28/08/2023 20:55:30 La trascrizione negli eucarioti Rispetto ai procarioti abbiamo 3 #RNAPol., ma il processo di trascrizione è identico. In vivo negli eucarioti il DNA è organizzato in cromatina e prevede l'intervento di diversi attori; in vitro avviene usando uno stampo di DNA senza istoni, non organizzato in cromatina. La #RNAPol2 è quella principale, dato che sintetizza mRNA, localizzta nel nucleoplasma e promossa da BRE, TATA box, Inr e DPE. Promotori della Pol 2 in eucarioti superiori Con #CORE si indica l'elemento centrale del promotore ossia il tratto di DNA indispensabile viene ad essere riconosciuto dai fattori di trascrizione, fondamentale per far avviare la trascrizione stessa. Ogni sequenza viene indicata con un nome specifico e la posizione relativa al sito d'inizio trascrizione (+1). Il #promotore eucariotico contiene la sequenza Inr, che sta per iniziatore, che prende il +1, generalmente è un adenina. La sequenza a -26, viene chiamata #TATAbox, catalizzta dalla sequenza conservata TATAAA; permette di venir riconosciuta da una proteina specifica, la #TBP (TATA binding protein), componente delle subunità che costituiscono il fattore di trascrizione TFIID. Accanto a TATA box si ha, spesso, la sequenza #BRE, che permette il legame ad un altro fattore basale, ossia il #TFIIB. A valle del sito si trovano anche altri elementi, come il DPE, tipico di promotori che non hanno #TATAbox riconosciuta sempre dalla D. 50% dei promotori hanno TATA box, l'altra metà ha promotori detti #TATALex. Gli elementi DCE possono essere presenti in più copie nei promotori che hanno il TATA box. Nei promotori sono presenti delle regioni dinucleotidiche, GC, chiamate isole CPG; più del 50% dei promotori umani contiene queste sequenze dinucleotidiche, molto importanti se metilate, perché vanno ad avere un ruolo fondamentale nella regolazione dell'espressione genica. Oltre a questo #CORE, centrale, che va da 40 a 60 nt a monte e a valle del sito di inizio, il promotore contiene #SequenzeProssimali fino a 200pb a monte. Quelli a 10.000 nt dal sito d'inizio, riconosciuti da proteine che regolano la trascrizione stessa e di attivarla, sono detti #Enhancer o elementi distali. Inizio della trascrizione della RNA pol 2 in vitro Non si ha organizzazione in cromatina. TBP (che riconosce #TATAbox), fa parte del TFIID, fattore di trascrizione generale che consta di 12 subunità. Alla TPB sono associati i TAF (TPB associated factors), delle proteine che si associano alla TBP e costituiscono il D. TFIID, grazie a TBP, si associa a TATA box, è il primo fattore che si lega al DNA e al promotore; dopo di lui vengono reclutate due proteine TFIIA (con 3 subunità) e TFIIB (1 subunità). A serve a stabilizzare il legame tra B e TBP; B lega la proteina TBP, si associa al complesso ed aiuta a reclutare la #RNAPol. Il complesso TBP-DNA-TATA box #TBP è una proteina molto importante perché, avendo una regione a Beta-foglietto, riconosce e lega il #TATAbox ed interagire col solco minore, aprendo il DNA e portanto ad una torsione di 180°, creando una piattaforma utile al reclutamento gli altri fattori; il box ha sequenze TA, quindi l'appaiamento ha solo 2 legami H, facilmente separabili. Il complesso TFIIB-TBP-TATA box Viene poi reclutato #TFIIB, che interagisce sia con TBP, ma anche con #RNAPol., rappresentando il ponte tra questi due elementi; questo è importante perché così facendo la polimerasi è posizionata correttamente sul sito d'inizio. Questo legame è asimmetrico, perché si posiziona solo su uno dei due lati. A completare il complesso di pre-inizio vengono reclutate altre due proteine #TFIIH e #TFIIE, la prima è aiutante della seconda nel complesso di pre-inizio, mentre H è un'altra proteina importante perché attività elicasica, in particolare, apre il DNA formando la bolla di trascrizione, promuovendo l'apertura del promotore. #TFIIH ha anche un'importante funzione: quella che viene chiamata coda CTD, prerogativa specifica della #RNAPol2 eucariotica. Non da confondere con alfa CTD (carbossi terminal domain) polimerasica procariota. Qui la coda è sempre un'estremità carbossi terminale, ed è costituita da un eptapeptide ripetuto tante volte. TFIIH ha attività chinasica, difatti fosforila CTD, determinando il distacco e la dissociazione della #RNAPol2 dal promotore permettendole di abbandonare il promotore e di entrare nella fase di allungamento, non solo, ma anche di reclutare i fattori necessari alla maturazione del mRNA (capping, splicing e poliadenilazione). Il complesso di pre-inizio in vivo La situazione qua si complica, si a che fare con la cromatina e ciò necessita che intervengano altri fattori, ossia gli #attivatori, proteine regolatrici. Questi regolatori riconoscono sequenze specifiche del DNA e aiutano a reclutare la polimerasi al promotore e a stabilizzare il legame stesso. Questo reclutamento è mediato da una serie d'interazioni tra gli attivatori legati al DNA e fattori di modificazione della cromatina come, per dirne una, HAT (istone acetiltransferasi), enzimi che modificano le code istoniche. Altro esempio sono i rimodellatori della cromatina. Il complesso del mediatore associato alla coda CTD viene a fare da ponte tra attivatori e #RNAPol e i fattori di trascrizione; il complesso del mediatore viene definito un coattivatore, che crea un pponte tra gli attivatori trascrizionali legati al DNA, RNA Pol. e i fattori i trascrizione, permettendone l'assemblaggio. Complesso del mediatore Sono più di 20 proteine, non ancora caratterizzate; un grosso complesso, che interagisce con la coda CTD della #RNAPol e fa da ponte tra attivatore e complesso di pre-inizio, aiutandone l'assemblaggio (co-attivatore). Modello di allungamento su sequenze organizzate in nucleosomi assistito da FACT O come risolve il problema degli istoni la RNA pol? In vivo il DNA è organizzato in nucleosomi, dove gli chaperoni, che reclutano e legano gli istoni stessi, smantellandoli, rendono libero il DNA per essere trascritto ad opera della #RNAPol2. In particolare il #FACT, uno chaperone costituito da 2 proteine, SSRP1 e Spt16; questo eterodimero smantella i nucleosomi che si trovano davanti ad #RNAPol. in modo da liberare il DNA e renderlo pronto per essere trascritto dalla stessa. Le subunità H2A e B legano #FACT, mentre H3 e H4 legano SPT6. Queste subunità smantellano il nucleosoma, lasciano che venga letto dalla RNA pol e poi lo riassemblano. Fase di allungamento Grazie alla fosforilazione della coda CTD della pol 2 si entra nella fase di allungamento. La #RNAPol abbandona il promotore e avviene l'evasione del promotore e la polimerasi inizia a scorrere lungo il DNA, trascrivendo RNA. Eventi di maturazione di mRNA eucariotico 1. Capping 5' 2. Splicing 3. Poliadenilazione estremità 3' Nel caso del #capping la coda 5' è fosforilata, quindi ogni eptapetide ripetuto ha la serina fosforilata in posizione 5. Questo stato di fosforilazione coincide con quella che è la fase della trascrizione, in cui si passa da inizio ad allungamento (fosforilazione = segnale di evasione del promotore). In questa fase e coda vengono reclutati gli enzimi coinvolti ad andare a svolgere e aggiungere il cap 5', nelle primissime fasi della trascrizione, dopo che il nascente ha raggiunto una lunghezza di 20-40 basi. La successiva fosforilazione a livello della serina 2 recluta i fattori per lo #splicing. Man mano che l'allungamento avanza, la serina in posizione 5 viene defosforilata, mentre rimane solo quella in posizione 2; in questo grado di fosforilazione la coda va a reclutare gli enzimi necessari per la #poliadenilazione e il taglio del RNA. Capping RNA Servono 3 enzimi: 1. RNA trifosfatasi: rimuove il fosfato gamma in 5' del trascritto nascente. 2. Guaniltransferasi: trasferisce la guanina al 5' del nascente, catalizzando l'attacco nucleofilo del fosfato beta del nascente, che colpisce il fosfato alfa del GTP, creando un legame fosfato-fosfato liberando pirofosfato. 3. Metiltransferasi: modifica la guanosina aggiungendo un gruppo metile in posizione 7. Funzioni del CAP: 1. Protegge il terminale 5' del pre-mRNA dalle esonucleasi 5'-3'. 2. Aiuta a trasferire mRNA maturo nel citoplasma. 3. Assicura un coinvolgimento della traduzione, perché nel citoplasma si va a legare al CAP un fattore di inizio della traduzione, chiamato eIF4E, il quale scarta CBC e si lega al CAP; questo aiuterà mRNA e legarsi col ribosoma, nelle prime fasi di traduzione. Splicing mRNA è sottoposto alla rimozione degli introni e questo avviene quando la coda viene fosforilata anche in posizione della serina 2 (momento specifico di pieno allungamento ove avviene splicing). Argomento che verrà approfondito successivamente. Poliadenilazione e taglio mRNA Quando la polimerasi raggiunge l'estremità di un gene incontra e trascrive sequenze specifiche chiamate segnali di poliadenilazione. Quando questa sequenza viene trascritta, innesca il trasferimento dei fattori coinvolti nella poliadenilazione di mRNA. I fattori CstF e CPSF vengono traferiti sulla sequenza segnale di Poli A non appena #RNAPol trascrive il segnale di poliadenilazione. Questi due fattori sono importanti perché permettono il taglio del mRNA, in particolare: CPSF, stimolato da CstF, va a tagliare immediamente dopo il segnale di poliadenilazione e questo determina il rilascio di CstF, CPSF rimane associato alla sequenza aiutando il reclutamento di una Poli A polimerasi, detta PAP, che riconosce 3' creata dal taglio di CPSF e aggiunge tanti residui di adenina, creando un'estremità 3' con coda Poli A di 200 adenine. Funzioni della coda Poli A: 1. Regolano azione delle PAP. 2. Proteggono mRNA. 3. Aiutano il passaggio e esportazione di mRNA dal nucleo al citoplasma. 4. Importanti nella traduzione, interagiscono con eIF4G. Modelli per la terminazione della trascrizione 1. Modello a siluro: alla #RNAPol è associata una ribonucleasi 3'-5', detta siluro, con due nomi diversi; Rat1 (lievito) e Xrn2 (identificato nell'uomo). La Pol. una volta che trascrive la sequenza di Poli A, va a trasferire la coda e la sequenza su mRNA, che viene poi tagliata. Questo determina il trasferimento della ribonucleasi dalla RNA Pol. alla 5' del secondo messaggero. Quando mRNA senza CAP viene riconosciuto dalla ribonucleasi, lo inizia a tagliare. Quando la ribonucleasi, caricata sul trascritto della polimerasi, viene in contatto con l'enizma stesso, ne promuove il distacco, portando alla #terminazione. 2. Modello allosterico: si basa sul fatto che #RNAPol è altamente processiva lungo il gene, tranne che per quando incontra la coda Poli A, il che causa un cambiamento conformazionale che induce una #terminazione rapida e spontanea, a causa della ridotta processività. Anche qua il secondo mRNA viene degradato da una ribonucleasi 3'-5', secondo questo modello la dissociazione è dovuta al fatto che la #RNAPol, subisce cambiamento conformazionale a causa di enzimi che si trovano sulla coda, CtsF e CPSF, che una volta trasferiti dalla coda della polimerasi alla sequenza segnale Poli A, potrebbero indurre una modifica, abbassando la processività. Controllo trascrizionale negli eucarioti Il promotore della #RNAPol2 presenta un core che contiene l'iniziatore con il sito +1 d'inizio trascrizione, vari elementi a valle del sito stesso, la sequenza #TATAbox e la sequenza BRE adiacente. Questi elementi fanno in modo che il promotore sia riconosciuto dalla RNA polimerasi. Abbiamo poi elementi prossimali e elementi distali; i primi fino a 200pb dal promotore, i secondi anche 100kb di distanza, ed hanno la funzione di essere #attivatori o #repressori; quelli prossimali sono a loro volta riconosciuti da alcuni attivatori o repressori. Le loro sequenze specifiche sono organizzate in strutture chiamate box; un esempio è il CAAT box. riconosciuto dal fattore nfy; un altro è il GC box, riconosciuto da sp1, qua troviamo i geni housekeeping. Gli elementi distali hanno diverse funzioni; gli #enhancer funzionano da amplificatori e perciò hanno controllo positivo sulla trascrizione, ossia un incremento. Gli enhancer possono trovarsi anche a -10 o +10kpb, vengono ad avere lunghezza attorno alle 500pb e contengono 10-12 siti di legame per i fattori di trascrizione, sono riconosciuti da più di un attivatore. Sono anche detti #elementiCis, ossia si trovano vicino al gene che deve essere trascritto a RNA (promotori, enhancer, silencer, insulator, ecc...). Con #elementiTrans indichiamo i fattori di regolazione prodotti da regioni molto lontane rispetto al gene sui cui essi agiscono. Il complesso che si lega all'enhancer viene chiamato #enhanceosoma, lui può interagire con il mediatore facilitando il reclutamento della #RNAPol e di tutti i fattori necessari. Siccome gli enhancer sono sia a valle che a monte del +1, per funzionare devono formare un'ansa in modo di avvicinarsi ai coattivatori, funzionano entrambi gli orientamenti rispetto alla direzione di trascrizione. #Esoni = regioni che codificano per proteine. #Introni = regioni non codificanti. Gli isolatori (insulators) bloccano l'attivazione creata dagli enhancer Altri #elementiCis sono gli #isolatori; servono ad influenzare l'azione degli enhancer o silencer a loro vicini, impedendo l'attivazione o repressione di un gene da parte di questi due elementi. Perché funzioni deve essere posizionato in mezzo tra enhancer, o silencer, ed il promotore. 1. Enhancer senza isolatore può legarsi al promotore ed agire attivando la trascrizione. 2. In presenza di isolatore è impossibilitato a legarsi al promotore; non c'è comunicazione tra enhancer e promotore, la trascrizione si spegne. 3. Se ci sono più enhancer o silencer, ma solo 1 isolatore interposto tra questi ed il promotore, sarà isolato soltanto 1, l'altro attiverà la trascrizione. Sia nei procarioti che eucarioti, queste proteine, sia attivatori che repressori, hanno dominio di attivazione e di legame al DNA separati. I meccanismi del funzionamento degli #attivatori o #repressori non sono ancora ben note; si sa che sono dei dimeri, in questa forma ogni monomero ha un dominio di legame al DNA, a motivo elica-giro-elica (negli eucarioti non sono solo omodimeri, ma anche eterodimeri o monomeri. Abbiamo anche un dominio di dimerizzazione che consente al dimero di andare a dimerizzare. Struttura dei domini di legame al DNA degli attivatori e repressori trascrizionali eucariotici Oltre al motivo elica-giro-elica, possiamo avere proteine con omeodominio, domini a motivo a dita di zinco, motivo a cerniera di leucine, proteine elica-ansa-elica. Riconoscimento del DNA mediante omeodominio Le proteine che legano il DNA mediante #omeodominio sono fatte da 3 Alfa-eliche. La 2 e 3 formano un elica-giro-elica dove la 3 funziona da elica di riconoscimento. Con ser, arg, asn s'inserisce nel solco maggiore di DNA; a stabilizzare il legame abbiamo che alfa elica 1 presenta un residuo di Arg che interagisce col solco minore del DNA. Nel motivo a dita di zinco Abbiamo l'atomo di Zn coordinato con due His che appartengono all'elica di riconoscimento con 2 Cys che appartengono al dominio N-terminale a Beta-foglietto e Alfa-elica al carbossi- terminale; in questo modo l'elica di riconoscimento viene ad essere tenuta in posizione opportuna per il legame con il DNA (posizione data dall'interazione con Beta-foglietto, data grazie allo Zn che forma legami di coordinazione con due aa di riconoscimento e due aa del foglietto). Motivo a cerniera di Leucine Presenza di leucina ripetuta ogni 7 aa; questa disposizione fa in modo che nella struttura secondaria, le leucine siano esposte tutte sullo stesso lato. Ogni giro di Alfa-elica corrisponde a 3 residui e mezzo di aa; quindi, le leucine si trovano ogni due giri sullo stesso lato, rappresentando così il dominio di dimerizzazione. I dimeri dimerizzano grazie alle regioni ricche di L che instaurano tra loro una serie di legami idrofobici. C'è poi un dominio basico, costituito da aa basici, come Arg, Lys, fondamentali per legare il DNA; i dimeri sono uniti a livello delle leucine, a livello degli aa basici si forma una sorta di motivo a due dita che diviene il sito d'interazione con il DNA, in particolare col solco maggiore. Motivo elica-ansa-elica Abbiamo due monomeri costituiti da un'Alfa-elica poco più lunga ed una poco più corta; la differenza tra il classico elica-giro-elica è la presenza di un'ansa con una sequenza aa molto più lunga. Le due Alfa-eliche più brevi servono a far dimerizzare, mentre quelle lunghe si mettono a cavallo del solco del DNA, al fine di interagire con le basi. Le zone di riconoscimento del DNA sono anche qui costituite da aa basici. Gli attivatori reclutano anche modificatori e rimodellatori dei nucleosomi constentendo al complesso trascrizionale di legarsi al promotore o iniziare la trascrizione Gli attivatori vanno ad interagire con i complessi di rimodellamento e modificazione della cromatina, questi contengono enzimi che modificano chimicamente le code istoniche, come HAT. Il DNA in vivo è avvolto ai nucleosomi, quindi non sempre il promotore è accessibile; gli attivatori reclutano gli attori del complesso di rimodellamento della cromatina e gli enzimi modificatori di code istoniche, riuscendo a rendere più accessibili i promotori rilassando la cromatina. Ad esempio reclutando l'istone acetil transerasi, che va ad acetilare le code istoniche sui nucleosomi, permettendo alla cromatina diventa eucromatina. Un'altra possibilitàè il reclutamento del complesso di rimodellamento per far scivolare localmente il DNA liberando il promotore. Funzionamento dei repressori eucariotici 1. L'attivatore si sovrappone col sito di legame per il repressore; quando il repressore si lega al suo sito impedisce all'attivatore di legarsi al DNA (competizione). 2. Il repressore viene a mascherare i domini di attivazione dell'attivatore, inibendolo (inibizione). 3. Il repressore agisce direttamente con il mediatore, inibendo e bloccando il complesso sul mediatore; qua il repressore inibisce direttamente l'azione del mediatore (inibizione diretta). 4. Deacetilasi che fanno si che la cromatina diventi eterocromatina e la trascrizione viene bloccata direttamente (modifica delle code istoniche). Silenziamento di un gene mediante metilazione del DNA e modificazione degli istoni Per silenziare un gene esiste un'altra importante modifica; accanto al reclutamento di complessi di rimodellamento della cromatina e modificatori delle code istoniche, si possono silenziare i geni mediante metilazione. Il DNA viene metilato nelle #IsoleCpG, presenti a livello degli #enhancer, a livello del promotore anche in siti distanti dal punto di inizio della trascrizione. Queste regioni metilate possoono reclutare delle proteine che funzionano da repressori, a loro volta queste proteine possono silenziare ancora il gene reclutando istoni deacetilasi e complessi di rimodellamento della cromatina. Così la cromatina è in forma -etero ed è illeggibile. L'epigenetica regola l'espressione genica Questa metilazione viene ereditata grazie ad enzimi chiamati metilasi di mantenimento, che metilano la regione che dovrebbe essere metilata sul filamento neosintetizzato (come è sull filamento copia). Questo pattern di metilazione può venir ereditato come tratto epigenetico, pertanto innescato da diversi fattori ambientali (nutrizione della madre in gravidanza, inquinamento, smog, fumo, ecc...) Splicing Avviene negli eucarioti e fa parte dei processi di maturazione a cui il mRNA neosintetizzato viene sottoposto nel citoplasma per diventare maturo. Post maturazione, il mRNA presenta alle due estremità **5' 3'**delle regioni UTR (untranslated), cioè non tradotte. Queste sono fiancheggiano la regione CDS, che rappresentano la regione codificante, quella che viene tradotta in proteina. Gene eucariotico mRNA sintetizzato ha sia #introni che #esoni, dopo la maturazione, le estremità UTR rimangono, mentre gli esoni vengono avvicinati, costituendo la regione CDS. La chimica dello splicing Quali sono le sequenze che troviamo alla fine tra introni ed esoni, fondamentali per la reazione di splicing?
