Strain Improvement
of Microorganisms
Marlia Singgih Wibowo
Definition of
Strain Improvement
• In the field of agriculture : recovery of
plant’s characters
• In the fileld of microbiology : improve the
microbe’s productivities or characteristics
Purposes of
Strain Improvement
•
•
•
•
Increase productivities
To change unused co-metabolites
To improve the use of carbon and
nitrogen sources
To improve morphology of cells to be a
better cells in order to separate the cells
and its products
General Process
•
•
•
Induction of genetic variation in some cell
population of chosen microorganism
Fermentation Process in lab scale for
some cells
Analysis (assay) to check the
productivity of mutated strain
How to optimize miicrobe’s
productivity?
•
•
•
Optimize environmental condition
Optimize nutrition of microorganism
Genetic Modification : Mutation,
recombination, gene cloning
Optimize environmental
condition
• Modification of physical parameter
(temperature, agitation, etc)
• Modification of chemical parameter
(pH, O2 conc, etc)
• Modification of biological parameter
(co-culture, enzym, etc)
Optimize nutrition of
microorganism
•
•
•
•
•
Carbon source
Nitrogen source
Mineral source and other sources
Precursor
Enzyme
Screening in Industry
Stage
1
2
Process
a.Mutation of wild type
b.Culture on agar
c.Selection of colonies
d.Fermentation
e.Selection of good strain
Amount
a.8 different doses
c.25 of each dose
d.200 strains
e.40 strains
a.Re test of selected strain (5 a.40 x 5 = 200 strains
replication)
b.Selection of best strain
b.8 strain for primary
metabolites, 40 strains for
2nd metabolites
Next screening
MUTAGENESIS
• Mutagenesis is a process of mutation in
strain improvement of microorganism. A
treatment to microorganism will cause an
improvement in their genotipic and
fenotipic performances
• Mutation can be random or direct
Procedure of mutagenesis
• Mutation by : physical, chemical or
combination of physical and chemical
method
• Protoplast Fusion
• Recombination
• Gene Cloning
Physical Mutation
• X-ray
Chromosomal mutation
• UV Radiation (250 – 270 nm)
DNA absorps uv pada 260 nm
Point mutation
Dimerization of thymine
Photo-repair : gain improvement of some
abilities
• Radioisotop
Stages in Physical mutation
•
•
•
•
•
Wild-type of microbes is suspended in medium
Counting number of cells in medium and
concentration of cells is determined for
mutation process
Radiation is conducted in dark area with
certain distance for certain duration.
Exposed colonies are inoculated in growth
medium for several days
Check the growth and select some colonies for
further process
Chemical Mutation
• Base analog : substance that similar to purine or
pirimidine, so transition will occured , example :
5-bromouracyl : substitute C (cytosine) with T
(thymin)
2-aminopurine : substitute A (adenine) with G
(guanine)
• De amine and alkylating agent : transition,
example:
Nitrite (NaNO2) can cause de-amined A and C so
replication of AT will change to GC, or viceversa
EMS (Etil metil Sulfonat), MNNG (Metil-nitro-nitrosoguanidine)
• Intercalation
Dye acridine (proflavine) inserted between
base pair, will cause a frame-shift and will
misread its genetic information
Mutation of Monascus purpureus
using EMS
Albino mutant of Monascus purpureus
stable after 5 generation
PROTOPLAST FUSION
• Protoplast fusion is a general technic to
induce genetic recombination in some
prokariot and eukariotic microorganisms
• Protoplast : whole cell without cell wall
• Fusion has some benefits to improve
productivity of industrial microorganisms, e.g.
Actinomycetes.
• The Method is easy, no transduction phage
needed, plasmid or competention development,
the only things is how to get the stable protoplast
• In protoplast fusion will produce hybrid cells
Method of Protoplast Fusion
• Protoplast is prepared by removing the cell wall
using lytic enzyme in a osmotic solution.
• With the help of PEG (polyetilenglicol) at certain
conc. (fusogenic agent), the fusion can be done
and hybrid cells will produced (diploid)
• During this stage , genome (or chromosom)
from both cells will be fused and mixed . The
genetic recombination will occured
Protoplast Fusion for microorganism
• For prokariot Bacilli and Streptomycetes ,
recombination will occur in a very high frequency
because its chromosomes is free in the
cytoplasm
• For eukariot microorganism, protoplast fusion
should be followed by fusion of nucleus to
obtain the real recombination
• The important step in protoplast fusion is
REGENERATION of the cells after fusion
• Protoplast fusion mostly done for the same
species to obtain the best strain with high
productivity
Exampe of Protoplast Fusion :
Aspergillus terreus
Strain 1
Strain 2
Fusant after fusion
Genetic Engineering
Genetic Engineering
• Rekayasa genetik adalah salah satu cara pembuatan
DNA baru, biasanya melalui rekombinasi DNA dari
organisme yang berbeda dan meproduksi banyak
kopi dari DNA rekombinan tersebut melalui proses
yang disebut KLONING
• Kloning adalah suatu proses dimana suatu urutan
DNA tertentu disisipkan ke dalam suatu vektor
(berupa plasmid atau kromosom faga) dan
selanjutnya direplikasi sebanyak mungkin. Replikasi
terjadi di dalam suatu inang (host) yang
memungkinkan replikasi itu terjadi
Prinsip mutasi dengan
rekayasa genetik
• Informasi genetik yang dituju, diisolasi dari
organisme donor dan dipotong menjadi bagian
tunggal menggunakan enzim restriksi
• Potongan ini digabungkan di dalam suatu DNA
pembawa (vektor) dan selanjutnya bersama
vektor tersebut ditransfer ke dalam suatu sel
inang (host)
• Sel inang akan bereplikasi dan mensekresi
metabolit yang sesuai dengan informasi genetik
yang ditransfer sebelumnya.
Syarat untuk vektor
•
•
•
Memiliki Selectable markers
(penanda selektif)
Memiliki Restriction sites
(situs restriksi)
Berat molekul serendah mungkin
Plasmid
• Plasmid adalah suatu molekul DNA sirkular
(BM 106 – 2 x 108) dari bakteri, yang
membawa 1-3% genom sel dan mengkode
suatu sifat genetik penting yang tidak dikode
secara normal oleh kromosom bakteri
tersebut
• Sifat yang banyak digunakan : resistensi
antibiotik, produksi antibiotik, degradasi
senyawa aromatik, dll.
Faga (bakteriofaga)
• suatu sub-kelompok virus yang menginfeksi
bakteri dengan cara menyisipkan asam
nukleat nya ke dalam bakteri host nya.
• Faga terkecil hanya mengandung 3 gen
pengkode ss RNA
• T4, suatu faga bakteri yang mengandung lebih
kurang 60 gen pengkode ds genom DNA faga
tersebut
Cosmid
• Cosmid adalah partikel sintetik yang dapat bereplikasi
sendiri
• Berasal dari plasmid yang mengandung fragmen
lambda-DNA (DNA-λ) yang mengkode urutan cos site
(situs pengenalan) untuk sistem λ yang akan
membentuk struktur sirkular.
• DNA λ faga ini bereplikasi melalui suatu mekanisme
khusus yaitu rolling circle yang yang selanjutnya
membentuk struktur concatemer (berulang secara linear)
setelah disisipkan DNA asing.
• Bentuk linear ini merupakan substrat untuk reaksi
packaging secara in-vitro membentuk partikel.
Selanjutnya partikel tersebut digunakan untuk
menginfeksi sel inang, dan bentuk linear cosmid akan
membentuk sirkular kembali pada sisi cos site
Prinsip kloning gen menggunakan
plasmid E.coli pBR 322
Plasmid yang mengandung gen resistensi
thp ampisilin dan tetrasiklin dipotong pada
sisi tetrasiklin dengan enzim restriksi
DNA asing di sisipkan pada plasmid dengan
enzim ligase
Plasmid yang telah mengandung DNA
asing tsb ditransfer ke dalam sel bakteri
Pembiakan
Seleksi sel yang hanya
mengandung gen
resistensi ampisilin
dan DNA asing
Jenis Mutan
•
•
•
•
•
Mutan Aukosotrof (Auxotrophic mutan)
Mutan Resisten (Resistant)
Mutan yang sensitif terhadap temperatur
Mutan Konstitutif katabolik
Mutan Konstitutif anabolik
• Mutan aukosotrof adalah mutan yang tidak dapat
mensintesis suatu molekul organik yang sebenarnya
sangat diperlukan untuk salah satu jalur biosintesis
metabolit nya. Misalnya : nitrat, antibiotik
• Mutan resisten adalah mutan dari organisme yang
sebelumnya sensitif terhadap suatu senyawa
• Mutan yang sensitif terhadap temperatur
adalah mutan dari oraganisme yang semula tidak sensitif
terhadap temperatur
• Mutan yang memiliki enzim konstitutif
katabolik : antiinduksi, limiting factor, dll.
• Mutan yang memiliki enzim konstitutif
anabolik : antimetabolit