Chemia związków naturalnych 1. Aminokwasy 2. Peptydy 3. Białka 4. Sacharydy 5. Kwasy nukleinowe 6. Lipidy 7. Alkaloidy 8. Steroidy 9. Terpenoidy 10. Feromony Warunkiem zaliczenia wykładu jest zgromadzenie 60% punktów z trzech obowiązujących kolokwiów wykładowych. 1. 10.11.2020 2. 08.12.2020 3. 26.01.2021 Literatura 1. A. Kołodziejczyk, „Naturalne Związki Organiczne”, PWN, Warszawa 2013. 2. L. Stryer, „Biochemia'', PWN, Warszawa, 1997. 3. Wybrane przez studenta podręczniki omawiające podane tematy. Aminokwasy R CH COOH NH2 -aminokwas AMINOKWASY NATURALNE (D i L) SYNTETYCZNE (D,L; DL) Białkowe (L) Niebiałkowe (D lub L) pierwszorzędowe drugorzędowe (kodowane) trzeciorzędowe egzogenne endogenne Aminokwasy egzogenne – Phe, Ile, Leu, Lys, Met, Thr, Trp, Val, aminokwasy których organizm nie może syntetyzować samodzielnie, muszą być dostarczane w pożywieniu, w przeciwieństwie do aminokwasów endogennych (np. Ala, Asn (asparagina), Cys, Gly, Gln, Pro, Ser, Asp (kwas asparaginowy), Glu (kwas glutaminowy)). Aminokwasy kodowane alifatyczne Wzór kod 3-literowy kod 1-literowy pHi glicyna Gly G 5,97 alanina Ala A 6,02 walina Val V 5,97 leucyna Leu L 5,98 izoleucyna Ile I 6,02 prolina Pro P 6,30 nazwa CH2COOH NH2 CH3CHCOOH NH2 (CH3)2CHCHCOOH NH2 (CH3)2CHCH2CHCOOH NH2 CH3CH2CHCHCOOH H3C NH2 N H COOH Hydroksyaminokwasy CH2CHCOOH NH2 HO seryna Ser S 5,68 treonina Thr T 6,53 hydroksyprolina Hyp - 5,71 CH3CHCHCOOH HO NH2 HO N H COOH Aminokwasy siarkowe CH2CHCOOH HS NH 2 cysteina Cys C 5,02 metionina Met M 5,75 cystyna Cys2 - CH3SCH2CH2CHCOOH NH2 NH2 S-CH2CHCOOH S-CH2CHCOOH NH2 Aminokwasy aromatyczne CH 2CHCOOH NH 2 HO CH2CHCOOH NH2 CH2CHCOOH N H NH2 fenyloalanina Phe F 5,98 tyrozyna Tyr Y 5,65 tryptofan Trp W 5,88 Aminokwasy kwaśne i ich amidy HOOCCH2CHCOOH kwas NH2 H2NOCCH2CHCOOH NH2 HOOCCH2CH2CHCOOH NH2 H2NOCCH2CH2CHCOOH NH2 Asp D 2,87 Asn N Glu E 3,22 Gln Q 5,65 asparaginowy asparagina kwas glutaminowy glutamina 5,41 Aminokwasy zasadowe CH2(CH2)3CHCOOH NH2 NH2 H2NCNH-(CH2)3CHCOOH NH N N H NH2 CH2CHCOOH NH2 CH2CH(CH2)2CHCOOH NH2OH NH2 lizyna Lys K 9,74 arginina Arg R 10,08 histydyna His H 7,64 hydroksylizyna Hly - Aminokwasy białkowe pierwszorzędowe – aminokwasy stanowiące substraty w rybosomalnej syntezie białka. Aminokwasy białkowe drugorzędowe – powstają w wyniku modyfikacji postrybosomalnej, głównie w reakcjach: N-alkilowania, C-hydroksylowania i C-halogenowania. OH H3C CH COO CH3 N CH 3 CH3 N,N,N-trimetyloalanina 4-hydroksyprolina COOH N H Aminokwasy białkowe trzeciorzędowe - powstają w procesach postrybosomalnych, w reakcjach pomiędzy grupami funkcyjnymi różnych AA. NH2 H2C CH COOH Utlenianie Cys do Cys2 SH + NH2 H2C CH COOH S O S H2C CH COOH NH2 cystyna SH H2C CH COOH NH2 cysteina -AA1-AA2-Cys3-(AA)n-Cysn+4-AAn+5S S Naturalne aminokwasy niebiałkowe Właściwości kwasowo-zasadowe W cząsteczce aminokwasu grupy aminowa – NH2 i kwasowa – COOH reagują z sobą tworząc sól wewnętrzną, tzw. jon obojnaczy. + H3N-CHR-COO .. H2N-CHR-COOH Wartość pH, przy której stężenie aminokwasu w formie kationowej jest takie samo jak w formie anionowej nazywa się punktem izoelektrycznym pHi. RCH COOH + -OH + NH + H+ 3 kation K1 - RCH COO + NH3 jon obojnaczy + -OH - RCH COO + H+ NH2 K2 anion W środowisku silnie kwaśnym aminokwas występuje w postaci kationu, a w silnie zasadowym w postaci anionu, w pośrednim natomiast tworzy sól wewnętrzną. Wartość pHi dla aminokwasów obojętnych i kwaśnych równa się średniej arytmetycznej wartości stałych równowagi pK1 i pK2 przejścia jonu obojnaczego odpowiednio w kation i anion. Dla aminokwasów trójfunkcyjnych podawana jest jeszcze stała K3. Schemat dysocjacji aminokwasu zasadowego H2C (CH2)3 CHCOOH + NH + NH 3 3 + -OH + H+ K1 - H2C (CH2)3 CHCOO + OH + H+ + NH + NH 3 3 K2 H2C (CH2)3 CHCOO + NH NH 2 3 + H+ + -OH K3 H2C (CH2)3 CHCOO NH2 - NH2 - Reakcja aminokwasów z kwasami i zasadami Pod wpływem silnych kwasów aminokwasy ulegają protonowaniu tworząc sole amoniowe. Kwasy słabe i średniej mocy nie reagują z aminokwasami R + H3N CH COO + HCl aminokwas R + Cl H3N CH COOH chlorowodorek aminokwasu Z silnymi zasadami aminokwasy tworzą sole karboksylanowe. R + H 3N CH COO + KOH aminokwas R - + H 2N CH COO K sól karboksylanowa Synteza proliny wg Willstattera R. Willstatter, Ber., 1900, 33. 1160. M. Wróblewski, R. Kołodziejska, R. Studzińska, A. Karczmarska-Wódzka, M. Dramiński, Wiad. Chem., 2013, 67, 804-818. Reakcja z kwasem azotowym(III) COO - + H 3N C H NaNO2 H+ R L-aminokwas COOH HO C H R L-hydroksyaminokwas Acylowanie aminokwasów Grupa aminowa aminokwasów ulega acylowaniu pod wpływem halogenków kwasowych, bezwodników lub estrów aktywnych. Produktami takich reakcji są N-acyloaminokwasy. Acylowanie prowadzi się najczęściej w środowisku zasadowym. R - H2N CH COO sól aminokwasu Ac O/-OH 2 R - AcNH CH COO - AcO-/- HOH sól N-acetyloaminokwasu Estryfikacja grupy karboksylowej Grupę karboksylową aminokwasu można estryfikować typowymi metodami, np. działając na nie alkoholami w obecności kwasów w bezwodnym środowisku. R - + Cl H3 N CH COOH chlorowodorek aminokwasu CH3OH/HCl - HOH R + Cl H3 N CH COOCH3 chlorowodorek estru metylowego aminokwasu Dogodnym sposobem wytwarzania bezwodnego chlorowodoru in situ jest reakcja chlorku tionylu z alkoholem. Leu L-leucyna EtOH/SOCl2 HCl . LeuOEt (85%) chlorowodorek estru etylowego L-leucyny Chiralność Aminokwasy białkowe (oprócz Gly) są chiralne i mają konfigurację L na C. Inne aminokwasy naturalne występują w postaci L, D lub racemicznej. CHO COOH H2N C H HO C H COOH H2N C H CH2OH R CH3 L--aminokwas aldehyd L-glicerynowy L-alanina + NH3 L-alanina COO C CH3 - H COOH H2N C H H glicyna jest achiralna COO H - + NH3 C CH3 D-alanina Chiralne AA białkowe, oprócz Cys mają na Cα konfigurację absolutną (S). COO + NH3 C - H CH2SH 2 HSH2C H 3 COO C NH3+ 1 L-Cysteina ma konfigurację absolutną (R). - Izoleucyna (Ile) i treonina (Thr) mają dwa centra chiralne. H3C H COOH kwas (2S,3S)-2-amino-3H2N H Ile -metylopentanowy H OH kwas COOH (2S,3R)-2-amino-3-hydroksybutanowy H2 N H Thr Otrzymywanie aminokwasów na drodze syntezy chemicznej Amonoliza halogenokwasów CH3CH2COOH kwas propanowy Br2/P - HBr 2 NH CH3CHCOOH (62%) 3 CH3CHCOOH - NH4Br Br kwas DL-2-bromopropanowy NH2 DL-alanina Synteza Gabriela CH2 CHCOOK O CH2CHCOOK + KN Br O N O - KBr O 2-bromo-3-fenylopropanian ftalimidek potasu potasu O NH NH 1.NH2NH2, 2. H+/HOH DL-Phe DL-fenyloalanina O Synteza malonowa COOEt H2C HNO2 COOEt malonian dietylu AcNHCH(COOEt)2 COOEt COOEt Zn/AcOH (60%) AcHNC H HON=C H Ac2O COOEt COOEt oksym oksomalonianu dietylu acetamidomalonian dietylu NaOEt EtOH acetamidomalonian dietylu AcNHCNa(COOEt)2 CH3CH2CH2Br AcNHC(COOEt)2 CH2CH2CH3 acetamidopropylomalonian dietylu 2. NH3 1. H+/HOH , - CO2 CH3CH2CH2CHCOOH NH2 kwas DL-2-aminopentanowy Synteza Streckera Synteza aminokwasów z aldehydów i cyjanku sodu lub potasu w obecności amoniaku. Pośrednio tworzy się imina, z niej powstaje aminonitryl, który w wyniku hydrolizy przekształca się w aminokwas. C O + NH3 - HOH związek karbonylowy C NH imina HCN C CN H+/HOH + NH2 aminonitryl C COOH NH3 NH3.aq + C COO NH3 aminokwas Redukcyjne aminowanie -oksokwasów RCH2CCOOH NH3 RCH2CCOOH O NH oksokwas iminokwas H2/Pd RCH2CHCOOH NH2 aminokwas Zaproponuj syntezę Gly wykorzystując ftalimidek potasu. O O C N K C + ClCH2COOC2H5 C SN2 N CH2COOEt C chlorooctan etylu O O ftalimidek potasu ftalimidooctan etylu 1. KOH / H2O 2. HCl COOH + C2H5OH + COOH kwas ftalowy H3N CH2COO glicyna (Gly) Wychodząc z malonianu dietylu przedstaw metodę syntezy DL-Phe. COOEt COOEt HNO2 CH2 COOEt C NOH COOEt COOEt COOEt H2 / Pd CH NH2 PhCH2OCOCl CH NH-Z (chloromrówczan benzylu) COOEt COOEt N-benzyloksykarbonylo-aminomalonian dietylu -aminomalonian dietylu oksym oksomalonianu dietylu (izonitrozomalonian dietylu) malonian dietylu 1. Na 2. PhCH2Cl COOEt H3N CH CH2Ph COO DL-Phe H2 / Pd 1. NaOH Z-HN CH CH2Ph COOH N-benzyloksykarbonyloDL-fenyloalanina (N-Z-DL-Phe) + 2. H3O , (-CO2) PhH2C C NH-Z COOEt N-benzyloksykarbonylo-amino--benzylomalonian dietylu Synteza proliny wg Willstattera R. Willstatter, Ber., 1900, 33. 1160. M. Wróblewski, R. Kołodziejska, R. Studzińska, A. Karczmarska-Wódzka, M. Dramiński, Wiad. Chem., 2013, 67, 804-818. 1. Zaproponuj drogę syntezy DL-waliny z następujących substratów: a) kwasu 3-metylobutanowego b) 2-metylopropanalu c) acetamidomalonianu dietylu 2. Przedstaw w projekcji Fischera L-metioninę i podaj jej konfigurację absolutną. 3. Narysuj strukturę formy dominującej: a) alaniny przy pH 11 b) proliny przy pH 2 4. Zaproponuj syntezę L-alaniny mając do dyspozycji ftalimidek potasu i -bromomalonian dietylu. 5. Podaj główne produkty (wzór + nazwa) następujących reakcji: a) Gly z chloromrówczanem benzylu w środowisku zasadowym b) DL-Ala z bezwodnikiem kwasu octowego c) DL-Val z metanolem w obecności gazowego HCl d) DL-Phe z etanolem w obecności chlorku tionylu Aminokwasy chiralnie czyste Otrzymywanie: ● z hydrolizatów białkowych ● rozdzielanie aminokwasów racemicznych ● synteza związków chiralnych Czystość chiralną aminokwasów oznacza się: polarymetrycznie, za pomocą NMR, chromatograficznie, enzymatycznie lub mikrobiologicznie. Przykłady syntez chiralnych aminokwasów 1. Synteza Streckera R' O R C + H Ar * 1. 6M HCl R' benzen Na2SO4 * NH2 Ar R' COOH R' NaCN EtOH N Ar R * COOH H2/Pd(OH)2 2. wymiana jonowa Ar * N H * R EtOH/H2O NH2 * R CN N H * R 2. Redukcyjne aminowanie oksokwasów Jako czynnik chiralny stosuje się chiralne aminy, np. 1-fenyloetyloaminę, fenyloglicynę, 1-fenylopropyloaminę i 1-naftyloetyloaminę (NpEta). Synteza (R)-alaniny CH3 C COOH O kwas pirogronowy + (R) NpEta (R) Ala chiralna amina ee = 83% 3. Redukcja wobec chiralnych katalizatorów Rozpuszczalne katalizatory rodowe, zawierające chiralne ligandy umożliwiają otrzymywanie związków chiralnych z dobrą wydajnością i czystością optyczną. Ph-CH=C-COOR H2/kat. Ph-CH2CH-COOR NHAc NHAc Ph Kat. Rh2LCl L: H3C H C Ph P N Ph Ph CH2CH2 P N Ph C CH3 Ph H Otrzymywanie enancjomerów z aminokwasów racemicznych: 1. tworzenie soli diastereoizomerycznych i ich krystalizacja 2. tworzenie i rozdzielanie pochodnych diastereoizomerycznych 3. krystalizacja spontaniczna 4. metody enzymatyczne 5. chromatografia 6. elektroforeza Tworzenie soli diastereoizomerycznych i ich krystalizacja (R,S) R CH COOH + (R) B NH2 (R) R-CH-COO(-) + (R) BH(+) NH2 (S) R-CH-COO(-) + (R) BH(+) NH2 B – zasada chiralna, np: (-) brucyna, (-) chinina, (+) chinidyna, (+) i (-) efedryna, (+) i (-) 1-fenyloetyloamina, (-) strychnina. (R,S) R CH COOH + (S) AH NH2 (R) R-CH-COOH + (S) A(-) (+) NH3 (S) R-CH-COOH + (S) A(-) NH3(+) AH – kwas chiralny, np: (+) i (-) asparaginowy, (+) i (-) glutaminowy, (+) i (-) jabłkowy, (+) i (-) migdałowy, (+) i (-) α-metoksyfenylooctowy. Tworzenie i rozdzielanie pochodnych diastereoizomerycznych Wolne lub chronione racemiczne aminokwasy, można przeprowadzić w pochodne diastereoizomeryczne w wyniku utworzenia nowego, wiązania kowalencyjnego z odczynnikami chiralnymi. Otrzymane pochodne następnie rozdziela się poprzez krystalizację, wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC), gazową czy elektroforezę. Do tworzenia chiralnych diastereoizomerycznych pochodnych aminokwasów stosuje się np: butan-2-ol, mentol, oktan-2-ol, 1-fenyloetyloaminę. Do przekształcania DL-AA w estry można użyć, np. mentol. OH Krystalizacja spontaniczna przesycony roztwór DL-AA kryształek D-AA (-)-mentol D-AA Metody chromatograficzne A. Stacjonarne fazy chiralne B. Chiralne fazy ruchome Metody enzymatyczne Różne enzymy, np. acylazy, proteazy, syntetazy, czy oksydazy są stosowane do rozdzielania racemicznych aminokwasów lub wyodrębniania czystego enancjomeru. Acylazy – stosowane są do rozdzielania racemicznych N-acyloaminokwasów poprzez selektywną hydrolizę grupy acylowej na centrum L (np. wieprzowa acylaza) . Proteazy – stosowane są między innymi do hydrolizy grupy estrowej przy centrum L, co zostało wykorzystane do rozróżnienia centrów chiralnych aminokwasów wielofunkcyjnych. Stosuje się też enzymy immobilizowane, czyli osadzone na nośnikach. COOMe COONa (L) CH NH-Z (L) CH NH-Z (CH2)3 proteaza typu VIII NaHCO3, DHF/H2O (CH2)3 (D) CH NH-Z CH NH-Z COOMe COOMe Redukcja przy użyciu izolowanych enzymów, drożdży oraz mikroorganizmów NH2 HOOC NH3 aspartaza HOOC H COOH Asp (kwas L-asparaginowy) COOH (E)-kwas fumarowy HOOC H2O fumaraza Pseudomonas trifoli (bakterie) NH3 HOOC NH2 H COOH OH Asp (kwas L-asparaginowy) H COOH kwas (S)-jabłkowy Stosując acylazę zaproponować rozdział racemicznej waliny na enancjomery. H3 C O CH CH C H3 C NH3 Ac2O O H3 C CH CH COOH H3 C NH C CH3 O DL-Val N-acetylo-DL-Val acylaza COOH O H C NH C CH3 CH(CH3)2 N-acetylo-D-Val COO + H3 N C H CH(CH3)2 Val Peptydy R1 H O R3 CH N C CH N C CH N C H O R2 H O Wiązanie amidowe Peptydy są związkami powstającymi w reakcji acylowania aminokwasów aminokwasami AA1 R R' H2N CH COOH + - HOH C AA1 aminokwas N-terminalny H2N H2N CH COOH wiązanie peptydowe R R' AA2 C AA2 CH CO NH CH COOH aminokwas C-terminalny C C Wiązanie peptydowe jest to wiązanie amidowe pomiędzy aminokwasami. aktywacja YHN OR'' YHN X OH R' OR'' YHN NH + H2N R R O R' O O R O O wiązanie peptydowe X = halogen, N3, OR''' (aktywny ester), OCOR''' (mieszany lub symetryczny bezwodnik) Y = osłona grupy aminowej R'' = osłona grupy karboksylowej Osłony grupy aminowej O CH2 O C Z (Cbo lub Cbz) benzyloksykarbonyl (karbobenzoksy) O CH2 O C 9-fluorenylometoksykarbonyl Fmoc CH3 O H3C C O C CH3 Boc tert-butyloksykarbonyl Osłony grupy karboksylowej (głównie estry): -O-CH3 metyl OMe -O-CH2CH3 etyl -O-C(CH3)3 t-butyl OEt -O-CH2Ph benzyl OBzl O-t-Bu Osłony grupy hydroksylowej benzyl; tert-butyl; acetyl (Ac-); trimetylosilyl – (CH3)3Si- O CH2 O CH2 NO2 ONBzl p-nitrobenzyl Osłony grupy tiolowej benzyl; acetamidometyl (AcNH-CH2-); tert-butyl Osłony grupy imidazolowej benzyl; tert-butoksyl; formyl; benzyloksymetyl – Bzl-O-CH2; - tosyl; Fmoc Osłony grupy guanidynowej nitrowa (-NO2); tosyl, p-metoksybenzenosulfonyl (Mbs-); benzyloksykarbonyl benzyloksykarbonyl (Z, Cbo, Cbz): O CH2O C Wprowadzanie O CH2 O C O + H3N CH2 C glicyna + Cl NaOH Ochloromrówczan benzylu O CH2O C HN CH2 C O OH osłona Z N-benzyloksykarbonyloglicyna Usuwanie: hydrogenoliza, czyli działanie wodorem w obecności katalizatora (Pd lub Pt); acydoliza bromowodorem w kwasie octowym (HBr/AcOH), za pomocą ciekłego fluorowodoru (HF) oraz sodu w ciekłym amoniaku (Na/NH 3aq). Z-Ala-Val H2/Pd - toluen, -CO2 N-benzyloksykarbonyloalanylowalina Ala-Val alanylowalina tert-butyloksykarbonyl (Boc): O (CH3)3C-O-C Wprowadzanie O O + H3N CH C CH3 O - O + (CH3)3C-O-C-O-C-O-C(CH3)3 NaOH pirowęglan di-tert-butylu O (CH3)3C-O-C NH CH C osłona Boc alanina O CH3 OH N-tert-butyloksykarbonyloalanina Usuwanie: pod wpływem kwasu trifluorooctowego (Tfa); roztworem chlorowodoru w eterze, dioksanie, kwasie octowym lub w innych rozpuszczalnikach organicznych; roztworem bezwodnego kwasu p-toluenosulfonowego, np. w octanie etylu. Osłona Boc jest trwała w środowisku zasadowym. Boc-Ala-Gly CF3COOH (Tfa) N-tert-butyloksykarbonyloalanyloglicyna OoC Tfa x Ala-Gly trifluorooctan alanyloglicyny fluorenylo-9-metoksykarbonyl (Fmoc) – najczęściej stosowana osłona w syntezie peptydów na nośniku stałym Wprowadzanie: reakcja aminokwasu z chloromrówczanem fluorenylometylowym (Fmoc-Cl). Usuwanie: za pomocą drugorzędowych amin, np. piperydyny lub dimetyloaminy. O CH2 O C Cl chloromrówczan fluorenylometylowy R + NH2 CH COOH B R O CH2 O C NH CH COOH Fmoc-aminokwas -aminokwas NH piperydyna R + CH2 x C5H11N NH2 CH COOH -aminokwas Osłony grupy karboksylowej: metyl (Me): -O-CH3 etyl (Et): -O-CH2CH3 Wprowadzanie: otrzymuje się w reakcji bezpośredniej estryfikacji aminokwasów odpowiednim alkoholem w obecności kwasowego katalizatora, np. chlorowodoru lub chlorku tionylu (SOCl2). Usuwanie: hydroliza zasadowa w niskiej temperaturze. O + H3N CH C CH H3C CH3 walina (Val) O - + CH3OH metanol SOCl2 CH3OH O HClxH2N CH C CH H3C 1. NaOH/H2O OCH3 2. H+/H2O CH3 chlorowodorek estru metylowego waliny (HCl x Val-OMe) O + H3N CH C CH H3C CH3 walina (Val) O- tert-butyl (t-Bu): -O-C(CH3)3 Wprowadzanie: otrzymuje się najczęściej w reakcji aminokwasów z izobutenem w obecności kwasu siarkowego lub w reakcji aminokwasu z octanem tert-butylu w obecności kwasu nadchlorowego (HClO4). O +H N CH 3 C CH2Ph O- fenyloalanina (Phe) + CH2=C(CH3)2 izobuten O H2SO4 H2SO4xH2N CH C CH2Cl2 CH2Ph O-t-Bu wodorosiarczan estru tert-butylowego fenyloalaniny (H2SO4 x PheO-t-Bu) Usuwanie: za pomocą kwasu trifluorooctowego (Tfa) lub jego roztworu w rozpuszczalnikach organicznych; roztworu chlorowodoru w kwasie octowym, eterze lub chloroformie; HBr/AcOH; ciekłego fluorowodoru (HF); roztworu kwasu p-toluenosulfonowego (TosOH). benzyl (Bn): -O-CH2-Ph Wprowadzanie: najczęściej stosowana procedura polega na ogrzewaniu aminokwasu z alkoholem benzylowym w obecności kwasu p-toluenosulfonowego z równoczesnym azeotropowym usuwaniem wody: CH2 OH O +H N CH 3 C + O- CH3 TosOH TosOH xH2N CH C kwas p-toluenosulfonowy alkohol benzylowy alanina O CH3 OCH2Ph tozylan estru benzylowego alaniny O H3C S OH O kwas p-toluenosulfonowy Usuwanie: za pomocą hydrogenolizy, czyli działaniem wodoru w obecności katalizatora (Pd lub Pt); hydrolizy zasadowej. Boc-Ala-Gly-OBn 1. NaOH/H2O, 2. H+/H2O N-tert-butyloksykarbonyloalanyloglicynian benzylu -PhCH2OH Boc-Ala-Gly N-tert-butyloksykarbonyloalanyloglicyna Stopień racemizacji zależy zarówno od metody stosowanej do utworzenia wiązania peptydowego, właściwości komponentu acylującego; rodzaj osłony grupy aminowej. Osłony uretanowe (Z, Boc, Fmoc) są nieracemizacyjne (ulegają racemizacji w stopniu poniżej 0,1%). Aminokwas acylowany – taki, którego grupa aminowa bierze udział w tworzeniu wiązania peptydowego. Aminokwas acylujący – taki, którego grupa karboksylowa bierze udział w tworzeniu wiązania peptydowego. Racemizacji ulega aminokwas acylujący X-AA + AA'-Y aktywacja X-AA-AA'-Y + X-D-AA-AA'Y Metody tworzenia wiązania peptydowego Metoda karbodiimidowa (DCC) Ac-Phe + Leu-OMe DCC Ac-Phe-Leu-OMe (54%) + Ac-D-Phe-Leu-OMe (7%) Stopień racemizacji E = 11% N C N DCC + Ac-Phe-DCU (17%) HOH O N C N H H dicykloheksylomocznik DCM O N C N H C O Ac-NH CH CH2 Ph Ac-Phe-DCM N-acylomocznik N-acetylofenyloalanylodicykloheksylomocznik DCC (N,N’-dicykloheksylokarbodiimid) – odczynnik stosowany do otrzymywania peptydów i estrów; powstaje on w wyniku ogrzewania mocznika z cykloheksyloaminą i następczej dehydratacji dicykloheksylomocznika (DCM). O 2 NH2 + H2N C NH2 cykloheksyloamina mocznik , 20h EtOH O N C N H H N,N'-dicykloheksylomocznik (DCM) TosCl Py N=C=N N,N'-dicykloheksylokarbodiimid (DCC) DCC w reakcjach kondensacji (acylowania alkoholi lub amin) uaktywnia grupę karboksylową. Z kwasami tworzy on pochodne O-acyloizomocznika. N=C=N DCC O + R C OH N C=N H O O-acyloizomocznik R C=O alkohol H-OR' lub amina H-NR'2 O N C N H H N,N'-dicykloheksylomocznik H Nu OH N C=N H + R C=O Nu ester lub amid aminokwas acylowany aminokwas acylujący Z-Gly + TosOH.AlaOBz chronione aminokwasy DCC B, - TosO-, - HOH Z-Gly-Ala-OBz chroniony dipeptyd O-acyloizomocznik Z-NH-CH2COOH + N C N Z-Gly N C N H O DCC Z-NH2-CH2 C O reszta Z-Gly H3C O .. H2N-CH-C-OBz Ala-OBz O N C N H H dicykloheksylomocznik + Z-Gly-Ala-OBz ester benzylowy N-benzyloksykarbonyloglicyloalaniny Reakcja z udziałem soli estru Ac-Phe + HCl.Leu-OMe DCC, NEt3 Ac-Phe-Leu-OMe (61%) + Ac-D-Phe-Leu-OMe (23%) + Ac-Phe-DCU (8%) Metoda DCC z dodatkami obniżającymi racemizację Ac-Phe + HCl.Leu-OMe N N DCC, NEt 3 HOBt O N N OH OH HOBt O Ac-Phe-Leu-OMe (88%) + Ac-D-Phe-Leu-OMe (1,4%) + Ac-Phe-DCU HONSu (1,4%) Metoda aktywnych estrów Boc-Val-OR(akt) + Tyr-OBzl Boc-Val-Tyr-OBzl (92%) Aktywne estry: p-nitrofenylowe; pentafluorofenylowe; -OBt; -ONSu Boc-Val + HO NO 2 p-nitrofenol DCC Gln-ONBz Boc-Val-ONp - HO ester p-nitrofenylowy Boc-Val Boc-Val-Gln-ONBz NO2 ester p-nitrobenzylowy t-butyloksykarbonylowaliloglutaminy Metoda mieszanych bezwodników Z-Ala 1. ClCOO-izo-Bu, NMM 2. Phe-OMe Z-Ala-Phe-OMe (95%) Metoda mieszanych bezwodników O Cl R + Z HN Z NH R O O Z-Ala O O O NMM OH (L) O B NMMxHCl A R = etyl; izobutyl Z-Ala C O O Cl R H2 N + O OMe O O N Me NMM N R O Phe-OMe A Cl Me CO2 + R-OH O B R-OH Z H N O OMe (L) N H (L) O Z-Ala-Phe-OMe Z NH H2 / Pd O H2 N OMe (L) N H O O (L) O ester metylowy L-alanylo-L-fenyloalaniny OMe O uretan N H O Metoda BOP (kancerogenny) Z-Gly-Phe + Val-OMe (CH3)2N + N (CH3)2N P O N N (CH3)2N PF6 BOP HOBt Z-Gly-Phe-Val-OMe BOP heksafluorofosforan tris(dimetyloamino)-1benzotriazyloksyfosfoniowy Niekancerogenne odczynniki kondensujące N + N N P O N N N PF6 PyBOP heksafluorofosforan tris(pirolidyno)-1-benzotriazoliloksyfosfoniowy (CH3)2N + N C O N N (CH3)2N BF TBTU 4 tetrafluoroboran [2-(1-benzotriazolo)]-1,1,3,3-tetrametylouroniowy Metoda CDI R. Paul, G. W. Anderson, J. Am. Chem. Soc., 1960, 82, 4596–4600. R. M. De Figueiredo, J.-S. Suppo, C. Midrier, J.-M. Campagne, Adv. Synth. Catal., 2017, 359, 1963–1968 Zaproponuj drogę syntezy TFAxGly-Ala-OBn. Synteza peptydów na fazie stałej Synteza w roztworze nazywana jest syntezą klasyczną. W 1963 r. B. Merrifield zaproponował nową metodę syntezy peptydów, została ona nazwana syntezą na fazie stałej, SPPS - solid phase peptide synthesis. Synteza na nośniku stałym - SPPS XNH-CHR'-COO + ClCH2 P Polimer do SPPS stosowany jest zwykle w postaci kuleczek o średnicy ziarna 20-100 mm P = polistyren sieciowany diwinylobenzenem XNH-CHR'-COO- N 1. - X (deprotekcja) 2. B- (neutralizacja) H2N-CHR'-COO-N XNH-CHR''-COOH DCC + dodatki XNH-CHR''-CO- NH-CHR'-COO-N N = nośnik Syntezę peptydów sposobem SPPS prowadzi się obsadzając ziarna żywicy pierwszym aminokwasem zwykle w granicach 0,2-0,7 mmola/g żywicy. Żywica Merrifielda (kopolimer styreno-diwinylobenzenowy) pęcznieje pod wpływem dichlorometanu zwiększając 9-krotnie swoją objętość. Synteza pochodnej karnozyny na fazie stałej z zastosowaniem żywicy chlorku 2-chlorotritylu M. H. H. Tehrani, A. Bamoniri, M. Gholibeikian: The toxicity study of synthesized inverse carnosine peptide analogues on HepG2 and HT-29 cells. Iran J. Basic Med. Sci., 2018, 21, 39–46. Synteza peptydu na fazie stałej to operacje jednostkowe powtarzające się cyklicznie. SPPS została zautomatyzowana przemywanie przemywanie test Polisynteza Skonstruowano syntezatory peptydów umożliwiające równoczesną syntezę nawet kilkuset różnych peptydów. Takie operacje prowadzi się np. na prętach pokrytych glikolem polietylenowym lub innym polimerem zdolnym do przyłączenia C-końcowego aminokwasu. Pręty osadzone są w gniazdach bloku zaopatrzonych w system doprowadzający roztwory odczynników. deprotekcja acylowania neutralizacja acylowanie przemywanie Przykłady peptydów naturalnych Glutation - GSH Biosynteza Glu + Cys ATP enzym -Glu-Cys-Gly -Glu-Cys Gly, ATP GSH enzym Występuje we wszystkich komórkach zwierząt wyższych i u wielu mikroorganizmów. Bierze udział w reakcjach redoks. Jest antyutleniaczem, aktywatorem pewnych enzymów. Otrzymywany jest najczęściej z drożdży. Enkefaliny – endogenne peptydy opioidowe, wyizolowane z mózgu i innych ośrodków nerwowych wielu kręgowców, szybko ulegają enzymatycznej biodegradacji tracąc aktywność. Znane są dwie naturalne enkefaliny: Tyr-Gly-Gly-Phe-Met Met-enkefalina Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu Leu-enkefalina Zwiększoną odporność enkefalin na biodegradację uzyskano poprzez: - zastąpienie L-AA aminokwasami D-AA, - modyfikację C-końca – amidowanie, redukcja -COOH, - modyfikację N-końca – N-alkilowanie, N-acylowanie, - wprowadzenie wiązań izosterycznych czy cyklizację. Enkefaliny modyfikowane Tyr-D-Ala-Gly-Phe-Leu [D-Ala2]-Leu-enkefalina [D-Ala2,D-Leu5]-Leu-enkefalina Tyr-D-Ser-Gly-Phe-Leu-Thr Tyr-D-Ala-Gly-N-MePhe-Gly-ol Endorfiny występują w wielu tkankach, np. w mózgu, płynie mózgowo-rdzeniowym, nerkach, we krwi, w żołądku, jelitach, a nawet w łożysku. b-endorfina człowieka 1 5 10 15 Thr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-Val20 25 30 -Thr-Leu-Phe-Lys-Asn-Ala-Ile-Ile-Lys-Asn-Ala-Tyr-Lys-Lys-Gly-Glu Nazwa endorfiny wywodzi się od wyrażenia endogenne morfiny, co oznacza morfinopodobne substancje wytwarzane przez własny organizm. Ich rolą jest polepszenie samopoczucia. Oksytocyna i wazopresyna Peptydy wytwarzane w podwzgórzu i magazynowane w przysadce; należą do neuropeptydów, czyli hormonów peptydowych wydzielanych przez tkankę nerwową. Nazywane są też hormonami tylnego płata przysadki mózgowej. Oksytocyna i wazopresyna są cyklicznymi nonapeptydami. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Cys-Tyr-Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2 oksytocyna 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Cys-Tyr-Phe-Gln-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2 wazopresyna Insulina S 1 2 3 4 5 6 7 S 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu-Glu-Asn-Tyr-Cys-Asn S-S S-S Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr-Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg 22 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Gly 23 Thr Lys Pro Thr Tyr Phe Phe 30 29 28 27 26 25 24 Insulina jest lekiem ratującym życie diabetykom. Przez dziesiątki lat w terapii stosowano insulinę izolowaną z trzustek zwierząt rzeźnych – wołową i wieprzową. Pod koniec XX w. opracowano syntezę HI w oparciu o inżynierię genetyczną. Toksyny RCHR CHCH3 CO NH-CH-CO-NH-CH-CO-NH-CH2-CO HC N H CH3 NH OH OS CH-CH-CH2-CH3 N R'' CH2 H CH3 CO-CH-NH-CO-CH-NH-CO-CH2-N CO H2C-COOR''' Amatoksyna toksyczny peptyd jadu muchomora sromotnikowego TUFTSYNA Endogenny immunomodulator występujący we krwi człowieka i innych ssaków. HN H 2N NH OH O O Thr Lys OH N H N NH H2 N NH2 O Pro O Arg Synteza Boc-Thr-Lys(Z-Y)-Pro-Arg(NO2)-OMe Thr Pro Lys Arg NO2 Boc OH Tfa 1. iBuOCOCl, NH2 NMM 2. H2/Pd/C Boc Z-Y Boc OH 1. iBuOCOCl, NMM, Z-Y 2. TFA Tfa x H 1. iBuOCOCl, NMM HCl x H 1. iBuOCOCl, NMM 2. TFA Z Boc OH OMe NO2 OMe NO2 OMe NO2 OMe Z-Y Boc NO2 OMe Y = Ala; Val Białka (proteiny) Podział białek, wg A. kształtu: Białka (proteiny) – wielkocząsteczkowe biopolimery zbudowane z reszt aminokwasów połączonych ze sobą wiązaniami peptydowymi –CONH-. - globularne lub sferyczne, inaczej kłębuszkowe (albuminy, globuliny, gluteiny i inne) - fibrylarne - włókienkowe rozpuszczalne (fibrynogen, miozyna) nierozpuszczalne - skleroproteiny (kolagen, keratyna, fibroina) B. składu: - proste, inaczej proteiny lub homoproteiny są zbudowane wyłącznie reszt aminokwasów (kolagen, keratyna, albuminy, gluteiny, miozyna i inne). - złożone, inaczej proteidy zawierają oprócz reszt aminokwasów inne elementy, np. białka takie jak chromoproteiny, fosforoproteiny, glikoproteiny, lipoproteiny czy metaloproteiny. C. pochodzenia: - roślinne (prolaminy, gluteiny); - zwierzęce (białka mleka, białka krwi, białka mięśni); - drobnoustrojowe (białka drożdży, białka bakteryjne, białka wirusów). Kołodziejczyk A., Naturalne związki organiczne, PWN, Warszawa 2013. D. funkcji: - zapasowe (prolaminy, białka jaj); - szkieletowe (skleroproteiny); - ciała czynne (enzymy, hormony, przeciwciała); - receptory (receptory opioidowe, rodopsyna); - wykonujące prace mechaniczną (białka mięśni); - kontrolujące przepływ materii i energii (białka represorowe, czynniki wzrostu, hormon tyreotropowy); - transportowe (transferyna, hemoglobina); - ochronne (przeciwciała). E. wartości odżywczej: - pełnowartościowe – zawierają wszystkie aminokwasy niezbędne w potrzebnych ilościach (np. białka mięśni, jaj, ryb) - częściowo pełnowartościowe - wystarczają do podtrzymywania życia, nie zapewniają prawidłowego rozwoju (np. białka roślinne – niedobór Lys) - niepełnowartościowe przyswajalne, ale niewystarczające do podtrzymywania życia – nie zawierają jednego lub więcej aminokwasów niezbędnych, np. w żelatynie brakuje Trp i Cys i jest niedobór Met, Ile, Val i Tyr; - bezwartościowe nieprzyswajalne (np. białka włosów, paznokci czy rogów). Kołodziejczyk A., Naturalne związki organiczne, PWN, Warszawa 2013. Przestrzenna struktura białka 1. Struktura pierwszorzędowa – skład i sekwencja aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym. 2. Struktura drugorzędowa – przestrzenne ułożenie fragmentów łańcuchów polipeptydowych (kształt i forma łańcucha białkowego). Do struktur drugorzędowych zaliczana jest: - a-helisa - harmonijka b - b-zakręt (pętle omega) 3. Struktura trzeciorzędowa – kształt cząsteczki białka wynikający z wzajemnego oddziaływania grup funkcyjnych: -COO-....H3N+-; -S-S-; wiązań wodorowych. 4. Struktura czwartorzędowa – dwie lub więcej cząsteczek białkowych tworzą agregaty bez wiązań kowalencyjnych; wzajemne położenie łańcuchów polipeptydowych oraz struktur niebiałkowych (grup prostetycznych); - cukrów w glikoproteidach lipidów w lipoproteidach kwasów nukleinowych w nukleoproteidach barwników w chromoproteidach reszty kwasu fosforowego w fosfoproteidach. Oznaczanie składu aminokwasowego białek białko 6N HCl mieszaAA + AA + AA + AA + ..... 1 2 3 4 nina AA 110oC, 24h HPLC i AA1 AA2 AA3 AA4 ..... rozdzielone oznaczone AA Większość AA białkowych nie ma chromoforu, dlatego w celu detekcji przeprowadza się je w barwne pochodne, często za pomocą ninhydryny. O O O O + HOH OH - HOH OH ninhydryna O Kołodziejczyk A., Naturalne związki organiczne, PWN, Warszawa 2013. W reakcji ninhydryny z aminami II-rzęd. powstają sole iminiowe o zabarwieniu żółto-pomarańczowym. Pro (zawiera pierścień pirolidynowy) – kolor żółty; Hyp – kolor różowy. Do wykrywania barwnych pochodnych aminokwasowych wykorzystywane są detektory UV/Vis. Chromatogram rozdzielonych aminokwasów kodowanych Hydroliza białek za pomocą enzymów, które tną łańcuch peptydowy w określonych miejscach. Enzymy specyficznie hydrolizujące wiązania peptydowe Enzym AA, którego wiązanie jest hydrolizowane Miejsce hydrolizy Trypsyna (T) Lys, Arg (AA zasadowe) AA-NHCH- Chymotrypsyna (CT) Tyr, Phe, Trp (aromatyczne) AA-NHCH- Pepsyna (P) Tyr, Phe, Trp (aromatyczne) -CO-NHAA Ile, Leu, Val (duże alifatyczne) -CO-NHAA Klostrypaina Arg Arg-NHCH- Proteaza ze Staphylococ. Asp Asp-NHCH- Termolizyna (TL) AA - aminokwas Kołodziejczyk A., Naturalne związki organiczne, PWN, Warszawa 2013. Analizę sekwencyjną białek - zastosowanie automatycznych sekwentatorów, ich działanie jest oparte na degradacji Edmana, można określić sekwencję 100 kolejnych reszt AA. Enzymatyczna analiza sekwencyjna białek Zachowując ostrożność można za pomocą leucyloaminopeptydazy kolejno odszczepiać aminokwasy od N-końca białka. Karboksypeptydaza A hydrolizuje większość aminokwasów C-terminalnych za wyjątkiem Lys, Arg, His i Pro, które z kolei są hydrolizowane przez karboksypeptydazę B. Kołodziejczyk A., Naturalne związki organiczne, PWN, Warszawa 2013. Struktura drugorzędowa białek – kształt i forma łańcucha białkowego Płaskie wiązanie peptydowe -CO-NH- jest częściowo usztywnione i zwykle przyjmuje ułożenie trans, rzadziej cis. Wokół innych wiązań zapewniony jest swobodny obrót. C O -Ca-CO- C C wiązanie częściowo usztywnione O .. -N-Ca- C Ca N Ca C N sp3 H O Wiązanie peptydowe w białkach najczęściej występuje w formie trans. Ca trans N Ca H N Ca O Reszta Pro preferuje formę cis i zwykle tam gdzie się ona znajduje dochodzi do zwrotu kierunku łańcucha peptydowego. Ca cis Kołodziejczyk A., Naturalne związki organiczne, PWN, Warszawa 2013. O Ca N Ca OH Pro N sp2 .. H cis Struktura helikalna Kształt śruby jest utrzymywany dzięki wiązaniom wodorowym -N-H.......O=C- pomiędzy grupami NH i OC-, oddalonych od siebie wiązań peptydowych. W a-helisie wiązania wodorowe tworzą się pomiędzy grupą -CO i grupą HN-czwartego z kolei aminokwasu w łańcuchu peptydowym. 1 O R n+1 2 H 3 O R n+3 4 H O R n+5 O H N CH C N CH C N CH C N CH C N CH C N CH C N n H H R O Rn+2 H Rn+4 H O 1 2 3 h: skok zwoju d: część zwoju 1 AA n: liczba AA/zwój Helisa a jest przedstawiana również symbolem a(3,613), gdzie 3,6 oznacza liczbę AA tworzących jeden zwój. Liczba 13 mówi ile atomów znajduje się w pierścieniu połączonym wiązaniem wodorowym. Kołodziejczyk A., Naturalne związki organiczne, PWN, Warszawa 2013. 4 Struktura harmonijkowa b (pofałdowanej kartki) Tworzy się pomiędzy dwoma, równolegle ułożonymi fragmentami łańcucha peptydowego; znane są dwa typy tej struktury I i II. O C R N H HC C O H N R CH O C O C R N H HC C O H N R CH O C O C N H N H Struktury harmonijkowe N H O C R CH H N R C O HC N H O C R CH O C R N H HC C O H N R CH I równoległa Kołodziejczyk A., Naturalne związki organiczne, PWN, Warszawa 2013. N H II antyrównoległa Zwrot b, (b-zgięcie, b-turn) Charakterystyczny element strukturalny, który zmienia kierunek łańcucha peptydowego o 180o. O n+3 R CH NH R n+2 C R N C CH N O H O C O H CH C CH N R n+1 N HC C Bardzo często w b-zgięciu znajduje się Pro; H Rn O jest to aminokwas bez funkcji -NH-, wobec czego w tym miejscu układ helikalny zostaje przerwany. Inne często spotykane aminokwasy to Gly, Asp, Ser i Asn. 60% łańcuchów statystycznego białka przyjmuje konformację a-helisy lub b-harmonijki, kolejne miejsce zajmuje b-zwrot. Inną ważną strukturą białka jest struktura kolagenowa. Wyróżnia się również struktury naddrugorzędowe. Zalicza się do nich: ■ pęczki 4 helis, ■ układ bab (b-harmonijka-a-helisa-b-harmonijka), ■ układ 8 fragmentów b otoczonych 8 a-helisami i inne. Kołodziejczyk A., Naturalne związki organiczne, PWN, Warszawa 2013. Struktura trzeciorzędowa - wynika z działania sił przyciągających, np. jonowych, wodorowych czy typu van der Walsa. AAn-AAm-AAm+n H3N + AAn-Cys-AAm-Cys-AAm+n+2 - C O O S S wiązania disulfidowe oddziaływania jonowe CH3 CH H3C CH3 CH3 H3C CH3 CH oddziaływania hydrofobowe Kołodziejczyk A., Naturalne związki organiczne, PWN, Warszawa 2013. wiązania wodorowe NH O H O C CHR Struktura czwartorzędowa Opisuje agregaty złożone z dwóch lub więcej pojedynczych łańcuchów makropeptydowych, tzw. podjednostek. Podjednostki mogą być identyczne (białka homogeniczne, np. laktoglobulina) lub różne (białka heterogeniczne, np. hemoglobina). Hemoglobina Cztery zasocjowane podjednostki, z których każda zawiera cząsteczkę hemu (zaznaczoną na zielono). http://pl.wikipedia.org/wiki/Struktura_czwartorz%C4%99dowa_bia%C5%82ka Białka proste (proteiny) (zbudowane są wyłącznie z aminokwasów) albuminy białka globularne, rozpuszczalne w wodzie (pH 4-8,5); rozpuszczalne w rozcieńczonych elektrolitach; koagulują pod wpływem stężonych elektrolitów i w podwyższonej temperaturze. Przykłady: laktoalbumina (w mleku), owoalbumina (w jajach); albumina osocza; występują także w mięśniach, nasionach, ziemniakach i wielu innych surowcach. globuliny białka globularne, nierozpuszczalne w wodzie, rozpuszczalne w rozcieńczonych elektrolitach, koagulują w stężonych elektrolitach i w podwyższonej temperaturze. Przykłady: globuliny mleka, tuberyna (białka zapasowe ziemniaków), g-globuliny (ciała odpornościowe), enzymy (lipazy, fosfatazy i inne). fibroina białka proste, włókienkowate, nierozpuszczalne w wodzie, ani w elektrolitach; odporne na działanie wielu czynników chemicznych i enzymów. łańcuchy boczne: Gly Ala Ser Tyr Główny składnik naturalnego jedwabiu, zawiera Gly (50%) i Ala (25%) oraz Ser i Tyr, nie ma Cys i Met. Reszta Gly jest przedzielona resztami innych AA: -Gly-Ala-Gly-Ser-GlyAla-Gly-. Taki skład i sekwencja fibroiny wymusza strukturę pofałdowaną b. Schematyczna b struktura nici jedwabiu Kołodziejczyk A., Naturalne związki organiczne, PWN, Warszawa 2013. kolagen białka proste; włókienkowate; nieprozpuszczalne w zimnej wodzie, ani w elektrolitach. Główny składnik białek: skóry (do 25%), tkanki łącznej, chrząstek, kości (do 25%) czy łusek. Występuje także w mięśniach i w ścianach naczyń krwionośnych. Ponad 95% kolagenu stanowi fragment o składzie -Gly-X-Y, gdzie X najczęściej jest Pro (30%), a Y Hyp. Właściwości kolagenu są bardzo zróżnicowane: - rogówka jest delikatna i przeźroczysta; - ścięgna są elastyczne i odporne na rozerwanie - kości to kopolimer z fosforanem wapnia, twarde jak beton. keratyna białka proste, włókienkowate, nierozpuszczalne w wodzie, ani w elektrolitach, bardzo odporne na działanie czynników chemicznych. Dominujący składnik włosów (sierści, wełny), paznokci, kopyt, rogów i naskórka. Głównym aminokwasem keratyny jest Cys (do 12%). W dużych ilościach występują: Glu, Ser i Gly oraz AA hydrofobowe: Val, Leu, Ile i Pro. elastyna białko proste, włókienkowate, nierozpuszczalne w wodzie, ani w elektrolitach, odporne chemicznie, odporne na działanie enzymów trawiennych; elastyczne, bardzo wytrzymałe mechanicznie. Skład elastyny - Gly, Pro i Ala (60%); Val, Leu i Ile (27%). Odporność elastyny na działanie czynników chemicznych, enzymatycznych i mechanicznych wynika z gęstego usieciowania łańcuchów polipeptydowych i tworzeniu desmozyny. Desmozyna - aminokwas powstający w wyniku kondensacji reszty Lys z 3 resztami All, aminokwasów wchodzących w skład 4 łańcuchów polipeptydowych. CHO All (CH2)3 C CO CH H O CH2 (CH2)2 CH HC (CH2)2 CH2 + C C NH NH O All H O H All NH2 CO-CH-NH H2N C H (CH2)3 CO-CH-NH (CH2)4 COOH Lys CO CH NH (CH2)3 CO HC (CH2)2 NH + N CO All – L-allizyna (CH2)2 CH NH (CH2)3 CO CH NH reszta desmozyny miozyna i aktyna - białkowe składniki mięśni Miozyna stanowi – 30-40% białek mięśniowych, aktyna 15-20%. Miozyna występuje głównie w mięśniach, aktyna należy do najbardziej rozpowszechnionych białek, np. około 30% masy płytek krwi to aktyna. Oba białka, tj. miozyna i aktyna tworzą aktywny kompleks zwany aktomiozyną, umożliwiają skurcz i rozkurcz mięśni. W cząsteczce miozyny wyróżnia się helikalnie spleciony dwuniciowy ogon i 2 głowy, w głowach znajduje się większość miejsc aktywnych. głowa głowa Model cząsteczki miozyny. L. Stryer, Biochemistry, PWN, Warszawa 1997 Cząsteczka aktyny F; monomery, czyli cząsteczki aktyny G zaznaczono różnymi kolorami. gluteiny białka proste, roślinne, globularne; nierozpuszczalne w wodzie, ani w elektrolitach; rozpuszczają się w kwasach i zasadach. Występują one w ziarnach zbóż i nasionach innych roślin; gluten – jest mieszaniną gluteiny i gliadyny – innego białka prostego. Gluten ułatwia spulchnianie ciasta, ponieważ absorbuje CO2. histony białka proste, globularne; rozpuszczalne w wodzie i w kwasach; są zasadowe – zawierają ~ 25% Lys i Arg; pod wpływem amoniaku ulegają koagulacji; MM = 11-21 kDa. Występują w jądrach i organellach wszystkich komórek w postaci kompleksów z kwasami nukleinowymi. Histony roślin i zwierząt są prawie identyczne. Białka złożone Chromoproteiny – białka barwne, ich barwa pochodzi od chromoforu grupy prostetycznej. hemoglobiny są to pigmenty oddechowe krwi kręgowców. Mają tę samą grupę prostetyczną – hem, różnią się częścią białkową – globinami, zbudowane są z 4 cząsteczek hemu i 4 globin. reszta pirolowa N H N N H mostek metinowy N Hem jest heterocyklicznym barwnikiem, pochodną tetrapirolu, zwanego też porfiną – układ 4 pierścieni pirolowych połączonych mostkami metinowymi: =CH-. tetrapirol (porfina) CHO N H CHO NH + HN H OHC OCH N a-piroloaldehyd HCOOH N - 4 HOH, + 2 H H N N H N porfina Porfinę można otrzymać syntetycznie w reakcji kondensacji a-piroloaldehydu. Hem tworzy się w wyniku skoordynowania jonu Fe2+ przez atomy azotu protoporfiryny. CH2=CH H3C CH3 N N H3C HOOCCH2CH2 Fe N N CH=CH2 CH3 CH2CH2COOH Hemoglobina zawierająca utleniony hem (Fe3+) zwana methemoglobiną nie wiąże się z tlenem; jest biologicznie nieczynna. Biologicznie czynna hemoglobina, zwana ferrohemoglobiną zawiera jon Fe2+. Kołodziejczyk A., Naturalne związki organiczne, PWN, Warszawa 2013. mioglobina jest analogiem hemoglobiny, różni się tym, że zbudowana jest jedynie z pojedynczej globiny i hemu. Jej rola polega na pobieraniu tlenu od hemoglobiny, magazynowaniu go i przekazywaniu mięśniom (komórkom) w razie zapotrzebowania. Powinowactwo tlenu do mioglobiny jest większe niż do hemoglobiny pomimo takiej samej budowy. Zjawisko różnego powinowactwa wynika z oddziaływań allosterycznych, tj. oddziaływań wyższych rzędów. Mioglobina była pierwszym białkiem, którego strukturę poznano za pomocą rentgenografii (1957 roku). Mioglobina dobrze krystalizuje i jest białkiem łatwo dostępnym. Występuje w dużych ilościach w mięśniach szkieletowych ssaków wodnych. L. Stryer, Biochemistry, PWN, Warszawa 1997 fosforoproteiny zawierają 1-10% fosforu w postaci estrów kwasu fosforowego. OH P OH O CH2 O Kwas fosforowy związany jest z grupami HO- Ser lub/i Thr. NH C H C O Ser Do fosforoprotein należą kazeina mleka, fosfityna żółtka jaja, ichtulina ikry rybiej czy witelina. Kazeina w roztworze występuje w postaci koloidalnego roztworu soli Ca2+. Lekkie zakwaszenie (pH < 4,5) mleka powoduje koagulację kazeiny. glikoproteiny zawierają cukry, oligocukry, policukry jako grupy prostetyczne Najczęściej spotykanymi cukrami w glikoproteinach są: galaktoza, mannoza, fukoza, kwas glukuronowy, N-acetyloglukozoamina, N-acetylogalaktozoamina i kwas sjalowy (N-acetyloneuraminowy). Do glikoprotein należy mucyna – śluzowate białko występujące w ślinie, żołądku, jelitach i żółci. Do glikoprotein należą białka powierzchniowe erytrocytów (determinujące grupy krwi) oraz białka błony komórkowej. Część cukrowa białek błony komórkowej znajduje się po zewnętrznej stronie błony i jest połączona z łańcuchem polipeptydowym wiązaniem O-glikozydowym pomiędzy N-acetyloglukozoaminą lub N-acetylogalaktozoaminą i Ser lub Thr. Kołodziejczyk A., Naturalne związki organiczne, PWN, Warszawa 2013. CH2 O —cukier NH C H C O Ser Dobrze poznaną glikoproteiną jest glikoforyna A (główne białko transbłonowe erytrocytów). Część cukrowa zawierająca 100 reszt cukrowych w postaci 16 oligosacharydów stanowi 60% masy białka. glikoforyna A zewnętrzna strona komórki błona komórkowa wnętrze komórki 1 + H3N Leu Ser Thr Thr Glu Val Ala Arg Ser Ile 10 Leu Ala Gln His Val 30 Lys Tyr Ile Ser Ser Gln Thr Arg Asn Asp Thr His 20 Asp Thr Pro Glu His Ala Arg Thr Ala Ala Glu Ile Ser Val Arg Thr Val Ile Leu His Thr Glu Phe Ile Gly Ser Glu Thr Glu Glu Tyr Pro Phe Gly Arg 60 Thr Val Ser 100 Arg Ser Ser Ser Thr Thr Thr His 40 Ile Lys Val 80 Tyr Ser Met Ile Ala Leu 90 Gly Leu Val Ile Ile Thr Pro 50 oligosacharyd związany O-glikozydowo Pro Gly AA AA hydrofobowe AA AA zasadowe Glu AA kwaśne Ser Asp Lys Pro Leu Val Pro110 Ser Pro Asp 70 Glu Glu Pro Lys Ser Ile Gly Met Ser Val Lys Leu Glu Ile Glu Thr Val Asp Ser Val Pro Leu Ser 120 Asn Pro 130 Ser Glu Thr Asp Gln - COO oligosacharyd związany N-glikozydowo Kołodziejczyk A., Naturalne związki organiczne, PWN, Warszawa 2013. lipoproteiny zawierają lipidy jako grupy prostetyczne, takie jak: tłuszcze, kwasy tłuszczowe, fosfolipidy i steroidy. Występują w: Do lipoprotein transportujących lipidy należy LDL, czyli tzw. „zły” cholesterol oraz HDL, czyli. „dobry” cholesterol. metaloproteiny - błonach komórkowych; - organellach komórkowych; - mielinowych otoczkach nerwów; - pręcikach siatkówki oka; - substancji białej mózgu; - osoczu krwi; - cząsteczkach transportujących lipidy. koordynują jony takich metali jak: Cu, Zn, Fe, Mg, Mo i V. Często te kompleksy są barwne, a więc należą wówczas do chromoprotein. W niektórych enzymach metal stanowi grupę czynną, np. Zn w proteazach cynkowych czy w anhydrazie węglanowej, także Cu w oksydazie kwasu askorbinowego lub oksydazie polifenolowej. Istotne znaczenie ma Fe w hemoglobinie i mioglobinie. enzymy Większość enzymów ma budowę białkową. Do znanych enzymów należą, np. rybonukleazy, proteazy; lizozym; .... Rybonukleaza A, białko proste, globularne o MM = 13,7 kDa. Hydrolizuje ono wiązania fosfodiestrowe kwasów nukleinowych. Proteazy - białka proteolityczne lub trawienne, hydrolizują wiązania peptydowe. Zostały podzielone na 4 klasy: - cynkowe (miejscem aktywnym jest Zn), np. karboksypeptydaza A; - serynowe (w miejscu aktywnym jest Ser), np. trypsyna, chymotrypsyna, elastaza i trombina; - cysteinowe, np. papaina i katepsyna B; - aspartylowe (proteazy kwasowe lub karboksylowe), np. pepsyna, renina, chymozyna czy proteaza HIV-1. Kołodziejczyk A., Naturalne związki organiczne, PWN, Warszawa 2013. Lizozym jest białkiem prostym, globularnym, został odkryty przez A. Fleming w ślinie, później obecność lizozymu stwierdzono we łzach i . w białku jaja kurzego, skąd najłatwiej go wyodrębnić. Bakteriobójcze działanie lizozymu polega na rozkładaniu ściany komórkowej bakterii. We wnętrzu lizozymu, podobnie jak i u innych globin przeważają aminokwasy hydrofobowe. Miejsce aktywne tego lizozymu tworzą dwa AA kwasowe Asp 52 i Glu 35 Lizozym hydrolizuje wiązania glikozydowe występujące w ścianie komórkowej bakterii. Osłabiona ściana nie wytrzymuje ciśnienia osmotycznego wnętrza bakterii i pęka. L. Stryer, Biochemistry, PWN, Warszawa 1997 Trypsyna, chymotrypsyna i elastaza hydrolizują białka w jelicie cienkim, biorą udział w trawieniu białek. Należą do proteaz serynowych, ponieważ Ser odgrywa kluczową rolę w centrum aktywnym enzymu, tworzy przejściowo wiązanie estrowe z grupą -COOH substratu. Chymotrypsyna selektywnie hydrolizuje wiązania peptydowe, w których aminokwasami acylującymi są AA aromatyczne i hydrofobowe. -AACO NHHN miejsce aktywne chymotrypsyny CO CH hydrofobowa wnęka mieszcząca Phe , Tyr i Trp Kołodziejczyk A., Naturalne związki organiczne, PWN, Warszawa 2013. Trypsyna selektywnie hydrolizuje wiązania peptydowe, w których AA acylującymi są AA zasadowe, a elastaza selektywnie hydrolizuje wiązania peptydowe, z udziałem Gly i Ala. Selektywność tych reakcji wynika z właściwości i rozmiarów miejsc aktywnych. CO CH (CH2)4 + NH3 HN miejsce aktywne - trypsyny wnęka mieszcząca Lys lub Arg Asp Kołodziejczyk A., Naturalne związki organiczne, PWN, Warszawa 2013. karboksypeptydaza A białko złożone – metaloproteina (zawiera Zn), globularne, pojedynczy łańcuch (307 reszt AA), MM = 34,4 kDa. Prawie 40% łańcucha występuje w strukturze a-helikalnej (8 helis), a 17% to 8 fragmentów b. His 196 Zn2+ jest wiązany jonowo przez grupę -COOH Glu 72, koordynacyjnie przez dwie His 69 i 196 i cząsteczkę wody. Cząsteczka HOH uaktywniona atomem Zn hydrolizuje wiązanie peptydowe. HOH Zn2+ His 69 Glu 72 Kołodziejczyk A., Naturalne związki organiczne, PWN, Warszawa 2013. Białka toksyczne Najsilniejsze (najgroźniejsze) trucizny są białkami. Nazwa LD50 [mg/kg] myszy źródło botulinotoksyna 3.10-8 toksyna jadu kiełbasianego tetanotoksyna 1.10-7 toksyna tężca kobrotoksyna 3.10-4 toksyna jadu kobry toksyna dyfterytu 3.10-4 toksyna bakteryjna abryna 1.10-4 białko z nasion modligroszku (drzewa różańcowego) rycyna 2.10-3 wstrzyknięta, doustnie bungarotoksyna 0,15 białko jadu żmij tetrodotoksyna 5.10-3 toksyna ryb Tetraodon cyjanek potasu 3,0 arszenik 10 Kołodziejczyk A., Naturalne związki organiczne, PWN, Warszawa 2013. Oznaczanie N-terminalnego aminokwasu (metoda Sangera) Val-Gly-Lys-Ala DNP-F DNP- Val-Gly-Lys-Ala F O2N H+/HOH DNP (CH3)2-CH-CH-COOH NH NO2 2,4-dinitrofluorobenzen, DNP-F DNP- Val + Gly + Phe + Lys + Ala O2N NO2 DNP-Val N-terminalny aminokwas można też oznaczyć za pomocą aminopeptydazy, czyli enzymu hydrolizującego białka (peptydy) od N-końca. Oznaczanie N-terminalnego aminokwasu Gly O Val C(CH3)2 CH2 Tyr OH H2N .. CH2C NH CHC NH CHCOOH O 2N O F KHCO3 NO 2 - HF arylowanie hydroliza 1. H+/HOH, O C(CH3)2 CH2 HN CH2C NH CHC NH CHCOOH NO 2 O NO 2 OH 2. NH3 -+ HN CH2COO NH4 NO 2 + Val + Tyr NO 2 arylowana glicyna Oznaczanie C-terminalnego aminokwasu AA1-.......-AAn-1-AAn 1. NH2NH2 2. H+/HOH AA1-NHNH2 + AAn-1-NHNH2 + AAn hydrazydy wolny aminokwas C-terminalny AA można również oznaczyć za pomocą karboksypeptydaz, czyli enzymów hydrolizujących białka (peptydy) od C-końca. O C(CH3)2 CH2 OH 1. H2NNH2 H2N CH2C NH CH C NH CHCOOH Gly Val O Tyr 2. NH3 GlyNHNH2 + ValNHNH2 + Tyr Oznaczanie sekwencji aminokwasów w białku Degradacja Edmana N-terminalny aminokwas białka (peptydu) pod wpływem fenyloizotiocyjanianu zostaje odszczepiony i przekształcony w pochodne 3-fenylo-2-tiohydantoiny (PTH). H O H O N C S + H2N C C NH C C NH ......... R' fenylotioizocyjanian R reszta AA N-terminalnego S pochodna 3-fenylo-2-tiohydantoiny (PTH) H O NH + H N C C NH ......... 2 N CHR reszta kolejnego R' O AA N-terminalnego Stosując degradację Edmana zidentyfikuj N-terminalny aminokwas tripeptydu YLA. S O H2N CH C HN Leu Ala CH2 1. Ph-N=C=S izotiocyjanian fenylu 2. H3O + C HN CH C O Tyr-Leu-Ala OH N Ph + H2N Leu Ala fenylotiohydantoina tyrozyny OH Synteza peptydów na fazie stałej W 1963 r. B. Merrifield zaproponował metodę syntezy peptydów na fazie stałej, SPPS - solid phase peptide synthesis. Synteza na nośniku stałym - SPPS XNH-CHR'-COO + ClCH2 P Polimer do SPPS stosowany jest zwykle w postaci kuleczek o średnicy ziarna 20-100 mm P = polistyren sieciowany diwinylobenzenem XNH-CHR'-COO- N 1. - X (deprotekcja) 2. B- (neutralizacja) H2N-CHR'-COO-N XNH-CHR''-COOH DCC + dodatki XNH-CHR''-CO- NH-CHR'-COO-N N = nośnik Syntezę peptydów sposobem SPPS prowadzi się obsadzając ziarna żywicy pierwszym aminokwasem zwykle w granicach 0,2-0,7 mmola/g żywicy. Żywica Merrifielda (kopolimer styreno-diwinylobenzenowy) pęcznieje pod wpływem dichlorometanu zwiększając 9-krotnie swoją objętość. Synteza na nośniku stałym Synteza peptydu na fazie stałej to operacje jednostkowe powtarzające się cyklicznie. SPPS została zautomatyzowana przemywanie przemywanie test acylowania acylowanie deprotekcja neutralizacja przemywanie Przykładowe pytania 1. Stosując metodę Sangera (DNP-F) zidentyfikuj N-terminalny aminokwas tripeptydu Val-Gly-Ala. Przedstaw mechanizm tej reakcji. 2. Zaproponuj metodę zidentyfikowania C-terminalnego aminokwasu tetrapeptydu Ala-Arg-Pro-Gly. 3. Scharakteryzuj drugorzędową strukturę białka. 4. Podaj przykład białka o czwartorzędowej strukturze. 5. Podaj produkty reakcji pentapeptydu Ala-Gly-Val-Gly-Ala: a) z tioizocyjanianem fenylu b) z hydrazyną c) z 6N HCl 6. Stosując metodę Sangera (DNP-F), zidentyfikuj N-terminalny aminokwas tetrapeptydu AGGF. 7. Zaproponuj metodę zidentyfikowania C-terminalnego aminokwasu pentapeptydu VAPGA. 8. Czym się różnią białka proste od białek złożonych? Podaj po dwa przykłady. 9. Na czym polega synteza peptydów na fazie stałej. 10. Przedstaw mechanizm obsadzania L-alaniny na żywicy 2-chlorotritylowej.
0
advertisement
Related documents
Download
advertisement
Add this document to collection(s)
You can add this document to your study collection(s)
Sign in Available only to authorized usersAdd this document to saved
You can add this document to your saved list
Sign in Available only to authorized users