Le immagini di seguito riportate sono in parte tratte da: Voet-Voet-Pratt Fondamenti di Biochimica-Zanichelli Nelson-Cox-I principi di biochimica di Lehninger -Zanichelli Berg-Tymoczko-Stryer-Biochimica - Zanichelli Garret-Grisham – Principi di Biochimica- Piccin Ringe-Petsko- Struttura e funzione delle proteine- Zanichelli e sono ad uso esclusivo degli studenti del corso di Biochimica del Corso di Laurea in Scienze Biologiche dell’Università degli Studi di Genova. Adenosina trifosfato (ATP) Diverse ragioni sono alla base dell’elevata variazione di energia libera associata all’idrolisi di ATP: - rimozione della repulsione elettrostatica - il fosfato inorganico è stabilizzato dalla risonanza - ionizzazione immediata del prodotto di reazione ADP - i prodotti della reazione sono maggiormente solvatati del reagente 1 2ATP ADP Carica energetica 2 ATP ADP AMP Strategie per la produzione di ATP nelle cellule Ci sono due modi per produrre ATP attraverso reazioni del catabolismo ossidativo: 1) Reazioni di fosforilazione a livello del substrato In queste reazioni, catalizzate da cinasi (o chinasi), un intermedio metabolico fosforilato cede il fosfato all’ADP con formazione di ATP secondo lo schema generale: XP + ADP X + ATP Es. 1,3 bisfosfoglicerato e fosfoenolpiruvato nella glicolisi. Il potenziale di trasferimento del fosfato di questi composti fosforilati è maggiore di quello dell’ATP. 2) La fosforilazione ossidativa Nel processo della fosforilazione ossidativa (che avviene nei mitocondri) l’energia “potenziale” dei coenzimi ridotti (NADH e FADH2) è trasformata nell’energia “pronta” dell’ATP attraverso un complesso meccanismo. I coenzimi ridotti sono stati prodotti in reazioni di ossidazione dei substrati (glucoso, fruttoso, acidi grassi) nelle varie vie metaboliche del catabolismo (glicolisi, ciclo di Krebs, ossidazione degli acidi grassi). Pertanto il processo di produzione dell’ATP via fosforilazione ossidativa si può dividere in 2 fasi: Fase 1 : riduzione dei coenzimi nelle reazioni di ossidazione dei substrati metabolici Xrid + NAD/FAD Xox + NADH/FADH2 Fase 2 : ri-ossidazione dei coenzimi ridotti accoppiata alla produzione di ATP nella fosforilazione ossidativa nei mitocondri NADH/FADH2 + O2 NAD/FAD + H2O ADP + Pi ATP + H2O La fosforilazione ossidativa è la principale fonte di ATP per la maggior parte delle cellule del nostro organismo. SCHEMA DELLA GLICOLISI Glucosio ATP esochinasi, glucochinasi ADP Glucosio 6 fosfato REAZIONE COMPLESSIVA glucosio+2NAD++2ADP+2Pi glucosio fosfato isomerasi Fruttosio 6 fosfato ATP ADP fosfofruttochinasi Fruttosio 1-6 bisfosfato 2piruvato+2NADH+2H++2ATP fruttosio bisfosfato aldolasi 2x Diidrossiacetone Gliceraldeide fosfato 3-fosfato trioso fosfato isomerasi NAD gliceraldeide 3 fosfato deidrogenasi H3PO4 NADH+H+ AC. 1-3 bisfosfogliecerato ADP ATP fosfoglicerato chinasi 3 fosfoglicerato fosfoglicerato mutasi 2 fosfoglicerato enolasi H2O fosfoenol piruvato ADP ATP piruvato piruvato chinasi Glucosio + ATPGlucosio-6P + ADP ΔG0= -16,7 KJ/mol Concentrazione dei metaboliti glicolitici negli eritrociti allo stato stazionario ΔG = -16,7 KJ/mol + 8,314 J/molK*310K*ln [G-6P] [ADP] [G] [ATP] ΔG = -16,7 KJ/mol + 8,314 J/molK*310K*2.3log (0,083) (0,14) (5,0) (1,85) ΔG = -16,7 KJ/mol + (-16,34 KJ/mol) = -33,04 KJ/mol -16,7 KJ/mol -33,04 KJ/mol REGOLAZIONE DELLA GLICOLISI Glucosio ATP esochinasi, glucochinasi ADP Glucosio 6 fosfato La esocinasi è inibita dal glucoso 6fosfato glucosio fosfato isomerasi Fruttosio 6 fosfato ATP ADP fosfofruttochinasi Fruttosio 1-6 bisfosfato La fosfofrutto cinasi è stimolata allostericamente da AMP e ADP (bassa carica energetica della cellula) e inibita allostericamente da ATP e da citrato (alta carica energetica). Inoltre è attivata dall'insulina e inibita dal glucagone. Inoltre è attivata allostericamente da fruttosio 2,6 bisfosfato fruttosio bisfosfato aldolasi 2x Diidrossiacetone Gliceraldeide fosfato 3-fosfato trioso fosfato isomerasi NAD gliceraldeide 3 fosfato H3PO4 NADH+H+ deidrogenasi AC. 1-3 difosfogliecerato ADP fosfoglicerato chinasi ATP 3 fosfoglicerato La piruvato cinasi è inibita allostericamente da ATP ed è inibita dal glucagone ed è indotta (aumentata sintesi di enzima) dall'insulina fosfoglicerato mutasi 2 fosfoglicerato enolasi H2O fosfoenol piruvato ADP ATP piruvato piruvato chinasi - cooperatività di legame La fosfofruttochinasi (PFK) è un omotetramero dove ciascuna subunità presenta tre siti di legame, due per i substrati ed uno per effettori positivi (ADP) e negativi (PEP) Il loop 6-F posto tra l’alfa elica F ed il filabento beta 6 rappresenta l’elemento di collegamento tra il sito dell’effettore di una subunità ed il sito attivo presente sulla subunità contigua dimero della PFK costituito da due subunità ciascuna formata da due domini La struttura quaternaria della PFK presenta due zone di interazione, tra le subunità A-B e C-D a formare i dimeri e tra i dimeri a formare il tetramero stato R Le subunità possono trovarsi in due distinti stati conformazionali (stato T, teso) e (stato R, rilassato). Le transizioni fra i due stati conformazionali sono concertate dando vita ad un legame cooperativo. stato T Il tetramero origina dall’interazione di due foglietti beta che possono formare legami idrogeno per dare vita ad un foglietto beta esteso (stato T) o possono essere separati da molecole di acqua disposte a ponte (stato R) La struttura quaternaria dello stato R dipende dalla presenza, a livello del sito attivo, della porzione 6-F avvolta ad elica. Tale porzione risulta quasi completamente svolta nello stato T. GLICOLISI “ANAEROBICA”: fermentazione lattica e alcolica La fermentazione lattica rappresenta la via anaerobica di utilizzo del piruvato, che si attiva nei muscoli degli organismi aerobici, quando, a causa del lavoro muscolare molto intenso, l'apporto di ossigeno da parte dell'apparato cardiovascolare non è sufficiente alle richieste. In questo caso si parla di glicolisi anaerobica. L'acido lattico, se prodotto in quantità notevoli, può provocare crampi muscolari, comunque è una delle cause della sensazione di fatica prodotta dal lavoro muscolare. COO- NADH+H+ NAD+ C=O CH3 piruvato COOH-C-OH LDH (lattico deidrogenasi) CH3 lattato Riduzione di un gruppo chetonico ad alcol secondario La fermentazione alcolica rappresenta l’unica via di utilizzo del piruvato da parte di organismi anaerobi come i lieviti. Tale fermentazione avviene nel mosto d'uva ad opera dei saccaromiceti e produce alcol etilico, a partire dal glucosio; durante tale processo il mosto ribolle per lo svolgimento di anidride carbonica (CO2) gassosa. Il saccaromices cerevisiae è analogamente responsabile, nel processo di panificazione, del rigonfiamento della pasta (lievitazione) dovuto alla produzione di CO2. COOC=O CH3 piruvato NADH+H+ CO2 CHO NAD+ OH CH2 CH3 aldeide acetica CH3 alcol etilico La prima è una reazione di decarbossilazione (enzima: piruvato decarbossilasi), la seconda rappresenta la riduzione di un'aldeide ad alcol primario (enzima: alcol deidrogenasi). enzima deramificante enzima ramificante La glicogeno fosforilasi è regolata allostericamente in maniera diversa nel muscolo e nel fegato: Muscolo: La glicogeno fosforilasi b è attivata da AMP e inibita da ATP e glucosio-6P Fegato: La glicogeno fosforilasi a è inibita da glucosio (aumenta la suscettibilità dell’enzima alla sua defosforilazione e quindi alla sua inattivazione) Regolazione ormonale nel fegato Glucagone recettore attivato cAMP PKA attiva fosforilasi attiva e glicogeno sintasi inattiva. Insulina attivazione di una fosfatasi che defosforila la glicogeno fosforilasi (inattivandola) e la glicogeno sintasi (attivandola). Il glucagone (iperglicemizzante) attiva nel fegato la demolizione del glicogeno e inibisce la sintesi. L’insulina (ipoglicemizzante) attiva nel fegato la sintesi del glicogeno e ne inibisce la demolizione. La parte non ossidativa della via dell’esoso monofosfato, anch’essa nel citoplasma, consiste nell’interconversione di zuccheri fosforilati a 3, 6 e 5 atomi di carbonio, secondo il seguente schema : C5 + C5 C3 + C7 transchetolasi C7 + C3 C4 + C6 transaldolasi C5 + C4 C3 + C6 transchetolasi Regolazione: Il primo enzima della via ossidativa, la glucoso 6-fosfato deidrogenasi, è l’unico regolato della via dell’esoso monofosfato: è stimolato da NADP+ (forma ossidata) e inibito da NADPH (forma ridotta) e da ATP. Inoltre è indotto (aumentata sintesi) dall’ insulina DG0’= -33,4 kJ/mole Piruvato + NAD+ + coenzima A acetil-CoA + NADH + H+ + CO2 COO- CoA-SH + NAD+ NADH+H+ C=O CH3 S-CoA C=O CO2 piruvato piruvato deidrogenasi CH3 Acetil-CoA FAD Struttura di NADH/NAD+ NADPH/NADP+ (1) Reazioni anaplerotiche del Ciclo di Krebs Piruvato + NAD+ + coenzima A acetil-CoA + NADH + H+ + CO2 Piruvato deidrogenasi Regolazione: La piruvato deidrogenasi è inibita da ATP, acetil-CoA e NADH e stimolata da AMP, CoA e NAD+ Le deidrogenasi che catalizzano le reazioni di decarbossilazione ossidativa sono inibite allostericamente da ATP e da NADH (alta carica energetica) La citrato sintasi è inibita da ATP e NADH e stimolata da ADP citrato sintasi Isocitrato deidrogenasi -KGA deidrogenasi Il trasporto degli elettroni e la fosforilazione dell’ADP sono processi associati alle membrane (1) Trasporto di protoni dalla matrice allo spazio transmembrana ad opera del complesso I Il trasporto di protoni transmembrana è alla base della teoria chemiosmotica di Mitchell Modello della ATP sintasi L=loose T=tight 0=inactive Dimostrazione di Racker e Stoeckenius della validità del modello chemiosmotico di Mitchell Il sistema navetta del glicerolo fosfato Il sistema navetta malato-aspartato La traslocazione di ATP e ADP è mediata da una traslocasi Siti di azione di alcuni inibitori del trasporto elettronico e della fosforilazione ossidativa Digestione e assorbimento dei trigliceridi derivanti dall’alimentazione un fosfolipide CH2O-C CH O-C O + O H3N-CH2-CH2O-P-O- CH2 OH Testa polare (idrofilica) un trigliceride CH3 CH3 coda apolare (idrofobica) Adrenalina Glucagone ACTH Il distacco degli acidi grassi dal glicerolo è ormone-dipendente Attivazione degli acidi grassi acil-CoA deidrogenasi trans-enoil-CoA idratasi 3-idrossiacil-CoA deidrogenasi b-chetoacil-CoA tiolasi Degradazione dei trigliceridi e ossidazione degli acidi grassi; regolazione: Le lipasi e la carnitina acil transferasi sono attivate per fosforilazione da una cinasi a sua volta attivata dal glucagone Il glucagone stimola il trasporto degli acidi grassi dentro i mitocondri e quindi la loro ossidazione citrato sintasi Isocitrato deidrogenasi -KGA deidrogenasi Il sistema navetta malato-aspartato Gluconeogenesi Regolazione La piruvato carbossilasi (enzima mitocondriale) è stimolata allostericamente da acetil-CoA e stimolata (in seguito a fosforilazione) da una cinasi attivata dal glucagone La fruttoso 1,6 bisfosfatasi e la fosfofruttochinasi sono reciprocamente regolate allostericamente da fruttosio 2,6 bisfosfato (attiva la glicolisi e inattiva la gluconeogenesi) La fruttoso 1,6 bisfosfatasi e glucoso 6 fosfatasi sono stimolate dal glucagone Glucosio ATP OH ATP HO PFK-2 PFK-2 ADP ADP Fruttosio-6-fosfato ATP Pi PFK-1 F2,6-BP F-1,6-BPasi F2,6-BP ADP F-2,6-BPasi F-2,6-BPasi Fruttosio 1,6-bifosfato P Pi Fruttosio 6-fosfato Pi P 2 piruvato Fruttosio 6-fosfato Glucosio HO P ATP PFK-2 ADP Fruttosio-6-fosfato F2,6BPasi ATP Pi PFK-1 F2,6-BP PKA PKA ADP Fruttosio 1,6-bifosfato Pi Fruttosio 6-fosfato F-1,6-BPasi 2 piruvato La glucosio-6-fosfatasi è localizzata nel reticolo endoplasmatico. La conversione del glucosio-6-P in glucosio avviene in seguito al trasporto nel RE. La glucosio-6-fosfatasi ed i tre trasportatori sono noti come sistema della glucosio-6-fosfatasi. Le due vie metaboliche differiscono per localizzazione cellulare, trasportatore dei gruppi acile, coenzima ossidoriduttivo. Sintesi degli acidi grassi ATP Dopo l’uscita dal mitocondrio sotto forma di citrato, l’acetil-CoA è carbossilato a malonil-CoA. Il malonil CoA può essere considerato il “mattoncino” di costruzione dell’acido grasso acetil CoA carbossilasi ADP +Pi Schema del complesso multienzimatico dimerico della acido grasso sintetasi Regolazione: L’enzima acetil CoA carbossilasi è stimolato allostericamente da citrato e inibito da palmitoil-CoA. Il glucagone (via cinasi) inattiva e l’insulina (via fosfatasi) attiva l’acetilCoA carbossilasi. L’allungamento degli acidi grassi è un processo mitocondriale inverso all’ossidazione: nell’ultima reazione anziché FADH2 il coenzima è il NADPH La sintesi dei trigliceridi può partire da diidrossiacetone fosfato o da glicerolo 3-fosfato Gli amminoacidi possono essere degradati in differenti situazioni metaboliche: • durante il “turnover” (degradazione e sintesi) delle proteine • in seguito ad una dieta ricca di proteine e/o amminoacidi • durante il digiuno o nel diabete di tipo I Il sito attivo delle transaminasi opera attraverso un meccanismo acido-base che, in questi enzimi, si realizza per vicinalità di catene laterali acide (aspartico 222) e basiche (lisina 258) che generano forti campi elettrostatici in grado di attuare la catalisi legando un cofattore (piridossal-fosfato) senza interagire fra di loro come avverrebbe in acqua. L’aspartato amminotransferasi ne è un esempio. Domini proteici dotati di analoga attività hanno, a volte, fold diversi Aspartato ammino transferasi D-amminoacido ammino transferasi (un buon esempio di evoluzione convergente) Solo i siti attivi, individuabili per la presenza del cofattore, presentano similarità. I siti attivi sono speculari e forse responsabili delle differenti stereospecificità. Degradazione degli amminoacidi: transaminazione, deaminazione e ciclo dell’urea L’unico amminoacido che può essere deaminato (distacco del gruppo amminico) direttamente è il glutammato, con formazione di ammoniaca e -chetoglutarato, che è un intermedio del ciclo di Krebs. Glutammato + NAD + H2O -chetoglutarato + NADH + NH4+ Glutammato deidrogenasi La carbamil fosfato sintetasi I è attivata allostericamente da acido Nacetilglutammato sintetizzato da acetil CoA e glutammato da parte dell’enzima N-acetilglutammato sintasi: Se la dieta è ricca di proteine si ha un eccesso di gruppi amminici da smaltire (si produce molto glutammato) con elevata produzione di urea. Durante il digiuno (si produce molto acetil-CoA si attiva la demolizione delle proteine muscolari come rifornimento di sostanze nutrienti. Struttura ai raggi X della carbamil fosfato sintetasi di E.coli: un esempio di enzima polifunzionale. amminoacidi NH3 -chetoglutarato glutamato CARBAMIL-P CITRULLINA ASPARTATO OSSALACETATO ARGININ SUCCINATO ORNITINA MALATO ARGININA UREA FUMARATO I nucleotidi sono biomolecole fondamentali: RNA, DNA ATP GTP UDP-G cAMP, cGMP. cADPR La sintesi dei nucleotidi, inoltre, è il bersaglio terapeutico di molti farmaci antitumorali BASE RIBONUCLEOSIDE RIBONUCLEOTIDE (5’- monofosfato) Adenina (A) Adenosina Adenilato (AMP) Guanina (G) Guanosina Guanilato (GMP) Uracile (U) Uridina Uridilato (UMP) Citosina (C) Citidina Citidilato (CMP) I nucleotidi possono essere sintetizzati “de novo” o attraverso vie di recupero che riciclano le basi libere derivate dal “turnover” dei nucleotidi o dalla dieta e le trasferiscono al PRPP attraverso specifiche transferasi. Nella via “de novo” l’anello pirimidinico viene trasferito al PRPP dopo che è stato sintetizzato a partire da precursori semplici come bicarbonato e aspartato. Per questo processo è necessaria l’idrolisi di ATP. aspartato transcarbamilasi diidroorotato deidrogenasi diidroorotasi Nei mammiferi la carbamil fosfato sintetasi, l’ aspartato transcarbamilasi e la diidroorotasi sono raggruppati in una singola catena polipeptidica di 210 kD che prende il nome di CAD. In forma nativa la CAD è un omotrimero dove ciascuna subunità possiede tutte e tre le attività enzimatiche. orotato fosforibosil transferasi orotidilato decarbossilasi Orotidina-5’-monofosfato (OMP) Uridina monofosfato (UMP) Una volta prodotto UMP, l’ulteriore fosforilazione a UDP e UTP avviene grazie a due attività enzimatiche: nucleoside monofosfato chinasi (specifica) nucleoside difosfato chinasi (aspecifica) UMP+ATP UDP+ADP nucleoside monofosfato chinasi XDP+YTP XTP+YDP nucleoside difosfato chinasi Una volta prodotto UTP viene aminato a CTP Il donatore del gruppo amminico è la glutammina (Gln) citidina trifosfato sintetasi La ribonucleotide reduttasi converte i ribonucleotidi in deossiribonucleotidi. Successivamente il dUMP viene metilato per formare dTMP con il metilentetraidrofolato come donatore del gruppo metilico. timidilato sintasi A differenza di quanto avviene per le pirimidine, l’anello purinico viene sintetizzato su un derivato del ribosio fosfato, la 5-fosforibosil-1-ammina ottenuta per sostituzione del pirofosfato del PRPP con l’ammoniaca derivata dalla glutammina. Il nucleo purinico viene costruito attraverso nove tappe che, di frequente, consistono nella fosforilazione di un atomo di ossigeno seguita dalla sostituzione del gruppo fosforico da parte di un nucleofilo (gruppo amminico proveniente dalla glutammina) glicinamide ribonucleotide (GAR) sintetasi (GAR) transformilasi formilglicinamide sintasi amminoimidazolo ribonucleotide sintasi carbossiamminoimidazolo ribonucleotide sintasi carbossiamminoimidazolo ribonucleotide sintasi succinilamminoimidazolo carbossamide ribonucleotide sintetasi adenilsuccinato liasi inosina monofosfato cicloidroliasi amminoimidazolo carbossamide ribonucleotide transformilasi Il prodotto finale inosinato(IMP) è il precursore di adenilato(AMP) ottenuto per aggiunta dell’aspartato seguita dal rilascio del fumarato. Il guanilato(GMP) si ottiene per azione di una deidrogenasi NAD-dipendente e sostituzione di un ossigeno carbonilico con un gruppo amminico ottenuto per idrolisi della glutammina. Le vie di recupero delle basi puriniche riciclano le basi libere derivate dal “turnover” dei nucleotidi o dalla dieta facendo risparmiare energia (ATP) necessaria per la sintesi “de novo”. Due enzimi, la adenina fosforibosiltransefarasi e la ipoxantina-guanina fosforibosiltransefarasi trasferiscono adenina, ipoxantina e guanina sul PRPP portando all’eliminazione di pirofosfato inorganico PPi. Adenina + PRPP adenilato (AMP) + PPi adenina fosforibosiltransefarasi Guanina + PRPP guanilato (GMP) + PPi ipoxantina-guanina fosforibosiltransefarasi Inosina + PRPP inosinato (IMP) + PPi ipoxantina-guanina fosforibosiltransefarasi
