20240126 Utili per biochem Aminoacidi (2) 20 Asimmetrici Struttura comune Quasi tutti isomeri L Gruppi: alifatici non polari (idrofobi), aromatici, polari ma non carichi, carichi positivamente, carichi negativamente. Aa assorbono nel vicino UV (280 nm), misurando le proteine totali; i residui assorbono diversamente e sono presenti in quantità diversa da proteina a proteina. Requisiti per ponti S: -Almeno 2 cisteine (di solito 10-20 residui lys) -Ambiente ossidante. -Importante avvengano ponti S fra coppie legittime di cisteine. Modificazioni post traduzionali: Aggiunta reversibile o non di gruppi chimici (vedi: gamma carbossilazione per i fattori della coagulazione). -Fosforilazione: da parte di chinasi, la rimozione ad opera di fosfatasi. -Acetilazione: aggiunta di CH3C=O (reversibile). Aa come zwitterioni: Istidina, acido gluttamico e glicina. Punto isoelettrico: valore di pH al quale una molecola non presenta alcuna carica netta. Legame peptidico: 💀 La sua rottura è termodinamicamente favorita in 10-1000 anni ( ), in presenza dell'enzima avviene in pochi ms. In una serie di aa, la testa ha N-term libero e la coda C-term libero. Struttura primaria e secondaria delle proteine (3) Legame peptidico: sequenza degli aminoacidi nella proteina: un quasi-doppio legame, quindi ha tutte le caratteristiche di un legame singolo, rigido e planare. L'interazione tra gruppi funzionali e le catene laterali limita ulteriormente la quantità di conformazioni permesse. Strutture secondarie Corte sequenze di aa (10-15) che si organizzano spazialmente in modo ordinato. -Alfa elica: 25% delle secondarie, precise, destrogire. -Ogni giro d'elica ha 3,6 residui. -Struttura avvolta ad elica stabilizzata da legami H che si formano tra H legato a N del legame peptidico e O carbonilico del quarto residuo aminoacidico. Ciascuno dei 20 aa mostra una propensione per, o meno, assumere conformazione ad alfa elica. Ala, glu, leu, met; buoni iniziatori. Gly, tyr, ser: deboli iniziatori. Pro: impossibile che faccia legame H con CO, funziona se si trova al primo giro, in qualsiasi altra posizione produce significativa distorsione dell'asse dell'elica. -Beta foglietto: brevi appaiamenti di sequenze lineari ( in parallelo). -Struttura stabilizzata da legami idrogeno che si formano fra gruppi NH e CO di catene diverse, R esposti sopra e sotto il piano -La distanza tra ogni residuo è 7Å. -Dato che il numero di strutture che si possono generare da alfa elica e beta foglietto è grande, perché ciò avvenga correttamente serve che il polipeptide presenti strutture meno regolari in modo da permettere ripiegamenti tra elica e foglietto. Questi ripiegamenti sono un motivo strutturale molto semplice che coinvolge foglietti β, detti anche forcina-β, nel quale due filamenti antiparalleli sono legati tra loro da un segmento di due-cinque residui amminoacidici, tra i quali figurano solitamente una glicina e una prolina, che sono in grado di assumere gli angoli diedri necessari per disporsi a giro. Struttura terziaria e folding (4) Dominio: regione proteica con struttura/funzione ben identificabili. -Domini delle serin-proteasi della coagulazione: Dominio serin-proteasico: attività catalitica. Di attivazione: contiene il sito di taglio per l'attivazione dello zimogeno. Domini EGF: interazione con altre proteine. Dominio Gla: 10-12 residui di acido gamma carbossiglutammico, legame Ca2+ dipendente alle membrane fosfolipidiche. Struttura terziaria Ossia organizzazione globale. -Definisce la disposizione spaziale di tutti gli atomi della proteina. -Aminoacidi localizzati in regioni anche lontane e parte di strutture secondarie diverse, possono interagire e causare avvolgimenti della proteina su se stessa. -Non è rigida: gode di flessibilità (anche se non moltissima), il che permette modificazioni conformazionali spesso associate alla funzione biologica. La conformazione nativa è una struttura 3/4 di una proteina, in genere a minor energia di Gibbs e a cui è associata la funzione. Nella 3aria abbiamo interazioni: a ponte disolfuro; legami H; ponti salini; interazioni idrofobiche. Senza interazione si arriva alla denaturazione della proteina. Denaturazione: perdita di conformazione nativa e funzione, cooperativo, andamento sigmoide; processo reversibile. Agenti fisici: calore/congelamento Agenti chimici denaturanti: valori estremi di pH (<4-5 o >9), elevata forza ionica, molecole denaturanti (SDS, si lega ogni due aa, fa perdere peculiarità alla proteina, salvo dimensione). Per fare il folding la molecola non "prova" tutte le conformazioni possibili, ma viene spinta dal calare dell'entropia (e quindi dell'energia). I due meccanismi sono a framework e collasso idrofobico (se in acqua). Le proteine che non raggiungono la conformazione nativa vengono ubiquitinate (marcamento) e degradate dal proteosoma (facente parte del processo di autofagia). I chaperoni aiutano nel folding, non lo spingono direttamente, ma impediscono le interazioni non volute legando le regioni idrofobiche. Struttura quaternaria delle proteine (5) Riguarda proteine costituite da 2 o più catene polipeptidiche, dette subunità (dimeri, trimeri, tetrameri); le sub. possono essere uguali, differenti (omo, etero) e si associano tra loro con vari tipi di legame, in genere non covalenti. L'associazione di catene polipeptidiche può servire a diversi scopi: -Regolatori -Diverse ma correlate funzioni. La struttura quaternaria ha 2 forme: globulare e fibrosa. Es. Globulare: emoglobina (2 omodimeri, 4 sub, 2 alfa e 2 beta). Es. Fibrose; alfa cheratina e collagene (insolubili in H2O), con ruoli strutturali. L'alfa cheratina è composta da alfa eliche destrorse (pasao 3,6 aa), che unite a due a due vanno a formare coiled coils a due catene sinistrorsa (stabilizzate da ponti disolfuro e interazioni idrofobiche e ioniche tra le due eliche). La cisteina è determinante strutturale anche nelle 4arie. Leu, ala, val, ile, met e phe danno interazioni idrofobiche. Il collagene è costituente del tessuto connetivo, assieme ad elastina, fibrillina e proteoglicani, prodotti da fibroblasti, condroblasti e osteoblasti; è la proteina più abbondante nei mammiferi (25% del peso); composta da, insolitamente, 30% gly, 20% pro e idrossi-pro. Struttura collagene: -Struttua 4aria: 3 eliche sinistrorse avvolte una sull'altra a formarne una destrorsa (unità di tropocollageno), stabilizzata da ponti H e anche legami covalenti (resiste alla trazione ma non è elastica); la polimerizzazione spontanea (extracellulare) del tropocollageno forma le fibrille collagene. -Struttura 3aria/4aria, la cui unità costitutiva è il tropocollageno formato da 3 catene polipeptidiche avvolte a tripla elica destrorsa molto stretta. -Struttura 2aria di una singola catena: elica sinistrorsa (ordinata ma non alfa), non stabilizzata da H, 3 residui per giro. -Struttura 1aria generale di una singola catena (circa 1000 aa): Gly-X-Y, circa 100 residui X sono pro/lys e 100 residui Y sono 4-OH-pro/5-OH-lys. L'unico amminoacido permesso dentro l'eliche è gly. I ponti H avvengono fra i gruppi -OH aggiunti a proline e lisine da specifici enzimi: idrossilasi (la reazione avviene nel Golgi). Idrossilando lisina e prolina si possono formare numerosi ponti H, che formano legami crociati sia internamente che fra singole molecole di collagene presenti in 1 fibrilla, per fare ciò è necessaria la Vitamina C. Funzione delle proteine-Trasporto ossigeno (6) O2 poco solibile in acqua, diffusione attraverso tessuti è limitata, nessun aa può legare reversibilmente ossigeno, il ruolo di legame reversibile è svolto da Fe e Cu. Il ferro però verrebbe ossidato portando alla formazione di specie radicaliche, serve rendere Fe meno reattivo, capace di rimanere Fe2+. La natura ha inventato il gruppo protestico Eme, una porfirina; 4 anelli pirrolici uniti da ponti metilenici. Fe2+ viene coordinato con 4 atomi di azoto, che impediscono l'ossidazione a Fe3+, ma solo se eme è nella proteina. Nella proteina, il ferro è coordinato con una catena laterale di una istidina (istidina prossimale), perciò l'accesso ai siti di coordinazione nella proteina risulta limitato, il che è fondamentale cosinderato che CO e NO hanno affinità 20000 volte superiore a O2 (nella mio globina solo 200 volte). -Mioglobina: proteina monomerica, 153aa, 8 alfa-eliche; l'eme è nella tasca interna, movimenti molecolari permettono accesso all'ossigeno; presente nei muscoli. La mioglobina ha una P50 bassissima (alta affinità per ossigeno), risulta che è ottima come riserva d'ossigeno per i tessuti, ma pessima trasportatrice, al contrario di emoglobina. -Emoglobina: minore affinità per ossigeno rispetto a mioglobina; proteina globulare, eterotetramero contenente 4 gruppi eme. Ciascuna subunità Hb lega O2, il tetramero intero lega 4 O2; hanno struttura simile ma comportamento molto diverso, Hb modula la propria affinità in base alle condizioni, ma in generale Hb rilascia più ossigeno della mioglobina. Più aumenta la pO2, più Hb diventa affine per ossigeno. Più cala la pO2, più Hb perde affinità per ossigeno e lo rilascia. Il tetramero assume due conformazioni: stato T a bassa affinità per ossigeno (deossigenata) e stato R ad alta affinità per ossigeno (ossigenata). Il legame di O2 a una subunità nello stato T induce un cambiamento conformazionale convertendola nello stato R; i dimeri alfa/beta1 e alfa/beta2 si spostano. Le modificazioni conformazionali sono trasmesse alle subunità che non hanno ancora legato ossigeno rendendole affini, tramite regolazione allosterica. Allosteria: regolazione di una proteina mediante un effettore allosterico che si lega presso un sito allosterico. La CO2 prodotta metabolicamente porta alla liberazione di H+ negli eritrociti. Ossigeno e H+ legano emoglobina con effetti opposti ed in punti diversi. H+ favorisce lo stato Teso (dal momento che vuol dire che deve cedere ossigeno a tessuti attivi). O2 favorisce stato Rilassato. Hb è un trasporatore di H+ e funge da sistema tampone. CO2 lega Hb con un legame reversibile, formando la carbaminemoglobina (legandosi alle code amminoterminali) si formano nuovi legami ionici che stabilizzano stato T e portano a liberazione di ossigeno. Altro importante modulatore 2,3-bisfosfoglicerato, che legandosi al centro di Hb favorisce lo stato T. Hb adulta Alfa2Beta2 lega il BPG. Hb fetale Alfa2Gamma2 lega BPG con bassa affinità. L'adattamento ad alta quota aumenta BPG, abbassando affinità di Hb per O2. Gli enzimi (7) DeltaG'° variazione di energia libera STANDARD BIOCHIMICA (37 °C, pH 7,4, [1M], P 100Kpa). Anche se la reazione è spontanea ma non è rapida, è come se non avvenisse. Gli enzimi: -Permettono alle reazioni di andare verso condizioni che l'organismo può tollerare. -Gli enzimi sono proteine, globulari. -Possono processare milioni di molecole ogni secondo. -NON alterano equilibrio della reazione, ma solamente accellerare la velocità riducendo l'energia di attivazione richiesta per iniziare la reazione (non alterano DeltaG, [S] e [P]). -Dalla regolazione dipende l'attabilità metabolica. -Agiscono in modo specifico, con soli pochi tipi di molecole (riconoscimento stereospecifico substrati). L'enzima accellera la reazione attraverso 2 peculiarità: -Formazione complesso ES altamente specifico: sia per substrato, che per prodotto. -Abbassamento della Eatt. -Stato fondamentale: reagenti/substrato. -Stato di transizione: specie chimiche con legami non completamente formati. -Intermedi: specie chimiche con legami completamente formati. -Prodotti. L'energia di attivazione è l'energia necessaria per arrivare allo stato di transizione, ovvero per rompere i vecchi legami e formare i nuovi. Il modello di funzionamento degli enzimi è quello a modello adattamento induttivo. La reversibilità delle reazioni enzimatiche è particolare: -A <--> B; si raggiunge l'equilibrio e si può catalizzare la reazione inversa. -A --> B <--> C; se B è substrato di una reazione successiva, la prima reazione è praticamente irreversibile. Tipi di catalisi: acido base, covalente, da ioni metallici. Nomenclatura a 3 nomi: Nome del substrato. Nome del coenzima. Nome della reazione catalizzata + asi. Cinetica enzimatica (8) Misurando la velocità della reazione catalitica, è possibile generare un'equazione che descriva in generale il comportamento cinetico degli enzimi e quindi determinarne i principali parametri cinetici (Km; Vmax: costante di specificità, costante catalitica) che costituiscono la carta d'identità per ogni enzima. La saturazione è dovuta alla conversione di tutto il substrato in prodotto, aumentando substrato si arriverà ad una velocità massima d'enzima. Vmax = n massimo di molecole di P generate nell'unità di tempo da una quantità costante di enzima. Km = misura la forza con cui l'enzima lega il substrato; a bassi valori di Km, l'enzima si satura con poco substrato (alta affinità) e viceversa; corrisponde a metà della velocità massima. Km è inversamente proporzionale all'affinità tra enzima e substrato. Kcat = o numero di turnover è il n° massimo di molecole di substrato covertite in prodotto nell'unità di tempo, per unità di enzima; correlata alla decomposizione del complesso ES, ovvero è rappresentata dalla K della reazione limitante. Kcat/Km = definisce l'efficienza catalitica di un enzima. La costante di specificità non può essere infinitamente alta perché E e S devono avere il tempo d'incontrarsi. Assunzioni utilizzate per scrivere l'equazione di Michaelis-Menten -Velocità iniziale V0 viene valutata solo la velocità catalitica all'inizio della reazione. Problema: [S] varia nel tempo. Si considera la velocità iniziale, in condizioni di [S] >> [E], se si misura la V0 la variazione di [S] è trascurabile, viene anche misurata in un periodo in cui la reazione inversa è ininfluente. La velocità massima ottenibile sarà determinata così dalla velocità iniziale. -Step limitante è ES --> E + P. -Equilibrio rapido del complesso ES e raggiungimento dello stato stazionario del complesso ES. L'equazione è generale, formata da 2 grandezze misurabili che si ottengono da informazioni che riguardano la cinetica dell'enzima. Inibizione modulazione attività enzimatica (9) La velocità di reazione è influenzata da numerose variabili: concentrazione di substrato. Gli enzimi possono essere inibiti: reversibilmente o irreversibilmente. Inibizione reversibile: generalmente molto simili al substrato (accedono entrambi al sito attivo dell'enzima); Stessa Vmax, aumento Km. Effetto dose dipendente. Inibizione non competitiva: Cala Vmax, Km invariata. Inibizione incompetitiva: Calo Vmax, Cala Km Il pH influisce sull'attività di molti enzimi, spesso perché nel sito catalitico vi sono residui acidi e basici e le variazioni di pH modificano le interazioni intra- e inter- molecola. La temperatura ottimale varia da enzima ad enzima e dipende dal particolare sistema cellulare; in vitro, la velocità di gran parte delle reazioni enzimatiche in media raddoppia per ogni aumento di 10 °C di temperatura. Gli enzimi allosterici hanno cinetica sigmoidale, non seguono MM (non hanno Kw ma K0,5). Il legame di un effettore ad una subunità determina cambiamenti conformazionali e dunque funzionali, anche sulle altre subunità della proteina. Esistono modulatori positivi e negativi, hanno effetto su K0,5 ma non su Vmax. -Il regolatore è in genere una molecola diversa dal substrato (regolazione eterotropica). -In certi casi il substrato può essere anche regolatore e perciò il sito attivo è anche regolatore (regolazione omotropica). L'attivazione avviene per modifiche covalenti reversibili: fosforilazione, adenilazione, uridilazione, metilazione, ADPribosilazione. O irreversibili: attivazione per taglio proteico (avviene una volta sola); molti enzimi vengono sintetizzati sotto forma di precursori inattivi (proenzimi, zimogeni) e attivati attraverso la rottura di specifici legami peptidici; il taglio proteolitico è la rottura di legami peptidici per azione di specifici enzimi, le proteasi. Meccanismi di azione enzimatica (10) La catalisi da ioni metallici ha come esempio la DNA polimerasi. Le proteasi sono enzimi che catalizzano la scissione idrolitica di un legame peptidico. Vi sono 4 famiglie: serin proteasi, metallo proteasi; cisteina proteasi; aspartico proteasi, altre. Le proteasi creano un potente nucleofilo che attacchi al carbonio carbonilico del legame peptidico, la forma della curva ci suggerisce che la reazione proceda in due fasi. La triade catalitica della serin proteasi: Asp 102; His 57; Ser 195. Altre strategie per idrolizzare il legame peptidico: generare un forte nucleofilo per attaccare il carbonio carbonilico del legame peptidico. Coagulazione (11) Emostasi: insieme di processi (biochimici e cellulari) atti ad arrestare una emorragia; la coagulazione è solo una parte dell'emostasi; la coagulazione è solo una parte dell'emostasi. Vasocostrizione Emostasi primaria --> tappo piastrinico. Cascata coagulativa Fibrinolisi Le piastrine riconoscono e legano il collagene, adarendovi, si attivano. Le piastrine si attivano cambiando forma, modificano la composizione lipidica di membrana (carica -), liberano molecole che attivano altre piastrine. Formato il tappo termina l'emostasi primaria. Le piastrine cariche negativamente sono la superficie ideale su cui s'innesca la cascata coagulativa. I fattori vitamina K dipendenti possiedono numerosi residui GLA (acido gamma carbossiglutammico). La cascata coagulativa è attivazione sequenziale per i tagli proteolitici; zimogeni --> enzimi attivi. 2 tipi di fattori della coagulazione partecipano assieme alla cascata; enzimi serin proteasici e cofattori proteici. Controllo dell'attivazione delle Serin Proteasi: Si genera una nuova estremità N-term (+) che si legherà con un ac. Aspartico (-) inducendo numerose modificazioni conformazionali. Zimogeno ---proteolisi---> serin proteasi. Il complesso TF/FVIIa inizia la coagulazione (nb. a significa attivo). Nella coagulazione enzima, cofattore e substrato spesso hanno dimensioni simili. Carboidrati (12) Molecole più abbondanti sulla terra, hanno numerose funzioni: energetico, strutturale, funzionale. Possono essere poliidrossi aldeidi o poliidrossi chetoni. La forma ciclicla è la più comune in ambiente acquoso. Forma alfa: OH sotto. Forma beta: OH sopra. Reazione di maillard a temperatura 140-180 °C; in 3 fasi: 1) Interazione tra C carbonilico di uno zucchero e N-term di una proteina. 2) Formazione di composti con proprieta organolettiche nuove. 3) Formazione di molecole che conferiscono il colore bruno.
