Kuliah 14
UJI POTENSI ANTIMIKROBA
FARMASI – UHAMKA
2013
Priyo Wahyudi
UJI POTENSI ANTIMIKROBA
• Metode Difusi Agar
• Metode Dilusi
Mengapa Antimikroba perlu
ditentukan Potensinya ?
• Penggunaan antimikroba yg meningkat kadarnya,
menyebabkan meningkat pula resistensi berbagai
mikroba patogen terhadapnya
• Efektivitas antimikroba sangat tergantung pada kadar
dan kekuatan zat aktifnya
• Kadar  jumlah per satuan berat/volume
• Potensi  ukuran kekuatan atau daya bunuh zat aktif
terhadap mikroba
• Respons mikroba thd antimikroba berbeda-beda,
umumnya bersifat SPESIFIK dan SENSITIF
Prinsip Uji Potensi Antimikroba
(berdasar FI IV 1995)
• Estimasi potensi antibiotik melalui perbandingan
langsung antara sampel (antibiotik uji) dengan
antibiotik standar yang telah disahkan
penggunaannya, terkalibrasi dengan baik dan umum
digunakan sebagai rujukan
• Tujuan: sebagai standar utk mengatasi keraguan
tentang kemungkinan hilangnya aktivitas (potensi)
antibiotik terhadap mikroba
Potensi Antimikroba
• Potensi Antimikroba adalah kekuatan suatu
antibiotika dalam menghambat atau membunuh
pertumbuhan mikroba. Satuannya dalam IU/mg
(iu=international unit) atau µg/mg
• Penetapan potensi antibiotika secara mikrobiologi
merupakan metode penetapan pada sistem hayati
(mikroorganisme)
• Dilakukan pada :
– HILIR : Pemantauan Potensi Antibiotik terhadap mikroba
Uji / Terjadinya Resistensi antibiotik pada mikroba
– HULU : Penemuan zat aktif antibiotik baru
Potensi Antimikroba
• Prinsip : membandingkan respon mikroba uji yang
peka terhadap percobaan dalam kondisi yang sama
terhadap zat baku pembanding (standar) atau zat uji
• Baku standar : zat/senyawa yg sudah diketahui
kemurnian dan kekuatan / potensinya
• Mikroba yang digunakan adalah mikroorganisme
yang diketahui kemurnian dan susceptibilitasnya
Potensi Antimikroba
• Cara analisis :
– Metode difusi agar (lempeng)
– Metode dilusi (Turbidimetri)
• Respon yang diamati :
– Efek hambatan terhadap pertumbuhan mikroba uji yang
ditentukan oleh daerah bening (inhibition zone) di
sekeliling zat uji (cara difusi)
– Kekeruhan (turbiditas) yg ditimbulkan oleh pertumbuhan
mikroba dalam medium cair (cara turbidimetri)
menggunakan tabung reaksi dan spektrofotometer
METODE DIFUSI AGAR &
TURBIDIMETRI
1. DIFUSI AGAR
• Prinsip : zat antimikroba yang akan diuji berdifusi
dari reservoir ke dalam medium agar yg telah
diinokulasi dengan mikroba uji.
• Inkubasi selama waktu tertentu, kemudian diamati
adanya hambatan pertumbuhan mikroba uji dan
diukur diameter hambatannya
• Diameter hambatan yang terbentuk dibandingkan
dengan diameter baku standar
2. CARA TURBIDIMETRI
• Digunakan media cair, hambatan pertumbuhan
mikroba uji diukur dengan menentukan kekeruhan
(turbiditas) larutan dengan spektrofotometer
Bahan untuk Uji Potensi Antimikroba
Bahan-bahan yang diperlukan dalam uji potensi
antibiotik:
• Mikroba uji
• Baku pembanding biologis
• Media pertumbuhan
• Larutan dapar (penyangga)
Mikroba / Inokula Uji
• Mikroba uji harus berasal dari galur murni, dapat
memberikan respon yg bertingkat antara
peningkatan konsentrasi dgn peningkatan daerah
hambatannya.
• Mikroba uji utk jenis antibiotik tertera pada Tabel FI
IV, dipelihara pada agar miring dan diremajakan
setiap minggu
• Untuk cara difusi, daerah hambatan yg terbentuk
harus jelas dan mudah diukur.
• Untuk penetapan cara tabung, perbedaan kekeruhan
pada tingkat dosis tertentu harus terlihat jelas
Penyiapan Inokula
• Inokula diperbanyak dalam media cair, inkubasi
dilakukan selama 24 jam hingga transmitan suspensi
inokula 25% blanko
• Ukuran inokula juga dapat dinyatakan sesuai dengan
prosedur uji potensi antibiotika untuk jenis bakteri
tertentu berdasar skala McFarland
• Skala McFarland adalah standard yang digunakan
sebagai referensi utk menentukan kekeruhan
suspensi inokula uji, sehingga jumlah inokula sesuai
dengan kisaran yang dipersyaratkan
Skala McFarland
• Standard McFarland awalnya dibuat dengan
mencampurkan jumlah tertentu BaCl dengan H2SO4.
campuran keduanya akan menyebentuk barium sulfat
yang tersuspensi, sehingga menyebabkan kekeruhan
• Saat ini standard McFarland dibuat dari suspensi
partikel latex yg lebih awet dan stabil.
• Standard diperbandingkan secara visual dengan
suspensi inokula yang ditumbuhkan pada nutrient
broth. Jika suspensi inokula terlalu keruh, maka
dilakukan penambahan larutan media. Jika suspensi
inokula kurang keruh, maka dapat ditambahkan
suspensi bakteri
Skala McFarland
McFarland Standard No.
0.5
1
2
3
4
1.0% Barium chloride (ml)
0.05
0.1
0.2
0.3
0.4
1.0% Sulfuric acid (ml)
9.95
9.9
9.8
9.7
9.6
Approx. cell density (1X10^8 CFU/mL)
1.5
3.0
6.0
9.0
12.0
% Transmittance*
Absorbance*
74.3
0.132
55.6
0.257
35.6
0.451
26.4
0.582
21.5
0.669
Panjang gelombang 600 nm
MacFarland 0.5 & Suspensi Inokula
18
Baku Pembanding (Biological Reference)
• Baku pembanding (biological reference) ;
Digunakan antibiotik yg telah diketahui kemurnian dan
potensinya secara pasti. Baku pembanding ini
direkomendasikan oleh WHO dan di Indonesia seperti BPOM,
SPI, SPN, SBL (S=standar, B=baku, P=pembanding, L=lab,
I=intern)
Media Pertumbuhan
Media yang digunakan harus mendukung pertumbuhan
mikroba uji dgn baik, tidak boleh mengandung zat yg
bersifat antagonis ataupun yg mempengaruhi aktivitas
antimikroba dari antibiotik yg diperiksa
Larutan Dapar
Digunakan untuk melarutkan antibiotik yang akan
diperiksa baik baku pembanding maupun sampel uji.
Pemilihan larutan dapar yang digunakan disesuaikan
dengan sifat dan stabilitas bahan yabg akan diuji.
Metode difusi agar
• Metode analisis potensi antibiotik secara difusi agar merupakan cara
yang sederhana dan hasil yg diperoleh cukup teliti.
• Cara ini mrp cara terpilih dan direkomendasikan oleh International
Collabotrative Study di Swedia dan FDA di AS untuk pengujian mutu
antibiotik
• Prinsip penetapannya yaitu mengukur luas hambatan pertumbuhan
mikroba uji yg disebabkan oleh zat baku standar dan zat yg di uji
• Dlm range konsentrasi tt terdapat hub yg linear antara peningkatan
konsentarsi dgn luas daerah hambatan pertumbuhan mikroba uji
Faktor yang mempengaruhi luas daerah
hambatan dengan cara difusi agar
•
•
•
•
•
•
•
Ingredien / komposisi medium pertumbuhan
Pemilihan medium pertumbuhan
Pengaruh pH
Ukuran inokulum
Stabilitas mikroba uji
Aktivitas antibiotika
Waktu inkubasi
Ingredien medium pertumbuhan
• Komposisi ingredien yg umum tdp pada komposisi
pertumbuhan mo adalh ; pepton, tripton, ekstrak
ragi, agar, dan mineral (Ca, Mg, Fe, NaCl, KH)
• NaCl mengurangi aktivitas antibiotik gol
aminoglikosida dan menahan aktivitas ferosidin
• KH pada uji difusi dapat mempertinggi aktivitas
nitrofurantoin atau ampisilin
Pemilihan medium
• Diperlukan persiapan medium yg cocok bagi
pertumbuhan mo demikian pula ketebalan dan
konstituen harus merata pada medium agar
• Pengaruh pH terhadap luas daerah hambatan
disebabkan oleh aktivitas antibiotik yg tergantung
pada pH medium. Misalnya aktivitas aminoglikosida
diperkuat dalam suasana asam sedangkan tetrasiklin
dalam suasana basa
• Jika dalam melarutkan media ; pH yg tinggi
diturunkan dgn menambahkan HCl 0,1N, pH yg
rendah dinaikkan dgn penambahan NaOH 0,1N
Ukuran inokulum
• Inokulum adalah campuran antara suspensi dan
media.
• Luas daerah hambatan akan semakin kecil jika
inokulum semakin besar kandungan
mikroorganismenya.
• Suatu inokulum dikatakan ideal apabila kandungan
mikroorganismenya homogen, misal 1-10%
• Apabila pertumbuhan yg rapat, dapat menyebabkan
terjadinya penumpukan pada tempat tt
Stabilitas mikroba uji
Resistensi mikroba uji terhadap suatu antibiotik dapat
terjadi dalam kondisi pertumbuhan tertentu. Oleh
sebab itu regenerasi mikroba perlu dilakukan secara
periodik dan sewaktu-waktu diuji kemurnian dan
kepekaannya.
Aktivitas antibiotik
Untuk mendapatkan daerah hambatan yang baik pada
suatu penetapan, terlebih dahulu perlu ditentukan
kadar hambat minimum (KHM) dari antibiotik yang
diuji. Pengaruh predifusi larutan antibiotik yangg terjadi
sebelum inkubasi harus dihilangkan atau dikurangi
dengan cara pengisian larutan antibiotik ke dalam
medium agar
Waktu Inkubasi
Inkubasi inokulum dilakukan dalam waktu yang
optimal, sehingga keseimbangan antara aktivitas
antibiotik dengan daya tumbuh mikroba dapat
menghasilkan daerah hambatan yang baik untuk
pengukuran zona bening yang muncul sebagai daerah
penghambatan pertumbuhan mikroba, biasanya antara
18-24 jam
Reservoir
• Resevoir pada Teknik difusi agar dapat berupa:
– Silinder gelas / logam
– Cakram kertas (paper disc)
– Cetak lobang (punched holes)
• Cakram : tempat meletakkan sampel antimikroba
yang akan diuji potensinya pada medium agar yang
telah memadat
Uji Difusi Agar
The standard procedure that assesses antimicrobial activity
is called the Kirby–Bauer method (Figure 24.8).
• Agar media are inoculated by evenly spreading a
defined density of a suspension of the pure
culture on the agar surface. Filter paper disks
containing a defined quantity of the antimicrobial
agents are then placed on the inoculated agar.
• After a specified period of incubation, the
diameter of the inhibition zone around each disk
is measured. Table 24.4 presents zone sizes for
several antibiotics.
• Antibiograms are periodic reports that
indicate the susceptibility of clinically isolated
organisms to the antibiotics in current local
use.
Prepare inoculum
suspension
Select colonies
Mix well
Standardize inoculum
suspension
Swab plate
Remove sample
Incubate overnight
Add disks
Measure Zones
Transmitted Light
Reflected Light
Tube dilution tests
•
•
•
A series of culture tubes are prepared, each containing a
liquid medium and a different concentration of a
chemotherapeutic agent. The tubes are then inoculated with
the test organism and incubated for 16-20 hours at 35C.
After incubation, the tubes are examined for turbidity
(growth).
Minimum Inhibitory Concentration (MIC): Is the lowest
concentration of chemotherapeutic agent capable of
preventing growth of the test organism.
Minimum Bactericidal Concentration (MBC): Is the lowest
concentration of the chemotherapeutic agent that results in
no growth (turbidity) of the subcultures.
MIC
• Minimal inhibitory concentration
• The lowest concentration of antimicrobial
agent that inhibits the growth of a bacterium
• Interpret:
– Susceptible
– Intermediate
– Resistant
Penentuan Konsentrasi Hambat
Minimal (KHM) Antimikroba
• Metode Dilusi Cair
• Medium cair ditambahkan zat antimikroba dengan
konsentrasi separuhnya (2 fold serially diluted
antibiotic solutions) yang diinokulasi mikroba uji
• Setelah inkubasi, KHM diperoleh dari medium
pertama yg menunjukkan terjadinya penghambatan
pertumbuhan mikroba uji
• Mikroba yang resistan, akan mempunyai KHM tinggi
•
•
If the bacteria removed from the drug can grow on drug free
medium at highest concentrations, the drug is known to have
bacteristatic action
If the bacteria removed from the drug can not grow on drug
free medium at most concentrations, the drug is known to have
bactericidal action. One tube difference is allowed in this test
Prepare inoculum
suspension
Microdilution MIC tray
Dilute & mix inoculum suspension
Pour inoculum into
reservoir and
inoculate MIC tray
Incubate overnight
Inoculate
purity plate
Read MICs
Examining purity plate
Reflected light
Transmitted light
Optimal Use of Purity Plates
• Sub final test suspension to non-selective
medium (after inoculating MIC test)
• Streak for isolation (avoid several specimens
per plate - may not reveal contaminants if no
isolated colonies)
• Examine before reading MIC (usually at 16-20
h)
• Re-incubate if antibiogram questionable
Microbroth Dilution Method
–
Microdilution plates:
• “Microdilution/ Microbroth
dilutions”
• 96 wells/ plate: simultaneously
performed with many tests
organisms/ specimens, less
reagent required
0.5
1
2
- +
4
8
16
32
64
>64
>64
Epsilo-meter test
• It’s a new technique for direct detection of MIC, a
graduated increasing concentration of the antibiotic
is fixed along a rectangular plastic test strip which is
applied to the surface of an inoculated agar plate,
after over night incubation a tear drop shaped
inhibition zone is seen.
• The zone edge intersect the graded test strip at the
MIC of the antimicrobial.
E Test
E Test
S. pneumoniae
Penicillin MIC = 3 g/ml
Uji Antifungi Filamentous
• Teknik Gores Silang
Cawan Petri
Goresan silang
Fungi Uji
Kertas filter
mengandung
antibiotik uji
Zona hambat
pertumbuhan fungi
Koloni
Fungi
Uji