‫عنوان‪ :‬خصوصيات فنوتيپي ‪ Escherichia coli‬طيور به‬
‫وسيله آزمايش آنتي بيوگرام‬
‫نويسندگان‪ :‬مهرناز راد*‪،‬‬
‫طاهره غالمحسيني مقدم‬
‫آدرس‪ :‬گروه پاتوبيولوژي دانشكده دامپزشكي دانشگاه‬
‫فردوسي مشهد‪ ،‬صندوق پستي‪ ،1793-91775 :‬مشهد‬
‫* نويسنده مسئول‬
‫پست الكترونيكي‪mehrnazrad@yahoo.com :‬‬
‫خالصه‬
‫عفونتهاي ناشي ازاشريشياكلي ازاهميت ويژه اي در صنعت‬
‫طيوربرخوردار است‪ .‬اين عامل مهمترين باكتري بيماريزاي طيور‬
‫بوده كه سبب تعداد زيادي سندرم بيماري شده كه منجر به ضررهاي‬
‫اقتصادي جدي در صنعت طيور مي گردد‪ .‬بسياري از روشهاي فنوتيپي‬
‫و ژنوتيپي براي تايپينگ اشريشيا كلي به كار رفته اند‪ .‬تشخيص‬
‫سويه هاي مختلف اشريشيا كلي راهنمايي براي مطالعه اپيدميولوژي‬
‫در مورد منشا عفونت ونحوه انتقال بيماري است‪ .‬اهميت‬
‫اپيدميولوژيكي اين روشها بستگي به قدرت تفكيك‪ ،‬قابليت اطمينان‬
‫و سهولت اجراي آنها دارد‪ .‬درمطالعه حاضر برای تايپينگ ‪34‬‬
‫مورد‬
‫اشريشيا کلی جدا شده از بيماری کمپلکس تنفسی در طيور از روش‬
‫آنتی بيوگرام استفاده گرديد‪ .‬جهت تاييد موارد جدا شده از‬
‫آزمايشات بيوشيميايي استفاده شد‪ .‬الگوحساسيت‪ /‬مقاومت در هر‬
‫مورد مشخص گرديد تا گامي جهت درک بهتر عامل مسببه در کلي‬
‫باسيلوز و اساسی براي تحقيقات بعدی جهت فرموالسيون معيارهای‬
‫جديد برای کنترل وپيشگيری باشد‪ .‬حساسيت ‪ /‬مقاومت سويه های‬
‫‪ Escherchia coli‬با استفاده از روش استاندارد انتشار از ديسک مورد‬
‫بررسي قرار گرفت‪ .‬از ‪ 7‬ديسک آنتی بيوتيک در روی محيط کشت مولر‬
‫هينتون آگار تلقيح شده با باکتری ‪ Escherchia coli‬استفاده گرديد‪.‬‬
‫پليتهای تلقيح شده يک شب در حرارت ‪ 37‬درجه سانتيگراد قرار داده‬
‫شد و سپس قطر ناحيه عدم رشد اندازه گيری شده وبر اساس جداول‬
‫استاندارد تفسير گرديد‪.‬‬
‫نتايج نشان داد که تمام سويه ها به جز يکی نسبت به‬
‫ناليديکسيک اسيد مقاوم بودند‪ .‬در مورد اکسي تتراسيکلين هم‬
‫نتايج مشابه ناليديکسيک اسيد بود‪ .‬تمام موارد در برابر‬
‫جنتامايسين حساس بودند‪.‬‬
‫‪ 14‬الگوی متفاوت( گروه‪(A– N‬شناسايی‬
‫گرديد که نشان داد که قابليت‬
‫اين روش در تفکيک ‪ 34‬سويه‬
‫اشريشيا کلی ‪ %41.17‬می باشد‪ .‬در هفت گروه ‪ ،‬يک سويه و در سه‬
‫گروه ‪ ،‬دو سويه و درچهار گروه ديگر هر کدام ‪ 6 ،4 ، ،3‬و ‪ 8‬سويه‬
‫قرار گرفتند‪.‬‬
‫اين احتمال وجود دارد که با استفاده از تعداد بيشتری آنتی‬
‫ِک در اين روش‪ ،‬تعداد الگوها افزايش يابد‪ .‬با توجه به‬
‫بيوت‬
‫سهولت انجام اين روش در آزمايشگاه‪ ،‬مي توان از آن همراه با‬
‫ساير روشهای فنوتايپينگ و ژنوتايپينگ‬
‫برای افزايش قدرت تفکيک‬
‫سويه های اشريشيا كلي استفاده نمود‪.‬‬
‫كلمات كليدي‪:‬‬
‫آنتي بيوگرام‪ ،‬فنوتايپينگ‪ ،‬سويه هاي اشريشيا كلي‬
‫مقدمه‬
‫روشهاي بسياري براي تايپينگ اشريشيا كلي جهت مطالعه‬
‫اپيدميولوژي آن مورد استفاده قرار گرفته اند‪ .‬ارزش‬
‫اپيدميولوژيكي اين روشها به قدرت تفكيك‪ ،‬قابليت اطمينان و‬
‫سهولت انجام آنها بستگي دارد‪ .‬متداولترين روش فنوتايپينگ‬
‫اشريشيا كلي سروتايپينگ مي باشد (‪ .)4‬سروتيپ هاي بسياري از اين‬
‫باكتري گزارش شده است كه با بررسي هاي سرولوژيكي نشان داده‬
‫شده است كه بيشترين موارد جدا شده از عفونتهاي طيور متعلق به‬
‫سروگروه هاي ‪O2 ،O1‬و ‪ O78‬مي باشد‪ .‬سروتايپينگ يكي از‬
‫متداولترين روشهاي فنوتايپينگ بوده كه بر اساس حضور آنتي ژن‬
‫هاي ‪ K ،O‬و ‪ H‬مي باشد‪ .‬بسياري از سويه هاي اشريشيا كلي با‬
‫استفاده از اين روش غيرقابل تايپ شدن هستند و انجام آن مستلزم‬
‫هزينه و صرف زمان است (‪ .)2‬ساير روشهاي فنوتايپينگ مثل‬
‫بيوتايپينگ‪ ،‬رزيستوتايپينگ‪ ،‬هموآگلوتينين تايپينگ و كلي سين‬
‫تايپينگ نيز توسط كريكتون و اولد (‪ )1980‬و ديويد و همكاران‬
‫(‪ )1991‬توصيه شده اند و نتيجه گيري كرده اند كه با ادغام دو‬
‫روش مي توان يك سيستم قابل اطميناني را به وجود آورد (‪3‬و‪.)4‬‬
‫از آنجايي كه معيارهاي كنترلي براي بيماري هاي به موجب‬
‫اشريشيا كلي عمدتا بستگي به استفاده از آنتي بيوتيك دارد‪،‬‬
‫بنابراين افزايش سويه هاي مقاوم به آنتي بيوتيك‬
‫هاي‬
‫رايج و‬
‫مورد استفاده در صنعت طيورمشاهده مي گردد‪.‬با استفاده از‬
‫آزمايش حساسيت ضد ميكروبي عالوه بر تفكيك سويه ها ‪ ،‬مي توان از‬
‫وقوع سويه هاي مقاوم با استفاده از ساير روشهاي پيشگيري‬
‫جلوگيري نمود‪.‬‬
‫مواد و روش کار‬
‫آزمايش حساسيت ضد ميكروبي براي ‪ 34‬سويه اشريشيا جدا شده از‬
‫بيماري كمپلكس تنفسي در طيور به روش انتشار از ديسك صورت گرفت‬
‫(‪ .)6‬سويه هاي اشريشيا كلي به صورت ليوفيليزه دركلكسيون باكتري‬
‫آزمايشگاه ميكروبيولوژي دانشكده دامپزشكي دانشگاه فردوسي مشهد‬
‫نگهداري مي گردند‪ .‬از محيط كشت مولر هينتون آگار براي آزمايش‬
‫آنتي بيوگرام استفاده شد‪.‬‬
‫از ‪ 7‬ديسك آنتي بيوتيك مختلف شامل‬
‫ناليديكسيك اسيد‪ ،‬آمپي سيلين‪ ،‬اكسي تتراسيكلين‪ ،‬جنتامايسين‪،‬‬
‫كلرآمفنيكل‪ ،‬نئومايسين و تري متوپريم سولفامتوكسازول استفاده‬
‫گرديد‪ .‬از سوسپانسيون‬
‫هر كدام از سويه ها ي اشريشيا كلي كه‬
‫كدورت آن مطابق با لوله ‪ 0.5‬مك فارلند بود در محيط كشت مولر‬
‫هينتون آگار تلقيح شد و ديسك هاي آنتي بيوتيك با فاصله ‪ 24‬ميلي‬
‫متر از هم روي محيط كشت قرار داده شدند‪ .‬پليتها در انكوباتور‬
‫‪ 37‬درجه سانتيگراد به مدت ‪ 24‬ساعت‬
‫گذاشته شدند‪ .‬پس از ‪ 24‬ساعت‬
‫ناحيه عدم رشد باكتري در مورد هر آنتي بيوتيك به طور جداگانه‬
‫برحسب ميلي متر اندازه گيري گرديد وبا مقايسه با جداول‬
‫استاندارد درجه حساسيت نسبت به هر آنتي بيوتيك تعيين شد‪.‬‬
‫نتايج‬
‫نتايج حاصله نشان داد كه تمام سويه ها در برابر جنتامايسين‬
‫حساس بودند‪ .‬در مورد آنتي بيوتيك هاي ناليديكسيك اسيد و اكسي‬
‫تتراسيكلين تمام سويه ها به جز يك سويه ‪ ،‬مقاوم بودند‪ .‬تمام‬
‫سويه ها با استفاده از اين روش قابل تايپ شدن بودند‪ .‬در بين‬
‫اين ‪ 34‬سويه ‪ 14‬الگوي متفاوت آنتي بيوگرام شناسايي گرديد‪ .‬كه‬
‫نشان داد كه قابليت اين روش در تفكيك ‪ 34‬سويه اشريشيا كلي‪،‬‬
‫‪ %41.17‬مي باشد‪ .‬در هفت گروه هر كدام يك سويه‪ ،‬در سه گروه هر‬
‫كدام دو سويه و در چهار گروه ديگر هر كدام ‪6 ،4 ،2‬و ‪ 8‬سويه‬
‫قرار گرفتند‪ .‬جدول زير نشاندهنده الگوهاي آنتي بيوگرام در بين‬
‫‪ 34‬سويه اشريشيا كلي مي باشد‪.‬‬
‫الگوهاي مختلف آنتي بيوگرام سويه هاي‬
‫اشريشيا كلي‬
‫‪C NE TS‬‬
‫‬‫الگوي ‪1‬‬
‫‪3‬‬
‫‬‫‬‫الگوي ‪2‬‬
‫‪8‬‬
‫‬‫‬‫الگوي ‪3‬‬
‫‪4‬‬
‫‬‫‬‫الگوي ‪4‬‬
‫‪2‬‬
‫‬‫‪+‬‬
‫الگوي ‪5‬‬
‫‪1‬‬
‫‬‫‬‫الگوي ‪6‬‬
‫‪6‬‬
‫‬‫‬‫الگوي ‪7‬‬
‫‪1‬‬
‫‪-+‬‬
‫‪+‬‬
‫الگوي ‪8‬‬
‫‪1‬‬
‫‪-‬‬
‫‪GM‬‬
‫‪OT‬‬
‫‪-‬‬
‫‪NA‬‬
‫‪-‬‬
‫‪AP‬‬
‫تعداد سويه ها‬
‫‬‫‪+‬‬
‫‪-+‬‬
‫‪-‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪-‬‬
‫‪+‬‬
‫‪-‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪-‬‬
‫‪-+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪-‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪-‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪-‬‬
‫‪+‬‬
‫‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪+‬‬
‫‪-‬‬
‫‪+‬‬
‫‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪+‬‬
‫‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪-+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪-‬‬
‫‪-+‬‬
‫الگوي ‪9‬‬
‫‬‫الگوي ‪10‬‬
‫‬‫الگوي ‪11‬‬
‫‬‫الگوي ‪12‬‬
‫‬‫الگوي‪13‬‬
‫‪1‬‬
‫الگوي ‪14‬‬
‫‪-‬‬
‫‪+‬‬
‫‪1‬‬
‫‪-+‬‬
‫‪1‬‬
‫‬‫‪1‬‬
‫‬‫‪1‬‬
‫‪+‬‬
‫‬‫‪2‬‬
‫‪-‬‬
‫‪+‬‬
‫‪-‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪-‬‬
‫‪+‬‬
‫‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪-+‬‬
‫‪-+‬‬
‫‪-+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‬‫‪+‬‬
‫‬‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪+‬‬
‫‪-+‬‬
‫‬‫‪-+‬‬
‫‪+‬‬
‫‬‫‬‫‪-+‬‬
‫‪-‬‬
‫‪-‬‬
‫‪-+‬‬
‫متوسط‬
‫‪-+‬‬
‫‪ +‬حساس‪ - ،‬مقاوم‪،‬‬
‫‪ :TS‬تري متوپريم سولفامتوكسازول ‪ :NE ،‬نئومايسين‪:C،‬‬
‫كلرآمفنيكل‪ :GM ،‬جنتامايسين‪ : OT ،‬اكسي تتراسيكلين ‪ :AP،‬آمپي‬
‫سيلين‪ :NA ،‬ناليديكسيك اسيد‬
‫بحث‬
‫روشهاي گوناگون تايپينگ براي تفكيك سويه هاي اشريشيا كلي مورد‬
‫استفاده قرار گرفته اند‪ .‬بكارگيري از روشهاي فنوتايپينگ به‬
‫دليل سهولت انجام آنها در هر آزمايشگاهي‬
‫بيشتر مورد استفاده‬
‫قرار مي گيرند‪ .‬سروتايپينگ‪ ،‬بيوتايپينگ‪ ،‬رزيستوتايپينگ‪ ،‬كلي‬
‫سين تايپينگ و آزمايش حساسيت ضد ميكروبي از جمله روشهاي‬
‫فنوتايپينگ مي باشند‪ .‬در مطالعه حاضراز روش آنتي بيوگرام‬
‫استفاده شد و در بين ‪34‬سويه اشريشيا كلي ‪ 14‬الگوي متفاوت‬
‫شناسايي شد‪ .‬بنابراين‪ ،‬قابليت اين روش در تفكيك اين ‪ 34‬سويه‬
‫‪ %41.17‬تعيين گرديد‪ .‬در بررسي‬
‫ون در واج (‪ 160 )1975‬سويه‬
‫اشريشيا كلي به وسيله روش بيوتايپينگ مورد آزمايش قرار گرفتند‬
‫و تمام سويه ها قابل تايپ شدن بودند و ‪ 55‬بيوتيپ شناسايي‬
‫گرديد(‪ .)7‬در مطالعه اي ديگر توسط باكولد وهمكاران (‪17 )1979‬‬
‫آزمايش بيوشيميايي براي تفكيك ‪ 959‬سويه بكار برده شد و‪78‬‬
‫بيوتيپ شناسايي شد (‪ .)1‬در تحقيقي ديگر از ‪ 178‬سويه اشريشيا‬
‫كلي جدا شده از خرگوش سروتيپ ‪ O132:H2‬برجسته بوده و‪ %70‬از سويه‬
‫ها به اين سروتيپ تعلق دارند(‪.)5‬‬
‫در تحقيق ديويدوهمكاران در‬
‫سال ‪ 20 ، 1991‬سويه با استفاده از سي و دو ديسك آنتي بيوتيك‬
‫مورد آزمايش قرار گرفتتند و قابليت اطمينان روش در تفكيك سويه‬
‫ها ‪ %90‬تعيين شد وبر اساس نتايج آنها تلفيق روش آناليز پالسميد‬
‫و آنتي بيوگرام مي تواند قابليت اطمينان را به ‪ %100‬برساند (‬
‫‪.)4‬‬
‫در بررسي انجام شده توسط كريكتون‬
‫وهمكاران (‪184 ، ) 1980‬‬
‫سويه اشريشيا كلي مورد آزمايش آنتي بيوگرام قرار گرفتند‪ .‬آنها‬
‫با استفاده از ‪ 8‬ديسك آنتي بيوتيك مختلف به ‪ 9‬الگوي متفاوت دست‬
‫يافتند و بكارگيري اين آزمايش را به تنهايي و با اين تعداد‬
‫آنتي بيوتيك در تفكيك سويه ها با درجه تفكيك محدودي ارزيابي‬
‫نمودند(‪ .)3‬در مطالعه كالد وهمكاران (‪ )1985‬نشان داده شد كه‬
‫اكثر موارد اشريشيا كلي جداشده نسبت به آنتي بيوتيك هايي كه‬
‫به طور متداول در صنعت طيور استفاده مي شوند‪ ،‬مقاوم مي‬
‫باشند(‪.)2‬‬
‫درمطالعه ما در بين ‪ 34‬سويه با استفاده از ‪ 7‬ديسك‬
‫آنتي بيوتيك مختلف ‪ 14‬الگوي متفاوت شناسايي شد‪ .‬محدوديت روش‬
‫آنتي بيوگرام به دليل ظهور سويه هاي مقاوم بر عليه آنتي‬
‫بيوتيك هاي مختلف مي باشد‪ .‬با اينحال از مزاياي اين روش انجام‬
‫سريع و سهل بودن آن است واز طرفي با استفاده از آن مي توان‬
‫تمام سويه ها را تايپ نمود‪ .‬از طرف ديگربا استفاده ازتعداد‬
‫بيشتري از آنتي بيوتيكها و همچنين تلفيق اين روش با روشهاي‬
‫ديگر می توان قدرت تفكيك را افزايش داد‪.‬‬
‫منابع‬
‫‪1- Buckwold,F.J.; Ronald,A.R.; Harding,G.K.M. and et al.(1979) Biotyping of‬‬
‫‪Escherichia coli by a simple multiple-inoculation agar plate technique. Journal of Clinical‬‬
‫‪Microbiology, 10, 275-278.‬‬
‫‪2- Cloud,S.S.; Rosenberger,J.K.; Fries,P.A. and et al.(1985) Invitro and invivo‬‬
‫‪characterization of avian Escherichia coli.I. serotypes, metabolic activity and antibiotic‬‬
‫‪sensitivity. Avian diseases 291084-1093.‬‬
‫‪3- Crichton,P.B. and Old,D.C. (1980) Differentiation of strains of Escherichia coli:‬‬
‫‪multiple typing approach. Journal of Clinical Microbiology, 11, 635-640.‬‬
4- David,B.P.; Purushothaman,V.; Venkatesan,R.A.(1991) Comparison of plasmid
profile analysis, antibiogram testing, resistotyping and biotyping in the identification of
Escherichia coli isolates from poultry. Veterinary Record, 129,94-97.
5- Penteado,A.S.; Ugrinovich,L.A. ; Blanco, J. and et al. (2002) Serobiotypes and
virulence genes of Escherichia coli strains isolated from diarrheic and healthy rabbits in
Brazil. Veterinary Microbiology 89, 41-51.
6- Quinn, P.J.; Carter,M.E.; Markey, B.; Carter, G.R. (1994) Clinical Veterinary
Microbiology. Wolfe, London 95-101.
7- Van der Waaij, D.; Speltie,T.M.; Guinee,P.A. and et al. (1975) Serotyping and
biotyping of 160 Escherichia coli strains : Comparative study. Journal of Clinical
Microbiology, 1, 237-238.
Phenotypic characterization of avian Escherichia coli by antibiogram testing
M. Rad*; T. Gholamhosseini Moghadam
Department of photobiology, Faculty of Veterinary Medicine, Ferdosi University
* Corresponding author: mehrnazrad@yahoo.com
Key words: Antibiogram, phenotyping, Escherichia coli strains
Escherichia coli infections are of significant concern to the poultry industry. It is one
of the most important bacterial avian pathogen causing a wide variety of disease
syndrome resulting in serious economic losses to the poultry industry. Many phenotyping
and genotyping methods have been used to type Echerichia coli. Identification of
different Escherichia coli strains give guidance for epidemiological studies of sources of
infection and disease transmission. The epidemiological value of these methods depends
on their discriminatory ability, reliability and ease of performance.
In the present study the antibiogram testing was used to survey Escherichia coli
isolates associated with complicated respiratory disease in poultry in Mashhad, Khorasan.
After identification of isolates as Escherichia coli with biochemical tests, each isolate
was characterized on the basis of antibiotic sensitivity/ resistance pattern in attempt to
better understand one of causative agents involved in colibacillosis and to form a
foundation for further research toward formulaton of new control measures. The
susceptibility/resistance of Escherichia coli isolates was assessed by using the standard
disc diffusion method. Seven antibacterial discs ( Mast diagnostics) were used on
Muller- Hinton agar plates streaked with Escherichia coli culture. After overnight
incubation at 37c, the diameter of each zone was measured and interpreted according to
standard charts.
The results showed that all of the isolates except one were resistant to nalidixic acid,
and oxytetracycline is also has the same result. All isolates were susceptible to
gentamycin. Fourtheen different Patterns (A-N) were identified, indicating a reliability of
41.17 % in differentiating 34 Escherchia coli isolates. Seven groups contained one strain,
three groups contained two strains and another four groups contained 3, 4, 6, and 8
strains.. Increasing the number of antimicrobial used in the test, may enhance the number
of patterns. Due to ease of performance of this method in laboratory, this method can be
used along with other phenotyping and genotyping methods for increasing the
discriminatory ability for identification of different Escherichia coli strains.