Измерение митохондриального
мембранного потенциала и анализ
результатов.
Абруев Шерзод
1
Введение
Во время клеточного дыхания питательные вещества окисляются с образованием энергии за
счет механизма, называемый окислительным фосфорилированием, происходящим в
митохондриях. Во время окислительного фосфорилирования, постепенный распад молекул
через цикл TCA высвобождает электроны от разорванных ковалентных связей. Эти электроны
захватываются НАД + через его восстановление в НАДН. Наконец, НАДН переносит электроны
во внутри мембранную цепь митохондрий. Эти комплексы используют энергию, перекачивают
протоны в межмембранное пространство, создавая электрохимический градиент через
внутреннюю мембрану митохондрий, которая обеспечивает энергией АТФ-синтазный
комплекс, в конечном итоге производя аденозинтрифосфат (АТФ). Мы оценили
потенциал митохондриальной мембраны (ΔΨm m) с использованием катионного красного
флуоресцентного красителя- метилового эфира тетраметилродамина (TMRM),
Рис.1 Химическая формула тетраметилродамина
Потенциал митохондриальной мембраны (ΔΨm), создаваемый протонными насосами
(Комплексы I, III и IV), является важным компонентом в процессе накопления энергии во время
окислительного фосфорилирования. Вместе с протонным градиентом (ΔpH) ΔΨm формирует
трансмембранный потенциал ионов водорода, который используется для образования АТФ.
Измерение митохондриального мембранного потенциала.
Для измерения митохондриального потенциала (ΔΨm) фибробласты загружали в
течение 30 минут, при помощи 1 µМ тетраметилродамина метилэстера (TMRM, Invitrogen), при
комнатной температуре, в темноте. Измерения проводились на инвертируемом
флуоресцентном микроскопе EVOS FL Color (Thermo Fisher Scientific, США). Для регистрации
сигнала ΔΨm, TMRM возбуждали при 560 нм и флуоресценцию регистрировали при 580 нм (для
данных целей на микроскопе использовался фильтр RFP). Все эксперименты проводили при
комнатной температуре (25°С), в стандартном растворе Рингера (в мМ): 135 NaCl, 5 KCl, 2 CaCl 2, 1
MgCl2, 11 HEPES, 5 глюкоза (pH 7.35, доводили при помощи NaOH).
2
Рис. 2 Снимок флуоресцирующих фибробластов, полученных инвертированным
флуоресцентным микроскопом.
Трансмембранная разность электрохимических потенциалов ионов водорода, генерируемая
на мембране митохондрий в результате окисления субстратов дыхания, является основным
источником энергии для синтеза АТФ. Это было доказано, в первую очередь, с помощью
действия разобщителей - соединений, вызывающих диссипацию мембранного потенциала
путем облегчения трансмембранной диффузии протонов и приводящих тем самым к
разобщению окисления и фосфорилирования в митохондриях. В качестве разобщителя в
нашем случае выступал – карбонил цианид m-хлорфенилгидразон( или же СССP от Carbonyl
cyanide m-chlorophenyl hydrazone).:
Рис. 3 карбонил цианид m-хлорфенилгидразон
После добавления СССР наблюдается уменьшение интенсивности
фибробластов, вызванное нарушением потенциала и работы АТФ-фаз.
флуоресценции
Микроскопом были сделаны снимки убывание митохондриального потенциала после
добавления СССР для дальнейшего анализа полученных данных, с периодом 1 0 секунд между
фотографирование, в количестве 25 снимков.
3
Обработка данных в ImageJ
Полученные данные требуют цифровой обработки, и в нашем случае, снимок изменения
митохондриального потенциала и интенсивности флуоресценции, удобным является
использование графических инструментов обработки данных, таких как ImageJ
ImageJ — программа с открытым исходным кодом для анализа и обработки изображений.
Написана на языке Java сотрудниками National Institutes of Health и распространяется без
лицензионных ограничений как общественное достояние. Открытый API позволяет гибко
наращивать функциональность за счёт подключаемых плагинов, а встроенный макроязык —
автоматизировать сложные повторяющиеся действия. ImageJ широко применяется
в биомедицинских исследованиях, астрономии, географии и других дисциплинах.
Знакомство с ImageJ и обработка данных в нем
Нажатие на иконку запуска вызывает окно ImageJ напоминающий панель инструментов:
Панель управления и команд
Панель инструментов ImageJ
Для начала работы, необходимо выбрать файл, с которым вы будете работать. Выполняется
это последующим нажатиями на панели управления кнопки File---Import---Image Sequences
(в нашем случае)
4
Меню File позволяет вам открывать, сохранять. Распечатать
ваши файлы, через подменю Import вы выбираете тип своего
файла (фотографии, таблицы, схемы). Выбор файла происходит
через Файлообменик, после чего программа выбрать нужное
разрешение и количество фотографий, нужно ли конвертировать
или внести какие-то изменения перед открытием:
В нашем случае это серия фотографий из 25 снимков, которые
будут отсортированы по алфавиту
Нажатие кнопки OK, приведет к началу загрузки наших снимков,
что можно увидеть в строке состояния ImageJ:
Готовое рабочее поле ImageJ, содержит слайд-шоу составленный из выстроенных по очереди
фотографий, с их отображением:
5
Дальше следует выбрать
необходимые требования к
обработке данных, через
меню Analyze (подменю
позволяет
тонко
настраивать
параметры
анализа)
выбрать
Set
Measurements (параметры
измерения)
поставить
галочку
в
функции
измерения интенсивности и
убрать с других функций:
Нашей целью является изучения изменения интенсивности
флуоресценции фибробластов, теперь мы с вами можем выбрать нужные
клетки, а программа рассчитает и выдаст нам график изменения.
Для этого, нужно сначала указать какие клетки нас интересуют:
1.Выбираем меню Analyze
2.Выбираем подменю Tools (здесь находятся инструменты тонкой
Настройки обработки данных, такие как множественный анализ)
3.Выбираем ROI Manager (Regions of Interests, инструмент, который
«запомнит» участки нужных нам клеток и снимков) и нам остается
только указать нужную нам область или клетку с помощью инструментов:
6
Указать на интересующий наш участок фотографий можно с помощью набора инструментов на панели:
1
2
3
4
5
№1 Инструмент выделения квадратным штрихом № 2выделения круглым штрихом, №3 полигонами,
№ 4- произвольное, № 5- линиями
Выделите с помощью мыши и удержания левой кнопки интересующие участки удобным для вас
инструментом (1), потом в меню ROI Manager нажимаем кнопку Add(Добавить) (2) и программа
занесет координаты нужного региона в менеджер (3):
3
2
1
После этого нажмите на кнопку More, в меню ROI
Manager, для того чтобы выбрать множественный
подсчет из вплывшегося выберите Multi Measure
и подтвердите это действие на все рисунки.
Данные подсчета можно сохранить через меню
«File», это результат
Анализа программой всех 25 фотографий. Что
дает в результате таблицу
Изменения интенсивности флуоресценции
фибробластов
7
Обработка полученных данных в программе Origin
Для предоставления результата данных в виде наглядного графика, удобно
использовать программу Origin — пакет программ фирмы OriginLab Corporation
для численного анализа данных и научной графики и для создания двумерной,
трёхмерной научной графики, которая создаётся с помощью готовых шаблонов,
доступных для редактирования пользователем. Также возможно создавать новые собственные
шаблоны. После создания изображения оно может быть отредактировано с помощью меню и диалогов,
вызываемых двойным щелчком мыши на его элементах. Можно экспортировать полученные графики и
таблицы в ряд форматов, таких как PDF, EPS, WMF, TIFF, JPEG, GIF и др.
Нажатие иконки запуска, выводит на экран рабочее поле Origin (1), панель состояния (2) и панель
инструментов (3):
Для начала работы нужно импортировать данные в программу.
Для этого через меню File, это меню позволяет управлять
файлами, открыть, импортировать и экспортировать, сохранять их,
и мы выбираем Import и дальше для облегчения задания
Import Wizard, он поможет настроить формат и анализ добавляемых
данных.
Добавить файлы в Origin можно и через кнопку быстрого
импорта на панели инструментов, и перетаскиванием(Drag&Drop).
После добавления, таблица наших данных будут выглядит так:
Сейчас таблица представляет собой будущий график из двух
осей Х (1) и Y (2):
8
Так
как
мы
измеряем
изменения
флуоресценции во времени, в оси X, должно
быть указано время(секунды), и для этого в
нашем
случае
достаточно
умножить
значение каждой строки на 10, ведь
фотографии сделаны с интервалом в 10
секунд и в количестве 25 штук.
Для этого выделяем колонку А(X) нажатием
ПКМ, нажимаем комбинацию клавиш Ctrl +
Q, вызывая меню прописываем функцию
(Col(A)*10)-10, это увеличит значение всех
чисел на 10, но первая будет равна нулю, так
как это начало опыта.
Ctrl + Q
Теперь на оси X будет отображено время, также на строках Long Name нужно будет вписать «Время», а
на Units, единицы измерения, в нашем случае секунды. А также заменить номером и название клеток
(столбов Y): в нашем случае это Fibroblast 1,2,3,
Для построения графика. Выбираем колонку один «Время» и колонки «Fibroblast. Для создания
графика нажимаем кнопку «Линейная графа» внизу рабочего поля:
9
*Выборка происходит при нажатии и удерживании клавиши Ctrl + Enter
10
В полученном графике, легко можно изменить любое составляющее, размер шрифта и формат, как
цифр, так и индивидуально линию каждой клетки.
К примеру, давайте изменим шкалу времени(Х) у нее шкала измерения до 275, из-за чего там есть
лишний отрезок. При двойном нажатии на шкалу, вам откроется редактор оси, где вы можете менять и
шаг расчета, и границы, размеры и форматы шрифта и отображения, мы же сменим лишь поле «To» с 275
на 250:
Origin кроме представления данных в виде графики позволяет проводить математическую и
статистические обработки данных.
В нашем случае, в наблюдаемом изменении интенсивности флуоресценции в каждой клетке
фибробластов, можно вычислить среднее значение между ними.
Для этого выделяем колонки с
показателями клеток (1), нажимаем
кнопку Statistics на панели
инструментов, выбираем значение
Descriptive Statistics (наглядная
статистика) и кнопку Statistic in Raw
(статистика в колонне):
После нажатия кнопки вы можете увидеть, как появляется две колонны, причем Mean это среднее
значение по ряду, а второй Standard Deviation, стандартная ошибка.
При желании вы можете оперировать этими показателями, и с помощью уже их, построить график:
11
Origin позволяет гибко настраивать и оперировать данными, выстраивая разного значения и типа
данных:
12