Struttura chimica degli acidi nucleici 1. DNA e RNA sono catene polinucleotidiche che: -nel caso del RNA possono avere migliaia di nt -nel caso del DNA milioni di nt 2. Gli nt sono quindi unità fondamentale del DNA e RNA e hanno 3 componenti: -zucchero pentoso (deossiribosio o ribosio) -una base azotata -uno o più gruppi fosfato Zucchero + base azotata = nucleoside, ossia quando non è incorporato all'interno di un acido nucleico, ed assume la forma di #NucleosideTrifosfato. Quando è dentro una catena, prende il nome di #Nucleotide ed ha 1 solo gruppo fosfato. I gruppi fosfato sono massimo 3 e sono chiamati con una lettera greca a partire da alfa (il più vicino), beta (il secondo) e gamma (il più lontano e terzo). Strutture dei componenti chimici dei nucleotidi La prima parte è lo zucchero pentoso, molecola con 5 atomi di carbonio. La seconda parte del nucleotide è la base azotata, molecola di struttura ciclica legata al carbonio 1' dello zucchero. Troviamo 4 basi nel DNA: 1. Adenina, purina, doppio anello. 2. Guanina, purina, doppio anello. 3. Timina, pirimidina, singolo anello; in RNA è Uracile. 4. Citosina, pirimidina, singolo anello. Le basi sono legate allo zucchero tramite legame N-Beta-Glicosidico, tra carbonio 1' dello zucchero e l'azoto; il beta indica l'orientamento del legame rispetto all'anello del pentoso (va verso l'alto). L'ultima porzione del nucleotide è il gruppo fosfato, legato al C5', questo legame si chiama #Fosfoesterico. Nomenclatura Le unità strutturali (gli nt), per essere specifici, sono dette: 1. Nel DNA: deossiribonucleotidi. 2. Nel RNA: ribonucleotidi. Formazione del legame nucleotidico mediante condensazione La formazione di un nucleotide e la formazione dei due legami, ovvero glicosidico e fosfodiesterico, avviene mediante la perdita (condensazione) di due molecole di H2O. I legami fosfodiesterici negli acidi nucleici I singoli nucleotidi devono essere legati per formare il polimero, che viene chiamato polinucleotide (se nt > 50) o oligonucleotide (<=50 nt). Come sono uniti i nucleotidi? Mediante legame fosfodiestere (legame #Fosfo2esterico); ossia tra gruppo fosfato 5' del nucleotide e il gruppo OH al 3' del nucleotide che gli sta "sopra". Il nome reale è legame 3'-5' fosfodiestere. Questo dona direzionalità alla molecola, ossia 5'-3' ma anche 3'-5'. Struttura fisica del DNA: doppia elica e parametri strutturali La struttura a doppia elica è formata da due filamenti, con legami tipo "scala a pioli" costituiti da legami idrogeno, che qua prendono il nome di appaiamenti di #WatsonCrick, specifici in base alla sequenza: guanina con citosina, timina/uracile con adenina. La doppia elica ha un diametro di 20 Angstrom (2 nm) e un giro d'elica di 34 Angstrom (3,4 nm) parti a 10,5 coppie di basi; avvolgimento destrorso. Gli appaiamenti richiedono che le basi si trovino nella forma tautomerica preferita (quella corretta). La struttura a doppia elica Non è affatto regolare; si possono ben vedere due solchi spiraliformi lungo il decorso dell'elica: il maggiore è 22 A, quello minore è 12 A. Le proteine che interagiscono col DNA lo fanno a livello del solco maggiore, più ampio e solito accogliere strutture ad #AlfaElica delle proteine che interagiscono con il DNA stesso. I filamenti hanno quel che viene chiamato #OrientamentoAntiParallelo. La stabilità della doppia elica è assicurata da 2 tipi d'interazione: 1. Appaiamento tra basi complementari. 2. Impilamento delle basi, implicando la presenza di una serie di forze attrattive tra le varie coppie adiacenti che aumentano la stabilità della doppia elica (spesso sono delle Van der Walls). Modello del DNA in forma B La forma B è quella presente in vivo e descritta sinora. Non è l'unica possibile. 1. La forma A prevede: maggiore angolatura delle basi, grandezze diverse, coppie di basi per giro d'elica sono 11 contro le 10,5 della B; ha forma più tarchiata rispetto a B; il senso è sempre destrorso. Il DNA è così in bassa umidità, in vitro; in vivo è un'eccezione che avviene quando un duplex che contiene 1 o 2 filamenti di RNA assumono forma A, o 1 di DNA ed 1 di RNA , il che rende impossibile all'altro filamento essere in forma B. 1. La forma Z prevede: senso elica sinistrorso; diametro di 18A e giro d'elica di 46A, ha struttura più lunga ed allungata; ha insolito andamento a zig-zag, grazie alla particolare conformazione del legame glicosidico che risulta essere syn o anti, che indica l'orientamento rispetto al legame glicosidico tra guanina e zucchero. In B ed A è anti. Il DNA Z è stato osservato in vitro, studiando DNA di sintesi, in cui C e G; in particolare nella stessa molecola possono esserci tratti in Z e altri in B. Il cambiamento di conformazione tra Z e B è determinato da estrusioni a livello della giunzione della timina e adenina rispettivamente. DNA intrisecamente curvo Il realtà il DNA ha una curvatura instriseca: la vicinanza e alternanza delle coppie A-T/A-T crea dei ripiegamenti della nostra doppia elica. Nello specifico, A-T verso il solco minore, mentre G-C ha tendenza inversa. Il DNA contiene, 2 o 3 paia di basi A-T consecutive con certa periodicità, i piccoli angoli di ripiegamento si sommeranno, producendo curvatura dell'asse della doppia elica piuttosto apprezzabile. DNA tripla elica Osservata in vitro, la struttura a #TriplaElica, è formata da DNA duplex di 20-30 coppie di basi aventi un filamento di sole purine accoppiato con un filamento complementare di sole pirimidine. Si forma una tripla elica, con una terza catena polinucleotidica più corta, composta da solo pirimidine, complementare alla sequenza purinica del duplex. I tipi d'interazione tra la terza catena ed il duplex sono sempre legami idrogeno, diversi da quelli di Watson-Crick, che prendono il nome di #InterazioniDiHoogsten. Quartetti di G (tetraplex) Si forma tra 4 tratti di DNA o RNA a singolo filamento che contengono ciascuno 3 o più G consecutive. I 4 tratti di G si trovano sullo stesso piano e formano delle interazioni, anche in questo caso si parla di legami di Hoogsten. Osservato in laboratorio studiando i telomeri, ricchi di elementi G, hanno propensione a formare tetraplex. Palindromi e sequenze ripetute ed invertite Altre strutture secondarie: palindromi e sequenze ripetute e invertite. Un #Palindromo può essere letto in entrambe le direzioni ed avere lo stesso significato; in bio molecolare, abbiamo due sequenze ripetute adiacenti ed una intera sequenza che è ripetuta nel filamento sottostante. Se questa sequenza ripetuta ed adiacente viene interrotta da qualche base, si chiama #SequenzaRipetutaInvertita. Se questa sequenza Rip-Inv. la troviamo su DNA singolo filamento o RNA, prende il nome di forcina (stem-loop). Le proprietà termiche del DNA: la denaturazione reversibile Il DNA a doppia elica, o anche RNA sono molto viscose a pH 7 e 25°. A temperature superiori a 80° la viscosità diminuisce bruscamente, indicando che il DNA ha subito un cambiamento fisico, che altro non è se una denaturazione o fusione della doppia elica di DNA o RNA. La denaturazione distrugge i legami di WC tra le basi appaiate e le interazioni deboli di VDW. Quando si torna poi a temperatura ambiente, ed i filamenti si #Annealing. Denaturazione e annealing sono processi reversibili. Assorbimento della luce UV da parte del DNA Il DNA ha valore di assorbanza del DNA a T ambiente di 260nm, perché il DNA ha massimo di assorbimento dei raggi UV a questo valore, dovuto agli anelli che costituiscono le sue basi. Riscaldando la soluzione e monitorando l'assorbanza, si può notare che aumenta fino ad arrivare ad un plateau. Quando il DNA è impacchettato e le basi impilate, diminuisce assorbanza, questo è detto effetto #ipocromico; il contrario, ossia il DNA si strotola ed aumenta l'assorbanza, è detto effetto #ipercromico. Topologia del DNA e DNA topoisomerasi Superavvolgimenti Il DNA cellulare deve essere estremamente compattato e possedere un livello di organizzazione molto elevato dal punto di vista strutturale. Dunque, può avvolgersi su stesso ulteriormente, formando #superavvolgimenti, compiendo un'ulteriore torsione attorno al suo asse centrale. Forme di Writhe 1. #Interwound (writhe plectomico), asse longitudinale della doppia elica è avvolto su se stesso. 2. #Toroide (spirale), asse longitudinale della doppia elica è avvolto come attorno ad un cilindro. Linking number I superavvolgimenti sono aspetti intrinseci della struttura terziaria di DNA. Il #LinkinNumber è una misura del superavvolgimento del DNA. 1. Il numero di legame (LK) è una proprietà topologica del DNA, che può essere modificata solo dalla rottura e riunione dell'ossatura di uno o entrambi i filamenti del DNA; avviene attraverso le #Topoisomerasi. 2. Si usa l'equazione LK = Tw + Wr. 3. Tw è la torsione, il numero di giri della della doppia elica rispetto all'asse centrale; devo dividere il numero di coppie del DNA d'interesse per il numero di coppie di basi per giro, che per il DNA in forma B è di 10,5. 4. Wr, contorsione, il numero di volte che l'asse centrale della doppia elica si ripiega su sè stessa. Superavvolgimenti positivi e negativi I DNA circolari raramente sono rilassati (ma nemmeno quelli lineari), e generalmente sottoposti a tensione che li porta a sviluppare superavvolgimenti, che possono essere di due tipi: 1. Negativi, rotazione in senso opposto a quello di avvolgimento del duplex; DNA anteriore incrocia il segmento che sta dietro da dx verso sx. 2. Positivi, rotazione nella stessa direzione a quello di avvolgimento del duplex; DNA anteriore incrocia il segmento che sta dietro da sx verso dx. Il DNA cellulare normalmente è superavvolto negativamente, un meccanismo d'immagazinamento dell'energia meccanica libera (tensione) che aiuterà poi quesi processi che necessitano separazione dei due filamenti (replicazione o trascrizione). Le regioni di DNA superavvolte negativamente hanno la tendenza a disavvolgersi localmente, perciò la separazione dei due filamenti è favorita nel DNA avvolto negativamente. I nucleosomi introducono superavvolgimenti negativi sul DNA degli eucarioti DNA eucariotico avvolto attorno alle proteine istoniche per formare i nucleosomi, che presentano così dei superavvolgimenti negativi di forma toroide. Struttura del cromosoma mitotico Il DNA è organizzato in vere e proprie anse di #Cromatina, le cui estremità sono fissate ad una struttura proteica, in queste anse sono presenti i nucleosomi, ed ogni ansa presenta un certo grado di superavvolgimento, analizzabile con il Linkin number. Domini del DNA superavvolto nel cromosoma di E.coli Il DNA batterico non è mai rilassato, il DNA forma delle anse tenute ferme da proteine strutturali ed ogni ansa ha una certa topologia; si presenta anche come DNA curvato, dato da sequenze ripetute di coppie di basi uguali. Effetti della replicazione e della trascrizione sul superavvolgimento del DNA Si possono creare anche dei superavvolgimenti positivi per effetto della replicazione o della trascrizione. Per capire perché immaginiamo che il DNA sia una corda composta da due filamenti avvolti uno sull'altro; entrambe le estremità sono tenute ferme ma una viene srotolata per un pò e aperta, il DNA subisce questa tensione ma non avendo la possibilità di scaricare questa energia, si vanno a formare dei superavvolgimenti positivi a valle dell'apertura/bolla di replicazione o trascrizione. Questo aggrovigliamento non può essere risolto da solo perché il DNA è maggiormente aggrovigliato e il superavvolgimento positivo ha tendenza a separarsi spontaneamente. Per rimuoverlo sono necessarie le #topoisomerasi. DNA topoisomerasi Servono a modificare il Linkin number, rompendo e riunendo l'ossatura di uno o entrambi i filamenti di DNA. Esistono di due classi: 1. Topoisomerasi 1, modificano il valore di LK di un'unità alla volta, determinano la rottura temporanea di un singolo filamento di DNA duplex, consentendo al filamento integro di passare attraverso la rottura dell'altro prima che il nick venga saldato. 2. Topoisomerasi 2, modificano il valore di LK di 2 unità, determinano una rottura temporanea dei due filamenti del DNA attraverso la quale fanno passare il duplex integro, prima che il taglio venga rinsaldato; richiedono energia di idrolisi dell'ATP per consentire cambiamenti conformazionali. Meccanismo d'azione della topoisomerasi 1 Taglia uno dei due filamenti, rompendo un legame fosfodiesterico, fa passare poi il filamento integro attraverso la rottura/nick e, una volta passato, la rottura vien rinsaldata sempre dalla topoisomerasi. Funziona attraverso un meccanismo detto a ponte, composta da diverse subunità che una volta tagliato uno dei due filamenti, vanno ad afferrare le due estremità della rottura, tenendole vicine e creando uno spazio sufficiente per far passare il filamento integro. Avvenuto il passaggio l'enzima avvicina le estremità, così che la topoisomerasi rinsaldi il legame fosfodiesterico. Meccanismo d'azione della topoisomerasi 2 Molto simile alla precedente, anche se vengono tagliati entrambi i filamenti e fa passare la doppia elica intera, avvicinando le estremità e rinsaldandole. Usa idrolisi dell'ATP. Il meccanismo viene detto a doppio cancello. Le topoisomerasi decatenano, districano e snodano il DNA Nei procarioti esiste una particolare topoisomerasi 2 detta #DNAGirasi che, invece che rimuovere, aggiunge superavvolgimenti negativi, perché facilita la denaturazione della doppia elica per replicazione e trascrizione del DNA stesso. Le topoisomerasi hanno anche altre funzioni: 1. Concatenano e decatenano DNA circolari chiusi, introducendo una rottura su una delle due molecole, sul doppio filamento. 2. Stessa cosa possono fare le topoisomerasi 1, purché una delle due molecole abbia una regione a singolo filamento. 3. Le topoisomerasi 2 separano molecole di DNA molto lunghe e attorcigliate, che si verificano spesso durante la replicazione dei cromosomi eucariotici. 4. Altre situazioni più o meno complesse in cui va districato DNA. Le topoisomerasi tagliano il DNA usando come intermedio una tirosina covalentemente legata al DNA Entrambe le topoisomerasi utilizzano un residuo di tirosina presente nel loro sito attivo. La 1 ha una subunità e la 2 ne ha due. La topoisomerasi con il residuo di tirosina, grazie al suo gruppo OH fa un attacco nucleofilo sul filamento di DNA a livello del legame fosfodiesterico, rompendolo e creando un nuovo intermedio covalente. La formazione di questo intermedio covalente viene poi dopo ad essere colpito dall'estremità 3'OH liberata, che fa un attacco nucleofilo su questo legame fosfotirosinico; in questo modo libera l'enzima che può andare a colpire un altro filamento e la rottura viene rinsaldata. Struttura del RNA Ha diverse caratteristiche: 1. Costituito da un singolo filamento. 2. Anche RNA ha una direzionalità. 3. Lo zucchero è il ribosio con un OH in posizione C2. 4. La timina nel RNA è sostituita dall'uracile che mantiene la stessa capacità di appaiamento con l'adenina formando due legami idrogeno (unica differenza è l'assenza del metile in posizione 5). Caratteristiche del RNA 1. Ribosio. 2. Uracile. 3. Singola catena polinucleotidica. Funzioni RNA: 1. mRNA. 2. tRNA . 3. rRNA. 4. Regolatore microRNA/snRNA. 5. Enzimatica (nei ribosomi. Caratteristiche della doppia elica di RNA Nonostante sia singolo filamento (e possa formare comunque eliche a doppio filamento), essendo molto flessibile si possono formare strutture secondarie a stem-loop o forcina, regioni che creano delle biforcazioni e anse interne dove le basi non sono appaiate. Le strutture secondarie del RNA, quindi, sono piuttosto variegate. Appaiamento delle basi G:U nel RNA Nel RNA ribosomiale gli accoppiamenti GU e GA sono più abbondanti. GU è appaiamento insolito, dove si formano due legami idrogeno tra la posizione O in posizione C6 della guanina e H in posizione N3 dell'uracile e tra H in posizione N1 della guanina e O in posizone C2 dell'uracile. Pseudonodi Avendo la molecola una certa flessibilità, essendo a singolo filamento, possiamo avere regioni, a forcina, che hanno nell'ansa delle basi disponibili, possono andare ad appaiarsi con sequenze complementari non contigue, creando strutture più o meno complesse chiamate #Pseudonodi. Tripletta di basi U:A:U Si possono avere triplette di basi, sempre tramite legami H, che coinvolgono 3 basi appunto. Molto frequente la tripletta UAU, per esempio nel tRNA. Qui si creano delle strutture terziarie in virtù della flessibilità del RNA stesso, che si piega e crea strutture piuttosto complesse. Struttura del genoma, cromatina e nucleosoma Genomi procariotici ed eucariotici 1. I geni sono segmenti di DNA che contengono il codice per una proteina specifica e, quindi, contengono tutte le informazioni per codificare/specificare/produrre una specifica proteina. 2. I cromosomi sono strutture all'interno delle cellule che contengono i geni di un organismo. 3. Il cromosoma contiene un numero variabile di geni in base all'organismo. 4. Il numero di cromosomi può essere differente, umani 23 coppie per 46 cromosomi totali. Il cromosoma può essere lineare o circolare Nei procarioti è normalmente circolare, anche se vi sono eccezioni come l'agrobacterium, uno dei pochi ad essere lineare. Confronto tra cellula eucariotica e procariotica La procariota è più piccola, con diametro di 1 micrometro; presenta un DNA non contenuto nel nucleo ma organizzato in una struttura chiamata #Nucleoide, che è circolare e comprende anche dei plasmidi. I #Plasmidi sono DNA circolari di piccole dimensioni, indipendenti dal cromosoma batterico e che non sono fondamentali per la crescita della cellula ma forniscono proprietà aggiuntive per la crescita, resistenza, resilienza. La cellula batterica ha un solo cromosoma ed è per questo detta #Aploide. L'eucariota è una cellula #Diploide, quindi si hanno due copie per ogni cromosoma, 1 dalla madre ed 1 dal padre, parliamo quindi di cromosomi #Omologhi. Il DNA è dentro il nucleo. Non tutte le c. eucariote sono diploidi ma ci sono delle eucariotiche aploidi, come spermatozoii e uova. La grandezza del genoma viene indicato in megabasi (1 megabase = 1 milione di paia di basi). Quello che sorprende è il fatto che organismi che dal punto di vista della complessità non sono similari, abbiano grandezza del genoma simile; organismi più semplici hanno un numero di geni minore rispetto a organismi più complessi. La densità genica rappresenta il numero di geni all'interno di una megabase di DNA e viene ottenuta dividendo la grandezza del genoma per il numero approssimativo di geni. La densità genica diminuisce all'aumentare della complessità dell'organismo eucariotico, per due fattori: 1. I geni eucarioti hanno dimensioni superiori, a causa della presenza di introni. 5% esoni, 95% introni; gli introni andranno rimossi mediante splicing durante la #Maturazione del pre-mRNA. Nei procarioti non abbiamo introni, quindi massima densità genica. 1. Il DNA esistente tra i geni è in quantità elevata; a livello del DNA vi sono diverse #SequenzeIntergeniche che non sono strettamente correlate con i geni stessi. I geni che codificano per RNA funzionale servono per la sintesi delle proteine. Gli #Pseudogeni derivano da un'infezione virale che ha inserito nel DNA, tramite trascrittasi inversa, geni che non si attiveranno mai, dal momento che sono privi di sequenze regolatrici. Le sequenze a basso numero copie sono poco ripetute all'interno del genoma e non si conosce la loro funzione. Gli #ElementiInterspersi sono soprattutto #Trasposoni, ovvero sequenze di DNA che da una regione si spostano ad un'altra in maniera casuale, lasciando una copia originaria di sè nel punto da cui si sono spostati. Le #RipetizioniInTandem, ovvero DNA satellite sono suddivisi in: minisatelliti (sequenze di 10-15 pb ripetute anche 1000 volte nel genoma) e microsatelliti (segmenti di 2-6 pb ripetuti fino a 100 volte consecutive). La presenza di sequenze intergeniche va a diminuire la densità genica che si trova a livello del DNA. Impacchettamento del genoma batterico e del DNA eucariotico Il nucleoide non è piccolo, ma va a riempire una parte dello spazio intercellulare ed è organizzato in modo tale che il DNA circolare si organizzi in circa un centinaio di anse, di lunghezza 40Kpb, dal punto di vista topologico, avranno un proprio Linkin number. Cambiamenti della struttura della cromatina Nel caso eucariotico, il DNA è contenuto nel nucleo, il materiale genetico viene a costituire, nei nuclei, la #Cromatina o massa cromatinica. La cromatina subisce dei cambiamenti molto vistosi durante il ciclo cellulare (interfase costituita da G1, S e G2). Durante l'interfase: Le molecole di DNA eucariotico sono organizzate a formare delle anse di 30-100Kpb, ancorate alla matrice cellulare; ogni ansa ha ulteriori livelli di organizzazione strutturale/compattazione che vanno da una fibra da 10nm ad una da 30nm. La fibra da 10nm è avvolta attorno a delle proteine istoniche, viene chiamata a collana di perle; se presente una proteina #H1, la fibra si può ulteriormente complessare, fino a formare il solenoide, con 6 nucleosomi per giro, questa viene chiamata anche 30nm. La matrice nucleare in interfase è un reticolo insolubile di varie proteine scheletriche e nel DNA esistono sequenze specifiche che gli consentono di ancorarsi alla matrice nucleare stessa durante l'interfase, in particolare le #Topoisomerasi2 e le #ProteineSMC. Durante la mitosi: I cromosomi si compattano ancora di più in quelli che sono i tipici cromosomi mitotici e anche in questo caso è mantenuta una struttura secondaria di anse cromatiniche, con i nucleosomi, di 30100Kpb, che sono ancorati però ad una vera impalcatura proteica che attraversa il cromosoma e non ad una matrice. L'impalcatura contiene le topoisomerasi 2 e le condensine, che servono a far condensare il DNA, e anche in questo caso il DNA contiene le sequenze specifiche per farlo ancorare a questa impalcatura tipica dei cromosomi mitotici. La cromatina interfasica ha diversi gradi di condensazione del materiale genetico In base al fatto che il DNA deve essere replicato o trascritto può avere diverse forme. #Eucromatina è la forma più sparpagliata della cromatina, ed appare come un piatto di spaghetti, sinonimo di minor organizzazione rispetto al cromosoma mitotico e quindi alti livelli di espressione genica. #Eterocromatina è quando le fibre sono più condensate è compatte, sinonimo di ridotta espressione genica. L'eterocromatina può essere divisa in 2 categorie: 1. Costitutiva: riguarda regioni del genoma che non sono codificanti e quindi ha ruolo strutturale, come ad esempio i #Centromeri. 2. Facoltativa: riguarda regioni del DNA che codificano per proteine, come ad esempio una proteina che può essere espressa in un tessuto muscolare ma non uno adiposo. Nella realtà ci sono regioni miste, in cui si hanno entrambi i tipi. Cromosoma mitotico Il cromosoma mitotico contiene due filamenti, chiamati cromatidi fratelli, che si ottengono dopo che il DNA è stato replicato; questi due #CromatidiFratelli sono tenuti assieme da una regione che si chiama centromero. Ciascun cromatidio contiene due telomeri, un centromero e più #OrigineDiReplicazione. Le origini di replicazione sono generalmente posizionate ogni 30-40Kpb e sono molteplici e posizionate in regioni non codificanti del DNA, tuttavia, solo una si attiverà per avviare la duplicazione. I #Centromeri sono utili per tenere assieme i due cromatidi fratelli ma anche per consentire una corretta segregazione dei cromosomi omologhi post-replicazione. I centromeri si associano ad un complesso proteico, il #Cinetocore, che va ad unirsi con i microtubuli cellulari, consentendo una separazione dei cromosomi ai due poli della cellula. Nella maggior parte di eucarioti superiori i centromeri hanno dimensioni > 40 Kpb e contengono numerose sequenze ripetute. 1. Fondamentale che ogni cromosoma abbia un solo centromero, assicurando un solo cromosoma per cellula figlia. 2. Se i cromosomi non ci sono, si avrà che i cromosomi non segregano in maniera corretta e si avrà una segregazione casuale, una cellula sarà priva di cromosoma e l'altra ne avrà due. 3. Se si hanno due centromeri, si possono avere delle rotture del cromosoma con conseguente perdita di materiale genetico. Telomeri Vengono riconosciuti da proteine che hanno funzione di proteggere le estremità da rotture o danni e da altre proteine, le #Telomerasi; la telomerasi è una particolare DNA polimerasi, che replica il resto del DNA e anche il meccanismo è diverso rispetto a quello del resto del DNA. I telomeri presentano una sequenza ripetuta; il telomero non è tutto a doppia elica perché ha regione terminale al 3', lunga, che comprende anche centinaia di basi a singolo filamento. Questa estremità è ricca di 3G consecutive e il DNA telomerico, può, avendo 3 G consecutive, organizzarsi in strutture a quartetti di G, ripiegando su se stesso e le G che si trovano sullo stesso piano creano appiamenti di Hoogsten, che pare stabilizzano la struttura del telomero. Perché i cromosomi mitotici vengano a condensarsi durante la mitosi ha bisogno di una serie di proteine che fanno parte della famiglia delle SMC (Structural Maintenence of Chromosome). Nella profase la cellula si prepara alla mitosi; la membrana nucleare scompare ed i due cromatidi fratelli sono tenuti assieme dalla coesina. La coesina è un complesso proteico che lega regioni distanti di due cromatidi, è come un anello che si posiziona avvolgendo due cromatidi fratelli in regioni distanti, connettendoli al termine della fase S, in mitosi i due cromatidi sono già tenuti assieme. Da profase a metafase, interviene la condensina. Nella metafase iniziano a condensarsi, allineandosi a livello della piastra equatoriale, al centro della cellula. Nella metafase avviene la condensazione cromosomica; questa compattazione è possibile grazie all'intervento della condensina, che è un complesso proteico ad anello che viene a legare regioni diverse dello stesso cromatidio. Nell'anafase i cromatidi fratelli iniziano ad essere separati ai poli, la coesina viene tagliata mentre la condensina rimane legata a ciascun cromatidio, mantenendolo condensato durante l'anafase. Nella telofase i cromosomi sono meno condensati, si inizia a riformare la membrana nucleare intorno a ciascun pool di cromosomi e successivamente le condensine vengono rilasciate; post cito-chinesi, la cromatina è in uno stato meno condensato, ovvero quello tipico dell'interfase. Nucleosomi e proprietà strutturali e funzionali della cromatina Il DNA ha come primo livello di compattazione il nucleosoma, avvolto attorno ad un disco proteico, detto core proteico, lungo 147pb. Composto da 8 proteine istoniche, due copie di H2A, B, H3 e H4, 4 proteine istoniche in due copie ciascuna. Il DNA core è avvolto 1,65 volte all'ottamero istonico. Tra un nucleosoma e l'altro si ha un DNA linker, che ha una lunghezza variabile di 20-60pb. Grazie alla formazione dei nucleosomi si ha un compattamento del DNA di circa 6 volte rispetto alla sua lunghezza. L'ottamero è costituito dalle 4 proteine istoniche, che hanno peso in media dalle 11 alle 15 KDalton e sono ricche di residui amminoacidici come lisina ed arginina (20-24%). Il DNA è carico negativamente, in virtù dei gruppi fosfato che costituiscono lo scheletro zucchero-fosfato e viene favorito nell'interagire con le proteine istoniche, che hanno carica positiva. La H1 non fa parte dell'ottamero ma si lega al DNA linker. La maggior parte del DNA è impacchettato, ma ci sono sezioni volutamente strotolate ed legate a complessi proteici di trascrizione o replicazione. Componenti del core istonico Tutte e 4 le proteine hanno: coda N-terminale, estremità carbossi terminale e componente centrale comune, denominata #Histone-fold, ovvero il dominio di ripiegamento (regione conservata). 1. H3 e H4 si organizzano per formare tetrameri. 2. H2A e B si organizzano per formare un dimero. Il core proteico si assembla solo in presenza di DNA, le molecole di ciascun istone interagiscono sovrapponendo le une sulle altre, in particolare incrociando le due alfa-eliche centrali di ogni dominio histone-fold, creando la cosiddetta STRETTA DI MANO. Si formano in maniera indipendente due dimeri H2A e B, e un tetramero H3 e H4, poi in presenza di DNA il primo a legarsi è il tetramero e in un secondo momento si assemblano i due dimeri fino a formare il nucleosoma. Questo processo di assemblaggio non avviene in maniera autonoma, ma richiede delle proteine che sono dette #Chaperonine, ovvero proteine che controllano diversi intermedi con il DNA. Le code non contribuiscono al legame con il DNA, ma sono importanti perchè se modificate chimicamente vengono ad alterare lo stato della cromatina. 1. Le code degli istoni H2B e H3 sporgono in mezzo alle due eliche di DNA. 2. Le code degli istoni H2A e H4 emergono sulla parte superiore o inferiore di entrambe le due eliche di DNA. Il legame DNA-proteine è mediata da tantissimi contatti, in particolare da legami H, che vengono ad essere in numero elevato, fornendo la necessaria energia per aiutare la curvatura del DNA. Strutture di ordine superiore della cromatina Il primo livello superiore d'impacchettamento è grazie al legame da parte dell'istone H1 al DNA linker; che determina un ulteriore impacchettamento nella fibra da 30nm (solenoide). Modelli per descrivere la fibra 30: 1. Solenoide, prevede che i nucleosomi siano avvolti attorno ad una superelica, che contiene 6 nucleosomi per giro; la superelica ha un foro centrale, con un diametro di 11nm, questo foro è vuoto. 2. Zig Zag, il foro centrale è attraversato dal DNA linker, che in questo caso sono più lunghi e consentono di attraversare la struttura. La fibra 30nm è stabilizzata dalle code amminoterminali; in particolare, nella H4, carica positivamente, interagisce con le cariche negative dell histone-fold. Bisogna passare poi a modelli di condensazione superiori, come le #AnseDiDNA, chiamate fibra da 100-400nm, che contengono organizzazione inferiori, quali la 10 e 30, ancorate alla matrice nucleare interfasica. Ogni ansa ha una sua topologia, in cui la fibra si presenta localmente con livelli di condensazione differenti. Regolazione della cromatina L'interazione DNA-ottamero istonico è dinamica, il DNA viene disavvolto, si sposta e quindi non è sempre la stessa porzione di DNA ad essere avvolto. L'interazione dinamica viene ad essere supportata da #ComplessiRimodellamento dei nucleosomi, che facilitano i cambiamenti di posizione dei nucleosomi e quindi l'interazione tra DNA ed ottamero istonico, mediante ATP. Questi complessi catalizzano lo #Scivolamento, #Trasferimento e #ScambioDimeri. Lo scivolamento prevede che il DNA scivoli lungo la superificie dell'ottamero istonico consentendo di liberare il DNA contenente il sito di legame della proteina, rendendolo accessibile alla proteina specifica; sono una sorta di mano che prende il DNA e lo strotola lungo la superficie dei nucleosomi. L'esplusione/trasferimento è un movimento più drastico perché viene espulso un ottamero istonico, liberando il DNA dall'interazione con le proteine istoniche; l'ottamero liberato viene in qualche modo trasferito/riciclato da un'elica all'altra del DNA. Lo scambio di dimeri prevede che ci siano complessi di rimodellamento dei nucleosomi che possono sostituire alcuni componenti dell'ottamero istonico con delle varianti (come H2AX, ossia il segnale per la riparazione del DNA). #H2AX viene fosforilata e perciò richiama delle proteine che sono coinvolte nel riparare i filamenti di DNA rotti; interviene quando si hanno delle rotture della doppia elica, portando gli enzimi riparatori sul luogo del misfatto. Tipi di meccanismi di rimodellamento: 1. Bromodominio, dominio conservato all'interno dei complessi che serve a riconoscere gli istoni e legare le code N-terminali istoniche che contengono le lisine acetate. 2. Cromodominio, serve per legare gli istoni e le code N-terminali istoniche a livello delle lisine metilate (che servono per far riconoscere il complesso di rimodellamento da parte dei nucleosomi). Modificazione delle code N-terminali istoniche Altra modifica, oltre a metilazione, fosforilazione e acetilazione, può essere l'ubiquitinazione, che riguarda in particolare la C-terminale. Lo stato della cromatina riguarda modifiche chimiche che riguardano principalmente la coda Nterminale, ad esempio, una coda può subire modifiche chimiche differenti in posizione e tipo chimico; H2A può essere contemporaneamente acetilato e fosforilato e questo crea un codice istonico, che dice come e quando il DNA compattato è accessibile. Diventa, insomma, una sorta di alfabeto che si traduce in un possibile grado di compattamento del nucleosoma. Le modifiche degli istoni influenzano la funzione dei nucleosomi Se si ha un istone modificato, l'acetilazione delle code istoniche in punti diversi porta ad uno stato di cromatina più aperta e rilassata, detta ATTIVA. Lo stato di cromatina chiuso, detto INATTIVA, si ha quando le code istoniche sono metilate in posizioni diverse, in diverse code, H3 e H4 in particolare. Acetilazione = apertura. Metilazione = repressione genica, inattivazione della cromatina. L'acetilazione, avviene sulle HAT, istone acetil-transferasi; modifica rimossa dalle HDAC, istone deacetilasi, che la rimuove. La fosforilazione è ad opera dell'enzima istone chinasi, mentre quello che la rimuove è la istone fosfatasi. La metilazione può essere mono-, di- o tri- e l'enzima è HMT, quello che rimuove è HCM. Ogni enzima ha istoni bersaglio specifici sui quali agisce. Si ricorda che la cromatina può essere modificata localmente mediante cooperazione dei complessi di rimodellamento dei nucleosomi, magari quelle interessate per venir trascritte o replicate.
