Unidad 2
Transcripcion y /regulacion
en procariontes
/
,
Conceptos previos:
Gen: Secuencia de ácidos nucleicos o nucleótidos, necesaria para la síntesis de un
producto funcional, como un ARN o una proteína.
Genes: Secuencias activas donde vamos a encontrar información codificante.
Material Genético Mitocondrial: Material genético circular que tiene un sistema de
replicación diferente, y que contiene información propia que será utilizada solo por la
mitocondria para llevar a cabo procesos de síntesis y metabolismo.
Centrómero: Zona central de cromosoma.
En
Telómeros
eso
Cromatina: Forma extendida del cromosoma que
~
mantiene durante toda su vida, antes de la
Locus
replicación.
Cinetocoro: Borde del centromero importante
Cinetocoro
Centrómero
•
para el enganche de los microtubulos durante la
división celular
Satélite
Telómeros: Zona terminal de los cromosomas.
Loci
Secuencias Satélites: Secuencias repetidas que
↳
podemos encontrar en distintas partes del
cromosoma.
Locus: Zona específica donde está localizado el
gen.
Loci: Sector en el que se encuentra localizado
varios genes juntos en el cromosoma
i
¥
OJO: Solo se transcriben los genes, tanto en eucariontes como procariontes, pero la
diferencia es que en procariontes el proceso se lleva a cabo por enzimas y todo esto
ocurre en el citosol. En el caso de la transcripción eucarionte es mas compleja. Dentro de
las zonas de los genes, los genes tienen zonas llamadas exones e intrones. Por lo tanto,
los ADNs tienen que ser procesados y remover aquellas zonas que no contengan
información codificante.
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Introducción:
La síntesis de ARN ocurre en etapas. Las procariontes sólo tienen 3 etapas, inicio,
elongación y terminación, pero en el caso de la transcripción eucarionte es distinto,
porque tiene mayor cantidad de información, por lo tanto aquí vamos a tener 5 etapas,
la primera etapa que es la formación del complejo de pre iniciación, el inicio, la
elongación, la terminación y el procesamiento de los ARN y eso, dependiendo del tipo de
ARN, va a ocurrir en el núcleo o en el citoplasma.
Tenemos una simbología que es +1, el cual significa el primer nucleótido que agrega la
polimerasa. Este no es el que va a formar el codón AUG (codón que codifica para la
metionina de inicio de la traducción).
Río arriba vamos a encontrar las zonas reguladoras dónde está el promotor y, río abajo
vamos a encontrar las secuencias codificantes dónde están los exones e intrones.
Sabemos que el ADN está formado por dos hebras, una que va de 5’ a 3’ y de 3’ a 5’.
La hebra no molde es conocida como hebra codificante, porque es aquella que tiene el
código y siempre va desde 5’ a 3’, en cambio, la hebra molde es la que va de 3’ a 5’ y es
complementaria al ARNm o al ARN que se esté sintetizando. La razón de esto es porque
el ARN, al igual que el ADN, se sintetiza en sentido 5’ a 3’.
La hebra codificante, es igual a la hebra de ARN y su única diferencia es el cambio de la
timina por el uracilo.
Etapas transcripción; Iniciación
Se va a instalar toda la maquinaria necesaria para que ocurra el proceso, en este caso
la ARN polimerasa
En el caso las procariontes sólo hay una ARN polimerasa encargada de la síntesis de
todos los ARN, y tiene varias sub unidades.
Para poder cumplir su función, requiere de un cofactor enzimático, generalmente
magnesio o manganeso, que le permite cambiar su conformación. Esto significa que
normalmente la enzima se encuentra en estado inactivo y en presencia del cofactor se
activa.
La polimerasa se une a la secuencia del ADN en su forma de dúplex (ADN unido) y tiene
que generar una burbuja transitoria para que una hebra sirva de molde. Para esto no va
a participar la helicasa, sino que hay proteínas que tienen actividad helicasa.
La misma polimerasa dentro de sus unidades y tiene varias subunidades, como la subunidad Sigma, la encargada de cumplir varias funciones; primero reconocer al promotor,
después producir un cambio conformacional que le permite tener actividad helicasa, y
una vez que se abra la burbuja de manera transitoria, la polimerasa va a sufrir otro
cambio conformacional que le va a permitir tener actividad polimerizadora, y además
catalizadora, lo que le permitirá catalizar el enlace fosfodiéster para ir formando la
hebra de ADN.
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Cuando hayan ocurrido estos cambios
conformacionales, la polimerasa va a empezar a
arrastrarse por el ADN, hasta que va a llegar a la
purina, que va a ser nuestro nucleotido +1 y va a
empezar a agregar los nucleótidos de esta hebra.
Ahí la síntesis va de 5’ a 3’, y a medida que se va
desenganchando se va sintetizando, porque a
medida que la polimerasa avanza, se va cerrando
la hebra de ADN, dado que la
complementariedad que hay entre ADN y ARN es
menor, se va a empezar a salir el ARN que
aparece.
Etapas trasncripción; Elongación
Aquí tenemos nuestra zona promotora (amarillo),
la subunidad Sigma y el ARN polimerasa
(celeste). Cuando la subunidad Sigma tiene a toda
la polimerasa enganchada, este factor Sigma
activa su actividad helicasa, que genera la
burbuja transitoria. Ahora la ARN polimerasa
comienza a avanzar, y a agregar los nucleótidos,
ahí va a partir del proceso de elongación.
Posteriormente el factor Sigma es liberado una
vez que la polimerasa empezó la elongación y de
esa manera la polimerasa puede avanzar sola,
hasta llegar a la secuencia de término, entonces
se va a producir el desenganche de toda la
maquinaria y se va a liberar este ARN.
La polimerasa va a ir
avanzando por la
hebra molde en sentido
de 3’ a 5’, pero la
hebra que va a ir
sintetizando es en
sentido a 5’ a 3’
Como es un ARN procarionte, sí es un ARN mensajero, es
un ARN policistrónico, (codifica diferentes proteinas que
serán traducidas a partir de una misma molécula de mRNA).
y ademas se ordena como un operón (segmento que tiene
varíos genes juntos y seguidos). Los genes están en claster,
una secuencia reguladora que regula a varios genes
simultáneamente, por lo tanto generamos simultáneamente
varios ARN unidos, por lo tanto, cuando el ribosoma los
reconozca, va a ir leyendo uno tras otro y sintetizando
todas las proteínas que hay acopladas a ese operón.
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Al igual que el proceso de síntesis del ADN, aquí también vamos a tener a los
ribonucleicos trifosfatados, porque de esta manera el proceso va a tener la suficiente
energía para generar el ARN.
Transcripción de arnM procariontes
La transcripción en procariontes tiene como característica fundamental la presencia de
operones, genes en claster, entonces este gen procarionte, en realidad es un operón
procarionte que tiene 3 genes. Está regulado por la región llamada zona reguladora,
donde vamos a tener el promotor, secuencias reguladoras, y operador.
La zona del operador es una zona donde se unen proteínas que generalmente reprimen la
transcripción procarionte, y las zonas reguladoras es dónde se pueden unir represores o
activadores.
+1
Gen 1
Gen 3
Gen 2
A….AUG…………UAA..AUG…………..UAA..AUG………
UAA
Cuando se produce el proceso de transcripción, es decir se genera un ARN, vamos a
tener al +1, donde se va a unir el primer nucleótido que vamos a agregar (adenina), pero
en esta zona se van a agregar varios nucleótidos más, lugar que corresponde a zonas
UTR, o zonas no codificantes, luego viene el codón de stop, después nucleotidos, y
posteriormente otro AUG pero del segundo gen, que después va a ser leído por el
ribosoma, y así sucesivamente.
Toda esa zona que se encuentra en azul, se llama UTR 5’, y es una zona que está antes
de los codones de inicio o de las secuencias codificantes y corresponden a nucleótidos
que no codifican.
Al hacer la traducción de un gen, partimos del primer nucleótido, pero este no
necesariamente es el de inicio, el codón de inicio es el AUG, ya que ahí va a estar la
secuencia codificante. Al finalizar el ribosoma llega hasta nuestro gen 3 y se engancha
en la zona no codificante y empieza a buscar hasta encontrar el codón de inicio para
comenzar a agregar los aminoácidos, y va a generar la proteína del gen 1, del gen 2 y
del gen 3, entonces va a sintetizar, llegar al término,y soltar la primera proteína y sigue
sintetizando a la siguiente, es por eso ese ARN se llama policistrónico.
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Etapas Transcripción: Terminación
Existen dos tipos de terminaciones en procariontes, una que se conoce como intrínseca
y otra que se conoce como Rho dependiente.
Rho Dependiente
Intrinseca
:
Cuando se llega al codón de término, se
produce la formación de esta horquilla o
loop (hairpin). Junto con esto, cuando la
polimerasa reconoce esta horquilla,
generalmente encuentra una adenina,
entonces va a generar una pequeña cola
de uracilo.
Hay una proteína rut, que es la que
reconoce el sitio o la secuencia de término
y recluta a esta proteína Rho, que cuando
llega a donde está el híbrido genera
actividad helicasa y separa a la hebra de
ADN de la de ARN, generando esta forma,
y junto con eso, que se desenganche toda
la maquinaria, o sea que se suelta también
la ARN polimerasa.
Regulación de la expresión génica en procariontes
Todos estos procesos son altamente regulados,
no solamente vamos a encontrar un proceso de
regulación por la unión de la subunidad sigma, o
estas proteínas o estas secuencias, sino que
también vamos a encontrar zonas donde hay
regulación a través de proteínas.
Hay un proceso de regulación de la expresión en
procarionte negativa, y una regulación positiva:
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Cuando hablamos de
expresión génica, el primer
paso es la transcripción,
(síntesis de ADN),y el
segundo paso es la síntesis de
proteínas, entonces cuando
hablamos de expresión
génica, decimos si se
transcribe o no un gen.
Regulacion Negativa
Rio arriba existen proteínas represoras que se pueden unir a secuencias llamadas
operador o a secuencias reguladoras, esas son las dos opciones que tiene.
Una opción es que la proteína represora
se mantenga unida a la secuencia
reguladora y así evita que ocurra la
transcripción. Entonces para que ese
proceso se active, es necesario que alguna
sustancia saque a esa proteína represora
y permita que toda la maquinaria pueda
generar el ARN mensajero.
Otra alternativa es que tengamos a la
proteína represora unida a la secuencia
reguladora, pero dependa de la presencia
de un ligando para que la proteína
represora se puede unir al ADN y
mantenga el gen apagado, entonces si
sacamos al ligando del medio, la proteína
represora pierde afinidad por el ADN y
puede ocurrir la transcripción.
Regulacion Positiva
r
En primer lugar, la ARN polimerasa no se va a
mover sin sufrir un cambio conformacional, eso
significa que vamos a necesitar a algo que la active,
y eso es lo que hace la regulación positiva; una
proteína activadora se une al ADN, pero además
produce que haya un cambio conformacional en la
ARN polimerasa, que también depende de un
ligando, es decir si agregamos una sustancia a la
proteína activadora, esta cambia la forma de la
polimerasa y así puede partir y hacer el proceso de
elongación.
De igual manera podría pasar lo contrario, que la
proteína activadora esté unida al ligando y necesite
que ese ligando se pierda para que pueda cambiar
su conformación, se mueva y empiece a agregar los
nucleótidos.
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Recordar características de la estructura del gen:
Zona Codificante
Zona reguladora
Tiene una zona codificante que corresponde
a los genes estructurales, y una zona
reguladora que es donde están las
secuencias reguladoras.
Tenemos las secuencia promotoras, importante para la unión de la polimerasa. Las
secuencias reguladoras que pueden activar, es decir donde se van a unir activadores, y
las secuencias represoras, llamadas operador, donde se van a unir las proteínas que
reprimen el proceso.
Regulacion Por Potenciador
En esta parte estamos viendo la regulación por
un potenciador, es decir que aquí va a ocurrir el
proceso de transcripción, y al mismo tiempo va a
ocurrir un proceso potenciado (lo que ocurre
con esta proteína NtrC), que en el fondo es que
vamos a aumentar la velocidad a la que se está
produciendo, y eso por la necesidad que tienen
la células.
Entonces esta proteína genera un tipo de pliegue
o loop, porque esta proteína represora se une al
ADN, pero el ADN se repliega para
engancharse a la polimerasa y generar un
cambio conformacional y gatille que el proceso
se haga rápido.
Regulacion Activador-Potenciador
La regulación por activadores también puede
ser llevada a cabo entre unión de activadores y
represores. En este ejemplo lo que vemos en
azul es la zona donde se unen las proteínas
activadoras (las que van a generar el cambio
conformacional de la ARN polimerasa), en
amarillo tenemos al promotor (donde se una la
subunidad sigma) y dado que existen proteínas que ayudan a que el factor sigma se una,
cuando una proteína activadora está unida a la sub unidad sigma y ambas se enganchan
al ADN, se produce la transcripción, pero si esta proteína activadora está enganchada
al represor, la polimerasa no se va a poder enganchar, entonces se inactiva el proceso
de transcripción.
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Transcripcion y yregulacion
en eucariontes
/
r
Introducción:
A diferencia de la transcripción procarionte,
hay un paso previo a la transcripción;
pre iniciación, en donde es necesario formar
un complejo. Y un segundo que sucede
durante la elongación, que tiene que ver con
la maduración del material genético.
Muchos de las modificaciones en el ARN son
co-transcripcional, es decir que ocurre
conjunto a la transcripción.
En esta imagen, vemos los pasos, en donde la
maquinaria se instala en las zonas
reguladoras. Aquí se activa el promotor con
el ARN polimerasa, se abre una burbuja
transitoria, y posteriormente se produce la
agregación de los ribonucleótidos.
Son desoxiribonucleotidos
cuando estamos sintetizando
ADN, y ribonucleótidos cuando
estamos sintetizando el ARN.
Secuencia de Inicio; Caja TATA
Las secuencias características del gen están en la zona reguladora, donde se van a unir,
amplificadores, o silenciadores y vamos a encontrar a la secuencia promotora. Este es
un promotor basal que se encuentra 25 nucleótidos rio arriba, y que tiene como
característica, la presencia de una Caja TATA, importante para la transcripción
eucarionte, ya que tienden a ser las secuencias de inicio del proceso transcripcional.
¿Por qué son importante las distancias, y las características que tienen estas cajas?
Porque hay muchas proteínas que se van a unir en estas zonas reguladoras.
Por otra parte, tenemos la secuencia UTR, que corresponde a las secuencia que se van
agregando y no todo el segmento va a ser codificante. Van a haber zonas que sirven
para darle estabilidad, para los mecanismo de exportancion o para el reconocimiento de
ribosomas.
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ARN Polimerasa Eucariontes
ARN Pol. III
ARN Pol. I
Ubicada en el nucleolo porque está
encargada de sintetizar el ARN ribosomal.
Esta no la sintetiza completamente, sino a
las que tienen menos 5s. Y algunos genes
de clases 1, que son ARN que se
transcriben, pero no son codificante.
Es de mayor tamaño todavía en cuanto a
la cantidad de subunidades. Es la
encargada de la síntesis de ARN de
transferencia.
ARN Pol. II
De mayor tamaño, porque tiene 12 subunidades, es sumamente importante, porque
sintetiza el ARN mensajero. Transcribe genes estructurales, es decir que tiene
característica la síntesis de proteínas que previamente tienen que haber pasado por el
ARN mensajero, y este ultimo sufre varios procesamientos, siendo uno de ellos el splicing
o corte y empalme, en donde removemos los llamados intrones del material genético.
El ARN ribosomal, viene del gen del ADN, la cual se transcribe en un
ARN no codificante, sino un ARN estructural, porque forma la
estructura del ribosoma.
En cambio, el ARN de transferencia, es un ARN que tiene que ver con
procesos de transferir, transportar aminoácidos a nivel citoplasmático.
El ARN mensajero, es el único codificante, el que tiene material genético
que puede ser leído por el ribosoma.
Todas las polimerasas requieren de factores enzimáticos, en este caso es el magnesio, y
como sabemos, se va a unir a la zona del promotor, pero no directamente. Para eso son
necesarias proteínas llamadas complejo de iniciación de la transcripción, y factores de
transcripción, que son proteínas que ayudan al reclutamiento de la maquinaria.
Entonces está la Caja TATA y alrededor tenemos el complejo, que son proteínas que se
unen y que van a permitir el Inicio de la transcripción.
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Factores de transcripción
Tenemos 2 tipos:
• Factores de transcripción basales
• Factores de transcripción específicos
Algunas se unen a la zona del promotor, y
otra a las zonas reguladoras.
A diferencia de la transcripción
procarionte, aquí necesitamos todas estas
proteínas, no solo a la polimerasa, por lo
que no es tan sencillo.
Las basales, se unen en todos los genes y son importantes para el reclutamiento de la
polimerasa, en cambio, los específicos se unen en la expresión de un gen puntual.
EJ: El P53 que guarda el genoma, y es un factor de transcripción, que activa el P21, que va a
bloquear el ciclo celular, por lo tanto, es un factor de transcripción específico.
Factores de transcripcion basales
r
Tambien llamado constitutivo, haciendo referencia que está en todos los genes.
• Actua con el promotor a través de la Caja TATA.
• Las zonas BRE son secuencia en donde se une proteínas.
• Tenemos el TRP, proteína de union a la Caja TATA, y es la encargada de unir
directamente al ADN. En caso de no tenerla, no se puede unir el ADN, lo que implica que
no puede reclutar a otros factores, y menos a la polimerasa.
• La primera en ensamblarse es la TBP, luego se unen otros factores para la polimerasa II,
que se divide en A, B, D, E, F, H.
• Cada polimerasa, recluta a sus propios factores.
• Cual es la importancia de que sea tan grande?
- Al reclutar, algunas tendran actividad helicasa, entonces, en caso de que no funcione la
helicasa estas cumplirán la función de abrir la burbuja transitoria. También habrán otros
que fosforilan, otros sirven para el cambio conformacional. Entonces vamos a ver que hay
distintos factores y cada uno tiene un rol importante.
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:
Factores de transcripcion basales
• No se unen a la zona del promotor, sino más arriba, en las zonas reguladoras/enhacer/
potenciadoras o silenciadoras.
• En las zonas enhancer se une un factor de transcripción que tiene función activadora.
• Podría ser que más arriba se una una proteína represora, y más arriba activadores.
• Siendo este complejo muy grande, el material tiende a replegarse, para generar el
proceso de transcripción.
• Puede estar toda la maquinaria lista, pero si no se activa, no hay cambio
conformacional, la polimerasas sigue
pegada al promotor, y no podra
avanzar, y además la proteína
encargada no tendra actividad helicasa.
• Cuando se necesita mayor velocidad,
un activador activará el inicio, y habrá
otro sitios activadores para que el
proceso vaya más rápido, y en caso
contrario, de necesitar una reacción más
lenta, las zonas de rio arriba, en donde
tengo estos factores de transcripción
específicos, regulan la activación y la
velocidad a la que ocurre la
transcripción.
Primero unimos la Caja TATA, se reclutan los factores de transipcion basales, luego los
Coactivadores que son los que harán la conexión con los represores o activadores.
Factores de transcripcion generales RNA Polimerasa II: TFII
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El TBP recluta a TFII B. Luego que se forma el reconocimiento, se van uniendo otros
factores. El TAF, ayuda a que haya activación, o sea transcripción.
Luego el B, que se unia al principio, es el encargado de reclutar a la polimerasa, y si falla
TBP repercute en reclutar a la polimerasa.
Luego tenemos a F y H que participan, y asisten.
El H es el más importante, porque tiene la actvidad Helicasa, por lo tanto si lo reclutamos,
E produce un cambio conformacional, entonces el H cumple su actividad helicasa,
rompiendo los puentes de hidrógeno y formando la burbuja transitoria, entonces la
polimerasa se rodea de factores de transcripción y no puede salir. Los cambios van a
hacer que se suelte, y esto depende de los factores.
Entonces el H, tiene actividad helicasa (rompe puentes de hidrógenos), y quinasa
(fosforila), lo que hace que se desenganche la polimerasa, y comience a andar
produciendo lo que llamamos Elongación. Cuando está reclutado, la pre-iniciación ha
terminado, y comienza la etapa de inicio.
El inicio es el cambio conformacional de todas estas proteínas para que se suelte la
polimerasa, y vaya agregando nucleótidos desde el AUG, que va a llegar a una purina
marcadora consenso (A/G), y agrega hasta llegar el codon de término, en donde se
produce otros elementos para la terminación. Y durante todo este proceso, los factores
de transcripción que estaban en el promotor, se van a desenganchar.
Formacion del complejo de pre-iniciacion
/
/
Entonces aquí tenemos a la TBP, unida al TFIID. TBP reconoce a la Caja TATA, y se une a
ella. Luego esta recluta a la B, y cuando se recluta, esta es la encargada que E y H vaya
ensamblandose junto con las ARN polimerasa.
Este colita, de carboxilo terminal, es muy importante para el proceso de transcripción.
El complejo se forma, se recluta la
maquinaria, y se requiere que se active
el inicio, y al hacerlo se genera que
algunos factores tengan actvidad
quinasa y helicasas.
La quinasa es importante para que la
polimerasa se desenganche, tiene que
fosforilarse en esta cola, y esa
fosforilación va a ir cambiando
durante el proceso.
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r
r
-
Activacion de la enlongacion en eucariontes: Fosforilacion CTD ARN polimerasa.
Acá tenemos la polimerasa y su cola, en donde se ensambla PIC (complejo de
preiniciacion) y tenemos el complejo completo. Ahí el Factor H genera la fosforilación
de la cola, para que escape del complejo. Al salir, tenemos la enlongación.
Durante este proceso, varias proteinas (quinasas) producen cambios en esta cola, es
decir que se hiperfosforila.
Esta polimerasa avanza, se agregan nuevos nucleótidos, y al transcurrir el avance, el
ADN trata de juntarse, y no hay proteínas que mantengan abierta esta hebra. Es más
fuerte la union ADN-ADN que ADN-ARN, por lo tanto el ARN empieza a salir,
Pero al hacerlo, el nucleo tiene nucleasas
que lo degradan, y tiene que protegerse,
entonces ocurre la primera modificación
Durante la elongación, ocurre una
fosforilacion de proteínas que detiene a la
polimerasa (NELF/ DSIF) para agregar
una guanosina metilada (5 CAP), y así
evitar que este ARN se degrade.
Cuando se agrega esto, ocurre la
fosforilacion del dominio terminal, y vamos
a fosforilar las proteinas que detienen el
proceso, y continua la elongación.
Aquí vemos el C terminal, y estos numeros es donde
ocurre la fosforilación. Una vez se detiene el proceso, se
une la caperuza (guanosina metilada), y evita la
degradación.
A medida que transcrurre el proceso de transcripción,
hay proteínas que tienen que ver con maduracion del
material genético (verde/rojo) y se van ensamblando,
tanto al ARN como a la polimerasa (Factores de
enlongación), que son importante en la elongación y la
terminación.
El capping es el agregamiento en el extremo 5 ́de ARN
una guanosina Metilada
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Elongación
Aquí el B es importante para el reclutamiento de la polimerasa, y si no está, no reconoce
a la caja TATA.
El D con la TBP reconocen a la caja TATA, y el B recluta a la polimerasa, y a otros
factores como el H. Si no está H, no tengo helicasa y quinasa.
Como se forma una burbuja transitoria, hay tension, entonces participan las
topoisomerasas para el proceso de corte. Es más común la I porque no hay tanta torción
Procesamiento del pre-ARNm
El primer procesamiento es el capping, en donde la cola 5 ́ se une la metil guasinada.
Luego a medida que avance, viene un segundo proceso, el splicing que ocurre durante la
transcripción.
Se reclutan proteínas, ya que a medida que se forma este ARN pre mensajero, estas
reconocen secuencias específicas que reconocen los intrones y se enganchas para sacar
estos intrones.
El ultimo proceso ocurre es en el 3 ́terminal, que es donde se agrega una cola de
adenina, que es la agregación de muchas adeninas para varia funciones:
• Evita que se degrade
• Permite que ocurra la exportación del ARN
• Localizacion: Porque el ARN se localiza afuera del citoplasma para ser reconocido por
los ribosomas.
Capping
Para que ocurra este proceso, en el carbono 5’
terminal, ocurre este puente de tres fosfato que lo
une con la guanosina metilada. Este es un proceso
que requiere de enzimas (transferasas) que
participan en el proceso de este enlace.
Su finalidad es estabilizar, y evitar que se
degrade, además participa en la exportación.
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Tenemos el complejo de pre
iniciacion con la cola
carboxilo terminal de la
polimerasa, y ocurre la
fosforilzacion de nucleotidos
en serina (tiene un número de
fosforilación).
Esto nos marca la salida de
la polimerasa para la
enlongacion (2)
Luego vienen las proteinas
que detienen esta polimerasa
(3) para que ocurra el
capping. Para que ocurra esto, es necesario otra proteína que agregue el capping. (4)
Cuando se agregue la guanosina metilada, se fosforila otra serina, no de las mismas ya
fosforilada, y al hacerlo se pueden eliminar las proteínas enganchadas que detenian el
proceso de enlongación.
Aquí vemos las fosforilacion que desengancha a las proteínas que detienen a la
polimerasa, pero ahora con nuestro ARN con nuestro cap.
Splicing
Entonces la polimerasa sigue avanzando, y se enganchan otras proteínas.
Este proceso, que sucede durante la elongación, tiene como fundamento la remoción de
los intrones gracias a enzimas.
Por definicion un intron es una secuencia no codificante, pero no quiere decir que una
mutación en un intron no tenga un impacto, porque para removerlo, tienen que ser en
secuencia específicas, y si se
mutan no puedo moverlos.
El intron puede ser o no ser
codificante dependiendo del
gen, pero en general son no
codificantes.
Entonces generamos el
Capping y se genera el ARN
mensajero. En el método
convencional, dice que tenemos
que eliminar todos los intrones,
y para ello es necesario que
estos tengan una secuencia
específica para removerlos por
proteínas específicas.
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Aquí vemos el intron con una Adenina específica que es reconocida por una proteína
que hace que se genere un lazo y empalma a los exones.
Entonces nos queda un exon 1, 2 3.
Mecanismo:
Aca tenemos el exon 1, y 2, y en amarillo el intron.
Está la proteína U1, que reconoce el extremo 5 ́ del intron.
Por el otro lado, tenemos una purina reconocida por una proteina BBP U2AF.
Cuando estas secuencia son reconocidas, se produce el enganche de una Riboproteina
U2, que las saca y se engancha. Ahí tenemos al intron con 2 proteínas enganchadas en
sus extremos.
Luego se recluta un trímero snRNP que junta a estas 2 proteínas enganchadas, y así
genera lo que conocemos como el lazo, o como Esplicesoma, entonces las enzimas
nucleasas cortan los extremos.
Se hace un primer corte (5 ́) y se liberan algunas moléculas. Luego viene el segundo
corte (3 ́). Después de esto, se empalman los exones, y mientras tanto, la polimerasa
sigue agregando nucleotidos repitiendo el proceso hasta llegar a los codones de término.
Este proceso es co-traduccional
Estas proteinas estan asociadas a
las ribonucleoproteinas y además
activan la función de cortar y unir.
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Splicing Alternativo
Tenemos un splicing alternativo, en
donde en 1 gen, puedo generar más de
1 ARN mensajero, y esto depende de las
característica y del contexto.
Podría ser que necesitemos otra
proteínas en las zonas donde
eliminamos lo intrones y el exon 1,
dejando así el exon 2 y 3, y no es
porque sea una falla, si no que es otra proteína con otra función o la misma pero en
otro contexto celular. Y así tenemos varias combinaciones.
Hay algunas proteinas que tiene intrones retenidos y son importante para estas
proteinas, y quiere decir que tiene material codificante. Pero si hablamos de que si en
una proteína, que no necesita intrones, tiene un intron, hablamos de una mutación.
2
3
(1) Tenemos la ARN polimerasa II, la formacion
de ARN mensajero, con el splicing formando los
lazos, vemos la cola de poliA, que se agrega
cuando se está terminando el proceso y puede
recibir algunos cortes en el nucleo, que dará
longitud, algo importante para la translocación.
Una vez esto listo, se exporta al citoplasma, en
donde se insertan proteinas de traducción y se
regulan procesos (si se necesita o no
transcribir). Si se sintetiza, es reconocido por el
ribosoma, pero si es reconocido por un
microRNA, puede bloquear el proceso de
traducción. Si un ARN mensajero no se agrega
bien la cola de Poli A, viene un exosoma (no es
de los que se liberan) que degrada ARN mal
procesado.
(2) Los ARN de transferencia son sintetizados
por la polimerasa III, que lo que necesitamos
saber es que se sintetiza en el nucleo, se
repliega por si mismo para dar estabilidad y
sale al citoplasma para unir aminoácidos en su
extremo 3 ́ y una vez ahí, los dirige a la sintesis
de proteínas.
(3) El ARN ribosomal que tiene que ver con la polimerasa I, tiene que ver con estructura,
formar las subunidades ribosomal, y va a ser transportado.
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Estabilidad mRNA: Degradacion de ARNs
:
La cola de A, es importante para el transporte de este ARN.
En el nucleo tenemos nuestro ARN, y cuando se produce esta estabilidad, hay unas
nucleasa, que degradan a la adenina que se van recortando, lo que permite la
translocación. Una vez afuera, se enganchan varias proteinas al ARN que será
reconocido por el ribosoma, porque ayudan a que ocurra el proceso, pero si viene con
fallas cuando fue transportada, será reconocida por nucleasas citoplasmáticas que
degradarán por el extremo PoliA, o por el Caps:
Se elimina la caperuza que
es conocida como
desanilación donde vemos
que las proteinas eliminan
el extremo CAP, que hace
que nuestro ARN sea
inestable y sea degradado
por nucleasa.
También puede ser
eliminado por el extremo
5 ́en donde una nucleasa
reconoce la cola Poli A y
comience a degradar a
la caperuza.
Poliadenilacion del pre ARNm
Cuando llegamos a las zonas de termino, la
polimerasa reconoce la secuencia del ADN
codificante, entonces se desengancha y ocurre la
cola de poli A, y cuando se llega al final, se corta
el ADN y se agrega adenina 150-250 que luego se
va cortando dependiendo de la señal.
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O podria ser por
una nucleasa que
va por dentro
cortando el RNA.
Corte y Poliadenilacion del pre ARNm
r
Aquí está el dominio terminal de la polimerasa fosforilado,
y la colita que a medida que se va fosforilando, avanza.
Recordemos que ahí se fosforila una proteína, se detiene,
llega una caperuza, salen las proteínas, y sigue
avanzando. Esto sucede en distintas cerinas de esta cola.
Después de el proceso de splicing, se reclutan factores
(proteínas), que reconocen a la secuencia consenso.
Entonces van reclutadas en la cola de la cola de
polimerasa, y cuando aparece la secuencia de término en
el ARN, se enganchan directamente a el. Una de estas
secuencias que reconoce es la de cleavage, y la otra es
que se va a unir a zonas ricas en guaninas y adeninas.
Cuando avancen va a aparecer el proceso de corte,
entonces se va a producir el cleavage por estos factores
1 y 2, que son los que hacen el corte de la misma (tienen
actividad quinasa), y al cortar directamente se adhiere
una polimerasa PAP, o la polimerasa A, que es la que va a
adherir a la poli, y va a transcribir 250 adeninas.
La ARN polimerasa se detiene, se suelta, se desengancha
del ADN, y este se cierra.
Primero la polimerasa empieza a agregar los residuos de adenina, entonces se agrega la
proteína de unión de la PAP. entonces al ir
agregando a la adenina, se adhiere a la cola de polímero.
Esto va a ser importante, ya que no solo le va a dar estabilidad y proteger, sino que
también va a servir para procesos de exportación.
Y se produce entonces la formación de la cola de poli A, o del acceso de poli adenisación.
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Mecanismo de regulacion
/
→
4h
/
RanGTP en núcleo y RanGDP en citosol: Direccionalidad del transporte
Nuestro ARNm está listo y procesado con la cola de poli A, tiene que salir al citosol para
cumplir su función de síntesis de proteínas. Si hablamos del ARN ribosomal, va a salir por
la estructura del ribosoma, y el estructural al ribosoma afuera.
Todo esto se lleva a cabo a través del sistema de las RanGTP, estas GPasas aue funcionan
produciendo intercambios en el GTP, o hidrolizando este GTP, para que ocurra el proceso
de translocación de moléculas a través de los poros nucleares.
Hay moléculas pequeñas que pueden difundir por la estructura del poro, pero hay otras
moléculas que no pueden entrar y salir, entonces requieren de mecanismos energéticos,
donde el poro va a jugar un rol importante y las proteínas tienen un rol activo.
Si recordamos cómo funcionan las GTPasa,
tienen un estado donde la proteína tiene unido
el GDP y está inactiva, (cuando tienen el
trifosfato esta activa) y para que ocurra ese
proceso específico de activación y de
desactivación, en el núcleo son
específicamente la familia de las Ran.
Entonces tenemos una RanGTP activa en el
interior del núcleo, pero esta se activa cuando
ingresa una Ran inactiva a través del poro.
Una proteína GEF, que es una proteína que
permite intercambio (no fosforila) cambia el
GDP y le pone el GTP enzima activa. Cuando el GTP está activo tiene que llevar
moléculas fuera del núcleo, y en el citosol una GAP va a producir hidrólisis, y ahí le va a
quitar un fosfato y le va a dejar inactivo.
Estas GPasas son importantes porque se unen a proteínas llamadas importinas y
exportinas, que son las encargadas de transportar. Entonces aqui una importina va a
reconocer a la molécula que va a ingresar, la cual tiene una señal de localización K,
cuando ingresa la Ran GTP que está dentro se une a la importina, y esta cambia
conformacionalmente y libera la molécula que tenia dentro, y vuelve a salir, reciclando la
importina e hidrolizando la GTPasa.
El ARN como estructura nucleotidica, a medida de que se agregan a la cola de poli A se
le incorporan proteínas de unión, las cuales van reclutar a otras proteínas que tienen la
señal. Ya no va a salir porque el ARN es una señal nucleotídica, no una señal
aminoacídica. Ran-GTP proteína con señal de exportación nuclear (carga)
Por lo tanto, es importante la señal para que la exportina junto a la GTP se junten.
Cuando eso ocurra van a salir juntos a través del poro, y cuando lleguen al citosol va a
ocurrir el proceso de olisis y los cambios conformacionales.
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ARNm maduro se exporta al citoplasma a traves del
-
receptor nuclear de exportacion
:
Para poder salir el procesamiento tiene que ser primero caperuza en el 5', la remoción de
los intrones va a ser mediante el proceso de splicing y la proteínas de unión que se unen a
la cola de poli A. Osea que si formó la cola de poli A, pero nunca fueron las proteínas de
unión, esto nunca va a sequir, porque esas proteínas de unión están protegiendo que se
degraden desde la cola del poli A.
Entonces nuestro ARN tiene en el extremo 5' el CBC que es de 80 anacaperuza, el complejo
de proteinas que se enganchan a donde esta el GAP.
Esta quanasina metilada en realidad no es que quede libre, sino que está protegida por un
chamuzon de proteínas.
Luego, a medida que avanzamos están las proteínas SR y las EJC, que son proteínas que se
van adhiriendo a la estructura del ADN. Y en la cola de poli A se incorporan estas
proteínas de unión a la cola de poli A, que eran las proteínas GAP que vimos anteriormente
en el proceso de degradación.
Se unen todas estas proteínas en la estructura del ARN, se llaman ribonucleoproteínas
mensajeras, o sea que en realidad nosotros vamos a transportar una ribo proteína
mensajera. En realidad es un ARN protegido por proteínas que va a salir. Por supuesto se
incorpora una proteína que nos va a servir como receptor de exportación, ese es el sitio
donde se van a unir las exportinas.
Va a salir protegido por proteínas. Por supuesto se incorpora una proteína que nos va a
servir como receptor de exportación, ese es el sitio donde se van a unir las exportinas.
Este va a ser importante para que, el receptor nuclear de exportación es la proteína que
tiene la señal de exportación que va a ser reconocida.
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Exportacion del ARNm
Aquí va a ir nuestro ARNm, y tenemos la
estructura del poro, recordemos que tiene una
serie de anillos que le dan esta forma
tetraédrica. Este anillo va a ir pasándose a la
estructura del ARN mensajero.
Están presentes estas ribonucleoproteínas que
nosotros las vimos en la imagen anterior como
HN ribonucleoproteínas, esas que estaban
adheridas son las que se van a unir a la
estructura de la fenilalanina que están en el
poro. Esto va a permitir que todo vaya saliendo, y que los receptores y las Ran GTP
salgan y no se devuelva.
Dentro de las características que ya hemos visto del poro, tiene como caracteristica
importante el transporte.
El ARN mensajeros puede procesarse de distintas formas, y ese procesamiento diferencial
hace que tengamos una proteómica mayor que nuestra genómica.
¿A que se debe la enorme diversidad celular si contienen el mismo genoma?
-
I
Si teníamos el splicing alternativo, teníamos distintas
características del gen de la tropomiosina en el músculo estriado y
el músculo esquelético, y si pensamos en nuestras mismas células,
todas son distintas desde el punto de vista estructural y funcional,
hasta en el morfológico.
¿A qué se debe?, a que las células de un mismo individuo, tiene el mismo genoma, pero
hay una regulación con enzimas en lo que se expresa y en lo que no se expresa del gen.
En distintos momentos de nuestro proceso embrionario, no expresamos los mismos genes.
Eso nos lleva a que procesamiento puede ser distinto.
La multicelularidad se establece por expresion genica diferente
/
/
Existen genes que se expresan siempre, que no necesitan una regulación tan específica,
a esto llamamos expresión constitutiva. Estos genes se declaran genes constipi o genes
de mantenimiento, o sea tienen una tasa de expresión constante y actúan en procesos
estructurales y funcionales importantes, ya que si fallan, no existiría la célula.
La expresión requlada es a través de esos genes funcionales, y específicos que se
expresan, dependiendo de la condición temporal y la etapa en la que estemos
(embrionaria, fetal, neonatal, adulto, infancia) que se van a expresar son distintos,
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el contexto, el ambiente, la alimentación (que es la más fuerte en regulación de genes), la
exposición al sol, o cambios de temperatura.
Vamos a encontrar que existen diferencias importantes en los procesos regulatorios, pero
no todos los genes son iguales, y esto nos lleva a procesos de diferenciación celular. La
diferenciación celular tiene que ver con todo este proceso regulatorio, y gracias a esto se
puede entender que se expresa y cuando se expresa.
Cuando estamos en etapa de cigoto, y
recibimos nuestra dotación materna y paterna
de material genético, este ya pasó por una
recombinación que le da la característica de
ser único, fue durante la profase de la meiosis,
donde sufrió el crossing over la recombinación
de material genético y la segunda fase de va a
ser la metafase1 de la meiosis donde va a
ocurrir la permutación de cromosomas, donde
los cromosomas salieron de metafase, pero los
tenemos duplicados, entonces se van a alinear
en la célula, de una manera azarosa, por lo que puede ser que en esta parte del
alineamiento queden solamente los paternos o los maternos, o quede la mitad maternos y
la mitad paternos, y en todas las células va a ocurrir este proceso.
Entonces cuando hacemos la recombinación, este gameto que heredamos de nuestro
padre tiene más herencia de nuestro abuelo, que de nuestra abuela.
En esta etapa vamos a tener a nuestro cigoto, que es una célula multipotencial (tiene la
capacidad de diferenciarse en un individuo completo) luego comienza el proceso de
modula, se formó el cigoto y tenemos la modula que siguen siendo células multipotentes,
estas células sufren el ciclo del embrión temprano y claramente no tienen expresados los
mismos genes que tenemos ahora.
Luego van a recibir señales y las células que queden alrededor, van a recibir distintas
señales de los del centro, entonces se va a formar el blastocisto.
Quiere decir que se forma una estructura que
tiene células a su alrededor, y un grupo de
estructuras que se va a entrar y un grupo de
células que se va a polarizar. Así se va a
formar el embrión, y el resto va a formar la
placenta.
Los blastocistos son células pluripotentes, o
sea, se puede transformar en cualquier tejido,
pero no en un individuo completo. De aquí
avanza la división celular, y tenemos que todas
las células tienen la misma cantidad de material genético, pero no con la misma información.
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Regulacion de la expresion genica
r
-
r
Como este es un proceso altamente regulado, en cada parte de esta etapa existen
procesos de regulación. La regulación tetranscripcional (no aparece en la imagen), tiene
que ver con la modificación que va a tener la cromatina. El material genético no está
libre, está compactado en su estructura de cromatina, y podrían haber niveles donde
esté muy compactado, y justo en esa zona haya genes muy importantes que se tienen
que transcribir, pero no pueden, entonces ahí va a tener que haber remodelamiento de la
cromatina. Este es un paso postranscripcional, significa que tengo que cambiar la
estructura de la proteína para que pueda ingresar todo el complejo de regulación, para
que ingrese la polimerasa, y ocurra el proceso de transcripción.
Pre-Transcripcional; modificaciones covalentes en ADN e histonas
Vemos modificaciones covalentes en las histonas, que ya veíamos que se fosforilan, se
acetilan, etc. Todas estas modificaciones pueden ocurrir, pero ahora nos concentramos
solo en dos; acetilaciones y metilaciones.
Las histonas son proteínas que tienen residuos y colitas, (tienen distintos residuos
aminoacídicos) entonces dependiendo de las características de estos residuos, y también
de la necesidad que tenga la célula, es que va a ocurrir la ubiquitinación.
Cuando tenemos las histonas acetiladas, el ADN pierde afinidad por las histonas, y se
libera un poco, lo que permite que la maquinaria pueda ingresar, y se pueda transcribir.
Si es que la modificación la sufre el ADN,este solo se puede metilar en la citosina, si
están las citocinas, el ADN se cierra, pero no es tan simple, porque cuando se metilan
citocina, se metilan las zonas del promotor, entonces no ocurre la transcripción,
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La otra alternativa es que este material genético esté muy compactado, y sea necesario
desarmar los nucleosomas, entonces actúan los complejos llamados SWI, que
corresponde a proteínas que se unen al nucleosoma y de esa manera se abre el ADN.
Estas son todas las posibles alternativas. De esta manera voy a ingresar la maquinaria
Entonces citosina metilada, en las islas CoG, histonas acetiladas, pero para
remodeladores como los SWI, abre el ADN porque desarma los nucleosomas, esas son
las modificaciones que vamos a ver.
Pre-Transcripcional; Factores de transcripcion especificos
✓
,
Aquí vemos el proceso de factor de transporte, y si importancia a nivel pretranscripcional
¿Por qué a este nivel los factores de transcripción? ¿Cuál es la primera etapa del
proceso de transcripción?
En teoría debería ser inicio, elongación, pero sabemos que no puede iniciarse si antes no
reconoce el promotor, se forma un complejo de preiniciación compuesto por factores de
transcripción basal, ADN polimerasa, activadores, represores y coactivadores
Esto quiere decir que si falla un factor de transcripción, o se unen represores, voy a
apagarlo, por lo tanto esta también es una forma de regulación a nivel
postranscripcional, y tiene que ver mucho con factores específicos que van a a activar o
reprimir. Recordemos que la maquinaria conoce los sitios de la parte basal, pero los que
van a activar y reprimir son los que se repliega y actúan como activadores o supresores.
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Tenemos la caja TATA que va a ser la unión de orden de transcripción basales, que se
van a ensamblar a la caja TATA, se va a unir el mediador, que este efecto coactivador
permite interactuar a los basales con los inespecíficos, y lo específicos
se van a unir en zonas distales cuando puedan estar las zonas potenciadoras, y las
zonas silenciadoras.
Entonces aquí se produce el pliegue, pero si esto fueran represores, aun cuando esté
toda la maquinaria instalada, no va a abrir el proceso
Entonces aquí hay un juego importante entre activador y represores, van a estar
produciendo este proceso de transcripción.
Además los activadores y represores son los encargados de reclutar a las enzimas que
no tengan cromatina, los activadores van a reclutar a las proteínas que van a remodelar
estas estructuras.
Dominios presentes en proceso de transcripcion
¿Qué características tienen los factores de
transcripción? Que son proteínas que tienen varios
puntos, entonces estas secuencias tienen sitios de unión
al ADN, o eventualmente un dominio de activación, o un
dominio flexible o de módulo. Todos los factores de
transcripción tiene la misma característica; se unen en un
sitio de union al ADN y tienen sitios de activación que
van a servir para unirse al coactivador de la polimerasa
y a otros factores de transcripción.
Cuando los factores de transcripción hagan su
interacción van a formar estructura de diferentes tipos, y
uno de ellos se llaman dedos de zinc (pulgar levantado),
toman estructuras que microscopicamentes se pueden
observar, lo que permite identificar tridimensionalmente,
a través de técnicas de bioinformática donde están los sitios activos, donde están los
sitios union.
r
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