МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РЕСПУБЛИКИ БЕЛАРУСЬ
БЕЛОРУССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ
Кафедра генетики
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ НАРУШЕНИЯ ПРИ МЕЛАНОМЕ КОЖИ
Курсовая работа
Шаюка Тимофея Максимовича
студента 3 курса
43 группы
Специальность «научнопроизводственная деятельность»
Научный руководитель: кандидат
медицинских наук Субоч Е.В.
.
.
Минск, 2022
ОГЛАВЛЕНИЕ
ОГЛАВЛЕНИЕ .................................................................................................................................. 2
ВВЕДЕНИЕ ........................................................................................................................................ 3
ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ .................................................................................................... 4
1.1
Эпидемиология меланомы кожи ........................................................................................... 4
1.1.1
Воздействие солнца ............................................................................................................ 4
1.1.2
Иные факторы риска........................................................................................................... 6
1.1.3
Факторы хозяина ................................................................................................................. 7
1.2
Основные принципы лечения меланомы ............................................................................. 8
1.2.1 Хирургия первичной опухоли ................................................................................................. 9
1.2.2 Радиотерапия........................................................................................................................... 13
1.3 Иммунотерапия .......................................................................................................................... 14
1.3.1 Блокада CTLA-4...................................................................................................................... 15
1.3.2 Блокада PD-1 ........................................................................................................................... 16
1.3.3 Комбинация ингибиторов контрольных точек имунного ответа и таргетной терапии ... 17
1.3.4 Комбинация ингибиторов контрольных точек имунного ответа и таргетной терапии ... 18
1.4 Молекулярный патогенез меланомы кожи ............................................................................. 19
1.4.1 Изменения пути pRb при меланоме ...................................................................................... 19
1.4.2 Путь RAS/RAF/MEK/ERK ..................................................................................................... 20
1.4.3 Путь PI3K/AKT ....................................................................................................................... 23
1.4.4 Путь WNT/b-катенин ............................................................................................................. 24
1.4.5 Путь p53 ................................................................................................................................... 25
1.4.6 Прогностическое значение мутаций в генах BRAF и NRAS ............................................... 26
1.4.7 Прогностическое значение мутаций в гене c-Kit................................................................. 28
1.5 Методы молекулярной диагностики........................................................................................ 30
1.5.1 ПЦР .......................................................................................................................................... 30
1.5.2 Секвенирование по Сенгеру .................................................................................................. 32
1.5.3 NGS (Секвенирование нового поколения) ........................................................................... 33
ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ .......................................................................................... 35
Выделение ДНК из парафинизированной опухолевой ткани ..................................................... 35
2
Анализ мутаций в 600 кодоне гена BRAF с использованием методики АС-ПЦР............. 36
ГЛАВА 3 АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ............................................................................................. 39
ЗАКЛЮЧЕНИЕ................................................................................................................................ 41
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ ...................................................................... 41
ВВЕДЕНИЕ
Менее чем за 10 лет в лечении меланомы произошла революция, когда
были одобрены ингибиторы тирозинкиназы и ингибиторы иммунных
контрольных точек, которые, как было показано, оказывают значительное
влияние на прогноз пациентов с меланомой. Первые шаги этой трансформации
произошли в исследовательских лабораториях. Путь митоген-активированной
протеинкиназы (MAPK), путь фосфоинозитол-3-киназы (PI3K) способствуют
развитию меланомы через многочисленные геномные изменения различных
компонентов этих путей. Более того, клетки меланомы глубоко взаимодействуют
с микроокружением опухоли и иммунной системой. Эти знания привели к
выявлению новых терапевтических мишеней и стратегий лечения. В данной
курсовой работе рассмотрены эпидемиологические особенности кожной
меланомы, а также биологические механизмы, участвующие в ее развитии и
прогрессировании. Также обсуждаются современные стратегии лечения
меланомы и имеющиеся на сегодняшний день данные об использовании
прогностических биомаркеров.
Цель данной курсовой работы –
Для решения поставленной цели решались следующие задачи:
3
ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1
Эпидемиология меланомы кожи
За последние 50 лет заболеваемость меланомой достаточно сильно
возросла, увеличившись с 8,2-9,4 случаев на 100 000 населения в 1975 году
(женщин и мужчин, соответственно) с поправкой на возраст до приблизительно
24,2 и 35,4 на 100 000 населения в 2010 году (женщин и мужчин, соответственно)
в США. Смертность также увеличилась, причем недавно было достигнуто плато
среди женщин, а среди мужчин она продолжает расти [1].
Эпидемиология меланомы кожи достаточно сложна и индивидуальный риск
зависит от воздействия солнца, факторов хозяина и генетических факторов, а
также взаимодействия этих факторов:
Воздействие солнца можно классифицировать как периодическое,
хроническое или кумулятивное (общее), и каждое из них, по-разному влияет на
тип меланомы. Другие факторы окружающей среды, такие как химическое
воздействие – посредством специфики профессии отдельного человека,
атмосферы или потребляемой пищи - могут повышать риск развития меланомы,
и эти факторы требуют дальнейшего изучения. Известно, что важными
факторами хозяина являются количество и типы невусов, а также фенотип кожи.
Генетические факторы классифицируются на гены высокого риска, гены
умеренного риска или генетические полиморфизмы низкого риска.
1.1.1 Воздействие солнца
Основным фактором окружающей среды для развития меланомы является
воздействие солнца. Доля меланомы, возникновение которой связано с
воздействием солнца, была оценена более чем на 90 % в Австралии, Канаде,
скандинавских странах, Швейцарии и США и от 78 до 90 % в некоторых других
европейских странах, включая Великобританию, где, по последним оценкам, 86
% меланомы связано с воздействием солнца [2]. Измерение воздействия солнца
для отдельного человека разнится от исследования к исследованию, но обычно
классификация в себя включает периодическое (короткое, интенсивное
воздействие солнца в результате принятия солнечных ванн, отдыха на открытом
4
воздухе и отпуска в солнечном климате), хроническое (более продолжительное,
чем периодическое, в основном воздействие связанное с профессиональной
деятельностью человека) и общее воздействие солнца (сумма периодического и
хронического воздействия). Есть убедительные доказательства того, что
периодическое пребывание на солнце увеличивает риск развития меланомы.
Также было выяснено, что хроническое пребывание на солнце не имеет связи
или имеет слабую обратную связь с риском развития меланомы. Общее
пребывание на солнце в течение всей жизни имеет положительную корреляцию
с риском развития меланомы, но эта связь слабее, чем для периодического
пребывания на солнце. Солнечный ожог – последствие и маркер периодического
воздействия солнца, и существует тенденция к большей прямой корреляции для
солнечного ожога, чем для периодического воздействия. Слабая связь развития
меланомы с хроническим воздействием солнца может быть обусловлена тем, что
оно способствует утолщению эпителия, что вместе с эффектом загара может
обеспечить некоторую защиту от воздействия солнечной радиации в будущем
[1]. В некоторых исследованиях, посвященных хроническому воздействию
солнца, оценка риска была ниже 1.00, но эти результаты не следует
интерпретировать в ключе того, что хроническое воздействие солнца даёт
защитный эффект против меланомы кожи [3].
Рисунок 1.1 – Злокачественная трансформация меланоцитов
Хроническое воздействие солнца - это в основном профессиональное
воздействие для людей, работающих на открытом воздухе, и в исследованиях
различных типов солнечного воздействия референтные категории могли
включать людей с высоким уровнем периодического воздействия вместе с
людьми с низким уровнем воздействия, тем самым искусственно создавая низкие
коэффициенты риска у лиц с высоким уровнем хронического воздействия [4].
Анализ двух крупных исследований методом случай-контроль показал
5
отсутствие связи между профессиональным воздействием и риском развития
меланомы, а также отсутствие признаков конфаудинга рекреационным
воздействием [5]. Важно отметить, что наличие солнечных кератозов - маркера
высокого кумулятивного воздействия солнца - положительно связано с риском
развития меланомы [4]. Следует отметить, что имеющиеся данные
свидетельствуют о том, что воздействие солнца может вызвать меланому на всех
участках тела, но риск, как правило, выше для участков, обычно
подвергающихся воздействию солнца, чем для участков, подвергающихся
воздействию время от времени [6]. Вероятно, важную роль играет солнечное
облучение в раннем возрасте, иногда за десятилетия до постановки диагноза.
Миграционные исследования показали, что детство является чувствительным
периодом [4]. Современные данные также свидетельствуют о том, что риск
меланомы продолжает увеличиваться по мере накопления периодического
солнечного облучения. Мета-анализы показали, что риск меланомы повышается
с увеличением числа солнечных ожогов во все периоды жизни (детство,
подростковый возраст, взрослая жизнь и за период всей жизни) [7], без
существенных различий между солнечными ожогами в детском и взрослом
возрасте.
1.1.2 Иные факторы риска
Несколько исследований показали, что воздействие полициклических
ароматических углеводородов, бензола или других химических веществ,
используемых в полиграфической промышленности [8,9], связано с развитием
меланомы. Аналогичным образом, исследования работников химической
промышленности также показали повышенный риск развития меланомы [10,11].
Когортные исследования работников электрооборудования и электроники
[12,13] также показали повышенный риск развития меланомы. Была выдвинута
гипотеза,
что
работники
профессий,
подверженных
воздействию
ионизирующего излучения, могут быть также подвержены повышенному риску
развития меланомы.
Следует отметить, что не все исследования показывают повышенный риск
в какой-либо из этих отраслей или профессий. Кроме того, работники
химической, электротехнической и электронной промышленности потенциально
подвергаются воздействию большого количества агентов на рабочем месте, что
затрудняет или делает невозможным связать повышенный риск с одним или
несколькими конкретными химическими веществами. Большинство оценок
повышенного риска основаны на относительно небольшом количестве случаев
меланомы, так как исследования до настоящего времени были преимущественно
6
когортными, направленными на оценку заболеваемости или смертности от
распространенных видов рака, а меланома все еще является относительно
редким
заболеванием
в
большинстве
популяций.
Наконец,
эти
профессиональные исследования обычно основаны только на трудовых книжках
и, таким образом, не могут корректировать основные известные факторы риска
заболевания, включая фенотипические характеристики, плотность невусов и
воздействие ультрафиолетового излучения [1].
1.1.3 Факторы хозяина
Факторы хозяина в значительной степени изменяют реакцию человека на
УФ-излучение - основной экологический фактор риска развития меланомы.
Факторы хозяина относятся к характеристикам пигментации: невусы, цвет кожи,
волос и глаз, способность загорать и склонность к солнечным ожогам.
Основным фактором риска развития меланомы является количество и тип
невусов. Невусы - это доброкачественные скопления меланоцитов, и количество
невусов было названо в многочисленных исследованиях самым важным
фактором риска развития меланомы, причем увеличение количества невусов
связано с повышенным риском заболевания [14]. Мета-анализ показал, что у лиц
с более чем 100 нормальными невусами риск почти в семь раз выше, чем у лиц с
небольшим количеством (≤15) невусов [3,15].
Также считается, что увеличение риска происходит постепенно и
пропорционально количеству имеющихся невусов. Было показано, что наличие
11-25 невусов приводит к увеличению риска в 1,5 раза по сравнению с менее чем
10 невусами, и этот риск удваивается с каждым дополнительным 25 невусом [16].
Размер фактического невуса также повышает риск развития меланомы, особенно
тех, которые превышают 2,0 мм в диаметре. Роль невусов как предшественников
меланомы или маркеров риска меланомы является спорной. Однако они часто
встречаются рядом с тонкими меланомами (менее 1,70 мм) и реже встречаются
среди более толстых меланом [17]. Приблизительно 50 % меланом менее 1,0 мм
имеют прилегающие остатки невусов [18]. Тем не менее, многие меланомы
возникают de novo; очевидно, что лица с большим количеством невусов имеют
высокий риск развития меланомы.
Диспластические или атипичные невусы также связаны с повышенным
риском развития меланомы. Эта подгруппа невусов характеризуется
цитологическими аномалиями, по крайней мере, трех признаков: нечетко
очерченной границы, неровного контура, наличия эритемы и изменений цвета
или размера более 5 мм [3, 15, 16]. У людей, имеющих только одно атипичное
7
новообразование, риск развития меланомы повышается в 1,6 раза, а при наличии
пяти и более атипичных невусов этот риск возрастает в десять раз [3,15].
Точный характер роли невусов в развитии и прогрессировании меланомы
еще не до конца понятен. Вероятно, отчасти это связано с тем, что факторы,
влияющие на экспрессию и развитие невуса, также сложны и еще не до конца
выяснены. Исследование близнецов показало, что вклад генетических факторов
в экспрессию невусов был опосредован воздействием солнца и что с возрастом
вклад, обусловленный воздействием солнца, значительно уменьшается,
увеличивая долю экспрессии невусов, обусловленную генетикой. Невусы на
участках тела, регулярно подвергающихся воздействию солнца, имели меньший
генетический вклад в дисперсию, чем невусы на солнцезащищённых участках,
что свидетельствует о большем влиянии солнечного облучения на развитие
невусов на открытых участках тела [19].
Говоря о других факторах пигментации, стоит сказать, что особенности
пигментации являются хорошо известными факторами риска развития
меланомы, причем известно, что цвет кожи, глаз и волос связан с
предрасположенностью к этому заболеванию. Постоянно демонстрируется
обратная зависимость между риском развития меланомы и степенью
пигментации кожи [20, 21]. У светлокожих людей риск развития меланомы
гораздо выше, чем у темнокожих, при этом оценка риска у лиц неевропейского
происхождения, которые обычно имеют темную кожу, в 10-20 раз ниже, чем у
лиц европейского происхождения, которые обычно имеют светлую кожу [14, 22].
Реакция кожи на солнце также является отправной точкой для предсказания
риска развития меланомы. Кожа, которая легко покрывается веснушками, имеет
склонность к ожогам или неспособность загорать, что свидетельствует о
повышенной предрасположенности к заболеванию [22, 23].
1.2 Основные принципы лечения меланомы
Говоря в общем о принципах лечения меланомы, стоит сказать следующее.
Адекватное хирургическое лечение первичной меланомы и метастазов в
региональных лимфатических узлах, а в редких случаях и отдаленных
метастазов, является единственным установленным методом лечения.
Хирургическое лечение первичных меланом состоит из иссечения с краями 1-2
см и наложения первичных швов. Рекомендуемый метод биопсии - эксцизионная
биопсия с краем 2 мм и небольшим количеством подкожной жировой клетчатки.
В особых ситуациях (очень большие поражения или определенные
8
анатомические области) может быть приемлемой эксцизионная или
пункционная биопсия всей толщины. Биопсия сторожевого лимфатического узла
дает точную информацию для стадирования пациентов с клинически
непораженными регионарными узлами и без отдаленных метастазов, хотя пользя
в повышении выживаемости не доказана. В случае положительной биопсии
сторожевого лимфоузла или клинически выявленных региональных узловых
метастазов
(пальпируемых,
положительно
цитологических
или
гистопатологических) показано радикальное удаление лимфатических узлов
вовлеченного региона. При операбельных местных/интранзитных рецидивах
рекомендуется иссечение с четким краем. При многочисленных или
ноперабельных транзиторных метастазах в конечности следует рассмотреть
возможность изолированной перфузии конечности или инфузии мелфалана.
Решение о хирургическом лечении отдаленных метастазов должно приниматься
с учетом индивидуальных обстоятельств. Лучевая терапия показана как вариант
лечения для отдельных пациентов с меланомой lentigo maligna и как адъювант
для отдельных пациентов с региональным метастазированием. Радиотерапия
также показана для паллиации, особенно при костных метастазах и
метастазировании в мозг [24].
1.2.1 Хирургия первичной опухоли
1.2.1.1 Биопсия
Поражения кожи, которые могут быть меланомой, должны быть
направлены на обследование с использованием системы ABCDE (A, асимметрия;
B, неровные границы; C,
изменение цвета; D, диаметр >5 мм; E, возвышение) или по системе Глазго
[25]. Однако >50% меланом являются новообразованными поражениями,
которые могут не иметь ни одной из перечисленных выше характеристик.
Эксцизионная
биопсия
необходима
для
точной
диагностики
и
микростадирования. Это определяет выбор дальнейшей терапии и дает важную
прогностическую информацию. Патологическое заключение должно включать
толщину по Бреслоу (мм), наличие изъязвлений, митотический индекс (0 или
±1/мм2), уровень Кларка, размер бокового и глубокого хирургического края (мм)
и наличие местного метастазирования. Митотический индекс является третьим
по значимости независимым прогностическим фактором [26]. Регрессия,
инфильтрирующие опухоль лимфоциты, вертикальная фаза роста,
9
ангиолимфатическая инвазия, нейротропизм и гистологический подтип также
могут иметь значение.
Эксцизионная биопсия обычно проводится с боковым краем в 2 мм и
манжетой из подкожного жира. Инцизионная или пункционная биопсия может
проводиться при поражениях, которые трудно удалить из-за их размера или
места расположения. Считается, что она не оказывает вредного воздействия,
если последующая терапевтическая операция проводится в течение 4-6 недель.
Бритвенная биопсия или биопсию кюреткой проводить не следует, поскольку
она ограничивает количество и качество образца для патологической оценки.
Первоначальный биопсийный рубец не должен мешать последующей операции;
на конечности он должен быть ориентирован вдоль длинной оси исследуемой
области [24].
1.2.1.2 Радикальная хирургия
До 1970-х годов края терапевтического иссечения варьировались от
3 до >5 см. Однако с тех пор было оценено влияние ширины краев
иссечения на частоту местных рецидивов и выживаемость. Три исследования
были проведены для меланом меньше 2 мм: Французское исследование
Кооперативной группы [27] и Скандинавское исследование Группы по меланоме
[28] сравнивали края резекции 2 см и 5 см, а исследование 10 Программы по
меланоме Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) сравнивало края
резекции 1 см и 3 см [29]. Ни одно из этих исследований не продемонстрировало
преимущества более широких краёв резекции.
Для меланом промежуточной толщины (1-4 мм) 486 пациентов,
участвовавших в Межгрупповом испытании [30, 31], были рандомизированы к 2
см или 4 см краями резекции. Показатели местного рецидива (2,1% по сравнению
с 2,6%, соответственно) и общей выживаемости были одинаковыми (79% по
сравнению с 81%, соответственно). В группе пациентов с краями резекции в 2 см
пересадка кожи потребовалась только в 11% случаев, по сравнению с 46%
случаев в группе с краями резекции 4 см (P < 0,001). Два крупных исследования
были проведены среди пациентов с меланомами толщиной более 2 мм:
исследование UK Melanoma Study Group (MSG) с участием 900 пациентов
сравнивало края 1 см и 3 см, а скандинавское исследование с участием 936
пациентов сравнивало края 2 см и 4 см [32, 33]. В британском исследовании MSG
общая выживаемость была одинаковой в обеих группах, хотя в группе с узким
краем отмечалась на 25% более высокая частота локорегиональных рецидивов
[отношение рисков 1,26, P = 0,05]. Скандинавское исследование, в котором
пациенты с меланомами >2,0 мм (pT3, pT4) рандомизировались между 2 см и 4
см краями, не выявило различий в результатах по показателям выживаемости без
рецидивов или общей выживаемости [33,34].
10
Данных по меланомам толщиной более 4 мм меньше, поскольку
заболевание в этом диапазоне толщины встречается редко. Крупное, но
нерандомизированное исследование [35] показало, что иссечения с краями шире
2 см не влияют на частоту местных рецидивов, выживаемость без рецидивов и
общую выживаемость. В британское MSG и скандинавские исследования были
включены пациенты с меланомами >4 мм [33,34]. Для меланомы толщиной не
более 1 мм достаточно иссечения с краем в 1 см. Рекомендации относительно
инвазивной меланомы толщиной 1-2 мм менее ясны; однако многие
национальные руководства указывают, что достаточно иссечения с краем 1-2 см,
особенно в областях анатомических ограничений, связанных с ожидаемыми
функциональными или косметическими деформациями (например, лицо,
дистальная часть конечностей). При меланомах >2 мм уместен край в 2 см [24].
Во всех хирургических исследованиях первичной меланомы глубина иссечения
всегда была не менее чем до мышечной фасции, и это рекомендуемая глубина
края резекции, так как более поверхностное иссечение не было признано
эквивалентным. Не было доказано, что более глубокое иссечение улучшает
исход операции [36, 37]. В целом, все это означает, что хирургическое лечение
первичной меланомы состоит из иссечения и первичного закрытия.
1.2.1.3 Техническая сторона хирургии
Длинная ось разреза должна располагаться в направлении лимфатического
дренажа и параллельно длинной оси конечности. Это снижает риск развития
лимфатического отека (особенно в случае последующего иссечения
лимфатических узлов). Первичное закрытие без "собачьих ушей" обычно
требует, чтобы длинная ось эллиптического разреза была как минимум в три раза
длиннее короткой оси. Иссечение также должно включать подкожную клетчатку
вплоть до лежащей под ней мышечной фасции, но не включая ее. Большинство
ран с краями иссечения 1-2 см могут быть закрыты первично. В меньшинстве
случаев используется пересадка кусочков кожи или местных лоскутов
произвольной формы. Полнотолщинные трансплантаты обычно используются
на лице или руках для достижения лучших эстетических и косметических
результатов и могут быть взяты из-за уха, из надключичной или паховой области,
или из места биопсии дозорного узла. Пересадка свободных тканей с
микрососудистой реконструкцией используется в основном при обширных
заболеваниях на голове и шее. Микрографическая операция Моса не подходит
для лечения первичной меланомы, поскольку ее целью является удаление
местных микрометастазов, которые, по определению, не связаны с первичным
поражением. Операция Моса может быть полезна при обширном прилежащем
заболевании, таком как большая, клинически плохо определяемая меланома in
situ типа lentigo maligna и возможно, десмопластическая меланома [24].
11
1.2.1.4 Первичная меланома в специфических местах
Меланома на ладонях и подошвах ног, ногтях, голове и шее должна
лечиться как обычно, исходя из толщины опухоли. Пациенты с такими
поражениями обычно исключаются из хирургических исследований. Имеется
мало достоверных данных о резекционных краях и адъювантной
химиорадиотерапии при меланоме слизистых оболочек и аногенитальной
меланоме.
Первичная меланома, расположенная на слизистых оболочках, составляет
<3% от всех меланом, но является агрессивной, и только 20% пациентов
выживают в течение 5 лет [38]. Среди слизистых оболочек наиболее часто
встречаются голова и шея (±50%), женские половые пути (в основном вульва,
20%) и аноректальная область (20%) [38, 39]. Самыми редкими являются
первичные меланомы, происходящие из мочевыводящих путей и
желудка/кишечника. Раннее выявление маловероятно из-за скрытых
анатомических локализаций. Диагноз должен быть установлен после биопсии
всей толщины подозрительного поражения, за исключением небольших
поражений, подходящих для эксцизионной биопсии. Эксцизионная биопсия
должна включать репрезентативный образец с границы поражения, чтобы
помочь патологу дифференцировать первичную меланому слизистой оболочки
от метастаза меланомы слизистой оболочки. Меланома слизистой оболочки
головы и шеи поражает в основном носовую и ротовую полости. Основным
подходом к лечению меланомы слизистой оболочки является широкая
хирургическая резекция, однако 5-летняя OS составляет всего 13-22% [40, 41].
Хотя многие случаи меланомы слизистых оболочек лечатся только
хирургическим путем, радиотерапия или химиотерапия в качестве адъювантной
терапии или даже единственного метода (радиотерапия) применяется чаще, чем
при кожной меланоме, хотя польза от этого неясна. Наиболее частой первичной
локализацией генитальной меланомы является вульва [42]; отмечается высокая
частота местных и отдаленных метастазов. Радикальная вульвэктомия, в отличие
от широкого местного иссечения, связана с очень высокой заболеваемостью и не
рекомендуется. В большинстве случаев меланома полового члена лечится путем
ампутации [43]. При генитальной меланоме может быть рассмотрена
возможность стадирования с помощью биопсии сторожевого узла. Большинство
меланом аноректальной области возникает ниже зубчатой линии в сквамозной
слизистой оболочке и поэтому часто проявляется поздно. Не было выявлено
существенных различий между абдоминоперинеальной резекцией и местным
иссечением ни в общей выживаемости, ни в выживаемости без рецидивов [44].
Выбранной процедурой является широкое местное иссечение с гистологически
12
четкими краями (УЗИ может быть полезным в определении границ поражения),
что позволяет избежать постоянной колостомы.
1.2.2 Радиотерапия
Радиотерапия - это метод лечения рака, способствующий излечению или
паллиации онкологических больных. Кожная меланома долгое время считалась
относительно радиорезистентной опухолью, что связано с отчетливо
выраженным широким плечом в низкодозовой части кривой выживаемости [45].
Ранние исследования меланомы показали, что частота ответа зависит от размера
дозы на фракцию [24]. Однако недавние исследования клеточных линий
показывают характеристики, сходные с характеристиками остро и медленно
реагирующей нормальной ткани с широкой вариабельностью внутренней
радиочувствительности
[46,
47].
Единственное
рандомизированное
исследование, в котором оценивалась эффективность высокодозного
фракционного облучения при лечении меланомы, было запланировано
Онкологической группой лучевой терапии (RTOG) в 1983 году. Сто тридцать
семь пациентов без метастазов в брюшную полость или головной мозг и с 50%
поражений >5 см были рандомизированы на четыре фракции по 8 Гр или 20
фракций по 2,5 Гр. В обеих группах частота общего и полного ответа составила
59% и 24% соответственно [48]. Предпочтение следует отдавать традиционным
схемам фракционирования, поскольку они одинаково эффективны в борьбе с
опухолью. В некоторых ситуациях, таких как паллиация костных метастазов или
облегчение метастатических поражений у пациентов с небольшой
продолжительностью жизни, более высокая доза на фракцию является более
удобной.
1.2.2.1 Радиотерапия первичной меланомы
Хирургическая резекция доказала свою эффективность с низким риском,
поэтому радиотерапия не является основным методом лечения инвазивной
кожной меланомы. Радиотерапия должна рассматриваться при lentigo maligna,
особенно у пожилых пациентов с обширным или нерезектабельным
заболеванием [24]. Однако, не было доказано, что она эффективна при меланоме
lentigo maligna. Он также может применяться при десмопластической меланоме,
но только в тех случаях, когда невозможно резекцию провести с достаточным
резекционным краем [24]. Нет данных, подтверждающих эффективность
адъювантной радиотерапии при других формах кожной меланомы. Она может
редко применяться специалистами по меланоме при наличии недостаточного
13
резекционного края, когда повторную резекцию провести трудно, а локальная
неудача при операции может поставить под угрозу вероятность излечения.
Радиотерапия может быть успешно использована для лечения меланомы
слизистой полости носа и околоносовых пазух. При меланомах слизистой
оболочки методы первичной радиотерапии приводят к регрессии с частотой 80%
[49, 50]. Послеоперационная радиотерапия была выявлена более эффективной,
чем только хирургическое вмешательство [24], и некоторые авторы считают
хирургическое
вмешательство
с
послеоперационной
радиотерапией
современным стандартом лечения меланомы слизистых головы и шеи [51].
Однако необходимы проспективные рандомизированные исследования
адъювантной терапии, чтобы оценить реальное влияние радиотерапии на
качество жизни и общую выживаемость.
Радиотерапия играет важную роль в паллиации многих симптомов у
пациентов с меланомой. Обычно предпочитается короткий курс радиотерапии, и
примерно в двух третях случаев удается добиться хорошей паллиации; однако
точная степень ответа опухоли в значительной степени зависит от размера
опухоли на момент облучения [48]. Об облегчении боли и/или декомпрессии у
67% пациентов с костными метастазами и хорошей паллиации у 80-85%
аналогичных пациентов сообщалось при использовании 30 Гр за 10 фракций или
20 Гр за 5 фракций [49]. Общая частота ответа при использовании различных
фракционных доз варьирует от 9% до 92%, а медиана составляет 50% [51]. Такой
же процент был достигнут в рандомизированном исследовании RTOG 83-05, что
подтверждает, что радиотерапия по-прежнему является наилучшим методом
паллиации в тех случаях, когда операция не применима.
1.3 Иммунотерапия
Меланома является одной из наиболее чувствительных опухолей к
иммунной модуляции. Несколько факторов влияют на восприимчивость клеток
меланомы к ответу иммунной системы, включая высокую мутационную
нагрузку опухоли из-за воздействия ультрафиолетового света, экспрессию
антигенов рака/яичка и мимикрию белков линии меланоцитов с патогенассоциированными антигенами. В этом контексте Т-клеточный ответ, повидимому, играет центральную роль для удержания меланомы от развития.
Инфильтрирующие опухоль лимфоциты (TILs) играют центральную роль в
развитии противоопухолевого иммунного ответа, а подгруппа TILs
демонстрирует цитолитическую активность против аутологичных опухолей у
14
пациентов с меланомой. Их присутствие также коррелирует с увеличением
выживаемости и снижением риска метастазирования. В последние десятилетия
было проведено несколько клинических испытаний, направленных на
вызывание Т-клеточного ответа с помощью местных или системных
иммуномодулирующих препаратов, таких как интерферон-α, интерлейкин-2,
противораковые вакцины и адоптивная трансплантация клеток [52]. Несмотря на
некоторые доказательства активности, эти испытания не смогли
продемонстрировать устойчивый эффект у пациентов с метастатической
меланомой. Совсем недавно ингибиторы контрольных точек против
цитотоксического антигена-4 Т-лимфоцитов (CTLA-4) и программируемой
смерти-1 (PD-1) кардинально изменили лечение как нерезектабельной и
метастатической меланомы, так и пациентов с высоким риском рецидива после
резекции. К сожалению, первичная и вторичная резистентность и отсутствие
прогностических маркеров ответа являются сложными проблемами терапии
ингибиторами контрольных точек [53]. Комбинация стратегий иммунотерапии
направлена на улучшение ответа и преодоление резистентности, а обнаружение
биомаркеров имеет фундаментальное значение для оптимизации отбора
пациентов.
1.3.1 Блокада CTLA-4
CTLA-4 - это ингибирующий рецептор-контрольная точка иммунного
ответа, который блокирует активацию Т-клеток и вызывает иммунную
супрессию. В 1996 году было выяснено, что блокада CTLA-4 может ослабить
рост нескольких имплантированных мышиных опухолей [54]. В 2011 году
ипилимумаб, полностью человеческое моноклональное антитело IgG1, которое
ингибирует взаимодействие между CTLA-4 и его лигандами, стал первым
ингибитором контрольной точки одобренным FDA [52]. У ранее леченных
пациентов с развитой меланомой ипилимумаб улучшил медиану общей
выживаемости по сравнению с пептидной вакциной gp100 (10,6 против 6,4
месяцев) [55]. За 3 года выживаемость составляла 22%, после чего на протяжении
10 лет наблюдалось плато кривой выживаемости [56]. Комбинированные
стратегии ипилимумаба с IL-2 или Peg-IFN не показали улучшения по сравнению
с монотерапией ипилимумабом. Тремелимумаб, еще одно моноклональное
антитело, направленное против CTLA-4, не продемонстрировал преимущества в
выживании по сравнению со стандартной химиотерапией в клиническом
исследовании III фазы [57]. В адъювантном случае рандомизированное
15
клиническое исследование среди пациентов с резецированным раком III стадии
показало, что ипилимумаб улучшает безрецидивную выживаемость и общую
выживаемость по сравнению с плацебо.
1.3.2 Блокада PD-1
PD-1 - это иммунный контрольная точка, играющая центральную роль в
иммунопатологии и иммунном надзоре за опухолью посредством ингибирования
эффекторных Т-клеток [58]. В 2014 году два моноклональных антитела,
направленных на PD-1 (ниволумаб и пембролизумаб), получили одобрение FDA,
став препаратами первой линии лечения метастатической меланомы.
Рандомизированные клинические исследования показали, что монотерапия
ниволумабом или пембролизумабом превосходит только ипилимумаб [59].
Монотерапия пембролизумабом у ранее лечившихся пациентов показала
устойчивый ответ на 30-40% [52]. При лечении 'наивных' пациентов
пембролизумаб показал 3-летнюю общую выживаемость в 51% и 5-летнюю в
41% [60,61]. Клинические испытания монотерапии ниволумабом обеспечили
стойкий ответ 32% у пациентов без лечения и 40% у пациентов с ранее леченной
меланомой [62,63]. Трехлетняя выживаемость при применении ниволумаба у
ранее не леченных пациентов составляет 42% [64], в то время как 5-летняя
выживаемость у ранее леченных пациентов при монотерапии ниволумабом
составляет 35% [65]. Перекрестное сравнение однородных групп пациентов,
получавших монотерапию пембролизумабом или ниволумабом, дало сходные
результаты в отношении клинических конечных точек и частоты нежелательных
явлений [66]. С 2017 года адъювантная иммунотерапия с использованием одного
агента анти-PD-1 моноклонального тела является первым вариантом лечения у
пациентов с резецированным заболеванием III стадии. Ниволумаб улучшил
безрецидивную выживаемость по сравнению с ипилимумабом при меньшей
токсичности [67]. В двойном слепом исследовании 3-й фазы лечение
пембролизумабом привело к значительному увеличению продолжительности
безрецидивной выживаемости по сравнению с плацебо при отсутствии новых
токсических эффектов [67]. по сравнению с другими исследованиями
монотерапии пембролизумабом [68].
16
1.3.3 Комбинация ингибиторов контрольных точек имунного ответа и
таргетной терапии
Монотерапия ингибиторами контрольных иммунных точек ассоциируется со
значительным улучшением выживаемости пациентов, однако частота ответов на
терапию низка. В попытке увеличить число пациентов, получающих пользу от
терапии ИКИ, в проспективных клинических исследованиях оценивалась
комбинация анти-CTLA-4 моноклональных антител плюс анти-PD-1
моноклональных антител. В частности, два рандомизированных исследования
показали, что комбинация анти-CTLA-4 плюс анти-PD-1 моноклональные
антитела приводит к увеличению клинической пользы по сравнению с одним
препаратом ипилимумаб или ниволумаб. Checkmate-067, рандомизированное
клиническое исследование третьей фазы, сравнивало ипилимумаб плюс
ниволумаб с одним только ниволумабом и одним только ипилимумабом при
нерезектабельной/метастатической меланоме. Показатели ответа составили 57,6,
43,7 и 19% соответственно, а 5-летняя выживаемость - 52% в группе с
комбинацией, 44% в группе с ниволумабом и 26% в группе с ипилимумабом
[69,70]. В комбинированной группе наблюдалась повышенная токсичность по
сравнению с каждой группой монотерапии. В частности, связанные с лечением
нежелательные явления любого класса возникли у 95% пациентов в группе
комбинированного лечения по сравнению с 82% в группе ниволумаба и 86% в
группе ипилимумаба. Нежелательные явления 3 или 4 степени, связанные с
лечением, произошли у 55% пациентов в группе ниволумаб плюс ипилимумаб, у
16,3% пациентов в группе ниволумаба и у 27,3% пациентов в группе
ипилимумаба [69]. В 2015 году FDA одобрило комбинацию ипилимумаб плюс
ниволумаб на основании общей частоты ответов и улучшения выживаемости без
прогрессирования. В попытке снизить токсическую нагрузку комбинации были
исследованы различные графики дозирования путем снижения дозы
ипилимумаба и применения более стандартных доз анти-PD-1 одиночных
агентов. Хотя общая степень ответа, по-видимому, сохраняется, ожидаемая
разница в эффективности и безопасности невелика, и только результаты более
крупных исследований будут окончательными [71,72]. В настоящее время
соответствующие преимущества комбинированной иммунотерапии по
сравнению с последовательной иммунотерапией еще не до конца изучены и
являются предметом открытых дебатов в клиническом и научном сообществе. С
одной стороны, комбинированные стратегии ассоциируются с повышенным
количеством неблагоприятных событий, что может быть оправдано намерением
17
добиться долгосрочного ответа на болезнь. С другой стороны, неизвестно
подмножество пациентов, которые получают больше пользы от комбинации, что
потенциально подвергает пациентов ненужной токсичности [73]. Метастазы в
головной мозг являются распространенной причиной инвалидизирующих
неврологических осложнений и плохого прогноза у пациентов с метастатической
меланомой. Клиническое исследование 2 фазы CheckMate-204 включало
пациентов с небольшими, неизлеченными и бессимптомными метастазами в
головной мозг и показало, что ипилимумаб плюс ниволумаб обладают
клинически значимой эффективностью (56% ответа). Профиль безопасности был
аналогичен тем, которые были зарегистрированы для этой комбинации у
пациентов без метастазов в головной мозг [74]. В другом клиническом
исследовании фазы 2 сравнивалась комбинация ниволумаб плюс ипилимумаб
против одного только ниволумаба. Несмотря на небольшой размер выборки,
комбинация ИКИ превосходила монотерапию ниволумабом, при этом у большой
доли пациентов был зафиксирован ответа [75]. Пока нет данных о потенциальной
пользе комбинации анти-CTLA-4 плюс анти-PD-1 в адъювантной терапии.
1.3.4 Комбинация ингибиторов контрольных точек имунного ответа и
таргетной терапии
Таргетная терапия и ИКИ радикально изменили лечение различных типов
опухолей, включая меланому на поздней стадии [76]. Однако оба подхода имеют
свои ограничения, включая ограниченную продолжительность ответа при
таргетной терапии и низкую общую частоту ответа без четких прогностических
биомаркеров у пациентов, получающих ИКИ. Поэтому большой интерес
вызывает возможность создания комбинированных стратегий, которые могли бы
использовать преимущества высокой частоты ответа при таргетной терапии и
длительного контроля заболевания при использовании ИКИ. Несмотря на
некоторые контрастные доклинические результаты, полученные при
использовании ингибиторов BRAF и MEK в сочетании с иммунотерапией, в
настоящее время проводятся различные испытания по изучению сочетания
ингибиторов MAPK с ИКИ и другими стратегиями иммунотерапии [77].
Несколько испытаний с ингибиторами CTLA-4 и ингибиторами MAPK вызвали
беспокойство из-за токсичности, связанной с комбинациями, что привело к
досрочному прекращению испытаний [78,79]. Более толерантным и с хорошими
показателями контроля заболевания представляется объединение ингибиторов
оси PD-1/PD-L1 с ингибиторами BRAF и MEK [79]. В этом контексте дизайн
исследования является основополагающим для правильного проведения
18
клинических
токсичности.
испытаний
комбинированных
стратегий
без
увеличения
1.4 Молекулярный патогенез меланомы кожи
Меланома возникает в результате трансформации меланоцитов,
полученных из нервного гребня, пигментных клеток кожи, которые находятся в
базальном слое эпидермиса. Рассматривается меланому как сложная ткань,
возникающая в результате нарушения гомеостаза кожи, а не рассматриваем
только на клетки меланомы и генах в ней. Нормальный гомеостаз кожи
поддерживается динамическими взаимодействиями между меланоцитами и их
микроокружением, таким как кератиноциты, фибробласты, эндотелиальные и
иммунокомпетентные клетки, а также внеклеточный матрикс. Аналогичным
образом, во время трансформации и прогрессии меланоцитов в клетки меланомы
существуют, однако, дерегулированные, взаимные и конспиративные
взаимодействия между неопластическими клетками и прилегающими
стромальными клетками [80]. В нормальных физиологических условиях
меланоциты и кератиноциты образуют "меланиновую единицу" в эпидермисе. В
этой единице меланоциты и кератиноциты равномерно выровнены вдоль зоны
базовой мембраны в соотношении 1:5-8. Каждый меланоцит протягивает свои
дендриты в верхние слои эпидермиса, передавая пигментсодержащие
меланосомы примерно 35 кератиноцитам в своей единице через дендритные
отростки. Меланин, содержащийся в этих меланосомах, поглощает и рассеивает
повреждающее ультрафиолетовое излучение, тем самым защищая нуклеиновые
кислоты кожи от повреждения [81]. Недифференцированные кератиноциты
базального слоя регулируют рост меланоцитов, количество дендритов и
экспрессию молекул клеточной поверхности, предоставляя доказательства того,
что эта высокоупорядоченная организационная схема служит структурной
основой для межклеточной регуляции. Пока нет информации о том, как
меланоциты и кератиноциты могут поддерживать этот пожизненный баланс,
который нарушается только при трансформации в меланоцитарный невус
("родинку") или меланому. В настоящее время общепризнано, что риск развития
меланомы зависит пигментацией кожи, например, связанной с MC1R
полиморфизмами, и ранним воздействием ультрафиолетового (УФ) света [81].
1.4.1 Изменения пути pRb при меланоме
19
Путь p16-циклин D/Cdk4-pRb дерегулирован в подавляющем большинстве
раковых опухолей человека либо через потерю функции p16 или pRb, либо через
дерегулированную экспрессию циклина D или cdk4 [81]. В различных
злокачественных опухолях и их клеточных линиях было отмечено несколько
механизмов инактивации пути pRb. Наиболее распространенными известными
способами дисрегуляции продуктов этих генов в новообразованиях являются
делеция генов (гомозиготная или гемизиготная); инактивирующие мутации;
эпигенетические изменения, такие как метилирование промотора,
транскрипционная репрессия, секвестрация и инактивация белков (например,
вирусных онкопротеинов); и посттрансляционные модификации (например,
инактивирующие события фосфорилирования). Путь p16-циклин D/Cdk4-pRb
как функциональная единица часто изменяется в патогенезе меланомы [81]. В
одном исследовании практически все (96%) исследованные клеточные линии
меланомы имели изменения на уровне ДНК в CDKN2A/p16, CDKN2B/p15, CDK4
и CCND1/циклин D1 [82]. Инактивирующие мутации в "карманной" области
pRb, которая блокирует связывание с E2F, в меланоме встречаются редко.
Вместо
этого
функция
pRb
в
меланоме
обычно
подавляется
гиперфосфорилированием и, в меньшей степени, неполной экспрессией. В одном
исследовании был проведён геномный анализ числа копий ДНК и мутационный
анализ BRAF и NRAS в 126 меланомах, полученных от людей с разной историей
УФ-облучения [83]. Они обнаружили, что амплификация CDK4 часто
встречается в акральных и слизистых меланомах, но не наблюдается в опухолях
с активирующими мутациями BRAF или NRAS или увеличением числа копий
Циклин D1. Кроме того, потери/делеции локуса супрессора меланомы CDKN2A
также чаще обнаруживались в слизистых и акральных меланомах, но только в
образцах без амплификации CDK4.
1.4.2 Путь RAS/RAF/MEK/ERK
Сообщается, что путь RAS/RAF/MEK/ERK активируется в более чем 80%
всех кожных меланом. Этот сигнальный путь регулируется рецепторными
тирозинкиназами, цитокинами и гетеротримерными G-белок-связанными
рецепторами. Малый G-белок RAS (HRAS, KRAS и NRAS у людей) активирует
RAF (ARAF, BRAF и CRAF у людей) с последующей последовательной
активацией MEK и ERK, и этот сигнал в конечном итоге передается на
регуляцию транскрипции в ядре [84]. Этот путь конститутивно активируется
факторами роста (эпидермальный фактор роста [EGF], тромбоцитарный фактор
20
роста [PDG], фактор роста эндотелия сосудов [VEG], фактор стволовых клеток
[SCF], фактор роста фибробластов [FGF], фактор роста гепатоцитов [HGF] и
глиально-клеточный нейротрофический фактор [GDNF]) [84]. Когда RAS
активируется, он может образовывать комплекс с RAF. Этот активированный
комплекс
приводит
к
фосфорилированию
митоген-активированных
протеинкиназ (MAPK, также известных как ERK) через активацию MEK. MAPK,
будучи фосфорилированной, может непосредственно проникать в ядро и таким
образом влиять на экспрессию генов. В конечном итоге это приводит к
изменению контроля клеточной пролиферации. Активирующие мутации BRAF
наблюдаются в 50%-60% меланом. Среди мутаций BRAF, наблюдаемых в
меланоме, более 90% находятся в кодоне 600, и среди них более 90%
представляют собой однонуклеотидную мутацию, приводящую к замене валина
на глутаминовую кислоту (BRAFV600E). Реже встречается мутация BRAFV600K,
например, замена валина на лизин, что составляет 5-6%. Однако в некоторых
популяциях распространенность BRAFV600K была зарегистрирована выше [85].
Мутация BRAFV600K активирует BRAF и вызывает конститутивную MEK-ERK
сигнализацию в клетках. Активированный BRAF также участвует в контроле
прогрессии клеточного цикла. Все эти события происходят под влиянием
конститутивно активного пути MAPK, что приводит к пролиферации,
выживанию, инвазии и ангиогенезу меланомы. Интересно, что мутации BRAF
также встречаются с высокой частотой (>80%) в меланоцитарных невусах, что
позволяет предположить, что эти соматические изменения происходят на ранних
стадиях
меланомагенеза
[86].
Однако
большинство
невусов
не
трансформируются в злокачественную меланому. Это предполагает, что мутация
BRAF может быть необходимой, но недостаточной для того, чтобы вызвать
злокачественную трансформацию. Предполагается, что индуцированные
BRAFV600E контрольно-пропускные механизмы могут вызывать состояние,
подобное старению, в отсутствие дополнительных генетических или
молекулярных событий, способствующих опухолеобразованию [86].
Предполагается, что другие мутации наряду с RAFV600E могут быть
необходимы для инициации и прогрессии опухоли, особенно в меланомах,
возникающих в ассоциации с ранее существовавшим невусом. В меланомах
человека мутации в NRAS встречаются наиболее часто и составляют примерно
15-30 % случаев. Среди всех мутаций NRAS наиболее часто встречается
RASQ61K/R- замена глутамина в положении 61 на лизин или аргинин [87]. 81%
врожденных меланоцитарных невусов несут мутации RASQ61K/R.
Принудительная экспрессия онкогенного RASQ61K/R в нормальных
меланоцитах вызывает фенотип старения через остановку роста. Известно, что
невусы могут оставаться в состоянии остановки роста в течение десятилетий
[86]. Онкогенная экспрессия NRAS и BRAF способствует пролиферации,
21
выживанию, инвазии и ангиогенезу меланомы через активацию MAPK-пути.
Кроме
того,
активация
NRAS/BRAF
опосредует
эпителиальнотомезенхимальный переход (EMT) в меланоме на поздней стадии. EMT является
независимым фактором плохого прогноза у пациентов с меланомой [86].
Сигнальный путь NRAS/BRAF является потенциальной мишенью для
противораковой терапии в связи с высокой частотой мутаций и важной ролью в
развитии меланомы [86]. Однако помимо NRAS и BRAF в клеточных линиях и
образцах меланомы человека часто мутируют и некоторые другие компоненты
MAPK-пути. Было установлено, что мутации наблюдаются в MAP3K5 и
MAP3K9. Недавно были выявлены неканонические мутации BRAF, приводящие
к конститутивному фосфорилированию ERK и повышенной устойчивости к
ингибиторам MEK. Скрининг большей когорты лиц с меланомой выявил
наличие повторяющихся соматических мутаций MAP2K1 и MAP2K2, которые
встречались с общей частотой 8% [87]. Хотя возможно, что мутации MEK1/2
активируют ERK, наличие этих изменений на фоне онкогенных поражений
BRAFV600E предполагает, что могут иметь место другие сигнальные эффекты,
и, по крайней мере, некоторые мутации MEK1/2 могут также придавать
устойчивость к ингибированию RAF [87].
Рисунок 1.2 - Схематическая диаграмма сигнального пути MAPK-ERK и ингибиторов
22
1.4.3 Путь PI3K/AKT
Путь PI3K/AKT является одной из наиболее важных сигнальных сетей при
раке. Многочисленные исследования показали, что активация этого пути играет
важную роль в меланоме, часто в условиях одновременной активации
сигнальных путей RAS/RAF/MEK/ERK [88]. Путь PI3K/AKT активируется
факторами роста или митогенными стимулами, такими как инсулиноподобный
фактор роста 1 (IGF1) и/или RAS. PI3K катализирует фосфорилирование
фосфатидилинозитола (PI) в фосфатидилинозитол-3-фосфат (PIP3), который
активирует серин/треониновую киназу AKT. Гомолог фосфатидилинозитол
фосфат фосфатазы (PTEN) негативно регулирует путь PI3K путем
дефосфорилирования и инактивации PI3K. PTEN часто инактивируется в
раковых опухолях человека. Инактивированный PTEN не может ингибировать
PI3K; в результате активируются митогенные белки, приводя в действие их
вышележащий регулятор AKT3 [86]. AKT3 - это форма серин/треониновой
киназы, которая преимущественно экспрессируется в меланомах человека, и ее
активация путем амплификации гена встречается примерно в 60%
спорадических меланом (35% случаев) или путем инактивации PTEN (40%-60%
случаев). Эти мутации негативно регулируют путь PI3K/AKT. Мутации PI3K
были выявлены только в 5% случаев [89]. Примерно 30% метастатических
меланом с моноаллельными потерями PTEN демонстрируют аномально низкие
уровни транскрипта и белка, что позволяет предположить, что эпигенетическая
регуляция может быть вовлечена в развитие опухоли. Недавние исследования
выявили корреляцию между эпигенетическим сайленсингом PTEN и худшим
исходом
заболевания
[86,90].
Функциональные
эксперименты
продемонстрировали важную роль пути PI3K/AKT как в возникновении
меланомы, так и в терапевтической резистентности. Доступность многих
ингибиторов против пути PI3K/AKT быстро приводит к разработке испытаний,
которые в конечном итоге определят его клиническое значение при этом
заболевании [88]. Кроме того, было установлено, что инсулин ослабляет
терапевтическую эффективность DTIC и PLX4720 в клетках меланомы, которая
опосредовано активацией пути PI3K/AKT и может быть преодолено
ингибиторами PI3K [87].
23
1.4.4 Путь WNT/b-катенин
Изменения в сигнальном пути Wnt/b-catenin вовлечены в многочисленные
аномалии развития, роста и гомеостаза [91]. Белки WNT включают различные
секреторные гликопротеины, которые соединяются с рецепторами Frizzled и
связанным с рецептором липопротеина низкой плотности белком, чтобы
стабилизировать критический белок b-катенин. b-катенин - это
многофункциональный белок, который связывается с E-кадхерином и aкатенином на плазматической мембране, чтобы помочь в клеточно-клеточной
адгезии. b-катенин также обнаруживается в цитоплазме или в ядре, где он
действует как транскрипционный кофактор с белками TCF и LEF. В отсутствие
сигнального пути Wnt-Frizzled b-катенин связывается ингибитором сигнального
пути Wnt (Axin), гликоген-синтазной киназой 3 бета (GSK3b) и APC в комплекс,
который направляет фосфорилированный b-катенин для деградации
протеасомой [86,91]. b-катенин активируется, когда лиганды WNT связываются
с рецепторами Frizzled на клеточной поверхности. Это связывание важно для
формирования меланомы через их ингибирующее воздействие на Gsk3b.
Мутации гена b-катенина в экзоне 3 (примерно 1,5% меланом) подавляют его
фосфорилирование Gsk3b, что приводит к его накоплению в цитоплазме и
транслокации в ядро, где он связывается и активирует партнеров
транскрипционного фактора TCF и LEF. Это приводит к повышению регуляции
митогенных белков, таких как Myc и Циклин D1 [86]. Также было установлено,
что экспрессия негативных регуляторов сигнального пути WNT, таких как
Dickkopf-1, 2, 3 (Dkk-1, 2, 3) и WNT inhibitory factor-1 (WIF-1) сильно снижена
или утрачена, как в клеточных линиях меланомы, так и в образцах опухолей [86].
Некоторые исследования показали, что активация пути Wnt/b catenin уменьшает
рост опухоли и взаимодействует с ингибиторами пути ERK/MAPK для
продвижения апоптоза в меланоме [87]. Путем скрининга данных siRNA
определили белок FAM129B как потенциальный регулятор WNT/b-катениновой
сигнализации. Было продемонстрировано, что нокдаун FAM129B,
опосредованный siRNA, в клеточных линиях меланомы A375 и A2058 подавляет
WNT3A-опосредованную активацию репортера люциферазы, реагирующего на
b-катенин, и ингибирует экспрессию эндогенного гена-мишени WNT/bкатенина, AXIN2. Также было показано, что нокдаун FAM129B подавляет
апоптоз в клетках меланомы, обработанных WNT3A. Эти эксперименты
подтверждают роль FAM129B в связывании сигнала WNT/bcatenin с апоптозом
в меланоме [87]. Установлено, что ICAT, другой ингибитор b-катенина, и TCF
подавляют транскрипцию b-катенина,
конкурируя
с
Т-клеточным
фактором/лимфоидным усиливающим фактором [92]. Клетки меланомы
человека с высоким уровнем ICAT часто характеризуются дерегулированной
24
сигнализацией b-катенина. Высокие уровни ICAT коррелируют с образованием
метастазов у голых мышей nude. Эктопическая экспрессия ICAT в клетках
меланомы не влияла на их пролиферацию, но увеличивала подвижность клеток
и инвазию метастатических клеток [92]. Недавно было показано, что
повышенный уровень ядерного b-катенина связан с улучшением выживаемости
пациентов с меланомой. Пациенты с более высоким уровнем ядерного bкатенина в опухоли не продемонстрировали преимущество в выживаемости,
которое ранее наблюдалось у молекулярно неселективных пациентов с
меланомой, не получавших BRAFi. Кроме того, активация сигнала Wnt/bкатенин заметно подавлена в культивируемых клетках меланомы, получавших
длительное лечение BRAFi. Эти наблюдения позволяют предположить, что
длительное лечение BRAFi может повлиять на взаимодействие между
BRAF/MAPK и WNT/b-catenin сигнализацией и повлиять на исход заболевания
[87]. Таким образом, понимание взаимодействия путей WNT/b-catenin
необходимо
для
пациентов
с
меланомой,
чтобы
облегчить
индивидуализированную терапию и, следовательно, продлить их жизнь.
1.4.5 Путь p53
p53 позитивно или негативно регулирует многие гены, участвующие в
регуляции клеточного цикла (CDKN1A), индукции аутофагии, старения и
апоптоза (NOXA, PUMA и BAX), а также гены, участвующие в репарации ДНК
или клеточном метаболизме [86,87]. Белок p53 активируется посредством
тетрамеризации, что позволяет p53 распознавать специфические сайты
связывания на генах-мишенях и стимулировать их активацию. Хотя мутации р53
встречаются примерно в 50% случаев рака человека, но только 1%-5%
первичных меланом и 11%-25% метастатических меланом имеют мутировавший
р53 [86]. Мутации в самом р53 в меланоме встречаются реже, поэтому
предполагается, что функциональные противоопухолевые свойства р53 могут
быть подавлены многими механизмами. Установлено, что MDM2
функционирует как негативный регулятор р53. Его способность ингибировать
р53 регулируется петлей отрицательной обратной связи, в которой
активированный р53 приводит к транскрипции и трансляции MDM2, что
приводит к ингибированию р53. MDM2 взаимодействует с трансактивационным
доменом р53 через р53-взаимодействующий домен на N-конце MDM2.
Связывание MDM2 с р53 препятствует связыванию р53 с его
транскрипционными коактиваторами и впоследствии не позволяет р53
25
активировать гены-мишени [87]. Хотя было установлено, что MDM2 высоко
экспрессируется в половине инвазивных первичных и метастатических меланом,
амплификация локуса MDM2 встречается нечасто [93]. В исследованиях по
наблюдению за пациентами снижение экспрессии MDM2 было связано с более
высокими показателями выживаемости [93]. Это можно объяснить
ауторегуляторной петлей между р53 и MDM2. Повышение экспрессии MDM2
также возможно из-за потери его репрессора p14ARF - распространенной
мутации или делеции, наблюдаемой при меланоме. Без своего репрессора MDM2
конститутивно активен. Эти события могут определять апоптотическую
резистентность в меланоме, несмотря на то, что р53 в основном находится в
диком типе [93]. Предполагается, что воздействие на регуляторную петлю
обратной связи p53-MDM2 с помощью малых молекулярных ингибиторов может
стать подходящей стратегией лечения пациентов с метастатической меланомой
и диким типом p53 [87]. Помимо обычно мутировавших генов BRAF, NRAS,
PTEN, p53 и p16, были выявлены новые гены-кандидаты, включая GRIN2A,
ERBB4 и MMP8 (мутировавшие в 30%, 19% и 7% случаев меланомы
соответственно). Совсем недавно были установлены новые гены-драйверы
меланомы, такие как PREX2, PPP6C, и RAC1 [86].
1.4.6 Прогностическое значение мутаций в генах BRAF и NRAS
В одном исследовании оценили корреляции генотип-фенотип у 217
пациентов с меланомой. Мутации BRAF были выявлены у 40,1%, мутации NRAS
- у 24,4%, в то время как у остальных 33,2% не было обнаружено изменений ни
в одном из генов [95]. Несмотря на то, что генотип не являлся фактором риска
при многофакторном анализе, у пациентов с BRAF-мутацией меланомы
наблюдалась тенденция к улучшению общей и относительной выживаемости.
Напротив, у NRAS-мутантных пациентов чаще развивался ранний узловой
рецидив и метастазы, чем у пациентов с BRAF-мутантом, что позволяет
предположить, что они подвержены наибольшему риску прогрессирования
заболевания и, в конечном итоге, смертности от конкретного заболевания [95].
Что касается характеристик первичной опухоли, то наиболее частой
локализацией у пациентов с BRAF-мутантом была опухоль торса. Первичные
опухоли этой когорты демонстрировали меньшую митотическую активность,
чем NRAS-. Узловой подтип чаще встречался в группах с BRAF- и NRASмутантами, в то время как в отношении других гистологических факторов риска,
таких как глубина опухоли или наличие изъязвления, существенных различий не
26
было. На долю NRAS-мутантных опухолей пришлось 4 из 6 местных рецидивов
в месте первичной опухоли, а локорегиональный рецидив и отдаленные
метастазы значительно чаще наблюдались у NRAS-мутантных пациентов. Время
до узлового рецидива было значительно короче в когорте NRAS-мутантов. Эти
результаты были дополнительно подтверждены в многомерной модели
прогрессирования заболевания [95]. Несмотря на то, что мутационный статус
NRAS не был значительным фактором риска для общей выживаемости опухоли,
он не был подтвержден в ходе исследования. Хотя эта корреляция не была
подтверждена в нашем коллективе, на долю NRAS-мутантных опухолей
пришлось 4 из 6 местных рецидивов в месте первичной опухоли, а
локорегиональный рецидив и отдаленные метастазы значительно чаще
наблюдались у NRAS-мутантных пациентов. Время до узлового рецидива было
значительно короче в когорте NRAS-мутантов. Эти результаты были
дополнительно подтверждены в многомерной модели прогрессирования
заболевания. Несмотря на то, что мутационный статус NRAS не был
значительным фактором риска для общей выживаемости в многомерном
анализе, эти результаты означают, что NRAS-мутантные опухоли по своей
природе более агрессивны и имеют высокий риск прогрессирования
заболевания. Эта тенденция к сокращению безрецидивной выживаемости была
подтверждена и другими крупномасштабными анализами [96]. Однако при IV
стадии заболевания различия в выживаемости между NRAS-мутантными и не
NRAS-мутантными пациентами, не были статистически значимыми в
исследовании, несмотря на то, что NRAS-мутантные пациенты демонстрировали
тенденцию к более короткой выживаемости при обнаружении метастатического
поражения [95]. Общая выживаемость, определенная как время от первого
диагноза меланомы до смерти, не показала различий между генотипами в
многофакторном анализе, что позволяет предположить, что влияние мутаций
NRAS более очевидно на более ранних стадиях заболевания. Через 5 и 10 лет в
когорте BRAF наблюдалось небольшое преимущество в выживаемости на 1015%, однако оно не было значимым для всей когорты. Post hoc расчеты размера
выборки показали, что для значительной оценки таких различий в выживаемости
потребовалось бы не менее 1239 пациентов. Тем не менее, эти результаты
поднимают вопрос о том, должны ли пациенты с NRAS-мутантом проходить
более интенсивное наблюдение после первичной диагностики и должны ли
крупные исследования стратифицировать NRAS как независимый фактор риска.
К достоинствам данного анализа относится реконструкция всего интервала
времени от постановки диагноза первичной опухоли до смерти. Основываясь на
наших данных, мы пришли к выводу, что изменения BRAF и NRAS скорее влияют
на ранние стадии заболевания. Таким образом, необходимо анализировать
полное течение болезни, а не только фокусироваться на IV стадии заболевания,
27
где различия между генотипами могут быть менее очевидны. Кроме того, мы
оценили прогностическую значимость мутаций BRAF и NRAS при наличии
новых методов лечения, таких как BRAFi и MEKi или ICB, которые широко
доступны в настоящее время и привели к значительному улучшению
выживаемости в испытаниях II и III фазы [97]. Однако данные в реальном мире
немногочисленны. Большинство исследований охватывают всю популяцию и
популяцию BRAF-мутантов, соответственно. Эта доля несколько ниже, чем
сообщалось ранее, и не позволила провести дальнейший анализ подгрупп из-за
небольшого числа случаев. Не-V600 мутации BRAF были зарегистрированы у 7
(3,2%) пациентов в этом исследовании, двое из которых имели сопутствующую
мутацию в NRAS. Более конкретно, мутации K601E и L597S были выявлены у 5
(2,3%) пациентов. Небольшое число пациентов ограничило дальнейший
статистический анализ и выводы по этой конкретной субпопуляции.
Другие исследователи представили доказательства того, что изменения
K601E и L597 имеют отличные клинико-патологические особенности от общих
мутаций V600E/K. Самая большая на сегодняшний день серия исследований по
этим мутациям показала, что опухоли, содержащие мутации K601E, похожи на
опухоли с мутациями V600E, в то время как опухоли с мутациями L597 схожи с
опухолями BRAF [34]. Однако данные о реакции на лечение BRAFi и
клиническом прогнозе скудны из-за малочисленности этих мутаций и
исключения их из крупных исследований [98].
1.4.7 Прогностическое значение мутаций в гене c-Kit
Прото-онкоген c-Kit является трансмембранным тирозинкиназным
рецептором, который имеет решающее значение для развития и пролиферации
меланоцитов. Мутация гена c-Kit в мышиных моделях может привести к
злокачественной трансформации с образованием опухолей, похожих на
амеланотическую меланому. Было выдвинуто предположение, что экспрессия cKit прогрессивно снижается во время локального роста опухоли и инвазии
меланомы человека. Было выяснено, что отсутствие экспрессии c-Kit прямо
коррелирует с метастатическим потенциалом клеток меланомы человека у голых
мышей nude [94]. В одном исследовании проанализировали сверхэкспрессию cKit во всех 202 случаях меланомы с помощью IHC. C-Kit был
сверхэкспрессирован в 46 (22,8%) случаях. Не было статистически значимой
разницы в выживаемости между c-Kit положительной и отрицательной группой
и, следовательно, не было выявлено прогностической значимости
28
сверхэкспрессии c-Kit. Однако в 53,7% случаев поверхностной
распространяющейся меланомы (ранняя стадия) c-Kit был сверхэкспрессирован,
что указывает на то, что c-Kit сверхэкспрессируется в основном на ранней стадии
заболевания, а при метастатическом/прогрессирующем заболевании возможно
снижение уровня c-Kit [94]. Механизм, посредством которого клетки
злокачественной меланомы теряют экспрессию c-Kit, неясен. Ген c-Kit ни
подвергся делеции, ни перестроен в c-Kit негативных клеточных линиях
меланомы, что позволяет предположить, что отсутствие сверхэкспрессии c-Kit,
скорее всего, связано с изменением экспрессии транскрипционных факторов.
Было предположено, что в метастатических клетках меланомы отсутствие
экспрессии c-Kit коррелирует с отсутствием экспрессии транскрипционного
фактора AP-2, и что в клетках меланомы AP-2 служит положительным
регулятором экспрессии c-Kit. Результаты исследования показывают, что
сверхэкспрессия c-Kit не имеет прогностического значения у пациентов со
злокачественной меланомой [94]. Однако выявление c-Kit у значительной части
пациентов может иметь важное терапевтическое значение для будущих
клинических испытаний, оценивающих роль сайт-специфической терапии при
меланоме. c-Kit был сверхэкспрессирован только у 26,6% пациентов с меланомой
без сопутствующих вторичных первичных злокачественных опухолей (p = 0,01).
Таким образом, отсутствие сверхэкспрессии c-Kit также клинически связано с
отсутствием других сопутствующих первичных злокачественных опухолей у
пациентов со злокачественной меланомой. Исходя из результатов, становится
ясно, что определенная терапевтическая ценность, но не прогностическая
ценность может быть потенциально найдена при тестировании пациентов со
злокачественной меланомой на сверхэкспрессию cKit [94].
29
1.5 Методы молекулярной диагностики
1.5.1 ПЦР
ПЦР была изобретена Кэри Муллисом в 1983 году, который в 1993 году
получил Нобелевскую премию по химии. Влияние ПЦР на биологические и
медицинские исследования было значительным, резко ускорив темпы прогресса
в изучении генов и геномов. Теперь с помощью ПЦР можно выделить
практически любой ген из любого организма, и она стала краеугольным камнем
проектов по секвенированию генома. На самом деле, ПЦР - это очень сложный
процесс, но он обладает огромной силой и универсальностью для манипуляций
и анализа ДНК. Изобретение и дальнейшее развитие метода ПЦР, несомненно,
является одним из самых
существенных технических достижений в области молекулярной
технологии за последнее столетие. Метод ПЦР основан на репликации ДНК in
vitro посредством повторяющихся циклов простых реакций. Основными
реагентами для ПЦР являются целевая ДНК, подлежащая амплификации,
одноцепочечные олигонуклеотиды (праймеры), комплементарные известным
последовательностям целевой ДНК, избыточные количества четырех
дезоксирибонуклеозидтрифосфатов (dNTPs) и термостабильная ДНКполимераза. Наиболее часто используется ДНК-полимераза, выделенная из
термофильной бактерии Thermus aquaticus (Taq ДНК-полимераза) [99]. Реакции
амплификации проводятся с помощью специальных ДНК-термоциклеров.
Целевая ДНК, служащая шаблоном, плавится при достаточно высокой
температуре, чтобы разрушить водородные связи, удерживающие нити вместе,
и таким образом освободить отдельные нити ДНК. Большим преимуществом
метода ПЦР является то, что целевая ДНК не обязательно должна быть особенно
чистой или многочисленной. Она может быть даже незначительным образцом в
сложной смеси других ДНК и других веществ. Это особенно важно, когда
исследуется присутствие определенного вида микроорганизмов в смешанной
инфекции. Два коротких праймера ДНК отжигаются к комплементарным
последовательностям на противоположных нитях целевой ДНК. Праймеры
подбираются таким образом, чтобы охватить нужный генетический материал,
определяя два конца амплифицированного участка ДНК. Последовательно
синтезируется комплементарная вторая нить новой ДНК путем удлинения
каждого отожженного праймера Taq-полимеразой в присутствии избытка dNTPs.
Все ранее синтезированные продукты служат шаблонами для новых реакций
30
удлинения праймеров в каждом последующем цикле. В результате происходит
экспоненциальная амплификация новых продуктов ДНК, что обеспечивает
исключительную чувствительность при обнаружении целевой ДНК. Типичная
реакция ПЦР состоит из 25-40 циклов амплификации [99].
1.5.1.1 ПЦР в реальном времени
Большинство анализов ПЦР являются качественными или могут быть
настроены на полуколичественный анализ. Исключением является ПЦР в
реальном времени, которая характеризуется непрерывным измерением
продуктов на протяжении всей реакции. В этом методе используются зонды,
специфичные для последовательности, обычно связанные с обнаружением
флуоресцентного резонансного переноса энергии (FRET). Обычно используются
два подхода: эмиссия флуоресценции путем отсоединения репортерного
красителя от зонда, несущего также гасящий краситель; или флуоресценция
путем сближения двух красителей. Система TaqMan является примером первого,
а подход LightCycler (Roche) - второго. В дополнение к специфической паре
праймеров в анализе TaqMan используется флуорогенный зонд, состоящий из
флуоресцентного репортерного красителя на 5'-конце и гасящего красителя на
3'-конце. Когда зонд отжигается к комплементарной нити ампликона во время
ПЦР, ДНК-полимераза Taq расщепляет его [99].
ДНК-полимераза Taq расщепляет зонд во время удлинения одного из
праймеров, молекулы красителя смещаются и разделяются. Репортерный
краситель с электронным возбуждением больше не подавляется гасящим
красителем, и излучение флуоресценции контролируется детектором
флуоресценции. Наблюдая за высвобождением флуоресценции с каждым
циклом ПЦР, ход реакции регистрируется в режиме реального времени, и
количество ДНК в образце может быть определено количественно. В основе
метода LightCycler лежат два флуоресцентно меченных олигонуклеотида,
которые отжигаются внутри соседних областей целевого продукта ПЦР. Один
краситель возбуждается источником света и передает энергию второму
красителю, который затем излучает на определенной длине волны для
обнаружения. Два красителя должны находиться в непосредственной
физической близости друг от друга, чтобы генерировать специфический
флуоресцентный сигнал, чего не происходит в свободном растворе. Если два
одиночно меченных зонда гибридизуются с соседними участками
специфического ампликона ПЦР, результирующий FRET между двумя
красителями приводит к увеличению флуоресценции, пропорциональному
количеству продукта [99].
31
1.5.2 Секвенирование по Сенгеру
С начала 1990-х годов получение последовательностей ДНК почти
исключительно осуществлялось с помощью полуавтоматизированной биохимии
Сэнгера на основе капилляров. В высокопроизводительных производственных
конвейерах ДНК для секвенирования подготавливается одним из двух подходов:
во-первых, для дробного секвенирования de novo случайные фрагменты ДНК
клонируются в плазмиду с высоким числом копий, которая затем используется
для трансформации Escherichia coli; или, во-вторых, для целевого
секвенирования
проводится
ПЦР-амплификация
с
праймерами,
фланкирующими
цель.
Результатом
обоих
подходов
является
амплифицированный шаблон - либо множество "клональных" копий одной
плазмидной вставки, присутствующих в пространственно изолированной
бактериальной колонии, которую можно собрать, либо множество ампликонов
ПЦР, присутствующих в одном реакционном объеме [100]. Биохимия
секвенирования происходит в реакции "циклического секвенирования", в
которой выполняются циклы денатурации шаблона, отжига праймера и
удлинения праймера. Праймер комплементарен известной последовательности,
непосредственно фланкирующей интересующий регион. Каждый цикл
удлинения праймера стохастически завершается включением флуоресцентно
меченых дидезоксинуклеотидов (ddNTPs). В полученной смеси концевых
меченых продуктов удлинения метка на завершающем ddNTP любого фрагмента
соответствует нуклеотидной идентичности его терминального положения.
Последовательность
определяется
путем
электрофоретического
разделения одноцепочечных продуктов удлинения с концевой меткой в
полимерном геле на основе капилляров с высоким разрешением. Лазерное
возбуждение флуоресцентных меток при выходе фрагментов различной длины
из капилляра в сочетании с четырехцветной детекцией эмиссионных спектров
дает показания, которые представлены в виде "следа" секвенирования Сэнгера.
Программное обеспечение переводит эти следы в последовательность ДНК,
одновременно генерируя вероятности ошибок для каждой базовой ячейки.
Подход к последующему анализу - например, сборке генома или идентификации
вариантов - зависит от того, что именно и зачем секвенируется. Одновременный
электрофорез в 96 или 384 независимых капиллярах обеспечивает ограниченный
уровень
параллелизации.
После
трех
десятилетий
постепенного
совершенствования биохимия Сэнгера может применяться для достижения
длины чтения до ~1000 п.н., а точность "сырых" оснований достигает 99,999%.
В контексте высокопроизводительного дробного геномного секвенирования,
32
стоимость секвенирования по Сэнгеру составляет порядка $0,50 за килобазу
[100].
1.5.3 NGS (Секвенирование нового поколения)
Технологии секвенирования Сангера и Максама-Гилберта были наиболее
распространенными технологиями секвенирования, используемыми биологами
до появления новой эры технологий секвенирования, открывающих новые
перспективы для исследования и анализа геномов. Новые технологии
секвенирования были впервые представлены технологией 454 компании Roche в
2005 году и были коммерциализированы как технологии, способные
производить последовательности с очень высокой пропускной способностью и
по гораздо более низкой цене, чем первые технологии секвенирования. Эти
новые технологии секвенированияобычно известны под названием "технологии
секвенирования
следующего
поколения
(NGS)"
или
"технологии
секвенирования с высокой пропускной способностью" [101]. Технологии NGS
производят массовый параллельный анализ с высокой пропускной способностью
из множества образцов при значительно меньших затратах. Технологии NGS
позволяют параллельно секвенировать от миллионов до миллиардов чтений за
один раз, а время, необходимое для генерации чтений размером в гигабазу,
составляет всего несколько дней или часов, что делает их более эффективными,
чем секвенирование первого поколения, такое как секвенирование по Сэнгеру.
Геном человека, например, состоит из 3 млрд. п.н. и состоит из макромолекул
ДНК длиной от 33 до ~247 млн. п.н., распределенных в 23 хромосомах,
расположенных в ядре каждой человеческой клетки, секвенирование генома
человека с помощью секвенирования Сангера заняло почти 15 лет, потребовало
сотрудничества многих лабораторий по всему миру и обошлось примерно в 100
миллионов долларов США, в то время как секвенирование с помощью NGS
секвенаторов с использованием 454 Genome Sequencer FLX заняло два месяца и
стоило примерно одну сотую стоимости. К сожалению, NGS не способны
прочитать полную последовательность ДНК генома, они ограничены
последовательностью небольших фрагментов ДНК и генерируют миллионы
прочтений. Это ограничение остается негативным моментом, особенно для
проектов по сборке генома, поскольку требует больших вычислительных
ресурсов [101].
В последние годы технологии NGS продолжают совершенствоваться.
Однако в литературе технологии NGS делятся на два типа. Выделяют технологии
33
секвенирования второго поколения, которые относятся к новейшим технологиям
секвенирования, разработанным в среде NGS после первого поколения, они
характеризуются
необходимостью
подготовки
амплифицированных
секвенирующих банков перед началом секвенирования амплифицированных
клонов ДНК, и технологии секвенирования третьего поколения, которые
являются технологиями секвенирования, появившимися недавно. В отличие от
второго поколения, эти технологии классифицируются как технологии
секвенирования одной молекулы, поскольку они могут производить
секвенирование одной молекулы без необходимости создания библиотек
амплификации и способны генерировать более длинные чтения при гораздо
меньших затратах и за более короткое время [101].
34
ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Выделение ДНК из парафинизированной опухолевой ткани
Для выделения ДНК использовали диагностический набор «QIAamp DNA
FFPE Tissue Kit» (Qiagen, Германия). При этом, срез опухолевой ткани толщиной
до 10 мкм помещали в микропробирку объемом 1,5 мл. Вносили в пробирку с
образцом 1 мл ксилена, перемешивали пробу на вортексе в течение 10 с,
центрифугировали при максимальной скорости в течение 2 мин при комнатной
температуре, удаляли супернатант. Добавляли к осадку 1 мл этанола (96 –100%),
перемешивали пробу на вортексе, центрифугировали при максимальной
скорости
в
течение
2
мин
при
комнатной
температуре
(15–25 ºС), аккуратно удаляли супернатант, осадок высушивали при комнатной
температуре (15–25 ºС) в течение 10 мин или до полного испарения этанола.
Ресуспензировали осадок в 180 мкл буфера для лизиса (Buffer ATL),
перемешивали пробу на вортексе в течение 10 с, добавляли 20 мкл протеиназы
К, затем повторно перемешивали на вортексе. Инкубировали образец при
температуре 56°С в течение 60 мин, в последующем – при температуре 90 °С в
течение 60 мин, центрифугировали для осаждения капель. Далее добавляли 200
мкл буфера (Buffer AL), перемешивали пробу на вортексе в течение 10 с,
центрифугировали для осаждения капель. Следующим этапом аккуратно
наносили лизат на колонку для выделения ДНК, центрифугировали при 8 000
об/мин в течение 1 мин, переносили колонку в чистую пробирку, удаляли
пробирку, содержащую фильтрат. Затем наносили на колонку для выделения
ДНК с образцом 500 мкл буфера для отмывки (Buffer AW1), центрифугировали
колонку с нанесенной на нее смесью при 8 000 об/мин в течение 1 мин,
переносили колонку в чистую пробирку, удаляли пробирку, содержащую
35
фильтрат. В последующем наносили на колонку для выделения ДНК с образцом
500 мкл буфера для отмывки (Buffer AW2), центрифугировали колонку с
нанесенной на нее смесью при 8 000 об/мин в течение 1 мин, переносили колонку
в
чистую
пробирку,
удаляли
пробирку,
содержащую
фильтрат.
Центрифугировали колонку для выделения ДНК при 14 000 об/мин в течение 3
мин, переносили колонку для выделения ДНК в чистую пробирку, удаляли
пробирку, содержащую фильтрат. Наносили на колонку 20–100 мкл раствора для
элюирования (Buffer ATE), инкубировали при комнатной температуре (15–25 ºС)
в течение 1 мин, центрифугировали колонку для выделения ДНК при 14 000
об/мин в течение 1 мин. Переносили образец ДНК в новую пробирку.
Концентрацию выделенной ДНК оценивали на спектрофотометре путем
измерения оптической плотности (ОД) при длине волны 260 нм.
Анализ мутаций в 600 кодоне гена BRAF с использованием методики
АС-ПЦР
Постановка АС-ПЦР
Анализ мутаций в гене BRAF проводили с помощью двух вариантов
методик, одна из которых основана на использовании аллель-специфических
праймеров для детекции мутации по прямой цепи ДНК (АС-ПЦР 1), другая – по
обратной комплементарной цепи ДНК (АС-ПЦР 2).
Для амплификации исследуемого фрагмента гена BRAF использовали
диагностический набор
«Taq ДНК-полимераза» (Праймтех, Республика
Беларусь) и синтетические олигонуклеотиды (контрольные праймеры на
константный участок гена (BS2-1/BA1-2 для АС-ПЦР 1 и BS5/BA4-2 для АСПЦР 2) и аллель-специфические праймеры на мутацию BRAF V600 (BS2-1/BA22 для АС-ПЦР 1 и BS4-2/BA4-2 для АС-ПЦР 2), а также TaqMan-зонд для
детекции сигнала амплификации в режиме реального времени (BTM5-2 для АСПЦР 1 и BTM6 для АС-ПЦР 2). В контрольной ПЦР оценивали качество и
количество выделенной ДНК, а в АС-ПЦР тестировали ДНК на наличие мутации
BRAF V600. Последовательности олигонуклеотидных праймеров и зондов
представлены в таблице 1.
36
Таблица 1 – Праймеры и зонды для амплификации
Название
праймера
BS2-1
BA1-2
BA2-2
BTM5-2
BS5
BS4-2
BA4-2
BTM6
Последовательность праймера,
5' → 3'
АС-ПЦР 1
TGTTTTCCTTTACTTACTACACCTCAGA
GGACCCACTCCATCGAGATT
CCCACTCCATCGAGATTCCT
ATGAAGACCTTCACAGAAAAATAGGTGATTTTGG
АС-ПЦР 2
TCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGG
GTGATTTTGGTCTAGCTACGGA
TCCACAAAATGGATCCAGAC
ACTGATGGGACCCACTCCATCGA
Метка,
5'
Метка,
3'
FAM
BHQ1
FAM
BHQ1
Для детекции мутации BRAF V600 проводили АС-ПЦР со смысловым
BA2-2 и антисмысловым BS4-2 аллель-специфическими праймерами для АСПЦР 1 и 2 соответственно. Праймеры и зонды предварительно разводили до
концентрации в 100 пмоль/мкл и готовили отдельные смеси для АС-ПЦР 1 с
контрольным (К1) и мутантным (A1) праймерами в соотношении: К1 – 1 BS2-1 :
1 BA1-2 : 1 BTM5-2 : 7 H2O, А1 – 1 BS2-1 : 1 BA2-2 : 1 BTM5-2 : 7 H2O и для АСПЦР 2 с контрольным (К2) и мутантным (A2) праймерами в соотношении: K2 –
1 BS5 : 1 BA4-2 : 1 BTM6 : 7 H2O, A2 – 1 BS4-2 : 1 BA4-2 : 1 BTM6 : 7 H2O.
Концентрация каждого праймера в итоговой смеси составляла 10 пмоль/мкл.
Постановку
реакции
ПЦР
осуществляли
согласно
протоколу
производителя. Реакционную смесь готовили отдельно для контрольного и
мутантного праймера из расчета количества реакций n+3, где n – это количество
образцов в постановке. Компоненты реакционной смеси для проведения ПЦР
представлены в таблице 2.
Таблица 2 – Компоненты реакционной смеси для проведения ПЦР
Реактив
Буфер для ПЦР, 10×
MgCl2, 50 мМ
ДНТП, 10 мМ
Полимераза, 5 ед./мкл
Смесь праймеров
H2O
ДНК
Общий объем
Количество на 1 реакцию, мкл
2,5
1,0
0,5
0,25
1,0
16,75
3,0
25
37
В каждую постановку ПЦР включали отрицательные и положительные
контроли. В качестве отрицательного контроля реакции использовали
дистиллированную воду. В качестве положительного контроля реакции
использовали образец ДНК с мутацией V600E в гене BRAF, подтвержденной
методом секвенирования по Сэнгеру и доведенной до 1% содержания
мутантного аллеля. При постановке реакции в первую очередь вносили
отрицательный контроль, далее образцы и в последнюю очередь положительный
контроль. Схема постановки ПЦР для трех образцов указана в таблице 3.
Таблица 3 – Схема постановки ПЦР
Образец
Ф.И.О. №1
Ф.И.О. №2
Ф.И.О. №3
Отрицательный контроль
Положительный контроль
А2
К2
Смесь тщательно перемешивали пипетированием и помещали
амплификатор
«СFX96»
(Bio-rad,
США).
Адаптированный
в
протокол
амплификации представлен в таблице 4
Таблица 4 – Программа амплификации
Этап
Предварительная денатурация
Денатурация
Отжиг*
температура, ˚C
95
95
58
Характеристика
время
количество циклов, абс.
3 мин
1
10 с
45
1 мин
* детекция сигнала проводится по каналу FAM или аналогичному ему по длине
волны во время этапа отжига.
38
ГЛАВА 3 АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ
Результат анализа оценивали при сравнении dCt образца с dCt
положительного 1% ДНК-стандарта, который тестировали параллельно с
исследуемыми образцами. Образец считали положительным (содержащим
мутацию) если dCt образца было равно или меньше dCt положительного ДНКстандарта.
Образец
считали
отрицательным
(отсутствие
мутации
или
содержание мутации меньше, чем в положительном ДНК-стандарте) если dCt
образца было больше dCt положительного ДНК-стандарта.
Алгоритм анализа результатов с использованием метода dCt по каналу
детекции FAM:
1)
Отрицательный контроль – обязательным условием является
отсутствие сигнала в пробирках К1А1, К2А2. В случае детекции сигнала по
каналу FAM в пробирках К1 и К2 с разницей Ct менее 10 циклов в сравнении с
исследуемыми образцами, или в случае детекции сигнала по каналу FAM в
пробирках А1 и А2, результат тестирования считать не информативным.
2)
Положительный контроль – обязательным условием является
наличие сигнала в пробирках К1 и А1, К2 и А2, значение dCt (К1-А1, К2–А2)
должно составлять не более 6 циклов.
3)
Исследуемые образцы:
- наличие сигнала в пробирках К1А1 и К2А2 и dCt между пробирками К1
и А1, К2 и А2 менее 6 циклов и значение dCt (К1-А1, К2–А2) образца меньше
значения dCt положительного контроля – исследуемый образец характеризуется
наличием патогенного варианта V600 в гене BRAF.
- наличие сигнала только в пробирках К1 и К2, или dCt между пробирками
К1 и А1, К2 и А2 более 6 циклов, или значение dCt (К1-А1, К2–А2) образца
больше значения dCt положительного контроля – исследуемый образец
характеризуется отсутствием патогенного варианта V600 в гене BRAF.
39
Рисунок 3.1 – Наличие варианта V600 в гене BRAF
Рисунок 3.2 – Отсутствие варианта V600 в гене BRAF
40
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
1. Melanoma Epidemiology and Prevention / M. Berwick [et al.] // Melanoma :
Cancer Treatment and Research / eds. H.L. Kaufman, J.M. Mehnert. – Cham: Springer
International Publishing, 2016. – Vol. 167. – P. 17-49.
2. Armstrong, B.K. How much melanoma is caused by sun exposure?: / B.K.
Armstrong, A. Kricker // Melanoma Research. – 1993. – Vol. 3, № 6. – P. 395-402.
3. Meta-analysis of risk factors for cutaneous melanoma: II. Sun exposure / S.
Gandini [et al.] // European Journal of Cancer. – 2005. – Vol. 41, № 1. – P. 45-60.
4. Armstrong B. K. Cutaneous and ocular melanoma / S. B. Gruber, B. K.
Armstrong // Cancer epidemiology and prevention. – 2006. – Vol. 3. – P. 1196-1229.
5. Occupational sun exposure and risk of melanoma according to anatomical site:
Occupational Sun Exposure and Risk of Melanoma / K. Vuong [et al.] // Int. J. Cancer.
– 2014. – Vol. 134, № 11. – P. 2735-2741.
6. Meta-analysis of risk factors for cutaneous melanoma according to anatomical
site and clinico-pathological variant / S. Caini [et al.] // European Journal of Cancer. –
2009. – Vol. 45, № 17. – P. 3054-3063.
7. Sunburns and Risk of Cutaneous Melanoma: Does Age Matter? A
Comprehensive Meta-Analysis / L.K. Dennis [et al.] // Annals of Epidemiology. –
2008. – Vol. 18, № 8. – P. 614-627.
8. Work-related cancer in the Nordic countries / A. Andersen [et al.] //
Scandinavian journal of work, environment & health. – 1999. – P. 1-114.
9. Cancer mortality among women in the Russian printing industry / M.A.
Bulbulyan [et al.] // Am. J. Ind. Med. – 1999. – Vol. 36, № 1. – P. 166-171.
10. Case-control study of malignant melanoma among employees of the
Lawrence Livermore national laboratory / D.H. Moore [et al.] // Am. J. Ind. Med. –
1997. – Vol. 32, № 4. – P. 377-391.
11. Melanoma and occupation: results of a case-control study in The
41
Netherlands. / P.J. Nelemans [et al.] // Occupational and Environmental Medicine. –
1993. – Vol. 50, № 7. – P. 642-646.
12. Robinson, C.F. Mortality patterns among electrical workers employed in the
U.S. Construction Industry, 1982-1987 / C.F. Robinson, M. Petersen, S. Palu // Am. J.
Ind. Med. – 1999. – Vol. 36, № 6. – P. 630-637.
13. Mortality among Workers Exposed to Polychlorinated Biphenyls / T. Sinks
[et al.] // American Journal of Epidemiology. – 1992. – Vol. 136, № 4. – P. 389-398.
14. Bataille, V. Melanoma--Part 1: epidemiology, risk factors, and prevention /
V. Bataille, E. de Vries // BMJ. – 2008. – Vol. 337, № nov20 1. – P. 2249-2249.
15. Meta-analysis of risk factors for cutaneous melanoma: I. Common and
atypical naevi / S. Gandini [et al.] // European Journal of Cancer. – 2005. – Vol. 41,
№ 1. – P. 28-44.
16. Malignant Melanoma in the 21st Century, Part 1: Epidemiology, Risk
Factors, Screening, Prevention, and Diagnosis / S.N. Markovic [et al.] // Mayo Clinic
Proceedings. – 2007. – Vol. 82, № 3. – P. 364-380.
17. Sagebiel, R.W. Melanocytic Nevi in Histologic Association with Primary
Cutaneous Melanoma of Superficial Spreading and Nodular Types: Effect of Tumor
Thickness / R.W. Sagebiel // Journal of Investigative Dermatology. – 1993. – Vol. 100,
№ 3. – P. S322-S325.
18. Skender-Kalnenas, T.M. Benign melanocytic lesions: Risk markers or
precursors of cutaneous melanoma? / T.M. Skender-Kalnenas, D.R. English, P.J.
Heenan // Journal of the American Academy of Dermatology. – 1995. – Vol. 33, № 6.
– P. 1000-1007.
19. Genetics of Risk Factors for Melanoma: an Adult Twin Study of Nevi and
Freckles / V. Bataille [et al.] // JNCI: Journal of the National Cancer Institute. – 2000.
– Vol. 92, № 6. – P. 457-463.
20. Armstrong, B.K. The epidemiology of UV induced skin cancer / B.K.
Armstrong, A. Kricker // Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. –
2001. – Vol. 63, № 1-3. – P. 8-18.
21. Berwick, M. Melanoma Epidemiology / M. Berwick // Melanoma
Development / ed. A.K. Bosserhoff. – Cham: Springer International Publishing, 2017.
– P. 39-61.
22. Tucker, M.A. Melanoma etiology: where are we? / M.A. Tucker, A.M.
Goldstein // Oncogene. – 2003. – Vol. 22, № 20. – P. 3042-3052.
23. Genetic and environmental factors in cutaneous malignant melanoma / B.
Bressac-de-Paillerets [et al.] // Biochimie. – 2002. – Vol. 84, № 1. – P. 67-74.
24. Surgery and radiotherapy in the treatment of cutaneous melanoma / A.
Testori [et al.] // Annals of Oncology. – 2009. – Vol. 20 – P. 22-29.
25. Management of cutaneous malignant melanoma by dermatologists of the
American Academy of Dermatology. I. Survey of biopsy practices of pigmented
42
lesions suspected as melanoma / T.G. Salopek [et al.] // Journal of the American
Academy of Dermatology. – 1995. – Vol. 33, № 3. – P. 441-450.
26. Attis, M.G. Mitotic Rate in Melanoma: A Reexamination / M.G. Attis, R.T.
Vollmer // Am J Clin Pathol. – 2007. – Vol. 127, № 3. – P. 380-384.
27. Surgical margins in cutaneous melanoma (2 cm versus 5 cm for lesions
measuring less than 2.1-mm thick) / D. Khayat [et al.] // Cancer. – 2003. – Vol. 97,
№ 8. – P. 1941-1946.
28. Long term results of a randomized study by the Swedish Melanoma Study
Group on 2-cm versus 5-cm resection margins for patients with cutaneous melanoma
with a tumor thickness of 0.8-2.0 mm / G. Cohn-Cedermark [et al.] // Cancer. – 2000.
– Vol. 89, № 7. – P. 1495-1501.
29. Thin Stage I Primary Cutaneous Malignant Melanoma / U. Veronesi [et al.]
// N Engl J Med. – 1988. – Vol. 318, № 18. – P. 1159-1162.
30. Efficacy of 2-cm Surgical Margins for Intermediate-Thickness Melanomas
(1 to 4 mm) Results of a Multi-institutional Randomized Surgical Trial: / C.M. Balch
[et al.] // Annals of Surgery. – 1993. – Vol. 218, № 3. – P. 262-269.
31. Final Version of the American Joint Committee on Cancer Staging System
for Cutaneous Melanoma / C.M. Balch [et al.] // JCO. – 2001. – Vol. 19, № 16. –
P. 3635-3648.
32. Excision Margins in High-Risk Malignant Melanoma / J.M. Thomas [et al.]
// N Engl J Med. – 2004. – Vol. 350, № 8. – P. 757-766.
33. Randomized trial of a resection margin of 2 cm versus 4 cm for cutaneous
malignant melanoma with a tumor thickness of more than 2 mm / U. Ringborg, E. M.
Brahme, K. Drewiecki // World Congress on Melanoma. – 2005. – . 753.
34. Eggermont, A.M.M. Randomized Adjuvant Therapy Trials in Melanoma:
Surgical and Systemic / A.M.M. Eggermont, M. Gore // Seminars in Oncology. – 2007.
– Vol. 34, № 6. – P. 509-515.
35. Surgical margins and prognostic factors in patients with thick (>4 mm)
primary melanoma / K.M. Heaton [et al.] // Annals of Surgical Oncology. – 1998. –
Vol. 5, № 4. – P. 322-328.
36. Excision of underlying fascia with a primary malignant melanoma: effect
on recurrence and survival rates / D. E. Kenady, B. W. Brown, C. M. McBride //
Surgery. – 1982. – Vol. 92, №. 4. – С. 615-618.
37. Holmström, H. Surgical management of primary melanoma / H. Holmström
// Semin. Surg. Oncol. – 1992. – Vol. 8, № 6. – P. 366-369.
38. Patrick, R.J. Primary mucosal melanoma / R.J. Patrick, N.A. Fenske, J.L.
Messina // Journal of the American Academy of Dermatology. – 2007. – Vol. 56, № 5.
– P. 828-834.
39. Chang, A.E. The National Cancer Data Base report on cutaneous and
noncutaneous melanoma: A summary of 84,836 cases from the past decade / A.E.
43
Chang, L.H. Karnell, H.R. Menck // Cancer. – 1998. – Vol. 83, № 8. – P. 1664-1678.
40. Gorsky, M. Melanoma arising from the mucosal surfaces of the head and
neck / M. Gorsky, J.B. Epstein // Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral
Radiology, and Endodontology. – 1998. – Vol. 86, № 6. – P. 715-719.
41. Head and neck mucosal melanoma: a 32-year review / T. R. Loree [et al.] //
Ear, nose & throat journal. – 1999. – Vol. 78, №. 5. – P. 372-375.
42. Vulvar Melanoma: A Retrospective Analysis and Literature Review / W.P.
Irvin [et al.] // Gynecologic Oncology. – 2001. – Vol. 83, № 3. – P. 457-465.
43. Prognosis of Primary Mucosal Penile Melanoma: A Series of 19 Dutch
Patients and 47 Patients from the Literature / A.N. van Geel [et al.] // Urology. – 2007.
– Vol. 70, № 1. – P. 143-147.
44. Brady, M.S. Anorectal melanoma: A 64-Year experience at memorial sloankettering cancer center / M.S. Brady, J.P. Kavolius, S.H.Q. Quan // Diseases of the
Colon & Rectum. – 1995. – Vol. 38, № 2. – P. 146-151.
45. Dossgg, L.L. The radioresponsiveness of melanoma / L.L. Dossgg, N.
Memula // International Journal of Radiation Oncology*Biology*Physics. – 1982. –
Vol. 8, № 7. – P. 1131-1134.
46. Local tumor control following single dose irradiation of human melanoma
xenografts: relationship to cellular radiosensitivity and influence of an immune
response by the athymic mouse / E. K. Rofstad // Cancer research. – 1989. – Vol. 49,
№. 12. – P. 3163-3167.
47. Retention of cellular radiation sensitivity in cell and xenograft lines
established from human melanoma surgical specimens / E. K. Rofstad // Cancer
research. – 1992. – Vol. 52, №. 7. – P. 1764-1769.
48. Fraction size in external beam radiation therapy in the treatment of melanoma
/ W.T. Sause [et al.] // International Journal of Radiation Oncology*Biology*Physics.
– 1991. – Vol. 20, № 3. – P. 429-432.
49. Stevens, G. Dispelling the myths surrounding radiotherapy for treatment of
cutaneous melanoma / G. Stevens, M.J. McKay // The Lancet Oncology. – 2006. –
Vol. 7, № 7. – P. 575-583.
50. Radiotherapy as palliative treatment for metastatic melanoma: / Y.M. Kirova
[et al.] // Melanoma Research. – 1999. – Vol. 9, № 6. – P. 611-613.
51. Konefal, J.B. Malignant melanoma: analysis of dose fractionation in
radiation therapy. / J.B. Konefal, B. Emami, M.V. Pilepich // Radiology. – 1987. –
Vol. 164, № 3. – P. 607-610.
52. Cutaneous melanoma and the immunotherapy revolution (Review) / G.
Leonardi [et al.] // Int J Oncol. – 2020. – Vol. 57, № 3. – P. 609-618.
53. Current Perspectives in Cancer Immunotherapy / T. Christofi [et al.] //
Cancers. – 2019. – Vol. 11, № 10. – P. 1472.
54. Leach, D.R. Enhancement of Antitumor Immunity by CTLA-4 Blockade /
44
D.R. Leach, M.F. Krummel, J.P. Allison // Science. – 1996. – Vol. 271, № 5256. –
P. 1734-1736.
55. Improved Survival with Ipilimumab in Patients with Metastatic Melanoma /
F.S. Hodi [et al.] // N Engl J Med. – 2010. – Vol. 363, № 8. – P. 711-723.
56. Pooled Analysis of Long-Term Survival Data From Phase II and Phase III
Trials of Ipilimumab in Unresectable or Metastatic Melanoma / D. Schadendorf [et al.]
// JCO. – 2015. – Vol. 33, № 17. – P. 1889-1894.
57. Phase III Randomized Clinical Trial Comparing Tremelimumab With
Standard-of-Care Chemotherapy in Patients With Advanced Melanoma / A. Ribas
[et al.] // JCO. – 2013. – Vol. 31, № 5. – P. 616-622.
58. Wei, S.C. Fundamental Mechanisms of Immune Checkpoint Blockade
Therapy / S.C. Wei, C.R. Duffy, J.P. Allison // Cancer Discov. – 2018. – Vol. 8, № 9.
– P. 1069-1086.
59. Pembrolizumab versus Ipilimumab in Advanced Melanoma / C. Robert
[et al.] // N Engl J Med. – 2015. – Vol. 372, № 26. – P. 2521-2532.
60. Five-year survival outcomes for patients with advanced melanoma treated
with pembrolizumab in KEYNOTE-001 / O. Hamid [et al.] // Annals of Oncology. –
2019. – Vol. 30, № 4. – P. 582-588.
61. Pembrolizumab versus ipilimumab in advanced melanoma (KEYNOTE006): post-hoc 5-year results from an open-label, multicentre, randomised, controlled,
phase 3 study / C. Robert [et al.] // The Lancet Oncology. – 2019. – Vol. 20, № 9. –
P. 1239-1251.
62. Nivolumab versus chemotherapy in patients with advanced melanoma who
progressed after anti-CTLA-4 treatment (CheckMate 037): a randomised, controlled,
open-label, phase 3 trial / J.S. Weber [et al.] // The Lancet Oncology. – 2015. – Vol. 16,
№ 4. – P. 375-384.
63. Nivolumab in Previously Untreated Melanoma without BRAF Mutation / C.
Robert [et al.] // N Engl J Med. – 2015. – Vol. 372, № 4. – P. 320-330.
64. Combined Nivolumab and Ipilimumab or Monotherapy in Untreated
Melanoma / J. Larkin [et al.] // N Engl J Med. – 2015. – Vol. 373, № 1. – P. 23-34.
65. Durable, long-term survival in previously treated patients with advanced
melanoma who received nivolumab monotherapy in a phase I trial / Hodi F. S. [et al.]
// American Association for Cancer Research Annual Meeting. – 2016. – P. 16-20.
66. Weiss, S.A. Immunotherapy of Melanoma: Facts and Hopes / S.A. Weiss,
J.D. Wolchok, M. Sznol // Clin Cancer Res. – 2019. – Vol. 25, № 17. – P. 5191-5201.
67. Adjuvant Nivolumab versus Ipilimumab in Resected Stage III or IV
Melanoma / J. Weber [et al.] // N Engl J Med. – 2017. – Vol. 377, № 19. – P. 18241835.
68. Adjuvant Pembrolizumab versus Placebo in Resected Stage III Melanoma /
A.M.M. Eggermont [et al.] // N Engl J Med. – 2018. – Vol. 378, № 19. – P. 1789-1801.
45
69. Combined Nivolumab and Ipilimumab or Monotherapy in Untreated
Melanoma / J. Larkin [et al.] // N Engl J Med. – 2015. – Vol. 373, № 1. – P. 23-34.
70. Five-Year Survival with Combined Nivolumab and Ipilimumab in Advanced
Melanoma / J. Larkin [et al.] // N Engl J Med. – 2019. – Vol. 381, № 16. – P. 15351546.
71. Combined low-dose ipilimumab and pembrolizumab after sequential
ipilimumab and pembrolizumab failure in advanced melanoma / M.C. Kirchberger
[et al.] // European Journal of Cancer. – 2016. – Vol. 65 – P. 182-184.
72. Standard-dose pembrolizumab in combination with reduced-dose
ipilimumab for patients with advanced melanoma (KEYNOTE-029): an open-label,
phase 1b trial / G.V. Long [et al.] // The Lancet Oncology. – 2017. – Vol. 18, № 9. –
P. 1202-1210.
73. The great debate at ‘Immunotherapy Bridge 2018’, Naples, November 29th,
2018 / P.A. Ascierto [et al.] // j. immunotherapy cancer. – 2019. – Vol. 7, № 1. – P. 221.
74. Combined Nivolumab and Ipilimumab in Melanoma Metastatic to the Brain
/ H.A. Tawbi [et al.] // N Engl J Med. – 2018. – Vol. 379, № 8. – P. 722-730.
75. Combination nivolumab and ipilimumab or nivolumab alone in melanoma
brain metastases: a multicentre randomised phase 2 study / G.V. Long [et al.] // The
Lancet Oncology. – 2018. – Vol. 19, № 5. – P. 672-681.
76. Falzone, L. Evolution of Cancer Pharmacological Treatments at the Turn of
the Third Millennium / L. Falzone, S. Salomone, M. Libra // Front. Pharmacol. – 2018.
– Vol. 9 – P. 1300.
77. Pelster, M.S. Combined targeted therapy and immunotherapy in melanoma:
a review of the impact on the tumor microenvironment and outcomes of early clinical
trials / M.S. Pelster, R.N. Amaria // Ther Adv Med Oncol. – 2019. – Vol. 11 –
P. 175883591983082.
78. Hepatotoxicity with Combination of Vemurafenib and Ipilimumab / A. Ribas
[et al.] // N Engl J Med. – 2013. – Vol. 368, № 14. – P. 1365-1366.
79. Severe gastrointestinal toxicity with administration of trametinib in
combination with dabrafenib and ipilimumab / D.R. Minor [et al.] // Pigment Cell
Melanoma Res. – 2015. – Vol. 28, № 5. – P. 611-612.
80. Haass, N.K. Normal Human Melanocyte Homeostasis as a Paradigm for
Understanding Melanoma / N.K. Haass, M. Herlyn // Journal of Investigative
Dermatology Symposium Proceedings. – 2005. – Vol. 10, № 2. – P. 153-163.
81. Bogenrieder, T. The molecular pathology of cutaneous melanoma / T.
Bogenrieder, M. Herlyn // CBM. – 2011. – Vol. 9, № 1-6. – P. 267-286.
82. Virtually 100% of melanoma cell lines harbor alterations at the DNA level
withinCDKN2A, CDKN2B, or one of their downstream targets / G.J. Walker [et al.] //
Genes Chromosom. Cancer. – 1998. – Vol. 22, № 2. – P. 157-163.
83. Distinct Sets of Genetic Alterations in Melanoma / J.A. Curtin [et al.] // N
46
Engl J Med. – 2005. – Vol. 353, № 20. – P. 2135-2147.
84. Fecher, L.A. The MAPK pathway in melanoma / L.A. Fecher, R.K.
Amaravadi, K.T. Flaherty // Current Opinion in Oncology. – 2008. – Vol. 20, № 2. –
P. 183-189.
85. The role of BRAF V600 mutation in melanoma / P.A. Ascierto [et al.] // J
Transl Med. – 2012. – Vol. 10, № 1. – P. 85.
86. Bertolotto, C. Melanoma: From Melanocyte to Genetic Alterations and
Clinical Options / C. Bertolotto // Scientifica. – 2013. – Vol. 2013 – P. 1-22.
87. Molecular alterations in signal pathways of melanoma and new personalized
treatment strategies: Targeting of Notch / J. Mozūraitienė [et al.] // Medicina. – 2015.
– Vol. 51, № 3. – P. 133-145.
88. Davies, M.A. The Role of the PI3K-AKT Pathway in Melanoma / M.A.
Davies // The Cancer Journal. – 2012. – Vol. 18, № 2. – P. 142-147.
89. Novel Somatic Mutations to PI3K Pathway Genes in Metastatic Melanoma
/ A.Y. Shull [et al.] // PLoS ONE. – 2012. – Vol. 7, № 8. – P. e43369.
90. Targeted Therapies in Melanoma: Successes and Pitfalls / G. Palmieri [et al.]
// Melanoma - From Early Detection to Treatment / ed. H. Duc. – InTech, 2013. –
Targeted Therapies in Melanoma.
91. Wnt-β-catenina signaling pathway and its relationship with cancer / A. B.
Ochoa-Hernández [et al.] // Cirugia y cirujanos. – 2012. – Vol. 80, №. 4. – P. 389398.
92. β-Catenin Inhibitor ICAT Modulates the Invasive Motility of Melanoma
Cells / M.J. Domingues [et al.] // Cancer Res. – 2014. – Vol. 74, № 7. – P. 1983-1995.
93. MDM4 is a key therapeutic target in cutaneous melanoma / A. Gembarska
[et al.] // Nat Med. – 2012. – Vol. 18, № 8. – P. 1239-1247.
94. Potti, A. [No title found] / A. Potti, R.C. Hille, M. Koch // J Carcinog. –
2003. – Vol. 2, № 1. – P. 8.
95. Prognostic significance of BRAF and NRAS mutations in melanoma: a
German study from routine care / M. V. Heppt [et al.] // BMC cancer. – 2017. – Vol.
17, №. 1. – p. 1-12.
96. NRAS mutation status is an independent prognostic factor in metastatic
melanoma / J.A. Jakob [et al.] // Cancer. – 2012. – Vol. 118, № 16. – P. 4014-4023.
97. Combined Vemurafenib and Cobimetinib in BRAF -Mutated Melanoma / J.
Larkin [et al.] // N Engl J Med. – 2014. – Vol. 371, № 20. – P. 1867-1876.
98. Rare BRAF mutations in melanoma patients: implications for molecular
testing in clinical practice / L. Heinzerling [et al.] // Br J Cancer. – 2013. – Vol. 108,
№ 10. – P. 2164-2171.
99. Siqueira, J.F. PCR methodology as a valuable tool for identification of
endodontic pathogens / J.F. Siqueira, I.N. Rôças // Journal of Dentistry. – 2003. –
Vol. 31, № 5. – P. 333-339.
47
100. Shendure, J. Next-generation DNA sequencing / J. Shendure, H. Ji // Nat
Biotechnol. – 2008. – Vol. 26, № 10. – P. 1135-1145.
101. Kchouk, M. Generations of Sequencing Technologies: From First to Next
Generation / M. Kchouk, J.F. Gibrat, M. Elloumi // Biol Med (Aligarh). – 2017. –
Vol. 09, № 03.
48