一个新的技术,发现一个新的世界 NanoDLSay™: 纳米金粒子结合动态 光散射用于化学和生物的检测和分析 July 2012 Copyright Nano Discovery Inc. 2012 www.nanodiscoveryinc.com Tel: 407-770-8954 Email: sales@nanodiscoveryinc.com Part I. 介绍 Part II. NanoDLSay™ 用于蛋白质检测与分析 Part III. NanoDLSay™ 与其他分析技术的比较 Part IV. NDS1200 – 基于 NanoDLSay™技术开发的设备 Part I. 介绍 o NanoDLSay™原理 o 怎样进行 NanoDLSay™ o 应用和案例 o 分析性能和优势 什么是 NanoDLSay™: 通过检测与目标分析物结合的金纳 米离子粒径的变化来检测目标分析物 金纳米粒子 (AuNP) Y Y D = 100 nm D » 120 nm D » 130-160 nm 未修饰的金纳米 粒子 AuNP 金纳米粒子免疫探针 金纳米粒子免疫探针结合 一个小分子单体蛋白 Y D > 130-160 nm 金纳米粒子免疫探针结合 一个大分子复合蛋白 2+ D >> 100-200 nm 2+ 2+ 2+ 金纳米粒子探针通过金属螯合配体 与金属离子目标物结合 一般检测模式:通过结合目标 分析物形成金纳米粒子聚集 D >> 100 nm 金纳米粒子探针通过协调配体的相互作用 与小分子化学物质结合 两种检测模式 I. 个别粒子粒径大小增加 Y •适合于大分子如:蛋白、复合物和病毒 •适用于动力学结合研究 Y Y II. 纳米金粒子聚合物形成 Y Y •适用于任何物质,尤其是化学 物质和离子 •提供最好的灵敏度 什么是动态光散射 (DLS): 测量纳米范围的粒径尺寸 散射光 激光束 散射光强度的动态波动 相关函数 NDS1200 Instrument 金纳米粒子特性 (AuNPs) • • • • • 特别强的光散射特性 比荧光染料分子强105; 比聚苯乙烯(PS)乳胶颗粒强100倍 检测限很容易达到fM—aM范围 作为一个光学探针,金纳米粒子很容易从样品基质中脱颖而出 B A C PS particle Serum AuNPs Gold nanorods AuNPs A:金纳米粒子与血清的暗场光学图像 B:金纳米粒子与聚苯乙烯粒子的暗场光学图像 C:金纳米棒的暗场光学图像 怎样进行 NanoDLSay™? • 步骤1. 准备金纳米粒子探针 • 步骤 2. 把金纳米粒子探针与样品溶液混合 • 步骤 3. 孵育待检测样品溶液 • 步骤 4. 测量待检测样品溶液的粒径大小 一个典型的实验条件: 1.把40 µL 纳米金粒子探针和 2 µL 样品溶液混合 2.在室温下孵育5-15分钟 3.分析粒径大小得到结果 读出读数: 平均粒径大小 (nm) 平均粒径大小 (nm) 剂量-反应曲线 未知样品 标准曲线 目标物浓度 金纳米粒子的生物共价制备 很容易使用,但是稳定性低;首要选择 1. 直接吸附法 ~15 min 柠檬酸金纳米粒子 (100 nm) (Ted Pella Inc.) (1 mL AuNP + 5-10 µg 抗体) 2. 共价结合法 ~30 min 阻断剂: 牛血清蛋白 (BSA) (2.5 mg/mL) 1. 离心 2. 再分散 复杂但稳定性高 NHS/EDC activation -NH2 or -COOH 功能配体涂层的金纳米粒子 1. 离心 2. 再分散 蛋白质 病毒 NanoDLSay™ 应用 小分子 化合物 DNAs RNAs 有毒 重金属粒子 案例 Liu X, et al. A One-step homogeneous immunoassay for cancer biomarker detection using gold nanoparticle probes coupled with dynamic light scattering. J. Am. Chem. Soc. 2008; 130:2780-2782. Chun C, et al. A facile and sensitive immunoassay for the detection of alphafetoprotein using gold-coated magnetic nanoparticle clusters and dynamic light scattering. Chem. Comm. 2011, 47, 11047-11049. Kalluri JR, et al. Use of gold nanoparticles in a simple colorimetric and ultrasensitive dynamic light scattering assay: selective detection of arsenic in groundwater. Angew. Chem. Int. Ed. 2009; 48:9668-9671. Gao D, et al. An ultrasensitive method for the detection of gene fragment from transgenics using label-free gold nanoparticle probe and dynamic light scattering. Anal. Chim Acta 2011; 696:1-5. Driskell JD, et al. One-step assay for detecting influenza virus using dynamic light scattering and gold nanoparticles. Analyst 2011; 136:3083-3090. Wang X, et al. Detection of hepatitis B surface antigen by target-induced aggregation monitored by dynamic light scattering. Anal. Biochem. 2012, online. 需要更多文献,请访问: www.nanodiscoveryinc.com Analytical Performance 待测物 灵敏度 动态范围 蛋白质 范围:从ng/mL到 pg/mL 2-3个数量级 DNAs 30 fM (比SPR和5荧光技术更灵敏5个数量级) >5个数量级 病毒 (流感病毒) < 100 TCID50/mL (比商业诊断试剂盒更灵敏1-2 数量级) 2-3个数量级 有毒金属离子 (铅和砷) 砷: 10 ppt (WHO 可接受的极限: 10 ppb) 铅: 100 ppt (比EPA标准限值低2个数量级) 2-3个数量级 小分子 (腺苷) 7 nM (比比色法更灵敏5个数量级) > 4 个数量级 爆炸物 (TNT) 100 pM 2-3个数量级 Notes: (1) ng-纳克; fg-飞克; fM-飞摩; pM-皮摩; nM-纳摩; ppb-十亿分之一; ppt-万亿分之一; TCID50- 50% 半数组织培养感染剂量 . (2)所有数据均取自发表论文。参考出版物的详细信息列表. (3) WHO: 世界 卫生组织; EPA: 环保局. Analytical Performance NanoDLSay™和其他方法检测DNA的比较 标记 方法 检测限 金纳米粒子 比色法 1 × 10-8 mol/L 金芯片 表面等离子体共振 1 × 10-9 mol/L 金/聚苯胺纳米管 电化学阻抗谱 3 × 10-13 mol/L 量子点 阳极溶出伏安法 5 × 10-11 mol/L ZnS and CdSe 量子点 荧光法 2 × 10-9 mol/L NanoDLSay™ 动态光散色法 3 × 10-14 mol/L Ref: Gao D, Sheng Z, Han H. An ultrasensitive method for the detection of gene fragment from transgenics using label-free gold nanoparticle probe and dynamic light scattering. Anal. Chim Acta 2011; 696:1-5. NanoDLSay™:超高灵敏度 金纳米粒子与病毒 大小 100 nm ~300 nm 散射光强度比 1 ~1000‡ 数量比(摩尔) 99.9% (10 pM) 0.1% (10 fM) 纯散射光强度 1 1 强度-平均粒径 ½ * 100 nm + ½ * 300 nm = 200 nm ‡:根据Mie散射理论计算 从上图可以看出, that with a trace amount of AuNP cluster formation due to target analyte binding, the intensity-averaged particle size increases substantially - The origin of high sensitivity of NanoDLSay™ NanoDLSay™优点 o 只需要微量样品 (1-5 µL) o 几分钟就可以得到结果 o 单步检测程序 o 非常简单和容易操作 o 超高灵敏度 o 重复性好 o 检测成本非常低 Part II. NanoDLSay™ 用于蛋白研究 o 介绍 o 蛋白检测和浓度分析 o 蛋白间相互作用的动力学研究 o 无标记的复合蛋白检测和分析 o 无标记的低聚/高聚蛋白的检测和分析 介绍: 了解传统免疫分析方法的问题 在生物系统里,蛋白质不是单个存在的 蛋白单体 A 复合蛋白 antibody 聚合蛋白 B X 传统免疫分析方法假设蛋白是单 独存在为前提的 传统的免疫分析方法无法检测 复合蛋白 NanoDLSay™: 可以检测以多种形式存在的蛋白 3 平均粒径大小 (nm) 独一无二的能力 2 1 = 2D of analyte 0 min 孵育时间 (min) 30 min 动力学结合研究: 在检测过程 中监控粒子大小持续变化 检测目标分析物的粒径大小 检测目标蛋白是否是单体、 复合物还是多聚物 无标记检测:不需要对目标 蛋白进行标记 在真实的生物样品中检测复 合蛋白和聚合蛋白 1. 蛋白检测和浓度分析 剂量-反应曲线 Y 平均粒径大小 (nm) Y • 单一单克隆抗体探针法 Y Y Y 未知样品 标准曲线 目标蛋白浓度 Y Y • 双探针法或单一多克隆抗体探针法 (更高的灵敏度) Y o 标准曲线是用标准溶液建立的 o 相对定量可以通过直接比较平 均粒径大小来实现 2. 蛋白质相互作用的动力学研究 Alternative: 目标蛋白 A 平均粒径大小 (nm) 目标蛋白 B 步骤: 1、把目标蛋白A修饰在金纳米粒子上 2、把目标蛋白A修饰的金纳米粒子和 目标蛋白B混合 3、监测金纳米粒子的大小变化 4、蛋白结合亲和力可以用Langmuir吸 附模型估计 无结合蛋白 0 孵育时间 (min) 30 3. 无标记复合蛋白的检测和结合蛋白的分析 Step 2: 结合蛋白可以 平均粒径大小 (nm) 通过抗体来筛选 Step 1: 俘获 目标蛋白 结合蛋白 c ~ 2D 没有被结合的蛋白 孵育时间 (min) • 步骤1. 检测目标蛋白是否以复合蛋白的形式存在 (金纳米粒子粒径的变化可以告诉人们目标蛋白究竟有多大) • 步骤 2.通过抗体筛选来分析结合在目标蛋白上的蛋白 4. 无标记的低聚/多聚蛋白的检测和分析 蛋白单体 • Specific detection of target protein oligomer/aggregates in real samples Average particle size increase (nm) • Protein oligomer/aggregates cause AuNP probe cluster formation 低聚蛋白 多聚蛋白 = 2D of analyte 0 min Incubation time (min) 30 min 文献 蛋白-蛋白或其他生物分子间相互作用 Jans H, et al. Dynamic light scattering as a powerful tool for gold nanoparticle bioconjugation and biomolecular binding study. Anal. Chem. 2009; 81: 9425-9432. Austin L, et al. An immunoassay for monoclonal antibody isotyping and quality analysis using gold nanoparticles and dynamic light scattering. American Biotechnology Laboratory 2010; 28: 8, 10-12. Sánchez-Pomales G, et al. A lectin-based gold nanoparticle assay for proving glycosylation of glycoproteins. Biotechnology Bioengineering 2012, published online. Wang, X.; Ramström, O.; Yan, M. Dynamic light scattering as an efficient tool to study glyconanoparticle-lectin interactions. Analyst 2011, 136, 4174-4178. 无标记复合蛋白和结合物的检测和分析 Jaganathan S, et al. A functional nuclear epidermal growth factor receptor, Src and Stat3 heteromeric complex in pancreatic cancer cells. PLoS One 2011, 6(5):e19605. 无标记低聚合/多聚合蛋白的检测 Bogdanovic J, et al. A label-free nanoparticle aggregation assay for protein complex/aggregate detection and analysis. Anal. Biochem. 2010; 45:96-102. Huo Q. Protein complexes/aggregates as potential cancer biomarkers revealed by a nanoparticle aggregation assay. Colloids Surfaces B 2010; 78:259-265. Part III. NanoDLSay™ 和其他分析技术的比较 o ELISA (酶联免疫吸附试验) o 表面等离子共振 o 免疫共沉淀/免疫印迹 o SEC体积排阻色谱 o 超速离心分析 (AU) o 使用金纳米粒子探针的比色法 1. NanoDLSay™ VS ELISA Sandwich ELISA o 可能无法检测复合蛋白质 o 需2-3个小时取得成果 o 多个步骤 – 大量的劳动 o 比较大的样本量(10-100s 微升) NanoDLSay™ o 可以检测以任何形式存在的目标蛋白 o 揭示更准确的生物信息 o 揭示蛋白质复合状态 o 在几分钟内获得结果 o 单步流程 o 低样本量(1-5 微升) 2. NanoDLSay™ VS 表面等离子共振 (SPR) SPR NanoDLSay™ o 无标记技术 o 无标记技术 o 光学基质:金纳米粒子 o 光学底物:黄金薄膜 o 读出:金纳米粒子大小的变化 o 读出:折射率变化 o 均相溶液测定 o 异构芯片检测 o 耗材成本低 o 耗材成本高 o 揭示的目标分析物的大小信息,区分蛋白 质复合物和低聚物/单体复合物 o 不能揭示目标分析物的大小信息, 不能判断一种蛋白质是单体的,复 杂的或低聚物 3. NanoDLSay™ VS 免疫共沉淀/免疫印迹 非特异性的相互作用 CO-IP法存在的问题: o分离过程中导致显著的非特异性相互作用 o在离心过程中,粒子探针和蛋白质的浓度 被人为地增大,导致非特异性相互作用加大 NanoDLSay™不存在这个问题: o金纳米粒子探针浓度相对较低, 减少非特异性相互作用 o无离心分离这个步骤 4. NanoDLSay™ vs SEC、AU SEC 和 AU: o仅适用于纯蛋白溶液研究 oSEC低估了复合蛋白或低聚/高聚蛋白的浓度 o(淋洗液稀释会破坏现有的复合物/低聚物) oAU 高估了复合蛋白或低聚/高聚蛋白的浓度 o(离心人为地增加蛋白质复合物/低聚物 ) NanoDLSay™: o从真实的样品中检测复合蛋白、低聚/高聚蛋白 o快速检测复合蛋白、低聚/高聚蛋白 o不适合各种低聚物的绝对定量分析 5. NanoDLSay™ vs 比色法 Y Y Y Y 颜色变化 Before assay 目标分析物结合金纳米粒子 Target analyte binding-induced AuNP cluster formation causes SPR band shift of AuNPs to longer wavelength - 颜色变化 比色法 吸光度 (A.U.) o容易操作 o需要或者不需要仪器 After assay o灵敏度低 o不能揭示分子大小信息 400 500 600 波长(nm) 700 800 o不适合有颜色的样品 (如:血液) Product & Services Part IV. NDS1200: 一个新的动态光散色仪专门设计用于 NanoDLSay™ • • • • • • • • • • 自动测量12个样品 自动动力学研究12个样本 检测速度快:10-20s每个样品 测量所需检测溶液40µL 成本低,一次性带盖玻璃试管被用作为样 品容器。 没有交叉污染样品 高通量分析能力:120 - 180样品/小时 硬件无需维护 仪器无需特殊的环境 非常容易使用的软件 Product & Services NanoDLSay™ 软件: 一款用于方便、灵活和 高通量分析的软件 Order Information 产品和订购信息 NDS1200 用于进行NanoDLSay™的动态光散色仪 NDS-Kit1000 包括一次性的样品细胞及其他消耗品的检测试剂盒 请联系我们进行报价: 3251 Progress Drive Suite A1 Orlando, FL 32826 Phone: 407-770-8954 Email: sales@nanodiscoveryinc.com 广州蔚林生物科技有限公司 地址:广州市海珠区敦和路189号 海珠区科技园3号楼202-203 http://www.gzwilling.com Or visit online: www. nanodiscoveryinc.com TEL: 020-89225173 FAX: 020-89225797 Notes oPatent application pending on NanoDLSay™ technology and NDS1200 system: PCT/US09/030087 and PCT/US11/21002 oNano Discovery Inc. has the exclusive license in the world to practice and commercialize NanoDLSay™ technology