Principles of Scientific
Instrumentation
Design of Experiments and Analysis of
Results
80-801
Bldg 101 Room 4
12:00-14:00 Thurs
Lecturers:
Dr. Itay Lazar
Dr. Alexander Varvak
Dr. Chaim Wachtel
Dr. Refael minnes
‫נוגדנים ויישומים טכנולוגיים‬
‫דוגמה לשימוש בבוחן אלייזה לא תחרותי (סנדוויץ') לקביעת נוגדנים ל וירוס ‪HIV‬‬
‫בדיקה חיובית‬
‫סובסטרט לאנזים‬
‫נוגדן שניוני אנטי ‪FC‬‬
‫קשור לאנזים‬
‫נוגדנים מנסיוב חולה‬
‫אנטיגנים של וירוס‬
‫מקובעים למשטח‬
‫בדיקה שלילית‬
‫‪Assay‬‬
‫‪Control‬‬
‫‪Patient C‬‬
‫‪Patient B‬‬
‫‪Patient A‬‬
‫‪Negative‬‬
‫‪Control‬‬
‫‪Positive‬‬
‫‪Control‬‬
‫‪0.123‬‬
‫‪1.999‬‬
‫‪0.412‬‬
‫‪O.055‬‬
‫‪0.153‬‬
‫‪1.689‬‬
‫‪65‬‬
‫‪ ‬תספיג אימונולוגי ‪Immunoblotting‬‬
‫מטרת השיטה‪ :‬זיהוי של חלבונים ספציפיים בתוך תערובת‪.‬‬
‫תיאור השיטה‪:‬‬
‫‪ .1‬מריצים את תערובת חלבונים‬
‫במכשיר אלקטרופורזה‪.‬‬
‫• שני גורמים משפיעים על‬
‫ההפרדה של החלבונים‪ :‬א‪.‬‬
‫גודל החלבון‪ .‬ב‪ .‬המטען שיש‬
‫לכל חלבון‪.‬‬
‫‪.2‬‬
‫‪.3‬‬
‫‪.4‬‬
‫‪.5‬‬
‫‪.6‬‬
‫‪.7‬‬
‫‪.8‬‬
‫החלבונים שבתוך הג'ל מעוברים לנייר צלולוז‪ .‬העברה זו מתבצעת‬
‫בשדה חשמלי‪.‬‬
‫מדגירים את נייר הצלולוז עם הנוגדנים הספציפיים לחלבון המבוקש‪.‬‬
‫שטיפת הנוגדנים שלא נקשרו‪.‬‬
‫הוספת נוגדן שניוני המסומן באנזים‪.‬‬
‫שטיפת הנוגדנים שלא נקשרו‪.‬‬
‫הוספת סובסטרט‪.‬‬
‫מתקבל תגובת צבע בפס עם החלבון המבוקש‪.‬‬
‫‪ ‬אבחון בעזרת סמנים רדיואקטיביים‬
‫‪.RIA- Radio Immuno Assay‬‬
‫•‬
‫•‬
‫•‬
‫•‬
‫בוחן זה מבוסס על סימון האנטיגן או הנוגדן באיזוטופ‬
‫רדיואקטיבי‪.‬‬
‫איזוטופים מקובלים הם‪ 3H , 131I ,125I :‬ו ‪.14C‬‬
‫יישומי שיטה זהים אשר תוארו לעיל במבחן ה ‪.ELISA‬‬
‫על אף ששיטה זו היא בעלת רגישות גבוהה‪ ,‬מעדיפים‬
‫לעשות שימוש במבחן ה ‪ .ELISA‬הסיבות לכך הן‪:‬‬
‫א‪ .‬הסיכון הכרוך בעבודה עם חומרים רדיואקטיביים‪.‬‬
‫ב‪ .‬הציוד היקר הנדרש בטכניקה זו‪.‬‬
‫‪ ‬אבחון בעזרת סמנים פלורוצנטיים‪.‬‬
‫‪FIA- Fluoro Immuno Assay‬‬
‫• בוחן זה מבוסס על סימון אנטיגנים או נוגדנים בסמנים‬
‫פלורוצנטיים‪.‬‬
‫• תרכובות פלורוצנטיות פולטות אור בתחום הנראה‬
‫בתגובה להקרנתם בתחום אור בעל אורך גל קצר יותר‪.‬‬
‫• עיקר השימוש של השיטה הוא זיהוי‬
‫אנטיגנים ונוגדנים ע"פ תאים ורקמות‪.‬‬
‫• החיסרון העיקרי של שיטה זו היא‬
‫הרגישות הנמוכה יחסית שלה‪.‬‬
Typhoon FLA 9500
Fluorescence, phosphorimaging,
Radioisotopes:
3H, 11C, 14C, 125I, 18F,
32P, 33P, 35S, 99mTc,
Excitation wavelengths:
473 nm (blue LD laser)
532 nm (green SHG laser)
635 nm (red LD laser)
650 nm (red LD laser)
Typhoon FLA 9500
Fluorescence, phosphorimaging,
Flourescence detection
Image analysis
‫שימוש בנוגדנים כאמצעי הפרדה‬
‫• כרומטוגרפיה זיקה אימונית ‪Immunoaffinity chromatography‬‬
‫מטרת השיטה‪:‬‬
‫בשיטה זו יש ניצול ספציפיות של קישור נוגדן‪-‬אנטיגן‪ .‬היא עושה שימוש‬
‫בנוגדנים או אנטיגנים מקובעים ע"מ לנקות חומרים מתוך תערובת‪.‬‬
‫תיאור השיטה‪:‬‬
‫א‪ .‬הכנת הקולונה‪ :‬קישור הנוגדן אל‬
‫פני נשא בלתי מסיס‪ .‬קישור אל‬
‫הנשא צריך להיעשות כך שלא‬
‫תהיה הפרעה לקישור אנטיגן‪-‬‬
‫נוגדן‪.‬‬
‫ב‪ .‬ספיחה‪ :‬מוסיפים תערובת‬
‫החומרים לקולונה‪.‬‬
‫ג‪ .‬שטיפה‪ :‬כל החלבונים‬
‫נשטפים החוצה מלבד‬
‫אותו האנטיגן שנקשר‬
‫לנוגדן‪.‬‬
‫ד‪ .‬שחרור‪ :‬ניתוק החומר ע"י‬
‫שינוי ב ‪ pH‬או שע"י שינוי‬
‫בריכוז המלח‪.‬‬
‫• שיטה זו מיושמת כאשר רוצים להגיע לדרגת ניקיון מאד גבוהות‬
‫של החומר‪.‬‬
‫• שיטה זו עשויה גם לשמש לניקוי והפרדה של נוגדנים‪ .‬במקרה‬
‫זה יתבצע קישור של האנטיגן לנשא הבלתי מסיס‪.‬‬
‫‪Immunoprecipitation‬‬
‫‪CO-Immunoprecipitation‬‬
‫‪Isolation of Cells and Molecular Material using Magnetic‬‬
‫‪Beads‬‬
Immunohistochemistry
• Immunohistochemistry or IHC refers to the
process of detecting antigens (e.g., proteins)
in cells of a tissue section by exploiting the
principle of antibodies binding specifically to
antigens in biological tissues.
Immunofluorescence
• Immunofluorescence is a technique to
visualize a specific protein or antigen in cells
or tissue sections by binding a specific
antibody chemically conjugated with a
fluorescent dye. We use the indirect
immunofluorescence staining to perform cells
fixed on slides and examine under a
fluorescence microscope
‫דוגמא א'‪:‬‬
‫צביעת של החלבון ‪Tubulin‬בעזרת‬
‫נוגדנים פלורוצנטים‪.‬‬
‫דוגמא ב'‪:‬‬
‫ניתן בעזרת סמן הפלורוצנטי‪ ,‬לזהות בין‬
‫אוכלוסיות שונות של תאי דם‪ .‬לכל סוג‬
‫של תאי הדם יתקשרו נוגדנים אחרים‪.‬‬
‫שיטה ‪ :2‬אימונופרסיפיטציה ‪ :‬שיטה להשקעת תצמידי נוגדן – אנטיגן ע"י ספיחת זיקה ישירה‬
‫במטרה להפריד אנטיגן ספציפי מתערובת אנטיגנים אחרים משתמשים באימונופרסיפיטציה‪.‬‬
‫השיטה מבוססת על הוספת נוגדן ספציפי לאנטיגן המטרה כשהוא מקובע לחלקיקי ספרוז ויצירת‬
‫תצמידים בתמיסה ‪ .‬חלקיקי הספרוז "לוכדים" את האנטיגן ושולפים אותו מהתערובת‪ .‬בשלב השני‪,‬‬
‫משקיעים את חלקיקי הספרוז עם התצמידים ע"י סרכוז בצנטריפוגה‪ .‬במשקע נקבל את אנטיגן‬
‫המטרה על חלקיקי הספרוז ‪.‬‬
‫השיטה טובה לבידוד אנטיגן שהוא מרכיב תוך‪ -‬תאי במטרה לחקור את נוכחותו או את כמותו בתא ‪.‬‬
‫** כדי להקל על איתור התצמיד נוגדן‪-‬אנטיגן מקפידים לסמן את האנטיגן באיזוטופ רדיואקטיבי ‪.‬‬
‫הסימון מאפשר גם קביעה כמותית של האנטיגן ‪.‬‬
‫אתר אנימציה של השיטה המתאר בידוד וזיהוי חלבון תוך‪-‬תאי ‪:‬‬
‫‪http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/IMPfolder/IMPQ.html‬‬
‫מוסיפים חלקיקי ספרוז‬
‫הנושאים נוגדן ספציפי‬
‫לאנטיגן המטרה (האדום)‬
‫אנטיגנים אחרים‬
‫בנוזל העליון‬
‫סרכוז‬
‫שחרור של‬
‫האנטיגן האדום‬
‫מהנוגדן ובדיקתו‬
‫בשיטות אנליטיות‬
‫האנטיגן האדום‬
‫במשקע‬
‫החלקיקים דגים את האנטיגן האדום‬
‫באמצעות הנוגדן הספציפי המקובע‬
‫‪40‬‬
‫פירוט השלבים בשיטת האימונופרסיפיטציה המשופרת ע"י ספיחה לנוגדן שניוני (לא ישירה)‬
‫תערובת חלבונים המכילה אנטיגן המיועד לבידוד‬
‫מוסיפים נוגדן ספציפי‬
‫נוצרים תצמידים של נוגדן ‪ -‬אנטיגן בתמיסה‬
‫מוסיפים חלקיקי ספרוז‪ -‬נוגדן שניוני‬
‫התצמידים נלכדים ע"י נוגדן שניוני המקובע לחלקיקי הספרוז‬
‫סרכוז בצנטריפוגה‬
‫מסרכזים להשקעת החלקיקים שספחו את התצמידים ושוטפים את‬
‫המשקע להרחקת שאר מרכיבי התערובת שאינם תצמידים‬
‫משחררים את האנטיגן מהתצמיד ע"י ‪ SDS‬ובודקים ניקיון באימונובלוטינג עם נוגדן ספציפי‬
‫אנטיגן משוחרר‬
‫‪Y Y‬‬
‫‪Y Y‬‬
‫הרצה בג'ל עם‬
‫‪ SDS‬ובדיקה‬
‫באימונובלוטינג‬
‫סרכוז‬
‫ושטיפות‬
‫לכידת התצמידים‬
‫‪Y Y‬‬
‫שחרור האנטיגן‬
‫מהתצמיד ע"י ‪SDS‬‬
‫הוספת נוגדן‬
‫לחלבון המטרה‬
‫‪Y‬‬
‫הוספת נוגדן שניוני‬
‫מקובע לחלקיק ספרוז‬
‫אנטיגן המטרה‬
‫קבלת תצמידים‬
‫מסיסים בתמיסה‬
‫‪42‬‬
IB:TRPV3
IB:pY
IP:328
IB:TRPV3
V3f+EGFR
V3f+EGFR kd
EGFR
V3f
EV
IB:328
‫•‬
‫הפרדה של תאים‪FACS -‬‬
‫‪FLOURESCENCE-ACTIVATED CELL SORTING‬‬
‫מטרת השיטה‪ :‬הפרדה בין אוכלוסיות שונות של תאים‪ .‬שיטה זו‬
‫מתבססת על כך שלתאים השונים יש אנטיגנים שונים ע"פ התאים‪.‬‬
‫תיאור השיטה‪:‬‬
‫א‪ .‬סימון תאים השונים בעזרת נוגדנים‬
‫שלהם סמנים פלורוצנטים בעלי‬
‫צבע שונה‪.‬‬
‫ב‪ .‬הזלפה של התאים‪ ,‬באופן שבכל‬
‫טיפה אין יותר מתא אחד‪.‬‬
‫ג‪ .‬הארה בעזרת קרן לייזר ורישום צבע‬
‫האור שנפלט מהתא במחשב‪.‬‬
‫ד‪ .‬ע"פ הצבעים שהתקבלו נותן‬
‫המכשיר פולסים חשמליים‪.‬‬
‫הפולסים השונים ממיינים את‬
‫התאים למבחינות שונות‪.‬‬
Innovation in Flow Cytometry
Introduction
EPICS
Profile II
benchtop
Cytometer
EPICS IV
2 lasers, 3 colors
1980
1970
EPICS II
First Laser
Analyzer
19
TPS
EPICS 750 – 3 laser
sorter
EPICS XL™
Fully automated clinical cytometer
1990
Q-PREP™
introduced 1st
automated flow
prep
FC500 advanced
cytometer
2000
EPICS ALTRA™
Sorter
PrepPlus™
Sample preparation
for flow cytometry
Navios
2009
FP1000 cytometry
auto prep
0
2008-2009•
2010-2011•
2006-2007•
2007-2008•
•2005-2006
•2004-2005
•2003-2004
11000
•2002-2003
•2001-2002
•2000-2001
•1999-2000
•1998-1999
•1997-1998
•1996-1997
•1995-1996
•1994-1995
•1993-1994
•1992-1993
•1991-1992
•1990-1991
•1989-1990
•1988-1989
•1987-1988
•1986-1987
•1985-1986
•1984-1985
•1983-1984
•1982-1983
•1981-1982
•1980-1981
•1979-1980
•1978-1979
•1977-1978
•1976-1977
•1975-1976
Publications using the keyword “flow cytometry” from 115,000 – refs 2010
125,411 - refs 2011
10000
9000
8000
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
Commercial Instruments
BC
BC
Luminex
Bryte
Bay
Biosciences
Accuri
Millipore/Guava
BC
Amnis
BD
BD Aria
BC
BD
BD Influx
Apogee
Flow Cytometry (2)
What can Flow Cytometry Do?
•
•
•
•
•
Enumerate particles in suspension
Determine “biologicals” from “non-biologicals”
Separate “live” from “dead” particles
Evaluate 105 to 5x106 particles in less than 1 min
Measure particle-scatter as well as innate
fluorescence or 2o fluorescence
• Sort single particles for subsequent analysis
Definitions
• Flow Cytometry (2)
– Measuring properties of cells in flow
• Flow Sorting (4)
– Sorting (separating) cells based on properties
measured in flow
– Also called Fluorescence-Activated Cell Sorting (FACS)
– but this term does refer to sorting, not analysis. FACS
is frequently misused. Saying FACS when you mean
flow cytometry is incorrect!!
1,2,5
ARIA III Optical Layout
How to cope with THAT
one?
Without going bankrupt?
These samples are from
HIV+ patients waiting
for or on anti-retroviral
therapy
See special supplement
Clinical Cytometry 74B;
2008.
BONE MARROW
TISSUES
ACTIVATION &
CLONAL
PROLIFERATION
Stem Cell
Pro-B Cell
Early-B Cell
H0L0
H0L0
HxL0
Pre-B Cell
Naive B cell
HxL0
CD34 cCD79 cCD79 cCD79
DR cCD22 CD22 CD22
CD19 CD19
CD19
CD21
CD20
CD10 CD21
CD10
HRL0
Immunocyte
Immunoblast
HRLR
cCD79 sCD79
CD22 CD22
CD19 CD19
CD20 CD20
CD21 CD21
cµ sµ/sd
Memory
B cells
Plasma cells
Classification of B- ALL (EGIL)
cCD79/CD19
/c or sCD22
CD10
c-µ
sIg
B-I (pro-B)
+
-
-
-
B-II (common)
+
+
-
-
B-III (pre-B)
+
+
+
-
B-IV (mature)
+
+
+
+
T lineage associated markers
TCR
CD3 g d e
ITAMITAMITAM
CD5
e zz/zh
CD2
ITAMITAMITAM
ITAMITAM
ITAMITAM
CD4
CD1
CD8
CD7
Classification of T-ALL (EGIL)
cCD3
CD7
CD2
CD5
CD8
CD1a+
sCD3+/
CD1a-
T-I (pro-T)
+
+
-
-
-
T-II (pre-T)
+
+
+
-
-
T-III (cortical T)
+
+
+
+
-
T-IV (mature T)
+
+
+
-
+
Matutes’ scoring of CLL
POSITIVE
NEGATIVE
OR WEAK
CD5
1
0
CD23
1
0
sIg
0
1
FMC7
0
1
CD22/CD79b
0
1
Hydrodynamic focussing in the
cuvette (5,6,7)
Sample
Sample
Sheath
Sheath
Sample
pressure low,
small core
stream. Good
for DNA
analysis
LOW
High sample
pressure,
broader core
stream.
Bad for DNA
analysis
HIGH
1
Laser delay
Sample
Sheath
•cross beam compensation
•Stability of fluidics
Fluorescence Activated Cell Sorting
Electrostatic Flow
Sorting
• After the cells are
interrogated by the laser,
vibrations separate the
sample stream into
droplets containing
either one or zero cells,
called the “break-off
point”
• At the point at which the
stream breaks into droplets, it
passes through an electrically
charged ring which charge cells
based on the results detected
by the cytometer’s laser and
detector system
• The cells then pass by charged
plates which sort the cells
based on the charge that they
have been given
http://www.bdbiosciences.com
Purity Sort Mode
Purity
Yield
Forward Angle Light Scatter (3)
Laser
FALS Sensor
90 Degree Light Scatter (4)
Laser
FALS Sensor
90LS Sensor
How a voltage pulse from the PMT is
generated
t
1.
Laser
Voltage
t
2.
Laser
Voltage
t
3.
Laser
Voltage
Pulse Height (H)
Voltage
Height, Area, and Width(8)
Pulse area(A)
0
40
Pulse Width (W)
Time (µs)
2 Parameter Histogram (2)
Single Positive
PI Population
Double Positive
Population
PE FL
Negative
Population
FITC FL
Single Positive
FITC Population
1 Parameter Histogram
Positive
Negative
Count
Dimmer
Brighter
6
4
1
1 2 3 4 6 7
150 160 170 .. 190
Channel Number
Fluorescence picked up from the FITC PMT
Light Scatter Gating (5)
1000
800
600
Scatter
Forward
Side Scatter Projection
Forward Scatter Projection
Neutrophils
Projections show 2D
Plots in 1 parameter
space
Forward Scatter Projection
200
400
Monocytes
0
Lymphocytes
0
200
400
600
800
1000
90 Degree Scatter
Human white blood cells (red cells lysed)
3:24 PM
☺☺☺
Multi-color studies generate a lot of
data
+-
++
--
+-
++
--
+-
++
--
+-
--
+-
QUADSTATS
Log Fluorescence
QUADSTATS
-+
++
++
--
+-
++
--
+-
QUADSTATS
Log Fluorescence
QUADSTATS
-+
-+
++
--
+-
++
--
+-
QUADSTATS
Log Fluorescence
QUADSTATS
-+
-+
++
--
+-
++
--
+-
QUADSTATS
Log Fluorescence
QUADSTATS
-+
-+
Log Fluorescence
+-
-+
Log Fluorescence
--
QUADSTATS
Log Fluorescence
QUADSTATS
-+
++
Log Fluorescence
+-
-+
Log Fluorescence
--
QUADSTATS
Log Fluorescence
QUADSTATS
-+
++
Log Fluorescence
+-
Log Fluorescence
-+
10
QUADSTATS
-+
++
--
+-
-+
++
--
+-
Log Fluorescence
QUADSTATS
Log Fluorescence
--
--
QUADSTATS
9
Log Fluorescence
++
++
8
Log Fluorescence
-+
-+
7
Log Fluorescence
+-
Log Fluorescence
--
+-
QUADSTATS
-+
++
--
+-
Log Fluorescence
Log Fluorescence
QUADSTATS
QUADSTATS
QUADSTATS
QUADSTATS
QUADSTATS
QUADSTATS
QUADSTATS
QUADSTATS
QUADSTATS
QUADSTATS
-+
++
--
+-
Log Fluorescence
3:24 PM
-+
++
--
+-
Log Fluorescence
-+
++
--
+-
Log Fluorescence
-+
++
--
+-
Log Fluorescence
-+
++
--
+-
Log Fluorescence
-+
++
--
+-
Log Fluorescence
-+
++
--
+-
Log Fluorescence
-+
++
--
+-
Log Fluorescence
-+
++
--
+-
Log Fluorescence
Log Fluorescence
Log Fluorescence
Log Fluorescence
Log Fluorescence
Log Fluorescence
Log Fluorescence
Log Fluorescence
Log Fluorescence
Log Fluorescence
Log Fluorescence
Log Fluorescence
Log Fluorescence
Log Fluorescence
Log Fluorescence
Log Fluorescence
Log Fluorescence
Log Fluorescence
Log Fluorescence
Log Fluorescence
++
--
QUADSTATS
Log Fluorescence
QUADSTATS
-+
++
6
Log Fluorescence
+-
Log Fluorescence
-+
5
Log Fluorescence
--
QUADSTATS
Log Fluorescence
++
Log Fluorescence
-+
Log Fluorescence
Log Fluorescence
QUADSTATS
4
Log Fluorescence
3
Log Fluorescence
2
Log Fluorescence
3 color
1
5 color
4 color
-+
++
--
+-
Log Fluorescence
PE
PE
How much compensation is correct? (14end)
CD4/CD8
Loss of Membrane Asymmetry: Annexin V
Jurkat cells stained with Vybrant®
Apoptosis Assay Kit #2 (V13241)
Untreated cells
Dead
Viable
Apoptotic
Induced with camptothecin
Dead
Jurkat cells stained
with Alexa Fluor 488Annexin V conjugate
and Propidium Iodine
51
Viable
Apoptotic
Molecular Probes™
The Cell Cycle
G
M
2
S
G1
G0
Quiescent cells
A DNA histogram
Cell Number
G0-G1
G2-M
S
Fluorescence Intensity
A typical DNA Histogram
G0-G1
G2-M
# of Events
S
Fluorescence Intensity
Amnis System
Page 55
©1990-2010
J. Paul Robinson,
Purdue
Image
from Amnis
web site
– www.amnis.com
University
3:24 PM
Amnis System
Page 56
©1990-2010
J. Paul Robinson,
Purdue
Image
from Amnis
web site
– www.amnis.com
University
3:24 PM
Summary
•
•
•
•
•
•
Main Applications
DNA and RNA analysis
Phenotyping
Cell Function
Sorting and cell isolation
Immunological assays