นางสาวดรุณร ัตน์ แก้วมูล ึ ษา 51312305 รห ัสน ักศก สถานทีท ่ างาน โรงพยาบาลศริ ริ าช ภาควิชานิตเิ วช สาขาวิชานิตพ ิ ษ ิ วิทยา ตาแหน่ง ผูป ้ ฏิบ ัติงานวิทยาศาสตร์การแพทย์ อาจารย์ทป ี่ รึกษา ั ศุภล ักษณ์นารี อาจารย์ ดร. ศุภชย Long-term stability of various drugs and metabolites in urine, and preventive measures against their decomposition with special attention to filtration sterilization. ความคงต ัวระยะยาวและMetabolite ของยาในปัสสาวะและมาตรการป้องก ัน ไม่ให้ยาเกิดการสลายต ัวโดยเฉพาะด้วย ื้ การกรองแบบปราศจากเชอ Author • Kei Zaitsu • Akihiro Miki • Munehiro Katagi • Hitoshi Tsuchihashi ปั ญหาในการตรวจวิเคราะห์ยาและสารเสพติดในสงิ่ สง่ ตรวจประเภท ปั สสาวะ ื่ มสภาพของปั สสาวะ - การปนเปื้ อนแบคทีเรียและการเสอ - วิธก ี ารเก็บรักษาสภาพสงิ่ สง่ ตรวจประเภทปั สสาวะ - การสลายตัวของยาและสารเสพติดในปั สสาวะ การพัฒนาวิธก ี ารเก็บสงิ่ สง่ ตรวจประเภทปั สสาวะเพือ ่ ตรวจวิเคราะห์ ยาและสารเสพติด - Aseptic Collection Kit - การเติม Sodium azide (สารกันบูด) - อุณหภูม ิ ความเป็นมา ี หาย ผูต ้ อ ้ งหา/ผูเ้ สย ิ ธ์รอ มีสท ้ งขอให้ม ี การตรวจวิเคราะห์ซา้ การตรวจวิเคราะห์ซา้ ครงแรก ั้ = ครงหล ั้ ัง ื่ ถือ ผลการตรวจวิเคราะห์นา ่ เชอ การตรวจวิเคราะห์ซา้ ครงแรก ั้ = ครงหล ั้ ัง ื่ ถือ ผลการตรวจวิเคราะห์ไม่นา ่ เชอ Forensic Urine sample Unknown Drug / Concentration Contaminate More/Less Infection/natural Collect Non aseptic Transport Expose to ambient temperature Expose to ambient temperature Effect bacteria ผลการตรวจ ครงแรก ั้ = ครงหล ั้ ัง การตรวจวิเคราะห์ซา้ ครงแรก ั้ = ครงหล ั้ ัง ื่ ถือ ผลการตรวจวิเคราะห์ไม่นา ่ เชอ Critical Cut off 1 1 ng / ml 2 Drug • • • • • • • Methamphetamine (MA) Cocaine (COC) Estazolam (EZ) 6-acetylmorphine (6AM) 7-aminoflunitrazepam (7AF) Amphetamine (AP) Nitrazepam (NZ) Drug MA COC EZ detected in urine unchanged forms Drug AP 6AM and 7AF metabolites of grate forensic proof of intake of their parent drugs Drug NZ readily decomposed by bacteria indicator of bacteria propagation Drug COC and 6AM common ester-type drug และ metabolite ทีจ ่ ะ hydrolyzed ได้ Shimadzu LCMS-QP2010 HPLC quadrupole mass spectrometer Experimental เก็บปัสสาวะจากอาสาสมัคร 24 คน ชาย =12 หญิง =12 (18 – 58 ปี ) ตรวจนับจานวน bacteria Standard Methods of Analysis in Health Scienc Sample ชาย 27 ปี 1900 cell ปนเปื้ อนน้ อย หญิง 29 ปี 10,000,000 cell ปนเปื้ อนรุนแรง Sample ความเข้มข้น 500 ng/mL Sample กรอ งNaN3 MA AP - NZ - EZ - 7AF - COC - 6AM 6 เดือน 0.5 wt% กรอง+NaN3 ไม่ใส่ เฉพาะ EZ, NZ และ 7AFเก็บไว ้ในทีม ่ ด ื ื้ ชุดกรองปัสสาวะปราศจากเชอ ิ ธิภาพชุดกรองปัสสาวะปราศจากเชอ ื้ ทดสอบประสท ปัสสาวะ 24 คน กรองด ้วยชุดกรอง LB (Luria-Bertani) media ไม่พบ Bacteria Sample IS 10 ug/mL DBA ปริมาณ 30 ul ปัสสาวะ 600 ul กรองผ่าน membrane 0.45 um Results Selectivity Table 1.doc Fig 2 obtained by the automated on-line extraction LC–MS of seven drugs and metabolites in urine at 500 ng/mL each Stability of MA and AP Fig. 3. Time-course changes in the concentrations of MA and AP in the severely contaminated urine under various storage conditions ((●) with filtration, at 25 °C; (♦) with NaN3, at 25 °C; (■) without any preservative measures, at 25 °C; (○) with filtration, at 4 °C; () with NaN3, at 4 °C; (□) without any preservative measures, at 4 °C). Stability of MA and AP MA ลดลง 32 % AM ลดลง 44 % Fig. 3. Time-course changes in the concentrations of MA and AP in the severely contaminated urine under various storage conditions ((●) with filtration, at 25 °C; (♦) with NaN3, at 25 °C; (■) without any preservative measures, at 25 °C; (○) with filtration, at 4 °C; ( ) with NaN3, at 4 °C; (□) without any preservative measures, at 4 °C) ย ับยงการสลายต ั้ ัวของMAและAM aseptic collection kit NaN3 ึ ษาเพิม ศก ่ 5 ราย 4 ราย ไม่มก ี ารเปลีย ่ นแปลง เก็บที่ 25 C/150 ว ัน 1 ราย MA AM 60 % 23 % ย ับยงการสลายต ั้ ัวของสาร aseptic collection kit NaN3 ทดสอบ MA เปลีย ่ นฟอร์มเป็น AM ร่างกายร ับ MA เข้าไป AM Enzyme ึ ษาเพิม ศก ่ ความเข้มข้น 500 ng/mL เก็บที่ 25˚C 30 ว ัน LC-MS No trace AM Stability of MA and AP การลดลงของ MA และ AM เกิดจาก Bacteria ทาปฏิกริ ย ิ า reductive ก ับ Nitrogen biological แยก carbon – carbon bonds Amine Stability of MA and AP ี MA และ AM เป็นไปได้ ด ังนนการสู ั้ ญเสย ว่าเกิดจากการ Break carbon – carbon bonds โดย Bacteria ผลการวิจ ัย Clauwaert et al 3,4-methylenedioxy derivatives of MA and AP Urine without preservative room temperature MA and AP มีความคงต ัวอยูไ่ ด้ถงึ 21 weeks Stability of NZ and EZ Fig. 3. Time-course changes in the concentrations of NZ and EZ in the severely contaminated urine under various storage conditions ((●) with filtration, at 25 °C; (♦) with NaN3, at 25 °C; (■) without any preservative measures, at 25 °C; (○) with filtration, at 4 °C; () with NaN3, at 4 °C; (□) without any preservative measures, at 4 °C). Stability of NZ and EZ -20˚C / 150 ว ัน /All NZ and EZ ไม่เปลีย ่ นแปลง ปนเปิ้ อนรุนแรง /25˚C / 14 ว ัน / no preserve ปนเปิ้ อนเล็กน้อย/ 25˚C / 14 ว ัน / no preserve ตรวจไม่พบ NZ NZ ค่อยๆลดลงชา้ ๆ ชา้ กว่า 5 เท่า Stability of NZ and EZ Oxygen-sensitive enzyme จาก Bacteria จะทาปฏิกริ ย ิ า reducing ก ับ nitroaromatic compounds amine NZ เป็นสารพวก nitrobenzodiazepienes เปลีย ่ นรูปเป็น 7amino-metabolites โดย bacteria ( bacteria in the gastrointestinal tract reduction nitrobenzene ) Stability of NZ and EZ detected 7- aminonitrazepam in all the samples in which losses of NZ were detected. Stability of NZ and EZ • Robertson and Drummer reported NZ was stable up to 24 months when samples were stored at 4 C ป้องก ันการสลายต ัวของ NZ aseptic collection kit NaN3 Stability of 7AF Fig. 5. Time-course changes in the concentration of 7AF in the severely contaminated urine under various storage conditions (●) with filtration, at 25 °C; (♦) with NaN3, at 25 °C; ( ) with filtration and NaN3, at 25 °C; (■) without any preservative measures, at 25 °C; (○) with filtration, at 4 °C; (♦ ) with NaN3, at 4 °C; ( ) with filtration and NaN3, at 4 °C; (□) without any preservative measures, at 4 °C). Stability of 7AF - 20˚C / 150 ว ัน /7AF ไม่เปลีย ่ นแปลง ี 7AF เล็กน้อยเหมือนก ัน ปนเปื้ อนรุนแรง/ ปนเปื้ อนเล็กน้อย / 150 ว ัน/ สูญเสย ี 7AF เล็กน้อยเหมือนก ัน กรอง / สูญเสย ี 7AF ปานกลางเหมือนก ัน NaN3 / สูญเสย NaN3 + กรอง / ย ับย้งการสลายต ัวของ 7AF ได้ดท ี ส ี่ ด ุ ทดสอบ การ Adsorption 7AF บนผิวหน้าของ Vessel ทดสอบ Adsorptions 7AF แต่ละความเข้ มข้ น (250 – 2000 ng/mL) A B C D กรองด ้วยชุดกรอง เก็บไว ้ 30 วัน ทดสอบการ Adsorption 7AF ลดลงในประมาณ 100 ng/mL ในทุก ความเข้มข้นของสาร แต่ละความเข้มข้น (A B C D) 7AF ลดลง ไม่ขน ึ้ อยู่ ก ับความเข้มข้นของ สาร 7AF ลดลง เกิดจากการถูก Adsorption ทีผ ่ วิ หน้าของ Vessel Stability of 7AF • ลดลงเองตามธรรมชาติ เพราะต ัวม ันเองไม่ stable • Robertson and Drummer : Normal blood /4, 22 and 37 C / sodium fluoride ี 7AF 10% ในระยะเวลา 28 ว ัน สูญเสย bacteria-contaminated blood /22 C. ี 7AF ประมาณ 10% ในระยะเวลา 2 ว ัน สูญเสย Normal blood /-20 C / sodium fluoride 7AF ลดลง Stability of 7AF ต่างก ัน Robertson and Drummer Normal blood /-20 C / sodium fluoride 7AF ลดลง ึ ษาไม่เหมือนกัน ตัวอย่างทีศ ่ ก เลือด กับ ปั สสาวะ จึงให ้ผลทีต ่ า่ งกัน ป้องก ันการสลายต ัวของ 7AF aseptic collection kit NaN3 Stability of COC and 6AM Fig. 7. Time-course changes in the concentration of COC and 6AM in the severely contaminated urine under various storage conditions ((●) with filtration, at 25 °C; (♦) with NaN3, at 25 °C; (■) without any preservative measures, at 25 °C; (○) with filtration, at 4 °C; ( ) with NaN3, at 4 °C; (□) without any preservative measures, at 4 °C). Stability of COC and 6AM ปนเปื้ อนรุนแรง/ no preservative /- 20˚C / 150 วัน / 7AF ไม่เปลีย ่ น ปนเปื้ อนรุนแรง/ no preservative / 4˚C/ 150 วัน/ COC และ 6AM ไม่เปลีย ่ น ปนเปื้ อนรุนแรง/ no preservative / 25˚C/ 30 วัน/ COC และ 6AM หายไป ปนเปื้ อนเล็กน ้อย/ no preservative / 25˚C/ 30 วัน/ COC และ 6AM หายไป ปนเปื้ อนรุนแรง/ NaN3 / 25˚C/ 75 วัน/ ตรวจไม่พบ COC ี ไป 75 % ปนเปื้ อนรุนแรง/ NaN3 / 25˚C/ 75 วัน/ 6AM สูญเสย Stability of COC and 6AM • จากผลการทดลองพบว่า เมือ ่ กรอง ให้ผลดีในการร ักษา COC และ 6AM • แต่กล ับพบว่าเมือ ่ ใช ้ กรอง + NaN3 ี COC และ 6AM กล ับให้ได้ผลไม่ด ี มีการสูญเสย ี COC และ6AM แสดงว่า NaN3 มีผลทาให้ สูญเสย Stability of COC and 6AM • COC and 6AM hydrolyzed เองหรือ/และ ด้วย enzymatically เปลีย ่ น ฟอร์มเป็น benzoylecgonine methylecgonineและ เปลีย ่ นเป็น morphine • การเกิด hydrolysis จะเกิดขนในสภาวะที ั้ เ่ ป็นด่าง • อ ัตราการ hydrolysis ในปัสสาวะทีป ่ นเปื้ อนรุนแรงจะเร็วกว่าปัสสาวะที่ ปนเปื้ อนเล็กน้อยหลายเท่า • เป็นไปได้สง ู ทีว่ า ่ การเกิด hydrolysis ภายใต้สภาวะทีม ่ ี pH สูงทาให้ bacteria แพร่พ ันธุ ์ Stability of COC and 6AM • NaN3 มีผลต่อการสลายต ัวของยาเนือ ่ งจาก azide anion functions เป็น a strong nucleophile จ ับก ับ carbonyl carbon และ เป็นไปทาให้เกิด hydrolysis ของ ester bond ในสภาวะเบสอ่อน Stability of COC and 6AM • Fuller and Anderson: 12 weeks /20 C/ 0.1 wt% NaN3/ มีการลดลง 6AM • ผลการทดสอบต่างมีความแตกกต่างก ันเป็นไปได้ ึ ษาต่างก ัน 90 ก ับ เนือ ่ งจากระยะเวลาในการศก 150 ว ันและความเข้มข้น NaN3 ทีใ่ ชใ้ นการ ทดสอบต่างก ัน 0.1 wt% ก ับ 0.5 wt% , Stability of 6AM เพือ ่ ป้องก ันไม่ให้ปริมาณ 6AM สูญหาย ชุดกรองเก็บปัสสาวะแทน NaN3 สรุปและวิจารณ์ผลการทดลอง - การใช ้ Aseptic collection of urine ่ ตรวจประเภท specimens ในการกรอง สงิ่ สง ้ มามี ปัสสาวะทีค ่ ณะผูว้ จ ิ ัยได้คด ิ ค้นขึน ิ ธิภาพในการลดการสลายต ัวยาในสงิ่ สง ่ ประสท ตรวจประเภทปัสสาวะได้ - การใช ้ Aseptic collection of urine specimens ในการกรองปัสสาวะเป็นวิธท ี ล ี่ ดการ ปนเปื้ อนของแบคทีเรียทีด ่ ก ี ว่าการใช ้ Sodium azide เป็นสารก ันบูดในปัสสาวะ ความคิดเห็นทีม ่ ต ี อ ่ งานวิจ ัย ี สเป็ น • การเก็บตัวอย่างทีอ ่ ณ ุ หภูม ิ -20 และ 4 องศาเซสเซย อุณหภูมท ิ เี่ หมาะสมทีส ่ ด ุ ตามลาดับ ี สจะต ้องมีการ • ตัวอย่างมีข ้อจากัดต ้องอยูท ่ ี่ 25 องศาเซสเซย กรองหรือและใช ้ NaN3 เพือ ่ ยับ ้ ยัง้ การสลายตัวของสาร • งานวิจัยนีส ้ ามารถนาไปประกอบเป็ นข ้อมูลของคูม ่ อ ื การสง่ ตรวจ ทางนิตเิ วชได ้ ่ ารผลิตชุดกรองทีม • อาจจะพัฒนาไปสูก ่ ส ี ารเคมีทเี่ หมาะสมในการ ยับยัง้ การสลายตัวของยาโดยไม่รบกวนตัวยา ึ ษาว่าควรใชภาชนะใดที ้ • ศก ส ่ ามารถเก็บรักษาปั สสาวะ โดยทีส ่ าร ไม่ถก ู Adsorption โดยพืน ้ ผิวของภาชนะ ึ ษาในความคงตัวของยาในตัวอย่างอืน ่ ผม เล็บ • ศก ่ ๆ เชน