determinar a potência efetivamente transmitida ao líquido e não a potência total despendida (sempre ocorrem perdas de potência nos selos de entrada do eixo no biorreator, no sistema de redução de velocidade, ou no próprio motor). Os detalhes dessas metodologias de medida devem ser observados nos trabalhos que ser~o mencionados a seguir. Conforme sugerido na Figura 14.9, é intuitivo imaginar que quando se faz girar um dado impelidor, imerso em um líquido, a capacidade desta turbina de transmitir potência ao líquido depende de uma enorme quantidade de possíveis variáveis. De fato, o tipo de impelidor usado, seu diâmetro, a freqüência do agitador, o diâmetro do tanque, a altura da coluna líquida, a existência ou não de chicanas e sua largura, as características do líquido (densidade, viscosidade), são apenas alguns exemplos das possíveis variáveis que afetam a potência que se transfere a um líquido submetido a agitação. Uma possível estratégia para abordar esse tipo de situação, consiste em lançar mão da análise dimensional, através da qual se busca juntar as variáveis em grupos adimensionais e, a seguir, obter as correlações entre esses adimensionais. Justamente essa foi a estratégia empregada por RUSHTON et al./ 0' 21 os quais demonstraram que: 2 =t(NDfp N D; HL DT WB N D; p 1.1 g - D; D; D; 3 p 5 I I I I f• • • ) (14.41) onde: Nr =Número de potência (=P /N3 D;5 p) (adimensional) NR. = Número de Reynolds (=ND; 2p/M (adimensional) NFr =Número de Froude (=N2 D;/ g) (adimensional) P = potência transmitida na agitação (W) N = freqüência de agitação (rps ou s-1) 3 p =densidade do líquido (kg/m ) 1.1 =viscosidade do líquido (kg/m·s) g = aceleração da gravidade (m/ s 2) D; = diâmetro do impelidor (m) HL/D;,DT/D;,W8 /D;, ... = adimensionais ligados à geometria do reator H L = altura da coluna de líquido (m) DT = diâmetro do tanque (m) W 8 = largura da chicana (m) C = distância do impelidor ao fundo do reator (m) W; =altura da pá da turbina (m) · ···-·-~-: ---·-.-. ,----~- - --:--·.-.-- - -- - -------- ---- ..... .,_...,..._ ~,...-·-·---.-~- --- - - --~-- ..:_ __ . __ __ -: ------- ----~· - ---- - - - - - - -- --- - 3IO Agitação e aeração em biorreatores ,, .. -....,,R,.,,,oooo,,,,,, ... ''"~ ,.,,,,.-.._,,,,,.._,,,o• ...~...- •,., ''"' Figura 14.9 - Esquema de um tanque agitado por turbina de pás planas, com indicação de dimensões importantes na transmissão de potência ao líquido. 1~1 ~ RUSHTON et al. 20 ' 21 efetuaram determinações de potência transmitida para um grande número de impelidores e em diferentes geometrias. Na Figura 14.10 encontram-se dados para a turbina de disco e pás planas ("flat-blade turbine") e para o impelidor tipo hélice ("marine propeller"- hélice impelidora de navios), que são os impelidores mais freqüentemente empregados em processos fetmentativos. Esses dados foram obtidos através da variação de N, Di, p e ll em tanques geometricamente semelhantes, providos com chicanas, indicando-se na Tabela 14.3 as relações geométricas utilizadas, as quais são entendidas como relações padrão, conforme discutido no item 14.2. Em distintas geometrias as curvas são semelhantes, porém deslocadas em relação às curvas indicadas na Figura 14.10. Para essa situação de tanques geometricamente semelhantes e ainda dotados com chicanas, que evitam a formação de vórtice, não ocorrendo, portanto, a participação do número de Fraude, a Eq. 14.41 fica: (14.42) NP 100~-----------------------------------------. • Turbina com disco e pás planas 10 / Hélice (marine propeller) / Figura 14.1 O- Número de potência(Np=P/N 3D; 5 p) em função do Número de Reynolds (NRe=ND; 2p/J.t). para impelidores tipo pás planas e tipo hélice ("propeller"). Dados obtidos para as geometrias indicadas na Tabela 14.3. 3I I Transferência de oxigênio em sistemas agitados e aerados Tabela 14.3 - Relações geométricas relativas aos dados da Figura 14.1 O. Tanques com 4 chicanas. Tipo de impelidor Dr/Di HdDi C/Di LJDi WJDi WB/Dr Turbina com 6 pás planas 3 3 1 0,25 0,2 0,10 Hélice (pitch=Di) 3 3 1 - - 0,10 ' Na Figura 14.10 observa-se a possibilidade de definir três distintas regiões: a região laminar (NRe<10), uma região de transição e, finalmente, a região turbulenta para elevados valores do número de Reynolds (NRe> 104 ). Na região laminar constata-se que: (14.43) Na região de fluxo turbulento: (14.44) As Eqs.14.43 e 14.44 indicam que, para o dimensionamento de sistemas de agitação na região laminar, a potência varia proporcionalmente com o quadrado da freqüência de agitação e com o cubo do diâmetro do impelidor, além de depender da viscosidade do fluido. Já na região turbulenta, na qual freqüentemente se procura efetuar os dimensionamentos, a potência é proporcional ao cubo da freqüência e à quinta potência do diâmetro do impelidor, dependendo também da densidade do fluido e não da viscosidade. Conforme se pode observar na Figura 14.10, na região turbulenta Np=6, sendo este o valor mais elevado dentre todas as turbinas ensaiadas por RUSHTON. Além disso, observa-se que na região de transição há uma tendência de queda do Np, o que é interessante para um processo fermentativo quando ocorre aumento na viscosidade do meio e, portanto, uma redução no NRe· Assim, caso o sistema de agitação tenha sido dimensionado na região turbulenta, operando com uma freqüência de agitação constante, não haverá risco para o motor com o progresso da fermentação, pelo menos até à região laminar. Essas são duas razões pelas quais freqüentemente se emprega turbina tipo pás planas, para a agitação e transferência de oxigênio em um processo aeróbio. Na verdade, o motivo que determina uma menor transmissão de potência ao líquido por uma turbina tipo hélice ("propeller"), reside no fato de que este impelidor tem um fluxo de descarga do líquido na direção axial (para baixo 3 12 Agitação e aeração em biorreatores na direção do eixo; vide Fig. 14.11), enquanto que uma turbina de pás planas apresenta fluxo de descarga na direção radial (na direção das paredes do tanque; vide Fig. 14.12). Assim, são turbinas que podem ter funções distintas em um reator, mas em termos de tninsferência de potência, sem dúvida, a turbina tipo "flat-blade" é mais efetiva. - r- tv~\\ ;(.' t tf 'd( \ t j ---~lll[r-~ t ( (' :J 1'- "'~ ~, . . . . . . ..._. ) " Figura 14.11 - Escoamento axial para impelidores tipo hélice ("propeller") em tanque com chicanas . • Figura 14.12 - Escoamento radial para impelidorestipo disco e pás planas ("flat-blade") em tanque com chicanas. Apenas para se ter uma idéia da importância do tipo de turbina, em termos da localização da curva de Np=f(NR.), dados fornecidos por KING et al. 22 permitem concluir que para uma turbina com 4 pás planas obtém-se Np=2,2, valor este bem inferior ao mencionado anteriormente (turbina com 6 pás planas). Além disso, esses autores observaram uma redução no Np para valores elevados do NR., em virtude da incorporação de ar da superfície, quando se agita a elevadas freqüências de rotação. Da mesma maneira a geometria do sistema interfere muito na potência transmitida como, por exemplo, a altura da pá (Wi) da turbina, assim como a distância da turbina ao fundo do tanque, ocorrendo a máxima transmissão de potência na condição (C/Di)=1, conforme indicado por BATES et al. 24 Esses autores, assim como outros, encontraram Np=5, para as mesmas condições geométricas e mesma turbina de pás planas que a empregada por RUSHTON, valor este diferente do indicado anteriormente. Transferência de oxigênio em sistemas agitados e aerados 3I3 Como freqüentemente se tem o problema .de calcular a potência transmitida em sistemas geometricamente distintos daqueles ensaiados por RUSHTON, AIBA et al. 10propõem multiplicar a potência, estimada através dos dados de RUSHTON, pelo seguinte fator de correção: ' fc= (DyiDi)*(HLIDi)* ' (14.45) (Dr I Di)(HL I Di) onde: (DTIDJ e (HLIDi) relações geométricas de RUSHTON. (DTIDY e (HLIDJ• relações geométricas distintas em relação às propostas por RUSHTON. Essa expressão deve, no entanto, ser empregada com a devida cautela, tendo em vista a interferência da geometria que, às vezes, é difícil de ser prevista de forma mais conveniente. Uma outra importante questão, tendo em vista a realidade de um processo fermentativo, reside na freqüente necessidade de se empregar mais do que um impelidor em um mesmo eixo, situação esta não.examinada por RUSHTON et al. 20' 21 É bastante intuitivo imaginar que, caso se pretenda colocar dois impelidores em um eixo, se estes estiverem muito próximos um do outro não se terá a máxima eficiência na transferência de potência, assim como não se atingirá a melhor condição de mistura. Por esta razão, encontra-se na literatura23 a seguinte recomendação: Di< H i< 2Di (onde: Hi=distância entre impelidores) e sendo o número de impelidores definido da seguinte forma: HL-D. 1 -=---..:.. > Nº de impelidores > HL-2D·1 Di Di Em termos quantitativos, há presentemente algumas menções na literatura sobre a potência transmitida ao líquido por duas turbinas em relação à que se observa com apenas uma turbina. Na Figura 14.13 dá-se Uma idéia dos resultados obtidos por HUDCOVA et al. 25 (dados experimentais foram omitidos), na qual se observa que ocorre a transferência do dobro de potência apenas quando (Hi I Di)> 1,8. Os resultados indicados na Figura 14.13 foram obtidos com a geometria próxima à indicada na Tabela 14.3, para a turbina de pás planas, apenas que vários dados experimentais foram obtidos com (HLIDT)=2. Quando as turbinas se encontram próximas [(HJ Di)<1,8], o fluxo de líquido causado por cada uma delas interfere no desempenho das outras turbinas, não permitindo o máximo de potência transmitida. Nessa direção, BATES et al./4 apesar de obterem um perfil de variação distinto do indicado na Figura 14.13, possivelmente por empregarem turl;>irtas de pás planas distintas das anteriores, indicaram que (P 2 IP 1) ~ 2 quando (HJDi)>1,3.. Esse dado reforça a idéia de que, acima de um certo espaçamento entre os impelidores, o qual depende do tipo de turbina empregada, esses impelidores passam a operar de forma independente, o que permite estimar a potência transmitida para sistemas com múltiplas turbinas. 3 14 Agitação e ae~ção em biorreatores · P2/P1 2 , 2.-----------~----~----------------------~ 2,0 1,8 1,6 1,4 2,0 1,O 2,5 3,0 Figura 14.13 - Relação entre a potência transmitida por duas turbinas em relação à transferida por uma turbina 25 (P 2/P 1), em função da relação H;/D;. para turbina de pás planas (H;=distância entre as turbinas). 14.5.2 - Agitação de líquidos newtonianos submetidos a aeração. As informações contidas no item anterior permitem efetuar estimativas de potência transmitida para um líquido, por um determinado sistema de agitação, quando não se está praticando a aeração (borbulhamento de ar), ou seja, quando há apenas a preocupação com o problema da mistura. Quando há preocupação com a transferência de oxigênio, haverá também a necessidade de aerar o líquido submetido à agitação, fato este que provocará alterações sensíveis na potência transmitida. De fato, quando se tem bolhas de ar suspensas em um líquido, ocorre uma redução na densidade aparente, o que deve provocar uma redu~ão na potência que se consegue transmitir em relação à potência transferida ao líquido não aerado. A fim de estudar esse tipo de situação, mais complexa do que a anterior, 26 OHYAMA; ENDOH definiram um adimensional, que chamaram de Número de Aeração (NA), através da seguinte expressão: N _Q!Df Q ND · - ND~ (14.46) A- l l onde: NA= Número de Aeração (adimensional) Q =vazão de ar (m3 /s) ND; =velocidade da extremidade do impelidor (m/s) A seguir, esses autores propuseram a construção de gráficos nos quais colocavam a relação entre a potência transmitida no sistema aerado e a potên- Transferência de oxigênio em sistemas agitados e aerados 3I5 cia sem aeração (Pg/ P), em função deste número de aeração sendo, portanto, relações entre números adimensionais. Um exemplo desse tipo de resultado experimental encontra-se na Figura 14.14, resultados esses obtidos por HUDCOVA et al./ 5 novamente obtidos em um sistema com dimensões padronizadas (Tab. 14.3) e duas turbinas com seis pás planas, distanciadas de Hi=3Di, condição para a qual as turbinas se comportavam de forma razoavelmente independente. Saliente-se, também, que esses autores realizaram medidas de potência com dois sistemas "strain-gage", um deles colocado entre os impelidores e o outro acima dos dois, de forma a obter os dados de potência para cada impelidor. Conforme se pode observar, ocorre uma sensível queda na potência transmitida, a qual é função da vazão de ar empregada. Particularmente, a turbina colocada na parte inferior, situada logo acima do dispersar de ar, é a que sofre uma maior perda de potência transmitida, justamente por receber diretamente todo o fluxo de ar, tendo a importante tarefa de dispersar este ar. Já a turbina colocada na parte superior conta com uma menor perda de potência transmitida, pois ela não recebe todo o fluxo de ar, o qual já foi dispersado. Dessa forma, as duas turbinas juntas também não conseguem transmitir a mesma potência que a observada no sistema sem aeração, mas o valor de Pg/P é superior ao obtido com apenas um impelidor. N=25 s-1 (H/0;)=3 0,6 0,4 X + * Impelido r inferior Os dois impelidores Impelido r superior 0,20~------~L---------~------~~------~-L--~ 0,05 Figura 14.14 - Pg I P em função de NA 0,10 = NA 3 0,15 0,20 Q!N D; para sistema de agitação com duas turbinas de pás planas? 5 Uma interessante observação foi a efetuada por MARTÍNEZ et al. 27 no que se refere ao emprego de distintos dispersares de ar. Esses autores indicaram que o uso de anéis no lugar de simples orifícios, permite obter uma maior potência transmitida pelo sistema de agitação. Quando empregaram um anel com um diâmetro superior ao diâmetro do impelidor, obtiveram ~alores muito maiores darelação Pg/P, para uma ampla faixa de valores de NA: Esses fatos comprovam -------,----:·-- --·------- --- - -:-- ---- ~ - .,--- .......,.....,....-,..,...--- ...... ------ --~ ----- - --- --;--·- --- - --~-- ~--- -------------- -- ,. i i' I;· 316 Agitação e aeração em biorreatores I ·.i ,,' i . I novamente a importância, em termos de transferência de energia, de se procurar evitar que um maior fluxo de ar incida diretamente sobre a turbina. 8 MICHEL; MILLER/ a partir do exame de seus resultados experimentais, propuseram a seguinte equação: .,,, ,,H (14.47) onde: Pg=potência transmitida ao líquido sob aeração (watt-W) Na Eq. 14.47 a constante de proporcionalidade é função da geometria do sistema, mas, tendo em vista que esta correlação não foi estabelecida entre números adimensionais, ela depende também das unidades consideradas para as várias grandezas envolvidas. Assim, considerando o Sistema Internacional de unidades (S.I.), MILLER 29 propõe: 2 3)0,45 Pg { = 0,70 P ND · Qo,s6' (14.48) com: Pg e P em W Nems·1 Diemm Qemm3 /s. A expressão de MICHEL; MILLER,28 apesar da dificuldade denão propor uma relação entre números adimensionais, costuma ajustar-se muito bem a dados experimentais, l!lesmo obtidos em sistemas geometricamente distintos, conforme será comentado no item seguinte. Antes, porém, uma dúvida adicional merece ser esclarecid!. O motor que irá acionar o sistema de agitação deve ser dimensionado segundo uma dada potência Pg (adicionada da perda de potência no selo da cabeça do reator), mas nos instantes iniciais de operação, quando se estiver dissolvendo os nutrientes e promovendo a esterilização, não se estará promovendo a aeração do meio e, caso o reator já esteja operando no volume de reação pretendido, a potência que se estará transmitindo será P e não Pg· Caso se possa prever um sistema de agitação que permita a variação da freqüência de agitação (N), segundo a Eq. 14.44, deve-se prever uma freqüência suficientemente baixa que permita a operação sem riscos para o motor. Alternativamente, há a possibilidade de se colocar dobradiças em algumas lâminas das turbinas tipo "flat-blade" (por exemplo, em um impelidor de seis pás planas, três delas podem conter dobradiças), de forma que quando se estiver esterilizando, faz-se o motor girar na direção de fechamento das pás dotadas de dobradiças, invertendo-se o sentido de rotação do motor· tão logo se inicie a aeração, quando então todas as lâminas se abrirão. -- ~-------- -- ----- - -- - Transferência de oxigênio em sistemas agitados e aerados 3I7 14.5.3 - Agitação e aeração de líquidos não-newtonianos Até este ponto tratou-se apenas de situações nas quais o interesse reside na agitação e aeração de líquidos newtonianos,. mas sabe-se que durante um processo fermentativo é possível ocorrerem alterações significativas no caldo, podendo este passar à condição de líquido não-newtoniana, como é o caso de processos envolvendo o ,cultivo de fungos filamentosos. É bem evidente que essa situação é mais complexa, exigindo um tratamento especial, sendo o caso mais freqüente o surgimento de um comportamento pseudoplástico. Na Figura 14.15 indicam-se as possíveis formas de variação da tensão de cisalhamento ('t) em função do gradiente de velocidade (dv/dr), para alguns líquidos típicos. Tensao de Cisalhamento (t) newtoniana Dilatante Gradiente de velocidade (dvldt) Figura 14.1 S - Tensão de cisalhamento (•) em função do gradiente de velocidade (dv/dr), para líquido newtoniano e líquidos não-newtonianos. ' Os líquidos newtonianos caracterizam-se por apresentar uma proporcionalidade entre a tensão de cisalhamento e o gradiente de velocidade, sendo esta constante de proporcionalidade definida como a viscosidade do líquido, ou seja: (14.49) onde: 't =tensão de cisalhamento (kg/m.s2, Pa) J.1 =viscosidade do líquido (kg/m.s, Pa.s) (dv/dr) =gradiente de velocidade na direção radial (s-1) 318 Agitação e aeração em biorreatores Para o líquido binghamiano pode-sé escrever: (14.50) .,.; ' ~· onde: y =coeficiente de rigidez (kglm.s) Para alguns fluidos não-newtonianos, é bastante freqüente aplicar-se achamada lei de potência, ou seja: 't = dv)n K ( dr (14.51) onde: K = índice de consistência (kg · m·1 • sn·2 ou g · cm·1 • sn·2 ) n = índice de comportamento do fluxo (adimensional) Obviamente na Eq. 14.51 se n = 1 trata-se de um líquido newtoniana; se O < n < 1 trata-se de um líquido pseudoplástico; quando n > 1 trata-se de um líquido dilatante. Ainda, na Figura 14.15, caso se imaginasse uma reta unindo a origem ( 't = O; dv I dr = O) com um determinado ponto sobre a curva de um fluido pseudoplástico, por exemplo, pode-se definir uma viscosidade aparente, como o coeficiente angular desta reta, ou seja: (14.52) onde: J..l.p =viscosidade aparente (kglm · s) Conforme se pode observar na Figura 14.15, essa viscosidad~ aparente varia com o valor do gradiente de velocidade, sendo que, para o líquido pseudoplástico, ela diminui com o aumento de dv I dr. Dessa forma, ao se submeter um dado fluido pseudoplástico a diferentes valores de dv I dr, em um viscosímetro, pode-se obter distintos valores de J..lap e, com esta série de dados, efetuar a determinação dos parâmetros K e n, ou seja: logJ..lap =logK +(n -1)log(dvldr) (14.53) Essa equação indica que a relação entre logJ..lap em função do log(dv I dr) é linear, o que permite o cálcJJ.lo dos parâmetros que caracterizam o líquido. Na Figura 14.16 encontra-se um exemplo de dados de caracterização reológica, ao longo de um cultivo de Aspergillus awamori, sendo os valores de K e n plotados em função da concentração celular.30 Conforme se pode observar, os valores de n e K variam ao longo do tempo, ou com a concentração celular, havendo inclusive a possibilidade de ajuste de uma função exponencial entre os valores de K e X (K=0,51e0,31X), o que Transferência de oxigênio em sistemas agitados e aerados 3 I9 mostra a influência do crescimento das células na alteração das características reológicas do meio, o que claramente torna o problema bem mais complexo. Para uma melhor compreensão da dificuldade em se ter de manusear um líquido não-newtoniana, basta lembrar que para estes fluidos não é possível definir uma dada viscosidade, pois essa depende do valor de dv I dr que está ocorrendo no tanque, gradiente de velocidade este imposto pelo impelidor. Dessa forma, não se pod~ definir um dado valor para o número de Reynolds (NRe' Eq. 14.41) e, assim, fica impossível obter a correlação entre Np=f(NRe), conforme indicado na Figura 14.10. O que pode ser feito é trabalhar com a viscosidade aparente (IJ..p, Eq. 14.52) e definir um Número de Reynolds modificado,-como sendo: NR em =NDfp (14.54) IJ.ap Índice de fluxo (n) Índice de consistência (K) 1,2 , - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - , 3 5 ,-· -+,;t- 1,0 K=0,51 exp (0,31.X) 30 + n 0 ,8 25 / + 20 0 ,6 15 0 ,4 10 0,2 o 5 o 2 4 6 8 10 12 14 16 o X(g/L) Figura 14.16 - Valores do índice de comportamento do fluxo (n, adimensional) e do índice de consistência (K, em 1 2 30 g.cm- .sn- ) em função da concentração celular (X), durante cultivo de Aspergillus awamori. Vários pesquisadores abordaram esse problema, ressaltando-se a contribuição de METZNER; 0TT0 31 e CALDERBANK; MOO-YOUNG, 32 que empregaram a seguinte metodologia experimental, aplicável para um dado líquido não-newtoniana: a) inicialmente agitaram o líquido não-newtoniana num determinado tanque com distintas freqüências de agitação (N), efetuando a medida da potência transmitida (P) para cada N, o que permite a construção do gráfico de Np em função de N. 320 Agitação e aeração em biorreatores b) a seguir, no mesmo tanque e mesmo sistema de agitação, agitaram um líquido newtoniana, definindo a função Np=f(NRe), pois agora pode-se conhecer NRe· c) dessa forma, para cada valor de N com o líquido não-newtoniana, tem-se o valor de Np (item a) e, com este valor, pode-se entrar na figura gerada no item b tirando-se o valor de NRe' o qual corresponde ao NRem (Eq. 14.54) no tanque operando com o líquido não-newtoniana na mesma freqüência de agitação. Isso permite a determinação de llw d) càso as características reológicas do líquido não-newtoniana (n e K, Eq. 14.51 ou 14.52) tenham sido determinadas em um viscosímetro, para cada valor de llap pode-se determinar, no tanque agitado, o valor médio do gradiente de velocidade (dv I dr)m. Isso parece ser razoável, pois, conforme se observa na Figura 14.15, um determinado valor de Jlap apenas define um único valor de dv I dr, seja no viscosímetro ou no tanque submetido à agitação, para qualquer líquido não-newtoniana. · Através desse procedimento, aqueles autores mostraram que existe uma relação muito simples entre (dv I dr)m e N, ou seja: (14.55) onde: (dv I dr)m = valor médio do gradiente de velocidade na direção radial e~tre a extremidade do impelidor e a parede do tanque (s. 1) · ki =constante de proporcionalidade (adimensional), que depende do tipo de impelidor e da geometria do sistema, além do tipo de líquido não-newtoniana. Encontram-se na literatura2,33 valores de ki para turbinas com seis pás planas variando entre 11 e 13; para impelidores tipo hélice algo como 11; e p>ara agitadores de fita helicoidal valores da ordem de 30. Substituindo-se a Eq. 14.55 na Eq. 14.52, obtém-se: llap = KNn-1kf-1 (14.56) Retornando, agora, à Eq. 14.54, vem: N - Rem- N2- nD?p z Kkn-1 (14.57) l É possível, dessa forma, construir curvas do Np (conforme determinações feitas no item a) em função destes valores de NRem' as quais deverão ser muito semelhantes, ou até mesmo coincidentes, às obtidas com o fluido newtoniana (Figura 14.10), tendo em vista o próprio procedimento adotado. Essa coincidência é particularmente observada na região laminar, na qual a potência transmitida depende fortemente da viscosidade do fluido, ocorrendo desvios na região transiente, quando o Np começa a não mais depender desta viscosidade. Transferência de oxigênio em sistemas agitados e aerados 321 Inversamente, para um dado valor de N, conhecendo-se as características reológicas (n e K) de um dado fluido não-newtoniano, admitindo-se (ou tendo-se determinado) um certo valor para a constante ki (dependendo do tipo de impelidor), pode-se determinar o NRem e, com isto, determinar Nr e a potência P com a figura para o líquido newtoniano. Claro está que os valores dos parâmetros n e K devem ser conhecidos ao longo do tempo, tendo em vista a sua variabilidade, conforme indicado na Figura 14.16. Particularmente, para um líquido pseudoplástico (n < 1), CALDERBANK; MOO-YOUNG 32 observaram que é possível definir uma relação entre a viscosidade aparente e as características reológicas do fluido, expressa por: 1 2Sj..t ' = ap 1 3 K ( n+ (8N) 1-n 4n )n para n < 1 (pseudoplástico) (14.58) o que significa: llap K (6n +2)n (14.59) =lONl-n - n- Desta forma, o número de Reynolds modificado obtém a forma: nP (. _n_ = D2N2i N Rem 0,1K 6n +2 )n (14.60) Na Figura 14.17 indica-se a curva obtida por esses autores (dados experimentais foram omitidos), a fim de se ter uma idéia a respeito da semelhança desta curva com a apresentada na Figura 14.10. lI 1Q•1 3 5 Figura 14.17 - Np=P/pN D; em função de NRem (Eq. l4.60) para líquido pseudoplástico (n < I), impelidor tipo dis32 . co com 6 pás planas. I .I 322 Agitação e aeração em biorreatores Resta ainda .c onsiderar a questão de líquidos não-newtonianos submetidos à aeração, quando então pode-se imaginar que ocorrerá uma redução na potência transferida pelo sistema de agitação, conforme já indicado anteriormente. Sob esse aspecto, cumpre ressaltar que a equação proposta por MICHEL; 28 MILLER (Eq. 14.47) é de utilidade para se procurar prever a potência transmitida a um líquido submetido à agitação e aeração. · Na Figura 14.18 indica-se a correlação sugerida por aqueles pesquisadores, no que se refere à agitação e aeração de líquidos newtonianos e não-newtonianos. É necessário mencionar que a Figura 14.18, na qual também foram omitidos os pontos experimentais, foi elaborada a partir dos dados fornecidos por 23 WANG et al. Esses autores indicam que, para o caso de líquidos newtonianos, a correlação proposta inclui resultados obtidos em reatores de volumes muito distintos, variando desde 3,5 litros até 42.000 litros, entre os quais, conforme se poderia esperar, ocorre uma razoável variação entre as relações geométricas . Inclusive, para os reatores de maiores dimensões, houve a utilização de 2 ou 3 turbinas nos sistemas de agitação . pg =0,545(P2ND?tQ0,56)0,48 (newtoniana) ~ pg =0 ,405(P2ND?tao.sa)o.44 • ( nao-newtoniano) 10 102 103 104 p2ND;3 /Qo~a 108 109 1010 W2s-1m3/(m3/s)Qss Figura 14.18 - Correlação do tipo da proposta por MICHEL; MILLER. 28 entre a potência transmitida sob aeração (Pg) e a grandeza P2ND;3/Q 0 '56 , para líquidos newtonianos e não-newtonianos (unidades no sistema S.I.). No entanto, a equação indicada na Figura 14.18 para o líquido newtoniana, difere da indicada pela Eq. 14.48, especialmente quanto à constante de proporcionalidade (0,706 na Eq. 14.48 e 0,545 na presente equação). Para o líquido não-newtoniana, os dados referem-se ao trabalho de 4 TAGUCHI et al./ relativos ao cultivo de Endomyces, o qual propicia o surgimento de líquido pseudoplástico. Saliente-se, novamente, que os resultados foram colhidos em reatores muito distintos, tanto em volume de reação (desde 20 até 30.000 litros), como em termos de relações geométricas. · Transferência de oxigênio em sistemas agitados e aerados 323 Apesar de se obter urna equação distinta da anterior, especialmente no que se refere à constante de proporcionalidade (agora atingindo o valor 0,405, vide Figura 14.18), os resultados experimentais são muito bem representados pela relação linear proposta. De qualquer maneira, fica bastante claro que urna equação com a estrutura proposta por MICHEL; MILLER 28 é de grande valia, apesar do inconveniente de não relacionar números adirnensionais, conforme já mencionado no item anterior . 14.5. 4 - Transferência de oxigênio Nos subitens anteriores houve a preocupação de analisar o problema da transferência de energia para um líquido newtoniano ou não-newtoniano, na presença ou ausência de aeração, procurando abordar as possibilidades de se prever esta transmissão de potência, dependendo do sistema de agitação e aeração existente, assim corno das características do próprio processo ferrnentativo. Toda essa preocupação reside principalmente na expectativa de que a agitação e a aeração permitam transferir oxigênio para o microrganismo, em condições de satisfazer suas necessidades metabólicas, ligadas às vias aeróbias, conforme discutido no item 14.4.3 (Eq. 14.19). Na verdade, resta agora quantificar a influência da transferência de potência ao líquido, assim corno das condições de aeração, na capacidade de transferência de oxigênio do sistema de agitação e aeração,-quantificação esta que permite o dimensionamento do sistema. As correlações indicadas a seguir são empíricas e, corno sempre, encerram o inconveniente de terem validade dentro das condições ensaiadas. Um dos trabalhos mais clássicos nessa direção foi o publicado_por COOPER et al} os quais, conforme já indicado no item 14.4.1, estudaram o transporte de oxigênio para unia solução de sulfito de sódio, quantificando-a na forma do coeficiente de absorção Kv. Além disso, mediram também a potência transferida sob as diferentes condições de agitação e aeração empregadas. Na Figura 14.19 indicam-se os resultados obtidos pelos mencionados autores, já arranjados segundo urna equação do tipo: (14.61) onde: K3 =constante que depende da geometria do sistema, assim corno do sistema de unídades empregado. 3 V= volume de líquido submetido à agitação e aeração (rn ) V5 =velocidade superficial do ar(= Q/S) (rn/s) Q =vazão de ar (rn 3 /s) S = rcD/ /4 a, 13 =constantes empíricas ""'----c----- ------- . --- --·-- -------- -.-- ----~------·-~------~------ ----------- 324 A€itação e aeração em biorreatores . ou seja, para os dados de COOPER et al. 9 obtém-se: j p K v = 25,301_ ~ )0,95 (V 5 ) (14.62) 0 67 ' desde que: Kv em mmolOdL · h · atm Pg/Vem W/m3 V 5 em m/s (HL/DT) = 1 Impelidor tipo disco ranhurado ("vaned disk") Kv (m moi/L.h.atm) 2~0--~-------------------------------------, 2000 1~ X 1000 10 (~ 20 30 40 50 60 70 80 /V)o.ss(Vs)o,67 Figura 14.19 - Dados de transferência de oxigênio (Kv) para solução de sulfrt:o de sódio, submetida a diferentes 9 • condições de agitação e aeração, com impelidor tipo disco ranhurado ("vaned disk"). Na Figura 14.19, os valores de Kv estão expressos em mmol0 2 /L ·h· atm, pois a constante de Henry para a água tem um valor próximo da unidade quando expressa em mmol0 2 /L · atm (Tabela 14.1). Nessas condições, pela Eq. 14.6, os valores de Kv e kLa (em h"1) são muito próximos, caso se possa admitir a situação de transferência de oxigênio para a água. Também, como se nota na Figura 14.19, há valores de Kv bastante elevados, o que sugere a possibilidade de transferências de oxigênio extremamente elevadas. Pa mesma forma, o expoente do termo Pg/V é muito elevado, o que confere a este termo uma importância muito relevante. Tais fatos podem ser atribuídos a alguns fatores, sendo um deles o estudq da transferência de oxigênio para uma solução de sulfito de sódio, isto é, para uma sohição salina relativamente concentrada, o que confere ao meio a característica de não ocorrer a coalescência de bolhas de ar, além de reduzir a tensão superficial do líquido (característica de soluções salinas), o que tende a facilitar o Transferência de oxigênio em sistemas agitados e aerados 325 transporte de oxigênio. Nessa condição, é sempre interessante transmitir elevadas potências ao líquido (elevadas freqüências de agitação do sistema de turbinas), a fim de obter bolhas de pequeno diâmetro, pois essas bolhas não coalescem com facilidade, o que explica o elevado expoente do termo Pg/V. Outro importante fator reside no emprego de um impelidor de disco ranhurado ("vaned disk"), o qual tem características bastante particulares e não parece encontrar maiores aplicaçõés em processos fermentativos. Claro está que um dado meio de cultura em processo de fermentação pode ser muito distinto de uma solução de sulfito de sódio, especialmente no que se refere à possibilidade de coalescência de bolhas de ar. Segundo KOSSEN; 00STERHUIS35 os valores dos expoentes da Eq. 14.61 sofrem também interferência da escala em que se está trabalhando, observando-se que, na medida em que se aumenta o tamanho do reator, estes valores aproximam-se daqueles obtidos em sistemas onde ocorre coalescência de bolhas. Uma possível explicação para isso reside no fato de que, para reatores de grandes dimensões, as bolhas têm um maior tempo de residência no líquido, ampliando a possibilidade de coalescerem. Na Tabela 14.3 indicam-se os válores colhidos na literatura, pelos mencionados autores, a fim de apoiar esta discussão. Tabela 14.3 - Expoentes a e ~da 35 Eq. l4.61 segundo a escala de trabalho. Volume do reator (m3) a ~ Sistema 0,005 0,95 0,67 não coalescente 0,5 0,6 - 0,7 0,67 50 0,4 - 0,5 0,50 0,002 - 2,6 0,4 0,50 coalescente Como se pode notar na Tabela 14.3, para as várias correlações, o expoente de V5 varia relativamente pouco, quando se compara com as variações do expoente do termo Pg/V. Outro aspecto que merece ·ser comentado é que a equação de COOPER apenas explícita ainterferência da potência transferida e da velocidade superficial (a qual inchii a vazão de aeração), deixando de explicitar outras interferências que são de importância. Obviamente, o fato de não explicitar não significa que a equação não contempla essas outras interferências. Por essa razão, surgiram na literatura outras correlações, igualmente desenvolvidas através do método do sulfito, como por exemplo a equação proposta por RICHARDS: 36 326 ·Agitação e aeração em biorreatores (14.63) onde: N =freqüência de agitação(s-1 ). Outro exemplo de correlação desse tipo, desenvolvida a partir de dados obtidos em reatores de 100 a 42.000 litros, pode ser escrita na forma :23 p K v = (p + qN i) ~ )0,77 [ (V s) o,67 (14.64) onde: Ni = número de turbinas no eixo de agitação p, q = constantes empíricas Conforme salientado, as correlações indicadas foram desenvolvidas para soluções de sulfito de sódio, as quais têm a característica de não apresentarem o problema da coalescência de bolhas, o que significa uma situação diversa em relação a um processo fermentativo . Correlações obtidas para processos fermentativos ainda são relativamente escassas na literatura, podendo-se mencionar o trabalho já citado de TAGUCHI et al.} 4 que obtiveram resultados durante o cultivo de Endomyces, cujo caldo torna-se pseudoplástico ao longo do processo. Na Figura 14.20 encontram-se os resultados experimentais obtidos pelos autores, dados estes elaborados a partir da figura proposta por WANG et al. 23 Conforme se pode observar, apesar de uma razoável dispersão dos dados experimentais, é possível imaginar uma correlação do tipo da equação de COOPER, ou seja: j p Kv =128,4..-l ~ )0,33 Ws)o,s6 • (14.65) onde: (Pg/V) em W /m 3 (V5) em m/s (Kv) em mmol0 2 /L ·h· atm Conforme esperado a partir da discussão anterior, observa-se que o expoente do termo Pg/V é bem inferior ao proposto por COOPER, enquanto que o expoente do termo V 5 é bastante próximo. De qualquer maneira, a correlação obtida é razoável, tendo em vista as diferentes escalas em que os resultados foram obtidos, salientando-se ainda a existência de diferentes relações geométricas entre estas escalas . . Na verdade, a equação de COOPER, apesar de intensamente empregada, é muito simples, tendo em vista o fenômeno que se está abordando, deixando de explicitar fatores importantes, conforme já mencionado. Além disso, convém salientar que essa equação também relaciona grandezas cujos valores numéricos dependem das unidades empregadas, pois não se trata de correlação entre 'grandezas adimensionais. · Transferência de oxigênio em sistemas agitados e aerados 327 Kv (mmoi/L·h·atm) 200.-----------------~--------------------, Kv ·128,49(Pg/V)o, 33(V5 )o, 56 200 ~ 100 100 + + X 20L + 60L 50 * 3.000 L O 30.000 L 0~--_x~~------~--~==~==~ 1,0 1,5 Figura 14.20 - Dados de transferência de oxigênio (Kv) em líquidos pseudoplásticos (cultivo de Endomyces), obti34 dos em reatores de 20 a 30.000 litros. Ainda nessa direção da busca de correlações entre a capacidade de transferência de oxigênio e as variáveis manipuláveis do sistema, porém obtidas durante um processo fermentativo, é necessário mencionar o trabalho de JURECIC et al./7 que cultivaram Bacillus licheniformis visando a produção do antibiótico bacitracina, cultivo este que resulta em um caldo pseudoplástico. Tais dados foram obtidos em reator piloto de 100 litros e em reator industrial de 67.500 litros. Nesse reator industrial, os autores dispunham da possibilidade de efetuar a medida da concentração de oxigênio dissolvido, a fim de efetuarem a determinação de kLa através do método dinâmico, em duas alturas da coluna líquida. Inicialmente, os autores buscaram correlacionar os resultados obtidos através de uma equação estilo COOPER, observando que, para a instalação piloto, o expoente de P8 /V era de 0,46 a 0,52, enquanto que o expoente de V5 era de 0,7, indicando, assim, uma intensa participação de ambas as parcelas. Já para a parte inferior do reator industrial o expoente de P8 /V era de 0,46, mas o expoente de V5 encontrado era extremamente baixo, indicando uma forte interferência da potência transmitida. Para a parte de cima do reator industrial, o expoente de P8 /V foi de 0,2 a 0,3 e um elevado valor para o expoente de V5, indicando uma maior participação do termo relativo à vazão de aeração, ou seja, a parte superior funcionaria mais como uma coluna de bolhas. A partir dessas conclusões, os autores propuseram a substituição da turbina superior por um impelidor tipo hélice, pois não haveria a necessidade de uma transferência de potência importante, mas apenas teria a função de evitar uma maior coalescência das bolhas, o que significaria uma razoável economia de energia. Além disso, os .resultados indicam também que os valores obtidos em uma instalação piloto devem ser empregados com a devida cautela. ··--·- ----.-----,-_. . ...,.........._--- ~.....,_ __ _ -:···-· :· - - --- .,... --__,....,.------ - -,...--- ---- --~-- .,, ~--- ~,.---- - ----- - ,- ---.- ----------- --- ···-- -- -- -- - ------~--- --:--·-- ·----- ------------ ------ ~- ----- ---- ·····--- - ------ - ----------,-----·-- - 328 Agitação e aeração em biorreatores Todos os dados obtidos por }URECIC et al. 37 para as plantas piloto e industrial, apesar de operarem em condiçõés muito distintas e não serem geometricamente semelhantes, foram ajustados de forma bastante razoável através da equação: (14.66) onde Pgm)' J~) [Q p(gv)2/3 v = Jl ap =viscosidade cinemática p J.l.ap conforme Eq. 14.59 ou 14.56 p =densidade do meio (kg/m3 ) g = aceleração da gravidade (m/ s 2) P8 m =potência transmitida por turbina (W) V m =volume de líquido dividido pelo número de impelidores (m3 ) Q=vazão de 'aeração (m3 /s) Se =número de Schmidt = Jlapl pD D = difusividade do oxigênio (m 2 I s) cr = tensão superficial do meio (N I m) crw = tensão superficial da água (N I m) A Eq. 14.66, oriunda da proposta por ZLOKARNIK,38 é um exemplo de correlação,entre as existentes na literatura, na qual se busca explicitar grandezas importantes para o fenômeno em estudo, além de relacionar números adimensionais. Claro está que a dificuldade reside em contar com os dados necessários, o que significa um trabalho experimental muito evoluído, além de equipamentos adequados para estas determinações. Ainda, o trabalho de JURECIC et al.'3-7 indica a p~ssibilidade até intuitiva de que um reator industrial não apresente um mesmo comportamento ao longo de todo o seu diâmetro e altura da coluna líquida. Isso leva à idéia de se equacionar o reator por compartimentos, coino indicado por OOSTERHUIS; KOSSEN39 e BADER40. Essa abordagem não será elaborada no presente texto. De qualquer maneira, observe-se que, na parte final deste capítulo, já houve certa abordagem de resultados obtidos em laboratório, plantas piloto e escala industrial, indicando a clara preocupação com a ampliação de escala, tema a ser elaborado no próximo capítulo. Corisiderações finais J 29 14.6 .- Considerações finais Sem dúvida, um processo biológico aeróbio tem como um dos problemas fundamentais a necessidade de um correto dimensionamento do sistema . de transferência de oxigênio, sem o qual esse processo dificilmente será competitivo. Ao que tudo indica, com freqüência, as críticas aos sistemas aeróbios parecem estar muito ligaqas a uma eficiência não adequada deste sistema de transferência de oxigênio. · · No presente capítulo buscou-se fornecer informações que permitam. efetuar esse dimensionamento. A partir da demanda em um dado instante (Q 02 X) é possível calcular as condições de agitação e aeração, representadas pela potência transferida ao líquido e a vazão de aeração (a qual define, juntamente com a geometria do sistema, a velocidade superficial V 5 ). Como deve ter ficado claro, houve uma particular preocupação com o reator agitado e aerado, o qual se constitui no reator mais empregado presen. temente, mas houve igualmente a preocupação com o estabelecimento dos fundamentos desta operação em estudo. Dessa forma, é possível imaginar que outros sistemas de transferência de oxigênio possam ser adequadamente analisados, observando-se os conceitos aqui desenvolvidos. Realmente, os reatores de colunas de bolhas, particularmente os reatores "air-lift", ganham importância e devem ser considerados como uma alternativa interessante para uma eficiente transferência de oxigênio. Finalmente, cumpre destacar que as ·correlações apontadas, apesar de, com alguma freqüência, serem válidas para reatores de distintas geometrias, devem ser utilizadas com a devida cautela. Na realidade, a melhor condição para t.Jm perfeito dimensionamento reside no levantamento de correlações com as condições específicas do processo fermentativo em desenvolvimento . Isso significa um trabalho experimental intenso, além de uma equipe de trabalho suficientemente preparada para esta tarefa. Mas, sem dúvida, constitui-se no caminho mais seguro para uma perfeita ampliaçãp de escala, objetivo maior de um trabalho de desenvolvimento. · · Referências bibliográficas (1) SCHUGERL, K.; LUCKE, J.; OELS, V. Bubble column bioreactors. In: GHOSE, T.K.; FIECHTER, A .; BLAKEBROUGH, N. Advances in biochemical engineering, vol. 7, N.Y., p .1-84, 1977. (2) CHISTI, Y.; MOO-YOUNG, M. Fermentation technology, bioprocessing, scale-up and manufacture. In: MOSES, V.; CAPE,R.E. Biotechnology: the science and the business. 2.Ed., Suíça, Harwood Academic Publishers, 1994, p .167-209. (3) BAILEY, J.E .; OLLIS, D.F. 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Na grande maioria dos processos, o desenvolvimento natural parte de uma escala de produção menor para uma escala maior. A variação de escala nesse sentido é conhecida como aumento de escala ou "scale-up". Caso contrário, ou seja, quando se está operando uma instalação industrial e se necessita elaborar ensaios em pequena escala, a fim de verificar certos aspectos tem-se a chamada redução de escala ou "scale-down". Dessa forma, o estudo da variação de escala de processos examina os problemas associados com a transposição de dados obtidos em equipamentos de escalas de laboratório e piloto, para a escala de produção industrial, e vice-versa. Na Figura 15.1 indicam-se as várias etapas relacionadas ao desenvolvimento de um processo produtivo, assim como as interações entre elas. Em indústrias onde a conversão da matéria-prima em produto se baseia numa .conversão biológica, entre todas as etapas que devem ser ampliadas, inclui-:se a etapa de biotransformação, realizada em fermentadores . Neste capítulo _serão apresentadas e discutidas as teorias relacionadas com a variação de escala de fermentadores ou biorreatores convencionais. Entende-se por biorreatores convencionais tanques providos de dispersar de gás e agitador mecânico, constituído de motor, eixo e impelidores . .. - - -,--- -- -- - · · · , ·· ···· - . - , · - o-•. · - -,. - ·•• -.---- . . --- - - - ···:···- - - -- - - .... ·~-,~-~- -~ --- -· - ~ - --'-- -;-:----·- ----- ·--- -------- ---- ·-·-- - - - - - - -- - - - -- · · · · · · - · --- -- • ·334 Variação de escala O desenvolvimento tradicional de processos fermentativos é usualmente executado em três estágios ou éscalas, a saber: - Escala de bancada - Escala piloto - Escala industrial :- - ------------~------------------------ - ------- --- ---~ : : ~-----• : · lnformaçao bibliográfica e pesquisa básica de bancada '---'---r----'_' _-_::.-./--"' Na o o ~-------------+ Viabilidade téénica e econômica preliminar o .. ... ------ -- ------ ----· o o Sim ~ ____ ..,. o :· -----------------'o Definição da o o o o escala piloto o ,. ____ ..,. o o o o 1----· Figura 15.1 - Etapas dei desenvolvimento de Úm processo produtivo: com as fases de obtenção de dados e instantes principais de tomadas de decisões. Na escala de bancada, tendo em vista sua maior flexibilidade e menor custo de operação, os dados básicos sobre o processo devem ser levantados dentro do maior nível de detalhes possível. Nessa escala são realizadas tarefas básicas, como a seleção do microrganismo e o desenvolvimento do meio de cultura ideal. São também escolhidas as condições de temperatura e pH para o processo, assim como a forma de operação dobiorreator. Caso o processo seja aeróbio, deve-se conhecer a velocidade de consumo de oxigênio, a fim de que se possa dimensionar ---- ·- ··- - ···----- ---~------- - ···- - ------------ - -.--- ----- -~- -- - - - Introdução 335 adequadamente o sistema de transferência de oxigênio, conforme indicado no capítulo anterior. Ainda, esse lE!vantamento de dados deve permitir a elaboração de modelos matemáticos, a fim de se poder visualizar o desempenho do processo em condições não pesquisadas experimentalmente, através da simulação do modelo, o que também auxilia o raciocínio nas etapas subseqüentes. Uma vez que se tenha acumulado suficiente experiência sobre o processo fermentativo em questão, ~ desde que se tenha atingido desempenho adequado do ponto de vista econômico, pretende-se ampliar a escala para um reator piloto. Como agora a operação é mais onerosa, deve-se manter constante grande parte das possíveis variáveis, como é o caso de se buscar operar na mesma temperatura, pH, forma de operação, meio de cultura, etc. Sobre esse conhecimento acumulado do processo, deve-se definir um determinado critério de ampliação de escala, ou seja, uma determinada grandeza que deverá ser a mesma na escala piloto em relação à empregada na escala de bancada. Como exemplo, pode-se pensar em manter constante o cisalhamento no reator, caso as células sejam sensíveis a ele, ou manter-se constante o coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio (kLa), no caso de cultivo de células aeróbias. Assim, com esse critério fixado, opera-se a escala piloto, objetivando, obviamente, a obtenção de igual desempenho que o observado na escala de bancada. Caso esse desempenho seja adequado, conclui-se que o critério fixado está correto e, em caso contrário, deve-se ensaiar um novo critério, novamente escolhido de acordo com o conhecimento do processo. Ainda, caso não se obtenha o sucesso esperado, algumas corridas devem ser feitas ha escala piloto, alterando-se ligeiramente as grandezas fixadas, a fim de melhorar o desempenho do processo, mas deve-se lembrar que agora os custos operacionais são mais elevados. Deve, portanto, ter ficado clara a idéia de que a operação de uma escala piloto objetiva especialmente o teste do critério de ampliação de escala e não o estudo da influência de fatores (pH, temperatura, composição de meio, etc.). Sabe-se, porém, que ao ampliar a escala de trabalho vai-se deixando a condição de reator homogêneo, freqüentemente observada na escala de bancada, e este importante fato também estará sendo observado. Por fim, a escala industrial, devido à própria dimensão, visa o lado econômico do processo, ou seja, a produção em alta escala. Na escala industrial, procura-se operar o fermentador sob condições similares às ajustadas na escala piloto, as quais permitiram a obtenção de um desempenho adequado do processo. A Figura 15.2 ilustra a seqüência de escalas que compõem o desenvolvimento de processos microbiológicos, lembrando que a estrutura apresentada na Figura 15.2 não é necessariamente rígida, podendo, em muitos casos, existir escalas intermediárias entre as escalas piloto e industrial. A existência de vários reatores piloto, de diferentes dimensões, na verdade depende do volume do reator industrial. De fato, no desenvolvimento de uma vacina bacteriana, na qual o reator final terá algo como algumas centenas de litros, a escala piloto ficará em torno de algumas dezenas .de litros. Já para a produção de uma enzima ou antibiótico, para os quais o reator final deverá ter centenas de milhares de litros, é freqüente se contar com pilotos da ordem milhares de litros e dezenas de milhares de litros . .........__.___,_____ ,, -·-·-··· -··-·····-··--·-· ... ·---··· - -·- ·-··· · · --------... .. - - --~-····-~-- ~ ____ ...........,--· -- --···· ...... __,,~ --. --- ........._........----·------.- - -. , 336 Variação de escala É claro que esses reatores intermediários não serão apenas utilizados para o desenvolvimento inicial, mas serão empregados como pré-fermentadores (preparo do inóculo) para o reator principal, ou para estudos em menor escala quando houver, por exemplo, a necessidade de ensaiar novo microrganismo ou novo lote de matéria-prima. Industrial Piloto 1 Bancada :~. ··..·. 200-400 mL 1 - 10 L 50 - 200 - 500 L Figura I 5.2 - Escalas de trabalho no desenvolvimento de processos fenmentativos. Portanto, o grande problema da variação de escala está exatamente em reproduzir, na escala industrial, condições ambientais responsáveis pelo bom desempenho do sistema, obtidas nas de bancada e piloto. • Particularmente, alguns fatores físicos como o gprau de mistura, consumo de potência, grau de cisalhamento de células, velocidade de transferência de oxigênio, entre outros, dependem da escala e, por esta razão, devem ser tratados com maior cuidado, buscando-se então a definição dos mencionados critérios de ampliação de escala. Saliente-se, desde já, que uma vez fixado um dado critério, todos os demais serão distintos nas diferentes escalas, como ficará evidenciado mais adiante. I5.2 - Critérios para a ampliação de escala O procedimento usual de uma ampliação de escala com base nos critérios de ampliação baseia-se em, mantendo-se a semelhança geométrica na escala maior, selecionar o critério e, a partir daí, encontrar as novas condições de operação na nova escala que, supostamente reproduziriam as condições encontradas na escala menor. A Figura 15.3 ilustra o princípio da ampliação de escala e a seleção do valor do critério que maximizao desempenho do processo. Critérios para a ampliação de escala 337 Valor selecionado Critério de aumento de escala Figura 15.3 - Princípio de aumento de escala e seleção do valor do critério fixado. A seguir estão listados alguns critérios de ampliação de escala normalmente recomendados para fermentadores ou biorreatores convencionais. São eles: • constância da potência no sistema não aerado por unidade de volume de meio (P /V); • constância do coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio (kLa); • constância da velocidade na extremidade do impelidor (v1;p); • constância do tempo de mistura (tm); • constância da capacidade de bombeamento do impelidor (FL/V); • constância do número de Reynolds CN'Re); • constância da pressão parcial ou concentração de 0 2 dissolvido( C). O critério de ampliação de escala a ser fixado varia de processo para processo, pois depende das especificidades de cada um. EINSELE 1 menciona os critérios de ampliação de escala mais utilizados pelas indústrias de fermentação na Europa. A Tabela 15.1 ilustra esses dados. Tabela 15.1 - - Critérios de ampliação de escala mais utilizados na Europa: 1 Critério de ampliação Quantidade de indústrias (%) kLa 30 P/V 30 Vtip 20 c 20 0LDSHUE 2 cita alguns princípios básicos que devem ser considerados no aumento de escala de reatores ou fermentadores tipo tanques agitados: 1. É importante identificar qual ou quais propriedades são . importantes para otimizar a operação de um sistema agitado. Entre essas propriedades, pode- 338 · Variação de esCala mos citar a transferência de massa (kLa), a capacidade de bombeamento (FL/V), condições de cisalharnento, etc. Urna vez identificadas essas propriedades, o sistema pode ser submetido ao aumento de escala, desde que essas propriedades sejam mantidas na nova escala, o que certamente resultará em variações em outras variáveis de menor importância, lembrando sempre que a semelhança geométrica deve ser mantida. 2. As maiores diferenças entre grandes e pequenos tanques são que os grandes tanques apresentam um tempo de mistura (tm) maior e condição de cisalharnento máximo (na extremidade do irnpelidor) maior. 3. Para reações químicas homogêneas, o consumo de potência por unidade de volume (P 1V) deve ser usado corno "critério de aumento de escala". 4. No aumento de escala de sistemas bifásicos (gás-líquido), onde há transferência de massa entre as fases, corno no caso de bioprocessos aeróbios, o coeficiente volumétrico de transferência de massa (kLa) deve ser preferencialmente usado corno critério de aumento de escala. Em geral, o kLa é relacionado com P /V. 5. Valores típicos da razão entre o diâmetro do irnpelidor e o diâmetro do tanque (DJDT), para ferrnentadores, estão na faixa entre 0,33 e 0,40. Utilizando-se grandes irnpelidores, urna mistura adequada deve ser proporcionada por urna freqüência de rotação (N) que não d;mifique fisicamente as células. Alguns fermentadores não são, às vezes, operados em condições ótimas de transferência de oxigênio devido à sensibilidade de alguns microrganismos ao cisalhamento. Com base nesse apanhado geral, serão apresentados os critérios de ampliação de escala de ferrnentadores, e serão vistas as decorrências nas variáveis freqüência de rotação (N) e diâmetro do irnpelidor (Di), quando se fixa um determinado critério de ampliação de escala. Mantendo-se a semelhança geométrica e procedendo-se ao aumento de escala de ferrnentadores, utilizando-se os critérios de aumento escala, isto resultará em relações englobando as variáveis freqüência de rotação do sistema de agitação (N) e o diâmetro do irnpelidor (Di), entre as escalas em estudo. Na apresentação das relações NDi entre as diferentes escalas, o índice 1 indica a escala de partida, normalmente a escala menor ou de bancada, e o índice 2 denota a nova escala piloto ou industrial. 15.2. I - Constância da potência por unidade de volume de meio (PN) Até meados do século, o critério de ampliação de escala de ferrnentadores mais utilizado em bioprOcessos, onde se incluem os de produção de álcool e de ácidos orgânicos, foi o consumo de potência pelo sistema não aerado por unidade de volume de meio (P /V}. 3 Esse critério é, ainda hoje, amplamente utilizado, competindo apenas com o coeficiente volumétrico de transferência de 0 2 (kLa). Conforme visto no Capítulo 14, em tanques cilíndricos com chicanas, agitados por irnpelidores tipo turbina de pás planas, nos regimes de agitação laminar e 4 de transição (NRe<l0 ), tem-se que: . Np =f(·1 J · NRe (15.1) Critérios para a ampliação de escala 3 39 onde: Np: número de potência(= P /(N3D/p)) (adimensional) NRe: número de Reynolds (= NDi 2 p/f.l) (adimensional) P: potência transmitida na agitação (W) N: freqüência de rotação (rps ou s·1) p: densidade do fluido (kg · m· 3 ) f.!: viscosidade do flJido (kg · m· 1 • s·1) D;: diâmetro do impelidor (m) Logo: p a fl N Drp pNDf 3 Sendo as propriedades físicas (p e f.l) constantes no aumento de escala, tem-se que: ou (15.2) No regime turbulento (NR. > 104), NP é constante<4>, logo: p N 3 5 = constante (15.3) D; p Portanto: (15.4) O volume do tanque (V) é dado por: D2 v= 1t____1_ H L 4 onde: DT: diâmetro do tanque (m) H L: altura da coluna de líquido (m) Como se pretende, na ampliação de escala, manter semelhança geométrica, e sabendo-se que (Tabela 14.3- Capítulo 14): logo, (15.5) Dividindo-se as equações 15.2 e 15.4 pela Eq. 15.5, tem-se que: p a N2 v --+regime laminar (15.6) 340 Variação de escala .f va N 3 D? l -Hegime turbulento · (15.7) Na ampliação de uma escala 1 para uma escala 2, mantendo-se como critério P I V constante, tem-se, para o regime turbulento de agitação: e, portanto: N13D2ll· = .N3D2 2 lz · !l' D·]2/3 ou N 2 =N 1 [ (15.8) v:: Como um exemplo da utilização desse critério, a Figura 15.4 ilustra um aumento de escala para o processo de produção de penicilina baseado no critério PN constante (GADEN, informações colhidas em W ANG et aC). j j l I II E 3 n. (.) •+-- ! Valor escolhido para o aumento de escala ~ I !) 0,0 2,0 4,0 • kW/m 3 Figura I 5.4 - Produção de penicilina (C p) em função da potência fomecida em diferentes escalas. 3 1 i Na Figura 15.4 nota-se um fato interessante, comum em estudos de aumento de escala. Um valor próximo de 2,0 kW /m 3 para o critério PN, obtido a partir de ensaios em escala de bancada (5 L), foi o escolhido para realizar o aumento de escala. Pode-se notar que, nessa escala, valores razoavelmente maiores para o critério PN não causam uma maior produção de penicilina. Portanto, esse é o valor de partida escolhido para aumento de escala desse processo. No entanto, deve-se ter em mente que, em escalas maiores, devem ser realizados ensaios em condições próximas ao valor do critério escolhido na escala de bancada, uma vez que este procedimento pode culminar num desempenho ainda melhor do processo. Nesse exemplo, o valor de PN em torno de 2,0 kW /m 3 proporciona um desempenho similar para o processo, nas três escalas envolvidas. Já, valores de PN razoavelmente maiores, embora praticamente não alterem o desempenho do processo na escala Critérios para a ampliação de escala 341 de bancada, resultam em razoáveis melhorias, em termos de produção de penicilina, nas escalas piloto (760 L) e industrial (38m 3) . 15.2.2 - Constância do coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio (kLa) Em bioprocessos ql;le envolvem alta demanda de oxigênio, como os de produção de antibióticos e tármacos em geral, o coeficiente volumétrico de transferência de oxigênio (kLa) mostra-se como o critério ideal para ampliação de escala. Conforme visto no Capítulo 14, de acordo com COOPER et al., 5 pode-se escrever: (Vs)B (15.9) onde: kLa : coeficiente volumétrico de transferência de 0 2 (h-1 ) P g: potência transmitida ao fluido sob aeração (W) V : volume de fluido (m3) V5 : velocidade superficial (m · s-1 ) sendo a velocidade superficial, V 5 , dada pela equação: Q -_4Q 5 nDi Vs = - = - - onde Q: vazão volumétrica de ar (m 3 . s-1) S: área da secção transversal do tanque (nDi I 4) (m 2 ) DT: diâmetro do tanque (m) Cabe aqui ressaltar que correlações deste tipo podem ser utilizadas na ampliação de escala, desde que sejam válidas para as escalas envolvidas. Normalmente, em cultivos com fungos ou bactérias filamentosas que geram caldos não-newtonianos, devem ser utilizadas correlações mais complexas que levem em consideração variações nas propriedades físicas do caldo (vide capítulo anterior). Na ampliação de uma escala 1 para uma escala 2, mantendo-se o kLa constante, tem-se que: logo, (15.10) O consumo de potência para o sistema não aerado (P) se relaciona com o consumo de potência para o sistema aerado (Pg) através do número de aeração 342 Variação de escala (N.), ou através de correlação do tipo da proposta por MICHEL; MILLER6 conforme abordado no capítulo anterior (Eq. 14.47), ou seja: Pg a ( Sendo V a f" p~~~~ (15.11) Df e, para o regime turbulento de agitação, P a N 3 Df, logo: (15.12) e, portanto: (15.13) Sendo, Vs 4Q = - --e 2 Dr a Di tem-se: 1tDr V 5 aQ - (15.14) D~I Assim, substituindo-se as equações 15.13 e 15.14 na equação 15.10, tem-se que: (15.15) • e, portanto, 2 B-2,85 A Di, N2 =N1 ( o.,, J 3,15 A 0,25 A-B ( ~:) 3,15 A (15.16) A relação Q1 I Q2 pode ser obtida de critérios de ampliação de escala para a aeração, que serão abordados posteriormente. Quanto à escolha dos valores dos coeficientes A e B, estes devem ser escolhidos de acordo com o tamanho do tanque, e do tipo de caldo que o processo gera (coalescente ou não coalescentevide Tabela 14.3- Capítulo 1410). Vale aqui salientar que deve-se buscar obter, em escala de bancada, correlações de kLa com as dimensões do tanque e com variáveis de processo, como por exemplo, as constantes A e B para osistema em desenvolvimento, a fim de que se tenha maior segurança na ampliação de escala do bioprocesso. Critérios para a ampliação de escala 343 As Figuras 15.5 e 15.6 ilustram aumentos de escala para os processos de produção de estreptomicina e vitamina B12 baseados no critério kLa constante, onde kLa = Kv · H, sendo Kv o coeficiente de absorção de 0 2 e H a constante de Henry (Capítulo 14). 1,0 o 5L "" 57m3 +-- Valor escolhido para o aumento de escala o 5 10 KvP · 104 (moi 0 2 • mL-1 · h-1) Figura 15.5 - Ampliação de escala de um processo de produção de estreptomicina utilizando-se como critério, kLa 7 1 1 constante (KARROWeta/. ) (Kv: coeficiente de absorção de 0 2 (moi 0 2 • ml- ·h-I • atm - ) , p: pressão do arde entrada (atm)). 5,0 . - - - - - - , - - - - - - r - - - - , , - - - - - - - , 6.1 / I :::;E 3::. "' rii I . 2 ' 5 r- / I I o 0-~ // !----~ o ! ! ' ! >o . o-- ...... _o "" - ~.6 Õ'-, D ' lo - ü 0,0 '-----~L.,__ __..JL.,_L.,__ ___..JL.,__ ___..J o Figura 15.6 - Ampliaçã~ de escala de um processo deprodução de vitamina B12 , utilizando-se como critério kLa constante (BARTHOLOMEW ). 15.2.3 - Constância da velocidade na extremidade do impelidor (v"p) Um outro critério importante na ampliação de escala de fermentadores é a velocidade na extremidade do impelidor (vtip), que se relaciona com a freqüência de rotação (N) e com o diâmetro do impelidor (D;), da forma que segue: ·---~····--· ·-· , ··· -- - ---· .- -c- - · -~ •· ··-,.- -- --- -- --- -:-- - -- - - ~-· --·.··- -~~ -~--- -- -- _..._____________ _ 344 Variação de escala (15.17) A velocidade na extremidade do impelidor determina a velocidade de cisalhamento máxima (Ymáx), que por sua vez tem forte influência no diâmetro médio de bolhas, no tamanho dos aglomerados celulares e, principalmente, na viabilidade celular, como é o caso de células sensíveis ao cisalhamento como células de tecidos animal e vegetal. Pela sua importância, muitas companhias de fermentação utilizam esse critério na ampliação de escala de fermentadores. Em geral, uma faixa satisfatória de vtip para a ampliação de escala de cultivos envolvendo microrganismos, situa-se entre 250-500 cm/s. 3 De acordo com a Eq. 15.17, No procedimento de ampliação de uma escala 1 para uma escala 2, mantendo-se vtip constante, tem-se que: portanto, (15.18) ou 15.2.4 - Constância do tempo de mistura(~) Uma característica comum observada na ampliação de escala de fermentadores é que fluidos agitados em grandes tanques exibem características não uniformes. Em pequenos fermentadores (<500 L), principalmente na agitaoção de fluidos de baixa viscosidade, a mistura é praticamente instantânea. Já, em grandes tanques (>5.000 L), a mistura se apresenta deficiente, fato este ilustrado por perfis, tanto de pH quanto de oxigênio dissolvido, observados ao longo da altura desses tanques. O tempo de mistura Um), definido como o período de tempo necessário para a completa homogeneização de um fluido agitado, quando é adicionada uma pequena quantidade de um fluido distinto, sob o ponto de vista prático pode ser utilizado como uma medida do grau de mistura ou de turbulência num vaso agitado. NORWOOD; METZNER9 relacionaram o fator tempo de mistura () com o número de Reynolds (NRe) para sistemas agitados com um impelidor tipo turbina padrão de pás planas, sendo a grandeza definida como: = t m (N D~)2/3 gl/6 1 1 H112 D3/2 L o:/2 T (15.19) Critérios para a ampliação de escala 345 onde <1>: fator tempo de mistura (adimensional) tm: tempo de mistura (s) N: freqüência de rotação (rps ou s-1) D;: diâmetro do impelidor (m) g: aceleração da gravidade (m · s-2) HL: altura de coluna de fluido (m) D 1 : diâmetro do tanque (m) Um esboço da curva experimental de em função de NRe é ilustrado pela Figura 15.7, que mostra que para NRe >lOs, apresenta um valor constante em torno de 4,2. 102 10 103 10 105 · NRe Figura 15.7 - Fator tempo de mistura () em função do número de Reynolds (N Re) (NORWOOD; METZNER\ Para valores de NRe >lOs, e sabendo-se que HL e D 1 são proporcionais a D;, tem-se: ou Na ampliação de uma escala 1 para uma escala 2, mantendo-se o tm constante, tem-se que: (~·~r =(~l r ou (15.20) 15.2.5 - Constância da capacidade de bombeÇJ.mento do impelidor (FL /V) No interior de um tanque agitado, onde existe um bom grau de mistura, existe também um tempo de circulação característico (te). A capacidade de 346 Variação de escala bombeamento (FL/V), dada pela relação entre a vazão de circulação do fluido no interior do tanque (FL) e o volume de líquido (V), expressa esse tempo de circulação Uc ~ 1/FL). Seria como se as pás do(s) impelidor(es) funcionassem como pás de uma bomba centrífuga, impondo ao fluido uma determinada quantidade de movimento. Sendo, FL a NDf e, sabendo-se que V a Di e DT a Di, logo: ND~I D~I e, portanto: FL a N (15.21) v Na translação de uma escala 1 para uma escala 2, mantendo-se (FL/V) constante, tem-se que: logo, (15.22) 15.2.6 - Constância do número de Reynolds (N Re) • Outro critério de ampliação de escala diretamente ligado ao grau de agitação ou de mistura no interior de tanques agitados, é o número de Reynolds (NRe>· Sendo NRe dado por: N Re _pN D? - ll tem-se, pois p e 1.1 são constantes na ampliação de escala. Logo, na ampliação de uma escala 1 para uma escala 2, tem-se que: e, portanto, -----· -- -~ --· ---- 347 Critérios para a ampliação de escala (15.23) ou Quando se utilizam os critérios de ampliação de escala expostos anteriormente, as equações obtidas, na maioria dos casos, apresentam relações entre freqüências de rotação (N) e' dimensões (D;) para as duas escalas envolvidas. Essas equações expressam, apenas as condições de "agitação" da nova escala, mas não trazem informações sobre as novas condições de "aeração", quando se trata de bioprocessos aeróbios. Nesses casos; os "critérios ou regras de aeração", normalmente recornendados,11 são os que seguem: - número de aeração (NA) constante -velocidade superficial de ar (V5 ) constante - vazão específica de ar (<l>.r) constante Para o critério número de aeração (NA) constante, sendo, (14.46) tem-se que: ~ -- ------ ------- (15.24) ou A velocidade superficial de ar (V5 ) é definida corno: 4Q Vs = - nD~ e, sendo, Dy a D;, tem-se: V5 a Q (15.14) D~1 Portanto, para o critério velocidade superficial (V5) constante, tem-se que: (2.25) No terceiro critério de aeração, a vazão específica de ar (<!>.r) é definida corno: <l>ar(vvm) = var V meio tempo - Q V (15.26) 348 · Variação de escala Portanto, para o critério vazão específica de ar que V a tem-se que: . · Df, (~ar) constante, sabendo-se (15.27) Na seqüência, serão ilustradas algumas comparações entre os critérios de ampliação de escala apresentados. ,, ij :I li 15.3 - Comparações entre critérios para a ampliação de escala If ![ li Como um exemplo de utilização dos "critérios de ampliação de escala", a Tabela 15.2 ilustra as novas condições de agitação numa ampliação de escala de 10 a 5.000 L de um bioprocesso aeróbio de produção de uma determinada enzima, para vários critérios de ampliação escolhidos. As condições de agitação e aeração na escala de bancada foram, respectivamente, 700 rpm e 0,3 vvm, sendo que durante a ampliação foi eleito como critério de aeração, vazão específica de ar (~ar) constante. lI'i Tabela 15.2 - Variação da freqüência de rotação (N) numa ampliação de escala (V 1= lO L- V2 =5000 L- $a,=0,3 wm) il !I r[ 'i I I I Critério de ampliação de escala N (rpm) (V= 5.000 L) P/V 175,9 kta (A = 0,5 e B = 0,5) 91,3 cisalhamento (utip) 88,2 tm * 1174,9 FtfV 700 NRe 11,1 • Observando-se a Tabela 15.2, pode-se notar alguns aspectos interessantes. Por exemplo, a escolha do critério kLa constante, praticamente não se diferencia da escolha de vtip constante, mostrando que, qualquer um desses critérios poderia ser escolhido como base para a ampliação de escala desse processo, sem detrimento do outro. Pode-se notar, ainda, que a escolha de qualquer um dos critérios, tm ou Ft!V constante, recairia em condições absurdas de agitação para uma escala de 5.000 L. Quando se realiza uma ampliação de escala com base num dado critério, mantendo-se a semelhança geométrica, outras variáveis importantes do processo - Comparações entre critérios para a ampliação de escala 349 também variam na ampliação. Para alguns processos específicos, variações bruscas em outra variável pode até inviabilizar o aumento de escala nas condições preestabelecidas. Um exemplo disso, é a ampliação de escala de um processo que envolva células sensíveis ao cisalhamento. Nesse caso, quando se elege um critério de ampliação de escala, deve haver a preocupação com a variável relativa às novas condições de cisalhamento, qual seja, o produto ND;. Escolhido um dado critério, caso as novas condições de cisalhamento não sejam satisfatórias, deve-se eleger outro critério de ampliação oti, então, ajustar novas condições de agitação e aeração que satisfaçam a essas duas variáveis. A Tabela 15.3 ilustra as alterações em outros critérios ou variáveis do processo, quando se elege um dado critério de ampliação de escala. Nessa ilustração, escolheu-se como escala de partida um fermentador de 60 L, e como escala final um fermentador de 7,5 m 3, tendo-se, portanto, uma ampliação de escala de 125 vezes o volume inicial. 3 ) Tabela I5.3 - Relação entre variáveis numa ampliação de escala (V 1 = 60 L- V2 = 7,5 m Relações entre variáveis PN Fd V ND; NRe tm* N2 / Nl 0,34 1 0,2 0,04 1,5 (Fd2/(Fd1 42,7 125 25 5 187 P2/Pl 125 3125 25 0,2 10449 (P / Vh/(P!Vh 1 25 0,2 0,0016 83,6 (FdVh / (FdVh 0,34 1 0,2 0,04 1,5 (ND;h/(ND;h 1,7 5 1 0,2 7,5 (NReh / (NReh 8,6 25 5 1 37,4 Umh / (tmh 2,7 1,3 3,8 0,089 1 Critérios para ampliação de escala Pelos dados da Tabela 15.3, para o aumento de volume escolhido (125 vezes), a variável consumo de potência (P) mostra-se muito sensível aos critérios tm e Fd V constantes, resultando num aumento de mais de 10,000 vezes quando se escolhe o critério tm constante. Quanto às condições de cisalhamento (ND;), quando se elege um critério comum de ampliação de escala, como P I V, há um aumento de 70% nas condições de cisalhamento, chegando mesmo a um aumento de 7,5 vezes, quando tm consta~te venha a ser o critério escolhido. Esses exemplos mostram que na ampliação de escala de fermentadores, apesar de toda a teoria envolvida, deve-se confiar" no bom senso para a escolha do melhor critério de ampliação, o que faz da ampliação de escala uma verdadeira arte. --- ---· ------...- -- - - -~-~--··· - ·--··-- -···---~-~---~------~ ---·---- - -~------c------------- --:-'------ :r i! !: 350 Variação de escala Como discutido nos exemplos anteriores, deve-se, portanto, atentar para todas as variáveis durante uma ampliação de escala, sendo que tabelas do estilo da Tabela 15.5, apresentam-se como uma ferramenta de muita utili~ade, a fim de estudos comparativos. Assim sendo, é interessante detalhar como se pode construir tabelas desse estilo, o que será feito a seguir para dois casos tomados como exemplo. Variação de NOi (ou vtip) mantendo-se P/V constante Para o critério P /V constante, tem-se que: N 13 O~1 1 = N 23 O 12~ (15.8) A Eq. 15.8 pode ser modificada na forma: N~ O . N 2 0i =Nf O . N 10i t, ~ · l·~ ( v"P ), ( vlip ), ou (15.28) A Eq. 15.8 pode também ser escrita na forma que segue: o. N 1 = _ 1_ , N 2 ( o.t, )2/3 (15.8) • Logo, substituindo-se na Eq. 15.28, tem-se que: (15.29) ou, sabendo-se que v (l o; 1 (15.30) ou Assim, na Tabela 15.3, admitindo-se o critério [(P /Vh/(P /V)tl (NOJ 2 (NOJ 1 =( 7.500 ) 60 119 =1, 7 = 1, resulta: Redução de escala 35 I Variação de NRe mantendo-se FJV constante Para o critério FL/V constante, sabe-se que: (15.22) e, sendo: N Re "" N D~1 N Pode-se alterar a Eq. 15.22 para: ou Logo, tem-se que: . (15.31) ou Ou seja, na Tabela 15.3, tomando-se o critério [(FdV) 2 /(FL/V) 1] = 1, resulta: =( 7.500) =25 2/3 (NReh (NReh 60 As demais relações, podem ser obtidas de forma análoga. 15.4 - Redução de escala Sempre que se menciona variação de escala, pensa-se em ampliação de escala. No entanto, a operação de redução de escala é muito freqüente nas indústrias que se baseiam em processos fermentativos. Em uma instalação já em operação, lembrando-se que os conhecimentos básicos da área avançam com muita rapidez, há sempre a necessidade da operação de pequenos reatores, a fim de que sejam incorporados novos conceitos ao processo em operação. Isso reafirma o que foi mencionado no item 15.1, ou seja, o continuado emprego de reatores de menor porte na tarefa de pesquisa na empresa. Outros aspectos que exigem a operação em menor escala são, entre outros, a introdução de uma nova linhagem de microrganismo responsável pelo processo fermentativo e ensaios de novos lotes de matéria-prima. De fato, jamais se emprega uma nova linhagem, que tenha sido isolada ou que tenha sido obtida por mutação, diretamente na escala industrial. Na verdade, 3 52 . Variação de escala uma nova linhagem deve ser exaustivamente ensaiada em escalas de laboratório e piloto, a fim de se adequar as condições de operação às características deste novo material biológico. Da mesma forma, como freqüentemente se empregam meios de cultura naturais (farinhas diversas, água de maceração de milho, melaço, etc.), cuja composição química é mal conhecida, há sempre a necessidade de ensaiar novos lotes desta rp.atéria-prima em reatores de menores dimensões, visando observar o desempenho do processofermentativo para evitar surpresas nos reatores industriais. Deve-se lembrar, ainda, que a obtenção de resultados não satisfatórios na escala industrial pode ser devida a fatores pouco imaginados, como é o caso de uma distinta destruição de nutrientes durante as esterilizações descontínuas do meio de cultura na escala industrial e nas escalas de bancada ou piloto, em virtude de perfis distintos de temperatura nestas diferentes escalas de trabalho. Essa possibilidade pode ser verificada, efetuando-se ensaios típicos de redução de escala. Para tal, pode-se esterilizar o meio de cultura no reator industrial, finda a qual colhe-se amostras com assepsia para a operação em reatores de bancada, efetuando-se a inoculação com o mesmo inóculo empregado na escala industrial. Dessa forma, acompanha-se o desempenho do processo em ambas as escalas e, em paralelo, observa-se o desempenho em reator de bancada cujo meio tenha sido esterilizado in loco. Tal operação em igualdade de condições na pequena escala, tendo-se como única variável a esterilização nas distintas escalas, permite observar a influência da operação de esterilização no comportamento do processo fermentativo. Essas observações, ao lado de outras que poderiam ser descritas, tornam clara a idéia da necessidade de uma continuada evolução do processo, pois a situação considerada ótima em um dado instante pode deixar de sê-lo com a evolução dos conhecimentos. IS.S - Considerações finais • Conforme já salientado, é freqüente dizer-se que a tarefa de ampliar escala é uma "arte". Isso é assim, em virtude da necessidade de se contar com muita experiência específica, relativamente ao processo fermentativo em desenvolvimento. Essa experiência só pode ser obtida através da observação de resultados experimentais obtidos em escala de bancada. Deve-se lembrar que a obtenção de dados em pequena escala significa um custo relativamente reduzido, quando comparado com o custo da construção e operação de uma instalação piloto ou industrial. Assim sendo, a decisão sobre a construção e operação de uma instalação piloto deve ser tomada após se contar com certo grau de segurança, báseado no conhecimento do processo. No entanto, deve-se também lembrar que não existe a disponibilidade de um tempo infinito para se tomar essa decisão, assim como nunca se contará com o total conhecimento do processo, em virtude do tempo que isto iria demandar, perdendo-se a oportunidade de lançar um novo produto no mercado. Conclui-se, portanto, que um certo risco sempre estará presente, o que acentua o aspecto "arte", acima mencionado. Referências Bibliográficas 353 Um ponto que também deve ser comentado é a freqüente heterogeneidade do reator industrial de grande porte. Isso significa que o microrganismo poderá ficar exposto a valores diferentes de pH, temperatura, concentração de oxigênio dissolvido, etc., ao longo da altura do fermentador, fato este difícil de ser previsto em escalas menores. Ainda, quando se pensa em ampliar escala, imagina-se o emprego de reatores geometricamente semelhantes. No entanto, essa semelhança geométrica é difícil de ser mantida entre as várias escalas, pois isto pode levar a reatores com dimensões que poderiam, por exemplo, dificultar o seu transporte para a instalação industrial. Assim sendo, dependendo do volume necessário para uma dada produtividade, deve-se pensar em projetar um certo número de reatores com dimensões mais razoáveis, do que um único, ou poucos reatores de grandes dimensões, que exigiriam geometrias especiais. Na verdade, deve-se fazer vários exercícios e, dentro da experiência com a construção e operação desses biorreatores, escolher a situação mais conveniente. Referências Bibliográficas (1) EINSELE, A. Scaling-up bioreactors. Process Biochem., vol. 13, p. 13-14, 1978. (2) OLDSHUE, J.Y. Current trends in mixer scale-up techniques. In: ULBRECHT, J.J.; PATTERSON, G.K. Mixing of liquids by mechanical agitation, Nova York, Gordon and Breach Science Publishers, p.309-42, 1985. (3) WANG, D.I.C.; COONEY, C.L.; DEMAIN, A.L.; DUNNILL, P.; HUMPHREY, A.E.; LILLY, M.D. Fermentation and enzyme technology. Nova York, John Willey & Sons, 1979. (4) RUSHTON, J.H.; COSTICH, E.W.; EVERETT, H.J. Power characteristics of mixing impellers. Part li. Chem. Eng. Progress, vol. 46, p.467-76, 1950. (5) COOPE~, C.M.; FERNSTROM, G.A.; MILLER, S.A. Performance of agitated gas-liquid contactors. Ind. Eng. Chem., vol. 36, n° 6, p.5Q4-09, 1944. (6) MICHEL, B.J.; MILLER, S.A. Power requirements of gas-liquid agitated systems. A.I.Ch.E. J., vol. 8, n° 2, p.262-66, 1962. (7) KARROW, E.O.; BARTHOLOMEW, W.H.; SFAT, M.R. Oxygen transfer and agitation in submerged fermentations. 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Devemos distinguir essencialmente dois tipos de processos fermentativos realizados através de células imobilizadas. O primeiro é aquele que utiliza uma ou algumas das enzimas contidas nas células, não havendo nece?sidade da existência de coenzimas (ATP, NADH e outro~) e vias anabólicas presentes na replicação celular. Em outras palavras, as células não necessitam estar vivas quando imobilizadas; somente deve estar ativo o sistema enzimático envolvido na conversão bioquímica requerida. Exemplo marcante desse processo é a produção industrial de ácido málico, ácido aspártico e o xarope de frutose de milho (High Fructose Corn Syrup). 1 O segundo tipo de processo que utiliza célulasimobilizadas é aquele em que se impõe a necessidade de manter a viabilidade celular, uma vez que os produtos a serem formados requerem múltiplos passos de transformações, regeneração de coenzimas, presença de cadeia respiratória, vias metabólicas geradoras de intermediários e outros mecanismos inerentes às células vivas. As principais vantagens dos sistemas com células imobilizadas citadas na literatura são as seguintes: a) possibilidade de utilização de altas concentrações celulares no volume reacional, implicando em maiores velocidades de processamento; b) operação de sistemas contínuos à vazão específica de alimentação acima da velocidade específica máxima de crescimento, !lmáx' característica da célula não imobilizada; 356 Reatores com células imobilizadas c) eliminação de problemáticos reciclos externos de células através de uso de sedimentadores, filtros é centrífugas; d) provável obtenção ·de maiores fatores de conversão de substrato ao produto desejado; e) possibilidade de utilização de .projeto de biorreatores mais adequados à · cinética do sistema biológico utilizado; f) maior proteção. ao sistema biológico em relação ao estresse ambiental, ocasionado por elevadas concentrações de substratos, pH e cisalhamento. Além disso, esse sistema é único no sentido de possibilitar a utilização de fermentação submersa, para o cultivo de linhagens de células de mamíferos dependentes de ancoragem em um suporte para seu desenvolvimento adequado. Este capítulo tem como objetivo abordar os principais aspectos relacionados com os processos que utilizam o sistema de células imobilizadas que detêm sua · capacidade vital. Informações sobre os processos que utilizam células não viáveis podem ser encontradas em literatura.2' 3 16.2 - Métodos de imobilização A imobilização é geralmente conseguida através do contato de um material utilizado para a imobilização com as células vivas que se pretende imobilizar, sob condições ambientais controladas. O material utilizado para a imobilização é denominado suporte. As principais características de um suporte para a imobilização de células vivas são as seguintes: a) não toxidez às células; b) alta capacidade de retenção; c) resistência ao ataque químico e microbiano; d) pouca sensibilidade às possíveis solicitações mecânicas, seja de compressão por peso, de tensões de cisalhamento ou eventuais pressões internas e externas de gases; e) alta difusividade de substratos e produtos. • Os suportes mais utilizados na imobilização de células vivas estão apresentados na Tabela 16.1. Deve-se destacar que existe possibilidade de se utilizar combinaÇão desses materiais para produção de novas matrizes imobilizadoras e de se proceder à modificação da superfície dos suportes, com a finalidade de se introduzir grupos funcionais que serão responsáveis pela imobilização. Existem basicamente três métodos de imobilização de células em suportes, a saber, adsorção, ligação covalente e envolvimento. Os mecanismos de interação célula-suporte são diferenciados para cada uma dessas técnicas. 16.2.1 - Adsorção Segundo MESSING/ as forças de interação entre a superfície celular e a superfície do suporte no método da adsorção são complexas e envolvem múltiplos tipos de formação de ligações. Deve-se destacar aqui as interações eletrostáticas - ·- -:-- Métodos de imobilização 357 entre cargas opostas de parede celular e superfície do suporte, a formação de ligações iônicas entre grupos amínicos e carboxílicos da parede celular e um grupo reativo da superfície do suporte e a formação de ligações covalentes parciais entre grupos amínicos da parede celular e grupo hidroxila ou silano (SiO-) da superfície do suporte. Considera-se, então, adsorção a adesão de células em suportes que não foram especialmente funcionalizados para a .ocorrência de ligação covalente. A principal limitação da técnica reside no fato de que existe influência bastante acentuada das condições ambientais promovidas pelo meio de cultivo na capacidade de retenção das células no suporte, mormente as relacionadas com concentração iônica, pH e idade da população celular que se deseja imobilizar. Tabela 16.1 - Materiais utilizados na produção de suportes para imobilização de células vivas Polímeros naturais Polímeros sintéticos Materiais inorgânicos Alginato -Poliacrilamida Alumina K-carragenana Cloreto de polivinila Sílica Agar Poliestireno Zircônia Pectina Poliuretano Vidro Celulose Polietileno gli~ol Diatomita Colágeno L .- li 1' .I Vermiculita Dextrana c_/;~ ro..~ ~ ;-'~ ~l~~t~.i ij -. ... r.~t • .tí . r:.-f!~· ·t "'lr~-~~t ....... :e ;L.: ';_., ~. rt~ - l. :r·::.nf ,' .. ~~- .ç\ ; ~j ., j.j i lfl' i t ..!,f;,ir·-.. " i~-·; ..... Os materiais mais comumente utilizados na adsorção são os inorgânicos e os polímeros sintéticos mostrados na Tabela 16.1. Deve-se salientar que esses materiais têm sido submetidos a tratamentos superficiais, visando a obtenção de estruturas macroporosas, com o intuito de se incrementar a capacidade de retenção do suporte. A Tabela 16.2 dá alguns exemplos ilustrativos de suportes comerciais utilizados no método de adsorção e suas principais características. 16.2.2 - Ligação covalente No método da ligação covalente, os suportes são especialmente funcionalizados para conter um grupamento químico, que será responsável pela imobilização da célula ao suporte. A literatura descreve várias técnicas que se utilizam desse princípio. Uma das mais utilizadas é a silanização de esferas de vidro, seguida de reação com glutaraldeído. Nessa metodologia, esferas de vidro de cerca de 100 a 500 micra são primeiramente tratadas com o reagente y-aminopropil-trietoxisilano (APTS) . Posteriormente, o grupamento amina resultante reage com glutaraldeído, de forma a se produzir uma estrutura espacial que possui um grupamento -HC=O altamente reativo (Figura 16.1). A interação da célula com o su:Eorte se dá pela ligação da carbonila do suporte com aminas daparede celular. '4 · - -- · :-··- ······-- - --- , - - --. --·---. ~ -. -.,.,. ···;·------- --..,_-.--- ---- -,.,....- ---- ~· -.-......,..,...---- .. --- - i! ii ' 358 Reatores com células imobilizadas Tabela 16.2 - Suportes comerciais utilizados no método de adsorção Nome comercial Material Diâmetro (mm) Densidade (g/mL) Célula ; Cytodex Dextrana 0,20 1,04 Mamífero Cytopore Celulose 0,23 1,03 Mamífero microrganismo Cytoline Polietileno e sílica 2,0 a 2,5 1,03 a 1,3 Mamífero microrganismo Siran Vidro poroso 1,0 a 2,0 1,6 Microrgailismo A grande limitação dessa metodologia para imobilização de células vivas é a potencial toxicidade do sistema, conferida pela presença do glutaraldeído. 16.2.3 - Envolvimento O envolvimento é o mais utilizado dos métodos de imobilização de células vivas pela sua facilidade, baixíssima toxidez e alta capacidade de retenção celular. A técnica consiste no confinamento físico de uma população celular em uma matriz polimérica formadora de um gel hidrofílico. Os poros da matriz formada são menores que as células contidas em seu interior. Em contato com o meio de cultura, há o estabelecimento de um fluxo de substratos para dentro das partículas de gel, onde são consumidos pela população imobilizada. Os produtos formados no interior da matriz difundem-:se através do gele se acumulam no meio de cultura. Os materiais mais utilizados para produção das partículas de gel são os polímeros naturais agar, k-carragenana, alginato e pectina. A gelificação do primeiro é realizada simplesmente pelo abaixamento de temperatura e, dos últimos, através da ação de um cátion mono ou bivalente, como K+ ou Ca 2+. O método consiste ein se preparar inicialmente uma solução do polímero em água a 1 a 4% em pes(). Em seguida suspende-se nessa solução uma população celular previamente crescida. Procede-se então ao gotejamento da suspensão células-polímero em uma solução aquosa de CaC1 2 ou KCI 0,05 a 0,5 M, sob agitação branda. As partículas formadas têm diâmetro de 0,5 a 5 mm e densidade populacional até cerca de 250 mg de biomassa seca g-1 de matriz. 5 A Figura 16.2 ilustra o procedimento. O gel de poliacrilamida é utilizado para o envolvimento das células vivas de uma maneira diferenciada. Uma solução aquosa do monômero acrilamida é pré~polimerizada em presença de um catalisador orgânico que possui um radical amina. A cultura celular é então suspensa na solução do polímero, efetuando-se a seguir a adição de um agente para produzir as ligações cruzadas responsáveis pela gelificação da matriz. Posteriormente, a matriz obtida é granulada e utilizada nos biorreatores. O detalhamento dessa metodologia foi . descrito por FREEMANN. 6 ----'- --~ ---~· -- --------.-------;--- - ~- - - -- · - - - --- -- -~ .. Métodos de imobilização 359 o Suporte -O-Si-C-C-C-NH2 ; O I Resultante do tratamento de APTS e suporte o H O o li 11 Suporte -O-Si - C - C - C - N- C-C- C - C - C o I H Resultante do tratamento do aminoalquil-suporte com glutaraldeldo Figura 16.1 - Preparação de suporte para imobilização de células por ligação covalente. A principal desvantagem da técnica de imobilização por envolvimento é a limitação imposta pela difusão intraparticular d~substratos e produtos metabólicos. O tamanho da partícula, a difusividade das espécies através da matriz polimérica e a concentração celular na partícula devem ser otimizadas, no sentido de se minimizar ·esses efeitos. Polissacarldeo + células o Partlculas contendo células imobilizadas o Soluçao de KCI ou CaCI 2 Agitador magnético Figura 16.2 - Imobilização de células por envolvimento em gel hidrofílico induzida por CaH e K+. ~---·-· - - ··--. --- - ----·· ·-- ··· ·· ·-- -····----.----- ---- -...----.·,------------ -- -- - -~ --- - ------;-·-- ---- - - - -.-- -- - - ----------.---·-··-· 3 60 . Reatores com células imobilizadas 16.3 · - Tipos de biorreatores empregados O confinamento celular, ensejado pelas técnicas de imobilização, permite a utilização de biorreatores de configuração bastante diferenciadas do tradicional fermentador do tipo tanque continuamente agitado (STR). A maior parte dos biorreatores estudados para sistemas com células imobilizadas, constituem-se de colunas operadas continuamente, contendo um leito fixo ou fluidizado das partículas com as células imobilizadas. 8 16.3. 1 - Leito fixo O leito fixo disposto verticalmente tem sido o mais utilizado (Fig.l6.3a). Normalmente a coluna é esterilizada e empacotada com as partículas de gel hidrofílico que contêm as células imobilizadas, no caso da utilização da técnica de envolvimento. Quando o método escolhido é a adsorção ou ligação covalente, após o empacotamento e eventual esterilização da coluna, faz-se circular através do leito uma suspensão celular previamente cultivada, para a promoção de sua adesão às partículas. Para prevenir a compactação do leito formado pelas partículas de gel hidrofílico, tem sido proposta a utilização de colunas de seção circular ou retangular munidas de chicanas transversais/ ou de colunas em estágios. 10 Os leitos fixos de partículas imobilizadas, particularmente por adsorção, apresentam também dificuldades operacionais · quando em operação contínua de longa duração, devido ao sobrecrescimento da biomassa celular dentro do leito fixo, ocasionando o bloqueio físico do sistema, com a formação de caminhos preferenciais e conseqüente queda de conversão. Alguns autores têm procurado contornar o problema, através da admissão periódica ao sistema de meio de cultura limitado em algum nutriente, 11 ou da passagem fceqüente de uma corrente gasosa (N 2 ou C02 ), visando a remoção do excesso de biomassa · formada. 12 Nos processos biológicos onde a evolução de C0 2 é intensa, produzindo aumentos indesejáveis de pressão e formação de caminhos preferenciais, tem sido proposta a utilização do leito fixo horizontal (Fig. 16.3b). Esse arranjo tem proporcionado desempenhos mais satisfatórios para esse tipo de processo. A colocação de chicanas nesse sistema também tem sido útil para a minimização de problemas de retromistura ("backmixing") do fluido que escoa através do leito. A eliminação desse fenômeno é particularmente útil em processos fermentativos que possuam inibição pelo produto.11 O controle dos principais parâmetros de processo (pH, oxigênio dissolvido e temperatura) obviamente é bastante complicado de se efetuar no leito fixo. Uma formulação bastante original desse tipo de biorreator é a utilização de um leito fixo de fluxo paralelo, formado de placas de gel de resina de polietilenoglicol fotopolimerizada (Fig. 16.3c) proposta por NOJIMA; YAMADA. 7 - ·.- - -.. - - .------- --- ---- ···--······ - - ~ ----- - -- ··----- -----..,. - -----·----~ . -. Tipos de biorreatores empregados 36 I Os autores sustentam que esse arranjo sobrepuja vários dos problemas encontrados com os leitos fixos convencionais, quais sejam, entupimento por sobrecrescimento da biomassa, necessidade de remoção do C02 formado e formação de caminhos preferenciais. O controle das principais variáveis de processo tende a ser também mais fácil de se efetuar. O leito fixo proposto opera de forma vertical e a manufatura das placas com as células imobilizadas, segundo os autores, pode ser efetivada em larga escala e de forma asséptica. 16.3.2 - Leito fluidizado Outro tipo de biorreator bastante estudado é o leito fluidizado (ou expandido) de partículas de células imobilizadas por adsorção ou envolvimento. A literatura descreve configurações diversas desse tipo de fermentador. Saída de gás Saída de gás Produto Substratato Produto (b) (a) Substrato Saída de gás e produto (c) Substrato Figura 16.3 - (a) Leito fixo vertical; (b) Leito fixo horizontal; (c) Leito fixo de fluxo paralelo. 362 Reatores com células imobilizadas Basicamente o biorreator constitui-se de uma coluna vertical de seção circular, dentro da qual as partículas com as células imobilizadas são carregadas, até cerca de 70% do volume útil do fermentador, e fluidizadas ou expandidas através de um dos seguintes mecanismos: a) introdução na base da coluna de ar atmosférico ou <;ie um gás inerte (N2 ou C02 ); b) reciclo parcial do efluente da coluna; c) movimentação interna do fluido promovida por agitação mecânica (Fig. 16.4a, b, c) . Eventualmente a expansão do leito pode ser promovida pelo própio ~ás carbônico 1 13 formado durante o processo, como é o caso da fermentação alcoólica. ' · Sarda de gás + \ U o 7Produto C)uO . Oooo ~oo (a) c& Substrato ~00 -~º-º·-~ 1 I Safdade gás Produto 1: • Gás inerte Safdade gás Produto Substrato 1: agitador Figura 16.4 - (a) Leitos flu idizados por reciclo, (b) gás e (c) agitador. . ·· - - -- -- ·- - - - .-·------ ------- ~·-. ------- -- - - ---:-·-·-- · ··- - ---,------- -- .. .. - --· . -· .. - ----" 363 Aspectos relativos ao transporte de massa As principais dificuldades encontradas nos leitos fixos (remoção de gases e do excesso de biomassa, dificuldade de controle de variáveis de processo) são facilmente contornáveis nos leitos fluidizados. É possível afirmar-se que, de uma maneira geral, os sistemas de leito fluidizado possuem escoamento mais próximo do tipo mistura completa ("backmixing") e os de leito fixo, do tipo pistonado ("plugflow"). Assim, biorreatores de leito fluidizado em série pofiem eventualmente ser utilizados para aqueles processos que se beneficiem de um escoamento mais próximo do tipo pistonado, como é o caso da fermentação alcoólica. 14 16.4 - Aspectos relativos ao transporte de massa 16.4.1 - Efeitos difusivos Um dos aspectos mais importantes dos sistemas com células imobilizadas é o efeito que as limitações de transporte de massa de reagentes e produtos podem impor sobre a cinética das transformações bioquímicas realizadas pelas partículas. Essas resistências são devidas ao filme de fluido que se forma ao redor das partículas (difusão interparticular) e ao transporte condutivo através das partículas (difusão intraparticular), como mostra a Figura 16.5. Assim, a eficiência (rl) de uma partícula que contém células imobilizadas é definida como sendo a relação entre a velocidade real de reação, rP' e a velocidade reacional máxima possível na ausência de qualquer limitação de transporte de massa, r máx, dado por : · · (16.1) A difusão interparticular depende das condições hidrodinâmicas do fluido ao redor das partículas, a saber, velocidade do fluido, diâmetro da partícula e propriedades físicas do fluido como viscosidade e densidade. A transferência de massa de uma molécula (substrato ou produto) através do filme de fluido que se forma ao redor de uma partícula é diretamente proporcional à diferença de concentração dessa molécula noseio do fluido e na superfície externa da matriz imobilizadora. O coeficiente de transporte de massa,nesse caso contido no adimensional denominado número de Sherwood (Sh=kx O I c o. ), está relacionado com o número de Reynolds (Re=O v p/J.t) e com o número de Schmidt (Sc=J.l/ p O.) através de uma equação da seguinte forma: Sh=a Ren b Sem (16.2) onde: O = diâmetro da partícula (m) v = velocidade do fluido (m.s-1) p = densidade do fluido (kg.m-3) J.l =viscosidade do fluido (kg.m- 1 .s-1 ) kx = coeficiente de transferência de massa através do filme (moles m· 2 .s-1) o. = difusividade do substratoS (m2 .s-1 ) c = concentração molar (moles m '3) a, n, m = constantes da equação (16.2). ~----- ---- ····· · • - -.--- -.--------- - ------- --- --------·------ -------.-.~:- --- - -.- ~ ---- ---- . -·- -· -- -- ---- .... ". --------- ------ - - --·----------- . . --- - 364 ·Reatores com células imobilizadas .r. Substratos difundindo para dentro Filme de fluido Produtos difundindo para fora Figura I6.5 - Efeito difusivo em partícula de células imobilizadas de diâmetro D. Assim, o aumento do coeficiente de transporte de massa, kx, através do filme de fluido é proporcional ao aumento do número de Reynolds do sistema. Esse efeito pode ser conseguido através do aumento da velocidade do fluido, v, no caso de reatores de leito fixo e aument0 da velocidade de agitação ou da vazão de reciclo, no caso dos reatores de leito fluidizado. Nesse caso, rP~rmáx e 16 11~1< ' ), e a velocidade de reação se torna a máxima possível rmáx · A difusão· intraparticular depende da concentração celular, da estrutura e do tamanho da matriz que contém as células imobilizadas, e do tamanho das moléculas que se difundem através das partículas. A transferência de massa de uma molécula (substrato ou produto) através de uma partícula formada pela matriz imobilizadora e pelas células imobilizadas é diretamente proporcional ao grqdiente da concentração dessa molécula na superfície externa da matriz imobilizadora e no centro da partícula (eq. 16.3). O coeficiente de transporte de massa nesse caso é dado pela difusividade efetiva D. 1, e, segundo KLEIN e VORLOP/ 7 está relacionado com outras propriedades das partículas, segundo a eq. 16.3: 15 N s =-Def (ds / dr) • (16.3) onde: N 5 =fluxo molar de S através da partícula (moles m-2.s-1) D. 1 = difusividade efetiva de S através da partícula (m 2.s-1 ) dS/dR =gradiente de concentração de S. O valor de D.1 deve ser medido experimentalmente, e metodologias são apresentadas na literatura para sua determinação em matrizes de gel. 17 No caso da difusão intraparticular, a eficiência da reação 11 está correlacionada com um grupamento adimensional, denominado módulo de Thiele, , que é proporcional à razão da velocidade real da reação e à velocidade de difusão do substrato ou do produto através da partícula. A literatura descreve vários tipos desse adimensional, dependendo do tipo da cinética do processo fermentativo em questão e da geometria da partícula com as células imobilizadas. 17' 18' 19l Um exemplo que ilustra o desenvolvimento matemático do efeito difusivo e suas implicações na cinética do processo fermentativo pode ser encontrado em Aspectos relativos ao transporte de massa 365 LUONG/ 0 que estudou a fermentação alcoólica contínua em leito fixo realizado por células de Zymomonas mobilis imobilizadas em partículas de gel hidrofílico de K -carragenana . O meio de cultura empregado tinha glicose como substrato limitante. Nesse caso, estabeleceu-se uma relação entre a eficiência da reação 11 e o módulo de Thiele , ilustrada pela Figura 16.6. O módulo de Thiele era dado por: (16.4) onde: R = raio da partícula (m) K. = constante de limitação do substrato (kg.m-3) b =razão da área superficial da partícula e seu volume (m2 .m-3 ) Na Figura 16.6 St é a concentração da glicose no seio do fluido. O autor afirmou, que numa situação de concentração de substrato (glicose) igual a 10 g/L, os efeitos difusivos eram desprezíveis se o diâmetro da partícula fosse igual ou menor que 1 mm para a concentração de células na matriz de 276 g/L. Nesse caso, o fator de efetividade calculado, levando-se em conta a eq. 16.4 e a Figura 16.6, era de 0,95. Assim, a velocidade real do sistema se aproximava à velocidade máxima possível r má x · Por outro lado, partículas que apresentavam concentração celular de 27,6 g/L possuíam velocidade máxima possível inferior ao caso anterior. Nessa situação, a utilização de partículas de diâmetro maior (3 mm) não ocasionava efeitos difusivos •, • 20 a prec1a ve1s. 16.4.2 - Modelagem matemática A modelagem matemática de sistemas com células imobilizadas é b.astante complexa. Para a descrição dos reatores que se utilizam desse sistema, aos efeitos de inibição por substratos e produtos de metabolismo que são tradicionalmente adicionados à cinética clássica proposta por Monod, devem ser acrescidos também efeitos físicos. Esses últimos estão relacionados com a transferência de massa de substratos e produtos, com o desvio de comportamento ideal do fluxo de fluido através dos reatores e com a mudança da fisiologia das células imobilizadas. Ess.e fatores são normalmente descritos por sistemas de equações diferenciais parciais, que podem ser resolvidas numericamente (método de colocação ortogonal e método de Runge-Kutta de quarta ordem, por exemplo), utilizando-se computador. Está além do escopo deste capítulo a exploração dessa metodologia, e a literatura possui vários exemplos da técnica .21 ' 22 ' 23 · ·-- ~ --.-----....,--·--:·- -.----.'---- --------.-:-- --- ~~- -·----·· · -- ·-·· 366 Reatores com células imobilizadas 5 10 20 50 70 100 <l> Figura 16.6 - Relação de TI e para Z. mobilis imobilizada em K -carragenana em fermentação alcoólica contínua, para 51 = I Og/L. 20 16.5 - Processos que utilizam célUlas imobilizadas Provavelmente o mais antigo dos processos que faz uso das células imobilizadas remonta ao século passado, e se constitui na fermentação acética de uma corrente de vinho, que é reciclada através de um leito fixo formado de suporte, o qual abriga uma população nativa de microrganismos acidogênicos. 8 Nos últimos anos, a partir de um trabalho pioneiro de imobilização de células microbianas e de organelas em gel hidrofílico de alginato de cálcib, descrito por KIRSTEN, BUCKE/4 o tema ganhou novo impulso e uma grande quantidade de informações, abrangendo virtualmente todos os produtos de síntese realizadas ~or células livres, tem sido também experimentadas por células imobilizadas. 5' 26 O objetivo deste capítulo não é fazer uma revisão extensa do tema, mas tão-somente descrever alguns exemplos de aplicação, para apontar as potencialidades do método. • 16.5. I - Produção de etano! A fermentação alcoólica contínua de carboidratos por leveduras e bactérias tem sido, entre os sistemas imobilizados de células vivas, o mais estudado nos últimos anos. A técnica de imobilização mais empregada é a de envolvimento em gel hidrofílico onde se destacam as matrizes formadas por alginato, K-carragenana e pectina. Resinas de troca iônica e polimerizadas por fotorradiação também têm obtido sucesso. Em virtualmente todos esses sistemas, altas concentrações de células excedendo 100 g de biomassa/litro de reator são alcançadas, com elevados valores de fator de conversão de carboidratos a etanol é consumo da fonte de carbono quase que completo. Produtividades, em etanol de cerca 20 a 30 g/litro de reator h para Saccharomyces cerevisiae imobilizada em gel hidrofílico e de até 100 g/litro de reator h para Zymomonas mobilis imobilizada em resina de troca iônica, são apontadas na literatura. 11 ..... Processos que utilizam células imobilizadas 361 Reatores de leito fixo (vertical, horizontal ou de fluxo paralelo) e leito fluidizado têm sido utilizados com sucesso, e vários são os dispositivos empregados para superar os inconvenientes inerentes a esse processo, ligados principalmente à enorme produção de gás carbônico associado ao etanoL . Pelo menos um processo, que utiliza levedura imobilizada em gel de alginato de cálcio em reatores de leito fluidizado, desenvolvido pela Kyowa Hakko Kogyo Co. do Japão, foi demonstrado em escala piloto27 (Fig. 16.7) . A imobilização das células foi realizada através do gotejamento da suspensão de levedura e alginato de sódio dentro dos reatores, que eram previamente preenchidos com uma solução de cloreto de cálcio. O sistema operava com a alimentação contínua de uma solução de melaço diluída a uma concentração de carboidratos de 150 g/L, alimentada na . base do primeiro fermentador. A fluidização dos leitos era alcançada devido à grande quantidade de co2 formado . A produtividade do sistema foi de 20 g de etanol/litro de reator h, a uma concentração de etanol no caldo fermentado de 68 g/L e rendimento da fermentação de 95% do valor teórico. Afirma-se que a planta piloto produzindo 12 m 3 de etanol por dia operou, nas condições acima descritas, por 6 meses, sem perda de estabilidade. Essa característica foi conseguida, segundo os autores, graças à adição de esteróides na matriz de imobilização e pela aeração adequada dos reatores, o que proporcionou uma população de leveduras imobilizadas altamente viável. Os valores de produtividade em etanol e de rendimento da fermentação são superiores aos processos de produção de etanol do tipo batelada alimentada (processo Melle-Boinot), hoje operando em nosso país, que são respectivamente da ordem de 6 g de etanol/litro de reator h e 86%.28 · . Levedura Alginato e esteróides Caldo para destilaria Melaço A9ua ar Figura 16.7 - Fluxograma simplificado para produção de etano! utilizando levedura imobilizada.27 ·· ·--;---·- -.----,---·-··,· - - --~------ -------~ ··------ ......... ----..~.. ~~"":-· "··--------···---·--------. -. ··---- -- -- ... ____ _, ____ ---- --- - ------- -·- --· ··- 368 Reatores com células imobilizadas 16.5.2 - Produção de antibióticos · A produção de antibióticos com células imobilizadas também tem sido objeto de estudo. 25 ' 26 Uma das abordagens mais interessantes nesse tema é a descrita por ARCURI et al. 29 do Centro de Pesquisas da companhia Merck, Sharp & Dohme dos Estados Unidos. Nesse trabalho, estudou-se a síntese do antibiótico thienamicina por células de Streptomyces cattleya imobilizada em partículas de celite, de granulometria de 60 a 80 mesh. A imobilização se dava através do contato de uma suspensão celular, previamente crescida em um meio de cultura completo, na qual se adicionava assepticamente uma massa de celite esterilizada, que era posteriormente transferida para um reator constituído de um leito fluidizado, como apresentado na Figura 16.3a. Meio de cultura completo era então continuamente introduzido pela base da coluna, enquanto o efluente livre das partículas de celite era retirado pelo topo da coluna, de maneira a se manter constante o nível do sistema. A fluidização do leito era conseguida através do reciclo parcial do efluente para a base da coluna, e a aeração era feita através de dispersor localizado na base da coluna. Após cerca de 4 a 5 dias, o reciclo, a aeração e a alimentação eram descontinuados, as células imobilizadas eram decantadas, e o meio de cultura para crescimento celular era retirado do sistema. Esse meio era, em seguida, substituído por um outro meio de cultura limitado em vitaminas e sais minerais, com a finalidade de promover a síntese do antibiótico. As operações de reciclo e aeração eram então reiniciadas e, a cada 24 horas, um novo ciclo dessas operacães, denominado pelos autores de "sangria e alimentação", era refeito. Análise dos dados indicou que foi possível separar a fase de crescimento da biomassa e a fase de produção do antibiótico, através da manipulação de meios de cultura diferenciados e da forma de operação do leito fluidizado. As partículas de celite, após a fase de crescimento, possuíam cerca de 45% de sua superfície recoberta de biomassa de Streptomyces, firmemente imobilizada a uma densidade de cerca de 240 mg de células/g de suporte, comparável aos métodos de imobilização por gel hidrofílico. A estabilidade do sistema era bastante grande, uma vez que os autores descreveram eperações contínuas por mais que 30 dias, produzindo o antibiótico. É importante salientar que a estabilidade do sistema para produção desse antibiótico, do mesmo modo que para a produção de etanol, pôde ser conseguida através da manipulação de variáveis controláveis de processo, na qual se destaca o manejo de meios de cultura. 16.5.3 - Tratamento de resíduos O tratamento de resíduos é visto como uma das áreas mais significativas de aplicação para os processos com células imobilizadas. A maior parte dos conceitos desenvolvidos são baseados em populações bacterianas não definidas, que formam um filme de biomassa sobre superfícies sólidas, retidas dentro de leitos fixos ou fluidizados. Processos de nitrificação e denitrificacão, 8 e produção de metano a partir de resíduos, encontram aplicaçao nesses s1s t emas. 8'30 - o Processos que utilizam células imobilizadas 369 Recentemente, o uso de populações microbianas, especializadas na degradação de compostos recalcitrantes (xenobióticos), tem encontrado na imobilização celular uma técnica extremamente útil para o projeto e operação de biorreatores de alto desempenho .31 ' 32 Esses compostos se constituem principalmente de resíduos de processamentos químicos, como os organoclorados e os heteroaromáticos. Devido à cinética des's e tipo de processo ser altamente inibitória, em relação à concentração desses substratos, reatores completamente agitados são preferíveis aos do tipo escoamento pistonado. Assim, leitos fluidizados com reciclo parcial de efluente, e/ ou introdução de corrente gasosa, permitem aos sistemas operarem à máxima velocidade de conversão. Suportes de escolha para esse tipo de processo incluem partículas esféricas 31 de vidro poroso e blocos de espuma de poliuretano. 30' 32 16.5.4 - Produção de metabólitos utilizando células animais O cultivo de células animais em fermentadores é realizado atualmente para produção de diversas substâncias, como vacinas, a enzima proteolítica uroquinase, anticorpos monoclonais e interferon. 18 Alguns tipos de células animais necessitam estar imobilizadas em suporte sólido compatível, para que possam se desenvolver. A "ancoragem" ou imobilização de céltilas animais em suportes tem merecido atenção nos últimos anos. · Um dos métodos mais bem-sucedidos, na imobilização de hibridomas para a produção de anticorpos monoclonais em larga escala, foi o proposto por LIMe MOSS. 33 O método se constitui numa variação do envolvimento celular em gel de alginato de cálcio. De fato, as células são submetidas ao envolvimento em gel, como apresenta<i() na Figura 16.2. Um recobrimento posterior da superfície das partículas com polilisina é efetuado, seguido da dissolução e remoção da matriz de alginato. Durante a promoção do crescimento, as células ocupam todo o espaço interno da partícula, formando uma densa população ativa. Células animais também têm sido envolvidas em gel de polissacarídeos}4 e adsorvidas em microssuportes especialmente projetados para essa finalidade. 35 Os reatores utilizados têm sido o leito fluidizado} 5 (Fig. 16.4b) e o expandido34 (Fig. 16.4a), para a produção de anticorpos monoclonais. 16.5.5 - Utilização de microrganismos geneticamente modificados Microrganismos geneticamente modificados têm propiciado oportunidades extremamente interessantes para a produção industrial .de metabólitos e de proteínas especializadas. O desempenho dos biorreatores, que fazem uso de microrganismos que albergam plasmídeos exógenos, é entretanto largamente influenciado pelo caráter instável destes microrganismos. BARBOTIN 36 sugere que dois tipos de instabilidade podem ocorrer: estrutural, devido à instabilidade do própio plasmídeo transferido e segregacional, devido à insuficiência de 37O Reatores com células imobilizadas transferência do plasmídeo para as células filhas durante a divisão celular. Nesse caso, devido às diferenças de velocidade específica de crescimento das células transformadas e da população livre do plasmídeo, essas últimas têm capacidade de rapidamente se tornar a população dominante, implicando em perda irreversível da capacidade produtiva do biorreator. A utilização da pressão de seleção, via linhagens transformadas, que levam marca de resistência a um antibiótico como método de prevenção da predominância de linhagens não transformadas, é uma possibilidade factível em nível de bancada. Todavia, devido ao elevado custo desse insumo, o método tende a ser irrealista em escala industrial. A imobilização de células microbianas pelo método de envolvimento, tem sido reportada em literatura na produção de importantes produtos proporcionados pela engenharia genética de microrganismos. A Tabela 16.3, adaptada de BARBOTIN/ 6 ilustra algumas dessas aplicações. Tabela 16.3 - Imobilização de microrganismos geneticamente modificados. Plasmídeos Produto da clonagem B subtilis BS 273 pPCB6 Proinsulina Agarose E. coli HB 101 pKBF 367-11 P-lactamase K-carragenana Levedura BJ 1991 p336/1 Somatomedina C Alginato S. cerevisiae SEY 2202 pYCB 115 < ... a-2-lnterferon Linhagens Matriz ' I '· ,·-J( .~j'~-:-;.$·~.:.-~Jnt· o o .'~-- .;-:.:,, :cc\ :.;,.;--.: .. Alginato . ~ .."· ._,; ' ... -1 16.6 - Conclusões Nos últimos anos, a partir de trabalhos pioneiros na década de 70 sobre a imobilização de células microbianas e de organelas em gel hidrofílico.desenvolvidos por vários autores, essa tecnologia vem ganhando importância crescente. Ela vem contribuindo para um nova abordagem dos sistemas biológicos, gerando uma família inteiramente diferente de biorreatores de alto desempenho. Sua característica mais diferenciada é o confinamento físico de elevadas densidades celulares em uma dada região do sistema, independente dos fluxos de substratos e produtos, propiciando sua reutilização ilimitada. A completa compreensão e domínio dessa tecnologia, mormente no que se refere à fisiologia das células imobilizadas e sua relação com as propriedades físicas das matrizes de imobilização, ainda está para ser completamente elucidada, razão pela qual a aplicação desse sistema está circunscrita ainda a poucos casos em escala comercial. As potencialidades do método, entretanto, estão bastante bem demonstradas para a biossíntese de virtualmente qualquer classe de metabólito celular. É provável que, em um futuro próximo, produtos de alto valor agregado, bem como a utilização de microrganismos especializados no tratamento de resíduos de difícil biodegradação, devam encontrar nessa técnica uma alternativa de processo bastante interessante. Referências bibliográficas J7I Referências bibliográficas (1) KLEI, H .E. Commercial successes with immobilized microbial cells and enzymes, Seminário de Hidrólise Enzimática de Biomassa, Maringá, 1983. . (2) MESSING, R.A. Immobilizaton by adsortion and inorganic bridge formation. In: MESSING, R.A. Immobilized enzymes for industrial reactors. Academic Press, 1975. p. 79. (3) KENT, C.; ROSEVEf,\R, A.; THOMSON, A.R. Enzyme immobilized in inorganic suports. In: WISEMAN,A. Topi'cs in enzyme and fermentation biotechnlogy. Halsted Press, 1978, v .2, p.12. (4) NA VARRO, J.M.; PAREILLEUX, A.; DURAND, G. 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O custo da fermentaÇão, associado aos custos relacionados com o isolamento da enzima e,nos_casos pertinentes, os referentes à imobilização, devem ser minuciosamente avaliados, frente às potenciais vantagens de se utilizar um processo enzimático. Quando comparadas aos microrganismos, as enzimas isoladas poderão fornecer maior rendimento num dado produto, já que substâncias colaterais contaminantes, resultantes do metabolismo e/ou lise celular, não seriam formadas. No caso particular da imobilização, há a possibilidade de se modificar as características cinéticas da enzima. A escolha entre as formas solúvel e insolúvel de uma enzima depende da natureza do processo de conversão e da estabilidade operacional das duas formas. Pela sua natureza, alguns processos, como panificação e amaciamento de carnes, tornam inviável a recuperação das enzimas, desde que as mesmas são usadas na forma solúvel e adicionadas nos estágios finais dos processos. Embora em algumas situações a escolha seria afetada pelo fato de ser possível a remoção da enzima imobilizada do produto final, garantindo desta forma uma menor contaminação protéica, e/ ou pela possibilidade de mudança da cinética da reação, é inegável que a estabilidade operacional do sistema imobilizado apresentaria um peso ponderável na decisão entre enzima solúvel versus enzima insolúvel. --·----··· ----- ·-- - - - ----- - -- ··-· ------··· ·--·-· ·--- ---·-····· - ---------·----- ... . --------- - - ---·-·---·"---.--·-- ------------ ------..----- --------·--- ii ..J 374 Reatores com e~zimas imobilizadas Tabela 17.1 - Alguns exemplos de enzimas industriais. ; INDÚSTRIA uso Panificação Redução da viscosidade da massa; acelerar o crescimento da massa Cervejaria Liquefação do amido Papel Produção de gomas Têxtil Remoção de gomas de amido Açucareira Produção de xaropes de glicose Lavanderia Incorporação em detergentes Curtume Curtir e depilar o couro Alimentícia Fabricação de queijos, amaciamento de carne Pectinases Alimentícia Clarificação de sucos Glicoseisomerase Alimentícia Produção de xaropes de frutose Glicoseoxidase Alimentícia Desglicosação d~ ovos Papaína Alimentícia Evitar turbidez da cerveja Penicilina-amidase Farmacêutica Produção de antibióticos Aminoacilase Farmacêutica e alimentícia Purificação de misturas racêmicas de aminoácidos ENZIMA a-amilase Glicoamilase Proteases • 17.2 - Reatores enzimáticos A princípio, quando se dispunha apenas de enzima na forma livre e solúvel, o único tipo de reator utilizável era o de batelada. Contudo, com o advento das enzimas imobilizadas, surgiu a possibilidade de se utilizar outros tipos de reatores. Pode-se dizer, pela análise da literatura, que o número de reatores possíveis e preconizados é no mínimo igual ao número de estudiosos do setor. 1 No entanto, a maioria deles são inviáveis economicamente, quer por exigirem grandes dimensões, quer por apresentarem baixas porcentagens de conversão. ..... Reatores enzimáticos 375 17.2.1 - Tipos 17.2. 1. 1 - Reator de batelada Este tipo pode ser usado em processos onde, terminada a reação, a enzima imobilizada pode ser separada da mistura final com relativa facilidade (filtração, decantação, por exemplo) . 17.2.1.2 - Reator agitado contínuo Neste caso há entrada e saída contínua de fluido. Eventualmente uma certa quantidade de enzima pode ser arrastada no efluente, devendo-se, por isso, acoplar na saída um sistema que permita recuperá-la (filtração, por exemplo). 17.2. 1.3 - Reator de leito fixo Neste tipo de reator a enzima imobilizada é empacotada, permanecendo estacionária, enquanto a solução de substrato é bombeada através dela. 17.2. 1.4 - Reator de leito fluidizado A enzima imobilizada nesse caso encontra-se em suspensão no interior do reator , sendo a solução de substrato bombeada através dela. A velocidade de fluxo da solução de substrato é tal, que impede a deposição das partículas no fundo do reator, e é fraca o suficiente para evitar que as mesmas sejam arrastadas no efluente. 17.2.2 Fatores a considerar na escolha do reator 17.2.2.1 - Uso e custo do reator Basicamente o modo de operação do reato~ estará na dependência do "output" desejado. Nos casos em que o "output" é baixo, deve-se dar preferência ao reator tipo batelada, que representa um sistema barato e flexível (no sentido de poder ser usado em diferentes processos). No caso do reator contínuo de qualquer tipo, o seu emprego usualmente será planejado para um processo específico, o que eleva o custo do investimento inicial. Contudo, um reator desse tipo apresenta as vantagens: de custo de mãode-obra reduzido, possibilita a automação e a constância das condições de reação. 17.2.2.2 - Reutilização da enzima A decisão de se reutilizar ou não uma enzima, dependerá de considerações de ordem técnica e de custo. Com exceção de algumas enzimas extra celulares (por exemplo, amilases, proteases), as demais são instáveis para uso prolongado em reatores, podendo a imobilização, nestes casos, tornar-se uma aiternativa atraente. · Considerando os custos totais referentes à enzima livre, suporte e imobilização, é possível calcular o número de reutilizações em um reator batelada ou o tempo requerido (no caso do reator contínuo), que tornariam o custo do processo da mesma ordem de grandeza daquele apresentado pelo uso da enzima na forma solúvel. A economicidade da reutilização estará na dependência da relação custo do - ---- .--·--.--· - .,-..------.- -'---------- -------- ------.........~- -----~---- - ----'----~~- · ---. ·----------~ 3 76 Reatores com enzimas imobilizadas catalisador I custo total do processo. É claro que a reutilização limitará a escolha do reator àquele que propiciar o modo de retenção do catalisador mais eficiente. 17.2.2.3 - Requisitos operacionais Os requisitos operacionais do processo podem limitar severamente a escolha do reator. Lembrando que a maioria das reações bioquímicas requer controles de temperatura e pH, então um reator tipo tanque-agitado poderá ser usado. Algumas vezes, no entanto, é necessário fornecer substrato ao sistema de reação de um modo intermitente, como no caso em que o substrato em elevada concentração inibe a enzima. Isso pode ser conseguido usando-se um reator tubular. No caso de tanques agitados operados de forma contínua deve-se utilizar vários deles em série. Caso no fluido de alimentação existam sólidos insolúveis, então o reator de leito fixo não pode ser usado. Finalmente, em processos contínuos pode ser necessária a adição de uma nova quantidade de enzima~ para suprir a perda de atividade catalítica durante o processo contínuo prolongado. No caso do reator continuo agitado, tal acréscimo poderá ser feito a qualquer momento, sem a necessidade de interromper o processo, que não é possível na maioria dos outros tipos de reatores, cujo funcionamento deverá forçosamente ser interrompido. 17.2.3 - Cinética de reatores enzimáticos Para o desenvolvimento das equações de processo referentes aos reatores do tipo batelada e contínuos (tubular e contínuo agitado) admitir-se-ão as seguintes premissas: (a) condição de fluxo ideal; (b) reação irreversível; (c) ausência de efeitos inibitórios; (d) reação do tipoS -t P; (e) reação catalisada por uma só enzima, cuja cinética obedece ao modelo de Michaelis-Menten. 17.2.3.1 - Reator tipo batelada (RB) • Em primeiro lugar definamos os seguintes termos: Vs =volume da mistura em reação (L); M =massa total do sistema em reação (kg); RA =vazão mássica de entrada de substrato (kg/h); Rs =vazão mássica de saída de substrato (kg/h); Rc =razão de consumo do substrato no reator (kg/h); RE =razão de variação do substrato no reator (kg/h); p =densidade (kg/L); 5 0 =concentração inicial de substrato (g/L); S =concentração de substrato num instante qualquer (g/L); m =massa inicial de substrato (kg); x' =massa de substrato consumida/massa total (M) x =massa de substrato consumida/massa inicial de substrato (riz) v= massa de substrato consumida/tempo· unidade de volume (kg/L ·h) Reatores enzimáticos 377 Seja a equação do balanço material em relação ao substrato: (17.1) como RA = R5 = O (nada entra e nada sai), temos: (17.2) Lembrando que: (17.3) RE = -:M ·dx' I dt (17.4) Substituindo (17.3) e (17.4) na (17.2 ), temos: -v ·V 8 =-M·dx' ldt (17.5) e integrando: (17.6) ou (17.6a) Sabendo que mdx = Mdx' ou dx'= (miM) · dx e substituindo na (17.6a), tem-se (quando a densidade é constante): (17.7) como: V =(Vmáx ·S) I (Km +5) (17.8) (17.9) então, substituindo (17.8) e (17.9) na (17.7) e resolvendo-se as integrais, chega-se à equação de processo: (17.10) onde V max é a velocidade máxima da reação catalisada pela enzima e Km é a constante de Michaelis-Menten (corresponde à concentração de substrato para a qual a velocidade da reação é metade da velocidade máxima). 17.2.3.2 - Reatortubular (RT) O balanço será feito considerando o reator operando em regime permanente . i ......... J 378 Reatores com l!nzimas imobilizadas Além das definições apresentadas no item anterior, acrescentam-se as seguintes: A = massa de alimentação total (kg); x' (conversão) =massa de substrato consumida/ massa de alimentação total (A) Xs (fração mássica de substrato) = massa de substrato /massa de alimentação total (A) VR =volume do reator Q = vazão volumétrica de alimentação ( L/h) ta (tempo de residência)= VR/Q (h) (17.11) RA -Rs -Rc =RE Em regime permanente RE =O (não há acúmulo). Logo (17.11) fica: (17.12) RA -Rs -Rc =0 Como RA=A·xs-A · x'; Rs=A·x 5 -(x'+dx') · A; Rc=v·dVR Substituindo esses parâmetros na (17.12), tem-se: (17.13) A ·dx' =v· dVR Rearranjando e integrando a (17.13), obtém-se a equação de projeto para. o reator tipo tubular: rx s VR/A=Jo dx'/v (17.14) • ComoA=p·Q e t. =VR/Q,então: ta =p · VR /A (17.15) Define-se vazão específica de alimentação (v.) como sendo o inverso do tempo de residência, ou seja, 1/t. = Q/VR =v., que representa a alimentação volumétrica máxima permissível por unidade de volume do reator. Assumindo que a reação enzimática obedeça ao modelo de Michaelis-Menten, então (17.16) Substituindo (17.15) e (17.16) na (17.14): rx s ta =p · Jo dx' [(Km t S) /(Vmax ·S)] (17.1 7) Reatores enzimáticos Sabendo que dx' = (miM)dx, p tém-se a equação de processo: =1 e 379 S =5 0 (1 -x) e integrando a (17.17) ob(17.18) Embora a equação (17.18) seja parecida com a correspondente do reator tipo batelada (17.10), dev~ ser lembrado que nesta última t é o tempo total de reação, enquanto que ta é tempo de residência de urna partícula dentro do reator. Caso não ocorra mistura durante o escoamento pelo reator (neste caso o reator tubular recebe o nome particular de reator pistonado) e Q permaneça constante durante a passagem da mistura pelo reator, então ta seria de fato o tempo de residência de cada partícula no reator. Corno a não idealidade é um fato mais corriqueiro, então o tempo de residência representará um valor de permanência médio da partícula dentro do reator. o 17.2.3.3 - Reator agitado contínuo (RCA) Neste tipo de reator vale o seguinte balanço material (no estado estacionário): (17.19) Q·(S 0 -S) =v· V 8 Sabendo que S =5 0 • (1-x) e admitindo que a reação enzimática segue o modelo de Michaelis-Menten, a equação de processo para este tipo de reator é: (17.20) 17.2.4 - Desempenho dos reatores enzimáticos 17.2.4. 1 - Reatores não ideais As considerações cinéticas feitas até o momento levaram em conta situações ideais, onde o sistema era perfeitamente hornogeneizado ou sujeito ao pistonarnento. Exceto no caso em que o efeito inibitório por substrato é intenso, o reator pistonado é mais eficiente do que o reator continuo agitado. Contudo, o efeito da retrornistura num sistema pistonado pode ·reduzir o rendimento do processo . Em adição, deve-se considerar os efeitos difusionais e a presença de "regiões mortas" dentro do reator, que também afetam seu desempenho. KOBAYASHI; MOO-YOUNG2 derivaram urna expressão que descreve o efeito da retrornistura no desempenho de um reator empacotado contendo enzima imobilizada. Corno simplificações básicas desse modelo, os autores negligenciaram o efeito da resistência da transferência de massa através da película envolvente das partículas de enzima imobilizada, bem corno a ocorrência de partição do substrato entre as fases líquida e sólida devido a efeitos eletrostáticos (Eq. 17.21): (1 I Bo) · [d 2 (1 - x) I dz 2 ] - [ d (1 - x) I dz] (17.21) -{k·E·(1-e)·•·S 0 (l-x)IS 0 ·e·[Km +5 0 (1-x)]}=O -·---------····---------- --- --------------- -- -- ------....-........ ---~- .···------- -- ------ ---------·· --·-. ··- -- ------- -----·- --- - ···· - - -~ - -- --·····--------- ---- ·-·· 380 Reatores com enzimas imobilizadas onde: e= volume morto do reator (espaços vazios); z =parâmetro adimensional referente ao comprimento do reator Bo (Número de Bodenstein) = u ·Lei De (onde u =velocidade intersticial do substrato; Lc = altura da camada de sistema imobilizado dentro do reator; De = coeficiente de dispersão). Quando a concentração inicial de substrato (5 0 ) é muito maior que o Km, ou seja, a reação enzimática é de ordem zero, a retromistura não tem efeito significativo no rendimento do processo. No entanto, no caso em que Sol Km estiver na faixa entre 0,2 e 100 a retromistura passa a ser significativa e a equação (17.21) deve ser resolvida analiticamente. Por isso, é importante que as extensões da retromistura (em reator de leito fixo ou fluidizado), e do grau de empacotamento do leito fixo, sejam conhecidas antes do estabelecimento da equação de processo de um dado reator enzimático. Deve ser, ainda, lembrado que o diâmetro das partículas (dp) do sistema imobilizado pode ser relacionado à retromistura através do Número de Peclet (Npe), definido por: Npe = dp · u I D c (17.22) Rearranjando e dividindo ambos os membros da (17.22) por u · Lc, tem-se: (17.23) Segundo CHUNG; WEN/ o Número de Peclet pode ser correlacionado ao Número de Reynolds (Nre) através da relação: (Npe I z) = 0,20 + 0,011 Nre 0 ' 48 (17.24) Para o reator de leito fixo z = 1 e para o reator de leito fluidizado z = (Nre)m1 INre [onde (Nre)mf corresponde ao Nre para o mínimo de fluidização]. Finalmente, o (Nre)mf pode ser correlacionado às características das partículas do sistema imobilizado, através da relação:3 (Nre)mf = [(33,7) 2 + 0,408Nga] 112 - 33,7 (17.25) Onde Nga (Número de Galileu) = [(dp)3 · p(p.- p) · giJ.l]; g é a aceleração da gravidade; ll = viscosidade do fluido; p = densidade do fluido; Ps = densidade das partículas do leito. Um outro exemplo de não idealídade dos reatores, seria o caso em que o rendimento de um dado processo enzimático varie conforme o tipo de reator empregado. O'NEILL, DUNNILL e LILLY 4 verificaram que, com um reator de leito fixo contendo amiloglicosidase imobilizada e alimentado com solução de maltose, o rendimento do processo era menor do que no caso de usar-se um reator continuamente agitado, sobretudo a baixas vazões. Os autores concluíram que o problema residia na heterogeneidade da transferên,cia de massa no interior do leito fixo. Reatores enzimáticos 381 17.2.4.2 - Inibição enzimática e desempenho do reator É comum a enzima durante a catálise sofrer inibição, tanto pelo substrato quanto pelo produto, quando estas substâncias se encontram acima de urna dada concentração. Só para citar um exemplo, PITCHER et al. 5 determinaram que a galactose inibe competitivamente a ação hidrolítica da lactase de levedura, sendo o K; (constante de inibição) da ordem de 0,70 rnM. Basicamente os inibid.ores enzimáticos podem ser divididos em irreversíveis e reversíveis. Um inibidor irreversível forma um composto covalente com a enzima, não podendo, por esse motivo, ser separado por meios físicos, embora em alguns casos possa ser removido por métodos químicos. BAKER6 preconiza o planejamento de inibidores irreversíveis específicos para determinadas enzimas, com o intuito de eliminá-las quando estiverem contaminando urna preparação enzimática comercial, e cujos efeitos sejam indesejáveis ao processo no qual a mesma será utilizada. O inibidor reversível, por sua vez, pode ser do tipo competitivo, incornpetitivo ou não competitivo. Os inibidores reversíveis incornpetitivos (V má x e Km diminuem) não apresentam interesse industrial, desde que seus efeitos se manifestam apenas sobre enzimas que requerem pelo menos dois substratos, as quais não são usadas em processos industriais no momento. Os inibidores reversíveis não competitivos (V máx diminui e Km inalterado) causam urna inibição que independe da concentração do substrato, já que o inibidor se liga a urna região da molécula enzimática diferente da do sítio ativo. Em termos industriais esse tipo de inibidor poderá ter uso potencial, já que poderia ser adicionado a um processo, com o intuito de diminuir a atividade enzimática no momento em que o grau de conversão do substrato tenha atingido determinado valor. Os inibidores reverSíveis competitivos são compostos que atuam ao nível do sítio de ligação da enzima. Tais compostos devem ser estruturalmente semelhantes ao substrato natural da enzima. Desde que o substrato e o inibidor combinam-se reversivelmente na mesma região da molécula enzimática, o grau de inibição irá depender das forças de ligação e das concentrações relativas de ambos. Corno a competição se dá desse modo, então espera-se que para altas concentrações de substrato a inibição deva ser eliminada. Em termos cinéticos, para esse tipo de inibição a velocidade máxima (Vmáx) deve permanecer inalterada, enquanto que o Km aumenta. Os inibidores competitivos de ocorrência mais comum são os produtos resultantes da própria reação, constituindo-se a inibição da galactose sobre a lactaseS ou da glicose sobre a celulase7 exemplos típicos. Tal inibição pode ser eliminada num processo industrial, através da separação do produto por ultrafiltração.8 Do ponto de vista industrial, sem dúvida alguma, a inibição competitiva é a de maior importância dentre todos os mecanismos inibitórios conhecidos. Apenas para exemplificar, consideremos urna enzima que possui dois sítios ativos suficientemente próximos, a ponto de urna molécula de substrato ligada a um deles afetar as propriedades ligantes do outro sítio. 382 Reatores com enzimas imobilizadas Sejam as reações envolvidas representadas como segue: E+S ~ ES ~ E+P k-1 ES + S < :!3 ) SES ~k 2 ) ES + p (17.26) (17.27) onde Brepresenta qualquer alteração na velocidade de quebra de ES, proveniente do efeito acima considerado. Realmente SES poderia se romper tanto para formar ES + P como SE + P. Porém, admite-se que as velocidades de ambas as reações são iguais e que a reação: SES ~ E + 2P é ignorada. Por conseguinte, podem ser estabelecidas as seguintes equações: Et =(E)+ (ES) + (SES) (17.28) d(ES) I dt = kl (S)(E)- k_1(ES) - k2(ES) (17.29) d(SES) I dt = k3 (ES) (S)- k_3 (SES)- Bk2(SES) (17.30) v= k2(ES)., + Bk2(SES) (17.31) onde: E1 = concentração total de enzima; E = concentração de enzima livre; ES = concentração do complexo intermediário binário; SES = concentração tio complexo intermediário ternário. Dividindo (17.31) por (17.28): (v I Et) = [k 2 · (ES) + k2 • (SES) · B1 I [(E)+ (ES) + (SES)] (17.32) Considerando a hipótese do "estado estacionário" 9 : d (ES) I dt =O e d (SES) I dt = O (17.33) a eq. (17.29) pode ser escrita do seguinte modo: (ES) = [(S) ·(E) · k1 ] I [k _1 + k 2 ] (17.34) e a (17.30): . (17.35) Reatores enzimáticos 383 Substituindo (17.34) e (17.35) na (17.32) e considerando as relações: Vmax =k 2 (E)t; Km =[k_1 +k 2 ]/k 1 e K'rrz =(k 3 +~·k 2 )/k 3 tem-se: (17.36) Admitindo que Km e K' m sejam constantes de dissociação, isto é, se os equilíbrios são rapidamente atingidos, então: Km = K5 e K'm = K'5 • Além disso, fazendo K's = K5 a, onde a refletiria o efeito causado pela associação do primeiro substrato sobre a maior ou menor facilidade de associação para o segundo, a equação (17.36) pode ser escrita da seguinte forma: (v /Vmáx)=[Ks +(S)~]/[Ks +(S)/a +K~ /(S)] Se a>> 1, então (S) · ~/a (17.37) e (S)/a tendem para zero. Logo, (17.37) toma a forma: (v I V máx) =(S) I [(S) + Ks] (17.38) Se a = 1 (nenhum efeito sobre K5 ) e f3 = O (a reação SES + S não ocorre), tem-se finalmente a seguinte equação, que expressa o efeito inibitório causado pelo substrato: V={Vmáx ·(S)/[(S)+Ks +(5) 2 I Ks]} (17.39) Substituindo a equação (17.39) nas correspondentes equações de projeto dos diferentes reatores, tem-se as equações de processo: · (RB) : t · V máx = xS 0 - Km · Ln (1- x) +(S~ I 2K 5 ) ·(2x -x 2 ) (17.40) (17.41) (17.42) A inibição por substrato, quando ocorre, é bem mais séria no reator tubular (pistonado) do que no contínuo agitado, porque neste último a enzima está operando numa concentração de substrato idêntica ao efluente. O'NEILL et al. 10 demonstraram teoricamente, que sob certas condições severas de inibição por substrato, o reator agitado contínuo pode apresentar mais de um estado estacionário sob condições operacionais específicas e, em conseqüência, alguns valores de x não podem ser obtidos. A inibição por substrato pode ser minimizada num reator batelada, introduzindo-se o substrato de forma intermitente num reator tubular (pistonado), pela ~ ------.,.----- ---- -r··- ·-.·-·-:---·- - --- - -- --- - ------~-~--,..-~---~- -, - ----- ------ ------'-'---.-- - ·- ·-----· - ·-·-·· - - ------ .------- ----- . 384 I Reatores com enzimas imobilizadas alimentação do substrato em vários pontos ao longo do reator e, num reator agitado contínuo, através do uso de vários reatores dispostos em série, cada qual sendo alimentado continuamente com substrato. A inibição por produto pode se dar por quaisquer dos mecanismos inibitórios mencionados. Não sendo possível nesse ponto uma abordagem completa dos mesmos, recomenda-se a leitura do livro de SEGEL. 11 Apenas para efeito de ilustração, as equações de processo frente à inibição competitiva pelo produto (Kip =constante de inibição referente ao produto) para os reatores RB, RT e RCA seriam, respectivamente: [1-(Km I Kip)]x·S 0 -[1+(5 0 I Kip)]Km ·Ln(1-x)=Vmáx ·t (17.43) [1- (Km / Kip)]x ·5 0 -[1 +(So / Kip)]Km · Ln (1- x) =Vmáx ·ta (17.44) I· I (17.45) 17.2.4.3 - Problemas operacionais Limitações difusionais A limitação, devida à transferência externa de massa em reatores de leito fixo, tem sido verificada para vazões de fluxo menores do que 1-2 cm/min.12 Para vazões maiores, tal efeito é minimizado, porém começa a surgir o problema do aumento da pressão sobre o leito fixo. As limitações difusionais internas para um sistema imobilizado podem ser • diminuídas através dos procedimentos: (a) redução do quociente atividade enzimática/volume de suporte; (b) aumento da concentração de substrato; (c) diminuição da espessura ou diâmetro das partículas do suporte. A última possibilidade enumerada é inexeqüível, desde que as menores dimensões das partículas do suporte foram estabelecidas no momento da imobilização. O "fator de eficiência" (razão entre as velocidades de reação em presença e na ausência de efeitos difusionais) 5 para partículas num RCA pode ser obtido diretamente a partir da discussão dos efeitos difusionais, desde que a concentração de substrato é constante com o tempo. Num RB ou RT a concentração de substrato, e daí o "fator de eficiência", varia com o tempo ou distância. LEE; TSA013 calcularam os valores médios do "fator de eficiência" em tais condições, usando o logaritmo da média entre as concentrações iilicial e final de substrato como parâmetro estimativo. Como a concentração de S num RCA é igual à concentração de S no fluido de saída, fica claro que a limitação difusiorial imposta pela porosidade das partículas da enzima imobilizada será mais séria no RCA do que no RT e RB, nos quais a concentração de S varia dentro de uma faixa bem estabelecida. Reatores enzimáticos 385 Temperatura e transferência de calor A temperatura influi tanto na velocidade da reação quanto na de denaturação da enzima.11 Para avaliar esse efeito, é empregada a equação de Arrhenius, que pode ser expressa na seguinte forma simplificada: 11 · (17.46) k=A·(e)(-E/RT) Onde k = constante de velocidade da reação; A = fator de freqüência; E = energia de ativação; R= constante de Clapeyron; T =temperatura absoluta. A transferência de calor em reatores de enzimas imobilizadas assume um papel extremamente relevante, quando a reação deve ser realizada sob temperatura bem controlada. De um modo geral, a transferência térmica é boa no caso de reatores de leito fluidizado e batelada, sendo, problemática para os de leito fixo. Queda de pressão No planejamento de reatores com leito fixo deve-se levar em conta as eventuais variações da pressão durante o processo. Quanto menores forem as partículas da matriz, maior será a queda de pressão. Partículas menores do que 50 mesh (tamis U.S. standard) são de uso impraticável em reatores operando em grande escala.5 A queda de pressão (~P') pode ser quantificada através da equação: 5 ~P' = [2. f m ·G2. Lc(l-E)(3 - n)] / dp. p. g c (17.47) ·4>[3-n(e)3] Onde: fm (fator de fricção)= 100/Nre (para número de Reynolds Nre < 10); n = 1 (para Nre < 10); 4> =fator de geometria (unitário no caso de partículas esféricas); E= fração relacionada com os interstícios vazios do suporte (grau de empacotamento do leito fixo); G =velocidade superficial de massa. Desempenho do reàtor com o tempo Durante a operação de um reator enzimático, a produtividade pode diminuir por várias razões. A enzima no reator perderá atividade com o tempo, devido à desnaturação e envenenamento. A desnaturação poderá ser conseqüência do calor, espumação e/ ou cisalhamento. A enzima poderá ser envenenada por inibidores naturalmente existentes no mosto ou formados durante o pré-tratamento do mesmo. As contribuições relativas dessas causas de perda de atividade dependerão das condições operacionais. Por exemplo, a 13-galactosidase covalentemente ligada a uma lâmina porosa sofria envenenamento, quando a temperatura era mantida a 25°C, porém, a 50°C a inativação térmica tornou-se o fator dominante. 14 É importante lembrar que muitas enzimas são mais termoestáveis em presença de seus substratos. Além dos efeitos mencionados, pode-se, também, perder rendimento através da contaminação microbiana. A contaminação do reator por microrganismos, pode ser minimizada ou eliminada trabalhando-se a temperaturas superiores a 40°C e pH adequado. Nos casos em que isso não é possível ou é inadequado, o fluido de alimentação deve ser pré-tratado (por exemplo, filtração esterilizante). HARPER et al. 15 -·-----· ------ ···-·· . ·--- ...···----- --~~ -- -..,..,~-.- .. ,.. .........,.. ,.... '----.---,------- ._. ~---- _____ ,,. __ ,:.... ______________ ---------- --------- .. .. -- -----. ·- . ----···--------- .. ---··- ,, 386 Reatores com enzimas imobilizadas estudaram o problema da contaminação microbianà em colunas contendo P-galactosidase imobilizada em vidro poroso e alimentadas continuamente com soro de leite . A pH = 6,6 o crescimento microbiano era rápido, mas poderia ser eliminado se as colunas fossem operadas continuamente a pH = 3,5 e a 50-60°C, intercalando-se ciclos de limpeza e sanitização a cada 72 h. A atividade aparente de uma enzima num reator diminuirá, se o padrão de fluxo no reator variar ou se houver modificação na distribuição da enzima no interior do reator. Por exemplo, com uma barreira de retenção na saída do reator (tal como filtro ou membrana de ultrafiltração), a enzima poderá se acumular na saída do mesmo. A deposição de gorduras, gomas e/ou polissacarídeos sobre as partículas de enzima imobilizada, também reduzirá a atividade enzimática. Existem, também, diversas maneiras pelas quais a enzima pode ser perdida pelo sistema. Desde que muitos suportes são polímeros hidrofílicos, eles podem se solubilizar com o tempo. Isso foi observado com vidro poroso não tratado com óxido metálico (por exemplo, Ti0 2, Si02) . É importante que o polímero hidrofílico usado como suporte tenha estrutura homogênea, a fim de minimizar a solubilização gradual. Para enzimas imobilizadas por adsorção, o desprendimento poderá ocorrer com o tempo. A adsorção inicial é usualmente feita sob condições nas quais o equilíbrio favorece a ligação. Entretanto, a exposição continuada da enzima imobilizada ao fluido contendo o substrato poderá provocar o desprendimento, reduzindo assim a capacidade catalítica do reator. A velocidade de dessorção aumentará em função da presença de altas concentrações de sais e/ou substrato. TOSA et al.16 observaram que uma solução 0,2M de acetil-DL-metionina era a maior concentração que poderia ser usada em reator contendo aminoacilase adsorvida em DEAE ~Sephadex. Outro fator de perda de atividade do reator enzimático é o desgaste sofrido pelas partículas contendo a enzima por causa do atrito, quer entre elas quer com elementos estruturais do reator (agitador, chicanas). • O planejamento inadequado da adição de ácido ou álcali para controlar o pH da reação pode provocar a formação de um gradiente de pH no seio do sistema imobilizado, causando a inativação localizada da enzima, bem como a hidrólise do substrato e/ ou produto. Geralmente, o desempenho ótimo do reator está vinculado à atividade enzimática total presente. No entanto, a atividade por unidade de volume do reator pode ser importante. Se o substrato e o produto são instáveis nas condições operacionais, então uma alta concentração de enzima reduzirá .o tempo de residência tanto do substrato quanto do produto, reduzindo deste modo as perdas. Para enzimas imobilizadas, alta atividade por unidade de volume pode ser obtida, tanto pelo aumento da atividade por peso de suporte como pelo aumento da quantidade de suporte dentro do reator. A ligação de mais enzima pode requerer um aumento na área superficial do suporte, significando isto aumento da porosidade ou redução no tamanho da partícula para suportes não porosos. Devem ser lembrados, também, os processos em que a enzima é empregada na forma solúvel, exceto quando se utiliza reator de membrana/ nos quais ela 387 Reatores enzimáticos pode ser inativada pelo simples aumento da temperatura do reator, desde que o produto não seja terrnolábil. Finalmente, as principais causas que reduzem o desempenho de um reator enzimático, podem ser, em linhas gerais, surnarizadas:17 a) Perda de enzima pelo reator: desintegração e/ ou solubilização do suporte; desprendimento da enzima; b) Interação enzima-substrato deficiente: padrão de fluxo irregular no interior do re'ator; formação de películas na superfície das partículas do suporte contendo a enzima; c) Perda da atividade enzimática: envenenamento; desnaturação; ataque rnicrobiano. Estratégia operacional de reatores com enzimas imobilizadas. 5 Em geral, o objetivo de urna dada estratégia operacional consiste em minimizar o custo global do processo, através da otimização da quantidade total de substrato convertido por unidade de atividade enzimática. Para tanto, a estratégia usada consiste na regulação da velocidade de produção, variação da temperatura e do tamanho ou número de reatores. A produção total (Pt) de um reator durante um período de tempo (tp) pode ser relacionado com a vazão de alimentação (F) pela seguinte equação: l tp Pt == o F .·dt (17.48) Para um processo onde a conversão é constante e o decaimento da atividade enzimática é exponencial, a eq. 17.48 pode ser escrita corno segue: , Pt== f~P[F·e(-LN2H!t,t, ]dt (17.49) onde t 112 ==meia-vida da enzima. Resolvendo a integral pelo método da substituição de variável tem-se: (17.50) Caso, ao reduzir-se a velocidade do fluxo de entrada para manter urna dada conversão, isto levar a variações inaceitáveis em termos de rendimento de processo, então devem-se utilizar vários reatores em série, cujos tempos de partida ou de recarga com enzima imobilizada sejam alternados. O uso do número adequado de reatores permite manter o rendimento do processo no nível desejado. O número de reatores requerido para manter a produção dentro de limites preestabelecidos é função do tempo de uso do sistema imobilizado (seria o número de meias-vidas durante o qual o reator é operado antes do sistema imobilizado ser trocado). Essa relação pode ser expressa pela equação: Rp ==exp (H· Ln2 IN) (17.51) onde: Rp == razão entre a menor e a maior velocidade de produção; H== número de meias-vidas de uso do sistema imobilizado; N = número de reatores. 386 · Reatores com enzimas imobilizadas estudaram o problema da contaminação rnicrobiana em colunas contendo ~-galac tosidase imobilizada em vidro poroso e alimentadas continuamente com soro de leite. A pH = 6,6 o crescimento rnicrobiano era rápido, mas poderia ser eliminado se as colunas fossem operadas continuamente a pH = 3,5 e a 50-60°C, intercalando-se ciclos de limpeza e sanitização a cada 72 h. A atividade aparente de urna enzima num reator diminuirá, se o padrão de fluxo no reator variar ou se houver modificação na distribuição da enzima no interior do reator. Por exemplo, com urna barreira de retenção na saída do reator (tal corno filtro ou membrana de ultrafiltração), a enzima poderá se acumular na saída do mesmo. A deposição de gorduras, gomas e/ ou polissacarídeos sobre as partículas de enzima imobilizada, também reduzirá a atividade enzimática. Existem, também, diversas maneiras pelas quais a enzima pode ser perdida pelo sistema. Desde que muitos suportes são polímeros hidrofílicos, eles podem se solubilizar com o tempo. Isso foi observado com vidro poroso não tratado com óxido metálico (por exemplo, Ti02, Si02). É importante que o polímero hidrofílico usado corno suporte tenha estrutura homogênea, a fim de minimizar a solubilização gradual. Para enzimas imobilizadas por adsorção, o desprendimento poderá ocorrer com o tempo. A adsorção inicial é usualmente feita sob condições nas quais o equilíbrio favorece a ligação. Entretanto, a exposição continuada da enzima imobilizada ao fluido contendo o substrato poderá provocar o desprendimento, reduzindo assim a capacidade catalítica do reator. A velocidade de dessorção aumentará em função da presença de altas concentrações de sais e/ ou substrato. TOSA et al. 16 observaram que urna solução 0,2M de acetil-DL-rnetionina era a maior concentração que poderia ser usada em reator contendo arninoacilase adsorvida em DEAE~Sephadex. l I I r l I li ii I' I" Outro fator de perda de atividade do reator enzimático é o desgaste sofrido pelas partículas contendo a enzima por causa do atrito, quer entre elas quer com elementos estruturais do reator (agitador, chicanas). O planejamento inadequado da adição de ácido ou álcali para •controlar o pH da reação pode provocar a formação de um gradiente de pH no seio do sistema imobilizado, causando a inativação localizada da enzima, bem corno a hidrólise do substrato e/ ou produto. Geralmente, o desempenho ótimo do reator está vinculado à atividade enzimática total presente. No entanto, a atividade por unidade de volume do reator pode ser importante. Se o substrato e o produto são instáveis nas condições operacionais, então urna alta concentração de enzima reduzirá o tempo de residência tanto do substrato quanto do produto, reduzindo deste modo as perdas. Para enzimas imobiliZadas, alta atividade por unidade de volume pode ser obtida, tanto pelo aumento da atividade por peso de suporte corno pelo aumento da quantidade de suporte dentro do reator. A ligação de mais enzima pode .requerer um aumento na área superficial do suporte, significando isto aumento da porosidade ou redução no tamanho da partícula para suportes não porosos. Devem ser lembrados, também, os processos em que a enzima é empregada na forma solúvel, exceto quando .se utiliza reator de rnernbrana, 9 nos quais ela Reatores enzimáticos 387 pode ser inativada pelo simples aumento da temperatura do reator, desde que o produto não seja termolábil. Finalmente, as principais causas que reduzem o desempenho de um reator enzimático, podem ser, em linhas gerais, sumarizadas: 17 a) Perda de enzima pelo reator: desintegração e/ ou solubilização do suporte; desprendimento da enzima; b) Interação enzima-substrato deficiente: padrão de fluxo irregular no interior do ;reator; formação de películas na superfície das partículas do suporte contendo a enzima; c) Perda da atividade enzimática: envenenamento; desnaturação; ataque microbiano. Estratégia operacional de reatores com enzimas imobilizadas. 5 Em geral, o objetivo de uma dada estratégia operacional consiste em minimizar o custo global do processo, através da otimização da quantidade total de substrato convertido por unidade de atividade enzimática. Para tanto, a estratégia usada consiste na regulação da velocidade de produção, variação da temperatura e do tamanho ou número de reatores. A produção total (Pt) de um reator durante um período de tempo (tp) pode ser relacionado com a vazão de alimentação (F) pela seguinte equação: (17.48) Para um processo onde a conversão é constante e o decaimento da atividade enzimática é exponencial, a eq. 17.48 pode ser escrita como segue: (17.49) Pt = fotp [F . e< -LN2) ·t/ tl /2 ] dt onde t 112 =meia-vida da enzima. Resolvendo a integral pelo método da substituição de variável tem-se: (17.50) Caso, ao reduzir-se a velocidade do fluxo de entrada para manter uma dada conversão, isto levar a variações inaceitáveis em termos de rendimento de processo, então devem-se utilizar vários reatores em série, cujos tempos de partida ou de recarga com enzima imobilizada sejam alternados. O uso do número adequado de reatores permite manter o rendimento do processo no nível desejado. O número de reatores requerido para manter a produção dentro de limites preestabelecidos é função do tempo de uso do sistema imobilizado (seria o número de meias-vidas durante o qual o reator é operado antes do sistema imobilizado ser trocado). Essa relação pode ser expressa pela equação: (17.51) Rp =exp (H ·Ln2/ N) onde: Rp = razão entre a menor e a maior velocidade de pr<)dução; H= número de meias-vidas de uso do sistema imobilizado; N =número de reatores. ~------·- ··- .. ---- ---~--~·-·······.··-------- ...-------~-~~-----.- ~--··------~----------------------· .- -- 388 Reatores com enzimas imobilizadas Para finalizar, deve ser lembrada a estratégia de manter-se a conversão desejada ao longo do tempo, através do aumento controlado da temperatura do processo. A idéia baseia-se na tentativa de contrabalançar a perda de atividade com o aumento da agitação molecular que sempre acompanha o aumento da temperatura. 17.3 - Exemplos de processos enzimáticos 17.3. I - lsomerização da glicose A isornerização enzimática da glicose em frutose é executada em escala industrial no mundo inteiro, sobretudo nos EUA. O produto comercial obtido (HIGH -FRUCTOSE CORN SYRUP, HFCS), contém, em base seca, 42 ou 55% de frutose. Cerca de 70% do HFCS produzido no mundo é usado na concentração de 55% em frutose, que é enriquecido por técnica crornatográfica/ 8 a partir da mistura equirnolecular de glicose e frutose formada pela ação da glicoseisornerase (GI), sobre a glicose proveniente da hidrólise do amido. O HFCS 55% é usado corno adoçante em bebidas não alcoólicas, enquanto que o HFCS 42% (resultante diretamente da ação da GI sobre a glicose) é usado em panificação, laticínios e enlatados. Devido à alta higroscopicidade da frutose, o HFCS não pode substituir a sacarose na manufatura de bombons rígidos. Segundo HAGEN; PEDERSEN/ 8 a partir de 1987 o mercado passou a dispor de frutose pura obtida de HFCS. O aparecimento em 1974 da GI imobilizada e o grande interesse da indústria de refrigerantes pelo HFCS, fizeram com que o processo de isornerização da glicose fosse aceito pelas principais indústrias processadoras de rnaterülis arniláceos do Ocidente. Um grande salto no consumo do HFCS ocorreu em 1978, quando foi introduzido o processo de enriquecimento do HFCS em frutose, através da separação crornatográfica da mistura glicose e frutose, aumentando o índice de dulçor deste xarope. Em 1988, a quantidade total de HFCS produzida em escala mundial • foi superior a 7 milhões de toneladas.18 A glicoseisornerase (GI) é urna enzima intracelular de origem rnicrobiana, que catalisa a conversão de glicose em frutose e obedece à seguinte equação develocidade: v= [Vf · (S) I K ms -Vr · (P} I Kmp] I [1 + (S) I Kms + (P) I Kmp] (17.52) onde: Vt = velocidade máxima da reação no sentido da formação da frutose; Vr = velocidade máxima da reação no sentido da formação da glicose; Kms e Kmp são, respectivamente, as constantes de Michaelis-Menten em relação à glicose e à frutose. No equilíbrio (v = O) tem-se que: (V f · Kmp) I (V r · Kms) =(P) eq I (S) eq =Keq (17.53) Substituindo (17.53) na (17.52) e rearranjando, tem-se: v= {V f · [(S)- (S) eq]} I {(S) + Kms · [1 + (P) I Kmp ]} (17.54) Exemplos de processos enzimáticos 389 Da eq. 17.54 fica evidenciada a ação inibitória competitiva do produto sobre a Gl. Ou seja, a velocidade inicial de isomerização depende do afastamento em relação ao ponto de equilíbrio no qual o sistema se encontra. A unidade de atividade para a GI é a "IGICU" ("Immobilized Glucoseisomerase Column Unit"), definida como sendo a quantidade de sistema imobilizado que produz 1 micromol de frutose/min, sob condições de processo definidas. A GI imobilizada é us,ada para converter um xarope de glicose 93-96% em HFCS, sendo que aGI comercial é obtida de diferentes microrganismos (Quadro 17.1). Durante o estágio inicial da produção de HFCS, que remonta aos anos 60, ficou claro que o emprego da GI solúvel requeria alta concentração de enzima ou longos tempos de reação. Ambos os requisitos eram inaceitáveis, já que o tempo longo de reação causava a formação de produtos colaterais indesejáveis (manose, cor, "off-flavors") aumentando os custos de refino e o uso de solução concentrada de GI era dispendioso, devido ao fato de a enzima ser intracelular e demandar, além do rompimento das células, operações mais complexas de "downstream". Em conseqüência, o uso da GI imobilizada foi o único caminho para tornar a isomerização exeqüível em escala industrial. Demonstrou-se que o uso de um sistema de isomerização imobilizado apresentava mais benefícios do que desvantagens. Por exemplo, o substrato usado pata a produção do HFCS é um fluido clarificado, refinado e de baixa viscosidade, que passa facilmente através de um leito fixo. Além disso, tanto o substrato (glicose) como o produto (frutose) são substâncias _de baixo peso molecular, que se difundem com facilidade através dos poros dos grânulos dos suportes usados na imobilização. Como a GI imobilizada possui meia-vida entre 6 e 24 meses sob condições normais de processo, seu custo se reduz significativamente. Estando a enzima imobilizada em concentração elevada e o processo sendo contínuo, ocorre uma redução significativa no te:J;llpO de reação, com a conseqüente baixa formação de produtos colaterais. · A imobilização da GI segue um desses dois processos: a) Processo usando a célula total: As células microbianas contendo a GI intracelular são recolhidas do caldo fermentado, sendo, a seguir, tratadas adequadamente para reterem a enzima dentro da célula. No processo proposto por JORGENSEN et al./ 9 as células são concentradas por centrifugação, rompidas por homogeneização, tratadas com glutaraldeído (para a formação de ligações cruzadas) e floculadas com agente catiônico. O precipitado é filtrado, extrudado, seco e tamisado (diâmetro das partículas: 300-1000 J.lm). Em outro processo, proposto por HUPKES/0 uma mistura de células e gelatina é tratada com glutaraldeído, lavada e tamisada .. Produtos celulares com GI imobilizada são descartados após o uso e substituídos por material novo. b) Processo usando enzima solúvel: As células colhidas do caldo fermentado são rompidas para a liberação da Gl. A seguir, a enzima é recuperada por filtração/centrifugação e concentrada por ultrafiltração. A enzima solúvel é, finalmente, ligada ao suporte. No processo pro- !I I:'' ,. 390 Reatores com enzimas imobilizadas posto por ANTRIM;AUTERINEN 2) aGI é recuperada por ultrafiltração e cristalização, sendo a seguir deixada em contato por 5 h com uma mistura (designada pela sigla CETIPO) cortstituída por DEAE-celulose, Ti0 2 e poliestirel)O. No final, o material sólido é moído e tamisado (400-800 Jlm). Um modo alternativo seria promover a adsorção de poliamina sobre alumina, a seguir, tratar com glutaraldeído e adicionar aGI, que através de seus aminogrupos se liga aos grupos carbonila do dialdeído. 22 Em alguns casos, o suporte pode ser reaproveitado diversas vezes, pela remoção da enzima residual com a introdução de nova carga de GI. Por exemplo, a DEAE-celulose pode ser regenerada, lavando-se alternadamente com água e com solução de NaOH (2%) até a remoção de toda a proteína e impurezas. Nova GI é, então, ligada através de uma operação descontínua ou contínua, até reconstituir 95% da atividade isomerásica inicial. Uma variante, seria adicionar a GI periodicamente através da corrente de alimentação do reator, sendo que a enzima vai se ligando ao suporte (CETIPO), à medida que a isomerização transcorre. Esse procedimento, proposto por ANTRIM et al./ 3 conhecido por "on-column loading", apresenta como vantagens principais: o controle rigoroso da vazão das colunas, facilidade de operação, baixo custo da isomerização e operação ininterrupta por mais de dois anos. Nesse processo emprega-se GI concentrada (3500-4500 IGICU I g) e o CETIPO usado possui as seguintes propriedades: incompressibilidade, volume invariável e resistência a altas pressões operacionais. No "on-column loading" a solução de substrato deve ter as seguintes especificações: glicose (94%, em base seca), matéria seca (40-45%), condutividade (< 40 J.1S/cm), cálcio(< 1,5 ppm) e isenta de oxigênio dissolvido. Para otimizar a isomerização, devem ser mantidos sob controle os seguintes parâmetros: a) Pureza da solução substrato: o fluido de alimentação deve ser isento de material insolúvel, que pode se acumular sobre as partículas do leito fixo, causando a inativação da enzima e aumentando a pressão através da coluna. A passagem da solução substrato por coluna de troca iônica é necessária para remover o Ca2+, que é um inibidor da GI, mas que se encontra presente na solução de glicose, porque é usado como estabilizante da a.-amilase, usada nos estágios iniciais da .hidrólise do amido, do qual provém o xarope de glicose (XG) a ser isomerizado; b) Sólidos solúveis: deve ser mantido em torno de 45%. Valores acima do referido, causam aumento da viscosidade do XG, dificultando a difusão pelo leito fixo e provocando queda no rendimento da isomerização. Valor inferior, no entanto, facilitaria a contaminação microbiana; c) Temperatura: é um parâmetro importante na otimização da produtividade e na manutenção da vida útil da coluna. A faixa recomendável situa-se entre 55 e 61 oc. Temperatura mais baixa favorece a contaminação e temperatura mais alta, embora estimule a atividade da GI, tende a reduzir a produtividade após longos períodos de operação, devido à inativação da enzima. Recomenda-se o uso de temperatura alta apenas quando se deseja um aumento de produtividade em curto espaço de tempo (por exemplo, quando o desempenho do reator cai abaixo de um dado valor); d)pH: embora dependa da origem da GI utilizada, a faixa considerada adequada estaria entre 7,5 e 8,2. Aatividade enzimátiCa aumenta à medida que o pH aumenta, mas a produtivid~de ao longo do tempo diminui como resultado da ins- Exemplos de processos enzimáticos 39 I tabilidade da enzima, quando exposta a um pH não favorável por longos períodos. O ideal seria manter o pH o mais baixo possível, a fim de reduzir a formação de produtos colaterais e manter alta produtividade. Pequenas quantidades de ácidos orgânicos são formados durante a isomel,"Ízação, devendo-se, portanto, ajustar o pH do XG com tampão de carbonato de sódio; e) Oxigênio: deve estar ausente no XG, para evitar a perda de atividade da GI devido à oxidação dos resíduos de cisteína. Em geral, adiciona-se S02 na concentração entre 1-2 mM para contornar esse problema; · 2 f) Magnésio: a presença de Mg + é importante, pois é um ativador e estabilizador da GI. Recomenda-se uma concentração de .sal de magnésio entre 0,5 e 5 mM. Para eliminar o efeito adverso causado pela presença de Ca2+,a quantidade de Mg 2 + adicionada é pelo menos 20 vezes maior. AGI é inibida pelos íons cobre, zinco, níquel, mercúrio e prata/4 _ · g) Tempo de reação: a vazão de alimentação do reator (tempo de residência entre 0,5 e 5 h) é controlada de tal modo a obter um efluente com 42-45% de frutose (base seca), ou seja, um pouco abaixo do valor da concentração de equilíbrio possível para esta reação (ver eq. 17.53), visando não só reduzir o tempo total de processo, mas também, reduzir o possível efeito inibitório da frutose sobre a GI imobilizada. Pela eq. 17.54 fica claro que [(S)- (S)eq] > O implica que o processo seja direcionado no sentido glicose ~ frutose. Todos ds parâmetros do processo mencionado devem ser controlados ao mesmo tempo, a fim de otimizar a conversão glicose/frutose. Caso um deles caia fora das faixas recomendadas, uma queda temporária ou definitiva do desempenho do reator pode acontecer. Redução temporária de produtividade pode resultar da variação moderada do pH, diminuição da têmperatura, aumento da concentração de sólidos, excesso de Ca 2 + e/ ou falta de Mg 2+. Urna vez corrigido um ou mais desses proble:J?aS consegue-se recuperar o desempenho do reator. Problemas sérios aparecem quando a temperatura supera 65°C e o pH cai abaixo do valor mínimo (7,0) ou supera o valor máximo (8,2) . A principal desvantagem do reator tubular (coluna) é que vários meses de atividade enzimática potencial podem ser perdidos, devido a flutuações indesejáveis do pH e da temperatura. No processo de isomerização observa-se que a atividade da GI imobilizada decai exponencialmente com o tempo de operação, mesmo quando se usa um XG devidamente tratado. Segundo REICHELT 25 esse decaimento seria devido à desnaturação da enzima resultante das oscilações da temperatura e/ou pH. Se os parâmetros de reação são mantidos dentro dos limites recomendados pelo fabricante, evidentemente a eficiência da operação será mantida por muitos meses, até que a atividade da enzima seja reduZida a 10-20% da atividade inicial. Para manter constante a concentração de frutose no efluente, a vazão de alimentação deve ser compatível com a atividade enzimática real. Operando-se com um só reator, flutuações amplas no teor de frutose do efluente são observadas. Para reduzir esse efeito, usam-se vários reatores operados em série e/ ou em paralelo, contendo GI imobilizada em atividade por diferentes tempos. Por exemplo, com um conjunto de 8 reatores pode-se manter a variação do fluxo do xarope efluente em torno de 13%. TEAGUE; BRUMM26 propuseram um reator para isomeriza- -cç~~-~~: ~~~-~~-~:~e-~--~a~:~:~:.~~ica~~di~~e~:~ 0,6 a 1,5 m; altura do leito fix~: 2---5 ~~--- 1· _ 1 /1 _____ 1 ~. 392 Reatores com enzimas imobilizadas razão altura:diârnetro do leito no mínimo 3:1, para assegurar um padrão de fluxo no reator. O HFCS contendo 42% de frutose e 51-54% de glicose é tratado sucessivamente com carvão ativo e resina trocadora de íons, para remover a cor, "off-flavors", sais e outras impurezas. A seguir é concentrado até 70% de sólidos totais, sendo mantido entre 27°C e 32°C, para evitar a cristalização da frutose. Os xaropes contendo concentrações de frutose maiores que 42% são preparados, passando-se o HFCS 42% (contendo 50% de sólidos totais em base seca) através de adsorvente catiônico, onde a maior parte da frutose é retida. O eluato, constituído por 80-90% de glicose, 5-10% de frutose e oligossacarídeos, é reciclado para os estágios de sacarificação ou de isornerização. A frutose adsorvida é eluída com água, obtendo-se urna solução contendo .80-90% de frutose e 7-19% de glicose. Essa solução enriquecida em frutose é misturada com o HFCS a 42%, quando se deseja HFCS com teor de frutose entre 45% e 85%, ou então, é concentrada para se obter a frutose na forma cristalizada. Finalmente, as perspectivas de desenvolvimento no setor da produção de HFCS poderão se dar no sentido de: (a) reduzir os custos da isornerização, através do barateamento do preço da enzima, que deverá passar pelo melhoramento genético das cepas produtoras de GI; (b) aumentar o rendimento em frutose, que poderia ser conseguido através do uso de GI terrnoestável (por exemplo, que resista à temperatura de 90°C); (c) combinar os processos de liquefação, sacarificação e isornerização pelo uso das enzimas correspondentes (a.-arnilase, glicoarnilase e GI) numa única etapa; (d) usar o HFCS corno matéria-prima para a síntese do rnanitol, usando o Cu/sílica corno catalisador; (e) aperfeiçoar o processo da separação crornatográfica. QUADRO 17.1 - Exemplos de glicoseisomerases imobilizadas comerciais. MAXAZYME/Gist Brocades: Actinoplanes missouriensis; aprisionamento em gelatina seguida por ligação cruzada com glutaraldeído; T: 58-60°C; pH: 6,8 a 1,5; sólidos totais (ST): 40-45%; t 11 2 = 1.500 h; F*: 700-900 g xarope/L.h. SWEETZYME/Novo-Nordisk: Bacillus coagulans; células unidas por ligação cruzada con\. glutaraldeído; T: 59-61 oc; pH: 7,8-8,3; ST: 40-45%; t 112 = 1.500 h; F*: 700-900 g xarope/L.h. OPTISWEET /Miles Kali-Chemie: Streptomyces rubiginosus; GI adsorvida em sílica, seguida de tratamento com glutaraldeído; T: 54-62°C; pH=7,6; ST: 40-50%; t 112 = 1.200 h; F*= 5.500 g xarope/L.h. SWEETASE/Nagase: Streptomyces phaechromogenes; células inativadas ligadas a resina· de troca aniônica; pH: 7,3-8,0; t 112 = 1.300 h; F*: 800-1.000 g xarope/L.h. SPEZYME/Finnsugar: Streptomyces rubiginosus; GI adsorvida em DEAE-celulose ligada com Ti0 2 em poliestireno; pH=7,7; t 112 = 1.200 h; F*: 1.000 -2.400 g xarope/L.h *F= velocidade inicial de fluxo; t112 = tempo de rneia-\_'ida da enzima imobilizada. 393 Exemplos de processos enzimáticos ',,· 17.3.2 - Hidrólise da lactose I: A lactose é o principal constituinte, em termos de sólidos totais, do leite, soro e leite desnatado, respectivamente, igual a 40, 75 e 50% de sólidos. A lactose pode ser hidrolisada por via ácida ou enzimática. A vantagem da hidrólise enzimática reside no fato de que a reação se processa a temperatura relativamente baixa (ao redor de 40°C), permitindo uma maior economia energética, além de não se formarem produtos colaterais. A lactase (EC.3.2.1.23) decompõe a lactose em glicose e galactose, ressalvando-se que este monossacarídeo inibe reversivelmente a enzima, conforme a equação: v= [Vrnáx · (S)] I {S + Km · [1 + (P) I Ki] !i !; ; ;: i' i": ! ' (17.55) A lactase (beta-galactosidase) é obtida de vários microrganismos, sendo os preparados comerciais obtidos de leveduras (Kluyveromyces fragilis; K. lactis) e de fungos (A. niger; A. oryzae). As lactases dessas duas fontes diferem basicamente no pH de atividade ótima, já que as de levedura têm pH ótimo entre 6,0 e 7,0, enquanto que as de fungos entre 4,0 e 5,0. Por isso, as lactases de levedura e fúngicas são recomendadas para deslactosar o leite integral (pH=6,8) e o soro de leite (pH=4,6), respectivamente. As lactases são inativadas por metais pesados (Cu2+; zn2+; Hg2+) e as de levedura, em particular, são inibidas pelo Ni2+ e Ca2+. Por outro lado, K+, Mg2+ e Mn2+ são ativadores nas concentrações, respectivamente, de 10-2 a 1Q-1M, lQ-3 a lQ-4 Me lQ-4 a 10-s M. A unidade lactásica é definida como sendo a quantidade de enzima que libera 1J.1mol de glicoselmin sob condições definidas.27 Caso se utilize-o substrato sintético ortonitrofenil-beta-D-galactopiranosídeo (ONPG) a unidade seria a quantidade de enzima que hidrolisa 1J.l.mol de ONPGimin. Os processos-de deslactosação de maior interesse industrial são: I ! I a) Deslactosação do soro de leite: SORO ~ PASTEURIZAÇÃO ~ AJUSTE DO pH ~ HIDRÓLISE DA LACTOSE (80-90%) ~ DESMINERALIZAÇÃO ~PASTEURIZAÇÃO ~EVAPORAÇÃO~ XAROPE (70% DE SÓLIDOS TOTAIS). I I I •, l b) Deslactosação do leite integral: Pode ser feita de duas maneiras: b .1) LEITE ~TRATAMENTO A ALTA TEMPERATURA POR CURTO PERÍODO DE TEMPO (UHT) ~ADIÇÃO DE LACTASE ESTÉRIL~ EMBALAGEM ASSÉPTICA ~ HIDRÓLISE DENTRO DA EMBALAGEM-> LEITE DESLACTOSADO E TRATADO POR UHT. i !' t 394 Reatores com enzimas imobilizadas b.2) LEITE---+ PASTEURIZAÇÃO---+ LACTASE (80% DE HIDRÓLISE)---+ PASTEURIZAÇÃO---+ LEITE DESLACTOSADO E PASTEURIZADO. WEETALL, et al. 27 imobilizaram a lactase fúngica (A. niger) em partículas porosas de Si02 (30145 mesh; 370 angstroms de diâmetro) para deslactosar soro de leite. O coeficiente de imobilização foi da ordem de 80%, tendo cada grama de suporte ligado 620 U de atividade lactásica total. A energia de ativação para a reação catalisada pela la c tas e imobilizada foi da ordem de 8 kcal/ moi, enquanto que para a enzima solúvel foi de 11 kcallmol. O pH ótimo da lactase imobilizada foi igual a 4,5 e o da enzima solúvel 6,0, indicando que o suporte empregado possuía uma densidade de carga residual positiva. O Km e o Ki para a lactase solúvel foram iguais a O,llM e 0,67 mM, respectivamente, enquanto que para o sistema lactase-Si02 foram, respectivamente, iguais a 0,071 Me 3,27 mM. A meia-vida da lactase imobilizada foi de aproximadamente 70 dias, além do que o soro de leite deveria ser desmineralizado e desproteinizado antes de ser introduzido no reator (diâmetro = 4 polegadas; carregado com 3 kg de lactase-Si02). Os autores estabelecerampara o reator utilizado a seguinte equação de processo: t ·Vmáx =[So- S] · [1- (Km I Ki)] + Ln[(So) I (S)] · {[So · Km I Ki] + Km} (17.56) Como resultado final do desenvolvimento, os autores descreveram o funcionamento de uma planta de deslactosação de soro de leite com capacidade de processar 10.000 Lb-peso lactosel dia sendo de 50% a hidrólise da lactose inicial. O deslactosador é operado com lactase-Si02 (300 UI g) a 35°C, sendo o balanço de massa governado pela eq. (17.56). 17.3.3 - Obtenção do ácido 6-amino-penicilânico • O 6-APA é um intermediário-chave na produção das penicilinas semi-sintéticas. É obtido pela hidrólise química ou enzimática (penicilinamidase) da benzilpenicilina, que, por sua vez, é produzida através da fermentação, usando-se fungos do gênero Penicillium. 28 LAGERLOF et al. 29 usaram a penicilinamidase imobilizada em Sephadex G-200 para a produção do 6-APA em escala piloto. Foram desenvolvidos dois processos: Processo batelada: 20,5 kg de diidrogenofosfato de sódio são dissolvidos em 2.900 L de água potável, em um reator termostatizado a 35°C. A seguir, o pH é ajustado a 7,8 e são adicionados 30 1 de uma suspensão de penicilinamidase imobilizada (atividade total (AT) = 3,7 x 106 U; peso úmido= 16,5 kg). Homogeneiza-se bem a mistura e, em seguida, dissolvem-se 100 kg de benzilpenicilina em pó, mantendo-se o sistema sob agitação e pH rigorosamente controlado. Uma vez concluída a hidrólise, o conteúdo do reator é filtrado através de filtro prensa, sendo o sistema imobilizado a) Exemplos de processos enzimáticos 395 recolhido e reutilizado em novo lote. Segundo os autores, a mesma quantidade de enzima imobilizada foi usada num total de 100 lotes. b) Processo contínuo: Em um funil munido de placa porosa são filtrados 3 L de suspensão de sistema imobilizado (AT= 0,12x106U; peso úmido= 500 g). Sob~e o depósito de material retido no filtro é colocada outra placa porosa, a fim de formar um leito fixo. A seguir, faz-se passar pelo sistema 90 L de uma solução aquosa (pH=7,8) de fosfato monossódico (6,6 g/L) e benzilpenicilina (33,3 g/L) . A temperatura do sistema é mantida a 37°C. O efluente, após vários reciclos pelo reator, é coletado, o pH ajustado para 2,5, adicionando-se, a seguir, metilisobutil acetona na proporção 2:1, a fim de retirar o ácido fenilacético formado durante a hidrólise. A fase aquosa é recuperada, o pH ajustado a 7,8 e concentrada cerca de dez vezes em relação ao volume inicial. Ao ajustar-se a 4,5 o pH do concentrado ocorre a precipitação do 6-APA, que após separação é submetido à secagem a vácuo. O rendimento do processo é da ordem de 90%. Comparando ambos os processos, os autores concluíram ser o processo contínuo vantajoso, devido à alta produtividade, à redução do custo da mão-de-obra e à redução das perdas de sistema imobilizado. Referências bibliográficas (1) VITOLO, M. Tópicos de enzimologia industrial. São Paulo, Ed. do Autor, 1981. (2) KOBAYASHI, T.; MQO-YOUNG, M. Backmixing and mass transferin the design of immobilized-enzyme reactors. Biotechnology and Bioengineering, v. 13, p.893-910, 1971 . (3) CHUNG, S.F.; WEN, C.Y. Longitudinal dispersion of liquid flowing through fixed and fluidized beds. AIChE, v. 14, n.6, p.857-866, 1968. (4) O'NEILL, S.P.; DUNNILL, P .; LILLY, M.D. A comparative study of immobilized amyloglucosidase in a packed bed reactor and a continuous feed stirred tank reactor. Biotechnology and Bioengineering, v . 13, p.337-352, 1971. (5) PITCHER, W .H. Design and operation of immobilized enzyme reactors. In: MESSING, R.A. 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A grande vantagem desses sistemas decorre da possibilidade da ampliação de seu uso, devido ao barateamento desses componentes; da maior possibilidade de interfaceamento, acompanhamento e gerenciamento de dados e do aumento de funções lógicas e programáveis dos controladores. Devido aos recursos computacionais, eles ampliam as opções de algoritmos de controle, bem como podem realizar funções mais complexas~ como a estimativa de variáveis não medidas, implementação de técnicas de otimização e identificação de processos. Contudo, a aplicação de controle automático em processos fermentativos tem evoluído relativamente pouco, devido a características específicas dos processos biotecnológicos que dificultam o controle automático, ou seja, a dificuldade de medidas em linha das principais variáveis do processo e a sua complexidade cinética, que dificultam a elaboração de modelos para correlacionar corretamente as variáveis de estadocom as variáveis manipuladas. 1 Apesar das dificuldades apontadas, os processos fermentativos vêm acompanhando a tendência de maior instrumentalização e automação registrada em outras áreas . . A aplicação do controle automático nos processos fermentativos permite uma maior reprodutibilidade da produção, garantindo melhor qualidade do produto, maior segurança e otimização da produção, para maior economia do processo. Com o .crescente aumento dos níveis de concorrência entre empresas, o controle de processos passa a ser estratégico e imprescindível na corrida por menores custos e ganhos de produtividade. Não é qualquer exagero dizer, que as companhias que não observarem um rigoroso controle de seus processos estarão fora do mercado num horizonte de tempo de curto prazo. ··· - - -.--- -·-- ······· ··-- - --- - . ------ -----·-- ······------- - ---- ---- --~ ----------,------ 398 Automação e controle de processos fenmentativos 18.2 - Principais instrumentos para monitoração em linha de processos fermentativos A obtenção de dados, que caracterizem a evolução no tempo das reações biológicas, é pré-requisitopara o entendimento e controle de processos biotecnológicos. Grande esforço tem sido feito para desenvolver sensores que forneçam sinais adequados, mesmo sob condições ambientais complexas, e que indiquem a evolução do processo. Tendo isso como base, é possível compreender a importância da existência de sistemas analíticos que gerem sinais em linha, ou seja, imediatamente disponíveis na forma de sinais elétricos para o ·controle dos processos fermentativos. Vários autores apontam a falta de sensores em linha como uma das principais limitações na aplicação do controle automático aos processos fermentativos. São poucos os sensores in situ (localizados no fermentador), esterilizáveis e que fornecem medidas sem atrasos significativos. No entanto, algumas técnicas recentes como Turbidimetria utilizando Fibras Ópticas, Cromatografia Líquida de Alto Desempenho (HPLC) e Análise por Injeção em Fluxo (FIA), entre outras, vêm sendo incorporadas aos processos fermentativos, aumentando a capacidade de observá-los e controlá-los. A seguir é apresentado um resumo das principais determinações em linha aplicadas a processos fermentativos. 18.2. I - Medidas baseadas em princípios físicos Temperatura Devido à estrita dependência do crescimento microbiano para com a temperatura e pela facilidade de sua determinação, a temperatura é a variável mais freqüentemente medida e controlada. Nos processos fermentativos, o intervalo de medida situa-se entre 0°C e 130°C. Essa medida é feita, principalmente, por termôm~tros baseados na variação da resistência de sensores metálicos (Cu, Ni, Pt ou liga RhFe). Esses termômetros contêm um fio metálico, dentro de um <;ilindro metálico para proteção, por onde se faz passar uma corrente elétrica constante. Devido à variação da resistência com a temperatura, ocorre variação de tensão no fio, que pode ser relacionada com a temperatura. Embora essa relação não seja linear para todo o intervalo de medida do aparelho (entre -100 a 650°C), é possível admitir essa linearidade como válida para o intervalo de medida utilizado nos processos fermentativos . 2 . Pressão Não existe dependência direta da pressão sobre os microrganismos, a não ser em casos extremos, porém ela afeta indiretamente b metabolismo pela sua influência na solubilidade dos gases dissolvidos. Devido à necessidade de interfaceamento elétrico, os medidores de pressão, manômetros, contêm elementos que convertem a deformação elástica do elemento sensor em sinal elétrico (transdutores de pressão). Como o deslocamento produzido é proporcional à pressão, pode-se estabelecer uma relação entre a deformação mecânica e o sinal elétrico. Existe uma grande variedade de transdutores, podendo-se destacar os capacitivos, os piezoelétricos e os extensômeros elétricos, strain-gages. Principais instrumentos para mon~oração em linha de processos fermentativos 399 O transdutor de pressão capacitivo consiste de duas placas capacitivas, separadas por uma membrana ou elemento sensor de capacitância (ver Fig. 18.1). A pressão a ser medida é transmitida através da membrana isoladora para o elementos sensor, imerso no óleo. A deformação do elemento sensor altera a capacitância entre as duas placas gerando um sinal elétrico, na forma de corrente ou tensão, proporcional à pressão exercida. O princípio de medida; de um medidor piezoelétrico baseia-se na propriedade do elemento sensor, um cristal, que submetido a uma tensão mecânica gera uma carga elétrica diretamente proporcional à força aplicada. O medidor por strain-gages é composto de um cilindro oco, em cuja superfície são colocadas quatro tiras de medição extensométrica de forma transversal em relação ao eixo do cilindro. Essas tiras são fios metálicos ou outro condutor elétrico. Quando se aplica uma pressão, a parede do cilindro se expande e as tiras a~ mentam sua resistência elétrica. Essas tiras estão ligadas eletricamente, formando uma ponte de Wheatstone. Nesse circuito estabelece-se uma tensão fixa e qualquer diferença das resistências gera um sinal elétrico (corrente ou tensão), que pode ser correlacionado com a pressão. 3 . . Placas capacitivas Elemento sensor Figura 18.1 - Conjunto sensor de um transdutor capacitivo. Medidas de vazão gasosa As medidas de vazão gasosa são necessárias para quantificar o ar fornecido ao fermentador e para controle de 0 2 dissolvido no meio. Outra aplicação comum é a quantificação do consumo de 0 2 e da produção de C02, na fermentação, e a correlação dessas medidas com o crescimento celular. Os principais instrumentos utilizados para a determinação de vazão gasosa são: Medidores de vazão de área variável (Rotâmetros). Nesses medidores, indicados na Figura 18.2, o fluido escoa em tubo cônico, vertical, de baixo para cima, no qual há um flutuador. Como o peso do flutuador é constante, o aumento da vazão acarreta um aumento da área livre de escoamento, uma vez que a perda de carga permanece constante. De.s sa forma, a posição do flutuador é uma indicação da vazão. A posição do flutuador pode ser convertida em sinal elétrico gerando medidas em linha de vazão. 4 J· 400 Automação e controle de processos fermentativos Saída de ~;:::::: J:...;.F...;.;;Iu=id"""o-+ Flutuador • Entrada de Fluido Figura 18.2 - Rotâmetro de vidro. Medidor térmico de vazão mássica. Esse medidor (Figura 18.3) vem sendo o principal método de medida de vazões gasosas para fermentadores pequenos. No medidor, uma fração dos gases passa através de um duto, que apresenta uma fonte de calor e dois sensores (termistores) mantidos antes e depois da fonte de calor. O princípio de medida baseia-se no fato de que a quantidade de energia necessária para manter um perfil de temperatura constante em um fluido é função davazão mássica. Assim, -';lledindo-se o calor fornecido e a diferença de temperaturas, é possível estimar a vazão mássica. Dependendo das faixas de temperaturas utilizadas, da variação das propriedade do fluido (calor específico) e do fio (elemento sensor), é possível estabelecer uma relação linear entre a vazão e a relação calor gerado I diferença de temperaturas. A vazão gasosa é calculada por circuito eletrônico e pré-ajustada com um gás de calibração. Quando se utiliza um gás diferente, o fabricante fornece fatores de correção que levam em conta as especificidades do gás utilizado. Como as medidas necessárias (calor fornecido e temperatura) são facilmente convertidas em sinais elétricos, pode-se dispor de uma medida em linha da vazão. A principal vantagem dessa medida é a sua independência da pressão do gás. Contudo, os medidores são susceptíyeis à sujeira dos gases. Dessa forma, sua manutenção exige cuidados para evitar a entrada e acúmulo de impurezas no sensor. Em geral, o medidor vem junto com unidade para controle de vazão (válvula de controle e controlador). Medidas de vazões líquidas Os medidores de vazão líquida, utilizados em processos fermentativos, são equipamentos comuns aos processos químicos, porém devem atender a algumas características específicas, especialmente a necessidade de .esterilidade do processo e manipulação de meios naturais (presença de sólidos em suspensão). Os mais comuns são: Medidores de pressão diferencial. Vários medidores são disponíveis para correlacionar medidas de diferenças de pressão, geradas por dispositivos mecânicos, com vazões (placas de orifício, tubo de Venturi). A forma mais comum é a utilização de placas de orifício, Figura 18.4. Nesses dispositivos o diferencial de pressão é. proporcional ao quadrado do fluxo. Assim utilizando-se transdutores de pressão, é possível obter-se uma medida em linha da vazão. Principais instrumentos para monitoração em linha de processos fermentativos 40 I Válvula agulha Termistores Controlador Referência (setpoint) Fio aquecido ! Figura 18.3 - Medidor térmico e controlador de vazão mássica. Medidores magnéticos. Esses medidores consistem em um tubo não magnético coberto com material isolante, com dois eletrodos em lados opostos, que produzem uma campo magnético perpendicular ao fluxo do fluido. A passagem de líquidos eletricamente condutores por esse dispositivo permite o surgimento de uma força eletromotriz entre os dois eletrodos, segundo a Lei de Faraday de indução eletromagnética. Essa força é amplificada em um conversor e fornece um sinal de corrente linear com a vazão. Esse tipo de medidor é muito apropriado para medições de líquidos contendo lamas, polpas e líquidos condutores em geral. Não oferece nenhuma restrição à passagem dos fluidos, tendo uma perda de carga equivalente a de um duto com o mesmo comprimento ocupado pelo medidor. 4 Figura 18.4 - Placas de orifício. Balanças. Reservatórios de alimentação, colocados sobre balanças conectadas a microcomputadores, são extremamente úteis para a determinação da massa (volume) adicionada ao fermentador a qualq~er instante. A principal vantagem ~---- . · -- ---, --~- ---- --·-·- ------.-··· . ····----- - - - ·~--· ·-- --~,--- --- ------:----- I _______ _j 402 Automação e controle de processos fenmentativos da utilização de balanças é a precisão da medida (urna unidade em 3.000 ou até 1 em 300.000). Contudo, a diminuição significativa do peso do reservatório, dependendo das vazões empregadas, pode tardar frações de hóras e pode levar a erros quando se realizam determinações diferenciais em intervalos de tempo curtos. Em conseqüência, essas determinações acabam necessitando longos intervalos de tempo para medida e cálculo e, desta forma, a determinação é mais utilizada para calibração de bombas que para determinação em linha de vazão. 2 Velocidade de agitação _ A medida e o controle da freqüência de agitação são de fundamental importância para o controle de oxigênio dissolvido no meio de cultivo. Em geral, a medida da freqüência de rotação do eixo de agitação é feita por tacômetro CC e urna interface do aparelho converte o sinal de medida para sinal analógico de 0-10 V. Um tacômetro CC é um dispositivo eletromecânico, que contém um gera~ dor de fluxo magnético, um rotor e um dispositivo onde o campo magnético gerado induz. urna tensão. Nesse tacômetro, o fluxo magnético é produzido por um rnagneto permanente e por espiras localizadas no rotor. Para urna velocidade zero não há movimento relativo entre o campo magnético e o filamento de saída e, dessa forma, a tensão de saída é zero. O aumento da velocidade do eixo acarreta um aumento da tensão; Essa tensão gerada tem a forma senoidal e um comutador e um par de escovas convertem a tensão CA em CC. A Figura 18.5 representa um tacômetro CC. .------------.--0 Terisao de salda .. Eixo de entrada Rotor com espiras Figura 18.5 - Tacômetro CC. ;· Antiespurnante Devido à agitação e aeração dos ferrnentadores, pode ocorrer a dispersão da fase gasosa no meio de cultura e, em conseqüência, a formação de espuma. Dependendo. da intensidade do fenômeno, a espuma pode trazer distúrbios ao processo como, por exemplo, o bloquearnento de linhas e filtro de exaustão. A espuma pode ser evitada tanto por meios mecânicos corno por agentes químicos. Os agentes químiCos mais comuns são óleos, emulsões de óleo e água, óleos à _j_ ______ · -- --- - - - - Prindpais instrumentos para monrtoração em linha de processos fermentativos 403 base de silicone e parafinas. Por outro lado, esses agentes químicos podem afetar o crescimento celular e a transferência de oxigênio para o meio e por isso sua adição deve ser minimizada. Isso é possível com sistema de medida e controle da adição de antiespumante. Utiliza-se comumente uma sonda, que consiste numa haste condutora de eletricidade, montada na tampa do fermentador. Ao entrar em contato com a espuma, a haste ativa um circuito elétrico que liga uma bomba permitindo a adição contrblada de antiespumante. A diminuição de espuma interrompe o circuito, que desliga a bomba. 18.2.2 - Medidas baseadas em princípios físico-químicos Acidez (pH) Como a temperatura, o pH é freqüentemente controlado nos processos biotecnológicos, devido à sua influência na atividade enzimática e no metabolismo microbiano. O pH é medido potenciometricamente com sondas esterilizáveis, que consistem numa combinação de eletrodo de vidro com eletrodo de referência (ver Fig. 18.6). A metade correspondente ao eletrodo de vidro é composta de membrana de vidro, fio de prata recoberto com cloreto de prata imerso em solução de AgCl, saturado com KCl sólido. A metade correspondente ao eletrodo de referência é feita do mesmo material (fio de prata e solução de AgCl saturada). Variações do pH do meio de cultura alteram a diferença de potencial elétrico nas faces da membrana de vidro. Essa diferençé! de potencial, medida em relação ao eletrodo de referência, é proporcional à concentração de íons entre as faces. Como a concentração de íons H+ é mantida constante dentro do eletrodo de vidro por solução tampão, é possível correlacionar o potencial E;létrico e a concentração de íons H+ no meio de cultivo. O principal problema na operação prolongada do eletrodo é a deterioração do eletrólito devido a esterilizações sucessivas da sonda. 5' 6 Eletrodo de vidro ~ l Elotcodo.do """""' -Diafragma Membrana de vidro Figura 18.6 - Sonda de pH (detalhe). Oxigên1odissolvido (p02 ) Como a solubilidade de oxigênio em meio líquido é baixa, o seu fornecimento ao meio, por transferência de massa, é de fundamental importância para evitar ·~-~'---7--------------------- 404 limitações ou controlar o desenvolvimento de processos bioquímicos. O oxigênio é determinado por sondas que medem o potencial polarizador do meio ferrnentativo (ver Fig. 18.7). O oxigênio é reduzido por meio de catodo aplicando-se um potencial polarizador entre 600 rnV-750 rnV, gerado externamente (método polarográfico) ou internamente (método galvânico). Urna membrana separa o eletrólito do meio para melhorar sua seletividade. Ela é responsável pela característica do sensor, que é controlado por difusão. O eletrodo gera urna corrente elétrica proporcional à quantidade de oxigênio que difunde para a sonda através da membrana, e essa velocidade de difusão é proporcional à pressão parcial de oxigênio no meio. Dessa forma determina-se, na verdade, a pressão parcial de oxigênio e a medida é fornecida corno porcentagem da pressão de saturação de oxigênio no meio. Urna sonda galvânica contém eletrodos de chumbo e prata com eletrólito alcalino. A corrente elétrica gerada ocorre devido às seguintes reações: i i ~ i I: I! ! ! Automação e controle de processos (ermentativos 02 +2H 2 0+4 e ~4oH - (catodo de prata) (anodo de chumbo) 2Pb Urna sonda polarográfica consiste de um de anodo tubular de prata e um (catodo), fio de platina imerso num eletrólito de cloreto de prata. A tensão externa polariza os eletrodos onde ocorrem as seguintes reações: lj 0 2 +2H 2 0+4e ~40H4Ag+4Cl- ~4AgCl +4e (catodo de platina) (anodo de prata) Registra-se urna diminuição da sensibilidade da membrana devido à incrustação de impurezas levando a leituras errôneas, especialmente para baixas concentrações. Observam-se também ruídos característicos do sinal de saídtt, devido às variações da fluidodinârnica do reator e a passagem de bolhas de ar próximas à rnernbrana. 2 0r-G ~ r- Isolante ~~~ ·: Anodo '" i . ~ Eletrólito - - ; < ;;:_:_;:;. ~. = I ) 1 l Catodo Membrana porosa Figura 18.7 - Sonda de p0 2 . Principais instrumentos para monitoração em linha de processos fennentativos 405 Oxigênio na fase gasosa A medida de oxigênio na fase gasosa é baseada nas propriedades para~ magnéticas da molécula de oxigênio. Mudanças na concentração mássica de 0 2 afetam a densidade de um campo magnético e, assim, as forças (dia ou para) magnéticas geradas por esse campo. Dentro da célula de medida existe um dispositivo mecânico que pode girar em função da variação de campo magnético causado pela presença de 0 2 • Essas forças podem ser compensadas por forças elétricas e a corrente elétrica necessária pode ser relacionada com a concentração mássica de 0 2 na corrente gasosa . É feita uma posterior conversão em fração molar (% de 02), sendo conhecida a pressão total. É possível multiplexar esse instrumento (ligando vários fluxos gasosos e alternando-os) realizando várias análises de 0 21 provenientes de vários fermentadores com um único analisador, reduzindo os custos de instrumentação. Nesse caso, devem ser considerados os atrasos na medida, devido ao transporte dos gases e à preparação da amostra (secagem e filtração) . Além do sensor paramagnético para a determinação de 0 21 constata-se um aumento da utilização da espectrometria de massa para essa determinação, assim como de outros compostos gasosos (C0 21 N 21 H 21 CH 4 ) ou voláteis presentes nos processos fermentativos (álcoois, acetonas). Essa técnica garante maior reprodutibilidade e precisão, além de permitir o aumento do número de compostos possíveis de serem determinados em linha. A grande limitação desse método reside no custo elevado do equipamento de medida. 7 co2 na fase gasosa Embora a maioria dos gases absorvam radiação na faixa do infravermelho (IR), os gases como H 2 , N 2 e 0 2 não absorvem, o que permite usar essa característica para medir C0 2 em misturas com esses gases. Um analisador de infravermelho C-O nsiste de Uma fonte de luz ( Â,, < 15 J..lm, particularmente, À. = 3 J..tm), uma seção óptica e sensor . Quando o gás a ser medido entra no analisador, ele passa por uma célula mantida entre a fonte de luz e o sensor. Ao absorver a radiação, o gás reduz a energia que atinge o detector. Essa mudança é medida e ampliada para fornecer um sinal elétrico que será proporcional à pressão parcial de C0 2 na mistura, que pode ser convertida em concentração. A relação entre absorção no infravermelho e concentração de C0 2 é logarítmica, o que implica em falta de sensibilidade do método para altas concentrações de C0 2 • 8 Além da medida por absorbância de infravermelho, como já afirmado anteriormente para a análise de 0 2 na fase gasosa, também vem sendo utilizada a técnica de espectrometria de massa para a determinação de C0 2 • 18.2.3 - Medidas de biomassa A determinação de biomassa é um fator-chave para o conhecimento e controle dos processos fermentativos, pois a concentração determina, entre outras, 406 Automação e controle de processos fermentativos as velocidades de crescimento e/ou formação de produtos. Todos os modelos matemáticos usados para descrever crescimento celular ou formação de produto contêm a biomassa como a variável de estado importante. Contudo, essa determinação é bastante complexa, pois envolve a determinação de grandes populações celulares com propriedades individuais. Essas propriedades individuais variam significativamente, dependendo das condições do microambiente, do histórico do crescimento, da posição da célula no ciclo de reprodução ou da interação com outras células ou superfícies. 9 Contudo, devido ao alto número de células presentes nos processos fermentativos, a análise de propriedades individuais das células tem sido negligenciada. Para fins de controle, é essencial que a determinação de biomassa seja em linha e sem atrasos significativos em relação à dinâmica do processo. Os métodos para determinação de biomassa apresentam algumas características comuns: (a) são medidas indiretas; (b) necessitam de uma curva que relacione a variação da propriedade medida (p.ex., transmitância) com a concentração de biomassa, ou seja, necessitam de uma curva de calibração ou modelo de observação. Essa última característica exige que esse modelo seja verificado a cada aplicação específica, ou seja, uma calibração a .cada sistema reacional e também a tomada de cuidados para a não utilização do modelo de observação fora do intervalo de validade . Muitos dos métodos indiretos não têm aplicação geral, pois estão sujeitos a restrições devido a características do crescimento celular (crescimento unicelular ou formação de agregados) e do meio de cultura (mudança de cor, viscosidade, formação de particulados) .9 As principais técnicas empregadas para medida de biomassa em linha consistem em fazer passar um feixe de luz por um meio e medir a quantidade recebida em uma célula fotossensível. A intensidade da luz tnfnsmitida (I) é dada por I = I ,e-•b onde [, é intensidade da radiação emitida, -r é uma propriedade do meio e b está associado ao caminho percorrido pela luz no aparelho de medida (caminho óptico). Quando o meio apresenta material particulado, como no caso da determinação de biomassa, -r é definido como turbidez do meio que, rearranjando-se a equação anterior, pode ser definida como: -r = 2 03 ' log (I , I I) b. A turbidez depende do número de partículas presentes na suspensão, do tamanho e da forma das partículas, além de outras características do meio e é determinada por dois fenômenos associados à passagem da luz pelo meio e que ocorrem simultaneamente: a absorção da luz e o seu espalhamento, devido à presença de material particulado em suspensão. A Figura 18.8 ilustra os principais fenômenos envolvidos na determinação de biomassa. Principais instrumentos para monrtoração em linha de processos fermentativos 407 Luz refletida Fe~e Espalhamento lnoldente \ Feixe transmitido Absorção Figura 18.8 - Fenômenos envolvidos na determinação de biomassa. O fenômeno característico a ser medido depende fundamentalmente do projeto do sensor (célula fotossensível). Assim, são encontrados quatro tipos de aparelhos: • aparelhos construídos de modo a medir a radiação absorvida pelo meio; • aparelhos construídos para medir a intensidade da luz espalhada na mesma direção do feixe de luz incidente (jorward scatteríng); • aparelhos construídos para medir a intensidade do feixe transmitido por espalhamento na direção oposta ao feixe de luz incidente (backward scattering); · • aparelhos construídos para medir a intensidade do feixe transmitido por espalhamento na direção perpendicular à direção do feixe de luz incidente (nefelometria). Os sensores do primeiro caso determinam a luz transmitida num caminho especificado, sufiCientemente longo para medir a sua diminuição. Os sensores para medida de espalhamento na direção oposta ao feixe incidente apresentam, segundo seus fabricantes, simplicidade de projeto, uma vez que a fonte de luz e o receptor podem ser arranjados próximos, permitindo a construção de sensores extremamente compactos. Por outro lado, também segundo seus fabricantes, esses sensores podem ser utilizados para medir sistemas com altos níveis de turbidez. Os sensores para medida de espalhamento da direção do eixo de emissão (jorward scattering) e nefelômetros são utilizados principalmente para medir sistemas com baixos níveis de turbidez, pois o sinal deste espalhamento é mais intenso nestes sistemas. Os principais problemas encontrados nas determinações ópticas são a sua falta de linearidade num intervalo amplo de medida, as dificuldades de limpeza do instrumento óptico e interferências com partículas e bolhas de gás, assim como perda da intensidade luminosa durante o percurso do feixe luminoso, devido a altas concentrações celulares. 9 408 Automação e controle de processos fermentativos 18.2.4 - Determinações de substratos e produtos na fase líquida HPLC (High Performance Liquid Chromatography/Cromatografiq Líquida de Alto Desempenho). O termo HPLC originalmente decorre da utilização de bombas para movimentar as amostras pelo interior de colunas em vez de operar à pressão atmosférica, ou seja, operando a "alta pressão" (High Pressure). Contudo, como a mudança das condições de pressão não é a principal característica desse sistema, vem sendo adotado internacionalmente o termo High Performance. As principais vantagens dessa técnica cromato§ráfica, que vem apresentando grande desenvolvimento nos últimos 25 anos, são: 10' 1 • respostas rápidas (minutos); • precisão e reprodutibilidade; • utilização de pequenos volumes de amostras. A cromatografia líquida, como a cromatografia gasosa, baseia-se na separação diferenciada dos componentes de uma solução líquida, devido à interação com uma fase estacionária. Essa separação ocorre devido a diferentes afinidades entre os componentes da fase líquida (móvel) e a fase estacionária. A cromatografia líquida é caracterizada quando a fase móvel é líquida. Podem ser caracterizados os seguintes tipos de cromatografia líquida de alto desempenho: Cromatografia Líquido-líquida (Cromatografia de partição): Neste caso, a separação ocorre por partição diferenciada entre o componente na fase móvel (líquida) e o componente na fase estacionária (líquido). Para maior estabilidade, a fase líquida estacionária é ligada quimicamente ao material de empacotamento de uma dada coluna (em geral sílica ou alumina). Essa cromatografia é dividida em: a) Fase normal; b) Fase reversa. Na Cromatografia de f~se normal, a fase móvel tem polaridade ~nor que a fase estacionária, enquanto na Cromatografia de fase reversa, a polaridade da fase móvel apresenta polaridade superior à fase estacionária. Essa última é mais usada, pois utiliza água como fase móvel para vários solventes orgânicos. Contudo, . o tempo de analise é maior que outros tipos de cromatografia. A Cromatografia de fase reversa é usada na separação de compostos orgânicos, particularmente compostos que diferem apenas pelo número de átomos de carbono. Cromatografia Líquido-sólida (Cromatografia de adsorção). Esse tipo de cromatografia envolve a competição de componentes da amostra líquida pelos sítios ativos de adsorção da fase sólida contida em colunas. Sílica é o suporte mais difundido. É usada para separar compostos orgânicos de peso molecular intermediários sendo muito útil na separação de compostos orgânicos com diferentes grupos funcionais, inclusive separando isômeros. Cromatografia de troca iônica (IEC). É usada principalmente na separação de compostos iônicos (ou ·altamente polares) . A fase estacionária é uma resina iônica, altamente permeável polarizada, obtida a partir de estireno e divinil benzeno com Principais instrumentos para monitoração em linha de processos fermentativos 409 um grupo funcional adequado. Essas resinas estão sendo substituídas por resinas de troca iônica, ligadas ao suporte sólido, que melhoram a separação e geram colunas mais estáveis. A grande vantagem da IEC é que todas as espécies iônicas podem ser determinadas num único aparelho. Cromatografia por exclusão de tamanho (Exclusão estérica, Exclusão líquida, Filtração em gel, Permeação em gel). Os componentes são separados de acordo com o seu peso molecular. O mecanismo de retenção depende mais das dimensões das moléculas da amostra que das características físicas do enchimento. Moléculas menores que o poro médio da coluna permanecem mais tempo na coluna que moléculas maiores. Isso resulta num cromatograma com distribuição de pesos moleculares, ou tamanhos de moléculas, com tempos de residência menores para as maiores moléculas. Esta técnica é utilizada para caracterização de polímeros. Os principais componentes de um sistema cromatográfico de alto desempenho são: coluna, bomba para acionamento da fase móvel, válvula de injeção, detectores e módulo de processamento (integradores). Para incorporação de HPLC ao processo, para análises em linha, são necessários ainda alguns módulos adicionais ao sistema cromatográfico para remoção de amostra e filtragem contínua e, dependendo das concentrações do processo, de diluição de amostras. A utilização de microprocessador nos módulos de processamento dos sistemas de cromatografia permite automatização das análises e transmissão de dados do analisador ao computador de processo. A Figura 18.9 mostra uma instalação para análise em linha com HPLC. Filtrado água . Micro ~ Bomba HPLC da fase móvel Figura 18.9 - Configuração para análise e~ linha com HPLÇ. FIA (Análise por Injeção em Fluxo/F/ow lnjection 12 ~nalysis) A análise por FIA é uma técnica relativamente recente de análises químicas em linha, e atualmente restrita a certos sistemas analíticos bem definidos . Isso ocorre visto que a determinação de um determinado composto necessita do desenvolvimento de método analítico específico que estabelece uma reação química, modificadora de uma característica do meio reacional. Essa proprieda- 41 O Automação -e controle de processos fermentativos de normalmente pode ser a cor do meio ou potencial elétrico. Apesar do número restrito de compostos determinados pela técnica FIA, esta pode ser caracterizada como uma das técnicas de maior aplicação potencial para monitoramento e controle de processos de fermentativos, especialmente devido à rápida resposta deste sistema de análise e a flexibilidade de incorporação de novos sensores. As principais vantagens apontadas para o sistema FIA, 13 são: • freqüência de análise muito alta, quando comparada com análises convencionais; • pequenos volumes de amostra; • amostragem e preparação da amostra integradas nos sistemas FIA; • calibração a qualquer momento; • poucas interferências (devido à diluição e ao tratamento da amostra); • confiabilidade do sistema; • grandes tempos de operação dos sensores; • flexibilidade para incorporação de novas técnicas analíticas. A técnica de Flow Injection Analysis (FIA) fundamenta-se portanto na injeção de uma amostra numa corrente líquida contínua não segmentada. À corrente de amostra são adicionados reagentes, de modo a formar uma zona de reação que é continuamente transportada para um detector que pode determinar absorbância, potencial de eletrólito ou qualquer outra propriedade física da solução. FIA compreende três blocos principais: • manipulação da amostra e transporte, que consiste na retirada de uma amostra do reator e condicioná-la para a análise; ' • especificação, que permite a eliminação de interferências ou outros produtos, de maneira a assegurar a proporcionalidade da propriedade medida com a espécie reagente; • detecção utilizando algum tipo de transdutor, de forma a gerar um sinal proporcional à espécie a ser determinada. • ,----------~----------------~ I - F = Filtro P = Padrões CM = Câmara de mistura; D = Detector I =Tratamento e interpretação de dados; GOD = Câmara reacional; Figura 18.1 O - Sistema FIA para análise on-line de glicose. 16 Controle aplicado a processos fermentativos 4 li Existe uma grançle flexibilidade para compor esses três blocos, de modo a gerar distintos sistemas de análise. De forma geral, FIA pode ser entendido como um sistema fechado, miniaturizado, que retira continuamente uma amostra e a processa até ela chegar a um detector. As principais determinações realizadas com sistemas FIA, 14' 15 estão indicadas na Tabela 18.1 e a Figura 18.10 ilustra os principais componentes de um sistema FIA. Tabela 18.1 - Principais determinações com sistema FIA Determinação Método Detector -·:i I.,_, ~~: Sacarose Glicose oxidase, catalase Termistor Glicose Glicose oxidase Fotômetro Galactose Galactose oxidase Fotômetro Lactose P-galactosidade Fotômetro Cefalosporina Penicilinase Fotômetro L-Leucina Leucina desidrogenase Fluorimetria Amônia Difusão gasosa e vermelho cresol Colorímetro Fosfato Cloreto de Titânio (IV) e Molibdato {IV) Colorímetro Sulfanilamida Colorímetro ....... .... _____ ,. ~ ~ .'~-}.f !}1 ~,; ·) ~ I.:~ -. Nitrato . " . ~· .. - •• " • ., . ·r .. . .. - -. -· - : r ' ("'* I C•'~') ~~~ -· .. ~~~.i·~~.... .. ;;:...i..l:l. -, ·j ~ 18.3 .- . C~ntrole aplicado a processos fermentativos A adoção do controle automático signific~ a viabilização de processos complexos, onde são necessárias grandes velocidades de processamento de informações e rapidez de atuação. Ele permite a operação estável, atenuando perturbações qu~ tendem a deslocar o ponto operacional desejado, garantindo, dessa forma, ·condições de segurança, reprodutibilidade da operação e economia do processo. Figura 18.1 I - Elementos de um sistema de controle. l 412 Automação e controle de processos ferrnentativos Um processo controlado pode ser geneticamente definido como a integração de quatro elementos básicos, conforme indicados na Figura 18.11: a planta (processo) a ser controlada; sensores, que medem alguma's variáveis características e informam a evolução do sistema em estudo (essas variáveis medidas são também denominadas saídas do processo); atuadores, que estabelecem as entradas do processo, e estas por sua vez alteram a condição de operação; e uma lei de controle que comanda essa alteração. Para a determinação da lei de controle, um aspecto fundamental a ser considerado é a definição do objetivo do controle. Dado um objetivo, a lei estabelecida é implementada por um algoritmo de cálculo que utiliza as variáveis medidas. A integração de todos esses elementos define um sistema de controle ou estratégia de controle de um processo. Para a realização do controle de processos fermentativos, é possível identificar diversas formas de integração desses elementos, caracterizando diversos sistemas de controle que podem ser agrupados, principalmente, nos seguintes tipos: • controle em malha aberta; • controle por sistema regulatório; • controle por pré-alimentação; • controle seguidor de trajetória. Entrada do processo Planta ou processo Saída do processo • Figura 18.12 - Controle em malha aberta. Sistema de controle em malha aberta. Este tipo de controle é aplicado, por exemplo, quando se estipula uma vazão de alimentação de substrato a um fermentador. Desse modo o valor adicionado é definido a priori e as condições do processo não alteram seu valor. A denominação malha aberta decorre do fato de a medida não estar integrada com a ação de controle, ou seja, não existe realimentação da medida. Um sistema de controle desse tipo leva a vários inconvenientes, pois quaisquer modificações do processo, decorrentes de perturbações posteriores ao início do controle ou mudanças das condições iniciais, não serão levadas em conta e muito menos corrigidas. O diagrama de blocos para es.s e tipo de controle está indicado na Figura 18.12. Controle aplicado a processos fennentativos. 413 Figura 18.13 - Controle do pH de um reator. Controle por sistema regulatório. Considere-se o controle do pH de um reator, como indicado na Figura 18.13. Nesse caso a sonda de pH é nosso sensor (saída) da variável de estado pH. Essa informação é levada a um controlador, onde está implementada uma lei de controle que, no caso específico, visa a manutenção do valor do pH numa referência definida (também conhecida como set-point) . A lei de controle fornece o sinal para uma bomba dosadora (atuador), que adiciona a quantidade de álcali necessária (entrada) para manutenção do pH na referência. Um sistema desse tipo; que mantém o processo numa referência fixa é dito Sistema de regulação automática. É um sistema em malha fechada, pois a medida retoma para ser comparada com o valor de referência e à- atuação é baseada nessa diferença, conforme pode ser visto no diagrama de blocos indicado pela Figura 18.14. .. Referência ~o pH 5 p=4,5 OH- Sinal Erro ~ Controlador da bomba Atuado r Planta ou processo Safda (pH) Realimentaçao da mediçao da sarda (pH) " Figura 18.14 - Sistema de regu lação automática. A regulação automática é utilizada principalmente para controle das variáveis ambientais de cultivo de um fermentador, como temperatura, pH e p02 • Em geral, utilizam-se malhas de controle independentes,; de uma entrada e uma saída, denominadas SISO (Single Input Single Output), com controladores on-offou PID. Diz-se controlador on-off quando o sinal do atuador é do tipo liga-desliga, não havendo sinais intermediários. A sigla PID vem de um anagrama das palavras Proporcional, Integral e Derivativo. É o algoritmo de controle mais difundido na indústria; nele o sinal do controlador (m) será função do sinal do erro (e), que é a diferença entre o valor medido e a referência estabelecida. Esse erro será pondera- 414 Automação e controle de processos fermentativos do por três parcelas associadas ao ganho proporcional (Kp), ao ganho Integral (1/Ti) e ao ganho derivativo (Td), conforme a expressão: 1 Jedt + Ta -de m = K ·e +p y.! dt Observam-se estudos de aplicação da regulação automática das concentrações de substratos, produtos e precursores de reações no meio de cultivo. Apesar do esforço para implementação desses sistemas, registra-se pouca utilização dos mesmos, devido à sensibilidade dos algoritmos de controle às condições de cultivo, ao mau funcionamento de sensores e a problemas devidos à falta de homogeneidade dos reatores. 1 Para a regulação automática de variáveis de cultivo, são utilizadas também configurações em cascata que combinam dois controladores individuais, formando malhas de controle mais sofisticadas que aumentam o desempenho do sistema de controle. O controle em cascata é aplicado, por exemplo, no controle de temperatura. A Figura 18.15 ilustra uma configuração em cascata para controle de temperatura de um fermentador. SP •jC_TRr.........@ . . ...1 ~@.I I i ~ J;-.-.;i-...:-;1....... • Figura 18.1 S - Controle da temperatura do fermentador. Nessa configuração mede-se a temperatura do reator (T R) e manipula-se a vazão de água de refrigeração I aquecimento. O valor do erro de temperatura (desvio em relação à referência) será .a entrada do primeiro controlador (chamado mestre), que determina o valor da referência para o segundo controlador (chamado servo). Esse controlador recebe a medida da temperatura da camisa e calcula o desvio estabelecido com a, nova referência (erro). A vazão de refrigeração/aquecimento é então manipulada para minimizar esse erro. A Figura 18.16 ilustra o diagrama de blocos da malha em cascata para controle da temperatura. C<>ntrole aplicado a processos fermentativos Sinal Referência '"'de erro de Tr de Tr Sinal Controlador ~de erro r" de Te (mestre) Controlador (servo) 1-----+1 4 :I S Planta ou processo Medida da temperatura da camisa (Te) Medida da temperatura do reator (Tr) Figura 18.16 - Diag~,rna de blocos para o controle em cascata da temperatura. Reatores mais modernos, encontrados em laboratório, dispõem de configurações onde a malha interna do controle cascata pode ser alternada, permitindo, dessa maneira, a manipulação de mais uma variável. Esse é o caso do controle de oxigênio dissolvido, onde manipula-se a freqüência de agitação e a vazão de ar com o objetivo de manter constante sua concentração. Quando o atuador numa das malhas atinge o valor máximo, por exemplo, a vazão de ar, o controlador mestre ativa outra malha e passa a controlar a concentração de p02 manipulando a freqüência de agitação. A Figura 18.17 mostra uma configuração desse tipo para o controle de p02 • Malha 1 Malha 2 Figura 18.17 - Controle de oxigênio dissolvido em fermentador. As configurações apresentadas indicam uma crescente sofisticação dos sistemas de controle, pois partindo de malhas simples, com uma entrada e uma saída, chega-se a configurações que permitem a incorporaç~o de duas medidas e atuação sobre duas outras variáveis . No entanto, estão limitadas a poucas variáveis de entrada e saída. A incorporação de mais variáveis medidas e manipuladas só é possível com estratégias de controle mais abrangen:tes, onde as diversas relações entre as entradas e saídas são consideradas. Tais configura- 416 Automação e controle de processos fennentativos ções são denominadas configurações de múltiplas entradas e múltiplas saídas (MIMO- multiple inputs, multiple outputs). Essas configurações ainda não são aplicadas no controle industrial de processos fermentativos, mas v~m sendo estudadas e constituem um campo de pesquisa e desenvolvimento na área. Sistema de controle por pré-alimentação (jeedforward). Nesse sistema é medida uma entrada da planta, cujo efeito deve ser compensado manipulando-se uma outra variável de entrada, através de uma lei de controle conhecida. Nas aplicações desse tipo de controle em sistemas fermentativos, a variável de entrada medida é a vazão de ar ou uma variável que depende da vazão de ar e a variável manipulada é a vazão de alimentação de substrato. A Figura 18.18 indica o diagrama de blocos para esse tipo de controle e a Figura 18.19 indica um reator com esse tipo de controle. Controlador Entrada do processo Planta ou Processo Saída da planta Figura 18.18 - Controle por pré-alimentação (feedforvvard). Utiliza-se o controle por pré-alimentação em sistemas fermentativos, porque as medidas combinadas da vazão de ar e as concentrações de 0 2 e C0 2 nos gases de saída do fermentador permitem avaliar a atividade de células viáveis e, dessa forma, caracterizar e controlar sua atividade. As principaistdeterminações realizadas nesse caso são OUR, velocidade de consumo de oxigênio, CPR, velocidade de produção de C02 e a relação entre CPR e OUR, denominada coeficiente respiratório RQ. OUR, CPR e RQ são calculados através de balanços materiais de 0 2 e C02 na entrada e na saída do reator, e determinados pelas expressões: 1 . OUR =~(F v SQ.luu-~-Y 0 2SQ(da -Fen1r,adaY 0 lmtmda ) 1 CPR =-(F V safda Y CO lsafdA -Fentrada Y CO 2mtmd4 ) RQ= CPR OUR Controle aplicado a processos fennentativos 4I7 onde: V= Volume de líquido no reator; Fsaída' Fentrada= vazão molar de gás, na entrada e na saída do reator; y0 2entrada , y0 2saída = fração molar de Ü 2 no gás, na entrada e na saída do reato r; yC02entrada , yC02saída = fração molar de C02 no gás, na entrada e na saída do reator; Esses indicadores têm sido utilizados, com diferentes graus de sucesso, pela disponibilidade de sensores de vazão de ar,'0 2 e C02, e pela rapidez da medida. No controle por pré-alimentação, a vazão de alimentação é fixada, de modo a suprir o consumo de substrato pela reação e este consumo por sua vez é estimado pelos indicadores indiretos (OUR, CPR) utilizando fatores de rendimento (Yx/ s e Yx/ o). Em algumas aplicações, esses parâmetros são admitidos constantes e utilizados valores obtidos em estudos prévios, em outros casos são considerados variáveis e sua estimativa é realizada durante o cultivo através de balanços materiais em linha. 17' 18 A lei de controle para sistemas por pré-alimentação depende essencialmente do modelo, dos parâmetros cinéticos e dos fatores de rendimento, e necessita de algoritmos mais complexos que não simples blocos PID. O controle por pré-alimentação é susceptível a variações dos parâmetros, podendo levar a um mau desempenho ou mesmo à instabilização do processo. É por essa razão que é recomendável acrescentar-se ao sistema de controle com pré-alimentação uma malhq. de controle com realimentação~ Essa segunda malha de controle diminui a sensibilidade paramétrica e realiza a estabilização do sistema, e tem sido adotada por vários pesquisadores. 19' 20 s M 02 co2 6)· - - ·- ··I~~RI Substrato . ' : ' ~~ Figura 18.19 - Controle por pré-alimentação 418 Automação e controle de processos fermentativos Controle seguidor de trajetória (tracking contrai). Se o processo necessitar que o valor de referência de uma variável não seja constante, porém siga uma determinada evolução temporal, nesse caso o controle a ser adotado é do tipo seguidor de trajetória (tracking contrai). Essa trajetória pode ser definida a partir de conhecimento experimental, ou através da solução de um problema de controle ótimo, ou seja, estabelecida pela análise do modelo do processo e da definição de um critério de desempenho a ser atingido. Em geral, nos processos descontínuos, busca-se a definição de perfis de temperatura e pH. 21 ' 22 Em processos descontínuo-alimentados são encontrados vários trabalhos que definem perfis para a vazão de alimentação do substrato, que garantem critérios distintos de desempenho como produtividade, concentração final de produto, conversão de substrato, retorno máximo de investimento ou uma composição destes índices. 23' 24 ' 25 ' 26' 27' 28 A Figura 18.20 ilustra uma malha de controle de um seguidor de trajetória que estabelece um perfil de pH para um processo. Referência pH . LL o 1 2 O Erro Sinal " Controlador da Atuado r OH- f-----+ Planta ou processo Salda (pH) bomba Realimentação da medição da salda (pH) Figura 18.20 - Controle seguidor de trajetória. Outros tipos de controle Além das configurações apresentadas, vêm sendo estudadas outras técnicas de cont:r;ole, que constituem campo de aplicação potencial em processos fermentativos. Podem ser destacadas: Controle ótimo. O controle ótimo é uma técnica que estabelece o mtilhor perfil das variáveis manipuladas, de modo a fazer com que o processo atinja um determinado objetivo ou, mais precisamente, fazer com que uma função de desempenho seja otimizada. Quando é disponível um modelo matemático preciso, a solução do problema , ou seja, a seqüência de ações de controle pode ser definida matematicamente. Se as vazões de alimentação são as únicas variáveis manipuladas, a definição do controle torna-se um problema denominado de "Controle singular", cuja solução é complexa, especialmente quando ocorrem restrições na otimização. 29 A solução desse problema de controle pode ser resolvida por otimização off line (realizada previamente por simulação numérica do processo) e, na maioria dos casos, implementada em malha aberta. A aplicação dessa otimização depende fundamentalmente do modelo utilizado. Por outro lado, a função a ser otimizada apresenta freqüentemente perfis planos, limitando os algoritmos de procura do ponto de míni. mo. Isso exige grandes esforços computacionais, testando-se condiÇões iniciais diferentes para assegurar a obtenção de verdadeiro ~ínimo global. 1 Esses pro- Controle aplicado a processos fermentativos 4 19 blemas, aliados às dificuldades de implementação de uma política de controle ótimo e de obtenção de modelos/parâmetros confiáveis, além dos problemas da observabilidade do sistema, têm levado à pouca aplicação prática deste tipo de controle. Outra forma, cada vez mais utilizada pelo aumento de sistemas de aquisição automática de dados, é a otimização on líne dos processos fermentativos.30,31,32 Em geral, esse enfoque utiliza m9delos entrada-saída para identificar a dinâmica do sistema e calcular ações de controle, que mantêm o sistema num estado estacionário desejável que maxirniza uma função de desempenho. Como no caso de otimização off line, os algoritmos exigem grandes esforços computacionais e o desempenho desses sistemas nem sempre apresenta vantagens, quando comparados com estratégias mais simples de controle.1,33,34,35 Sistema de controle adaptativo. As características dinâmicas dos sistemas costumam não ser constantes ao longo do tempo, devido a inúmeras razões, como variação de características dos componentes por envelhecimento natural dos mecanismos, alteração de condições ambientais não modeladas, falta de manutenção, modelagem não perfeita. Apesar de pequenas alterações nos parâmetros da planta serem compensadas por um sistema realimentado, alterações mais significativas podem desestabilizar o sistema, ocasionando uma falha. A função dos sistemas adaptativos é justamente detectar essas mudanças nos parâmetros e introduzi-las no sistema de controle, adaptando-o às novas condições. Tais sistemas não só são capazes de identificar mudanças no comportamento do sistema, como também reduzir as imprecisões na modelagem do mesmo, aumentando portanto a confiabilidade do controle. A Figura 18.21 indica o diagrama de blocos para esse tipo de controle. Perturbação Referência trajetória -~.. Sinal de erro Controlador adaptativo Entrada do processo 1 Planta ou processo I Saída da planta Realimentação da medição da saída I l I .I Figura 18.21 - Planta e controlador adaptativo. Sistema de controle por aprendizado. Muitas tarefas manuais, desenvolvidas por hábeis operadores, podem ser automatizadas. A maneira pela qual o operador se torna hábil é através de um aprendizado, em sua maioria das vezes, prático. Se formos capazes de substituir o conhecimento desse operador,bem como sua capacidade de aprendizado, por um sistema automático de controle, então diz-se que esse sistema tem capacidade de aprendizado. Essa área de pesquisa é a que mais tem crescido ultimamente e podemos citar como linhas mais estabelecidas, os sistemas fuzzy, os sistemas especialistas e os sistemas de redes neurais. 34 I I I L ~~ - --- --- - --- 420 Automação e controle de processos fermentativos Sistemas de controle digital Os sistemas de controle podem ser divididos em duas grandes categorias: sistemas analógicos e sistemas digitais. Historicamente, o controle automático inicia-se com sistemas analógicos. A primeira aplicação, constantemente citada/3 é o regulador de velocidade da máquina a vapor, no século XVIII, projetado por James Watt. Atualmente, os sistemas digitais são os sistemas mais difundidos e importantes, devido à utilização de computadores/microprocessadores nestes sistemas. As vantagens de processamento oferecidas por esses componentes e os seus baixos custos têm levado ao uso generalizado desses sistemas. Um sistema de controle digital pode ser representado conforme o diagrama de blocos da Figura 18.22. Figura 18.22 - Sistema de controle digital. Comparando-se esse diagrama como da Figura 18.11, observa-se a introdução dos conversores analógico-digitais, e a utilização de controlador digital. ' Nessa malha de controle digital o conversor A/D (analógico/digital) tem como função a quantização e discretização da variável contínua (analógica). A quantização é o estabelecimento de valores determinados, ou seja, valores pertencentes a um intervalo finito de pontos cuja precisão (diferença entre dois valores contíguos) será determinada pelo tamanho da palavra digital (número ~e bits) utilizada para representar a grandeza. A discretização é determinada pelo intervalo de tempo necessário para que sejam realizadas duas leituras consecutivas da variável. A diferença entre os tipos de sinais é ilustrada na Figura 18.23 . .. -- ------ .::::::::::r Precisao k >-:::<.-• Taxa de amostragem _ __,___ _ _ _ _ Discretização Sinal analógico Sinal digital Figura 18.23 ~ Sinais característicos dos sistemas analógico e digital. ---- Controle aplicado a processos fermentativos 4 21 O controlador digital, não importando se de pequeno ou grande porte, apresenta a arquitetura de um computador, tendo os seguintes componentes: CPU, memórias, dispositivos de entrada e saída, interface com o operador e interface com outros dispositivos. A Unidade Central de Processamento (CPU) realiza operações aritméticas básicas em rnaternátíca binária. Demonstra-se que procedimentos mais complexos, que não simples operações rpaternáticas, podem ser decompostos em algoritmos de operações binárias elementares e executadas na CPU. Essas operações, a serem executadas pela CPU, foram previamente codificadas e armazenadas em urna memória que pode ser volátil (caso a energia elétrica se acabe ela desaparece), também chamada RAM (Random Access Memory), ou não, a chamada memória ROM (Read Only Memory). Há também que se considerar a troca e armazenamento de informações entre o controlador e operador, e entre o controlador e outros dispositivos. Essa troca de informações é feita através de dispositivos de entrada-saída. Alguns bem conhecidos são: o teclado, o monitor e genericamente podem ser denominados de interface homem-máquina. Outros fazem a interface máquina-máquina corno os dispositivos magnéticos de armazenamento de memória (disco rígido) . Há ainda conexões remotas, corno por exemplo redes de comunicação. Todos esses elementos trocam informações através de um local comum denominado barramento de dados. A Figura 18.24 esquernatiza esses elementos, dando urna idéia da arquitetura básica de um computador. Barram ento de da dos 1 · CPU Interfaces homem máquina Interfaces máquina máquina l l I ROM I ' RAM Figura 18.24 - Arquitetura de um controlador digitaL Seu funcionamento básico é o seguinte: primeiramente, ao se energizar um computador, a instrução zero da máquina é procurar o firmware (programa residente na ROM) e executá-lo. O firmware indica à máquina qual é a configuração da mesma, ou seja, quais dispositivos de entrada-saída estão instalados, e onde deve procurar o sistema operacional, que é o programa básico do computador. A partir daí outros aplicativos, programas de nível mais elevado, podem ser carregados e executados. Todos os elementos da arquitetura apontada estão presentes em um controlador digital básico tipo PID utilizado para urna única variável de processo. Há que se medir a grandeza a ser cotitrolada, compará-la com a referência e enviar um sinal de comando para o atuador. 422 ·Automação e controle de processos fenmentativos Como o controlador é digital, o sinal medido do sensor passará por uma interface A/D, que produzirá um sinal digital a ser enviado à CPU via barramento de dados, para ser comparado com a referência. Essa, por suave~, foi previamente fornecida ao controlador PID pelo operador, através de um teclado. O algoritmo de controle, no caso um PID, encontra-se nos dispositivos de memória do controladqr e será executado pela CPU que - findo o cálculo - enviará o resultado para a interface DI A do atuadot correspondente, terminando assim o ciclo de controle. Pode-se pensar em uma escala maior, e em vez de termos um microprocessador dedicado à tarefa de implementação de um simples PID de uma variável, pensarmos na operação completa de um reator controlando várias malhas. Além da ampliação do número de malhas, o controlador pode passar a executar funções lógicas e programação de eventos, por exemplo, abertura de válvulas numa certa ordem de acordo com um critério ótimo de desempenho. Pode-se implementar tal controle num PLC, ou Controlador Lógico Programável, que- resumidamente- é um PC voltado para a automação de processos, sendo portanto mais robusto para aplicação industrial e geralmente menos versátil que um PC comum. Nesse PLC toda a lógica de acionamento das válvulas pode ser programada em um software residente, que comandará as válvulas remotamente através das interfaces A/D e D/ A. O desenvolvimento dos sistemas digitais permitiu a integração de toda uma " unidade industrial, devido ao barateamento dos componentes e pelo aumento da confiabilidade dos sinais. Assim, em uma última etapa, pode-se controlar remotamente toda uma planta industrial, através de uma arquitetura composta de vários PLCs, todos se comunicando através de um único protocolo de comunicação, utilizando-se do mesmo barramento de dados, com prioridades distintas, tudo harmoniosamente gerenciado por um software supervisor instalado em um computador de maior porte denominado host. A tal sistema dá-se o nome de SDCD, Sistema Digital de Controle Distribuído. Um esquema dessa arquitetura pode ser visto na Figura 18.25. • Host I I I I PLC PLC PLC Figura 18.25 - i I i Configuração de Sistema SDCD. I PLC Referências Bibliográficas 4 23 Referências bibliográficas (1) WANG, N . S: E STEPHANOPOULOS, G. Computer applications to fermentation process. CRC Criticai Reviews in Biotecnology, vol. 2, issue 1, pp 1-103 (1984). (2) CARLEYSMITH, S.W .. Monitoring of Bioprocessing. In: Modelling and Control of Fermentation Process. J.R. Leigh (Editor). Peter Peregrinus Ltd. Londres (1987). 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Inicialmente, fermentação era denominação reservada a processos anaeróbios; modernamente o termo estende-se a várias atividades microbianas. Qualquer que seja a ~atéria-prima e qualquer que seja a finalidade da fermentação, haverá processos de assimilação e de desassirrlilação, que envolvem o crescimento microbiano ou a transformação do substrato, Por uma ati~idade de assimilação, moléculas simples são transformadas em complexas, tais como proteínas, graxas e carboidratos, constituintes das células e substâncias de estrutura ou composição complexa, como antibióticos e vitaminas. Por desassimilação, os microrganismos podem decompor meios que contêm carboidratos, produzindo etanol, butanol, ácido láctico e butírico,,e butanodiol. Quase sempre as condições ótimas de crescimento não são as ótimas de produção da substância desejada. Esta pode, em certos casos, ser produzida em uma única operação e, em outros, em duas. Devido às diferentes características das substâncias produzidas e das exigências específicas dos agentes de fermentação, cada indústria, ou cada processo opera em condições peculiares. Por conseguinte, as operações e controles nas indústrias variam amplamente, para obter máxima produção, no menor tempo e com os menores custos. Nas estações de tratamento de esgotos domésticos ou de efluentes industriais, as condições de operação e controle são diferentes das empregadas nas destilarias L-----~-~ - -·~..,.~ . . ==--··~~. ~---·· ··-~--~--~----~----·-...--,--------·---C----,------- - - - ------ .426 Operação de instalações industriais de fermentação de ákool, nas vinícolas e cervejarias. Nas fábricas de antibióticos e vitaminas as indústrias trabalham com rigorosas condições de assepsia e, em determinadas seções, sob esterilidade. Devido a essa ampla diferença de condições, não é possível em um único capítulo de um livro didático cobrir detalhadamente todos os tipos de indústrias; por esta razão, as operações são tratadas de uma forma geral. Esclarecimentos específicos podem ser obtidos pela consulta a capítulos próprios desta mesma obra. 19.2 - Condições gerais para a execução de um processo fermentativo Qualquer indústria, pequena, média ou grande, é operada segundo uma seqüência básica: controle da matéria-prima, preparo do substrato, inoculação e controle do processo fermentativo . 19.2.1 - Matéria-prima A maioria das indústrias de fermentação usa matérias-primas que contêm açúcares fermentescíveis, ou substâncias que neles se transformem. Eles são usados para o desenvolvimento dos microrganismos e para serem transformados em metabólitos úteis. Entretanto, há microrganismos que metabolizam outros materiais que não açucares, para a obtenção desses metabólitos. Nessa categoria estão incluídos o etanol, para a indústria de vinagre ou ácido acético e os hidrocarbonetos, para produção de proteína alimentar. · A matéria~prima para qualquer processo deve ser obtida com as melhores características de composição e conservação. Melaços e açúcar invertido comercial devem ser armazenados em tanques apropriados, à prova de umidade e infiltrações, para evitar diluições e contaminações posteriores ao seu armazenamento. Açúcar deve ser estocado em armazéns ou silos, de forma a não abso;ver umidade. Cereais devem ser fornecidos como grãos inteiros, secos, isentos de infestação de insetos, não mofados e livres de impurezas metálicas e mecânicas de qualquer tipo. Devem ser peneirados, ventilados e armazenados em silos 0\1 armazéns, onde serão mantidos livres de infestações, contaminações e da umidade. Raízes, como a mandioca, devem ser usadas recém-colhidas. Se transformadas em raspas (desidratadas), devem ser tratadas como os cereais. A cana-de-açúcar deve ser colhida e moída o mais rapidamente possível, sendo armazenada em pátios ou galpões, em quantidade não superior a um período diário de moagem, mais algumas horas como fator de segurança, para cobrir falhas no aprovisionamento. Os materiais celulósicos, cascas, palhas e madeira devem ser protegidos da umidade e de contaminações microbianas. 'I ! il li l 1 1 19.2.2 - Preparo dos substratos Os substratos têm de ser adequados ao desenvolvimento do microrganismo e à finalidade .de sua atividade, que é produzir uma determinada substância. Além de uma composição capaz de suprir as exigências do microrganismo, para [_____ ___ . Condições gerais para a execução de um processo fermentativo 427 seu melhor d~sempenho deve estar devidamente condicionado em termos de pH, acidez, temperatura, assepsia ou esterilidade. O substrato (meio ou mosto) é preparado de acordo com a matéria-prima a ser usada. Materiais amiláceos são hidrolisados, xaropes e melaços são diluídos, uvas e outras frutas, beterraba e cana-de-açúcar sofrem operações para retirar o suco. O líquido açucarado obtido é corrigido em seu pH, adicionado de nutrientes e aquecido. Os hidrocarbonetos, que não são solúveis em água, são fornecidos a um meio sintético adequado, após a inoculação. 19.2.3 - Preparo do inóculo O inóculo pode ser definido como uma quantidade de células suficiente para dar início a um processo fermentativo de forma rápida e econômica. Teoricamente, se dispusermos de um substrato esterilizado, uma única célula é suficiente para iniciar o trabalho e seguir avante. Entretanto, o fator tempo é importante. Quanto mais células são colocadas em contato com o substrato, mais rápido e mais econômico será o processo. É importante usar um volume de inóculo que inicie produzindo metabólito e não dependa da fonte de carbono para crescer. É vantajoso, também, transferir as células do inóculo para o fermentador, no momento de sua maior atividade. Industrialmente, de forma prática, usa-se uma relação de 1 parte de inóculo para 10 partes de substrato a fermentar. A inoculação costuma também ser baseada em número de ~élulas ativas no meio, comumente em número de milhões por mL ou por g. Os processos fermentativos decorrem do uso de culturas puras ou de inóculos naturais, representados pela flora microbiana encontrada diretamente na matéria-prima. Uma cultura é considerada pura quando possui um tipo de microrganismo derivado de uma s_~ célula. Isso é razoavelmente fácil de obter em condições de laboratório, mas difícil de manter em condições industriais, nas quais riem sempre há certeza da ocorrência de apenas um microrganismo em trabalho. A conservação das culturas puras obedece a critérios específicos para cada grupo de microrganismos. A maneira de conservá-las é importante, sobretudo no caso de fungos filamentosos. A simples repicagem sucessiva em meios sólidos não é satisfatória, em grande número de casos. Esses microrganismos podem mudar de comportamento e não é raro que, após algumas repicagens, percam as propriedades que possuíam de sintetizar o produto que deles se espera obter. - Para contornar o problema, são usadas técnicas p~ra manter a sua capacidàde de metabolizar determinado produto; entre elas a liofilização e a conservação de células e esporos secos sobre areia ou solo. A preparação dos inóculos, de qualquer tipo de microrganismo segue um esquema geral (ver Capítulo 1 do Vol. 3), com modificações peculiares a cada um: a cultura pura da micoteca é passada para um tubo de cultura com meio de ágar sólido, com técnica apropriada para cada caso. Daí, para um frasco .c om meio líquido e desse para outros, com volumes crescentes de meio de fermentação, até atingir o volume necessário para os fermentadores. Se eles.são muito grandes, há a I 428 Operação de instalações industriais de fennentação necessidade de ampliar o inóculo em pré-ferni.entadores, com cuidados de laboratório. Os pré-ferrnentadores, normalmente são equipados com dispositivos de esterilização, aeração, agitação, controle de pH, adição de inóculo, tomadas de amostras e de controle de temperatura. Seu número e suq. capacidade variam com a capacidade dos ferrnentadores e da fábrica. Nas fermentações de fécula e de picles, assim como nas digestões anaeróbias de esgotos e despejos industriais, não há inóculos definidos. Eles provêm de urna flora microbiana local, que se desenvolve de acordo com as condições de higiene e de clima. 19.2.4 - Sala de fermentação, equipamento e acessórios As fermentações devem ser processadas em ambientes limpos, submetidos a cuidados especiais de higiene, assepsia ou esterilização, de acordo com as exigências dos microrganismos ou dos processos. Higiene é o asseio, a limpeza dos locais, recipientes, instrumentos, equipamentos, acessórios, bombas e canalizações, para eliminar os materiais que carreiam contaminantes. É uma operação que precede a assepsia, a qual, no sentido mais estrito, é o estabelecimento de condições que evitem o desenvolvimento de microrganismos prejudiciais. A aplicação de detergentes, germicidas e desinfetantes é capaz de preencher a exigência. Esterilidade pode ser definida como o impedimento completo da capacidade de crescimento das células. Essa condição é atingida por aquecimento até a inativação ou destruição dos sistemas enzimáticos, destruição ou desnaturação das proteínas, ou pelo uso de germicidas, os quais exercem um efeito tóxico por combinação com os grupos reativos das proteínas. Nas fermentaçÕes de ácido acético, lavagens freqüentes e assepsia do local comumente são suficientes para manter boas. as condições de operação. A temperatura elevada de fermentação (38-45°C) e o baixo pH são elernento!t importantes para controlar e impedir o crescimento de contarnirtantes, corno o Acetobricter xylinum e angüílulas. Nas fermentações de antibióticos, de vitaminas, acetona e butano! é preciso rigorosa técnica de assepsia e esterilidade, porque as infecções se instalam com facilidade. Nas fermentações de peniCilina, infectantes produtores de penicilinase destroem a penicilina, baixam ou anulam o rendimento. Na fermentação acetona-butanólica, bacteriófagos destroem o inóculo. Os fagos são arrastados pela poeira; sua eliminação ou redução pelo uso de filtros de ar e a esterilização do ar reduzem o perigo de contaminação. A assepsia da mão-de-obra e das vestimentas completam as exigências. Paralelamente, é inútil exigir esterilidade dos meios para a produÇão de fécula fermentada e de picles, embora seja recomendada boa assepsia das instalações. A assepsia rigorosa e esterilidade nos equipamentos de dig~stão anaeróbia de esgotos domiciliares e de resíduos orgânicos de indústrias são supérfluas, mas não é dispensada a higiene e assepsia dos locais de trabalho. Operação de uma indústria 429 19.3 - Operação de uma indústria Admitindo que o projeto da indústria satisfaz a todos os requisitos exigidos para a produção econômica de uma determinada substância por via fermentativa, os fermentadores são colocados em operação após uma série de operações preliminares, relacionadas a seguir. As primeiras dizem re,speito à escolha, aquisição, recepção, condicionamento e armazenamento da matéria-prima e sua transformação em substratos. Depois, ou concomitantemente, a obtenção, manutenção e manejo do agente de fermentação, no qual se insere o preparo do inóculo. Finalmente, o preparo do setor de fermentação, no qual é incluída a verificação da instalação correta para transporte dos substratos, transferências, limpeza, assepsia ou esterilização, a preparação dos fermentadores e as condições de seu manejo e dos acessórios imprescindíveis à operação de fermentação. Tubulações, registros, bombas, centrífugas, tanques, sistemas de fornecimento de água, de eletricidade e de vapor, instalações elétricas, todos devem estar adequados e em funcionamento, com mínimas possibilidades de perdas de energia e sem vazamentos. 19.3. I - Operação com os fermentadores A operação dos fermentadores inicia-se .pela limpeza das tubulações, bombas, válvulas, registros e acessórios, e sua esterilização, quando exigida. 19.3.1.1 - Esterilização dos meios Na indústria a forma mais usada é pelo aquecimento. Ele atua de forma diversa sobre os organismos. Uns são mais resistentes, outros menos; as formas vegetativas são menos resistentes que os esporos. A termorresistência varia de acordo com a relação tempo e temperatura de . aplicação do calor,.._c_om a concentração iniCial de esporos ou células e com as condições prévias do desenvolvimento da população. As células são menos resistentes na fase de crescimento logarítmiCo; o máximo de resistência é encontrado na fase estacionária. Os esporos secos resistem mais ao calor. Também devem ser levados em conta a composição do substrato, a temperatura de incubação, a idade do microrganismo e seu desenvolvimento. A variação de comportamento em relação ao calor se dá em ampla faixa de temperatura e em relação à forma de aplicá-lo, úmido ou seco. O vapor saturado ou superaquecido é usado nas esterilizações industriais (ver neste volume: Esterilização do equipamento, Capítulo 3, Esterilização de meios de fermentação, Capítulo 4). O calor em meio úmido afeta mais do que em ambiente seco. Alguns microrganismos morrem pela exposição em autoclave a l20°C por 20 a 30 minutos (calor úmido), e resistem por 3 a 4 horas em forno a 160-180°C (calor seco). o meio influi diferentemente para cada microrganismo, havendo maior resistência nos substratos mais completos. Os constituintes, a umidade e o pH do meio afetam a resistência ao calor. 430 Operaçã.o de instalações industriais de fermentação Esporos crescidos em areia ou solo são mais resistentes que os conservados em ágar. Alguns sais, como os de magnésio e os fosfatos contribuem para o aumento de resistência. Os ácidos diminuem-na, assim como a exposição prolongada aos produtos de metabolismo. Em meio ácido os microrganismos são mais sensíveis; em meio próximo da neutralidade apresentam o máximo de resistência. A alcalinidade também reduz a resistência. A esterilização dos substratos é feita nos recipientes de fermentação ou em separado. Quando é executada em separado, são empregados aparelhos de fluxo contínuo e o substrato é encaminhado aos equipamentos, já esterilizados à parte. A esterilização por fluxo contínuo evita, em certos casos, a corrosão dos recipientes pela residência do substrato quente. · Influência do calor sobre o substrato -A esterilização pelo calor pode causar alterações na composição do substrato, pela decomposição de constituintes (uréia) e interação entre outros (reações de escurecimento). A decomposição conduz a uma perda da capacidade nutricional e a interação ao aparecimento de substâncias inibidoras. Comumente, as temperaturas de decomposição são inferiores à de esterilização e a forma de evitá-la é provocar aquecimento rápido ao máximo de temperatura e o resfriamento imediato e rápido a baixas temperaturas. A tendência é o uso · de técnicas que permitam usar altas temperaturas em períodos curtos, fazendo fluir o substrato sob pressão para o fermentador, através de uma unidade de esterilização. A operação de aquecimento e resfriamento tarda alguns segundos. Esse processo 'é adequado para substratos livres de suspensões sólidas, que podem ser aquecidos até 150-160°C, praticamente sem alterações de composição. Quando há sólidos em suspensão, os níveis de temperatura são mais baixos, estimando-se em 135°C por 5 minutos e 121 oc por 10 20 minutos. O aquecimento é feito por injeção direta de vapor ou indiretpmente por meio de placas ou tubulações. Quando há expansão direta de vapor, é necessário levar em conta a diluição causada pela sua condensação no meio. Esse método arrasta óleo mineral e outras impurezas para o meio, além de poder cqntaminá-lo com odores estranhos. A esterilização em fluxo é superior à forma estacionária, porque permite melhor aproveitamento do calor com menor gasto de vapor e maior maneabilidade do processo, so.bretudo quando se trata de coordenar o trabalho em diversas escalas de fermentadores. Conduz também à menor corrosão dos equipamentos, permite dimensionar as tubulações e bombas com maior precisão, e facilita a automação dos processos. Quando há interação entre os constituintes do substrato ou perigo de decomposição de alguns componentes, é recomendada a sua esterilização à parte e sua ~eunião posterior, em condições assépticas. a Aeração- O ar nos fermentadores é usado para suprir de oxigênio a operação, para eliminar produtos metabólicos voláteis, às vezes inibidores, para reduzir 43 I Operação de uma indústria o risco de contaminação, mantendo internamente urna pressão positiva e para transferir líquido de um para outro recipiente. A transferência e a condução de líquidos por pressão de ar, sem bombas, diminui a complexidade mecânica e os riscos de contaminação. Para vencer a pressão exercida pelo líquido no ferrnentador, é necessário comprimir o ar. Para manter urna pressão de 1,5 a 2 kgf/c:rr? no dispersar de ar, é preciso manter urna pressão de saída do compressor de 2,5 a 3 kgf/ crn2 • O aumento do volume dos ferrnentadores exige um aumento proporcional na pressão do ar na saída e nos dispersares. Alguns microrganismos são inativados em pressão de 8 kgf/ crn2 • A compressão aquece o ar a temperaturas que variam de acordo com a pressão exercida. Para compensar o aquecimento, o ar é distribuído nos ferrnentadores depois de um resfriamento, para qu,e o aumento da temperatura não interfira com a atividade do agente de fermentação. O aumento da temperatura pela compressão pode realizar a desinfecção do ar, ou reduzir o número de contarninantes. Em instalações industriais é necessário esterilizar o ar e filtrá-lo, mas essa operação não é simples. Normalmente usa-se fazer lavagens, passá-lo por substâncias químicas, aquecê-lo, submetê-lo a irradiações e precipitações eletrostáticas. Os processos não são perfeitos, porque as lavagens industriais não são perfeitas e pode haver arrastamento de substâncias químicas, que interferem na fermentação (ver Esterilização do ar, Capítulo 5). Na prática os microrganismos estão unid~s a partículas ou gotículas na corrente de ar que entra no compressor; alguns são retirados no filtro de entrada, outros na água condensada retirada do compressor, outros são arrastados com gotículas de óleo ou permanecem no ar comprimido e devem ser retirados por filtração, a única forma econômica de fazê-lo. Nos filtros os poros são muito pequenos e ali se depositam impurezas com os rnicrorganis1llos,__até o bloqueio da passagem. As pré-filtrações auxiliam a reduzir os microrganismos existentes. As camadas filtrantes devem ser esterilizadas e devem estar dispostas de maneira a não causar a formação de canais, por onde as partículas contaminadas possam passar livremente. Óleo e umidade reduzem o desempenho. 19.3.2 - Controle operacional de fermentação Os diversos fatores que afetam a fermentação devem ser constantemente supervisionados, para que o processo se desenvolva com o máximo de rendimento técnico e econômico. Temperatura, pressão e fluxo de ar, medição e controle do pH, e formação de espumas devem ser mantidos sob controle. Temperatura, pressão e fluxo de ar.:.. Nos pequenos ferrnentadores de laboratório, freqüentemente há maior perda de calor por irradiação e evaporação que calor produzido pela exoterrnia do processo. Para compensar a perda e manter a temperatura adequada aos agentes de fermentação, são usadas serpentinas ou camisas para aquecer o substrato. Se houver excesso de ternpera.tura, os mesmos dispositivos podem resfriar. O controle pode ser automático . ...._________ o --- 1 • '1 432 Operação de instalações industriais de fermentação Nos grandes fertnentadores a área de irradiação decresce proporcionalmente ao aumento de volume. Quando a temperatura no interior aumenta, precisa ser resfriada. Trabalhando com água fria, os dispositivos de aquecimento funcionam como resfriadores. A temperatura pode ser medida contínua e automaticamente, registrada e corrigida da mesma forma. Controladores de ar podem regular sua vazão; a pressão interna, de preferência deve ser superior à externa, para evitar entrada de ar do exterior sem esterilização. Oxigênio dissolvido- Nos processos aeróbios, que necessitam de injeção de ar no substrato para atender às exigências do microrganismo, é. necessário que eles recebam seu suprimento de oxigênio adequadamente. O oxigênio dissolve em água e a dissolução depende da temperatura e da ocorrência de outras substâncias também dissolvidas. A determinação do oxigênio dissolvido no substrato para fermentação, é feita por meio de eletrodos que medem continuamente o potencial gerado pelo oxigênio. Seu conhecimento permite a correção da aeração, quando houver necessidade de alterar o suprimento de oxigênio. Agitação- As fermentações aeróbias, além do fornecimento de oxigênio, precisam de uma boa distribuição do ar no interior do fermentador. Com agitação há uma dispersão uniforme das bolhas de ar e também dos nutrientes, que não ficam concentrados em determinadas zonas. A avaliação do desempenho da agitação é feita pelo gasto de energia, medida ou registrada pela variação da potência consumida pelos agitadores. A variação de consumo de energia é causada pela alteração da densidade, da viscosidade do meio e pela resistência oposta pelas células, geralmente crescente com o progresso da fermentação. A medida da variação da potência é adequada para o controle dessa operação. Medição e controle de pH - A existência de eletrodos esterilizáveis permite incluir nos fermentadores, como acessório, um medidor de pH, com ou sem registrador, · acoplado ou não a um sistema automático de adição de álcali ou de ácido para corrigir o meio. Os eletrodos devem ser examinados quanto à precisão de suas medidas, porque as constantes esterilizações podem alterá-los. Nem sempre há a necessidade de elevar ou reduzir o pH durante a fermentação, mesmo que ele esteja diferente do início do processo. Entretanto, há processos que só têm desempenho adequado em relação ao produto, se a reação do meio se mantiver dentro dos níveis considerados como os adequados . Na oxidação de carboidratos para produção de levedura alimentar, o carboidrato pode estar presente em excesso e deve ser adicionada amônia para manter constante o pH de crescimento. Em certos processos, a correção adequada não é a do pH, mas a adição de nutrientes para prolongar a fase produtiva. Na fermentação de griseofulvin, o pH tende a elevar-se. A adição controlada de glicose mantém uma alta relação de produção por vários dias, e concorre para que se atinjam os mais altos níveis de produção de antibiótico. Na produção de ácido fumárico; o pH decresce com a formação do metabólito; o controle pode ser feito pela adição de carbonato de cálcio insolúvel, que vai Operação de uma indústria 433 precipitando o fumarato de cálcio à medida que o ácido é formado, e o pH mantém-se estável. Espumas - As espumas têm origem na aeração, na agitação e no desenvolvimento de gases no interior dos substratos em fermentação; seu aspecto é dive.rso nos diferentes meios, por razão de suas características reológicas. Reduzir a formação de espumas pela diminuição da intensidade de aeração, da agitação, ou de ambas, pbde reduzir a produtividade e o rendimento. Contornar o efeito da formação de espuma por redução do volume de meio nos fermentadores, deixando grande espaço vazio, é antieconômico porque reduz a capacidade de produção ou a eficiência da fábrica. Outras formas de reduzir a formação de espumas são diluir os substratos ou modificar as características reológicas dos meios naturais, por meio de precipitação de colóides e sua decantação seguida de filtração. As espumas dificultam as operações de assepsia e de desinfecção. Por isso devem ser evitadas ou eliminadas, e a maneira mais efetiva é a adição de antiespumantes, automaticamente de preferência. Quebra-ondas, batedores, ultra-som são outros sistemas utilizados, sem a mesma eficiência. Os antiespumantes são fabricados à base de silicone, de álcoois superiores e agentes de ação de superfície dispersos em óleos. Os à base de silicone são adicionados em menor proporção que os demais. O momento e a quantidade de antiespumante a adicionar são importantes. Alguns podem ser metabolizados, como já foi exposto, e outros afetam a capacidade de transferência do oxigênio. Uma característica importante, desejada nos antiespumantes, é poder ser facilmente eliminado no momento da separação do metabólito do substrato fermentado. Gases de exaustão- Os gases que saem do fermentador (C0 21 ou 0 2 ) permitem medir o grau de desenvolvimento do microrganismo. A existência de outros gases indica anormalidad-e do processo, que deve ser corrigida. Reologia - o·meio de fermentação possui características n:~ológicas, as quais mudam à medida que o processo progride. As mudanças são causadas pelo aumento do número de células, pelo aumento da temperatura, pelo aparecimento e aumento do metabólito. As modificações afetam a agitação, a aeração e outros fatores que devem ser corrigidos, quando acusarem anormalidade. · Acessórios - Os acessórios, aqui compreendidos os equipamentos de medi~ ção, tubulações, registros, centrífugas, filtros e outros, devem estar muito limpos e instalados de forma a poderem receber e escoar facilmente a água de lavagem, acompanhada ou não de detergentes ou antissépticos. Da mesma forma, devem ser projetados para serem esterilizados, poder receber aquecimento por vapor e permitir o escoamento dos condensados. As transferências de líquidos a fermentar, de efluentes de qualquer natureza e de inóculos devem ser feitas preferencialmente por gravidade ou por pressão de ar, para evitar a circulação por bombas, o que diminui a eficiência da assepsia. As bombas devem ser facilmente desmontáveis e permitir lavagem e esterilização. I 434 Operação de instalações industriais de fermentação 19.4 _- Operação de um processo fermentativo asséptico ! ' A operação asséptica é a que contém apenas o microrga~ismo destinado a produzir a substância desejada. Ela é caracterizada pela inoculação de uma cultura pura sobre um substrato esterilizado. Numa indústria que opere com um processo fermentativo dessa natureza, há locais estéreis e não estéreis; estes devem se comunicar com aqueles através de corredores ou câmaras estanques, providas de portas duplas, arejadas com ar filtrado e esterilizado. As contaminações ocorrem em qualquer fase do processo, se o manuseio não for o mais técnico possível. Para que elas não ocorram, é necessário que as salas, o equipamento e seus acessórios, tubulações, válvulas, registros e bombas sejam passíveis de esterilização. As tubulações, tanto quanto possível, não devem ter uniões rosqueadas e flanges, para evitar a retenção de resíduos. As flanges devem ter juntas de material resistente às esterilizações e não apresentar porosidade capazes de reter sujidades e microrganismos. Os recipientes não podem apresentar cavidades ou pontos mortos capazes de reter resíduos. Por isso as soldas devem ser lisas e a superfície, sobretudo a interna, ser polida. Eles devem ter porta de visita que permita a limpeza interna perfeita, e localizadas de forma a manter o mínimo contato com o meio de fermentação. O transporte de líquidos deve ser feito preferencialmente por pressão de ar. As bombas devem ser totalmente desmontáveis e permitir limpeza completa. Recipientes e tubulações esterilizados são fechados ou separados pór selos de vapor, ou constantemente sob pressão positiva com ar estéril. As tubulações estéreis não devem ter isolamento térmico, ainda que isso represente perda de energia, para permitir a detecção de vazamentos, que representam risco de contaminação. Num processo asséptico, os mínimos detalhes devem ser respei~ados . Assalas de lavagem de acessórios e vidraria de preparo de reagentes e nutrientes têm de ser perfeitamente lavadas e desinfetadas. Qualquer material que contiver resíduo de ferll\entação ou contato com microrganismos têm de ser esterilizados antes da lavagem. Depois de eliminados os restos de meios de cultura e soluções nutritivas, o local deve ser perfeitamente limpo e esterilizado. · A inoculação dos pré..:fermentadores ou germinadores (também denominados semeadores por alguns autores) é feita com o inóculo contido em frascos. Para transferir esse inóculo os germinadores devem possuir um sistema de válvulas e conexões que permitam sua esterilização e resfriamento, para a passagem do inóculo sem risco de contaminação. Para a transferência de meio fermentado dos germinadores para outros fermentadores, ou entre os fermentadores, deve haver uma tubulação esterilizável por vapor com dispositivo para o escoamento do condensado. As tomadas de amostras são feitas por meio de dispositivos especiais esterilizáveis, que após a retirada da amostra não ·oferecem risco de contaminação do meio no fermentador. i I j ____ _ Exemplo de operação de indústria de fermentação 435 Em uma indústria de fermentação com processo asséptico, há fases distintas de operação, em locais de distintas características. As salas ditas estéreis se dividem em três tipos. Salas de preparações -São locais em que a limpeza é extrema. Janelas fechadas, paredes e pisos de fácil lavagem e desinfecção, com comunicação com oexterior por meio de antecâmaras ou portas duplas, arejadas com insuflação de ar filtrado. Nelas são lavados vidraria e equipamento, preparados meios, feitos os exames de microscopia, repicagens, as primeiras inoculações, incubações e outros trabalhos típicos de laboratório de microbiologia. A contaminação ambiental é rotineiramente examinada pela exposição de placas ao ar ambiente, por 15 minutos. Seis colônias é o número considerado aceitável. Salas semi-estéreis - De construção simples, porém adequada a freqüentes lavagens e desinfecções, são salas para trabalhos assépticos como distribuição de meios de cultura esterilizados para placas de Petri, tubos de cultura, frascos . Essas transferências são feitas sobre mesas ou balcões de tampos de fórmica ou de aço inoxidável, de fácil limpeza e desinfecção. Nessas salas a higiene do operador e das suas vestimentas é importante. É comum a instalação de lâmpadas ultravioleta que permanecem acesas todo o tempo, só apagando quando outras lâmpadas de serviço forem acesas. Os testes de esterilidade realizados por exposição ao ambiente de placas com meio por 15 minutos, devem resultar em duas colôriiâs por placa. Salas estéreis - Estas salas são construí4as e mantidas com mais rigor que as anteriores. Nelas são feitos os trabalhos que-requeiram maior cuidado asséptico, tais como inoculação de meios a partir de culturas reservas, repicagens destas culturas. Para trabalhar nessas salas, o cuidado com a assepsia da mão-de-obra deve merecer grande atenção. Qs trabalhadores de qualquer nível devem entrar nas salas estéreis após banharem-se e vestirem vestimentas brancas esterilizadas. A cobertura dos cabel-os é um ponto importante. 19.5 - · Exemplo de operação de indústria de fermentação Como exemplo, são apresentadas as operações em destilarias de etano!. O primeiro passo em uma destilaria de aguardente ou de álcool é obter os mostos e ter um inóculo bem preparado (ver Produção de etano!, Capítulo 1, volume 3 desta coleção). 19.5.1 - Preparo dos substratos No Brasil, os mostos (substratos) das destilarias autônomas são preparados com caldo de cana, e nas destilarias anexas às usinas de açúcar com melaços ou caldo e melaço, dependendo do modo de fabricar o açúcar no momento. Os inóculos são comumente preparados com leveduras de panificação, ·ou com leveduras selecionadas. Os melaços são diluídos com água, até uma concentração adequada, sem outros tratamentos. 436 Operação de instalações industriais de fermentação As canas estão sempre acompanhadas de solo, folhas e outras impurezas, pela sua própria natureza, e por conseqüência das operações de corte, carga, transporte e descarregamento. Para reduzi-las, os colmos são lavados com água, mas nem sempre ficam perfeitamente limpas. Após a moagem, o caldo costuma ainda conter solo, que deve ser eliminado por decantação. Nas destilarias mais bem equipadas, o caldo é parcialmente clarificado, com aquecimento e decantação, formando um substrato limpo, que fermenta bem, espuma menos e contém menos microrganismos. Após a clarificação o mosto é resfriado à temperatura adequada e adicionado ou não de nutrientes, tais como sais de amônio e de fósforo. A adição de nutrientes depende das condições de maturação da matéria-prima ou da variedade. Normalmente os mostos oferecem uma reação adequada para o processo. i ; :l !I il il 19.5.2 - Condução e supervisão da fermentação A primeira fermentação começa com o contato do mosto com o inóculo. Por maior que seja o número de leveduras trazido pelo inóculo, as primeiras fermentações são normalmente lentas, porque ainda ocorre a multiplicação do microrganismo. Ao final, o mosto fermentado, ou vinho, é encaminhado a centrífugas para separar uma parte das leveduras, ou encaminhado à destilaria, de acordo com o sistema de fermentação empregado. As leveduras separadas por centrifugação voltam aos fermentadores após tratamento adequado com ácido sulfúrico. A observação prática da marcha do processo fermentativo é acompanhada da verificação de sua regularidade e pureza, por meio da observação criteriosa de alguns fatores . Dentre eles, são muito importantes: o tempo de fermentação, cheiro, aspecto da espuma, a presença de drosófilas, temperatura, densidade do mosto, os açúcares totais contidos no mosto e residuais no vinho, o álcool no vinho e acidez. Temperatura - Segundo a literatura, a temperatura mais favoráveJ à vida da levedura alcoólica oscila entre 20 e 30°C. Esses limites dependem da linhagem (raça) da levedura, podendo variar para mais ou para menos. Entretanto, as condições reinantes durante a safra de etano! diferem dos limites citados. O processo fermentativo é exotérmico e eleva a temperatura dos mostos a níveis muito mais elevados, muitas vezes próximo dos níveis favoráveis ao do desenvolvimento de bactérias acidulantes. Sendo progressivo o fenômeno da fermentação alcoólica, o aumento de temperatura do mosto também o é, atingindo o máximo, quando a fermentação for mais ativa. A curva de temperatura varia com a concentração dos açúcares, intensidade da fermentação e com o volume do fermentador. Nos dias de baixas temperaturas, a ·alteração não é muito significativa, porém nos dias quentes é comum a temperatura ultrapassar 35°C. Evitar essa elevação é um ponto crucial na operação; os substratos devem ser resfriados com água fria, por meio dos trocadores de calor, mas em muitos casos a água de refrigeração vinda de fontes de abastecimento apresenta temperatura de 30°C ou mais. Quando as destilarias usam água de recirculação, o problema às vezes é rn.ais grave. Os Exemplo de operação de indústria de femnentação 437 resfriadores nem sempre oferecem um rebaixamento suficiente da temperatura, porque trabalham com troca de calor com a atmosfera também quente. O volume de água gasto, o volume de álcool produzido e o seu baixo preço parecem não justificar investimentos em equipamentos de maior eficiência de resfriamento. Daí as destilarias procurarem trabalhar com leveduras que fermentem bem em temperaturas altas. Como conseqüência, há problemas com infecções, que exigem constante e eficiente supervisão. i ' Além desse problema, as temperaturas acima de 35°C causam perdas de álcool, enfraquecem gradativamente a atividade da levedura, favorecem o desenvolvimento de gérmens prejudiciais, os quais podem sobrepujar as leveduras, diminuem o rendimento industrial e dificultam a obtenção de destilado de boa qualidade. Variações da temperatura durante o trabalho na destilaria, pressupõem irregularidades de maior ou menor gravidade. Por exemplo, a lenta elevação da temperatura durante a fermentação pode ser devida a um meio insuficientemente élquecido, à má qualidade do inóculo (pureza, número de células vivas), à quantidade excessiva de açúcar em relação ao número de células, bruscas quedas de temperatura e aparelhamento insuficiente para corrigir o defeito. Tempo de fermentação- O tempo depende do sistema adotado e como é contado. Nos processos descontínuos é contado diferentemente segundo a destilaria. Pode ser desde a inoculação do mosto, ou depois do fermentador cheio. A maneira de adicionar o meio afeta a marcha do processo. Em uma mesma instalação, com mosto e inóculo nas mesmas condições, o enchimento total do fermentador de forma lenta e contínua mantém baixa concentração de açúcar e propicia fermentação mais rápida. O enchimento rápido do fermentador com a carga de mosto de uma única vez, aumenta o tempo. Nos processos contínuos a alteração da vazão altera o tempo de residência do substrato em contato com o inóculo, mas é mais difícil considerar o tempo como fatoide.contr.ole. · A dilatação do tempo de fermentação pode ser devida à excessiva riqueza sacarina do mosto, deficiência do inóculo em relação ao volume de mosto ou à qualidade da levedura, mau preparo do substrato, excesso de acidez, baixa temperatura e outros. A demasiada redução pode ser atribuída à excessiva diluição do mosto, fermentação incompleta e temperatura de fermentação muito elevada, entre outras causas. Cheiro - A intensidade do odor evolui na mesma ordem das fases da fermentação e atinge o máximo durante a fase tumultuosa. Embora difícil de definir qual é o cheiro que deve ser sentido durante a marcha da fermentação para julgá-la pura, é possível afirinar que ele deve ser sempre agradável, ativo, penetrante, persistente, embora variável com a natureza do mosto. Quase sempre tende ao de frutas maduras, especialmente ao de maçãs, característico de fermentações sadias. A percepção de cheiros a vinagre, produtos de laticínios, fumo, cebola, ácido sulfídrico e outros odores estranhos, indica-fermentação defeituosa, variável com a natureza e grau da infecção. 438 Operação de instalações industriais de fermentação Aspecto da espuma- A aparência da espuma varia com a natureza do mosto, com a estirpe da levedura e temperatura da fermentação entre outros fatores . Entretanto, para o mesmo mosto e a mesma levedura, as espumas formadas apresentam aspecto típico e característico. · Nos mostos de melaço, em condições normais há a formação de espuma clara e brilhante, que recobre toda a superfície do meio. É constituída de bolhas gasosas pequenas, regulares e com movimento rápido para o centro do fermentador, como em convecção. Elas acompanham as fases da fermentação; são pouco intensas no início, máximas durante a fase tumultuosa e diminuem até desaparecer por completo no final. As fermentações irregulares dão formação a bolhas de grande diâmetro, persistentes, pouco intensas, de cor e movimentação irregulares. Nos mostos de caldo de cana cru, o aspecto é muito diverso e varia com a linhagem da levedura, preparo do mosto, maturação da cana-de-aÇúcar, intensidade da extração do caldo, entre outros. Essa diversidade dificulta a descrição. Entretanto, a presença de irregularidade na fermentação é visível pela viscosidade, persistência e dimensões das bolhas. Nos caldos clarificados o aspecto é parecido com o das fermentações de mostos de melaço. Redução dos açúcares- A concentração dós açúcares no mosto em fermentação pode ser observada por meio de análise química ou, como é feito na prática, pela densidade do mosto. O progresso da fermentação acusa uma redução regular da densidade, que é medida por meio de areômetros graduados em densidade ou em escalas como a de Brix, comum no Brasil. A redução dos açúcares pode ser representada por curva, tanto pela análise química quanto pela densidade. A queda da densidade deve ser rápida e regular nas fermentações puras. Nos mostos de caldo de cana a fermentação chega ao final quando o .mosto acusar O Brix. Nos mostos de melaço a escala marcará de 3 a 7 • Brix, dependendo da concentração inicial, e da pureza do melaço. O estacionamento ou a queda muito lenta da densidade indica uma anormalidade que pode ser traduzida por infecção, queda brusca da temperatura, inóculo fraco, levedura inadequada ou outra causa. Acidez do mosto em fermentação - O desenvolvimento da acidez do mosto durante a fermentação é indicação preciosa sobre a marcha do processo, permitindo verificar sua pureza. Numa fermentação regular, o vinho não deve acusar grande alteração em relação à acidez inicial do mosto. Na prática, a fermentação é considerada boa quando o valor da elevação da acidez corresponde à metade do valor da acidez inicial. É prova de má f~rmentação quando a acidez final do vinho acusar um aumento maior que o dobro do valor inicial da acidez. Numa fermentação normal, regular, rápida e pura, a acidez pouco muda durante a fase inicial, aumenta na fase tumultuosa e acusa maior acréscimo na fase complementar. Quando a acidez de uma fermentação subseqüente acusar valor crescente em relação à anterior, é sinal de irregularidade. Bibliografia 439 Outros fatores a considerar- Entre os acidentes de fermentação que cooperam para a alteração da acidez estão as fermentações acética, lática e as fermentações gomosas de levânio e dextrânio. A observação da ocorrência do fenômeno de floculação das leveduras indica uma séria irregularidade. As causas da floculação têm sido muito discutidas, mas não há uma segura definição de suas causas. É comum ser associada à presença de bactérias láticas no meio. Estudos recentes associam a floculação a causas genéticas. O aparecimento de drosófilas (mosca-do-vinagre) nos locais de fermentaÇão ou sobre os mostos, indica infecção por bactérias acéticas. Bibliografia AIBA, S.; HUMPHREY, A.E; MILLIS, N.F. Engenharia bioquímica. Trad . Medina, J.C, ed. Sadir, R. Campinas. Fundação Centro Tropical de Pesquisa e Tecnologia de Alimentos. 1971. 334 p. ALMEIDA, J.R. Álcool e destilaria. Piracicaba. Ed. Nathanael dos Santos. 1940. 333 p. ALMEIDA, J.R. Matéria-prima. In: ALMEIDA, J.R. 11 Semana de Fermentação Alcoólica. Fermentação do mel final. Piracicaba. Instituto Zimotécnico. Mimeog. 1961 v . 2 p .172-187 A YRES, G.C.M. Fatores físicos e químicos que influem sobre a fermentação alcoólica In: ALMEIDA, J.R. Fermentação alcoólica. I Semana de Fermentação Alcoólica. Piracicaba. Instituto Zimotécnico. Mimeog. 1960 v. 1 p. 103-118 A YRES, G.C.M. Influência de antisséticos na fermentação do melaço In: ALMEIDA, J.R. 11 Semana de Fermentação Alcoólica. Fermentação do mel final. Piracicaba. Instituto Zimotécnico. Mimeog. 1961 v. 2 p .188 -1961 BLAKEBROUGH, N. Industrial fermentations. In: Biochemical and Biological Engineering Science. Londres. Academic Press. 1967 . v 1 BUTLIN,K.R. Aspects of Microbiology. In: BLAKEBROUGH, N. Biochemical and Biological Engineering Science. Londres . Academic Press. 1967 . v 1 FINN,R.K. Agitation and Aeration. In: BLAKEBROUGH, N. Biochemical and Biological Engineering Science. Londres. Academic Press. 1967 . y 1 FRIEDLANDER, S.K. Aerosol Filtration by Fibrous Filters. In: BLAKEBROUGH, N . Biochemical and Biological Engineering Science. London. Academic Press. 1967 . v 1 BORZANI, W. O emprego de antibióticos como desinfetante em fermentaçÕes alcoóli· cas. Boi. Dep. Quim. Esc. Politécnica. São Paulo. v. 2. p . 1-4, 1956 BORZANI, W. Preparo dos pés de fermentação para melaço In: ALMEIDA, J.R. 11 Semana de Fermentação Alcoólica. Fermentação do mel final. Piracicaba. Instituto Zimotécnico. Mimeog. 1961 V. 2 p.172-187 CALAI, F. Acidentes da fermentação alcoólica In: ALMEIDA, J.R. de Fermentação alcoólica. I Semana de Fermentação Alcoólica. Piracicaba. Instituto Zimotécnico. 1960. v . 2 p. 234-241 LIMA, U. de A. Verificação prática da pureza e da marcha da fermentaÇão alcoólica. In: ALMEIDA, J.R. Fermentação alcoólica. I Semana de Fermentação Alcoólica. Piracicaba. Instituto Zimotécnico. 1960. v. 2 p. 221-226 LIMA, U. A . Sistemas de fermentação alcoólica. In: ALMEIDA, J.R. Fermentação alcoólica. I Semana de Fermentação Alcoólica. Piracicaba. Instituto Zimotécnico. Mimeog. 1960 V.2 p. 242-253 440 Operação de instalações industriais de fermentação LIMA, U. A. Preparação dos mostos In: ALMEIDA, J.R. 111 Semana de Fermentação Alcoólica - Fermentação do caldo de cana. Piracicaba. Instituto Zimotécnico. 1962. V. 1. p . 89-103 LIMA, U. A. Produção de etanol In: LIMA, U. A.; AQUARONE, E.; BORZANI, W. TecnoÍogia das fermentações . São Paulo. Blücher. 1975. P. 48-69 MELONI, G. L'Industria dell'alcole. Milão. U. Hoepli. 1952. 3 v. MONZONI, D. Operação e controle de uma indústria de fermentação. In: BORZANI,W.; LIMA, U. A.; AQUARONE1 E. Engenharia Bioquímica. São Paulo. Edgard Blücher. 1975. 300 p . SERRA, P.G. Influência da água no preparo de mostos In: ALMEIDA, J.R. 11 Semana de Fermentação Alcoólica - Fermentação do mel final. Piracicaba. Instituto Zimotécnico. Mimeog. v. 11961 p . 137-152 • 441 Josef Ernst Thiemann 20.1 - Introdução O desenvolvimento dos equipamentos de fermentação, tal como são concebidos atualmente, foi lento e em grande parte empírico. Os primeiros produtos obtidos por fermentação, como por exemplo, a produção de vinho, cerveja, queijos, iogurte, vinagre, chucrute, etc., se processavam satisfatoriamente, ·mesmo sob condições precárias de assepsia. A natureza específica do substrato empregado, o crescimento vigoroso do microrganismo utilizado, ou ainda a ação inibidora do produto final, contribuíram, separadamente ou em conjunto, para o bom andamento dos processos fermentativos. A passa,geJ.!l desses processos artesanais de fermentação a: escalas comerciais mais evoluídas, aportou poucos melhoramentos ao desenvolvimento dos equipamentos utilizados. · Um primeiro passo ri.o melhoramento e na maior sofisticação dos processos fermentativos ocorreu com a introdução de culturas puras na produção de cerveja. Contudo, foi realmente com os trabalhos pioneiros de CHAIM WEIZMANN e colaboradores, na Inglaterra, durante os anos de 1914-1918, desenvolvendo processo submerso anaeróbio de produção de acetona-butanol, que o conceito e condições de fermentação controlada se afirmaram. Podemos considerar a fermentação acetona-butano! como representando o marco inicial da primeira fermentação industrial em grande ~scala, empregando condições de total assepsia. As condições de estrita anaerobiose, essenciais ao desenvolvimento do Clostridium acetobutylicum, serviam ao mesmo tempo de proteção contra um grande número de contaminantes ambientais aeróbicos mas não impediam a contaminação da fermentação por bacteriófagos, que passaram a ser um dos problemas mais sérios. 1 Ainda hoje, com todos os avanços, melhoramentos e sofisticação, a infecção fágica de fermentações de antibióticos pode apresentar sérios problemas, que são eliminados unicamente com a seleção e introdução de cepas fago resistentes. 442 · i·. I I j ! i lt I r I f i. COnstrução de equipamentos de fennentação É muito difícil imaginarmos hoje a multitude de problemas que se apresentaram na implantação das primeiras fermentações industriais e para os quais soluções satisfatórias tinham de ser encontradas rapidamente, para garantir o sucesso de um processo. Para realizar a fermentação acetona-butanol; reatores adequados não eram disponíveis e tentativas de adaptar os reatores utilizados na fermentação alcóolica, dotando-,os co.m tampas, simplesmente eram inviáveis pela impossibilidade de proceder a uma esterilização adequada com vapor. A construção de grandes reatores em aço-carbono, com fundo e tampa torriesféricos esterilizáveis com vapor sob pressão, com tubulações também esterilizáveis para a adição de inóculo, antiespumante, coleta de amostras, descarga e saída dos gases formados durante a fermentação, etc., foram passos de gigante. Apesar de os reatores utilizados na fermentação acetona-butanol não serem dotados de sistema de agitação (os grandes quantitativos de gás produzidos durante o processo fermentativo mantinham o conteúdo dos reatores em contínua agitação e homogeneização), permitiram acumular uma gama considerável de expertise na condução e construção de equipamentos, beneficiando o desenvolvimento de outros processos fermentativos (leveduras de panificação, ácido cítrico e outros ácidos orgânicos, enzimas, etc.). Assim, no início da década o cenário estava pronto para um novo e decisivo desenvolvimento no campo das fermentações, qual seja, a adaptação e aperfeiçoamento das técnicas de cultivo submerso, aeróbico e sob condições estéreis à produção de penicilina e logo a seguir de outros antibióticos, aminoácidos e transformação de esteróides. 2 Em setembro de 1943 foi iniciada, em Terre Haute, Estados Unidos, a primeira planta industrial de fermentação de penicilina com fer~ mentadores de aço-carbono, com 54m3 dotados de sistema de agitação, aeração e outros aperfeiçoamentos necessários à condução do novo processo fermentativo. 3 Durante os decênios subseqüentes, muita atenção foi dedicada a problemas relacionados com a substituição dos processos de batelada por batelada alimentada e processos contínuos, utilização de novos substratos como hidrocCll'bonetos e estudos de novas configurações dos reatores, agitadores, filtração do ar, controle dos processos, etc. Nos últimos anos, o d~senvolvimento quase que explosivo do rn:ercado de produtos biotecnológicos, advindo dos resultados práticos do emprego das tecnologias do DNA recombinante, influenciou novamente a concepção da construção dos equipamentos de fermentação, principalmente no que diz respeito ao conceito de esterilidade e contenção ambiental e o emprego de células animais ou humanas para a produção de biofármacos. 4 20.2 - Características básicas de reatores para cultivo de bactérias ou células animais Para satisfazer a função primária de um reator de fermentação, que é a de fornecer condições ambientais adequadas ao crescimento dos microrganismos, uma série de parâmetros deve ser considerada e incorporada ao mesmo, durante a sua fase de projeto e construção. Características básicas de reatores para cultivo de bactérias ou células animais 443 Os seguintes pontos devem ser observados: 1) O reator deve ser capaz de manter-se estéril por muitos dias, trabalh,a r sem problemas por longos períodos e satisfazer todas as exigências legislativas de contenção ambiental. 2) As exigências metabólicas dos microrganismos, quanto à aeração e agitação, devem ser plenament~ satisfeitas, mantendo porém a integridade física dos mesmos. 3) A potência absorvida deve ser a menorpossível. 4)Um eficiente sistema de controle de temperatura deve ser disponível. 5) Um sistema de controle de pH deve ser disponível. 6) Um sistema de tomada de amostras à prova de contaminação, tanto do conteúdo do fermentador como do meio ambiente, deve ser parte integrante do equipamento. 7) Perdas por evaporação devem ser mantidas ao mínimo. 8) Eficiente sistema de controle dos gases de saída do fermentador deve estar disponível. 9) O reator deve exigir o mínimo em mão-de-obra para sua operação, limpeza e manutenção. 10) O reator deve preencher, sempre que possível, a característica de multipropósito, contudo, a regulamentação de contenção ambiental e a possibilidade de contaminações cruzadas podem ser fatores limitantes. 11) O reator deve ter as superfícies in~ernas polidas e todas as suas conexões, na medida do possível, devem ser soldadas e não flangeadas ou rosqueadas. 12) Na medida do possível, o reator deve manter uma geometria similar à dos reatores menores ou maiores, a fim de facilitar a ampliação de escala do processo. · Sem dúvida, os itens 1 e 2 são os mais críticos e também os mais difíceis de satisfazer. Um grande número de diferent~s concepções de reatores têm sido descritos na litt;!ratura, contudo somente algumas têm se mostrado satisfatórias e encontraram aplicação industrial. O tipo de reator mais difundido é baseado no modelo de tanque cilíndrico vertical, agitado mecanicamente ou não, provido de sistema de aquecimento e resfriamento e demais controles necessários ao processo. A Figura 20.1 (a,b) mostra esquematicamente as características típicas de um reator agitado mecanicamente e as suas relações dimensionais (Tab. 20.1). Entre as novas configurações de reatores, duas em particular - o air lift e o tower fermenter- têm encontrado aplicações comerciais. .· · -----~--~·- -·__ I ___:_ . ___ _ ________J 1 [: 444 Construção de equipamentos de fermentação Ii I j. I I I I I Figura 20.1.a - Diagrama de biorreator com turbinas múltiplas Tabela 20.1 - Relações geométricas mais utilizadas em fermentadores Steel e Maxon Blakeborough Paca et al. Aiba et al. (1961) (1967) (1976) (1973) 55 em - 150cm - L/D (diâmetro) 0,73 1, o- 1, 5 1,7 Diâmetro turbina (P /D) 0,40 0,33 0,33 Largura chicana /D 0,10 O, 08- O, 010 0,098 0,095 . Altura • Agitador /D - 0,33 0,37 0,24 P/V - - 0,74 - P/W - - 0,77 0,85 P/Y - - 0,77 0,85 P/Z - - 0,91 H/D - - 2,95 Dimensões Altura do líquido (L) • 0,4 .. 2,10 2,20 I' J Caracterlsticas básicas de reatores para cultivo de bactérias ou células animais 445 MOTOR AMOSTRAGEM - CHICANA Figura 20.1.b - Visão geral de um biorreator ·Na presente apresentação vamos nos restringir mais especificamente à discussão das características construtivas de fermentadores clássicos aerados, agitados e utilizados no cultivo de bactérias ou fungos. Outros tipos de fermentadores utilizados, p.ex., para cultivo de células animais, serão abordados ao término do capítulo. A introdução da penicilina durante a Segunda Guerra Mundial, iniciou uma corrida para a descoberta de novos antibióticos, e evidenciou nitidamente a necessidade de intensos trabalhos integrados de microbiologistas, geneticistas, bioquímicas e engenheiros para completar, com sucesso, as· etapas necessárias para culminar no planejamento, "layout" e construção das plantas de fermentação e dos equipamentos. I l ~~J 446 Construção de equipamentos de fermentação Consideramos importante mencionar, mesmo que resumidamente, as etapas de planejamento que fazem parte integrante de um projeto de construção de uma planta de fermentação como um todo e não limitar-nos exclusivamente à descrição do equipamento de fermentação propriamente dito, ou seja, o reator. Para uma adequada elaboração do projeto, diversas etapas devem ser cumpridas. 20.2.1 - Critérios primários do projeto Esta etapa representa a coleta de todos os dados relativos ao projeto, englobando dados referentes ao processo biológico a ser desenvolvido, como também à planta a ser construída. Dados do processo englobam informações sobre a cinética do processo, balanços térmicos das reações, condições de assepsia necessárias, propriedades fisiológicas do(s) microrganismo(s), necessidade de matérias-primas e suas características, etc. Todas essas informações e outras pertinentes ao processo, fazem parte do "know-how" acumulado durante a fase experimental desenvolvida em nível de laboratório e planta piloto. Quanto aos dados relacionados com o projeto da nova planta, estes se relacionam fundamentalmente com a sua localização, capacidade instalada prevista, disponibilidade ou não de água, vapor, eletricidade, volume e características dos efluentes, tratamento dos mesmos, etc . 20.2.2 - Fluxograma do processo !.i lI li ll .. I' I' A elaboração de um fluxograma detalhado do processo, baseado nos dados acumulados e estabelecidos na elaboração dos critérios primários, é fundamental. No fluxograma, todos os equipamentos necessários ao processo são lilnÇados em escala e sua exata localização na planta. Um diagrama das tubulações e instrumentação é elaborado, nele sendo incluídas e detalhadas todas as linhas de processo, válvulas, dimensões, tipos, bitolas, materiais de construção, características, etc. Enfim, todas as informações necessárias ao "procurement" devem estar disponíveis . 20.2.3 - Desenho mecânico Com os dados e informações disponíveis através dos levantamentos dos critérios primários do projeto e do fluxograma do processo, o desenho mecânico enfim vai detalhar as especificações de todo o projeto, tais como, por ex.: • Cálculo da pressão dos reatores • Cálculo dos trocadores de calor . • Cálculo das estruturas metálicas • Análise da expansão térmica das tubulações Características básicas de reatores para cultivo de bactérias ou células_animais • • • • • • 447 Cálculo dos agitadores Especificação das tubulações Especificação dos acabamentos internos dos reatores Especificação dos critérios de assepsia e esterilidade Especificação dos materiais de construção Especificação e dimensionamento da rede elétrica, etc. I Com essas informações e cálculos, são elaborados os desenhos definitivos com os diversos cortes e elevações, onde necessários, compreendendo entre outros: • • • • "Layout" da planta "Layout" dos equipamentos "Layout" das tubulações "Layout" de águas pluviais, esgotos, etc; etc. Do exposto fica claro que os bioprocessos não diferem em muito de processos químicos usuais, no que diz respeito à elaboração dos projetos, salvo pela característica biológica dos mesmos, que deve ser levada em consideração em todas as etapas do planejamento, principalmente nos itens: assepsia, esterilidade e limpeza. 6· 7 A manutenção da esterilidade depende nao somente de um acurado processo de esterilização, como também; em grande parte, do correto planejamento e execução do projeto. Freqüentemente a causa do desenvolvimento de contaminações pode ser encontrada em falhas no projeto construtivo, tanto do fermentador como dos equipamentos ancilares, bem como das tubulações e válvulas utilizadas. Com a. intro_çlução de microrganismos recombinantes e o seu usei cada vez mais generalizado pela indústria de fermentação, o conceito de esterilidade foi ampliado, incluindo atualmente também aspectos de biossegurança e de contenção ambiental. Antes do emprego de microrganismos recombinantes, a maior preocupação era evitar a introdução no reator de microrganismos estranhos ao processo; atualmente existe a preocupação adicional de evitar a contaminaçao do meio ambiente com formas viáveis do microrganismo produtor.5' 8 As primeiras regulamentações sobre o manuseio e uso de microrganismos recombinantes e medidas para o controle dos riscos envolvidos, foram elaboradas pelo NIH americano (National Institute of Health) e gradativamente adotadas e implantadas pela maioria dos países, inclusive o Brasil.9.1o, 11 Para estabelecer o nível adequado de contenção ambiental necessário ao uso de microrganismos recombinantes, as condiç:ões devem ser analisadas cuidadosamente, a fim de levantar os pontos que podem ser fonte de contaminação ambiental. De acordo com a maior ou menor gravidade do risco, foram estabelecidos níveis diversos de contençã-o que devem ser seguidos. l! i ~ I l l II I 448 Construção de equipamentos de fennentação Microrganismos modificados geneticamente pela tecnologia do DNA recom. binimte são classificados como inócuos (grupo I), potencialmente patogênicos (grupo 11), ou patogênicos (grupo 111). Tudo indica que, no futuro, não será mais feita distinção entre microrganismos recombinantes e não recombinantes. O caráter fundamental será se o microrganismo é ou não patogênico ou potencialmente patogênico, independente de sua constituição genética. 5 A maioria dos microrganismos utilizados em processos industriais estão incluídos no grupo I. As regulamentações do CDC (Center for Disease Control) (1994) espeCificam 4 níveis de contenção, indo do Nível 1, de risco mínimo, onde a aplicação de Good Industrial Large Scale Practice (GILSP) é considerada adequada; Nível 2, onde microrganismos de patogenicidade moderada são agrupados; Nível 3, requer condições especiais de contenção para certos tipos de patógenos; Nível 4, descreve as condições drásticas de contenção a serem adotadas. 12 20.3 - Construção do fermentador 20.3.1 - Materiais de construção A escolha dos materiais de construção dos equipamentos de fermentação é de vital importância, e deve ser feita levando em consideração as condições particulares às quais os materiais serão expostos. 13 Ao contrário das condições encontradas na indústria química, nas indústrias de fermentação as variações de temperatura e pressão utilizadas são bastante limitadas e o pH é mantido geralmente próximo ao neutro. . Contudo, ao contrário da indústria química, as exigências de optirações assépticas' são fundamentais e condicionam profundamente a escolha dos materiais de construção. Para reatores de volume limitado (1-20 L) (reatores de bancada) é perfeitamente possível o emprego de vidro. A utilização de vidro apresenta uma série de vantagens: superfícies lisas, facilidade de limpeza, não tóxico, resistente à corrosão e facilidade de inspeção visual. . Fundamentalmente dois tipos básicos de fermentadores de bancada são utilizados: 1. Reatores em vidro com fundo arredondado ou chato e a tampa superior em inox ligada ao corpo por uma flange. O vidro de borossilieato utilizado pode ser esterilizado em autoclave. O inconveniente é a baixa resistência a choques e pressão. Segundo COWAN e THOMAS, 13 o diâmetro máximo para reatores de vidro é de 60 em. 2. Reatores com corpo cilí~drico de vidro, com tampas superior ·e inferior em aço inoxidável. Construção do fermentador 449 A parte inferior em reatores de volume maiúr (10-20 L) pode ser utilizada para a entrada das sondas e coleta de amostras, localizando-se na tampa superior o sistema de agitação, sonda de espuma e várias entradas para adições. Reatores desse tipo podem ser freqüentemente adaptados para esterilização in situ (Fig. 20.2). Figura 20.2 - Fermentador de bancada esterilizável in situ de 20 litros, modelo LH 21 O, com corpo de vidro, tampa superior em inox e parte inferior em inox com entrada dos sensores-pH, Oxigênio, temperatura e coleta de amostra. (lnceltech, França). Reatores pi-loto e industriais, onde os volumes podem variar de 50 L a 500 m 3 ou mais (Fig. 20.3), são atualmente construídos em aço inoxidável 316. Na construção desses reatores os materiais utilizados devem ser avaliados em função de sua capacidade de resistir às pressões de esterilização, resistência à corrosão, toxicidade dos produtos resultantes de uma eventual corrosão e custo do material. · Aço mole com menos de 0,25% de carbono foi utilizado na construção de fermentadores de grande porte para a produção de pen

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