УЧРЕЖДЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ
ПОЛЕССКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
Д.Д.ЖЕРНОСЕКОВ
Е.И.ПРИЛОВСКАЯ
РЕГУЛЯЦИЯ МЕТАБОЛИЗМА
КЛЕТКИ
специальности
1-31 01 01 Биология (по направлениям)
Пояснительная записка
Конспект лекций
Практикум
Литература
Вопросы к экзамену
Учебная программа дисциплины
Пинск
ПолесГУ
2020
ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА
Учебно–методический комплекс предназначен для подготовки студентов
дневной формы обучения. Он является нормативным документом, которым
определяются содержание обучения и устанавливаются требования к объему и
уровню подготовки студентов по специальности 1-31 01 01 ‖Биология (по
направлениям)―.
Целью курса является формирование у студентов целостной системы знаний о
принципах контроля метаболических процессов бактериальной клетки.
В задачи дисциплины входит изучение общих принципов регуляции клеточных
процессов на различных стадиях экспрессии геномной информации, молекулярных
механизмов, определяющих перестройку метаболических процессов при стрессовых
воздействиях, молекулярных механизмов межклеточных коммуникаций, а также
механизмов контроля локализации белков внутри клетки и за ее пределами.
Обучение студентов по курсу ‖ Регуляция метаболизма клетки ― по
специальности ‖Биология (по направлениям)― для дневной формы получения
образования проводится в форме лекций (26 часов) и практических занятий (14
часов). Общее количество часов по дисциплине составляет 92 часа. Форма контроля –
экзамен.
На лекциях излагаются общетеоретические основы по данной дисциплине.
На практических занятиях используются демонстрационные материалы,
учебно-методические материалы; методические материалы по тематике дисциплины.
При изучении данного курса используются учебно-наглядные пособия: схемы,
таблицы, фильмы.
Контроль усвоения знаний осуществляется посредством устных и пись-менных
опросов.
Формы текущей аттестации по дисциплине: фронтальный опрос, пись-менная
работа, реферат.
Формы итоговой аттестации по дисциплине – экзамен.
К экзамену допускаются студенты, успешно выполнившие программу по
дисциплине.
ЛЕКЦИИ
1. ОПЕРОННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ГЕНОВ
1. Общая характеристика.
2. Отрицательная регуляция лактозного оперона.
3. Положительная регуляция лактозного оперона.
4. Регуляция триптофанового оперона.
2. КАТАБОЛИТНАЯ РЕПРЕССИЯ
1. Определение катаболитной репрессии.
2. Катаболитная репрессия у Грамотрицательных бактерий на примере
E.coli.
3. Катаболитная репрессии у Грамположительных бактерий на примере
Bacillus subtilis.
3. КАСКАДНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ
1. Особенности регуляция экспрессии генов у про- и эукариот.
2. Регуляция экспрессии генов у прокариот.
3. Регуляция экспрессии генов у эукариот.
4. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ
ПРОТЕАЗЫ
ШАПЕРОНЫ
И
АТФ-ЗАВИСИМЫЕ
1.Структура и функциональная роль шаперонов в фолдинге белков.
2.Роль шаперонов в фолдинге белков.
3.Роль шаперонов в защите белков клеток от денатурирующих стрессовых
воздействий.
4. Болезни, связанные с нарушением фолдинга белков.
5. АТФ-зависимые протеазы.
6. Регуляция синтеза белков теплового шока.
5. СЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ
1.Трансмембранные рецепторы.
2.Двухкомпонентные системы.
3.Структура и функции гистидиновых протеинкиназ.
6. СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ
ПРОКАРИОТ
1.Структура регуляторов ответа.
2.Активация фосфорилированием.
3.Архитектура регуляторных систем.
РЕГУЛЯТОРОВ
ОТВЕТА
У
4.Регуляторные механизмы.
7. ХЕМОТАКСИС.
ХЕМОТАКСИСА
БЕЛКОВЫЙ
АППАРАТ
И
РЕЦЕПТОРЫ
8. КИСЛОРОДНЫЙ СТРЕСС И РЕДОКС КОНТРОЛЬ
1. Активные радикалы, их повреждающее действие.
2. Защита от окислительного стресса.
3. Адаптация к анаэробиозу.
9. РЕГУЛЯЦИЯ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА
1. Регуляция клеточного цикла у эукариот.
2. Регуляция клеточного цикла у прокариот.
3. Особенности клеточного деления у
грамотрицательных бактерий.
10. СПОРУЛЯЦИЯ
АКТИВАТОРОВ.
БАКТЕРИЙ.
грамположительных
МОРФОЛОГИЯ
И
1. Стадии споруляции.
2. Покоящиеся формы бактерий.
3. Культуральные свойства бактерий.
11. СЕКРЕЦИЯ БЕЛКОВ
1. Секретируемые белки и их расположение.
2. Секреторный аппарат первого типа.
3. Секреторный аппарат второго типа (GSP).
4. Секреторный аппарат третьего типа.
12. РЕГУЛЯЦИЯ СТАБИЛЬНОСТИ мРНК
1. Факторы, влияющие на стабильность прокариотической мРНК.
2. Бактериальные РНКазы, участвующие в деградации мРНК.
3. Мультибелковые комплексы деградации РНК.
и
РОЛЬ
КОНСПЕКТ ЛЕКЦИЙ
ТЕМА 1
ОПЕРОННАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ГЕНОВ
1. Общая характеристика.
Экспрессию генов регулируют процессы, влияющие на скорость синтеза и
разрушения продуктов генов. В значительной степени регуляция осуществляется на
уровне инициации транскрипции посредством регуляторных белков, которые либо
подавляют транскрипцию (отрицательная регуляция), либо активируют ее
(положительная регуляция) на специфических промоторах.
Гены бактерий, кодирующие продукты с взаимосвязанными функциями, часто
организованы в кластеры – опероны (отдельные транскрипционные единицы).
Транскрипция генов обычно блокируется при связывании специфического белкарепрессора с участком ДНК, называемым оператором. Небольшие молекулы
(индукторы) могут вызывать отсоединение репрессора от оператора. Эти принципы
впервые были установлены при изучении лактозного (lac) оперона. Lac-репрeccop
отделяется от fac-оператора, когда репрессор связывается со своим индуктором
аллолактозой. Регуляторные белки – ДНК-связывающие белки, распознающие
специфические последовательности ДНК; в большинстве регулируемых белков
имеется особый ДНК-связывающий домен. Для этих доменов характерны типичные
структурные мотивы, ответственные за связывание с ДНК: спираль-поворот-спираль,
цинковый палец и гомеодомен.
Регуляторные белки также содержат домены для межбелковых взаимодействий;
это лейциновая молния и спираль-петля-спираль, необходимые для димеризации, а
также другие мотивы, участвующие в активации транскрипции.
2.Отрицательная регуляция лактозного оперона.
Лактозный оперон (lac) (рисунок1) содержит гены (β-галактозидазы (Z),
галактозидпермеазы
(У)
и
тиогалактозидтрансацетилазы
(Л).
Фермент
тиогалактозидтрансацетилаза, по-видимому, модифицирует токсичные галактозиды,
чтобы облегчить их удаление из клетки. Каждому из этих трех генов предшествует
участок связывания рибосомы, который направляет трансляцию этого гена
независимо от остальных.
Рисунок 1.1 – Лактозный оперон. А-Lас-оперон в репрессированном состоянии. Ген I кодирует Lacpeпpeccop. Гены lac Z ,Y v iA кодируют (β-галактозидазу, галактозидпермеазу и
тиогалактозидтрансацетилазу соответственно. Р-промотор Zac-генов, Ра-промотор гена I. 01 –
главный оператор Zac-оперона; 02 и 03-дополнительные операторы с меньшим сродством к Lacpenpeccopy. Б- Lac-репрeccop связывается с главным оператором и с дополнительными операторами
02 или 03, что, вероятно, приводит к образованию петли ДНК, которая обвивается вокруг
репрессора.
При изучении клеток с мутациями 1ас-оперона были установлены некоторые
подробности его регуляции. В отсутствие лактозы транскрипция генов lac-оперона
подавлена. Мутации в области оператора или другого гена, гена I, приводят к
конститутивному синтезу продуктов. Если ген I поврежден, репрессию можно
восстановить, введя в клетку нормально функционирующий ген I на другой молекуле
ДНК. Это доказывает, что ген I кодирует способную диффундировать молекулу,
которая и подавляет транскрипцию. Оказалось, что эта молекула – тетрамерный
белок, теперь называемый Lac-репрессором, состоящий из идентичных субъединиц.
Оператор О1, с которым Lac-peпpeccop связывается прочнее всего, граничит с
точкой начала транскрипции. Ген I транскрибируется со своего собственного
промотора (P t) независимо от других генов lac-оперона. В lac-опероне есть два
дополнительных участка связывания Lac-penpeccopa. Центр одного из них (O2)
располагается в позиции 410 внутри гена, кодирующего бета-галактозидазу (Z); центр
второго ( O3) – в позиции 90 внутри гена I. Чтобы подавить экспрессию оперона, Lacрепрeccop, по-видимому, связывается одновременно с главным оператором и с одним
из двух дополнительных участков, так что расположенная между ними
последовательность ДНК образует петлю. При любом варианте связывания
инициация транскрипции блокируется.
Несмотря на образование этого сложного комплекса, транскрипция подавляется
не полностью. Связывание Lac-peпpeccopa уменьшает вероятность инициации
транскрипции в 10 раз. Если сайты О2 и O1 повреждены в результате делеции или
мутации, связывание Lac-репрeccopa с одним только оператором О1 уменьшает
транскрипцию в 102 раз. Даже при связывании репрессора в каждой клетке есть
несколько молекул β-галактозидазы и галактозидпермеазы, по-видимому,
синтезированных во время тех редких эпизодов, когда lac-репрeccop на краткое время
отсоединяется от операторов. Этот минимальный уровень транскрипции необходим
для регуляции оперона.
Когда в клетках появляется лактоза, происходит индукция Laс-оперона.
Молекула индуктора связывается с особым участком Lac-penpeccopa изменяя его
конформацию и приводя к отделению репрессора от оператора. Индуктором в
системе Lac-оперона служит не сама лактоза, а ее изомер – аллолактоза. Транспорт
лактозы в клетки Е. coli осуществляет присутствующий там фермент пермеаза; далее
под действием β-галактозидазной активности лактоза превращается в аллолактозу.
Отделение репрессора от оператора после связывания репрессора с аллолактозой
позволяет начать транскрипцию генов Lac-оперона и приводит к тысячекратному
увеличению концентрации β-галактозидазы.
Некоторые βгалактозиды, похожие по строению на аллолактозу, индуцируют
Lac-оперон, но не являются субстратами β-галактозидазы; другие, наоборот,
являются субстратами β-галактозидазы, но не индукторами. В экспериментах часто
используется очень эффективный (и при этом нерасщепляемый) индуктор Lacоперона изопропилтиогалактозид (IPTG). Нерасщепляемый индуктор позволяет
изучать физиологическую роль лактозы как источника углерода для роста клеток
независимо от ее участия в регуляции экспрессии генов.
В клетках бактерий обнаружено множество оперонов; несколько
полицистронных оперонов найдено и в клетках низших эукариот. Однако в клетках
высших эукариот почти все гены, кодирующие белки, транскрибируются по
отдельности.
3. Положительная регуляция лактозного оперона.
Взаимодействия оператора, репрессора и индуктора, описанные здесь на
примере Lac-оперона, представляют собой упрощенную модель регуляции
экспрессии генов по механизму включения/выключения. В действительности
регуляция оперона редко бывает настолько простой. Среда обитания бактерий
слишком сложная, чтобы их гены можно было контролировать одним-единственным
сигналом. Наряду с лактозой на экспрессию Lac-генов влияют и другие факторы,
например глюкоза. Для Е. coli глюкоза, расщепляемая в процессе гликолиза,
предпочтительна как источник энергии. Другие сахара тоже могут служить главным
или единственным питательным субстратом, но для их включения в гликолиз
требуются дополнительные реакции, для которых нужны специфические ферменты.
Очевидно, что экспрессия генов белков, расщепляющих такие сахара, как лактоза или
арабиноза, совершенно не оправдана при наличии достаточного количества глюкозы.
Экспрессия lac-оперона, если в среде одновременно присутствуют и глюкоза, и
лактоза. В присутствии глюкозы экспрессию генов, необходимых для катаболизма
лактозы, арабинозы и других вторичных сахаров, ограничивает регуляторный
механизм, называемый катаболитной репрессией. Влияние глюкозы опосредует с
АМР, выступающий в качестве коактиватора, и активаторный белок, называемый
сАМР-рецепторным белком (CRP, или САР – от англ. catabolite gene activator protein
– белок-активатор катаболитных генов). Белок CАP представляет собой гомодимер
(масса субъединицы Мт = 22000), содержащий участки для связывания ДНК и с
AMР. Связывание осуществляется через мотив спираль-поворот спираль в ДНКсвязывающем домене белка. В отсутствие глюкозы комплекс CАP-cAMP связывается
с ДНК вблизи 1ас-промотора и в 50 раз усиливает транскрипцию РНК.
Следовательно, комплекс CАP-cAMP – положительный регуляторный элемент,
реагирующий на концентрацию глюкозы, a Lac-peпpeccop – отрицательный
регуляторный элемент, реагирующий на лактозу. Оба элемента действуют
согласованно. Когда Lac-рeпpeccop блокирует транскрипцию, комплекс CАP-сАМР
оказывает незначительное влияние на lac-оперон, и диссоциация репрессора от Lacоператора мало изменяет транскрипцию 1ас-оперона, если не присутствует комплекс
CАP-cAMP, облегчающий транскрипцию. Без связанного CАP Lac-промотор дикого
типа является довольно слабым промотором. В отсутствие комплекса CАP-cAMP
открытый комплекс РНК-полимеразы и промотора образуется с трудом. Белок CАP
взаимодействует непосредственно с α-субъединицей РНК-полимеразы (рисунок 2).
Рисунок 1.2 – Влияние глюкозы и лактозы на экспрессию lac-оперона. А-высокий уровень
транскрипции достигается только при достаточно низкой концентрации глюкозы (когда
концентрация сАМР высокая, и комплекс CRP-cAMP связан с ДНК) и высокой концентрации
лактозы (когда Lac-peпpeccop не связан с ДНК), б-без связанного активаторного комплекса CRPcAMP транскрипция с Lac-промотора слабая, даже когда концентрация лактозы высокая, и Lacpeпpeccop не связан с ДНК.
Действие глюкозы на CАP опосредовано с АМР. Наиболее активно CАP
связывается с ДНК при высокой концентрации с AMР. В присутствии глюкозы
синтез сАМР подавляется, и стимулируется его выход из клетки. По мере снижения
концентрации с АМР ослабевает связывание CАP с ДНК, что снижает экспрессию
lac-оперона. Поэтому для сильной индукции 1ас-оперона необходимо присутствие и
лактозы (для инактивации Lac-репрессора), и глюкозы в низкой концентрации (для
повышения концентрации сАМР и усиления связывания сАМР с CАP). CАP и сАМР
участвуют в координированной регуляции многих оперонов, прежде всего тех,
которые кодируют ферменты метаболизма сахаров, таких как лактоза и арабиноза.
Несколько оперонов с общим регулятором называется регулоном. Эта структура из
сотен генов участвует в координации и изменении клеточных функций, а также
играет центральную роль в регуляции экспрессии генов, рассеянных по геному
эукариот. Приведем примеры бактериальных регулонов: система генов теплового
шока, которая реагирует на изменения температуры, и система генов, индуцируемых
в клетках Е. coli в рамках SOS-ответа на повреждения ДНК.
4. Регуляция триптофанового оперона.
Триптофановый оперон (trp) Е. coli содержит пять генов ферментов,
необходимых для превращения хоризмата в триптофан. Два из этих ферментов
катализируют более одного этапа биохимического пути. Время полужизни мРНК trpоперона составляет лишь около трех минут, поэтому клетка может быстро
реагировать на изменяющиеся потребности в этой аминокислоте. Trp-репрессор
представляет собой гомодимер, каждая субъединица которого содержит 107
аминокислотных остатков. Когда триптофана много, он связывается с Trpрепрессором и изменяет его конформацию, что позволяет репрессору связаться с trp–
оператором и блокировать экспрессию trp -оперона. Участок trp -оператора
перекрывается с промотором, поэтому связывание репрессора блокирует связывание
РНК-полимеразы.
Такая
простая
схема
опосредованного
репрессором
механизма
включения/выключения экспрессии не описывает всю систему в полной мере. При
колебании концентрации триптофана в клетке скорость синтеза ферментов этого пути
биосинтеза меняется более чем в 700 раз. Когда действие репрессора ослабевает и
начинается транскрипция, скорость транскрипции тонко регулируется с помощью
второго процесса, называемого аттенюацией транскрипции, при котором
транскрипция начинается в обычном порядке, но внезапно останавливается, не
доходя до генов оперона. Аттенюация транскрипции регулируется наличием
триптофана и основана нанепосредственной связи транскрипции и трансляции в
клетках бактерий.
Механизм аттенюации trp-оперона использует сигналы, закодированные в
четырех последовательностях внутри 162-нуклеотидного лидерного участка на 5'конце мРНК, предшествующего инициаторному кодону первого гена. Внутри
лидерного участка находится так называемый аттенюатор, состоящий из
последовательностей 3 и 4. Основания этих последовательностей спариваются с
образованием G =C -богатой шпильки (стебель и петля), сразу за которой следует
серия остатков U. Аттенюатор выступает в роли терминатора транскрипции.
Последовательность 2 также может спариваться с последовательностью 3. Тогда
аттенюатор не образуется, и гены ферментов биосинтеза триптофана нормально
транскрибируются; петля, образующаяся при спаривании последовательностей 3 и 2,
не мешает транскрипции.
Регуляторная последовательность 1 играет главную роль в механизме
чувствительности к триптофану; она определяет, спаривается ли последовательность
3 с последовательностью 2 (что позволит продолжать транскрипцию) или с
последовательностью 4 (что приведет к аттенюации транскрипции). Формирование
шпильки зависит от событий, которые происходят при трансляции регуляторной
последовательности 1; она кодирует лидерный пептид (названный так, потому что он
кодируется лидерной последовательностью мРНК), состоящий из 14 аминокислот,
среди которых два остатка триптофана. Лидерный пептид не выполняет никаких
других функций, его синтез нужен только для регуляции экспрессии оперона. Этот
пептид транслируется сразу же после транскрипции на рибосоме, которая по мере
продвижения транскрипции следует непосредственно за РНК-полимеразой (рисунок
3).
ТЕМА 2
КАТАБОЛИТНАЯ РЕПРЕССИЯ
1. Определение катаболитной репрессии.
Катаболитная репрессия (catabolite repression) (греч. katabole —разрушение;
лат. repressio — подавление) — замедление или остановка синтеза ферментов,
участвующих в катаболизме. Например, у бактерий в присутствии глюкозы
репрессируется лактозный оперон, кодирующий ферменты метаболизма лактозы.
Осуществляется это за счет снижения уровня сАМР (цАМФ) в результате активации
глюкозой фосфодиэстеразы (превращает цАМФ в АМФ) и подавления активности
аденилатциклазы (превращает АТФ в цАМФ). Клетки кишечной палочки E.coli
способны усваивать как глюкозу, так и лактозу. Возможны два случая:
1.В среде есть глюкоза и лактоза. Глюкозы вполне достаточно, чтобы снабжать
клетку энергией, поэтому в усвоении лактозы нет необходимости. Поэтому
транскрипция на lac-опероне должна быть выключена, чтобы клетка не тратила
ресурсы. Такой эффект достигается с помощью особого белка —CAP. CAP
связывается с цАМФ и образует комплекс CAP + цАМФ. Этот комплекс
присоединяется к промотору lac-оперона и помогает РНК-полимеразе начать
транскрипцию. Однако, если в клетке достаточно глюкозы, концентрация цАМФ
низкая, комплекс CAP + цАМФ не образуется и активации транскрипции не
происходит.
2.В среде есть только лактоза. Концентрация цАМФ повышается, он
связывается с CAP-белком и образует активный комплекс CAP + цАМФ. Комплекс
присоединяется к промотору и «усиливает» его. Транскрипция на lac-опероне
начинается. Синтезируемые белки усваивают лактозу.
2. Катаболитная репрессия у грамотрицательных бактерий на примере E.coli.
Концентрация цАМФ у кишечной палочки E. Coli регулируется с помощью
фосфотрансферазной системы (ФТС).
Бактериальная фосфоенолпируват:углевод фосфотрансферазная система
(фосфотрансферазная система, ФТС) - это сложная разветвленная сеть переносящих
фосфат белков, основной функцией которой является поглощение определенных
углеводов из внешней среды. Набор углеводов, поступающих в клетку посредством
ФТС, сильно варьирует у разных видов. Механизм работы ФТС заключается в
транспорте
углеводов
через
клеточную
мембрану,
сопряженном
с
фосфорилированием углевода. Наличие соответствующего углевода в среде и его
транспорт внутрь клетки ведут к значительному расходу высокоэнергетического
фосфата
и,
соответственно,
снижает
концентрацию
фосфорилированых
промежуточных переносчиков. А эти промежуточные переносчики фосфата
взаимодействуют со многими клеточными белками и изменяют их активность. Таким
образом наличие или отсутствие определенных углеводов в среде через ФТС влияет
на целый ряд важнейших процессов, таких, например, как хемотаксис, индукция
катаболитных оперонов, метаболизм азота, компетентность и вирулентность.
Вне зависимости от организма и углевода ФТС катализирует следующий
процесс:
Фосфоенолпи
+
руват
углевод
->
пируват
+ углевод-P
(внекле
(внутрик
(внутрик
(внутриклет.) т.)
лет.)
лет.)
Фосфорилирование углевода сопряжено с его транслокацией через мембрану, а
необходимая для этого энергия обеспечивается промежуточным продуктом гликолиза
- фосфоенолпируватом (ФЕП). Свободная энергия гидролиза фосфатной группы ФЕП
- около -14.7 ккал/моль (больше, чем у АТФ), а для фосфорилированного сахара около -3 ккал/моль. На первый взгляд, ФТС слишком расточительно расходует
энергию. Однако, во-первых, в процессе гликолиза из молекулы ФЕП получается
только одна молекула АТФ, а, во-вторых, ФТС обеспечивает одновременно и
транспорт, и фосфорилирование своих субстратов (фосфорилирование необходимо
для последующего катаболизма субстрата). Для углеводов, транспортируемых неФТС системами, на получение фосфорилированого субстрата внутри клетки
расходуется более одной молекулы АТФ (как правило, одна на транспорт и одна на
фосфорилирование). Это одна из причин, по которой ФТС системы существуют в
основном у облигатно и факультативно анаэробных бактерий. Такие бактерии
получают АТФ путем субстратного фосфорилирования в анаэробных условиях и,
следовательно, должны очень экономно расходовать молекулы АТФ, достающиеся
им с таким трудом.
Белки ФТС традиционно разделяются на три группы - фермент I (EI), HPr
(histidine protein) и фермент II (EII). EII обычно состоит из трех-четырех компонентов
(обозначаемых EIIA, EIIB, EIIC и EIID), которые могут быть либо субъединицами
одного белка, либо отдельными белками. Фермент I и HPr - растворимые
цитоплазматические белки размером соответственно 64-85 и 9-10 kDa, необходимые
для фосфорилирования всех ФТС сахаров данной бактерии, в связи с чем их
называют общими белками.
В случае E. Coli ФТС служит для переноса моносахаридов в клетку и их
фосфорилирования (это препятствует обратному выходу сахара из клетки, поскольку
фосфорилированные моносахариды имеют отрицательный заряд и не
«пропускаются»
клеточной
мембраной).
Если
глюкозы
много,
белок
фосфотрансферазной системы находится в дефосфорилированном состоянии (остаток
фосфорной кислоты переносится с него на глюкозу, в результате сам белок
дефосфорилирован) и ингибирует аденилатциклазу (синтезирующую цАМФ) и
галактозидпермеазу (транспортѐр лактозы в клетку). Если глюкозы много, то белок
фосфотрансферазной системы фосфорилирован и не может ингибировать эти
ферменты. Концентрация цАМФ в таком случае вырастает.
Рисунок 2.1. Схема катаболической репрессии (слева — до появления лактозы,
справа— после еѐ появления).
А) Если глюкозы в клетке мало, концентрация цАМФ высока. Молекулы
цАМФ связываются с CAP-белком, образуя комплекс CAP + цАМФ. Этот комплекс
присоединяется к промотору и «усиливает» его. Транскрипция на lac- опероне
начинается.
Б) Если глюкозы в клетке много, концентрация цАМФ низкая. Комплексов
CAP + цАМФ почти не образуется, и транскрипция на lac-опероне не идѐт, поскольку
промотор этого оперона «слабый», и сродство РНК-полимеразы к нему низкое.
Рассмотрим роль компонентов ФТС в этом явлении у группы
Грамположительных бактерий с низким ГЦ содержанием на примере B. subtilis (Рис.
5).
Рис.2.2. Катаболитная репрессия у Bacillus subtilis
Центральной молекулой, отвечающей за катаболитную репрессию у этой
бактерии является вышеупомянутый белок HPr. В отличие от энтеробактерий, HPr у
B. subtilis может быть фосфорилирован в двух положениях - His-15 ФТС ферментом I
и Ser-46 активируемой метаболитами (прежде всего, фруктозо-бис-фосфатом) АТФзависимой HPr-киназой (продуктом гена ptsK). Фосфорилирование по Ser-46 служит
исключительно регуляторным целям. Катаболитная репрессия у этих бактерий идет
двумя путями: во- первых, через репрессию катаболитных генов и оперонов белком
CcpA (catabolite control protein) и, во- вторых, за счет отсутствия индукции
катаболитных генов и оперонов, что определяется HPr путем фосфорилирования
соответствующих ферментов.
CcpA ингибирует транскрипцию катаболитных генов, связываясь с
операторным сайтом, который в данном случае называется cre (catabolite responsive
element). CcpA принадлежит к классу LacI-подобных регуляторов транскрипции.
Операторные сайты cre располагаются в регуляторных областях многих оперонов,
таких как xyl, gut (утилизация глюконата), hut (утилизация гистидина), lev (транспорт
фруктозы и деградация левана) и др. Для связывания CcpA с оператором cre
необходимо действие корепрессора, которым в данном случае является
фосфорилированый по Ser-46 HPr. Активная форма репрессора состоит из димера
CcpA и двух молекул HPr-S46-P.
Второй механизм катаболитной репрессии у грамположительных бактерий
определяется действием специфических для каждого сахара регуляторов. Примерами
таких регуляторов являются LevR, LicT и LacT, контролирующие синтез
соответственно леваназы, β-глюкозидазы и β-галактозидазы. Такие регуляторы
действуют как активаторы транскрипции или антитерминаторы (подобно BglG
у E.coli), а общим между ними является наличие регулируемого ФТС домена (PRD).
Активность этих регуляторов контролируется фосфорилированием белком HPr или
EII. В отсутствие глюкозы HPr-H15-P фосфорилирует один из аминокислотных
остатков PRD домена, что стимулирует активацию транскрипции. Фосфорилирование
HPr по Ser-46 HPr-киназой предотвращает фосфорилирование регуляторов. Таким
образом создается связь между гликолитической активностью (которую детектирует
HPr-киназа), степенью фосфорилирования HPr и активностью регуляторов,
содержащих PRD домен.
3.Катаболитная репрессии у Грамположительных бактерий на
примере Bacillus subtilis.
bgl оперон – ФТС и антитерминация.
bgl оперон E. coli (криптический) состоит из трех генов: bglG, кодирующего
позитивный регулятор (антитерминатор), bglF, кодирующего ФТС транспортер βглюкозидов и bglB, кодирующий фермент, гидролизующий β-глюкозиды. Контроль
экспрессии оперона осуществляется ри помощи двух терминаторов – в лидерной
области и между bglG и bglF. BglF фосфорилируется ФТС белками и в
присутствии β-глюкозидов сбрасывает фосфатную группу на эти сахара в процессе их
транспорта. BglF также может выступать в роли киназы, перенося свой фосфат на
BglG, и в роли фосфатазы, дефосфорилируя BglG.
Терминаторные области bgl оперона содержат по два перекрывающихся
участка, способных образовывать альтернативные шпилечные структуры.
Связывание BglG с первой шпилькой препятствует образованию второй, являющейся
терминатором. BglG активно связывается с РНК (и выполняет антитерминаторную
функцию) только в форме димера. Фосфорилирование BglG переводит его в
мономерную форму и препятствует связыванию с РНК. В присутствии β-глюкозидов
BglF фосфорилирует их и дефосфорилирует BglG; при отсутствии субстрата BglF
фосфорилирует BglG, что блокирует антитерминацию. Этот пример показывает
эффективное использование фосфорилирующей способности транспортного белка
для детекции сигнала из внешней среды и трансформации его в изменение
экспрессии генов через белковые взаимодействия.
ТЕМА 3
КАСКАДНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ
Экспрессия генов — это реализация заложенной в них информации, то есть
синтез РНК и белков. Другими словами, под экспрессией генов понимают их
активность.
1.Основные отличия экспрессии генов прокариот от эукариот
1. Почти всегда оперон эукариот содержит только один структурный ген в то время
как у вирусов и прокариот в большинстве оперонов их бывает несколько, иногда
более десятка. 2. У эукариот структурные гены, ответственные за разные звенья той
или иной цепи биохимических реакций, как правило, разбросаны по геному, а не
сосредоточены в одном опероне, как это часто имеет место у прокариот. 3. У
эукариот существует одновременное групповое подавление активности генов во всем
ядре, в целой хромосоме, или в большом ее участке. Такая групповая репрессия генов
осуществляется в значительной мере гистонами-белками, входящими в состав
эукариотических хромосом. Примером групповой регуляции активности генов — это
полное прекращение транскрипции всех генов при сперматогенезе. 4. Существует
система регуляции с помощью стероидных гормонов. Последние связываются со
специальными белками-рецепторами, расположенными в мембранах клеток-
мишеней. Синтез белков-рецепторов контролируется геном тестикулярной
феминизации Х-хромосомы. Такой комплекс обеспечивает активацию определенного
гена. 5. Транскрипция и трансляция у эукариот разобщены (у прокариот —
сопряжены). Синтез и-РНК происходит в ядре, а белков — на рибосоме.
Регуляция экспрессии генов у прокариот
У прокариот пока молекула РНК синтезируется на участке ДНК, она тут же
может транслироваться (начиная с уже синтезированного конца). Поэтому у них
регуляция экспрессии (активности) генов осуществляется почти исключительно на
уровне ДНК, так как в РНК часто невозможно внести какие-нибудь изменения до ее
трансляции.
В 1961 г. Жакобом и Моно была предложена модель оперона как системы
регуляции генов у бактерий. Оперон состоит из промотора, оператора, структурных
генов оперона (их может быть разное количество) и терминатора. В области
промотора прикрепляется фермент РНК-полимераза. В области оператора
присоединяется белок-репрессор, который кодируется отдельно отстоящим от
оперона геном-регулятором (может быть сцеплен со своим опероном, а может
находиться на расстоянии).
Если белок-репрессор соединяется с оператором, то транскрипция всех
структурных генов оперона становится невозможной, так как РНК-полимераза не
может перемещаться по цепи ДНК.
В свою очередь активность белка-репрессора может блокироваться
определенным для него низкомолекулярным соединением — индуктором (тем или
иным питательным веществом бактерий). В результате взаимодействия с индуктором
белок-репрессор видоизменяется и уже не может присоединиться к оператору своего
оперона. В этом случае гены оперона экспрессируются (т. е. на них идет синтез).
Бывает обратная ситуация, когда индуктор активирует белок-репрессор.
Таким образом, в зависимости от того, какие индукторы находятся в
цитоплазме, у прокариот экспрессируются те или иные генные группы.
Вышеописанный механизм экспрессии генов относится к негативной
регуляции, так как гены транскрибируются, если они не выключены репрессором. И
наоборот: не транскрибируются, если выключены.
Кроме негативной регуляции у бактерий существует также позитивная. В этом
случае вместо белка-репрессора действие оказывает белок-активатор. На эти белки
также действуют индукторы, активируя или инактивируя их.
Также у прокариот были выявлены опероны, которые актируются двумя
регуляторными белками, соединенными друг с другом.
σ-факторы. Каскадная регуляция экспрессии генов прокариот.
Исторически одними из первых были открыты альтернативные сигма-факторы,
участвующие в каскадной активации генов при литическом цикле развития
некоторых бактериофагов. Классический пример - бактериофаг SPO1 B. subtilis.
Литический цикл бактериофага можно разделить на три стадии. Сразу после
инфекции транскрибируются ранние гены бактериофага. Они считываются с
типичных бактериальных промоторов бактериальным холоферментом с основной
сигма-субъединицей (σ55 у B. subtilis). Очередность транскрипции средних и
поздних генов определяется тремя фаговыми генами, 28, 33 и 34. Продукт гена 28,
обозначаемый gp28, является сигма-фактором. Замещая основной сигма-фактор, он
позволяет РНК-полимеразе считывать средние гены бактериофага. Продукты
средних генов 33 и 34, gp33 и gp34, замещают gp28, снова изменяя промоторную
специфичность РНК- полимеразы, которая становится способной считывать теперь
уже только промоторы поздних фаговых генов. Таким образом, альтернативные
сигма-факторы
позволяют
бактериофагу
полностью
переключить
транскрипционный аппарат хозяйской клетки на считывание своих собственных
генов.
У E. coli важнейшим сигма-фактором является σs, продукт гена rpoS. Этот
сигма-фактор наиболее близок по своей аминокислотной последовательности к
основной сигме 70. Промоторы этих сигма- факторов тоже очень похожи, но,
несмотря на это, специфичны каждый для своего сигма-фактора in vivo. Буква S в
названии σ s происходит от стационарной фазы роста, на протяжении которой этот
фактор был впервые обнаружен. Затем присутствие этого сигма-фактора было
обнаружено в других стрессовых условиях, и сейчас считается, что присутствие σs
является свидетельством так называемого «общего стрессового ответа». Этот ответ
наблюдается, когда клетка сталкивается с рядом стрессовых ситуаций, видимым
признаком чего является снижение скорости роста вплоть до вхождения в
стационарную фазу. Голодание, повышение осмолярности среды (Осмомолярностьсумма концентраций катионов, анионов и неэлектролитов в одном литре раствора.
Выражается в миллиосмолях на литр) или понижение pH, неоптимальная
температура – эти и другие стрессовые воздействия могут индуцировать общий
стрессовый ответ. Физиологические последствия общего стрессового ответа
включают устойчивость к многим стрессовым воздействиям, накопление запасных
питательных веществ, изменения структуры клеточной стенки (увеличение частоты
кросс-сшивок в пептидогликане) и изменение морфологии клетки (уменьшение
общего размера и укорачивание клеток – они становятся почти сферическими).
Во время логарифмической фазы роста в лабораторных условиях клетки E. coli
практически не содержат σs, и потому мутанты по rpoS не имеют видимых
дефектов. В этих условиях большинство молекул РНК-полимеразы экспрессируют
гомеостатические гены и имеют в своем составе главный сигма-фактор σ70 (продукт
гена rpoD). Эта ситуация меняется, как только клетки подвергаются какому- либо
стрессу, то есть попадают в условия, не оптимальные для роста. В этих условиях σs
индуцируется до уровня 30% от количества σ70, что приводит к появлению
достаточного количества РНК полимеразы в комплексе с σs и индукции большого
числа (не менее 100) σs-зависимых промоторов. Активируемые гены жизненно
необходимы для выживания в стрессовых условиях, например, в стационарной фазе.
При адаптации к стрессовой ситуации σs действует как быстро индуцируемый
координатор стрессового ответа, а также как основной регулятор долговременной
адаптации со сложными физиологическими последствиями. Первая функция σs
очевидна при быстрой, но краткосрочной индукции σ s при переходе клетки с
утилизации глюкозы на лактозу. Как вы помните, при выращивании бактерии на
смеси двух углеводов наблюдается феномен диауксии – фаза логарифмического
роста, во время которой бактерии используют предпочтительный углевод, затем
плато, когда происходит перестройка метаболизма и второй этап логарифмического
роста. Прежде чем клетка начнет утилизацию лактозы, ФТС глюкозы должна
полностью освободиться от субстрата, должен накопиться цАМФ, что и приведет к
индукции lac-оперона. Как раз накопление цАМФ и зависит от σs –
кратковременное появление этого σ -фактора и активация σs-зависимых генов
предшествуют накоплению цАМФ и необходимы для этого.
Количество активной σ s субъединицы контролируется на уровне транскрипции,
трансляции и путем протеолиза. Различные стрессовые условия по-разному влияют
на эти уровни регуляции. Даже в условиях быстрого роста, когда белок σ s не
детектируется, присутствует достаточно много мРНК rpoS. Формирование
вторичной структуры этой мРНК препятствует ее трансляции. Для активации
трансляции этой мРНК необходимо действие небольшого РНК-связывающего белка
Hfq (HF-I). Кроме того, транскрипция rpoS в стрессовых условиях также возрастает.
Такой механизм регуляции уровня σ s используется в тех стрессовых условиях,
которые требуют длительной адаптации. В тех же случаях, когда требуется быстрое
реагирование на внезапные изменения условий, такие как внезапное голодание,
сдвиг pH, повышение температуры и осмолярности среды, увеличение количества
s
s
σ происходит за счет предотвращения ее протеолиза. Протеолиз σ происходит за
счет протеазы ClpXP при помощи регуляторного белка RssB. Нестабильность σ s
определяется короткой последовательностью аминокислотных остатков, которая
отсутствует у σ70. RssB узнает эту последовательность и выступает в роли
субстрат-узнающего фактора для ClpXP протеазы. Сродство RssB к σs изменяется в
зависимости от его фосфорилирования/дефосфорилирования, которое каким-то
образом связано со стрессовыми условиями.
Каковы же гены-мишени, активируемые σs? Их более сотни, и все они в той или
иной степени выполняют функцию адаптации к стрессовым условиям. В качестве
примеров можно привести активацию генов клеточного деления ftsQAZ и
активацию системы защиты от активного кислорода. В последнюю входят каталазы
KatE, KatG и протекторный белок Dps, непосредственно защищающий ДНК от
перекиси водорода.
В клетках, находящихся в стрессовых условиях, две формы РНК полимеразы, E
s
70
σ и Eσ , сосуществуют и обеспечивают экспрессию различных генов. Тем не
менее, промоторные последовательности генов, контролируемых Eσs , очень
сходны с таковыми зависящих от Eσ70 – вплоть до того, что в экспериментах in vitro
оба холофермента достаточно хорошо транскрибируют оба типа промоторов. (Хотя
Eσs все же менее требователен к –35 последовательности)
Как же тогда обеспечивается специфичность σs-зависимых промоторов?
Экспрессия многих генов регулона модулируется глобальными регуляторами H-NS,
Lrp, cAMP-CRP, IHF и Fis. Часть из этих факторов является распространенными
гистоноподобными белками с не очень ясными функциями. Зачастую несколько
белковых факторов одновременно контролируют транскрипцию с σ s-зависимых
промоторов. Также часто встречается ситуация, когда один и тот же ген
транскрибируется с двух промоторов, зависящих от разных факторов. В таких
случаях транскрипция с σs–зависимого промотора зачастую зависит от
дополнительного белкового регулятора, тогда как транскрипция с σ70 промотора
конститутивна.
Выше были изложены функции и принцип активации σs, сигма-фактора,
наиболее близкого к основному сигма-фактору σ70. Другие сигма-факторы менее
сходны с σ70 по своей последовательности и опознают промоторы, не имеющие
ничего общего со "стандартным" промотором σ70.
Рассмотрим принцип действия другого сигма-фактора E. coli, σE. Этот белок
принадлежит к большому семейству ECF (extraсytoplasmic factors) сигма-факторов.
Свое название эти сигма-факторы получили в связи с их участием в регуляции
экспрессии внецитоплазменных белков (периплазматических, внешней мембраны и
секретируемых во внешнюю среду). Основная функция σE - обеспечивать синтез
белков, ответственных за нормальный фолдинг (сворачивание) белков внешней
мембраны, но, кроме того, σE усиливает транскрипцию генов теплового шока
(путем активации еще oдного сигма-фактора, σ32), а у патогенных бактерий
родственные сигма-факторы активируют гены вирулентности.
σE реагирует на белки внешней мембраны и периплазматические белки,
утратившие нормальную конформацию. Но поскольку сигма-фактор, естественно,
является цитоплазматическим, а сигнал для его активации находится в периплазме,
должен быть какой-то переносчик сигнала между двумя клеточными
компартментами. Эту функцию выполняет мембранный белок RseA. В отсутствие
сигнала σE инактивирован путем связывания с RseA. Эта инактивация усиливается
за счет взаимодействия RseA с периплазматическим белком RseB. При нарушениях
внешней мембраны, предотвращающих нормальный фолдинг ее белков, RseB
связывается с неправильно свернутыми белками, освобождая RseA. Это ведет к
ослабеванию связи RseA с σE, а дополнительное взаимодействие неправильно
свернутых белков с RseA окончательно освобождает σE, который связывается с
РНК-полимеразой и активирует транскрипцию ряда генов В число этих генов
входят:
fkpA, кодирующий периплазматический шаперон (необходимый для
нормального фолдинга периплазматических белков и белков внешней мембраны);
degP - периплазматическая протеаза, деградирующая ненормальные или
неправильно свернутые белки;
rpoH - сигма-фактор, активирующий транскрипцию генов теплового шока;
собственный оперон rpoE rseABC;
гены вирулентности у ряда бактерий.
Поскольку σE активирует транскрипцию своего собственного оперона,
первоначальная индукция по механизму положительной обратной связи резко
усиливается за счет дополнительного синтеза σE. А поскольку одновременно с
σE происходит
сверхпродукция негативных регуляторов RseA и RseB,
вся система быстро выключается, как только периплазма оказывается
очищенной от неправильно свернутых белков.
У ряда бактерий система σE была адаптирована для контроля генов
вирулентности. Так, у P. aeruginosa гомолог σE (AlgU) регулирует экспрессию
генов alg, кодирующих синтез мукоидной капсулы, необходимой
для
установления хронических инфекций. Так же, как и у E. coli, до поступления
сигнала сигма-фактор инактивирован взаимодействием с другим белком, MucA.
Сигнал для активации AlgU скорее всего продуцируется на начальных этапах
инфекции, например, в виде повышенной температуры, мешающей
нормальному фолдингу белков оболочки.
OM-outer membrane (наружная мембрана), IM-inner membrane (внутренняя
мембрана)
Рис.3.1 Контроль регулона RpoE
Белки RseA и MucA принадлежат к классу регуляторов, известных как антисигма факторы. Принцип работы этих белков прост - связываясь с сигма-факторами,
они препятствуют их взаимодействию с РНК-полимеразой. Кроме σE регулона, анти-
сигма факторы участвуют в контроле регулонов, активируемых σ28 (биосинтез
жгутиков) и σF (ранние стадии споруляции B. subtilis).
Наиболее интересный пример действия анти-сигма факторов представляет
регуляция процесса биогенеза жгутиков, хорошо изученная у Salmonella typhimutium.
Синтез поздних жгутиковых генов (кодирующих флагеллин и хемотаксические
функции) зависит от альтернативного сигма фактора σ28. Во время ранних стадий
синтеза жгутиков σ28 находится в инактивированном состоянии за счет
взаимодействия с анти-сигма фактором FlgM. Как только базальное тело и крюк
оказываются собранными, FlgM секретируется через жгутик, высвобождая активный
σ28. Высвобождение σ28 приводит к началу транскрипции поздних жгутиковых
генов, одним из продуктов которых является флагеллин - белок, из субъединиц
которого собрана нить жгутика. А поскольку субъединицы флагеллина
экспортируются через тот же канал, что и FlgM, создается препятствие для выхода
FlgM из клетки, из-за чего его уровень внутри клетки снова возрастает.
3.Регуляция генов у эукариот
В связи с особенностями организации отдельных генов эукариот и генома в целом,
регуляция генной активности у них характеризуется некоторыми отличиями по
сравнению с прокариотами. У эукариот не установлено оперонной организации
генов. Гены, определяющие синтез ферментов одной цепи биохимических реакций,
могут быть рассеяны в геноме и, очевидно, не имеют, как у прокариот, единой
регулирующей системы (ген-регулятор, оператор, промотор). В связи с этим
синтезируемые мРНК у эукариот моноцистронны, то есть являются матрицами для
отдельных пептидных цепей.
Для большинства эукариотических клеток, как и клеток прокариот, стадия инициации
транскрипции является основной, главной регуляторной точкой экспрессии
активности генов.
Тем не менее имеются существенные различия: во-первых, место процессов
транскрипции (в ядре) и трансляции (в цитоплазме); во-вторых, активирование
транскрипции у эукариот связано с множеством сложных из-менений структуры
хроматина в транскрибируемой области; в-третьих, в эукариотических клетках
превалируют положительные регуляторные ме-ханизмы над отрицательными.
Положительная или отрицательная регуляция определяется типом белков,
вовлеченных в механизм регуляции.
В многоклеточных организмах среднее число регуляторных сайтов для одного гена
минимум равно пяти; положительные регуляторные белки связываются со своими
специфическими последовательностями в структуре ДНК. Следует указать еще на
один момент, почему эукариотическая клетка использует положительные механизмы
регуляции экспрессии генов. Подсчи-тано, что в геноме человека содержится около
32 тыс. генов, соответственно каждая клетка при отрицательном механизме
регуляции могла бы синтезиро-вать 32 тыс. разных репрессоров, причем в
достаточных количествах. При положительном механизме регуляции большинство
генов в принципе неактивно, соответственно молекула РНК-полимеразы не
связывается с промотором и клетка синтезирует ограниченный и избирательный круг
активаторных белков, необходимых для инициации транскрипции.
У эукариот выделены и охарактеризованы также пять регуляторных белков,
получивших название транскрипционных факторов (TF: IIА, IIВ, IID, IIЕ и IIF). Они
необходимы для узнавания участка (сайта) ДНК, названного TATA (concensus
последовательности,
ТАТАААА).
Установлено,
что
функционирование
эукариотических генов подчиняется регуляторным воздействиям, однако регуляция
транскрипции у эукариот является комбинационной, то есть активность каждого гена
регулируется большим спектром генов-регуляторов.
У многих эукариотических генов, кодирующих белки и транскибируемых РНКполимеразой II, в ДНК имеется несколько областей, которые узнаются разными
белками-регуляторами. Одной из них является область, распо-ложенная вблизи
промотора. Она включает около 100 пар нуклеотидов, в том числе ТАТА-блок,
располагающийся на расстоянии 25 пар нуклеотидов от точки начала транскрипции.
Установлено, что для успешного присоединения РНК-полимеразы II к промотору
необходимо предварительное соединение с ТАТА-блоком особого белка — фактора
транскрипции — с образованием стабильного транскрипционного комплекса.
Именно этот комплекс ДНК с белком узнается РНК-полимеразой II.
Последовательности нуклеотидов, примыкающие к ТАТА-блоку, формируют
требуемый для транскрипции элемент, расположенный перед промотором. Другая
область, играющая важную роль в регуляции активности эукариотических генов,
располагается на большом расстоянии от промотора (до нескольких тысяч пар
нуклеотидов) и называется энхансером (от англ. enhance — усиливать). И энхансер, и
препромоторный элемент эукариотических генов содержат серию коротких
нуклеотидных последовательностей, которые связываются с соответствующими
регуляторными белками. В результате взаимодействия этих белков происходит
включение или выключение генов. Особенностью регуляции экспрессии
эукариотических генов является также существование белков-регуляторов, которые
способны контролировать транскрипцию многих генов, кодирующих, возможно,
другие белки-регуляторы. В связи с этим некоторые (главные) белки-регуляторы
обладают координирующим влиянием на активность многих генов и их действие
характеризуется плейотропным эффектом. Примером может служить существование
белка, который активирует транскрипцию нескольких специальных генов,
определяющих дифференцировку предшественников жировых клеток. Ввиду того,
что в геноме эукариот имеется много избыточной ДНК, а в каждой клетке организма
транскрибируется всего 7–10 % генов, логично предположение о том, что у них
преобладает позитивный генетический контроль, при котором активация небольшой
части генома оказывается более экономичной, чем репрессия основной массы генов.
Особенностью регуляции транскрипции у эукариот является подчиненность этих
процессов регулирующим влияниям со стороны гормонов организма. Последние
часто играют роль индукторов транскрипции. Так, некоторые стероидные гормоны
обратимо связываются особыми белками-рецепторами, образуя с ними комплексы.
Активированный гормон рецептор приобретает способность соединяться со
специфическими участками хроматина, ответственных за регуляцию активности
генов, в которых рецепторы узнают определенные последовательности ДНК.
Регуляция активности генов эукариот гораздо сложнее и менее изучена. Вопервых у них имеется обособленное ядро и сложно устроенные хромосомы. И,
следовательно, транскрипция и трансляция оказались разделены во времени и
пространстве. Во-вторых эукариоты (почти все) многоклеточные организмы с
чѐткой специализацией тканей и органов.
Структурные гены эукариот подразделяются на:
1. гены «домашнего хозяйства». Функционируют во всех клетках организма
на всех стадиях (гены кодирующие белки-гистоны, рРНК, тРНК, ДНК
полимеразу).
2. «гены роскоши». Функционируют в клетках одной ткани или
специфичные для одного типа клеток (гены гемоглобина).
Регуляция действия генов может происходить на любом этапе синтеза белка.
ДНК → РНК → белок. Причем механизм регуляции действия генов у эукариот
более гибкий. У прокариот по принципу «всѐ или ничего», а у эукариот от
полной экспрессии до полной репрессии. Это достигается за счѐт локальной
модификации ДНК, изменения внутриклеточных условий.
ТЕМА 4
МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ШАПЕРОНЫ И АТФ-ЗАВИСИМЫЕ ПРОТЕАЗЫ
1.Структура и функциональная роль шаперонов в фолдинге белков
В процессе синтеза полипептидных цепей, транспорта их через мембраны, при сборке
олигомерных белков возникают промежуточные нестабильные конформации,
склонные к агрегации. На вновь синтезированном полипептиде имеется множество
гидрофобных радикалов, которые в трѐхмерной структуре спрятаны внутри
молекулы.
Поэтому
на
время
формирования
нативной
конформации
реакционноспособные аминокислотные остатки одних белков должны быть отделены
от таких же групп других белков.
Во всех известных организмах, от прокариотов до высших эукариотов,
обнаружены белки, способные связываться с белками, находящимися в
неустойчивом, склонном к агрегации состоянии. Они способны стабилизировать их
конформацию, обеспечивая фолдинг белков. Эти белки получили название
шаперонов.
Классификация шаперонов (Ш)
В соответствии с молекулярной массой все шапероны можно разделить на 6
основных групп:
 высокомолекулярные, с молекулярной массой от 100 до 110 кДа;
 Ш-90 – с молекулярной массой от 83 до 90 кДа;
 Ш-70 – с молекулярной массой от 66 до 78 кДа;
 Ш-60;
 Ш-40;
 низкомолекулярные шапероны с молекулярной массой от 15 до 30 кДа.
Среди шаперонов различают: конститутивные белки (высокий базальный синтез
которых не зависит от стрессовых воздействий на клетки организма), и
индуцибельные, синтез которых в нормальных условиях идѐт слабо, но при
стрессовых воздействиях на клетку резко увеличивается. Индуцибельные шапероны
относятся к «белкам теплового шока», быстрый синтез которых отмечают
практически во всех клетках, которые подвергаются любым стрессовым
воздействиям. Название «белки 25 теплового шока» возникло в результате того, что
впервые эти белки были обнаружены в клетках, которые подвергались воздействию
высокой температуры.
2.Роль шаперонов в фолдинге белков.
При синтезе белков N-концевая область полипептида синтезируется раньше, чем
С-концевая область. Для формирования конформации белка нужна его полная
аминокислотная последовательность. Поэтому в период синтеза белка на рибосоме
защиту реакционно-способных радикалов (особенно гидрофобных) осуществляют Ш70.
Ш-70 – высококонсервативный класс белков, который присутствует во всех
отделах клетки: цитоплазме, ядре, митохондриях.
Фолдинг многих высокомолекулярных белков, имеющих сложную
конформацию (например, доменное строение), осуществляется в специальном
пространстве, сформированном Ш-60. Ш-60 функционируют в виде олигомерного
комплекса, состоящего из 14 субъединиц.
Шапероновый комплекс имеет высокое сродство к белкам, на поверхности
которых есть элементы, характерные для несвѐрнутых молекул (прежде всего
участки, обогащѐнные гидрофобными радикалами). Попадая в полость шаперонового
комплекса, белок связывается с гидрофобными радикалами апикальных участков Ш60. В специфической среде этой полости, в изоляции от других молекул клетки
происходит выбор возможных конформаций белка, пока не будет найдена
единственная, энергетически наиболее выгодная конформация.
Высвобождение белка со сформированной нативной конформацией
сопровождается гидролизом АТФ в экваториальном домене. Если белок не приобрѐл
нативной конформации, то он вступает в повторную связь с шапероновым
комплексом. Такой шаперонзависимый фолдинг белков требует затрат большего
количества энергии.
Таким образом, синтез и фолдинг белков протекает при участии разных групп
шаперонов, препятствующих нежелательным взаимодействиям белков с другими
молекулами клетки и сопровождающих их до окончательного формирования
нативной структуры.
3. Роль шаперонов в защите белков клеток от денатурирующих стрессовых
воздействий.
Шапероны, участвующие в защите клеточных белков от денатурирующих
воздействий, как уже говорилось выше, относят к белкам теплового шока (БТШ) и в
литературе часто обозначают как HSP (англ. heat shock protein).
При действии различных стрессовых факторов (высокая температура, гипоксия,
инфекция, УФО, изменение рН среды, изменение молярности среды, действие
токсичных химических веществ, тяжѐлых металлов и т. д.) в клетках усиливается
синтез БТШ. Имея высокое сродство к гидрофобным участкам частично
денатурированных белков, они могут препятствовать их полной денатурации и
восстанавливать нативную конформацию белков.
Установлено, что кратковременные стрессовые воздействия увеличивают
выработку БТШ и повышают устойчивость организма к длительным стрессовым
воздействиям. Так, кратковременная ишемия сердечной мышцы в период бега при
умеренных тренировках значительно повышает устойчивость миокарда к длительной
ишемии. В настоящее время перспективными исследованиями в медицине считают
поиски фармакологических и молекулярно-биологических способов активации
синтеза БТШ в клетках.
4. Болезни, связанные с нарушением фолдинга белков
Расчѐты показали, что лишь небольшая часть теоретически возможных
вариантов полипептидных цепей может принимать одну стабильную
пространственную структуру. Большинство же таких белков может принимать
множество конформаций с примерно одинаковой энергией Гиббса, но с различными
свойствами. Первичная структура большинства известных белков, отобранных
эволюцией, обеспечивает исключительную стабильность одной конформации.
Однако некоторые растворимые в воде белки при изменении условий могут
приобретать конформацию плохо растворимых, способных к агрегации молекул,
образующих в клетках фибриллярные отложения, именуемые амилоидом (от лат.
аmylum – крахмал). Так же, как и крахмал, амилоидные отложения выявляют при
окраске ткани йодом. Это может происходить:
 при гиперпродукции некоторых белков, в результате чего увеличивается их
концентрация в клетке;
 при попадании в клетки или образовании в них белков, способных влиять на
конформацию других молекул белка;
 при активации протеолиза нормальных белков организма, с образованием
нерастворимых, склонных к агрегации фрагментов;
 в результате точечных мутаций в структуре белка.
В результате отложения амилоида в органах и тканях нарушаются структура и
функции клеток, наблюдаются их дегенеративные изменения и разрастание
соединительнотканных клеток. Развиваются болезни, называемые амилоидозами. Для
каждого вида амилоидоза характерен определѐнный тип амилоида. В настоящее
время описано более 15 таких болезней.
5. АТФ-зависимые протеазы
За распознавание субстрата у прокариот отвечают протеазы, поэтому их в клетке
несколько. АТФ-зависимые протеазы-крупные олигомерные комплексы. Протеазные
сайты располагаются во внутренней камере олигомера. Поступление субстрата в
такую полость обеспечивается АТФазными доменами (субъединицами). Поскольку
распознавание субстратов осуществляется регуляторными АТФазами, свойства
субстратов, приводящие к их деградации, не зависят от свойств, необходимых для
разрезания пептидных связей. Как только белок распознается и связывается
регуляторным АТФазным доменом, начинается последовательная деградация
полипептидной цепи с разрезами через каждые 5-10 аминокислот. У E.coli 4 АТФзависимые протеазы.
ClpAP ClpXP. У этих протеаз АТФазная и протеазная активность принадлежат
разным субъединицам, эти субъединицы способны действовать самостоятельно. ClpA
и ClpX могут действовать как шапероны. Гены clpX и clpP составляют оперон, clpA
расположен отдельно в моноцистронном опероне. Оба оперона имеют типичные
промоторы теплового шока.
HflB(FtsH). Zn и АТФ-зависимая протеаза, участвующая в деградации
цитоплазматических и мембранных белков, включая RpoH, SecY (часть аппарата
секреции). Единственная АТФ-зависимая протеаза, существенная для жизни E. coli. В
опероне с RpoH-зависимым промотором.
Lon. Деградирует белок N фага λ, ингибитор клеточного деления SulA,
позитивный регулятор биосинтеза капсулы RcsA и др. Кроме специфических
мишеней, Lon деградирует большинство аномальных белков E. coli. Белок –
гомотетрамер, имеет сайты связывания с АТФ и ДНК, причем связывание с ДНК
стимулирует протеазную активность. Транскрибируется с промотора теплового шока.
В белке можно выделить два домена – собственно протеазный с карбоксильного
конца с сериновым остатком в активном сайтеи следующий за ним АТФазный. Эти
два домена могут быть экспрессированы как отдельные полипептиды, смесь которых
функционально соответствует интактной протеазе Lon.
Регуляция синтеза белков теплового шока.
Шапероны и клеточные протеазы входят в состав регулона σ32 вместе с другими
белками теплового шока. Кроме того, в состав уже рассмотренного регулона σЕ
входят периплазматическая протеаза и шаперон. Было установлено, что эти два
регулона взаимосвязаны т.к. комплекс кора РНК-полимеразы с σЕ активирует
транскрипцию гена гроН, кодирующего σ32 , при экстремальных температурах (напр,
50°С). Многие протеобактерии имеют гомологи RроН, и у них механизмы регуляции
теплового шока являются схожими, тогда как грамположительные бактерии
выработали другие, причем достаточно разнообразные, регуляторные стратегии для
конкретных генов теплового шока.
У клеток Е. coli, перемещенных с 30° на 42°, уровень внутриклеточного σ32 резко
(хотя и ненадолго) возрастает, усиливая транскрипцию с промоторов теплового шока.
Возрастание концентрации σ32 является результатом стабилизации обычно
весьма нестабильного σ32 и активации трансляции уже существующей мРНК RроН.
Поскольку быстрая деградация σ32 зависит от шаперонного комплекса DnаК-DnaJGrрЕ, стабилизация происходит из-за того, что шаперон загружается огромным
количеством индуцированных стрессом неправильных белков и его уже не хватает
для обработки σ32. В фазе адаптации, следующей за фазой индукции, синтез НSР 9
(Heat Shock Protein) снижается негативной обратной связью на нескольких уровнях
экспрессии (трансляционная репрессия, дестабилизация и, возможно, инактивация
σ32). Количество шаперона DnаК-DnaJ в клетке невелико, поэтому он является весьма
чувствительным средством мониторинга стрессов. В деградации σ32 наибольшую
роль играет, вероятно, связанная с мембраной АТФ-зависимая протеаза HflB (FtsH).
Несколько цитоплазматических протеаз (НslVU, Lon) в норме отвечающих за
деградацию аномальных белков, также способны деградировать σ32. Таким образом
внутриклеточные протеазы вместе с шапероном DnаК-DnaJ способны регулировать
тепловой шок, контролируя внутриклеточную концентрацию аномальных белков.
Шапероны, конечно, не деградируют σ32непосредственно. Вступая в ассоциацию с
РНК-полимеразой, σ32стабилизируется и становится нечувствительной к протеолизу.
Роль шаперонов заключается в предотвращении связывания а с РНК-полимеразой,
что позволяет протеазам ее деградировать.
Индукция трансляции σ32происходит независимо не только от шаперонов, но и
вообще от каких бы то ни было регуляторных белков. 5' область мРНК RроН имеет
уникальную вторичную структуру, закрывающую рибосомсвязывающий сайт. Эта
структура стабильна при нормальной температуре, но денатурирует при ее
повышении, что освобождает последовательность Шайна-Далгарно и позволяет
инициировать трансляцию.
Транскрипция гроН может инициироваться с четырех промоторов, один из
которых зависит от σЕ, и регулируется белком DnаА и комплексом сАМР-СRР. Когда
клетки Е. coli подвергаются воздействию очень высоких температур, синтез почти
всех белков в клетке прекращается. Исключения составляют лишь несколько белков,
включая членов регулона σЕ (σ32 - один из таких белков). Другими членами этого
регулона являются периплазматические протеаза DegР (НtrА) шаперон (пептидил-
пролил цис- транс изомераза) FкрА, которые способствуют соответственно
деградации и фолдингу поврежденных белков в периплазме. Как уже говорилось
выше, активность σЕ контролируется парой белков, RsеА и RsеB. Белок
цитоплазматической мембраны RsеА является анти-сигма фактором и репрессирует
σЕ регулон, связываясь с σЕ и предотвращая его взаимодействие с промоторами.
Периплазматический белок RsеB взаимодействует с RsеА и способствует
инактивации σЕ. Когда же в периплазме накапливаются аномальные белки, RsеB с
ними взаимодействует, освобождая RseА, что ведет к ослаблению связи последнего с
σЕ . Кроме того, важным результатом повышения температуры является изменение
свойств мембраны - она становится более лабильной (становится "жиже"), что также
способствует изменению конформации RseА, ослабляющему взаимодействие с σЕ.
Регуляция теплового шока у грамположительных бактерий.
Регуляторные стратегии у этих бактерий существенно отличаются от таковых Е.
coli, хотя некоторые принципы остаются. У В. subtilis гены теплового шока могут
быть разделены по крайней мере на три класса.
Гены первого класса (регулон СIRСЕ/НrсА) кодируют синтез основных
шаперонов DnaKJ-GrpE и GroЕL-GroES, и их экспрессия негативно контролируется
репрессором НrсА, первым геном оперона DnaK. Действие этого репрессора
осуществляется через связывание с оператором - инвертированным повтором СIRСЕ.
Контроль этого регулона осуществляется при участии шаперонов, но, в отличии от
контролируемой шапероном DnaKJ-GrpE деградации σ32 у Е. coli, здесь регуляторную
функцию выполняет GroЕL-GroES. Этот шаперон необходим для фолдинга НrсА, а
титрование шаперона образующимися в стрессовых условиях аномальными белками
приводит к снижению активности НrсА.
ТЕМА 5
СЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ
Для бактерий (как, впрочем, и для любого другого организма) способность
координировать экспрессию генов с изменениями условий окружающей среды дает
существенное селективное преимущество. Адаптация бактерий к изменяющимся
условиям среды контролируется белковыми системами передачи сигнала. Такие
системы состоят из белковых модулей-доменов, собранных в несколько молекул,
количество которых варьирует в зависимости от вида бактерии и конкретного
фактора среды. Основными компонентами сенсорных систем являются:
сенсоры (трансмембранные
изменения окружающих условий;
или
цитоплазматические),
детектирующие
внутриклеточные посредники, получающие информацию от сенсоров и
передающие ее на эффекторы;
эффекторы - непосредственные регуляторы физиологического ответа (как
правило, на уровне транскрипции).
Трансмембранные рецепторы.
Что и как детектируется?
Механизм детекции сигнала не совсем ясен.
Детектируемый сигнал может быть как вне-, так и внутриклеточным. В
некоторых случаях показано, что сигнал детектируется периплазматическим
доменом. Так, PhoQ - регулятор экспрессии факторов вирулентности у Salmonella
typhimurium, - является сенсором дивалентных катионов, которые, связываясь
непосредственно с периплазматическим доменом, стабилизируют
неактивную
конформацию PhoQ.
Сигнал может быть внутриклеточным. Рецептор Aer, участвующий в регуляции
аэротаксиса, детектирует внутриклеточный запас энергии, связываясь с FAD. Еще
один пример – детекция внутриклеточной концентрации глутамина при регуляции
азотного метаболизма.
В ряде случаев показано, что сенсором является трансмембранный домен. Так,
Cpx-путь активирован у мутантов E. coli, лишенных фосфатидилэтаноламина - таким
образом, простое нарушение мембранной структуры приводит к активации этого
сигнального пути. У белка EnvZ E. coli - гистидинкиназы, участвующей в
осморегуляции, периплазматический домен может быть делетирован без потери
сенсорной функции.
Механизм передачи сигнала.
Многие бактериальные рецепторы имеют периплазматический домен-детектор
(P) и цитоплазматический сигнальный домен (C), заякоренные в мембране двумя аспиральными трансмембранными сегментами. Линейная структура таких белков
может быть представлена как TM1– P–TM2–L–C, где L - цитоплазматический линкер
Сигнальный домен либо сам является гистидинкиназой (EnvZ) либо с
гистидинкиназой взаимодействует (MCP рецепторы хемотаксиса).
Механизм передачи сигнала с сенсорного на сигнальный домен неясен.
Рецепторы обычно являются мембранными белками, гомодимерами. Предполагалось,
что конформационные изменения, возникающие при связывании субстрата,
передаются через мембрану на цитоплазматические домены рецептора, что влияет на
взаимодействие сигнальных доменов между собой. Однако делеция одного из двух
сигнальных доменов (равно как и удаление всех трансмембранных сегментов) у
димера не лишает его активности.
Двухкомпонентные системы
В конце 80-х слово "двухкомпонентные" было использовано для обозначения
нового класса регуляторных систем, найденных у бактерий. На сегодняшний день
описаны сотни таких систем у бактерий, архей и некоторых эукариот.
Двухкомпонентные системы выступают в качестве основного механизма сопряжения
реакции со стимулом, позволяющего организмам реагировать на многие изменения
условий окружающей среды. Эти сигнальные системы достаточно сложны и
характеризуются модульной организацией, хорошо адаптированной ко многим
клеточным сигнальным путям и интегрированной с ними. Типичная
двухкомпонентная система состоит
из двух
белков
–
гистидиновой протеинкиназы (ГК), содержащей консервативный киназный домен и
регулятора ответа
(РО), содержащего консервативный регуляторный домен.
Внеклеточные сигналы детектируются ГК, что приводит к изменению ее
активности. Затем ГК передает фосфогруппу на РО (реакцию катализирует сам РО).
Перенос фосфата на РО приводит к активации эффекторного домена этого белка, что
и вызывает в конечном итоге специфический физиологический ответ.
В
основе
работы двухкомпонентной системы лежат три реакции,
дающие два фосфорилированных продукта:
Автофосфорилирование ГК:
ГК-
-His~Ф + АДФ
Перенос фосфата:
ГК-His~Ф + РО-
-His + РО-Asp~Ф
Дефосфорилирование:
РО-
-Asp + PI
γ-фосфат из АТФ сначала переносится на боковую цепь консервативного
гистидинового остатка ГК (1). Затем РО катализирует перенос фосфата от
фосфогистидина на аспартатный остаток своего регуляторного домена (2). Наконец,
фосфат переносится от фосфоаспартата к воде в реакции гидролиза (3).
Хоть ГК и похожи по своей основной функции (фосфорилирование белков) на
"классические" Ser/Thr/Tyr киназы, химизм реакции принципиально отличается – ГК
образует не фосфоэфирную, а фосфоамидную связь. Реакция гидролиза
фосфоамидной связи имеет гораздо большее отрицательное значение ЛG по
сравнению с гидролизом фосфоэфирной связи, поэтому равновесие р-и (1) сдвинуто в
сторону нефосфорилированного белка ГК. Следовательно, только очень небольшой
процент ГК существует в фосфорилированном виде => не фосфорилирование ГК как
таковое, а перенос фосфата является основным в работе этого фермента. Богатая
энергией связь N~P идеально подходит для передачи фосфата. Именно поэтому такая
же связь используется хорошо знакомыми вам ферментами I и II ФТС, основной
функцией которых является также не фосфорилирование как таковое, а передача
фосфата "по цепочке" в направлении его конечного акцептора – фосфорилируемого
сахара.
В молекуле РО фосфорилируется остаток аспартата. Предположительно, именно
этот остаток используется, т.к. фосфорилирование его длинной ацильной цепи
вызывает протяженные конформационные изменения в молекуле РО, необходимые
для изменения эффекторной активности. Еще одним важным свойством
фасфоаспартата является быстрый гидролиз ацилфосфата как в кислой, так и в
щелочной среде. К тому же, многие РО имеют автофосфатазную активность, еще
более уменьшающую время полужизни фосфоаспартата.
Таким образом, основным результатом выбора для фосфорилирования
специфических остатков в молекулах ГК и РО является высокая мобильность
системы. При отсутствии стимула оба компонента будут дефосфорилированы.
Детекция стимула гистидинкиназой вызовет ее фосфорилирование и очень быструю
передачу фосфата молекуле регулятора ответа, что приведет к быстрому ответу
бактерии на изменившиеся условия. В свою очередь, легкость дефосфорилирования
молекулы РО приведет к быстрому возвращению всей регуляторной системы, а
вместе
с
ней
и
метаболизма
бактериальной
клетки,
в
исходное
(нефосфорилированное) состояние при исчезновении стимула, вызвавшего
первоначальное фосфорилирование ГК.
Распространенность двухкомпонентных систем
Двухкомпонентные сигнальные системы с участием фосфорилируемых остатков
гистидина и аспартата наиболее часто встречаются у бактерий. Несмотря на
обнаружение таких систем у эукариот, здесь в сигнальных цепях доминируют
сигнальные каскады с переносом фосфата между остатками серина, треонина и
тирозина. С друкой стороны, Ser/Thr/Tyr киназы у прокариот тоже имеются. Пока нет
удовлетворительного объяснения предпочтительному использованию той или иной
системы у про- и эукариот. Количество генов, кодирующих белки двухкомпонентных
систем, значительно варьирует в геномах различных организмов – от 0 у Mycoplasma
genitalium до 2.5% генома у Synechocystis sp. В полностью сиквенированных геномах
общее количество ГК и РО следующее:
Mycoplasma genitalium – 0
Haemophilus influenzae – 9
Helicobacter pylori – 11
Thermotoga maritima -19
Escherichia coli – 62
Bacillus subtilis - 70
Synechocystis sp. – 80
Methanococcus jannaschii – 0
Methanobacterium thermoautotrophicum - 24
Caenorhabdis elegans – 0
Saccharomyces cerevisiae – 4 (одна система)
У эукариот пока описаны лишь единичные примеры ГК и РО, однако у
некоторых организмов их число больше – так, у слизевика Dictyostelium discoideum
имеется как минимум 11 ГК. Кроме того, эукариотические системы имеют ряд
отличий от прокариотических. Прежде всего, гибридные ГК, содержащие и РО
домен, редки у прокариот (5 из 30 ГК у E. coli), тогда как у эукариот все описанные
ГК гибридные (с пока единственным исключением). Прокариотические РО являются,
как правило, транскрипционными факторами, тогда как только один из описанных
пока эукариотических РО имеет ДНК-связывающий домен.
Структура и функции гистидиновых протеинкиназ
У типичных двухкомпонентных систем сенсорные ГК "следят" за внешними
стимулами и передают полученную информацию РО путем его фосфорилирования.
ГК, как правило, содержит две основных "части" – характеризующуюся большим
разнообразием сенсорную и консервативную киназную. Общая активность киназы
модулируется сигналами, детектируемыми сенсорным доменом. ГК претерпевает
АТФ-зависимое автофосфорилирование по инвариантному гистидиновому остатку,
расположенному в киназном же домене. ГК – димер, причем в реакции
автофосфорилирования один мономер ГК фосфорилирует консервативный
гистидиновый остаток другого. В отличие от типичных киназных каскадов, в которых
одна киназа имеет множество мишеней, в случае двухкомпонентных систем РО
стехиометрически переносит фосфат с фосфо-ГК на консервативный Asp своего
регуляторного домена. К тому же многие ГК имеют фосфатазную активность,
позволяющую им дефосфорилировать свой РО. Такие ГК используются при
необходимости быстро "выключать" сигнальную цепочку.
Рис.5.1. Доменная организация гистидинкиназ
ГК исключительно разнообразны, и все это разнообразие было создано за счет
простых комбинаций сенсорных, каталитических и вспомогательных доменов (Рис.
6.2). Модульная структура этих белков позволяет адаптировать свойства каждой ГК к
специфическим нуждам конкретной сигнальной системы. Различные ГК имеют
размер в пределах 40-200 kDa. Более крупные ГК могут состоять из 5-6 структурно и
функционально различных доменов. Несмотря на такое разнообразие ГК могут быть
разделены на два больших класса: классические и гибридные.
Наиболее "традиционные" ГК, например, осмосенсор EnvZ из E. coli, действуют
как мембранные рецепторы с сенсорным доменом, расположеным в периплазме.
EnvZ
имеет
две трансмембранных а-спирали, которые разделяют белок на
периплазматический аминоконцевой сенсорный домен и цитоплазматический
карбоксиконцевой киназный домен. Другие ГК могут иметь больше
трансмембранных сегментов (до 4-8) или не иметь их вовсе (киназы хемотаксиса
CheA и азотного регулона NtrB). В последнем случае ГК являются
цитоплазматическими и детектируют внутриклеточные изменения (непосредственно
либо в результате взаимодействия с цитоплазматическими регуляторными белками).
ГК, принадлежащие ко второму классу, гибридных ГК, имеют множественные
донорные и акцепторные сайты для передачи фосфата. Вместо одного акта передачи
фосфата гибридные ГК используют многоступенчатые схемы "ретрансляции" сигнала
фосфорилирования. Сложность общей структуры гибридных ГК позволяет иметь
несколько "входов", а иногда и "выходов" для одного сигнального пути. Типичным
представителем гибридных ГК является белок ArcB, регулятор активности ряда
генов в анаэробиозных условиях. ArcB имеет два N-концевых трансмембранных
сегмента, за которым следуют киназный домен, затем домен, сходный с
регуляторным у РО и, наконец, второй гистидинсодержащий домен, называемый HPtдомен (от His-containing phosphotransfer – гистидинсодержащий фосфатпереносящий)
Каталитическое киназное ядро.
Унифицирующим структурным свойством семейства ГК является характерное
киназное ядро, состоящее из домена димеризации и АТФ/АДФ-связывающего
фосфотрансферного или каталитического домена.
Киназное ядро имеет размер ~350 АК и отвечает за связывание АТФ и
осуществление киназной реакции. Консервативный остаток гистидина, являющийся
субстратом киназной реакции, располагается в домене димеризации.
HPt-домены
у прокариот встречаются исключительно в составе гибридных киназ, тогда как у
эукариот – как отдельные белки. Эти домены имеют размер около 120 АК и содержат
остаток гистидина, способный участвовать в фосфотрансферных реакциях. HPtдомены не имеют ни киназной, ни фосфатазной активности, поэтому они идеально
приспособлены для коммуникации между различными белками. Интересно, что при
всем разнообразии первичных последовательностей HPt-доменов их третичная
структура очень схожа и напоминает таковую домена димеризации киназного ядра,
включая расположение консервативного гистидинового остатка.
Сенсорный домен
Изменения в окружающей среде детектируются непесредственно (или
опосредованно) аминоконцевым сенсорным доменом ГК. Между разнообразными
мембранными сенсорными доменами практически полностью отсутствует сходство
на уровне первичной последовательности, что поддерживает идею о специфичности
детектируемых ими взаимодействий. В большинстве случаев специфический стимул
и механизм его детекции остаются неизвестными. Информация о трехмерной
структуре этих доменов начинает появляться только сейчас, поэтому как сигнал
передается к киназному ядру, пока не ясно.
Примером цитоплазматических сенсоров являются PAS-домены. Эти
универсальные модули "чувствуют" изменения освещенности, окислительновосстановительного потенциала, концентрации кислорода и небольших лигандов.
Имя домена происходит от первых букв названий трех эукариотических белков, в
которых он был впервые обнаружен. С доменом обычно связана одна из нескольких
простетических групп, которые как раз и определяют распознавание разнообразных
сигналов. Такими кофакторами могут быть, например, гем, ФАД, ФМН и т.д. PASдомены имеют небольшой размер (~100 АК) и располагаются перед (ближе к Nконцу) киназным ядром, как правило, после одной или нескольких пар
трансмембранных сегментов. Таким образом, цитоплазматические сенсоры с PASдоменами тоже являются мембранными белками. Однако имеются и не связанные с
мембраной цитоплазматические сенсоры, например, NtrB, участвующий в регуляции
азотного метаболизма.
(более подробно о снсорных доменах и механизме работы трансмембранных
сенсорных ГК поговорим в разделе о хемотаксисе).
Линкерный домен
У трансмембранных ГК периплазматический сенсорный домен соединяется с
цитоплазматическим киназным ядром при помощи трансмембранной а-спирали и
цитоплазматического линкера. Линкерные домены совершенно необходимы для
нормального функционирования сенсорных ГК, однако об их функциях известно
немного. Размер линкеров варьирует в пределах 40-180 АК. Многие из них имеют
характерный а-спиральный coiled coil мотив, в большинстве случаев
предшествующий фосфорилируемому гистидиновому остатку киназного ядра. Две
наиболее вероятные функции линкерных доменов – правильное расположение
мономеров в димере ГК и передача сигнала от сенсорной к киназной части белка.
ТЕМА 6
СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ РЕГУЛЯТОРОВ ОТВЕТА У ПРОКАРИОТ
У большинства прокариот РО (регуляторы ответа) – конечное звено
сигнального пути, функционирующее как зависящий от фосфорилирования
"выключатель" адаптивного ответа. РО катализирует перенос фосфата от
фосфогистидина ГК к консервативному остатку аспартата в своем регуляторном
домене. Большинство РО также катализируют автодефосфорилирование, что
ограничивает время пребывания белка в активированном состоянии.
Фосфорилирование РО приводит к его конформационному изменению,
затрагивающему значительную часть поверхности РО. Изменение поверхности
позволяет происходить новым внутри- и межмолекулярным взаимодействиям,
которые и вызывают адаптивный ответ. Такой принцип работы РО делает
возможным многообразные регуляторные механизмы, оптимизированные для
различных эффекторных функций в различных системах.
Большинство РО состоит из двух доменов: консервативного аминоконцевого
регуляторного и варьирующего карбоксиконцевого эффекторного. Большинство
РО
являются
транскрипционными
факторами
с
ДНК-связывающими
эффекторными доменами (25 из 32 РО у E. coli). ДНК-связывающие домены могут
быть разделены на три группы, представленные OmpR, NarL и NtrC
(соответственно 14, 7 и 4 члена). Не все РО имеют ДНК-связывающие домены.
Карбоксиконцевые домены некоторых РО являются ферментами, как, например,
метилтрансфераза CheB, участвующая в хемотаксисе. Некоторые РО вообще
лишены эффекторного домена. Примером такого белка является опять же белок
хемотаксиса CheY, который функционирует путем взаимодействия с эффекторным
белком FliM, компонентом жгутикового мотора.
Регуляторный домен.
Наиболее консервативная часть белка содержит кластер остатков аспартата, которые
связывают Mg2+ и формируют активный сайт для переноса фосфата
Эффекторный домен
Эффекторным доменам сложно дать общую характеристику по причине их
большого разнообразия. Большинство эффекторных доменов имеет ДНКсвязывающую активность и действует путем активации или репрессии
транскрипции
специфических
генов.
Тем
не
менее,
узнаваемые
последовательности ДНК, расположение сайтов связывания и механизм
транскрипционной регуляции существенно различаются, даже у РО из одного
подсемейства.
OmpR, детально охарактеризованный представитель самого большого
подсемейства РО, действует и как активатор, и как репрессор, дифференциально
регулируя экспрессию генов ompC и ompF, кодирующих порины внешней
мембраны. Димеры OmpR последовательно связываются с F и C боксами,
предшествующими пориновым генам. Белки-представители этого семейства
связываются с ДНК посредством характерного мотива "крылатая спираль",
состоящего из распознающей спирали, взаимодействующей с большой бороздкой в
ДНК, и двух петель, или крыльев, по обе стороны спирали, которые
взаимодействуют с малой бороздкой.
Второе подсемейсво РО представляет NarL, – транскрипционный фактор,
который и активирует, и репрессирует гены, участвующие в метаболизме нитрита
и нитрата. NarL связывается со множественными "NarL гептамерами" – сайтами
связывания – путем типичного HTH мотива.
Наиболее сложное как структурно, так и функционально подсемейство РО
представлено регулятором азотного метаболизма NtrC – энхансером транскрипции,
активирующим содержащий а54 холофермент РНК-полимеразы. Эффекторная
область белков этого подсемейства состоит из двух доменов – АТФазного и ДНКсвязывающего HTH домена. Способные связываться с ДНК димеры NtrC после
фосфорилирования олигомеризуются в октамеры. Олигомеризация стимулирует
гидролиз АТФ что дает энергию для образования открытого комплекса и
активации транскрипции.
Активация фосфорилированием.
Большое разнообразие эффекторных доменов ставит вопрос о том, как
консервативный регуляторный домен может изменять активность таких
разнообразных эффекторных доменов. Регуляторные домены РО существуют в
виде находящейся в состоянии равновесия смеси активной и неактивной форм.
Фосфорилирование регуляторного домена сдвигает равновесие в сторону активной
формы, которая имеет существенно отличную поверхность. Различные
молекулярные поверхности двух форм могут способствовать специфическим
белок-белковым (или белок-ДНК) взаимодействиям. Поэтому любой тип
регуляции, который может быть осуществлен за счет меж- или
внутримолекулярных взаимодействий, может использоваться семейством РО.
Соответственно существуют различные механизмы активации РО. Каждый
механизм основан на специфических регуляторных взаимодействиях присущих
фосфорилированному и(или) нефосфорилированному регуляторному домену. В
некоторых случаях активация происходит за счет снятия ингибирования. При этом
РО обычно можно активировать путем делеции регуляторного домена. В других
случаях фосфорилированный регуляторный домен играет активную роль.
Фосфорилирование может способствовать взаимодействию с другими белками
либо ди- или олигомеризации. Так, связывание OmpR с соседними операторными
участками усиливается при взаимодействии его субъединиц между собой, которое
усиливается при фосфорилировании; фосфорилирование NtrC способствует его
олигомеризации в энхансерной области, что активирует транскрипцию. Некоторые
белки используют комбинацию этих механизмов. Фосфорилирование обычно
соответствует активации, но есть и исключения.
Для двух РО с известной структурой известен точный механизм
ингибирования эффекторного домена нефосфорилированным регуляторным
доменом. В нефосфорилированном состоянии регуляторный домен экранирует
активный сайт эффекторного домена, не давая последнему взаимодействовать с
субстратом, каковым может являться ДНК (в случае транскрипционного фактора
NarL) либо белок (рецептор хемотаксиса в случае метилэстеразы CheB, о которой
мы поговорим чуть позже). Для обоих белков активация происходит за счет
взаимного перемещения N- и C-концевых доменов в результате индуцированных
фосфорилированием конформационных изменений.
Недавно определенные структуры фосфорилированных регуляторных
доменов нескольких белков подтверждают, что фосфорилирование вызывает
протяженные структурные изменения, затрагивающие молекулярмую поверхность
регуляторного домена. Фосфорилирование не изменяет общую третичную
структуру и не вызывает существенных изменений во вторичной структуре.
Единственным результатом фосфорилирования являются незначительные (на пару
ангстрем) перемещения элементов вторичной структуры, которые, тем не менее,
оказывают существенное влияние на молекулярную поверхность, изменяя ее
топологические и электростатические характеристики.
Индуцированные
фосфорилированием
конформационные
изменения
затрагивают большую поверхность регуляторного домена, которая может быть
использована во взаимодействиях со многими мишенями. И действительно, многие
РО взаимодействуют с несколькими молекулами – ГК, вспомогательные
фосфатазы, эффекторные домены, другие регуляторные домены в составе димеров
и, возможно, компоненты транскрипционного аппарата.
Архитектура регуляторных систем
Элегантность двухкомпонентвых систем заключается в их модулярности.
Простейшая сигнальная система может состоять из одной пары ГК-РО. В более
сложных случаях домены, входящие в состав ГК и РО, а также HPt-домены могут
комбинироваться, образуя уже сигнальную цепочку или даже сеть, известную под
названием фосфотрансляционная система (система передачи фосфата).
Классические двухкомпонентные системы доминируют у прокариот, тогда как
фосфотрансляционные системы чаще встречаются у эукариот (хотя
прокариотические примеры тоже имеются). Дополнительная сложность
фосфотрансляционных систем позволяет ввести дополнительные стадии контроля,
а также возможность взаимодействия между различными сигнальными путями.
Большинство регуляторных систем устроены просто. Трансмембранная
сенсорная ГК посредством одной реакции передачи фосфата активирует
цитоплазматический РО, который вызывает ссответствующий адаптивный ответ.
Типичным примером такой системы, использующей единичный перенос фосфата
от His к Asp, является осморегуляторрная пара EnvZ-OmpR, контролирующая
экспрессию поринов внешней мембраны OmpF и OmpC. Есть и вариации на эту
тему, когда несколько ГК могут фосфорилировать один РО или одна ГК
контролирует несколько РО, но в любом случае для таких простых систем имеет
место только один акт передачи фосфата в направлении His -> Asp. Например, в
системе контроля хемотаксиса одна ГК CheA фосфорилирует два РО, CheB и
CheY. Еще более сложная ситуация встречается в системе контроля нитрат/нитритреагирующих генов, в которй две ГК, NarX и NarQ, контролируют два РО, NarL и
NarP.
Фосфотрансляционные системы
Еще более усложненные версии двухкомпонентных систем используют более
одного акта передачи фосфата. Такие сигнальные пути называют
фосфотрансляционными системами (системами передачи фосфата). В простейшем
случае фосфотрансляционная система удлиняет цепочку передачи фосфата на два
шага, Asp -> His и His -> Asp. Таким образом, базовая фосфотрансляционная
система имеет уже четыре фосфорилированных белковых продукта и пять реакций
переноса фосфата:
1. Автофосфорилирование ГК:
ГК-His1 + АТФ  ГК-His1~Ф + АДФ
2. 1-й перенос фосфата:
ГК-His1~Ф + РО1-Asp  ГК-His1 + РО-Asp1~Ф
3. 2-й перенос фосфата:
РО-Asp1~Ф + HPt-His2  РО-Asp1 + HPt-His2~Ф
4. 3-й перенос фосфата:
HPt-His2~Ф + РО-Asp2  HPt-His2 + РО-Asp2~Ф
5. Дефосфорилирование:
РО-Asp2~Ф + H2O  РО-Asp2 + PI
В этой схеме в качестве фосфорилируемых субстратов используются домены,
содержащие консервативные остатки гистидина и аспартата. Эти домены могут
существовать как изолированные белки или же быть соединенными ковалентно,
как это имеет место в случае уже описанных гибридных гистидинкиназ.
Система контроля споруляции B. subtilis (которую мы еще рассмотрим более
подробно позднее) является примером His-Asp-His-Asp цепочки. В этой системе
несколько ГК могут быть донорами фосфата для белка Spo0F. С Asp белка Spo0F
фосфат затем переносится на HPt белок Spo0B и, наконец, на Asp
транскрипционного фактора Spo0А.
Множественные фосфорилируемые домены фосфотрансляционных систем
создают возможность альтернативных путей передачи фосфата. В гибридной ГК
ArcB любой из имеющихся His-содержащих доменов (димеризационный или же
HPt) может получить фосфат от АТФ и передать его РО ArcA. Два различных
варианта используются в аэробных и анаэробных условиях.
Еще более сложная организация может достигаться за счет интеграции
различных сигнальных цепочек в сигнальные сети. У B. subtilis практически
каждая двухкомпонентная система взаимодействует с как минимум еще одной
цепочкой передачи фосфата. В качестве примера такой интеграции можно
привести взаимодействие путей, контролирующих утилизацию фосфата
(PhoR/PhoP), аэробного и анаэробного дыхания (ResE/ResD) и споруляцию (KinAB/Spo0A). Дыхание и утилизация фосфата регулируются совместно – фосфо-PhoP
активирует экспрессию ResD и наоборот. Однако, когда клетка вступает на путь
споруляции, и дыхание, и утилизация фосфата репрессируются, поскольку фосфоSpo0A негативно регулирует фосфорилированные ResD и PhoP.
Регуляторные механизмы
Единственной видимой причиной, по которой регуляторные системы
являются двух- (и более) – компонентными является сама необходимость контроля
– двухступенчатый (или еще более сложный) сигнальный путь просто напросто
создает те места, в которых клетка может контролировать поток информации.
Различные регуляторные механизмы накладываются поверх базовых путей
передачи фосфата, позволяя оптимизировать передачу фосфата для нужд каждой
конкретной системы. Результатом работы некоторых систем является
"количественный" ответ – так EnvZ-OmpR система обеспечивает различные уровни
экспрессии генов поринов ompF и ompC. Другие регуляторные системы, как,
например, система контроля споруляции у бацилл, дают качественный ответ типа
"все или ничего". Вне зависимости от типа даваемого ответа любая система может
иметь несколько уровней регуляции, зачастую с участием дополнительных
белковых компонентов. Основными мишенями для такой регуляции являются
активности ГК и дефосфорилирование РО.
Регуляция активности ГК.
ГК могут иметь две активности, способные контролировать уровень
фосфорилирования РО: автокиназную и РО-фосфатазную. Не все ГК имеют
фосфатазную активность – для некоторых возможна только регуляция
автокиназной активности. С другой стороны, во многих системах именно
фосфатазная активность подвержена основной регуляции.
У типичных трансмембранных ГК сенсорные домены непосредственно
связываются с лигандами либо детектируют физические стимулы. В более
сложных системах детекция сигналов может происходить через взаимодействие с
другими белковыми компонентами. Например, автокиназная активность ГК
хемотаксиса CheA, которая образует комплекс с хеморецепторами и адаптерным
белком CheW, ингибируется либо активируется сигналами, передаваемыми от
хеморецепторов (путем конформационных изменений). РО-фосфатазная
активность цитоплазматической ГК NtrB регулируется дополнительным белком
PII, чья способность взаимодействовать с NtrB зависит от его уридилированности,
которая, в свою очередь, связана с концентрацией внутриклеточного азота.
Активность ГК может также регулироваться дополнительными доменами.
Например, сенсор тургора KdpD содержит дополнительных АТФ-связывающий
домен, и связывание (но не гидролиз) АТФ необходимо для проявления
фосфатазной активности.
Регуляция дефосфорилирования РО
Как мы уже обсуждали, многие РО имеют автофосфатазную активность,
необходимую для поодержания надлежащих временных параметров системы
(времени существования РО в фосфорилированном состоянии). На
дефосфорилирование РО также может влиять фосфатазная активность ГК,
регулируемая различными механизмами.
В дефосфорилировании некоторых РО участвуют вспомогательные белки.
Система споруляции бацилл имеет набор строго регулируемых фосфатаз (RapA,
RapB, RapE), которые дефосфорилируют Spo0F, и еще одну фосфатазу, которая
дефосфорилирует Spo0A. В системе хемотаксиса вспомогательный белок CheZ
олигомеризуется с фосфо-CheY и стимулирует его дефосфорилирование.
Фосфатазы фосфоаспартата имеют настолько высокую специфичность по
отношению к белкам- субстратам, что возникает вопрос – действительно ли они
непосредственно катализируют гидролиз или же просто стимулируют присущую
РО автофосфатазную активность.
Другие способы регуляции
Некоторые системы могут иметь дополнительные и зачастую специфические
механизмы контроля. Например, может регулироваться сам перенос фосфата. Так, у
гибридной киназы VirA из A. tumefaciens карбоксиконцевой Asp-содержащий домен
влияет на автокиназную активность киназного ядра путем физического
взаимодействия с сайтом автофосфорилирования.
Дополнительная возможность регуляции создается в тех случаях, когда ГК
фосфорилирует более одного РО. В этих случаях конкуренция за фосфат может
влиять на активацию различных ветвей сигнального пути.
Наконец, еще один способ регуляции РО – контроль экспрессии его гена.
Многие из двухкомпонентных систем, регулирующих транскрипцию, подвержены
авторегуляции. В таких системах фосфо-РО действует как активатор или репрессор
оперона, кодирующего ГК и РО.
ТЕМА 7
ХЕМОТАКСИС. БЕЛКОВЫЙ АППАРАТ И РЕЦЕПТОРЫ
ХЕМОТАКСИСА
Пили представляют собой внеклеточные белковые структуры, которые
осуществляют самые разнообразные функции, включая обмен ДНК адгезию и
образование биопленки клетками прокариот.
Многие адгезивные пили собираются с участием системы шаперон-Usher-белок.
Сборка происходит на наружной мембране с участием Usher-белка, образующего
пору, сквозь которую проходят субъединицы пили, и шаперона периплазмы,
способствующего их скручиванию и прохождению через пору
Жгутики представляют собой внешние структуры клетки, которые служат
пропеллерами, обеспечивающими ее движение
У прокариот жгутики состоят из множественных сегментов, каждый из которых
образуется при сборке белковых субъединиц.
От поверхности прокариотической клетки отходят два типа придаточных
структур, пили и жгутики. Пили представляют собой нитевидные олигомеры белков,
присутствующие на клеточной поверхности. Существуют различные типы пилей.
Например, F-пили участвуют в клеточной конъюгации и в переносе ДНК. Когда эти
придаточные структуры были впервые обнаружены, их назвали «фимбрии» (лат.
fimbria — нить, волокно). Их присутствие коррелировало со способностью Е. coli
агглютинировать красные кровяные клетки.
Позже для обозначения фибриллярных структур (F-пили), связанных с
процессом переноса генетического материала между организмами при конъюгации,
был предложен термин пили (или пилюс) (лат. pilus — волос). С тех пор этот термин
стал общим для описания всех типов ворсинчатых придаточных структур, и
используется наряду с термином фимбрия.
Взаимодействие клеток бактерий с другими прокариотическими и
эукариотическими клетками с участием ворсинок часто служит важным этапом
заселения эпителия, проникновения микробов в клетки хозяина, обмена ДНК и
формирования биопленок. Пили могут служить рецепторами бактериофагов.
Основная функция большинства пилей состоит в структурном обеспечении
позиционирования специфических молекул, участвующих в клеточной адгезии.
Адгезивные субъединицы ворсинок (адгезины) представляют собой минорные
компоненты их кончиков, однако основные структурные субъединицы также могут
функционировать в качестве адгезинов.
Часто адгезивные пили представляют собой важные факторы заселения
микробами организма хозяина. Например, при инфекциях мочевых путей
патогенными бактериями Е. coli, клетки прикрепляются к эпителию мочевого пузыря
с помощью пилей типа I. Пили этого типа присутствуют у многих
грамотрицательных микроорганизмов. Они представляют собой сложные структуры,
состоящие из толстого тела, соединенного с тонким фибриллярным концом. На конце
расположены молекулы адгезина FimH, которые связываются с остатками маннозы
на поверхности клеток хозяина.
Рисунок 7.1. Два типа пилей у клеток прокариот.
Сборка пилей представляет собой сложный процесс, в котором участвуют
структурные белки, составляющие тело пили, и дополнительные белки,
способствующие сборке субъединиц на поверхности клетки. Все структурные
компоненты, необходимые для процесса сборки пилей на поверхности
грамотрицательных
микроорганизмов,
должны
транслоцироваться
через
цитоплазматическую мембрану в периплазму и далее, через внешнюю мембрану. В
завершении процесса сборки участвуют два специфических белка: шаперон,
присутствующий в периплазме, и транспортный белок внешней мембраны, который
называется Usher-белок.
Процессы, в которых функционируют эти белки, обеспечивают биогенез более
30 различных типов ворсинчатых структур. Как показано на рисунке ниже,
комплексы шаперонов с субъединицами образуются в периплазме и на наружной
мембране взаимодействуют с Usher-белком, где высвобождается шаперон. При этом
на субъединицах открываются интерактивные поверхности, что обеспечивает их
дальнейшую сборку в пили. Исследования пилей типа I и Р показали, что адгезиншапероновые комплексы (PapDG или FimCH) обладают большим сродством к Usherбелку, и адгезины представляют собой начальные субъединицы, которые собираются
в пили.
Включение остальных субъединиц отчасти определяется кинетикой образования
на Usher-белке комплекса с шапероном. Наряду с функционированием в качестве
сборочной платформы, Usher-белок, вероятно, играет также и другие роли в сборке
ворсинок. По данным электронной микросокопии высокого разрешения, PapС Usher
имеет вид кольцевых комплексов диаметром 15 нм, которые в середине имеют пору
размером 2 нм. После отщепления от шаперона, которое происходит на Usher-белке,
субъединицы включаются в растущую структуру пили, которая, как считают, должна
выталкиваться через центральную пору комплекса в виде толстой линейной
фибриллы, состоящей из одной субъединицы.
Большинство микроорганизмов обладает подвижностью, и часто она
обеспечивается длинными структурными придатками, которые называются
жгутиками. У грамположительных и грамотрицательных бактерий жгутики
собираются на поверхности клеток. Когда на полюсе клетки находится один жгутик,
такое расположение называется монотрихиальным (или полярным).
Если жгутики расположены вокруг клетки, то такое расположение называется
перитрихиальным. Если на одном полюсе клетки находится группа жгутиков, то
говорят об их лофотрихиальном расположении (от латинского «хохолок»).
Жгутики бактерий отличаются от этих структур эукариотических клеток,
которые состоят из микротрубочек и связанных с ними белков и окружены
плазматической мембраной. Жгутики могут быть различной длины, но их диаметр
обычно составляет 20 нм. Они не видны в световом микроскопе, если препараты
вначале не обрабатывались реагентами, которые увеличивали диаметр жгутиков. На
рисунке ниже видно, что жгутики состоят из трех отдельных доменов: филамента,
крючка и базального тела.
Филамент жгутика состоит из повторяющихся структур флагеллиновых белков.
Флагеллины представляют собой высококонсервативные белки бактерий, что
позволяет предполагать, что движение клеток с участием жгутиков характерно для
примитивных форм живых организмов. В месте присоединения жгутика к клетке
находится базальное тело, представляющее собой сложную структуру, состоящую из
множества белков. Филамент жгутика соединяется с базальным телом посредством
крючка. У грамотрицательных бактерий базальное тело проходит через наружную
мембрану, протеогликан клеточной стенки и цитоплазматическую мембрану. С
наружной мембраной жгутик связан посредством L-кольца. Две пары колец, S-М и Р,
способствуют прикреплению жгутика к цитоплазматической мембране и к клеточной
стенке соответственно. Каждое кольцо состоит из множества мембранных белков. На
цитоплазматической мембране находятся два белка Mot, которые выполняют роль
моторов, приводящих жгутики в движение. Еще один набор белков встроен в
цитоплазматическую мембрану и выполняет реверсную функцию по отношению к
моторам жгутика. Поскольку у грамположительных организмов наружная мембрана
отсутствует, у них есть только S-М кольца.
В образовании и сборке филаментов жгутиков участвует несколько десятков
различных генов. Их активность строго регулируется в соответствии с порядком
процесса сборки. Так, первыми экспрессируются гены, участвующие в сборке
базального тела и крючка, а затем наступает очередь генов, ответственных за
образование субъединиц жгутика. Экспрессии флагеллиновых субъединиц не
происходит до тех пор, пока не завершилась сборка крючка. В этот момент через
канал крючка выходит супрессор транскрипции, и, таким образом, снимается
подавление экспрессии флагеллина. Субъединицы флагеллина экспортируются через
жгутик и добавляются к его растущему концу.
Такой механизм обеспечивает сборку филамента только после образования
структуры крючка. Эта структура также имеет отношение к другим секреторным
системам белков.
Система хемотаксиса определяет наличие питательных компонентов и затем
определяет направление вращения жгутика. В отсутствие питательных компонентов,
жгутики вращаются по часовой стрелке, что вызывает поворот клетки. Движение
клетки по направлению к молекулам химического соединения или от них называется
хемотаксис. В данном разделе мы рассмотрим движение прокариотической клетки в
присутствии аттрактанта, являющегося питательным продуктом.
Для того чтобы обеспечить клетке такое движение, жесткий жгутик должен
вращаться подобно пропеллеру, за счет энергии, доставляемой протонной движущей
силой. Движение клетки состоит из серии прямых пробегов, за которыми следуют ее
быстрые беспорядочные повороты. Когда жгутики вращаются против часовой
стрелки, клетка перемещается по прямой линии, а при вращении по часовой стрелке
клетка совершает повороты. Поскольку в результате поворотов клетка занимает
случайные позиции, можно было бы думать, что общий итог движения окажется
нулевым. Однако периодичность пробегов регулируется в соответствии с
доступностью питательного компонента: более длинные пробеги характерны для
движения клетки по направлению к источнику питания, и количество поворотов
возрастает, когда клетка направляется от него.
Хотя направление отдельных пробегов все еще случайно, общий результат
проявляется в движении клетки в сторону аттрактанта.
Пути передачи сигнала хемотаксиса у прокариот характеризуются чрезвычайно
консервативной природой. Единственным из известных организмов, в геноме
которого отсутствуют гены хемотаксиса, является Mycoplasma. Практически у всех
прокариот обнаружены следующие консервативные белки хемотаксиса: CheR, CheA,
CheY, CheW, и CheB. При протекании сложного каскада событий, включающих
фосфорилирование и метилирование, эти белки обеспечивают сложный,
скоординированный и высокогибкий ответ клетки на присутствие аттрактантов и
репеллентов в окружающей среде. Мы опишем, как происходят эти события в
клетках Е. coli.
Присутствующие в окружающей среде аттрактанты или репелленты
связываются с рецепторами, расположенными на цитоплазматической мембране. С
этими рецепторами взаимодействует киназа CheA, также расположенная в
цитоплазматической мембране. Эта киназа фосфорилирует CheY, который затем
связывается с мотором жгутика, что приводит к переключению направления его
вращения и к повороту клетки. Под действием фосфатазы CheZ из CheY удаляется
фосфатная группа. При низкой концентрации аттрактанта происходит
аутофосфорилирование CheA, фосфатная группа переносится на CheY, и последний
мигрирует к мотору жгутика, изменяя характер движения клетки на поворот.
Система хемотаксиса характеризуется еще одним уровнем сложности, который
позволяет клетке постоянно адаптироваться к условиям, существующим в
окружающей среде. По мере своего продвижения по градиенту концентрации
химических соединений, клетка может реагировать на возникающие небольшие
флуктуации. Такая кратковременная память обеспечивается за счет метилирования
мембранных рецепторов. CheR метилирует мембранные рецепторы, a CheB удаляет
метальные группы.
Метилирование рецепторов увеличивает активность киназы CheA, что приводит
к десенсибилизации системы. В свою очередь, CheB также фосфорилируется CheA;
это вызывает увеличение метилэстеразной активности CheB и замыкает цикл
обратной связи для сигнального каскада.
Рисунок 7.2. Для сборки пили необходим шаперон PapD и мембранный Usher-белок.
Слева: нить G1 шаперона PapD завершает формирование нативной структуры
новосинтезированной субъединицы пили, располагаясь между двумя нитями этой
субъединицы.
Справа: в процессе сборки пили N-концевая нить новосинтезированной субъединицы
замещает G1-цепь шаперона PapD, связанную с предыдущей субъединицей пили.
У различных типов бактерий жгутики расположены по-разному.
Рисунок 7.3. Расположение жгутиков у бактерий
Жгутики прокариот состоят из трех сегментов, каждый из которых содержит
многочисленные белки.
Рисунок 7.4. Строение жгутика. На врезке вверху представлено изображение структуры
жгутика, полученное с помощью электронного микроскопа, а внизу — электронная
микрофотография области базального тела и крючка. Филамент жгутика состоит из
флагеллиновых субъединиц, которые собраны в спиральную структуру, содержащую 11
субъединиц на виток.
Рисунок 7.5. Движение бактерии по направлению к молекулам питательных веществ и от них
можно представить в виде длительных прямолинейных треков и, соответственно, большим
числом поворотов.
ТЕМА 8
КИСЛОРОДНЫЙ СТРЕСС И РЕДОКС КОНТРОЛЬ
Активные радикалы, их повреждающее действие
Метаболизм клеток существенно различается в аэробных и анаэробных условиях. В
аэробных условиях клетка может получить гораздо больше энергии, но это не дается
ей бесплатно – кислород окисляет не только источники энергии, но и многие
жизненно важные клеточные компоненты. Поэтому в аэробных условиях в клетке
при помощи регуляторов OxyR и SoxR индуцируются белки, защищающие ее от
кислорода, такие как супероксиддисмутаза и каталаза. С другой стороны, клетка
вынуждена существенно перестраивать свой метаболизм если она попадает в бедные
энергией анаэробные условия – теперь она уже не может себе позволить многие
"роскоши". Такая метаболическая перестройка контролируется регуляторными
белками – гистидиновой сенсорной киназой ArcB и регулятором транскрипции FNR.
Эти два белка контролируют такие разнообразные процессы, как дыхание и
фотосинтез, утилизация углерода и азота. Эти два регулятора реагируют на разные
концентрации кислорода, позволяя точно подстраивать контроль различных генов к
условиям полного или частичного анаэтобиоза. Активные радикалы: их
повреждающее действие и механизм инактивации. Кислородный стресс вызван
действием активных кислородных интермедиатов, таких как анион супероксида (O2•), перекись водорода H2O2 и гидроксил-радикал HO•, которые способны повреждать
белки, нуклеиновые кислоты и клеточные мембраны. Кроме того, повреждающее
действие на клеточные структуры имеют производные этих активных соединений
гипохлорная кислота (HOCl) и активные азотные интермедиаты - азотистый оксид
(NO•). Пероксинитрит (HOONO) и нитрозотиолы (RSNO). Для предотвращения
повреждений
клетка
вынуждена
постоянно
синтезировать
ферменты,
инактивирующие активные радикалы и устраняющие вызванные ими повреждения.
Причина окислительного стресса.
Окислительный стресс является неизбежным побочным продуктом аэробного
стиля жизни, поскольку O2•- и H2O2 формируются каждый раз, когда молекулярный
кислород химически окисляет переносчики электронов. Особенно активны в этом
отношении восстановленные флавопротеины. У экспоненциально растущих бактерий
E. coli O2•- и H2O2 образуются при автоокислении компонентов дыхательной цепи.
Флавин NADH дегидрогеназы II является основным местом переноса электронов к
кислороду. Фумаратредуктаза - терминальная оксидаза, индуцируемая при
анаэробном росте, - очень активно взаимодействует с кислородом и, возможно,
является основной причиной стресса, возникающего при переходе от анаэробных к
аэробным условиям.
Рис.8.1. Повреждение макромолекул клетки активными формами кислорода
В аэробных условиях E. coli производят достаточно супероксиддисмутазы, чтобы
поддерживать концентрацию O2•- на уровне порядка 10-10 M. Это около половины
той концентрации, которая могла бы уменьшить активность жизненно важных
ферментов и ингибировать рост. Концентрация H2O2 на порядок меньше
ингибирующей. Таким образом, защитные системы бактериальной клетки
поддерживают концентрацию активных производных кислорода на уровне, лишь
слегка более низком, чем токсичный. Это активно используется растениями,
животными, а иногда и другими бактериями для защиты от своих бактериальных
конкурентов (или патогенов). Например, фагоциты животных используют NADPH
оксидазу, NO• синтазу и миелопероксидазу для того, чтобы бомбардировать
захваченные бактерии O2•-, NO•, HOCl и их производными H2O2, HOONO и
RSNOМеханизмы окислительных повреждений клетки. Наиболее чувствительными к
окислительным повреждениям являются различные дегидратазы, использующие
железо-серные кластеры [4Fe-4S] для связывания и дегидрирования субстратов.
Окисление таких дегидратаз супероксид-ионом вызывает разрушение Fe-S кластеров
и потерю активности. Кроме того, побочным продуктом такого окисления являются
многочисленные ионы железа, высвобождаемые в цитоплазму, где они совместно с
H2O2 катализируют окисление ДНК.
H2O2 эффективно окисляет тиолы, поэтому повреждает множество дегидрогеназ,
использующих остатки цистеина в каталитическом центре. Кроме того,
взаимодействие H2O2 с ионами Fe2+ дает сильнейший окислитель HO• (гидроксил),
способный взаимодействовать практически со всеми биомолекулами, в первую
очередь с ДНК, с чем и связана в первую очередь летальность действия H2O2.
(действие активных форм азота)
Защита от окислительного стресса.
Для защиты от окислительного стресса клетка использует целый ряд
антиоксидантных ферментов и систем репарации, большинство которые
экспрессируется на низком базальном уровне в нормальных условиях. При
воздействии супероксида и перекиси водорода экспрессия многих антиоксидантных
белков индуцируется, что зависит в основном от действия двух регуляторов - SoxRS
и OxyR. SoxRS регулон SoxRS в ответ на супероксид регулирует экспрессию не
менее 10 белков, включая супероксиддисмутазу (SodA), участвующую в репарации
ДНК эндонуклеазу IV (Nfo) и резистентные к супероксиду изоформы фумаразы
(FumC) и аконитазы (AcnA). Аконитаза конвертирует цитрат в изоцитрат в цикле
Кребса. Это мономер с одним железо-серным центром, который может находиться в
каталитически активной [4Fe-4S] и неактивной (например, из-за окислительного
повреждения) [3Fe-4S] форме. Кроме того, SoxRS обеспечивает увеличение
концентрации
глюкозо-6-фосфат
дегидрогеназы
(Zwf),
что
усиливает
восстановительную силу клетки, и увеличение количества репрессора метаболизма
железа Fur, что снижает поглощение железа и, следовательно, снижает выработку
гидроксила. Индукция регулона происходит в два этапа. Сначала редокс-сенсорный
белок SoxR под влиянием супероксид-иона индуцирует транскрипцию soxS, а затем
уже SoxS непосредственно активирует гены-мишени, связываясь с их промоторными
областями. Конститутивно экспрессируемый белок SoxR - димер, каждая из
субъединиц которого содержит по одному стабильному [2Fe-2S] центру.
Окисление восстановленной формы [2Fe-2S]+ в форму [2Fe-2S]2+ приводит к
активации SoxR. Какая молекула вызывает окисление SoxR, пока неясно. Возможно,
это делает сам супероксид-ион. Только окисленная форма SoxR может активировать
транскрипцию soxS, однако восстановленная SoxR форма обладает той же
аффинностью к ДНК. Следовательно, окисление регулятора должно каким-то
образом
изменять
его
взаимодействие
с
ДНК.
Интересным является то, где SoxR связывается с регуляторной областью – между
сайтами –10 и –35 промотора, что очень необычно для активатора транскрипции.
Кроме того, расстояние между этими сайтами слишком большое для активного
промотора – 19 н.п. Скорее всего, промоторная область soxS одновременно
оказывается занятой РНК-полимеразой и SoxR, расположенными по разные стороны
ДНК, а окисление SoxR каким-то образом помогает РНК-полимеразе образовать
открытый комплекс на нестандартном промоторе.
Гены soxS и soxR расположены рядом друг с другом, транскрибируются в
противоположные стороны, причем их промоторные области перекрываются. OxyR
регулон. Другой транскрипционный фактор, OxyR, в ответ на H2O2 активирует
синтез примерно 30 белков (четко показан контроль через OxyR только для 9 из них),
в том числе каталазы (гидропероксидазы I, KatG), двух субъединиц
алкилгидропероксид редуктазы (AhpCF), глутаредоксина (GrxA), глутатион
редуктазы (GorA), Mn-супероксиддисмутазы и Fur-репрессора. Регулируемые OxyR
неспецифический ДНК-связывающий белок Dps (DNA-binding protein from starved
cells) и регуляторная РНК OxyS защищают от мутагенеза. Активируется также синтез
ряда генов теплового шока и регулятора синтеза капсульных полисахаридов.
Ген oxyR кодирует небольшой 34 kDa белок, примадлежащий к семействы LysRподобных регуляторов. Как и большинство регуляторов этого семейства, OxyR
негативно контролирует свой собственный синтез, причем как в присутствии H2O2,
так и в ее отсутствии. Такая регуляция поддерживает количество белка на
постоянном уровне. OxyR также активирует транскрипцию соседнего,
транскрибируемого в противоположном направлении, гена oxyS, продуктом которого
является небольшая нетранслируемая РНК, влияющая на экспрессию целого ряда
генов. Тетрамер OxyR существует в двух формах - окисленной и восстановленной, но
только окисленная форма активирует транскрипцию, связываясь с карбоксиконцевым
доменом α-субъединицы РНК-полимеразы (Рис. 9.3). H2O2 непосредственно
окисляет OxyR, приводя к образованию дисульфидной связи между двумя
цистеиновыми остатками одной субъединицы OxyR. Образование этой дисульфидной
связи вызывает конформационное изменение, которое влияет на связывание с ДНК.
Восстановление
(и,
следовательно,
инактивация)
OxyR
осуществляется
глутаредоксином
1
(тиол:дисульфид
оксидоредуктазой,
использующей
восстановленный глутатион и NADH в качестве восстановителей), а поскольку
глутаредоксин, также как и глутатионредуктаза, находятся под контролем OxyR,
получается, что OxyR сам активирует экспрессию ферментов, необходимых для его
восстановления, т.е. инактивации.
Адаптация к анаэробиозу.
Основные регуляторы - FNR (fumarate and nitrate reduction) и ArcA (aerobic respiratory
control) Оба белка являются транскрипционными факторами, активирующимися в
анаэробных условиях и инактивирующихся при взаимодействии с кислородом. FNR
детектирует кислород непосредственно через редокс-чувствительный Fe-S кластер,
входящий в его структуру, тогда как активность ArcA зависит от его
фосфорилирования, контролируемого мембранной гистидинкиназой ArcB. В отличие
от FNR ArcB не детектирует содержание кислорода непосредственно, а реагирует на
общее состояние клетки. В связи с этим два регулятора реагируют на различные
концентрации кислорода и контролируют разные, но частично перекрывающиеся
наборы генов. Это позволяет бактерии быстро и эффективно приспосабливаться к
широкому диапазону концентраций кислорода.
FNR как сенсор кислорода
FNR – глобальный регулятор, контролирующий экспрессию более 120 генов у E. coli.
Белок был идентифицирован путем изоляции мутантов, неспособных
восстанавливать нитрат и фумарат. Позже было показано, что белок отвечает за
индукцию в анаэробных условиях таких ферментов цикла Кребса как сукцинат
дегидрогеназа, фумараза, изоцитрат дегидрогеназа, участвующих в производстве
энергии путем окислительного фосфорилирования. FNR также активирует
экспрессию ферментов анаэробного дыхания, которые используют альтернативные
конечные акцепторы электронов, такие как DMSO, фумарат или нитрат. Помимо
активации экспрессии необходимых в анаэробных условях белков FNR также
репрессирует такие аэробные респираторные ферменты как цитохромоксидаза и
NADH дегидрогеназа. Интересно то, что по аминокислотной последовательности
FNR похож на БАК. Mеханизм активации транскрипции обеими белками тоже
одинаков - оба активируют транскрипцию, контактируя с α-субъединицей РНКполимеразы. Единственным существенным отличием FNR является дополнительный
участок на амино-конце этого белка, несущий ферредоксинообразный кластер из
четырех цистеиновых остатков (Cys-X3-Cys-X2-Cys-X5-Cys), что привело к
предположению о детекции кислорода при помощи железо-серных кластеров. При
взаимодействии с кислородом два [4Fe-4S]2+ кластера димера FNR быстро (за пару
минут) превращаются в два [2Fe-2S]2+ кластера, причем железо остается связанным
с окисленным FNR, скорее всего в виде сульфида. Если клетку быстро вернуть в
анаэробные условия, [2Fe-2S]2+ центры быстро возвращаются в исходное [4Fe-4S]2+
состояние. Однако более продолжительная инкубация в присутствии кислорода ведет
уже к необратимому разрушению центров [2Fe-2S]2+, давая апобелок, полностью
лишенный железа. FNR активен как транскрипционный фактор только в форме
гомодимера, для образования которого необходимо присутствие интактных [4Fe4S]2+ кластеров. Преобразование кубической структуры [4Fe-4S]2+ в плоскую [2Fe2S]2+ при окислении белка в аэробных условиях оказывается достаточным для
внесения существенных конформационных изменений, вызываэщих диссоциацию
димера FNR на мономеры, что предотвращает связывание белка с ДНК. Широкий
диапазон концентраций кислорода детектируется клетками E. coli. Анаэробное
дыхание у этой бактерии происходит в диапазоне концентраций кислорода 1-5 μМ
(при наличии соответствующих акцепторов электронов), при более низкой
концентрации бактерия переключается на брожение. Именно в этом диапазоне
концентраций и происходит переход FNR из неактивной в активную форму. ArcB
реагирует на изменения концентрации кислорода на границе микроанаэробной и
анаэробной зоны (5-10 μМ). Этот белок скорее всего реагирует на изменения
электронтранспортной цепи (трансмембранного протонного потенциала или же
степени окисления какого-то переносчика электронов). Вторым сигналом, на который
может реагировать ArcB, является концентрация анаэробных метаболитов. ArcB
работает в паре с РО ArcA. На сегодняшний день регулон ArcA насчитывает более 30
генов, кодирующих ферменты цикла Кребса (флавопротеиновые дегидрогеназы,
цитохромоксидазы и т.д.), глиоксилатного шунта и деградации жирных кислот.
Регуляция в основном заключается в репрессии при анаэробиозе синтеза ферментов
аэробного дыхания, хотя ArcA также активирует несколько генов в микроанаэробных
условиях. ArcB имеет существенное сходство с компонентами сенсорных систем.
Рис. 8.2 Двухкомпонентная регуляторная система ArcA/ArcB
Репрессия транскрипции белком FNR His входят: классический гистидинкиназный
домен, центральный домен, сходный с регуляторным доменом РО, и небольшой HPt
домен на карбокси-конце. Фосфат может передаваться на ArcA с любого из
фосфорилириванных гистидиновых остатков в составе ArcB – и из автокиназного, и
из HPt домена.
Причем имеются данные, что для реакции на анаэробные метаболиты достаточно
только автокиназного домена, тогда как для "определения" состояния
электронтранспортной цепи важен HPt домен. Аэротаксис Флавопротеин AerA
является мембранным рецептором, отвечающим за аэротаксис. Амино-концевой
домен этого белка похож на редокс-сенсоры фиксации азота у Azotobacter, а
карбокси-концевой - на сигнальный домен белка Tsr - серинового рецептора
хемотаксиса. Для обеспечения аэротаксиса необходимо взаимодействие AerA только
с CheY, CheA и CheW, таким образом, AerA - типичный сенсор хемотаксиса,
детектирующий концентрацию кислорода. В защите от активного кислорода
участвуют также еще несколько белков, не контролируемых SoxRS и OxyR.
Взаимосвязь между окислительным стрессом и другими регуляторными системами.
Еще несколько транскрипционных регуляторов участвуют в контроле экспрессии
антиоксидантных генов. Например, RpoS индуцируется, когда клетки подвергаются
различным стрессам, включая голодание, осмотический шок, кислотный шок и
стационарную фазу. Клетки, активно экспрессирующие RpoS, устойчивы к целому
ряду стрессовых воздействий, включая высокие концентрации перекиси водорода.
RpoS контролирует экспрессию целого ряда антиоксидантных генов, включая katE,
xthA и sodC. Члены OxyR- регулона katG, gorA и dps также подвержены регуляции
через RpoS. Анаэробные регуляторы FNR и ArcAB также модулируют экспрессию
генов sodA, sodC, acnA и fumC. Кроме того, два гомолога белка SoxS, MarA и Rob,
регулируют экспрессию практически всех генов регулона SoxRS. Наконец,
экспрессия одного транскрипционного фактора, Fur, контролируется как SoxRS, так и
OxyR.
ТЕМА 9
РЕГУЛЯЦИЯ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА
Клеточный цикл - это жизнь клетки от одного деления до другого. Про
клетки, которые делиться больше не будут, обычно говорят, что они вышли из
клеточного цикла. Продолжительность клеточного цикла у бактерий может
составлять всего 20-30 мин, а у клеток эукариот цикл обычно длится не менее 1012 ч, часто сутки и более. Исключение составляют быстро делящиеся клетки самых
ранних зародышей, весь цикл у них может проходить за 15-20 мин.
Установлено, что для прохождения клеткой цикла необходимо
последовательное
включение
определенных
генов.
Синтез
белков,
обеспечивающих каждую стадию цикла, осуществляется чаще всего заранее - в Giпeриоде синтезируются белки, участвующие в синтезе ДНК.
Регуляция клеточного цикла у эукариот
Рис.9.1. Клеточный цикл у эукариот.
● · В цитоплазме митотической клетки есть фактор (или факторы),
стимулирующие митоз (ФСМ, или MPF - mitosis promoting factor). Этот фактор
вызывает не только конденсацию хромосом, но и приводит к распаду ядерной
оболочки
● · Циклины получили свое название в связи с тем, что их внутриклеточная
концентрация периодически изменяется по мере прохождения клеток через
клеточный цикл, достигая максимума на его определенных стадиях.
● · Наличие контрольных точек в клеточном цикле необходимо для
определения завершения его каждой фазы. Остановка клеточного цикла
происходит при повреждении ДНК в G1-периоде, при неполной репликации ДНК в
S-фазе, при повреждении ДНК в G2-периоде и при нарушении связи веретена
деления с хромосомами.Одним из контрольных пунктов в клеточном цикле
является собственно митоз, который не переходит в анафазу при неправильной
сборке веретена и при отсутствии полных связей микротрубочек с кинетохорами. В
этом случае не происходит активации АРС-комплекса, не происходит деградации
когезинов, соединяющих сестринские хроматиды, и деградации митотических
циклинов, что необходимо для перехода в анафазу.
Регуляция клеточного цикла у прокариот
Клеточный цикл размножения бактерий осуществляется путем бинарного
деления. При этом все компоненты клетки распределяются между сестринскими
клетками поровну. Исключение составляет хромосома, которая находится одна в
каждой клетке. Так как чаще всего прокариотические клетки имеют клеточную
стенку, бинарное деление сопровождается образованием септы — перегородки
между дочерними клетками, которая затем расслаивается посередине.
Центральную роль в делении клеток грамотрицательных бактерий играет
септальное кольцо — кольцевая органелла, расположенная примерно посередине
клетки и способная сокращаться, образуя перетяжку между двумя новыми
дочерними клетками. Зрелое септальное кольцо представляет собой сложный
белковый комплекс
Рис.9.2. Цитокинез у прокариот.
Регуляция бактериального клеточного цикла очень сложна и включает
несколько взаимодействующих регуляторных механизмов. На протяжении
клеточного цикла бактериальная хромосома никогда не изменяет своей длины и
толщины путем спирализации, а в расхождении дочерних хромосом не участвует
система микротрубочек. Вообще микротрубочки, играющие столь многообразную
роль в организации и функционировании эукариотической клетки, у прокариот до
сих пор не были обнаружены.
Так как каждая клетка обладает хотя бы одной копией генетического
материала, репликация ДНК и клеточное деление должны быть тесно
скоординированы. У Е. coli при 37 градусах деление происходит через 20 минут
после завершения репликации. За это время генетический материал должен быть
распределен между дочерними клетками для разделения копий - белки ParA, ParB,
MukB и некоторые другие. ParA, ParB локализованы на полюсах перед делением,
возможно, сходны с митотическим аппаратом. Движение ДНК может быть
результатом роста мембраны и синтеза клеточной стенки. После разделения копий
формируется поперечная стенка/септа. Для запуска репликации клетка должна
достигнуть порогового размера или начальной массы. Репликация+деление = 40
минут.
У грамотрицательных микроорганизмов, таких как Е. coli, деление происходит
при сокращении слоев существующей оболочки, с последующим разрывом
образующейся перемычки. У других бактерий, например, у грамположительных В.
subtilis, новообразованные кольцевые структуры материала клеточной стенки растут
внутрь клетки, образуя перегородку. Когда образование перегородки завершилось,
между сестринскими клетками образуется двойная мембрана, но клетки остаются
связанными друг с другом. Разделение клеток представляет собой самостоятельное
событие, которое включает в себя автолиз материала перегородки. В зависимости от
условий роста, автолиз перегородки может происходить достаточно медленно и
сопровождаться возникновением длинных цепей связанных между собой клеток.
При
выделении
и
характеристике
мутантов
fis
(филаментарные
температурочувствительные мутации) был идентифицирован ряд генов, необходимых
для деления. Клетки мутантов fis при непермиссивной температуре растут в виде
длинных неделящихся филаментов. У большинства бактерий обнаружено около 8
генов fis. Интересным оказалось наблюдение Люткенхауза, который обнаружил, что
белок FtsZ образует кольцеобразные структуры непосредственно под клеточной
мембраной на месте деления. Затем к этому «Z-кольцу» в определенном порядке
подходят остальные белки деления. Этот процесс для клеток Е. coli представлен на
рисунке ниже. Функции большинства этих белков неизвестны.
Ключевой белок деления, FtsZ, представляет собой гомолог тубулина эукариот,
белка, входящего в состав цитоскелета и формирующего микротрубочки. Подобно
тубулину, этот белок является ГТФазой и в присутствии ГТФ полимеризуется с
образованием линейных прото-филаментов, in vitro, формирующих пучки и плоские
структуры. Кольцевая структура белка FtsZ крайне динамична, и in vivo постоянно
подвергается переформированию (с полупериодом <10 с!). В этом отношении белок
напоминает тубулин эукариот.
Рис.9.3. Деление прокариотических клеток.
В Z-кольце с белком FtsZ непосредственно взаимодействует белок FtsA, функция
которого, вероятно, состоит в стабилизации кольца. Белок FtsA напоминает актин
клеток эукариот, однако обладает дополнительным доменом, функции которого
неизвестны. Этот белок образует димеры, но, по-видимому, не полимеризуется. Хотя
он не участвует в формировании Z-кольца, клетки двойного мутанта, дефектного по
белкам FtsA и ZipA, не способны образовывать кольцевые структуры. Таким образом,
функции белков FtsA и ZipA частично перекрываются, и, по крайней мере, один из
них необходим для стабилизации Z-кольца. Также показано, что белок ZipA
непосредственно взаимодействует с FtsZ и, в отличие от последнего и FtsA,
представляет собой трансмембранный белок. Поэтому ZipA может обеспечивать
сопряжение Z-кольца с клеточной мембраной.
Остальные белки деления представляют собой трансмембранные белки.
Функции белков FtsL и FtsQ неизвестны. Белок FtsW, вероятно, поставляет
предшественники для белка FtsI, который является ферментом, участвующим в
синтезе перегородки. Последний обладает способностью связывать пенициллин и
взаимодействует с аппаратом синтеза клеточной стенки, функционирующим при
делении. Белки FtsK и FtsN необходимы для деления клеток Е. coli, однако у B.
subtilis гомолог белка FtsK (SpoIIIE) не участвует в делении, а гомолог белка FtsN у
этих клеток отсутствует.
Между двумя хорошо изученными микроорганизмами, Е. coli и В. subtilis,
существуют интересные различия в процессе сборки белков деления. Так, у E. coli
этот процесс носит почти линейный характер, в то время как у В. subtilis сборка
белков на Z-кольцевой структуре является взаимозависимой. Эти различия, вероятно,
отражают различную организацию клеточной оболочки у грамотрицательных и
грамположительных микроорганизмов. Пока мы мало знаем о том, каким образом
полностью собранный аппарат деления влияет на цитокинез, и выяснение этих
вопросов представляет собой обширное поле деятельности для исследователей.
Деление контролируется, главным образом, на уровне образования кольца FtsZ.
Предполагают, что положение сайта деления, и, вероятно, протекание этого процесса
во времени находятся под контролем двух факторов: блокирования нуклеоидом и
системы Min. Оба этих фактора обеспечивают наступление деления только после
завершения репликации ДНК, а также одинаковую величину образующихся клеток.
Деление контролируется, главным образом, на уровне образования кольца FtsZ.
Предполагают, что положение сайта деления, и, вероятно, протекание этого процесса
во времени находятся под контролем двух факторов: блокирования нуклеоидом и
системы Min. Оба этих фактора обеспечивают наступление деления только после
завершения репликации ДНК, а также одинаковую величину образующихся клеток.
Фактор блокирования нуклеоидом исследован недостаточно. Он проявляется в
том, что из-за своего объема нуклеоид может предотвращать деление. Поэтому
деление клетки происходит только после завершения раунда репликации ДНК и
расхождения сестринских хромосом с образованием отдельных нуклеоидов. При
блокировании процессов репликации или сегрегации, присутствие нуклеоида в
середине клетки предотвращает образование перегородки. В принципе
отрицательный эффект нуклеоида может объясняться просто отсутствием в этой
области исключением из его состава белка FtsZ. При этом белок не накапливается до
критической концентрации, необходимой для его полимеризации.
Значимость фактора блокирования нуклеоидом для клетки представляет собой
потенциальную проблему, которая заключается в том, что полюса клетки (по крайней
мере у палочковидных бактерий) не защищены нуклеоидом, и поэтому возможно
наступление аберрантного полярного деления. Для предупреждения этого, у многих
бактерий присутствуют белки, входящие в систему Min, которая препятствует
делению на полюсах.Название этой системы происходит от названия мини-клеток,
образуемых мини-мутантами, для которых характерно деление на полюсах.
Ключевой эффектор системы Min представляет собой ингибитор клеточного
деления, который называется MinC. Этот белок обладает способностью ингибировать
образование Z-кольца, вероятно, непосредственно ингибируя полимеризацию FtsZ.
Активность MinC находится под контролем белка MinD. Вероятно, этот белок
контролирует внутриклеточную локализацию MinC по двум различным механизмам.
Один из них состоит в том, что MinD транспортирует MinC на периферию клетки
(ближе к цитоплазматической мембране) туда, где происходит сборка кольцевой
структуры FtsZ. Второй механизм заключается в том, что MinD ограничивает
активность MinC полюсами клетки, тем самым предотвращая наступление полярного
деления, но способствуя делению клетки по средней линии.
У многих палочковидных бактерий система MiniCD используется для контроля
за местонахождением сайта деления. Эта система хорошо охарактеризована у
бактерий Е. coli и В. subtilis. Интересно, что у двух этих микроорганизмов
существуют совершенно разные механизмы, посредством которых MinD
ограничивает эффект MinC на полюса клетки. У В. subtilis используется простой
механизм, при котором полярный якорный белок DivIVA транспортирует комплекс
MinCD к полюсам клетки и в течение всего клеточного цикла удерживает его там в
статичном положении. Как показано на рисунке ниже, DivIVA и MinD локализуются
у полюсов вновь образованной клетки, и присутствие ингибитора MiniC
предотвращает формирование FtsZ-кольца у полюсов.
По-видимому, после завершения репликации ДНК, в середине клетки создается
новый потенциальный сайт деления. Концентрация ингибитора MiniC у полюсов
позволяет провести сборку FtsZ-кольца в середине клетки и обеспечивает
мобилизацию других белков деления. В этот момент аппарат деления, вероятно,
становится нечувствительным к ингибирующему действию MinC Затем белки
DivIVA и MinD перемещаются на середину клетки. Поэтому, когда при делении
образуется новая пара клеточных полюсов, DivIVA встраивается в новые полюса и
образует новую область проявления ингибирующего эффекта MinCD. Когда
произошло сокращение оболочки, наступает разборка FtsZ-кольца, однако DivIVA и
MinCD остаются на вновь образованных полюсах, тем самым предотвращая деление
на этих полярных сайтах.
Таким образом, транспортировка DivIVA к сайту деления и затем его удержание
на полюсах клетки являются ключевыми событиями этого механизма.
Интересно, что белок DivIVA локализуется на сайтах деления, когда он
экспрессируется в эукариотических клетках (делящиеся дрожжи). Эта позволяет
предполагать, что DivIVA может узнавать топологические характеристики, например
кривизну мембраны, а не специфические белковые мишени.
В противоположность этому, в клетках Е. coli существует динамическая система
MinCD, которая на какое-то время собирает комплекс у одного полюса. Затем он
разбирается и собирается вновь у противоположного полюса. Так повторяется много
раз. Этим процессом управляет кольцо белка MinE, которое, в свою очередь, каждый
раз перемещается к тому или иному полюсу, смещая MinCD и обеспечивая ему
возможность собраться у противоположного полюса. Изменение локализации MinCD
от одного полюса к другому происходит с частотой порядка десятков секунд. Как
показано на рисунке ниже, MinD поочередно накапливается на периферии мембраны
с каждой стороны кольца MinE. Быстрое изменение локализации MinD не позволяет
кольцу FtsZ собраться на полюсах.
Присутствие MinE в центральной области исключает проявление там
ингибирующего эффекта MinD и дает возможность собраться в этом месте кольцу
FtsZ. Остается невыясненным, почему для контроля MinCD и установления полюсов
у Е. coli выработался такой энергетически невыгодный механизм.
MinD относится к интересной группе белков, обладающих общей функцией
связывания нуклеотидов, которая также включает белок разделения хромосом, ParA.
Близкий к ParA белок, Soj, также проявляет динамические свойства. Вероятно, общей
для этих белков является их способность связывать и гидролизовать нуклеотиды и
контролировать реакции полимеризации и деполимеризации. Это напоминает
механизм контроля динамической нестабильности актиновых филаментов и
микротрубочек у эукарио . Поэтому эти белки относятся еще к одному классу белков
цитоскелета бактерий, обладающих широкими функциями, которые особенно
связаны с вопросами морфогенеза на разных стадях клеточного цикла.
Недавно у грамположительных бактерий был идентифицирован белок,
участвующий в блокировании клеточного деления нуклеоидом. Это Noc,
представляющий собой белок, неспецифически связывающийся с ДНК, который
локализован в нуклеоиде. Он также является ингибитором клеточного деления. Если
не нарушена репликация хромосом, то мутанты noc растут нормальным образом. При
этом в noc- клетках деление происходит с участием нуклеоида, а клетки дикого типа
не делятся. Как показано на рисунке ниже, Noc и система MiniCD определяют
местоположение кольца FtsZ в середине клетки. В клетках дикого типа, DivIVA
запускает процесс полимеризации белка MinD, который распространяется от полюсов
к середине клетки вдоль мембраны.
Белок MinC, связанный с белком MinD, предотвращает накопление FtsZ или
полимеризацию поблизости от полюсов клетки. Предполагается, что белок Noc
связывается с нуклеоидом и ингибирует накопление FtsZ или проявление его
активности поблизости от нуклеоида. В клетках noc-, система Min предотвращает
сборку кольца FtsZ, исключая область середины клетки, и клетки растут нормально.
Однако у min- клеток Noc ингибирует сборку FtsZ только вокруг нуклеоида, и FtsZ
образует кольцевую структуру в середине клетки и на полюсах, где нет нуклеоида. У
клеток с отсутствующими топологическими ингибиторами (двойные мутанты minnoc-) сборке FtsZ ничего не препятствует, и по всей клетке образуются
многочисленные вкрапления, состоящие из этого белка. Их образование приводит к
утрате клеткой способности к делению. У грамотрицательных бактерий Noc
отсутствует, однако у Е. coli обнаружен белок, контролирующий систему
блокирования деления нуклеоидом по механизму, аналогичному Noc.
Рисунок.9.4 Сборка белков деления в клетке Е. coli. Белки FtsZ образуют
кольцевую структуру, к которой в указанном порядке присоединяются остальные
белки. Порядок присоединения белков установлен методами молекулярной генетики.
Рисунок.9.5 Отрицательная пространственная регуляция клеточного деления за
счет блокирующего эффекта нуклеоида.
Рисунок 9.6. Локализация ключевых белков в сайте деления на разных стадиях
клеточного цикла, начиная со новообразованных клеток и заканчивая делением, в
результате которого образуются две дочерних клетки. На срезах показаны половины
каждой клетки, но целые кольцевые структуры FtsZ и MinC. Для простоты нуклеоиды
не показаны.
Рисунок.9.7. Модель пространственного контроля аппарата клеточного деления
у грамположительной бактерии В. subtilis.
ТЕМА 10
СПОРУЛЯЦИЯ БАКТЕРИЙ. МОРФОЛОГИЯ И РОЛЬ АКТИВАТОРОВ
Процесс споруляции (спорообразования) начинается сразу после возникновения
дефицита питательных веществ и продолжается приблизительно 8 ч. Никаких
внешних источников питания или энергии при этом не требуется. Споруляцию
стимулирует внесение в среду глюкозы, фосфора и NH4; угнетает внесение пептона,
лактозы, NaCl, CaCl2 (у бактерий рода Bacillus— DL-аланина).
Споруляция контролируется особыми генами. Их число вариабельно у
различных видов и может достигать 70. Детали спорообразования служат видовыми
признаками, но его принципиальные закономерности одинаковы для всех бактерий.
1.
Подготовительная
стадия споруляции
сопровождается
прекращением деления и увеличением количества липидных включений.
2.
Стадия предспоры споруляции обычно начинается бурно. В клетке
появляется эллиптическая оболочка, окружающая участок цитоплазмы с
изменѐнными плотностью и тинкториальными свойствами. Подобное
образование обозначают терминами «предспора», или «примордиальная
спора».
3.
Третья стадия споруляции включает появление оболочки (обычно в
течение 10 мин после образования предспоры) и ещѐ большее увеличение
коэффициента светопреломления.
4.
Стадия созревания споры сопровождается еѐ уплотнением и
снижением метаболической активности клетки.
Поскольку споры сильно преломляют свет, то распознавание их при
микроскопии не представляет затруднений, В спорных случаях прибегают к
специальным методам окрашивания.
Прорастание спор бактерий. Активация споры. Покоящиеся ( некультивируемые
) формы бактерий.
После созревания и лизиса родительской клетки спора освобождается,
сохраняясь в покоящемся состоянии до попадания в благоприятные условия.
• Прорастание споры в оптимальных условиях осуществляется в течение 2-3 ч;
процент проросших спор увеличивается после соответствующей предварительной
обработки.
Например,
споры
могут
быть активированы кратковременным
прогреванием.
Споры кислотоустойчивы, поэтому окрашиваются по методу Ожешки или по
методу Циля-Нильсена в красный, а вегетативная клетка в синий цвет.
Спора долго сохраняется из-за наличия многослойной оболочки, дипиколината
кальция, низкого содержания воды и вялых процессов метаболизмов. В
благоприятных
условиях
споры
прорастают,
проходя
три
последовательные стадии: активация, инициация, прорастание.
• Прорастанию предшествует активация споры. Еѐ инициируют различные
химические вещества, повышение температуры и влажности. Под воздействием
автолизинов происходит расщепление кортекса, поглощение воды и набухание.
Внешне процесс проявляется увеличением («вздутием») споры и уменьшением
коэффициента светопреломления. При этом в споре происходят глубокие
физиологические изменения: усиливается дыхание, увеличивается активность
ферментов, происходит выделение аминокислот, дипиколиновой кислоты и пептидов
(потеря сухой массы споры может достигать 20-30%). В этот период спора утрачивает
терморезистентность.
Затем спора лопается в произвольном месте и из неѐ выходит вегетативная
клетка, снабжѐнная у подвижных видов жгутиковым аппаратом.
Покоящиеся ( некультивируемые ) формы бактерий
Специализированные анабиотические формы (такие как эндо- и экзоспоры,
миксоспоры, цисты) известны лишь для ограниченного круга микроорганизмов.
Однако как у спорообразующих микроорганизмов (Bacillus cereus) на фоне
подавления спорообразования, так и у споронеобразующих (Pseudomonas
carboxidoflava, Micrococcus luteus, Escherichia coli) бактерий внеклеточные микробные
метаболиты, проявляющие свойства индукторов анабиоза, вызывают образование
цистоподобных рефрактерных клеток (термин связан с переходом целой клетки в
покоящуюся форму с увеличенной способностью данных клеток по сравнению с
обычными сильно преломлять свет).
В этих клетках снижение метаболической активности (гипометаболизм)
сопровождается развитием резистентности к экстремальным воздействиям. Эти
формы отличаются нерегистрируемым уровнем эндогенного дыхания, повышенной
терморезистентностью и специфической ультраструктурой. По сравнению с
вегетативными клетками, цистоподобные рефрактерные клетки обладают рядом
особенностей ультраструктурной организации: у них снижена плотность рибосом в
цитоплазме, цитоплазма приобретает мелкозернистую структуру, увеличена толщина
клеточной стенки, в самой клеточной стенке появляются слоистость и некоторые
плотные включения. Для споронеобразующих микроорганизмов цистоподобные
рефрактерные клетки — единственная покоящаяся форма, способная сохраняться в
течение нескольких лет, а для спорообразующих бактерий — альтернатива
спорообразования. Рефрактерные клетки невозможно выявить с помощью
традиционных бактериологических подходов.
Капсула микроорганизмов
Капсула возникает благодаря способности ряда бактерий (как сапрофитов, так и
патогенных) создавать снаружи клеточной стенки скопление слизистого вещества.
Образование капсулы часто является признаком вирулентности для патогенных
бактерий, так как она позволяет клетке противостоять воздействию защитных
механизмов макроорганизма. Такие бактерии образуют капсулу в организме
(например, пневмококк, возбудитель сибирской язвы) и утрачивают это свойство при
культивировании на питательных средах. Группа патогенных микроорганизмов,
получивших название «капсульные бактерии», образует капсулу независимо от
условий существования: и в организме, и при культивировании на питательных
средах.
Химический состав капсул различен: полисахариды у пневмококков,
преимущественно полипептиды у возбудителя чумы. При микроскопии препаратов,
содержащих бактерии в капсулах, последние имеют вид бесцветного ореола,
окружающего клетки, так как вещество капсул плохо воспринимает красители.
Микроорганизмы, у которых не выявляется четкой капсулы, могут содержать
аналогичную структуру, обнаруживаемую в виде очень тонкого поверхностного слоя,
получившего название микрокапсулы. Микрокапсула хорошо видна под электронным
микроскопом.
В чистых культурах бактерий капсула образуется реже. Она выявляется при
специальных методах окраски мазка (например, по Бурри-Гинсу), создающих
негативное контрастирование веществ капсулы: тушь создает темный фон вокруг
капсулы. Капсула гидрофильна, препятствует фагоцитозу бактерий. Капсула
антигенна: антитела против капсулы вызывают ее увеличение (реакция набухания
капсулы).
От капсулы следует отличать слизь - мукоидные экзополисахариды, не имеющие
четких границ. Слизь растворима в воде.
Бактериальные экзополисахариды участвуют
субстратам), их еще называют гликокаликсом.
в
адгезии (прилипании
к
Культуральные свойства бактерий
К культуральным или макроморфологическим свойствам относятся характерные
особенности роста микроорганизмов на плотных и жидких питательных средах. На
поверхности плотных питательных сред в зависимости от посева микроорганизмы
могут расти в виде колоний, штриха или сплошного газона.
Колонией называют изолированное скопление клеток одного вида, выросших из
одной клетки (клон клеток). В зависимости от того, где растет микроорганизм (на
поверхности плотной питательной среды, в толще ее), различают поверхностные,
глубинные и донные колонии.
Колонии, выросшие на поверхности среды, отличаются разнообразием, они
видоспецифичны и их изучение используется для определения видовой
принадлежности исследуемой культуры.
При описании колоний учитывают следующие признаки:
форму колонии - округлая, амебовидная, ризоидная , неправильная и т.д.;
размер (диаметр) колонии - очень мелкие (точечные) (0,1-0,5 мм), мелкие (0,5-3
мм), средних размеров (3-5 мм) и крупные (более 5 мм в диаметре);
поверхность колонии - гладкая, шероховатая, складчатая, морщинистая, с
концентрическими кругами или радиально исчерченная;
профиль колонии - плоский, выпуклый, конусовидный, кратерообразный и т.д.;
прозрачность - тусклая, матовая, блестящая, прозрачная, мучнистая;
цвет колонии (пигмент) - бесцветная или пигментированная (белая, желтая,
золотистая, красная, черная), особо отмечают выделение пигмента в среду с ее
окрашиванием;
край колонии - ровный, волнистый, зубчатый, бахромчатый и т.д.;
структура колонии - однородная, мелко или крупнозернистая, струйчатая; край и
структуру колонии определяют с помощью лупы или на малом увеличении
микроскопа, поместив чашку Петри с посевом на столик микроскопа крышкой вниз;
консистенция колонии - определяют прикасаясь к поверхности петлей, колония
может быть плотной, мягкой, врастающей в агар , слизистой (тянется за петлей),
хрупкой (легко ломается при соприкосновении с петлей).
Глубинные колонии чаще всего похожи на более или менее сплющенные
чечевички (форма овалов с заостренными концами), иногда комочки ваты с
нитевидными выростами в питательную среду. Образование глубинных колоний
часто сопровождается разрывом плотной среды, если микроорганизмы выделяют газ.
Донные колонии имеют обычно вид тонких прозрачных пленок, стелющихся по
дну.
Описание роста микроорганизмов при посеве штрихом включает его
особенности: скудный, умеренный, обильный; сплошной с ровным или волнистым
краем; диффузный; перистый; ризоидный ; древовидный. Характеризуют цвет,
поверхность, консистенцию.
Особенности колонии могут изменяться с возрастом, они зависят от состава
среды, температуры культивирования.
Рост микроорганизмов на жидких питательных средах учитывают, используя 4-7
суточные культуры, выращенные в стационарных условиях.
В жидких питательных средах при росте микроорганизмов наблюдается
помутнение среды, образование пленки или осадка.
Рост бактерий с равномерным помутнением среды , что характерно для
факультативных анаэробов. Степень помутнения может быть слабая, умеренная,
сильная.
Придонный рост бактерий характеризуется образованием осадка: скудного,
обильного, рыхлого, слизистого, хлопьевидного, зернистого. Питательная среда
может быть прозрачной или мутной.
Пристеночный рост - образование зерен, рыхлых хлопьев на внутренней
поверхности стенок сосуда. Питательная среда при этом остается прозрачной.
Поверхностный рост бактерий характеризуется появлением на поверхности
среды пленки: тонкой, плотной, рыхлой, гладкой, складчатой, влажной, сухой,
кольцеобразной, сплошной. Такой рост наблюдается при культивирован ии аэ робных
бактерий.
При росте на полужидких (0,5-0,7% агара ) питательных средах подвижные
микробы вызывают выраженное помутнение, неподвижные формы растут только по
ходу посева уколом в среду.
Нередко рост микробов сопровождается появлением запаха, пигментацией
среды, выделением газа. Характерный запах культур некоторых видов бактерий
связан с образованием различных эфиров ( уксусноэтилового , уксусноамилового и
др.), индола, меркаптана, сероводорода, скатола, аммиака, масляной кислоты.
Способность образовывать пигменты присуща многим видам микроорганизмов.
Химическая природа пигментов разнообразна: каротиноиды , антоцианы, меланины.
Если пигмент не растворим в воде, окрашивается только культуральный налет, если
же он растворим, окрашивается и питательная среда. Считается, что пигменты
защищают бактерии от губительного действия солнечных лучей, поэтому в воздухе
так много пигментированных бактерий, кроме того, пигменты участвуют в обмене
веществ этих микроорганизмов.
В природе существуют, так называемые, фосфоресцирующие бактерии,
культуры которых светятся в темноте зеленовато-голубоватым или желтоватым
светом. Такие бактерии встречаются, главным образом, в речной или морской воде. К
светящимся бактериям - фотобактериям - относятся аэробные бактерии (вибрионы,
кокки, палочки).
ТЕМА 11
СЕКРЕЦИЯ БЕЛКОВ
Секретируемые белки и их расположение.
Около 20% всех белков, продуцируемых бактериями, локализованы вне
цитоплазмы.
Секреция белков за пределы цитоплазмы является важнейшей способностью
вирулентных бактерий, поскольку большинство стадий процесса инфекции
представляет собой ту или иную форму взаимодействия с внешней средой, и многие
белковые продукты должны либо располагаться на внешней поверхности бактерии,
либо секретироваться во внешнюю среду. Кроме того, секреция белков имеет
важнейшее значение для биотехнологии, поскольку очистка белков из культуральной
среды простого состава значительно проще, чем из клеточных лизатов, являющихся
сложной смесью большого числа различных веществ. В связи с таким значением
секреции этот процесс интенсивно изучается. Одним из непредвиденных результатов
такого изучения стало обнаружение нескольких путей экспорта белков. Анализ
родственных связей между белками, входящими в состав различных систем секреции
у разных организмов позволил разбить эти системы на несколько групп, внутри
которых механизм секреции идентичен или очень схож. Сейчас выделяют пять
основных типа секреции, которые мы по очереди и разберем. Интересно, что
компоненты секреции трех из пяти типов секреторных систем имеют значительное
сходство с белками, участвующими в сборке жгутиков и ворсинок (пилей).
К сожалению, иногда в литературе по секреции не очень четко используются
термины, в связи с чем не всегда понятно, о каком типе транспорта через мембраны
идет речь. Поэтому здесь мы будем пользоваться следующими терминами для
дифференциации
основных
секреторных
путей
по
месту
назначения
транспортируемого белка:

секреция – транспорт белка в окружающую среду. В случае
грамотрицательных бактерий для этого белку необходимо преодолеть две мембраны
– цитоплазматическую и внешнюю.

экспорт - выведение белка за пределы цитоплазмы. Термин используется
исключительно для грамотрицательных бактерий. Результатом экспорта является
транспорт белка в периплазматическое пространство.

транслокация – доставка белка патогенными бактериями в
эукариотическую клетку хозяина. В случае грамотрицательных бактерий этот тип
транспорта требует преодоления уже трех мембранных барьеров – двух
бактериальных и одного эукариотического.
Важной проблемой секреции является направление секретируемого белка к
месту его назначения.
Секретируемые белки могут оказываться в различных местах:

быть полностью встроенными в цитоплазматическую мембрану
(интегральные мембранные белки, каковыми является большинство мембранных
транспортеров);

быть "заякоренными" в цитоплазматической мембране при помощи
трансмембранного гидрофобного сегмента (практически всегда N-концевого), к
этому классу принадлежит большинство периплазматических белков;

полностью находиться в периплазме;

быть полностью встроенными во внешнюю мембрану (порины);

заякориваться во внешней мембране так, что основная масса белка
располагается либо снаружи
(чаще всего) либо в периплазматическом пространстве;

во внешней среде (собственно секретируемые белки, к которым
принадлежит большинство гидролитических ферментов патогенов);

ассоциированными с мембраной эукариотической клетки (некоторые
компоненты аппарата секреции III типа)

внутри другой клетки, как правило эукариотической (большинство
субстратов секреции III и IV
типов)
И во всех этих случаях место конечной дислокации белка определяется его
аминокислотной последовательностью – секреторные системы распознают
определенные консервативные последовательности (мотивы) и направляют
секретируемый белок в соответствии с записанной в этих мотивах информацией.
Типичным примером того, как сложно бывает клетке определить назначение белка,
является транспорт через внутреннюю мембрану интегральных мембранных белков и
субстратов Sec-системы (части аппарата секреции II типа).
Для обоих классов белков сигналом их локализации являются довольно
протяженные участки гидрофобных аминокислот (порядка 20 АК остатков). Такие
-спиральную конформацию, способны легко встраиваться в
липидный бислой (поскольку на наружной поверхности такой спирали располагаются
исключительно гидрофобные боковые группировки, а длина спирали как раз
соответствует толщине липидного бислоя). Судьба белка будет зависеть от того, с
каким из секреторных шаперонов – белком SecB (о котором мы поговорим чуть
позже) или рибонуклеопротеидным комплексом SRP – провзаимодействует
секретируемый белок.
Бактериальная "частица, распознащая сигналы" (signal recognition particle, SRP)
является упрощенным аналогом эукариотической частицы с таким же названием. В
клетках
млекопитающих
все
секретируемые
белки
направляются
в
эндоплазматический ретикулум при помощи одного механизма, основой которого и
является SRP. Эукариотическая SRP – крупный рибонуклеопротеидный комплекс,
состоящий из 6 полипептидов и молекулы РНК длиной 300 рибонулеотидов. Сначала
54 kDa субъединица SPR (SRP54) узнает специфические гидрофобные сигналы сразу
после того, как они выходят с транслирующей рибосомы. Такими сигналами
являются либо N-концевые отрезаемые сигнальные последовательности либо первый
трансмембранный сегмент. Как только SPR свяжется с сигналом локализации,
комплекс
рибосома-мРНК-полипептид
мигрирует
к
эндоплазматическому
ретикулуму, где взаимодействие между SPR и гетеродимером рецептора SPR (SR)
катализирует высвобожбение синтезирующегося полипептида из комплекса и его
инсерцию в транслокационный канал.
У прокариот интегральные мембранные и прочие секретируемые белки
движутся к внутренней мембране по различным путям. Интегральные мембранные
белки направляются к внутренней мембране при помощи бактериального варианта
SPR. У бактерий SRP состоит всего из двух компонентов: белка Ffh - гомолога SPR54
и более короткой (около 100 нуклеотидов) РНК (4.5S РНК), а SR (рецептор SRP)
-субъединицы эукариотического SR - белка FtsY.
Несмотря на существенные структурные отличия, биохимические свойства
бактериальной SRP сходны с эукариотическим аналогом. Как и у эукариот, SRP из E.
coli котрансляционно распознает трансмембранные сегменты как секреторные
маркеры. С другой стороны, многие секретируемые белки направляются к аппарату
секреции молекулярными шаперонами, такими как DnaK или (чаще) SecB.
Первая стадия реакции требует присутствия специфичных для секреции
шаперонов - SecB и рибонуклеотидного комплекса называемого signal recognition
particle (SRP), который состоит из белка Ffh и 4.5S РНК.
SecB и SRP узнают каждый свою часть секретируемых белков. Функция SRP
наиболее существенна при экспорте интегральных мембранных белков. Самые
последние экспериментальные данные свидетельствуют в пользу того, что для
транспорта интегральных мембранных белков (не имеющих протяженных
цитоплазматических или периплазматических петель) достаточно только SRP (вместе
с ее рецептором SR), а ни один из Sec белков не нужен.
Выбор SRP или SecA/SecB пути происходит "на выходе" синтезирующейся
белковой цепи из рибосомы. Бактериальная SRP селективно распознает белки
внутренней мембраны по их протяженным трансмембранным сегментам. А сходное
взаимодействие SRP с менее гидрофобными и более короткими сигнальными
последовательностями секретируемых белков, возможно, предотвращается
ассоциированным с рибосомами шапероном триггерным фактором, который сильно
связывается с цитоплазматическими и секретируемыми белками, но не
взаимодействует с белками внутренней мембраны. Секреторные шапероны успешно
распознают более короткие и менее гидрофобные трансмембранные сегменты
сигнальных пептидов и направляют содержащий их белок к секреторному аппарату.
Основная проблема, решаемая всеми секреторными системами – обеспечить
прохождение через гидрофобную мембрану длинной полипептидной цепи,
содержашей значительные гидрофильные участки, и к тому же в нативном состоянии
свертутой в громоздкую структуру. Именно поэтому, несмотря на то, что транспорт
идет по градиенту концентрации, все секреторные системы расходуют энергию АТФ
– на решение конформационных проблем. В решении конформационных проблем
также участвует особый класс белков – секреторные шапероны. От уже изветных вам
шаперонов GroE/DnaK секреторные отличаются участием исключительно в процессе
секреции, и их функцией является задержка фолдинга секретируемых белков.
Большинство секретируемых белков являются глобулярными и в полностью
свернутом виде они просто не в состоянии преодолеть мембрану. Секреторные
шапероны, как правило, связываются с предназначенным для секреции белком сразу
же после его схода с рибосомы и не дают ему принять окончательную конформацию.
Секреторный шаперон фактически доставляет белок с рибосомы к секреторному
аппарату. Кроме того, для "разворачивания" (денатурации) белка, которая
понадобилась бы, не будь секреторных шаперонов, необходима энергия, и
секреторные шапероны ее экономят. Наконец, в некоторых случаях секреторные
шапероны определяют специфичность секреторного аппарата. Так, в случае системы
секреции III типа многие ее субстраты опознаются не сами по себе, а по шаперону, с
которым они связаны. Очевидно, что в таком случае шапероны должны обладать
высокой специфичностью. И действительно, для секреторных шаперонов аппарата
секреции III типа субстратом является один, реже два белка. И в случае других
секреторных шаперонов им в целом характерна большая избирательность по
отношению к субстрату по сравнению с шаперонами HSP60/HSP70.
Интересно заметить, что эукариоты не имеют секреторных шаперонов по той
простой причине, что секреция белка у них сопряжена с трансляцией – синтезируемая
белковая цепь сразу, не успев принять свою нативную конформацию, попадает в
секреторный канал. Прокариоты не могут воспользоваться таким механизмом,
поскольку у них рибосомы присутствуют в огромном избытке по отношению к
мембранным транслоказам (у эукариот такого избытка нет из-за гораздо большей
поверхности эндоплазматического ретикулума) и сопряжение секреции с
трансляцией привело бы к существенному снижению скорости синтеза белка.
Секреторный аппарат первого типа.
Белки, секретируемые по первому пути, не имеют сигнальных пептидов и не
используют т.н. общий секреторный путь (GSP), зависимый от sec генов. Эти белки в
процессе секреции полностью
минуют периплазму и секретируются непосредственно во внешнюю среду.
Секреторный аппарат первого типа устроен относительно просто. Во всех случаях он
состоит из трех белков. Первый принадлежит к классу АТФаз, называемых ABC
транспортерами и обеспечивает энергозависимые стадии процесса транспорта. Этот
белок является цитоплазматическим и ассоциированным с димерным белком,
обеспечивающим слияние цитоплазматической и наружной мембраны и фактически
образующим канал, через который и транспортируется секретируемый белок. И
третий белок- швейцар (gatekeeper) локализован во внешней мембране. Его функция запирать мембранный канал, когда субстрат отсутствует.
Как правило, гены, кодирующие все три компонента секреторного аппарата,
организованы в оперон, обычно вместе с геном (генами), кодирующим
секретируемый белок. Секреторный
Специфичность
Несколько систем в одной бактерии. Субстраты
Сигнал для секреции через аппарат 1-го типа располагается в их C-конце,
обычно в пределах последних 60 АК. Секреторный аппарат опознает характерную
последовательность вторичной структуры - две альфа-спирали, соединенные между
собой гибким линкером.
Рис.11.1 Секреторный аппарат первого типа
Секреторный аппарат второго типа (GSP).
Из всех систем секреции только эта, а точнее, ее часть, ответственная за экспорт
белков в периплазму - Sec система, - является необходимой для жизнеспособности клетки;
гомологичные экспортные системы были найдены у архей и эукариот. Через секреторный
аппарат II типа транспортируются разнообразные белки, такие как пектатлиазы,
полигалактуроназы, пектинметилэстеразы и целлюлазы у эрвиний (по нескольку
изоферментов каждого класса); полигалактуроназа, целлюлаза, протеаза и амилаза у
Xanthomonas campestris; липаза, фосфолипаза, эластаза, энтеротоксин А и щелочная
фосфатаза у Pseudomonas aeruginosa; пуллуланаза у Klebsiella oxytoca. Именно в связи с
большим числом и разнообразием субстратов, секретируемых через аппарат II типа его
зачастую называют "общим секреторным путем" (General Secretory Pathway, GSP).
Характерной чертой аппарата второго типа является секреция белков в две стадии.
Сначала они экспортируются через цитоплазматическую мембрану, где в случае Грамположительных бактерий их секреция и заканчивается. В случае Грам-отрицательных
бактерий белки оказываются в периплазме, и либо остаются там (и тогда говорят не о
секреции, а об экспорте), либо встраиваются во внешнюю мембрану, либо секретируются
во внешнюю среду посредством одной из терминальных ветвей GSP.
Sec система.
В отличие от секреции у эукариот, секреция через бактериальную плазматическую
мембрану протекает в основном посттрансляционно. Работу Sec системы можно разделить
на три стадии:
- направление белка на транспорт
- собственно транслокация белка через мембрану
- освобождение
транспортированного
белка
на
периплазматической
стороне
мембраны
На первой стадии пребелки направляются к точкам секреции в цитоплазматической
мембране (местам, где собран транслокационный комплекс). На второй стадии
полипептидная цепочка пересекает липидный бислой, скорее всего через транслоказу.
Рис. 11.2 Sec-система
На третьей стадии транслоцированный полипептид освобождается и либо принимает
свою нативную конформацию,
либо направляется для дальнейшей секреции в одну из
терминальных ветвей GSP.
Как минимум 10 белков необходимы для работы Sec системы (Рис. 13.2). Первая
стадия реакции требует присутствия специфичного для секреции шаперона SecB. Этото
шаперон является тетрамером, опознает белки, содержащие
сигнальный пептид, и
связывается с ними, выполняя
фактически
функцию
молекулярного
шаперона,
связываясь с областями пресекреторных белков, не принявшими свою окончательную
конформацию и поддерживая их в компетентном для транслокации состоянии. Второй
функцией SecB является "доставка" предшественников белков к SecA субъединице
мембранной транслоказы. В некоторых случаях могут привлекаться гомеостатические
шапероны GroEL и DnaK.
Вторая стадия реакции катализируется сложным белковым комплексом,
расположенным в цитоплазматической мембране - транслоказой. Транслоказа содержит
пронизывающий мембрану канал, состоящий из субъединиц трех белков, SecY, SecE и
SecG. Эти три белка являются интегральными мембранными белками, составляющими
структурную основу транслоказы - каркас или раму. SecY - интегральный мембранный
белок (10 НТМ - стр-ра подобная мембр транспортерам, напр, LacY). SecE имеет три
трансмембранных сегмента, SecD и SecF - шесть. А «мотором» транслокационный машины
служит АТФаза SecA. Этот белок уникален для бактерий - эукариоты используют другую
транслокационную АТФазу. SecA - большая вытянутая димерная молекула, содержащая
два домена - амино-концевой АТФазный и карбокси-конец, необходимый для димеризации.
Карбокси-концевой домен позволяет SecA связаться с SecYEG, что создает
функциональную основу транслоказы. Дополнительные субъединицы транслоказы SecD и
SecF оптимизируют секреторную реакцию. Источником энергии для секреции служит АТФ
и протондвижущая сила (ускоряет транслокацию).
Сигналом для секреции служит т.н. лидерная или сигнальная последовательность,
отщепляемая после транслокации специфической сигнальной пептидазой. Есть несколько
сигнальных пептидаз, каждая из которых отщепляет сигнальные пептиды специфического
класса секретируемых белков:
Сигнальная последовательность:
++hhhhhhhhhhhhhhhh(PG)NNANAPOor- (LepB - основная)
++hhhhhhhhhhhhhLNACDOor- (LspA - для липопептидов)
++QRGFhhhhhhhhhhhhNNNNNN (GspO)
^
Сигнальная последовательность липопротеинов обязательно содержит цистеин,
который модифицируется до глицерилцистеина перед отрезанием сигн. пептида, и именно
здесь затем присоединяются жирные кислоты.
Сигнальные пептиды отрезаются лидерной пептидазой в момент транспорта белка
через цитоплазматическую мембрану.
SecB направляет связанный белковый предшественник к мембранной транслоказе,
связываясь с SecA, ассоциированным с SecYEG. Кроме того, после такого связывания
сигнальный пептид связывается с карбокси-концевым доменом SecA, что еще более
усиливает взаимодействие SecA-SecB. Это взаимодействие вызывает высвобождение
зрелой части белкового предшественника из комплекса с SecB. Пре-белок таким образом
переносится от SecB к SecA.
SecA (мутанты нежизнеспособны). Димер. АТФаза. Гидрофильный белок, но часто
обнаруживается в ассоциации с мембраной и рибосомами. В определенных условиях in
vitro присутствия только белка SecA может быть достаточно для транслокации белков через
мембрану. Присутствует в клетке в большом избытке по сравнению с другими Sec-белками.
Связывается сильно с SecY.
Периплазма
После экспорта в периплазму Sec-системой некоторые белки могут здесь и
задержаться (причем большинство периплазматических белков олажется заякоренным в
цитоплазматической мембране). Часть белков, однако, следует дальше и секретируется во
внешнюю среду, причем такая секреция может осуществляться как минимум тремя
различными способами.
Выход белка в периплазму в чем-то похож на его выход с рибосомы. Белок проходит
через Sec- аппарат практически в полностью развернутом состоянии, поэтому перед ним
вновь возникает проблема фолдинга. И, хоть большинство секретируемых белков способны
сами справиться с этой проблемой, в периплазме, так же как и в цитоплазме, присутствуют
шапероны. Кроме классических шаперонов фолдингу способствуют еще и белки DsbA и
DsbC, являющимися дисульфидизомеразами. Функцией этих белков является образование
дисульфидных мостиков между цистеиновыми остатками. Дисульфидные связи
присутствуют у многих секретируемых белков. Такие связи обычно стабилизируют
третичную структуру белка и совершенно необходимы для его функционирования.
Дисульфидные мостики не могут образоваться в восстановительной среде цитоплазмы (к
тому же появление таких связей препятствовало бы секреции), поэтому они образуются в
периплазме, чему и способствуют ферменты DsbA и DsbC. Если зрелый белок должен
содержать дисульфидные связи, без их образования под действием DsbAC секреция за
пределы периплазмы, как правило, невозможна.
Основная терминальная ветвь GSP
JMB659 –GspEL interaction, good intro
Секреция во внешнюю среду белков, имеющих периплазматические интермедиаты,
может происходить несколькими путями, называемыми "терминальнуми ветвями общего
секреторного пути". Мы разберем работу только одного пути, который считают основным.
Рис.11.3 Основная терминальная ветвь общего секреторного пути
Основная терминальная ветвь GSP лучше всего изучена у клебсиелл и эрвиний. У
обоих бактерий (впрочем, как и у всех остальных, изученных в этом отношении) все гены,
кодирующие компоненты терминальной ветви, собраны в один кластер размером 13-15
т.п.н., в котором локализовано 12-15 генов. По историческим причинам эти гены
называются по-разному – pul у клебсиелл, out у эрвиний, но мы будем пользоваться
аббревиатурой gsp, принятой у некоторых бактерий и наилучшим образом отражающей
функцию этих генов. Мутанты по gsp генам акапливают в норме секретируемые продукты
в периплазме, что свидетельствует в пользу того, что первая стадия (экспорт) проходит у
таких мутантов нормально, и аппарат gsp нужен только для транспорта через внешнюю
мембрану. Поэтому логично было бы предположить, что белки Gsp будут локализованы во
внешней мембране или в периплазме. К удивлению исследователей, большая часть этих
белков опронизывает цитоплазматическую мембрану, а один (GspE) вообще локализуется в
цитоплазме.
В
большинстве
случаев (GspGHIJKMN) белки имеют битопную
конформацию с цитоплазматически локализованным N-концом и периплазматическим Cконцом, причем большая часть белка локализуется все-таки в периплазме. GspL имеет
такую же топологию, но с большей частью, расположенной в цитоплазме. GspO и GspF
являются политопными мембранными белками с несколькими пронизывающими мембрану
доменами.
Функции четко известны не для всех Gsp белков. GspO – специфическая пептидаза
для N- концевых секреторных сигналов белков GspGHIJ. Мишень, на которую действует
пептидаза у каждого из этих четырех белков, такая же, как и у предшественников
мономеров пилина, из которых складываются пили IV типа у некоторых бактерий
(например, P. aeruginosa). Препилины процессируются пептидазой PilD, оставляющей
метилированный остаток Phe на N-конце процессируемого белка. Поскольку белки
GspGHIJ имеют типичный сайт разрезания N-MePe- пептидазой и процессируются при
помощи GspO, их называют "псевдопилинами", хотя они и не участвуют в образовании
пилей. К тому же, в отличие от пилинов, после процессинга псевдопилины не
освобождаются, а остаются заякоренными в цитоплазматической мембране своими Nконцевыми гидрофобными участками. Поэтому функция процессинга остается не совсем
ясной, хотя и очевидно, что процессинг псевдопилинов необходим для нормальной сборки
секреторного аппарата, поскольку мутанты по GspO к секреции не способны.
Белок GspE является цитоплазматическим и, тем не менее, совершенно необходим
для секреции. Этот белок является типичным представителем ABC-транспортеров, и скорее
всего является транспортной АТФазой, обеспечивающей энергией какие-то стадии
секреторного процесса (скорее всего, сборку псевдопилюса), что осуществляется через
белок GspL (показано его взаимодействие с GspE).
Только два компонента секреторного аппарата, GspD и GspS локализованы во
внешней мембране. GspD принадлежит к крупному классу секретинов, представители
которого обязательно присутствуют во всех аппаратах секреции не только II, но и III типа.
Гомомультимеры этого белка образуют цилиндрическую пору во внешней мембране, через
которую и выходит из клетки секретируемый продукт. Белок имеет два четко выраженных
домена. C-концевой необходим для мультимеризации белка во внешней мембране. Nконцевой домен является периплазматическим и, скорее всего, именно он отвечает за
видоспецифичность аппарата секреции.
Липопротеин GspS является специфическим шапероном для GspD, защищая его от
протеолиза и способствуя инсерции GspD во внешнюю мембрану.
На сегодняшний день нет устоявшегося мнения о том, как работает аппарат GSP.
Скорее всего, многочисленные компоненты GSP взаимодействуют друг с другом, образуя
трансмембранную структуру, простирающуюся от цитоплазматической стороны
внутренней мембраны, через периплазму вплоть до внешней мембраны. Показано, что
экспрессия GspE должна предварять синтез остальных белков аппарата термнальной ветви
GSP. Возможно, что гидролиз АТФ вызывает у N-концевого домена GspL,
ассоциированного с GspE, конформационное изменение, которое передается через
мембрану периплазматическому домену GspL, что и вызывает сборку периплазматических
компонентов терминальной ветви GSP.
Система секреции II типа высоко специфична. Несмотря на то, что белки-компоненты
секреторного аппарата очень сходны друг с другом, их субстраты не будут секретироваться
даже очень близкородственными бактериями. Так, например, пектатлиазы E. carotovora не
будут секретироваться из близкородственного вида E. chrysanthemi, несмотря на то, что
сходство белков секреторного аппарата превышает 90%. Это свидетельствует о том, что
аппарат секреции содержит какой-то видоспецифический компонент. Наблюдается
своеобразный парадокс: с одной стороны, каждая бактерия способна секретировать
совершенно структурно несходные белки – пектатлиазы, целлюлазы, полигалактуроназы и
т.д., а с другой – неспособна секретировать практически идентичную пектатлиазы из
близкородственного вида.
Регуляция GSP
Как всегда в случае громоздкой белковой системы, клетка заинтересована в том,
чтобы энергоемкий синтез большого количества белков происходил только тогда, когда он
необходим. Поэтому большинство оперонов, входящих в GSP-кластеры у различных
бактерий, четко регулируется, хотя и по-разному у различных видов. Так, pul гены
Klebsiella контролируются активатором MalT, а out гены эрвиний - репрессором KdgR. В
обоих случаях экспрессия белкового аппарата, необходимого для секреции факторов
вирулентности, произойдет при контакте с хозяином и появлении соответствующего
индуктора – мальтозы или продуктов метаболизма клеточных стенок растений. Кроме того,
экспрессия
Gsp-белков у многих патогенов (эрвиний, псевдомонад и т.д.) зависит от фазы роста и
индуцируется при возрастании плотности популяции.
Сходные опероны ряда организмов Фенотип мутантов
Реконструкция Out пути в E. Coli
Секреторный аппарат III типа
1.1. Специфика
аппарата секреции III типа и его компоненты.
Системы секреции III типа жизненно необходимы для многих патогенов животных и
растений, таких как Bordetella bronchiseptica, Burkholderia pseudomallei, Chlamydia pitsitacii,
Erwinia amylovora, Erwinia crysanthemi, энтеропатогенные Escherichia coli, Pseudomonas
aeruginosa, Pseudomonas syringae, Ralstonia solanacearum, Rhizobia spp., Salmonella
typhimurium, Shigella flexneri, Xanthomonas campestri, и три вида Yersinia.
Отличительными чертами этих систем секреции являются доставка факторов
вирулентности непосредственно в клетку эукариотического хозяина (хотя часть белков,
секретируемых по этому пути, остается связанной с поверхностными структурами бактерии
или попадает в среду), а также использование большого количества специфических
секреторных шаперонов. Больше всего информации о системе секреции III типа имеется
для патогенов животных, где более или менее четко показаны функции нескольких белков.
Наиболее хорошо система секреции III типа изучена у иерсиний (Рис. 13.4). Yersinia spp.
секретируют как минимум 14 различных Yop белков (Yersinia outer proteins) по этому пути.
Гены, кодирующие Yops, так же как и гены, кодирующие секреторный аппарат, (ysc, Yop
secretion genes) расположены на плазмиде
вирулентности.
Повышение
температуры до 37°C, происходящее, например, при попадании бактерии в организм
человека, индуцирует экспрессию секреторного аппарата III типа. Высокая концентрация
кальция во внеклеточной
среде тканей человеческого тела ингибирует секреторный
аппарат, однако контакт с клеткой хозяина вызывает секрецию Yop-белков, причем в
данном случае происходит не только секреция, но и транслокация белков непосредственно
в клетки лимфоидных тканей, где иерсинии и размножаются.
Рис. 11.4 Секреторный аппарат III типа
Секреторный
аппарат
III
типа Yersinia spp. состоит из как минимум 24
Ysc белков, 11 из
которых консервативны
у
всех
секреторных
систем этого типа (включая таковые патогенов растений).
Некоторым сходством с аппаратом секреции III типа обладает система сборки
бактериального жгутика – из 11 консервативных секреторных генов здесь присутствует 10.
Не хватает только yscC, кодирующего белок внешней мембраны (секретин), через который
Yop белки и попадают во внешнюю среду. Этот секретин является единственным белком
системы секреции III типа, имеющим сходство с другими секреторными белками, а именно
с секретином GspD из аппарата секреции II типа. Предполагается, что 11 консервативных
компонентов (Hrc-белков) формируют белок-проводящий канал, который пронизывает обе
клеточные мембраны грамотрицательных бактерий. Такая структура была изолирована и
охарактеризована для системы сборки бактериального жгутика (называемой также
базальным телом). Секреторный аппарат базального тела транспортирует субъединицы
крюка и флагеллин, которые после секреции полимеризутся и образуют длинный
филамент, обеспечивающий подвижность бактерий. Секреторный аппарат III типа S.
typhimurium, называемый игольчатым комплексом, напоминает по своей структуре
базальное тело жгутика (имеет характерные кольца в различных слоях бактериальной
клеточной стенки), но в его состав еще дополнительно входит секретин внешней мембраны.
В дополнение к интегральным мембранным белкам в состав аппарата секреции III типа
входит и несколько цитоплазматических компонентов, которые могут участвовать в
доставке субстратов к сайту секреции. Некоторые компоненты секреторного аппарата,
очевидно, являются мобильными, поскольку могут быть обнаружены как в цитоплазме
бактериальной клетки, так и за ее пределами.
При повышении температуры до 37°C в отсутствии кальция иерсинии секретируют
полтора десятка белков во внешнюю среду. Система секреции III типа не зависит от secбелков. Соответственно, секретируемые белки не имеют сигнального пептида,
характерного для системы секреции II типа. Тем не менее, сигнал для секреции
закодирован в N-концевой части субстратов, с которыми происходит взаимодействие
специфических секреторных шаперонов (а в некоторых случаях, возможно, сигналом
является непосредственно мРНК). Распознавание субстрата является чрезвычайно
специфичным и точным, поскольку в момент секреции бактерия способна специфически
доставить конкретный субстрат в одно из трех возможных ―мест назначения‖ –
бактериальную оболочку, внешнюю среду или в цитозоль клетки эукариотического
хозяина.
О структуре аппарата секреции у фитопатогенов известно очень мало, однако для
нескольких бактерий показано наличие особенной поверхностной структуры, связанной с
аппаратом секреции III типа. Эта структура, длинный тонкий филамент - hrp-пилюс,
состоит, скорее всего, из одного белка HrpA и необходима для секреции. Секретируемые
белки могут проходить через внутренний канал hrp- пилюса, хотя он и имеет небольшой
диаметр 8-10 нм. Необходимыми компонентами аппарата секреции у фитопатогенов
являются секретин HrcC (гомолог YscC иерсиний), ассоциированный с наружной
мембраной липопротеин HrcJ, пять белков внутренней мембраны HrcR, HrcS, HrcT, HrcU,
HrcV (HrpO), и два цитоплазматических белка HrcQ и HrcN, последний из которых
является АТФазой.
Субстраты аппарата секреции III типа.
Наиболее хорошо изучены белки, секретируемые посредством аппарата III типа,
опять же, у патогенов человека, прежде всего, у иерсиний. Наиболее интересные из этих
белков и их функции перечислены ниже.
YopN - сенсор контакта, "затыкающий" секреторный канал. Похожей функцией
обладает LcrG, но этот белок располагается в цитоплазме. Гомологом YopN у
фитопатогенов является HrpJ, однако степень гомологии невысока, а роль этого белка при
секреции у фитопатогенов не показана.
YopE – цитотоксин. Транслоцируется непосредственно в цитозоль макрофагов, где
вызывает коллапс цитоскелета путем разрушения актиновых филаментов.
YopH - тирозин фосфатаза (попадая в цитозоль макрофага, дефосфорилирует
компоненты сигнальной цепочки, необходимые в фосфорилированной форме для
фагоцитоза)
YopB и YopD - мембранные транслоказы. Предполагается, что, будучи
секретированными за пределы бактериальной клетки, эти белки ассоциируют с мембраной
макрофага, образуя канал, через который и происходит транслокация остальных белков
внутрь эукариотической клетки.
К числу белков, секретируемых посредством аппарата III типа фитопатогенов,
относятся прежде всего непосредственные индукторы HR - Avr белки и харпины. По
крайней мере несколько генов, кодирующих эти белки, входит в состав hrp кластеров. При
всем отличии этих белков от секретируемых субстратов аппарата III типа у животных
можно заметить удивительное сходство функций. Так, по крайней мере часть Avr-белков
вызывает нарушение сигнальных каскадов в клетке хозяина,
контролирующих его защитный ответ (как и фосфатазы, доставляемые в цитозоль
макрофагов иерсиниями) либо нарушение регуляции защитного ответа на уровне
1.1.
транскрипции, а харпины, скорее всего, ассоциируют с растительной клеточной стенкой и
либо сами формируют транслокационный канал, либо способствуют его формированию
(что напоминает работу белков YopB и YopD иерсиний).
Харпины – внеклеточные элиситоры реакции гиперчувствительности (быстрой
гибели клеток растения в непосредственной близости от сайта внедрения "несовместимого"
патогена). Это относительно небольшие (40-45 kDa) термостабильные белки с высоким
(порядка 20%) содержанием глицина, низким тирозина и совсем лишенные цистеина.
Харпины из различных фитопатогенов по гомологии аминокислотных последовательностей
можно разделить на три группы – HrpN, HrpZ и HrpW. При всем сходстве общего
аминокислотного состава первичные аминокислотные последовательности представителей
разных групп не имеют заметного сходства, а внутри каждой группы это сходство
невелико. Поскольку по гомологии аминокислотных последовательностей отнести белок к
классу харпинов бывает сложно, единственным критерием является способность вызывать
реакцию гиперчувствительности при инокуляции препарата относительно очищенного
белка в ткани (как правило, листа) подходящего растения. Однако, несмотря на то, что
харпины могут вызвать реакцию гиперчувствительности у растений, их роль в процессе
патогенеза неоднозначна, поскольку у большинства проверенных штаммов инактивация
харпинов не вызывает заметных фенотипических эффектов. О молекулярной роли
харпинов пока известно мало, однако харпин HrpW имеет домен, сходный с пектатлиазами
(но не обладающий, тем не менее, пектолитической активностью), что наводит на мысль о
возможном взаимодействии этого белка с клеточной стенкой растений. И действительно,
такое взаимодействие недавно было продемонстрировано, правда, для другого харпина HrpZ. Было показано, что HrpZ, скорее всего, образует пору в мембране растительной
клетки, что приводит к быстрой потере электролитов и гибели.
В отличие от харпинов, секретируемых аппаратом III типа в среду и уже после
секреции взаимодействующих с поверхностными структурами растительных клеток, Avrбелки в норме во внешнюю среду не попадают, а доставляются непосредственно в
растительные клетки. Хотя до сих пор транспорт Avr-белков в растительные клетки не
продемонстрирован непосредственно, тому имеются многочисленные косвенные
подтверждения. Прежде всего, часть Avr-белков имеет в своем составе аминокислотные
последовательности, имеющие смысл только в эукариотической клетке, такие как сигнал
ядерной локализации. Взаимодействие Avr-белков с их партнерскими R-генами растений
было продемонстрировано в дрожжевой двухгибридной системе для нескольких Avr-R пар.
1.2.
Организация и регуляция генов, кодирующих белки аппарата секреции III типа
Несмотря на значительные таксономические различия между бактериями,
обладающими системами секреции III типа, различия в образе жизни этих патогенов и
принадлежность их хозяев к разным царствам (растений и животных), между всеми
системами секреции III типа имеется много общего. Наиболее интересным является то, что
все известные системы III типа, как у фитопатогенов, так и у патогенов животных,
организованы в крупные кластеры генов, состоящие из нескольких оперонов, полностью
кодирующих все компоненты соответствующих секреторных аппаратов. Как правило, в
состав этих кластеров входят также и гены, кодирующие секретируемые субстраты.
Следует заметить, что во многих случаях эти кластеры ограничены по краям мобильными
генетическими элементами и имеют нуклеотидный состав (%GC), существенно
отличающийся от остальной части генома бактерии. Такая организация кластеров
секреторных генов может свидетельствовать о сравнительно недавнем приобретении их
Рис.11.5. Транскрипционная регуляция систем секреции III типа
соответствующей бактерией и о том, что такие "острова патогенности" могут
относительно свободно перемещаться горизонтально между таксономически весьма
удаленными бактериями.
У всех изученных фитопатогенных бактерий большинство hrp генов располагается в
одном большом кластере размером 20-25 т.н.п. и организовано в 7-8 транскрипционных
единиц. Четыре наиболее полно охарактеризованных на сегодняшний день кластера могут
быть разделены на две группы на основании сходства между составляющими их генами,
структурой оперонов и регуляторными системами. К первой группе можно отнести hrp
кластеры P. syringae и E. amylovora, а ко второй - R. solanacearum и X. campestris.
Интересным является то, что и регулируются гены этих двух групп кластеров поразному. Основным регулятором у P. syringae и E. amylovora является альтернативный
сигма-фактор, а у R. solanacearum и X. campestris семейства (как, кстати, и у иерсиний)–
активатор AraC.
Наиболее хорошо система регуляции изучена у P. syringae pv. syringae. Для этой
бактерии было показано, что HrpR, HrpS, и HrpL являются частью многокомпонентной
регуляторной системы, контролирующей экспрессию hrp и avr генов. HrpR и HrpS
54
принадлежат к классу NtrC-зависимых энхансеров транскрипции. HrpR и
HrpS отличаются от большинства членов семейства NtrC тем, что они утратили
аминоконцевой регуляторный домен, который изменяет регуляторную активность (в связи
с чем можно предположить, что в сигнальной цепи, ведущей к активации hrp-генов,
обязательно должны присутствовать другие белки), однако они по-прежнему содержат
консервативный карбоксиконцевой ДНК-связывающий домен. Действие NtrCподобных энхансеров транскрипции осуществляется через взаимодействие с
54
), и было показано, что rpoN ген необходим для
экспрессии hrp генов у нескольких патоваров P. syringae. RpoN осуществляет свое
действие через контроль экспрессии другого сигма- фактора, HrpL, принадлежащего к ECF
семейству (extra cytoplasmic functions) сигма-факторов. А уже HrpL активирует
транскрипцию с зависящих от него промоторов, каковыми являются практически все
изученные на сегодняшний день промоторы оперонов, кодирующих hrp и avr гены.
Показано связывание HrpL с консервативной промоторной последовательностью
GGAACCNA-N14-CCACNNA, называемой hrp-боксом. Аналогичная схема регуляции имеет
место и у E. amylovora.
Секреторные шапероны.
Для секреции многих субстратов через аппарат 3-го типа необходимо действие
специфических цитоплазматических шаперонов. Первыми обнаруженными и наиболее
изученными являются Syc шапероны Yersinia, необходимые для секреции Yop белков.
Характерной чертой этих шаперонов является специфичность – все Syc белки
взаимодействуют только с одним секретируемым белком (только в одном случае с двумя).
Утрата одного шаперона блокирует секрецию соответствующего белка, тогда как секреция
остальных субстратов данного секреторного аппарата не нарушается. Белок, лишенный
шаперона, накапливается в цитоплазме и зачастую быстро деградирует.
В то время как взаимодействие между собой и вообще судьба факторов
вирулентности после секреции изучена слабо, много информации имеется о
взаимодействии между собой жгутиковых белков (использующих фактически такую же
систему секреции) после их экспорта из клетки. Эти белки, как правило, полимеризуются с
образованием характерных жгутиковых структур. Базальное тело жгутика, пронизывающее
периплазматическое пространство, состоит из 5 белков (FlgB, C, F и G, FliE). К нему
прикреплен достаточно гибкий крюк (FlgE), выходящий за пределы поверхности клетки. K
крюку присоединена длинная нить жгутика, состоящая из одного белка (FliC), для
прикрепления которого к крюку необходимы два белка, FlgK и FlgL, а конец нити жгутика
защищен еще одним белком, FliD. Базальное тело жгутика представляет собой не что иное,
как секреторный аппарат секреции пяти белков
– субъединиц крюка, нити и FlgK, FlgL и FliD. А поскольку диаметр секреторного
канала, через который должны проходить эти белки, невелика – всего 25-30Å, все эти белки
(включая и некоторые субъединицы базального тела) должны транспортироваться в
частично развернутом состоянии. Что проблематично, ибо эти белки преимущественно
-спиральную структуру и имеют выраженную склонность к олигомеризации. Для
предотвращения окончательного фолдинга и самосборки жгутиковых субъединиц в
цитоплазме бактерия использует специфические шапероны, которых на сегодняшний день
описано три – FlgN, FliT и FliC.
Таким образом, использование субстрат-специфических шаперонов в процессе
секреции является характерным для обоих ―подтипов‖ аппаратов III типа. Оба типа
шаперонов обычно связываются с небольшим районом субстрата. Но имеются и
существенные отличия. Для факторов вирулентности этот район располагается в пределе
первых 125 аминокислот с N-конца и соответствует области, необходимой для
транслокации субстрата в эукариотические клетки, тогда как шаперон-связывающий домен
жгутиковых белков расположен в пределах последних 40 АК белка (самый карбокси-конец)
и необходим для взаимодействия жгутиковых субъединиц между собой.
Что же представляет собой секреторный сигнал? Как у жгутиковых субъединиц, так и
у продуктов генов вирулентности он расположен в N-конце белка. Но по крайней мере в
случае Yop белков белковая природа сигнала находится под вопросом. Эксперименты со
введением сдвига рамки в начальную часть yop генов показали, что секреция не
нарушается, если этот сдвиг компенсируется еще одной мутацией через 15-17 кодонов. С
другой стороны, по крайней мере для некоторых Yop белков показана абсолютная
зависимость секреции от действия соответствующего шаперона.
Секреторный аппарат IV типа
Система секреции IV типа имеет выраженное сходство с аппаратом конъюгации ряда
плазмид и скорее всего произошла от него. Эта экспортная система характеризуется
чрезвычайно широкой специфичностью как по отношению к субстратам (крупные
нуклеопротеидные комплексы, мультикомпонентные белковые токсины и мономерные
белки), так и по отношению к мишеням секреции, каковыми могут служить бактерии,
грибы, растения и животные (иными словами, клетки представителей всех царств за
исключением архей).
Изначально система секреции IV типа была выделена при обнаружении сходства трех
секреторных аппаратов - транспорта T-ДНК A. tumefaciens, Tra системы IncN плазмиды
pKM101 и системы секреции токсина B. pertussis. Затем сходство с этими секреторными
аппаратами было обнаружено у еще нескольких Tra систем и системы секреции балка CagA
– фактора вирулентности Helicobacter pylori.
Таким образом, многие системы IV типа переносят ДНК, но необходимо отметить,
что переносится не ДНК сама по себе, но однонитевая ДНК, связанная с одним или
несколькими белками. Эти белки участвуют в процессинге ДНК в точке начала переноса
(oriT), ведущем к образованию конъюгационного интермедиата. Трансэстераза инициирует
процессинг, связываясь с ДНК в точке oriT (либо функционально эквивалентвых границах
Т-ДНК у агробактерий) и внося одноцепочечный разрыв. После внесения разрыва
трансэстераза остается ковалентно связанной с 5' концом одной нити через тирозиновый
остаток. Однонитевая ДНК при конъюгации переносится как раз в направлении 5' -> 3', и
скорее всего именно трансэстераза обеспечивает опознавание конъюгационного
интермедиата секреторным аппаратом. В случае A. tumefaciens трансэстераза VirD2
экспортируется вместе с Т-ДНК в растительную клетку , где сигналы ядерной локализации,
присутствующие в VirD2, направляют Т-ДНК в ядро клетки. Таким образом,
конъюгационные системы можно рассматривать как аппарат секреции белка,
приспособленный для экспорта ковалентно связанной с белком ДНК.
Кроме того, недавно было показано, что конъюгационные системы могут
транспортировать и не связанные с ДНК белки. Так, Tra аппарат плазмиды RP4 способен
секретировать белок RecA, а система
переноса Т-ДНК способна секретировать VirE2 (SSB белок) и еще один фактор
вирулентности, VirF. Интересно, что для секреции VirE2 необходимо участие шаперона
VirE1. VirE1 стабилизирует VirE2 in vivo и препятствует его агрегации in vitro, что делает
его похожим на Syc шапероны Yersinia.
Белковые субстраты систем секреции IV типа патогенов животных радикально
отличаются от субстратов Tra систем, тем не менее, имеется значительное сходство
аппаратов секреции. Например, система Ptl B. pertussis секретирует сложный токсин PT,
принадлежащий к группе A/B токсинов и состоящий из 5 субъединиц, S1-S5. Домен А
токсина состоит из субъединицы S1, а В домен – из S2-S5 субъединиц в соотношении
1:1:2:1. В отличие от Tra систем экспорт PT – двухстадийный процесс. Субъединицы ПТ
сначала экспортируются через цитоплазматическую мембрану при помощи Sec системы,
затем холотоксин собирается в периплазме и в собранном виде транспортируется через
внешнюю мембрану системой Ptl. После экспорта В домен токсина взаимодействует с
гликопротеиновыми рецепторами хозяйской клетки и обеспечивает транслокацию домена
А внутрь. Внутри хозяйской клетки домен А нарушает сигнальные пути путем
рибозилирования регуляторных белков.
Аппарат секреции IV типа (который мы рассмотрим на примере более изученных Tra
систем) состоит состоит из двух поверхностных структур, конъюгационного канала, через
который происходит транслокация ДНК и белков, и конъюгационного пилюса,
необходимого для контакта с реципиентной клеткой. Структура системы секреции изучена
недостаточно, и пока выделяют несколько групп белков, функции которых до конца не
выяснены:
поверхностные белки, участвующие в формировании пилюса и др. поверхвостных
структур; компоненты конъюгационного канала;
АТФазы цитоплазматической мембраны.
Изучение систем секреции II-IV типов выявило некоторое сходство между ними. Так,
системы III и IV типа начинают секрецию только при контакте с клеткой-мишенью. Обе
системы используют специфические шапероны. Обе системы (как правило)
транспортируют субстраты в одну стадию через трансмембранный канал, пронизывающий
обе мембраны. Наконец, обе системы каким-то образом используют пили в секреторном
процессе.
Рис. 11.6 Сходство систем секреции I-III типов
Имеется также сходство и с системой секреции II типа (особенно если рассматривать
секрецию PT B. pertussis). Интересно, что холерный токсин, очень схожий с PT B. pertussis,
выходит из клетки через аппарат II типа – таким образом, и система секреции II типа может
обеспечивать транспорт ДНК в ассоциации с белками.В дополнение к секреторным
механизмам, требующим участия специального аппарата секреции недавно был описан
случай "самотранспорта" белка, а именно протеазы IgA Neisseria gonorrhoeae через
внешнюю мембрану.
ТЕМА 12
Раздел 12: РЕГУЛЯЦИЯ СТАБИЛЬНОСТИ мРНК
Синтез определенного количества матричной РНК не обязательно
гарантирует продукцию пропорционального количества белка. Сила
экспрессии определенного гена зависит не только от эффективности его
транскрипции, но в значительной мере от того, что происходит с
транскриптом после его синтеза. Сразу после синтеза транскрипт
приобретает определенную вторичную структуру, от чего в значительной
степени будут зависеть его стабильность и скорость процессинга (у
эукариот), а также эффективность трансляции. Дополнительные
возможности регуляции имеются у эукариот в связи с наличием сложного
процессинга первичных транскриптов. Наконец, эффективность экспрессии
гена очень сильно зависит от стабильности его мРНК. Так, у прокариот время
полужизни различных мРНК варьирует в пределах от 20 секунд до более чем
20 минут.
Факторы, влияющие на стабильность прокариотической мРНК
Стабильность мРНК обычно не зависит напрямую от ее размера, а
определяется многими факторами, основными из которых являются ее
вторичная структура, элементы первичной последовательности (сайты
узнавания для специфических рибонуклеаз) и эффективность трансляции.
Наличие элементов вторичной структуры, как правило, стабилизирует
РНК, поскольку препятствует работе многих РНКаз. Большинство мРНК
имеют на своем нетранслируемом 3' конце достаточно стабильные
шпилечные структуры. Это в первую очередь терминаторы, однако имеются
и другие элементы вторичной структуры. Так, у E. coli имеется около 500 так
называемых REP (repetitive extragenic palindromes) элементов – палиндромов,
способных образовывать достаточно крупные шпилечные структуры на 3'
концах матричных РНК. В некоторых случаях шпилечные структуры могут
присутствовать и на 5' концах мРНК. Немаловажным
для
стабильности мРНК является наличие хорошего рибосомсвязывающего
сайта (на надлежащем расстоянии перед старт-кодоном). Рибосома,
транслирующая мРНК, защищает 35-50 нуклеотидов от атаки рибонуклеаз,
которые могут разрушить РНК. Если мРНК эффективно транслируется, она
фактически полностью будет покрыта рибосомами, что существенно
уменьшит вероятность
ее деградации рибонуклеазами.
Даже во время трансляции мРНК может выступать субстратом для
рибонуклеаз. Уже один разрыв в молекуле мРНК с большой вероятностью
ее инактивирует. Если в результате
разрыва оказывается удален
рибосомсвязывающий сайт, такая мРНК, естественно, не может
транслироваться. Если же разрыв произойдет где-то посередине кодирующей
последовательности, трансляция будет происходить, однако белок окажется
92
укороченным и почти наверняка нефункциональным. Кроме того, клетка,
скорее всего, повесит на такой укороченный белок ярлык, направляющий
его на протеолиз (например, при помощи ssrA РНК у E. coli). Кроме
того, обычно, если деградация мРНК уже началась, процесс ее разрушения
завершается очень быстро. Деградация мРНК у E. coli осуществляется
совместно эндо- и экзорибонуклеазами. Две экзонуклеазы, РНКаза II и
полинуклеотидфосфорилаза (ПНФаза, PNPase), разрушают РНК в
направлении 3'->5'. Похожие экзорибонуклеазы широко распространены как
у про-, так и у эукариот. РНКаза II – гидролитический фермент, дающий при
расщеплении РНК нуклеотидмонофосфаты. ПНФаза использует при
гидролизе неорганический фосфат, генерируя нуклеотиддифосфаты.
Инактивация обоих экзорибонуклеаз приводит к накоплению в клетке
промежуточных продуктов деградации мРНК и является летальной.
3' концы многих мРНК (в первую очередь образовавшиеся в результате
ρ-независимой терминации) образуют стабильные шпилечные структуры,
которые защищают
РНК от деградации экзорибонуклеазами.
Расщепление мРНК "в середине" при помощи эндорибонуклеазы может
убрать шпильку, образуя незащищенный 3' конец, доступный для
экзорибонуклеаз. Эндорибонуклеаза E (РНКаза E, RNAse E), первоначально
идентифицированная как необходимая для процессинга рибосомной 5S РНК,
также определяет стабильность многих мРНК.
Эндонуклеазное расщепление РНК менее важно у эукариот, где
основная деградация мРНК обеспечивается экзонуклеазами. У дрожжей
описано два экзонуклеолитических механизма, работающих в направлениях
5'->3' и 3'->5'. Эукариотические мРНК защищены от деградации кэпом на 5'
конце и поли(А) хвостом в комплексе с поли(А)-связывающим белком (PAB)
на 3' конце, и декэпирование и деаденилирование являются необходимыми
предпосылками для деградации. У дрожжей в 5'->3' пути деградации
декэпирование зависит от деаденилирования, и а мРНК деградируется
экзонуклеазой
XRN1.
3'->5'
путь
деградации
обеспечивается
мультибелковым комплексом – экзосомой. Интересно, что E. coli не имеет 5'>3' экзонуклеазного пути. 5' конец мРНК у прокариот не кэпирован, а 5'->3'
экзорибонуклеазы не известны, однако структура, подобная кэпу, все же
имеется. На 5' конце эубактериальных мРНК , как правило, находится
трифосфат, и его присутствие ингибирует действие эндорибонуклеаз. После
первого расщепления мРНК эндорибонуклеазой на вновь образованном 5'
конце РНК остается монофосфат, уже неспособный блокировать дальнейшее
эндонуклеолитическое расщепление. Именно поэтому первая атака
эндорибонуклеазой является лимитирующей по времени, а дальнейшее
расщепление мРНК при помощи эндонуклеаз и 3'->5' экзонуклеаз (для
последних первое расщепление мРНК также обеспечивает незащищенный 3'
конец) происходит очень быстро.
Бактериальные РНКазы, участвующие в деградации мРНК
93
РНКаза Е описана у E. coli. Кодируется геном rne. Продукт гена –
крупный белок (1061 аминокислотный остаток). активен в виде гомодимера.
Белок можно разделить на три домена. В центре расположен богатый
аргинином РНК-связывающий домен. N-концевой каталитический домен
имеет слабую гомологию с рибосомным белком S1. Имеется также некоторая
гомология между РНКазой Е и миозином.
Специфичность РНКазы Е по отношению к субстрату не очень четкая.
В качестве консенсус- последовательности сайта предпочтительного
узнавания был предложен пентануклеотид (A/G)AUU(A/U), однако по
другим данным единственным ограничением по отношению к
последовательности РНК является разрезание "слева" от динуклеотида AU в
однонитевых участках молекулы. Еще одним ограничением является то, что
РНКаза Е наиболее активно действует только в непосредственной близости
от свободного 5' конца, причем это должен быть конец с монофосфатом.
Наконец, двухцепочечная РНК резистентна к деградации РНКазой Е. Таким
образом, для успешного расщепления субстрата РНКаза Е должна распознать
специфический внутренний сайт и свободный 5' нуклеозидмонофосфат.
Экспрессия РНКазы Е находится под негативным контролем, причем
регулятором является сама РНКаза Е, и контроль осуществляется за счет ее
собственной РНКазной активности. В условиях эксперимента можно
добиться 40-кратного различия в количествах rne-транскрипта за счет
изменения клеточной концентрации функциональной РНКазы Е.
РНКаза III
РНКаза III (кодируемая геном rnc) была обнаружена у E. coli как
эндорибонуклеаза, разрезающая двухцепочечные молекулы РНК. Разрез
может быть одно- или двунитевым, что частично зависит от степени
спаренности оснований вокруг сайта разрезания. Специфичность по
отношению к конкретной последовательности контролируется негативно, т.е.
присутствие ряда оснований в определенных позициях сильно ингибирует
разрезание.
РНКаза III участвует в процессинге рРНК и деградации ряда мРНК,
хотя стабильность большинства клеточных мРНК не изменяется у мутанта по
РНКазе III. Инактивация rnc летальна у B. subtilis, но не летальна у E. coli.
РНКаза III - гомодимер из субъединиц размером 25.4 кДа. Фермент
содержит четко выраженные РНК-связывающий и РНКазный домен.
Экспрессия rnc авторегулируется (как и в случае РНКазы Е , каталитическая
активность РНКазы III напрямую участвует в авторегуляции). Активность
РНКазы III регулируется также и на посттрансляционном уровне путем
фосфорилирования.
Полинуклеотидфосфорилаза
Кодируется геном pnp. Гомотример из субъединиц размером 77.1 кДа.
Катализирует
обратимый
фосфоролиз
полирибонуклеотидов
с
освобождением нуклеозиддифосфатов. Содержит два РНК- связывающих
домена – один гомологичен некоторым эукариотическим гяРНК, а второй –
рибосомному белку S1. Фермент широко распространен у бактерий.
94
Экспрессия полинуклеотидфосфорилазы, как и описанных выше РНКаз,
находится под автоконтролем.
РНКаза II
Кодируется геном rnb. Как и полинуклеотидфосфорилаза, процессивно
деградирует однонитевую РНК с 3' конца, однако делает это путем
гидролиза, а не фосфоролиза мРНК, освобождая нуклеозидмонофосфаты.
Мономер с молекулярной массой 72.3 кДа. Содержит карбоксиконцевой
РНК- связывающий S1 домен. Экспрессия РНКазы II находится в обратной
корреляции с уровнем полинуклеотидфосфорилазы, что предполагает
участие этих двух РНКаз в деградации матричных РНК друг друга
Активность обеих экзорибонуклеаз ингибируется элементами
вторичной структуры, однако полинуклеотидфосфорилаза к такому
ингибированию значительно менее чувствительна.
Мультибелковые комплексы деградации РНК.
При очистке РНКазы Е из E. coli был обнаружен крупный
мультибелковый комплекс – РНК- деградосома. Основными компонентами
этого комплекса являются РНКаза Е, ПНФаза и РНК-хеликаза RhlB (Рис.
17.4). Ассоциация РНКазы Е с ПНФазой в одном комплексе дает прямое
доказательство их кооперации при деградации мРНК. В составе комплекса
также
выделяется
енолаза
(гликолитический
фермент)
и
(в
субстехиометрических количествах) полифосфаткиназа PPK и шапероны
DnaK и GroEL; роль этих компонентов в деградации мРНК неясна.
РНКаза Е – крупный мультидоменный белок. Эндонуклеазная
активность связана с N-концевым доменом. Этот же домен обладает
дополнительной активностью, отвечающей за деградацию поли(А) и поли(U)
хвостов. C-концевая половина белка взаимодействует с тремя основными
компонентами деградосомы, RhlB, PNPазой и енолазой. Таким образом,
РНКаза Е – сложный мультидоменный белок, N-конец которого является
каталитическим, а C-конец выполняет роль каркаса, на котором собираются
остальные компоненты деградосомы.
95
Рис.12.1 Прокариотическая РНК-деградосома
Несколько мультибелковых РНК- деградирующих комплексов,
структурно и функционально гомологичных бактериальной РНКдеградосоме, описано у эукариот. Все эти комплексы отвечают за
деградацию РНК в 3'->5' направлении. Комплекс, содержащий гомологи
PNPазы и РНКазы Е, участвует в процессинге и деградации мРНК в
хлоропластах шпината. Еще два комплекса описаны у дрожжей. Комплекс
mtEXO, содержащий экзонуклеазу, сходную с РНКазой II из E. coli,
деградирует интроны мРНК в митохондриях Saccharomyces
cerevisiae. Экзосома S.
cerevisiae, участвующая как в процессинге
рибосомной РНК, так и в деградации мРНК, содержит пять 3'->5'
экзорибонуклеаз, четыре из которых гомологичны РНКазе II или PNPазе из
E. coli. Человеческий гомолог дрожжевой экзонуклеазы Rpr4p был
обнаружен в составе большого комплекса, что свидетельствует в пользу
наличия экзосомы и в клетках животных.
РНК-хеликазы в деградации РНК
Идентификация РНК-хеликазы RhlB в составе бактериальной
деградосомы явилась первым свидетельством активной роли РНК-хеликаз в
деградации РНК. RhlB принадлежит к классу DEAD-бокс белков. Это
семейство АТФ-зависимых РНК-хеликаз, имеющих 8 консервативных
мотивов, включая аминокислоты аспартат (D), глутамат (E), аланин (A) и
опять аспартат (D). Белки-члены этого семейства участвуют в разнообразных
процессах, включая сборку рибосом, инициацию трансляции и сплайсинг
РНК. В экспериментах in vitro функция RhlB в составе деградосомы была
четко показана. Элементы вторичной структуры в РНК часто создают
препятствия для продвижения таких ферментов, как ПНФаза. Показано, что
присутствие RhlB в составе деградосомы стимулирует в АТФ-зависимой
манере деградацию при помощи ПНФазы субстрата с выраженной вторичной
структурой. RhlB "раскручивает" двухцепочечные участки РНК, что
позволяет экзорибонуклеазе продвинуться дальше по субстрату. RhlB сильно
активируется взаимодействием с C-концевой частью РНКазы Е. Дрожжевые
96
экзосома и комплекс mtEXO также имеют в своем составе хеликазы,
подобные RhlB.
Полиаденилирование оказывает противоположный эффект на
стабильность бактериальных и эукариотических мРНК.
Поли(А)-полимераза I (PAP I) из E. coli кодируется геном pcnB (plasmid
copy number), который был первоначально идентифицирован по его
действию на копийность плазмид с ColEI репликоном. PAP I участвует в
деградации РНК I – небольшой регуляторной РНК, которая взаимодействует
с РНК II – праймером, инициирующим репликацию ДНК ColEI. РНК I, время
полужизни которой составляет 2 минуты, первоначально укорачивается
РНКазой Е на 5 нуклеотидов с 5' конца. Время полужизни полученного
интермедиата (РНК I-5) возрастает в 10 раз в pcnB штамме (у которого
отсутствует PAP I активность). E. coli имеет еще один белок с поли(A)полимеразной активностью (PAP II). Инактивация обеих поли(A)-полимераз
летальна. PAP I из E. coli гомологичен эукариотическим поли(A)полимеразам.
Степень полиаденилирования бактериальных мРНК невысока, и у E.
coli только небольшой процент всех транскриптов полиаденилирован.
Однако, несмотря на низкую степень полиаденилирования, оно выполняет
существенную функцию при деградации РНК. Добавление поли(А)
способствует деградации РНК, чьи концы защищены от действия экзонуклеаз
вторичной структурой. Такие экзорибонуклеазы, как ПНФаза и РНКаза I,
нуждаются в одноцепочечном "хвосте", за который можно "ухватить" 3'
конец мРНК и начать ее деградацию. Полиаденилирование 3' конца как раз и
создает сайт связывания для экзорибонуклеаз.
Открытие дестабилизирующего влияния 3' поли(А)-хвостов на мРНК у
бактерий явилось сюрпризом, поскольку у эукариот функция
полиаденилирования противоположная (стабилизирующая). Такое отличие
объясняется тем, что поли(А)-хвосты эукариот значительно длиннее и, кроме
того, защищены особым белком PAB (poly(A)-binding). Короткие не
связанные с белком поли(А) последовательности и у эукариот оказывают
дестабилизирующее действие на мРНК.
97
ПРАКТИКУМ
Практическое занятие № 1
ТЕМА: РЕГУЛЯЦИЯ ТРАНСКРИПЦИИ.
ЦЕЛЬ: усвоение основных представлений о механизмах регуляции
экспрессии генов у про- и эукариот на уровне транскрипции.
ПЛАН
1. Понятие регуляции транскрипции.
2. Механизм регуляции транскрипции у прокариот.
3. Инициация и терминация транскрипции — процессы,
наибольшей степени подверженные контролю.
4. Регуляторные белки.
в
ОБЩИЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ СВЕДЕНИЯ
Регуляция транскрипции — совокупность процессов в клетке,
посредством которых осуществляется контроль за транскрипцией —
синтезом РНК на матрице ДНК — одним из этапов экспрессии генов.
Транскрипционная активность гена может контролироваться более чем
одним механизмом. Эти механизмы различаются у прокариот и эукариот.
Регуляция транскрипции у прокариот
Оперон — функциональная единица генома у прокариот, в состав
которой входят цистроны (гены, единицы транскрипции), кодирующие
совместно или последовательно работающие белки и объединенные под
одним (или несколькими) промоторами.
• Опероны по количеству цистронов делят на моно-, олиго- и
полицистронные, содержащие, соответственно, только один, несколько или
много цистронов (генов).
• Концепцию оперона для прокариот предложили в 1961 году
французские ученые Жакоб и Моно, за что получили Нобелевскую премию в
1965 году.
В генетике, оперон является функционирующей единицей ДНК,
содержащей кластер генов под контролем одного промотора. Гены
транскрибируются вместе в цепь мРНК и либо вместе транслируются в
цитоплазме, либо подвергаются сплайсингу для создания моноцистронных
мРНК, которые транслируются отдельно, то есть нескольких цепей мРНК,
каждая из которых кодирует один продукт гена. Результатом этого является
то, что гены, содержащиеся в опероне, либо экспрессируются вместе, либо не
экспрессируются вообще. Чтобы определить оперон, необходимо совместно
транскрибировать несколько генов. Первоначально считалось, что опероны
98
существуют только у прокариот (включая органеллы, такие как пластиды ,
происходящие из бактерий ), но с момента открытия первых оперонов у
эукариот в начале 1990-х годов появилось больше доказательств того, что
они встречаются чаще, чем раньше. предполагается. В общем, экспрессия
прокариотических оперонов приводит к генерации полицистронных мРНК, в
то время как эукариотические опероны приводят к моноцистронным мРНК.
Опероны также обнаруживаются у вирусов, таких как бактериофаги .
Например, фаги Т7 имеют два оперона. Первый оперон кодирует различные
продукты, включая специальную РНК-полимеразу Т7, которая может
связываться со вторым опероном и транскрибировать его. Второй оперон
включает ген лизиса, предназначенный для разрыва клетки-хозяина.
Инициация и терминация транскрипции как процессы, в наибольшей
степени подверженные контролю.
РНК-полимераза
E.coli
осуществляет
транскрипцию
всех
бактериальных генов и состоит из нескольких субъединиц: α-35кДа, β‗165кДа, β-155кДа, σ-чаще 70кДа (σ70). РНК-полимераза состава ααββ‘σ70
называется holo-фермент (Еσ70), состава ααββ‘- core-фермент (E).
σ - сменный фактор специфичности, который диссоциирует после инициации
транскрипции. Элонгация и терминация осуществляется core-ферментом. У
Е.coli ~10 видов σ-субъединиц. Транскрипция генов теплового шока, σ54 в
составе holo-фермента Eσ54 (54 кДа).Все субъединицы заряжены
отрицательно: σ>α>β>β‘ – расположены по убыванию заряда. В каждой
субъединице имеется кластер (+)-заряженных участков, которыми они
связываются с ДНК. Наибольшее число кластеров у – β‘, который участвует в
связывании фермента с ДНК, β-субъединица содержит активные центры инициации и элонгации, α-субъединицы обеспечивают правильное
взаимодействие фермента с промоторами. Рифампицин – блокирует
инициацию, стрептолидигин – блокирует элонгацию, что говорит о
разнесении
активных
центров
в
РНК-полимеразе.
Узнавание и связывание RNA-pol с промотором осуществляется holoферментом. Одновременно в клетке присутствует около 7000 молекул РНКполимеразы. Только holo-фермент обладает высоким сродством к
специфической последовательности нуклеотидов - промотору. У coreфермента одинаковое сродство к любой последовательности нуклеотидов.
Сам по себе сигма - фактор обладает наименьшим сродством к ДНК по
сравнению с другими субьединицами РНК-полимеразы, однако он придает
holo-ферменту такую конформацию, которая обладает повышенным
сродством к промотору. Стадии узнавания и связывания, а также инициации
осуществляются holo-ферментом. Элонгация и терминация осуществляются
core-ферментом.
Инициация. Последовательность
ДНК,
транскрибирующаяся в одну иРНК, начинающаяся промотором на 5'-конце и
заканчивающаяся терминатором на 3'-конце, является единицей
транскрипции и соответствует современному понятию «ген». Контроль
экспрессии генов может осуществляться на этапе инициации транскрипции.
99
На этом этапе РНК-полимераза распознает промотор — фрагмент длиной 4144 п.н. Транскрипция ДНК происходит в направлении 5'—3', или слева
направо. Предполагается, что последовательность ТАТА контролирует выбор
стартового нуклеотида, а ЦААТ — первичное связывание РНК-полимеразы с
ДНК-матрицей.
Терминация.
Транскрипция завершается в специфическом участке ДНК,
содержащем терминирующую последовательность. В клетках Е. сoli выявлен
особый белок (ро-фактор), повышающий точность терминации. Белок
присоединяется к 5'-концу растущей иРНК и продвигается по ней,
постепенно приближаясь к ДНК и как бы преследуя РНК-полимеразу. В
момент, когда РНК-полимераза останавливается в сайте-терминаторе,
фермент захватывается ро-фактором и сбрасывается с ДНК. Терминатор
содержит особую последовательность оснований, прочитывающуюся
одинаково в обеих цепях ДНК, но в противоположных направлениях.
Регуляторные белки (транскрипционные факторы): структура,
связывание с ДНК, взаимодействие с РНК-полимеразой и между собой.
Регуляторные белки бывают двух типов: белок-репрессор или белокактиватор. Они присоединяются к специфическим нуклеотидным
последовательностям ДНК оператора, что либо препятствует транскрипции
генов (негативная, отрицательная регуляция), либо способствует ей
(позитивная,
положительная
регуляция);
механизмы
их
работы
противоположны. Кроме того, на работу белков-репрессоров могут влиять
вещества - эффекторы: соединяясь с репрессором, они влияют на его
взаимодействие с оператором.
У прокариот, если какой-нибудь участок транскрибируется, то он
автоматически транслируется, т. е. регуляция синтеза белка у прокариот
осуществляется на уровне транскрипции.
У эукариот транскрипция и трансляция пространственно разделены
(транскрипция в ядре, трансляция в цитоплазме), и регуляция синтеза белка
проходит в 3 этапа:
1.транскрипция
2.экспорт
3.трансляция
из
ядра
Регуляция синтеза белка у эукариот осуществляется в основном на уровне
трансляции, когда регуляторные вещества присоединяются к управляющим
участкам
3‘-НТО
и
5‘-НТО.
5'-НТО
отвечает
за
частоту
трансляции
3'-НТО отвечает за время жизни иРНК в цитоплазме.
Транскрипция у эукариот регулируется почти так же, как у прокариот.
Разница: у эукариот транскрипция может не только подавляться
100
репрессорами, присоединенными к операторам, но и стимулироваться
активаторами, присоединенными к энхансерам опероны у эукариот
пространственные, т. е. участок, к которому присоединен репрессор, может
находиться не в том же участке хромосомы, где лежат промотор и
структурные гены, и приближаться к ним за счет укладки ДНК в
интерфазном ядре.
Индивидуальные вопросы для подготовки к семинарскому занятию:
1. Регуляторные белки (транскрипционные факторы): cтруктура,
связывание с ДНК, взаимодействие с РНК-полимеразой и между собой,
механизм репрессии и активации транскрипции.
2. Значение ди- и олигомеризации регуляторных белков.
3. Основные
белковые
домены,
узнающие
специфические
последовательности ДНК (спираль-поворот-спираль, спираль-петляспираль, гомеодомен, "лейциновая застежка", "цинковые пальцы").
4. Модули последовательностей ДНК, узнаваемые регуляторными
белками (промоторы и энхансеры, операторы).
5. Промоторы эукариот: размеры, положение, структура и механизм
распознавания различными РНК-полимеразами.
6. Промоторные элементы, контролирующие точку инициации и
интенсивность транскрипции.
7. Стадии инициации транскрипции. Различия механизмов инициации у
про-и эукариот.
8. Опероны бактерий. Понятие об индуцибельных и репрессибельных
оперонах. Негативная и позитивная регуляция оперонов бактерий на
примере лактозного, арабинозного и триптофанового оперона.
9. Понятие о регулоне.
10.Регуляторная роль бактериальной фосфотрансферазной системы.
11. Механизмы катаболитной репрессии.
12.Контроль утилизации галактозы у дрожжей.
13.Модульная организация
14.регуляторных белков.
15.Дрожжевые двухгибридные системы.
16.Контроль терминации транскрипции.
17.Антитерминация. Белки N и Q фага. nut-сайты и Nus-белки. bgl-оперон.
Практическое занятие № 2
ТЕМА: ПОСТТРАНСКРИПЦИОННАЯ РЕГУЛЯЦИЯ
101
ЦЕЛЬ: Изучить механизм посттранскрипционной регуляции, контроль
процессинга пре-мРНК, а также методы регуляции стабильности мРНК.
ПЛАН
1. Понятие посттранскрипционной регуляции.
2. Способы посттранскрипционной регуляции.
3. Осуществление контроля процессинга пре-мРНК.
ОБЩИЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ СВЕДЕНИЯ
Посттранскрипционная регуляция - это контроль экспрессии генов на
уровне РНК. Это происходит, когда РНК-полимераза присоединяется к
промотору гена и синтезирует нуклеотидную последовательность. Поэтому,
как следует из названия, это происходит между транскрипцией фазой и
переводом фазой геном экспрессии. Эти меры имеют решающее значение
для регуляции многих генов в тканях человека. Он также играет большую
роль в физиологии клетки, будучи вовлеченным в такие патологии, как рак и
нейродегенеративные заболевания.
Основные способы такой регуляции – альтернативный сплайсинг, РНКинтерферренция и изменения стабильности РНК (изменения скорости
деградации
РНК).
Альтернативный сплайсинг – это вырезание экзонов и их объединение
в разных комбинациях. Поэтому одна пре-РНК может давать несколько
разных мРНК. Один ген может кодировать не один белок, а несколько.
Например, во всех клетках есть ген кальцитонина, но в щитовидной железе
он экспрессируется в виде гормона кальцитонина, в гипофизе - нейропептида
CGRP. Альтернативный сплайсинг широко представлен в геноме человека,
поэтому протеом человека содержит намного большее количество белков,
чем
протеомы
других
организмов.
РНК-интерференция – это торможение экспрессии гена на стадии
трансляции или транскрипции действием малых РНК. Они выключают
роботу тех генов, последовательности которых отвечают цепи молекулы
малой
РНК.
Деградация мРНК. Время жизни эукариотических мРНК составляет от
нескольких часов до нескольких дней, а прокариотических – несколько
минут. Продолжительность жизни мРНК является важным механизмом
регуляции синтеза белков. Разрушение мРНК у эукариот осуществляется 3‘РНК-азами (у прокариот 5‘-РНК-азами). мРНК эукариот начинает
разрушаться с некодирующего полиаденилатного фрагмента. Этот фрагмент
подобно теломерным последовательностям ДНК служит буферной зоной,
которая защищает кодирующую часть мРНК от разрушения. В промежутке
между завершением трансляции мРНК одной рибосомой и началом
трансляции следующей 3‘-РНК-аза успевает отщепить от ее поли(А)
фрагмент 10-15 нуклеотидов. Когда в этом фрагменте остается около 50
102
нуклеотидов (критическая длина), быстро наступает полный гидролиз мРНК.
Кратность трансляции мРНК обычно не превышает 10-15 раз. Разница в
продолжительности жизни различных мРНК объясняется как разной длиной
поли-(А) -фрагмента, так и тем, что в короткоживущих мРНК между
кодирующей частью и полиаденилатным фрагментом находятся АУ-багатые
элементы. Наличие последовательностей обогащенных аденином и урацилом
резко усиливает деградацию поли (А) -фрагмента.
Контроль процессинга пре-мРНК (транс-сплайсинг, альтернативный
сплайсинг,
альтернативное
полиаденилирование).
Эукариоты широко используют возможность регулировать синтез белка на
посттранскрипционном уровне. Возникшая при транскрипции пре-мРНК у
эукариот претерпевает процессинг. Регулировать образование зрелых мРНК
можно через изменение активности ферментов и вспомогательных белков,
нужных для кэпирования, образования полиА-хвоста, обычного и
альтернативного сплайсинга.
Альтернативный сплайсинг позволяет получить различные белковые
продукты с одного гена благодаря ―сшиванию‖ разных наборов экзонов и
интронов при построении разных мРНК. Большое значение имеют присущие
эукариотическим клеткам механизмы управления альтернативным
сплайсингом. Характер сплайсинга регулируется белками, способными
связываться с пре-мРНК в районе интронов или на границе ―экзон-интрон‖.
Присоединение таких регуляторных белков может блокировать удаление
одних интронов, одновременно активируя вырезание других.
На конечный результат - синтез белка - влияет также скорость
транспорта РНК из ядра в цитоплазму, время ―полужизни‖ мРНК, степень ее
стабильности в цитоплазме, скорость поступления на рибосомы и
эффективность связывания с ними.
‘‘Временем полужизни‖ называют время, в течение которого
популяция молекул данного типа мРНК уменьшается наполовину. Известно,
что время существования мРНК увеличивается с удлинением ее полиАхвоста. Время полужизни большинства мРНК дрожжей составляет 10-20 мин,
хотя для некоторых оно уменьшается до 1 мин, а для других возрастает до 35
мин. У млекопитающих время полужизни мРНК обычно составляет
несколько часов.
Клетка имеет возможность резко снизить время полужизни
нежелательных мРНК (например, вирусных): с помощью особых малых РНК
и специальных белковых комплексов такие мРНК обнаруживаются и
расщепляются. Этот механизм носит название РНК-интерференции, или
посттранскрипционного генного сайленсинга.
Скорость освобождения РНК от сопровождающих белков и
поступления на рибосомы регулируется белками, окружающими ее в
информосомах (РНП- комплексах). В цитоплазме мРНК могут определенное
время храниться в виде нетранслируемых мРНП-комплексов.
103
Некоторые из белков этих комплексов участвуют в регуляции
матричной активности мРНК. Например, если в РНП-комплексе на одну
молекулу мРНК приходится 5 - 10 молекул белка p50, трансляция этой РНК
ингибируется, если 1-4 молекулы - активируется. Предполагают, что при
более высоком содержании белка его С-концевые части освобождаются от
контактов с РНК и начинают взаимодействовать между собой. Это приводит
к мультимеризации белка и переходу мРНП в конденсированное
(нетранслируемое) состояние.
В процессе транс-сплайсинга сплайсома выбирает для объединения 5'сайт и 3'- сайт сплайсинга, которые располагаются на разных молекулах
РНК. Транс-сплайсинг обнаружен у простейших (трипаносом), евглен,
нематод и плоских червей, а также в митохондриях, хлоропластах и
безрибосомных пластидах высших растений. Наиболее хорошо изучен
механизм транс-сплайсинга у нематоды.
Полиаденилирование- присоединение аденина к 3'-концу мРНК- это
один из вариантов посттранскрипционного процессинга (модификации)
мРНК, играющий значение, в том числе и в регуляции экспрессии генов.
Процессинг 3'-конца является важным этапом в созревании мРНК у всех
эукариот. Полиаденилирование необходимо для терминации транскрипции,
для транспорта мРНК из ядра, стабильности (защищает мРНК от деградации
нуклеазами)
и
инициации
трансляции.
Полиаденилированиедвухэтапная
реакция:
1)сайт-специфичное
разрезание
пре-мРНК
2)синтез поли-А хвоста определенной длины на 3'-конце порезанного
продукта.
Индивидуальные вопросы для подготовки к семинарскому занятию:
1. Регуляция стабильности мРНК.
2. Факторы, влияющие на стабильность мРНК.
3. РНКазы, участвующие в деградации мРНК (РНКаза Е, РНКаза
III, полинуклеотидфосфорилаза, РНКаза II).
4. Мультибелковые комплексы деградации РНК.
5. РНК-хеликазы в деградации РНК.
6. Действие полиаденилирования на стабильность бактериальных и
эукариотических мРНК.
7. Участие нетранслируемых молекул РНК в регуляции: контроль
инициации репликации ДНК, процессинга РНК и ее трансляции.
8. Антисмысловая РНК.
9. МикроРНК как регулятор.
10. РНК-интерференция.
104
Практическое занятие № 3
ТЕМА: ПОСТТРАНСЛЯЦИОННАЯ РЕГУЛЯЦИЯ И МЕЖКЛЕТОЧНЫЕ
КОММУНИКАЦИИ.
105
ЦЕЛЬ:
усвоение
основных
представлений
о
механизмах
посттрансляционной регуляции, а также структуры межклеточных
коммуникаций.
ПЛАН
1. Механизм посттрансляционной регуляции.
2. Фолдинг и деградация белков как компоненты регуляторных
систем.
3. Формирование нативной трехмерной структуры белков.
ОБЩИЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ СВЕДЕНИЯ
После завершения трансляции большинство белков подвергается
дальнейшим
химическим
модификациям,
которые
называются
посттрансляционными модификациями. Посттрансляционные модификации
могут регулировать продолжительность существования белков в клетке, их
ферментативную активность и взаимодействия с другими белками. Иногда
посттрансляционные модификации являются обязательным этапом
созревания белка, в противном случае он оказывается функционально
неактивным. Посттрансляционные модификации могут быть как широко
распространѐнными, так и уникальными. Универсальная модификация убиквитинирование (присоединение к белку цепи из нескольких молекул
короткого белка убиквитина), которое служит сигналом к расщеплению этого
белка протеасомой. Другой распространѐнной модификацией является
гликозилирование.
К
редким
модификациям
относят
тирозинирование/детирозинирование и полиглицилирование тубулина.
Один и тот же белок может подвергаться многочисленным
модификациям. Посттрансляционные модификации делят на: модификации
главной цепи;
отщепление N-концевого остатка метионина; ограниченный протеолиз
— удаление фрагмента белка, которое может происходить с концов
(отщепление сигнальных последовательностей) или, в отдельных случаях, в
середине молекулы; присоединение различных химических групп к
свободным амино- и карбоксильной группам (N-ацилирование,
миристоилирование); модификации боковых цепей аминокислот;
присоединение или отщепление небольших химических групп
(гликозилирование, фосфорилирование); присоединение липидов и
углеводородов; изменение стандартных аминокислотных остатков на
нестандартные (образование цитруллина);
образование дисульфидных мостиков между остатками цистеина;
присоединение
небольших
белков
(сумоилирование
и
убиквитинирование).
Шапероны. В клетках существует группа белков, функция которых —
обеспечение правильного сворачивания других белков после их синтеза на
106
рибосоме, восстановление структуры белков после их повреждения, а также
создание и диссоциация белковых комплексов. Эти белки называются
шаперонами. Концентрация многих шаперонов в клетке возрастает при
резком повышении температуры окружающей среды, поэтому они относятся
к группе Hsp (англ. heat shock proteins — белки теплового шока).
Фолдинг и деградация белков как компоненты регуляторных систем.
Деградация белков в клетке. Белки выполняют в клетке закреплѐнную
за ним функцию, а затем, в определѐнный момент, клетке необходимо от
него избавиться. Необходимость избавиться от белка обусловлена рядом
причин: во-первых, дальнейшая активность белка может навредить клетке,
во-вторых, нужно синтезировать новые белки, а перегрузка цитоплазмы
полипептидами является источником апоптоза. Переставшие быть
необходимыми, белки подвергаются протеолитической деградации.
Фолдингом белка называют процесс спонтанного сворачивания
полипептидной цепи в уникальную нативную пространственную структуру
(так называемая третичная структура).
Каждая молекула белка начинает формироваться как полипептид,
транслируемый из последовательности мРНК в виде линейной цепочки
аминокислот. У полипептида нет устойчивой трѐхмерной структуры. Однако
все аминокислоты в цепочке имеют определѐнные химические свойства:
гидрофобность, гидрофильность, электрический заряд. При взаимодействии
аминокислот друг с другом и клеточным окружением получается хорошо
определѐнная трѐхмерная структура — конформация. В результате на
внешней поверхности белковой глобулы формируются полости активных
центров, а также места контактов субъединиц мультимерных белков друг с
другом и с биологическими мембранами.
В редких случаях нативными могут быть сразу две конформации белка.
Они могут сильно различаться, и даже выполнять различные функции. Для
этого необходимо, чтобы в разных областях фазового пространства белковой
молекулы существовали два примерно равных по энергии состояния, каждое
из которых будет встречаться в нативной форме с соответствующей
вероятностью. Для стабилизации третичной структуры многие белки в клетке
подвергаются посттрансляционной модификации. Часто встречаются
дисульфидные мостики между пространственно близкими участками
полипептидной цепи. В фолдинге участвуют белки-шапероны. Существует
четыре типа молекул, которые играют роль таких шаперонов.
1. Молекулы, обеспечивающие правильный фолдинг белков.
2. Молекулы, созданные для удержания частично свернутой молекулы
белка в определенном положении. Это необходимо, чтобы система имела
возможность закончить фолдинг.
3. Шапероны, разворачивающие белки с неправильной формой.
4.Шапероны, сопровождающие белки, транспортируемые через
клеточную мембрану.
107
Формирование нативной трехмерной структуры белков.
Трехмерная структура белка играет важную роль в обеспечении его
специфической функциональной активности. Она формируется в результате
взаимодействия структур более низких уровней. Третичная структура —
пространственное строение полипептидной цепи. Структурно состоит из
элементов вторичной структуры, стабилизированных различными типами
взаимодействий,
в
которых гидрофобные
взаимодействия играют
важнейшую роль. В стабилизации третичной структуры принимают участие:

ковалентные
связи (между
двумя
остатками цистеина —
дисульфидные мостики);

ионные связи между противоположно заряженными боковыми
группами аминокислотных остатков;

водородные связи;

гидрофобные
взаимодействия.
При
взаимодействии
с
окружающими молекулами воды белковая молекула сворачивается так,
чтобы неполярные боковые группы аминокислот оказались изолированы от
водного раствора; на поверхности молекулы оказываются полярные
гидрофильные боковые группы.
Между уровнем вторичной структуры и атомарной пространственной
выделяют ещѐ один уровень — мотив укладки. Мотив укладки определяется
взаимным расположением элементов вторичной структуры (α-спиралей и βтяжей) в пределах белкового домена — компактной глобулы, которая может
существовать или сама по себе или входить в состав более крупного белка.
Индивидуальные вопросы для подготовки к семинарскому занятию:
1. Молекулярные шапероны семейств Hsp60 и Hsp70 у про- и
эукариот.
2. Рабочий цикл шаперонных комплексов GroELS и DnaKJ-GrpE.
3. Участие молекулярных шаперонов в регуляторных процессах.
4. Деградация белков: АТФ-зависимые протеазы прокариот и 26Sпротеасома эукариот.
5. Механизм распознавания аномальных белков.
6. Система убиквитинирования белков эукариот.
7. Роль контролируемого протеолиза в регуляции метаболизма у
про- и эукариот.
8. Автоиндукторы бактерий и их синтез.
9. Роль АГСЛ-сигналов в экологии бактериальных популяций.
10.Контроль биолюминесценции у Vibrio fischeri.
11.Регуляция синтеза экзоферментов и антибиотиков у
пектобактерий.
108
Практическое занятие № 4
ТЕМА: СЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ.
ЦЕЛЬ: усвоение основных представлений о механизмах регуляции
экспрессии генов у про- и эукариот на уровне транскрипции.
ПЛАН
1.
2.
3.
4.
5.
Понятие о сенсорных системах.
Трансмембранные рецепторы.
Механизмы передачи сигнала.
Передача информации через клеточную мембрану.
Белковые каналы, транспортеры и рецепторы.
ОБЩИЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ СВЕДЕНИЯ
Для бактерий (как, впрочем, и для любого другого организма)
способность координировать экспрессию генов с изменениями условий
окружающей среды дает существенное селективное преимущество.
Адаптация бактерий к изменяющимся условиям среды контролируется
белковыми системами передачи сигнала. Такие системы состоят из белковых
модулей-доменов, собранных в несколько молекул, количество которых
варьирует в зависимости от вида бактерии и конкретного фактора среды.
Основными компонентами сенсорных систем являются:

сенсоры
(трансмембранные
или
цитоплазматические),
детектирующие изменения окружающих условий;

внутриклеточные посредники, получающие информацию от
сенсоров и передающие ее на эффекторы;

эффекторы - непосредственные регуляторы физиологического
ответа (как правило, на уровне транскрипции).
Трансмембранные рецепторы.
Механизм детекции сигнала не совсем ясен. Детектируемый сигнал
может быть как вне-, так и внутриклеточным. В некоторых случаях показано,
что сигнал детектируется периплазматическим доменом. Так, PhoQ регулятор экспрессии факторов вирулентности у Salmonella typhimurium, является сенсором дивалентных катионов, которые, связываясь
непосредственно
с
периплазматическим
доменом,
стабилизируют
неактивную конформацию PhoQ. Сигнал может быть внутриклеточным.
Рецептор Aer, участвующий в регуляции аэротаксиса, детектирует
внутриклеточный запас энергии, связываясь с FAD. Еще один пример –
детекция внутриклеточной концентрации глутамина при регуляции азотного
метаболизма. В ряде случаев показано, что сенсором является
трансмембранный домен. Так, Cpx-путь активирован у мутантов E. coli,
109
лишенных фосфатидилэтаноламина - таким образом, простое нарушение
мембранной структуры приводит к активации этого сигнального пути. У
белка EnvZ E. coli - гистидинкиназы, участвующей в осморегуляции,
периплазматический домен может быть делетирован без потери сенсорной
функции.
Механизм передачи сигнала.
Многие бактериальные рецепторы имеют периплазматический домендетектор (P) и цитоплазматический сигнальный домен (C), заякоренные в
мембране двумя α-спиральными трансмембранными сегментами. Линейная
структура таких белков может быть представлена как TM1–P–TM2–L–C, где
L - цитоплазматический линкер. Сигнальный домен либо сам является
гистидинкиназой (EnvZ) либо с гистидинкиназой взаимодействует (MCP
рецепторы хемотаксиса).
Механизм передачи сигнала с сенсорного на сигнальный домен неясен.
Рецепторы обычно являются мембранными белками, гомодимерами.
Предполагалось, что конформационные изменения, возникающие при
связывании субстрата, передаются через мембрану на цитоплазматические
домены рецептора, что влияет на взаимодействие сигнальных доменов между
собой. Однако делеция одного из двух сигнальных доменов (равно как и
удаление всех трансмембранных сегментов) у димера не лишает его
активности.
Двухкомпонентная система состоит из двух белков – гистидиновой
протеинкиназы (ГК), содержащей консервативный киназный домен и
регулятора ответа (РО), содержащего консервативный регуляторный домен.
Внеклеточные сигналы детектируются ГК, что приводит к изменению
ее активности.
Затем ГК передает фосфогруппу на РО (реакцию катализирует сам РО).
Перенос фосфата на РО приводит к активации эффекторного домена этого
белка, что и вызывает в конечном итоге специфический физиологический
ответ.
Передача информации через клеточную мембрану.
Важное свойство мембран - способность воспринимать и передавать
внутрь клетки сигналы из внешней среды. "Узнавание" сигнальных молекул
осуществляется с помощью белков-рецепторов, встроенных в клеточную
мембрану клеток-мишеней или находящихся в клетке. Клетку-мишень
определяют по способности избирательно связывать данную сигнальную
молекулу с помощью рецептора.
Если сигнал воспринимается мембранными рецепторами, то схему
передачи информации можно представить так:
•
взаимодействие рецептора с сигнальной молекулой (первичным
посредником);
•
активация мембранного фермента, ответственного за образование
вторичного посредника;
110
•
образование вторичного посредника цАМФ, цГМФ, ИФ3, ДАТ
или Са2+;
•
активация посредниками специфических белков, в основном
протеинкиназ, которые, в свою очередь, фосфорилируя ферменты, оказьюают
влияние на активность внутриклеточных процессов.
Несмотря на огромное разнообразие сигнальных молекул, рецепторов и
процессов, которые они регулируют, существует всего несколько механизмов
трансмембранной
передачи
информации:
с
использованием
аденилатциклазной системы, инозитолфосфатной системы, каталитических
рецепторов, цитоплазматических или ядерных рецепторов.
Белковые каналы, транспортеры и рецепторы. Рецепторная функция
воротных каналов.
Воротный механизм белковых каналов обеспечивает способ регуляции
ионной проницаемости каналов. Полагают, что некоторые ворота фактически
являются удлинением транспортной белковой молекулы, которое может
закрывать или открывать отверстие канала при кон-формационном
изменении формы самой белковой молекулы. Открытие и закрытие ворот
регулируется двумя основными способами:
1.Электроуправляемые ворота. В этом случае молекулярная
конформация ворот или их химических связей соответствует электрическому
потенциалу на клеточной мембране. Напротив, когда внутренняя сторона
мембраны теряет отрицательный заряд, эти ворота могут внезапно
открываться, позволяя громадному числу ионов натрия проходить через
натриевые поры. Это основной механизм генерации в нервах потенциалов
действия, ответственных за проведение нервных сигналов. Открытие этих
ворот частично обусловливает завершение потенциала действия.
2. Хемоуправляемые (лигандуправляемые) ворота. Некоторые ворота
белковых каналов открываются при связывании с белком химического
вещества лиганда. Это ведет к конформационному или химическому
изменению в белковой молекуле, что открывает или закрывает ворота. Такой
воротный механизм называют химическим, или лигандным. Одним из
наиболее важных примеров химического воротного механизма является
действие ацетилхолина на так называемый ацетилхолиновый канал.
Ацетилхолин открывает ворота этого канала, в результате появляется
отрицательно заряженная пора диаметром около 0,65 нм, через которую
могут проходить незаряженные молекулы или положительные ионы
меньшего диаметра. Эти ворота исключительно важны для передачи нервных
сигналов от одной нервной клетки к другой и от нервных клеток к
мышечным, что необходимо для мышечного сокращения.
Открытое и закрытое состояние воротных каналов. Примечательно, что
канал проводит ток по принципу «все или ничего». Это значит, что ворота
канала резко открываются и затем также резко закрываются, причем в
открытом состоянии канал находится от долей миллисекунды до нескольких
миллисекунд. При одном уровне потенциала канал может оставаться
111
практически все время закрытым, а при другом уровне — почти все время
открытым. Как показано при промежуточных уровнях мембранного
потенциала ворота натриевого канала имеют склонность периодически
быстро открываться и закрываться, обеспечивая среднее значение тока.
Метод «пэтч-кламп» для регистрации ионного тока, протекающего через
одиночные каналы.
Микропипетку с диаметром кончика не более 1-2 мкм подводят
вплотную к мембране с наружной стороны. Затем изнутри пипетки создают
отрицательное давление, благодаря чему расположенный напротив участок
мембраны подсасывается к кончику пипетки, формируя плотный контакт с
его краями. В результате можно регистрировать электрический ток,
протекающий через очень маленький кусочек («пэтч») мембраны у верхушки
пипетки. Кроме того маленький кусочек клеточной мембраны на конце
пипетки можно вырвать из клетки. Затем пипетку с герметически
сцепленным с ней кусочком помещают в любой раствор. Это позволяет, по
желанию экспериментатора, изменять состав раствора как внутри пипетки,
так и снаружи, а также поддерживать на любом заданном уровне разность
потенциалов между двумя сторонами мембраны, т.е. фиксировать («кламп»)
напряжение. Можно выделить такой малый участок мембраны, что в нем
обнаруживается лишь один белковый канал, доступный для изучения. Путем
изменения концентраций разных ионов и напряжения по обе стороны
мембраны можно определять транспортные характеристики одиночного
канала и свойства его воротных механизмов.
Индивидуальные вопросы для подготовки к семинарскому занятию
( бригадные задания):
1. Двухкомпонентные сенсорные системы. Структура сенсоров и
регуляторов и их функционирование. Архитектура регуляторных
систем.
Фосфотрансляционные
системы.
Работа
двухкомпонентной системы EnvZ/OmpR при осморегуляции.
Распространение двухкомпонентных сенсорных систем у
различных представителей про- и эукариот.
2. Хемотаксис у бактерий. Устройство и принцип действия
двигательного аппарата бактерий. 77 Регуляция синтеза
жгутикового аппарата. Белковый аппарат хемотаксиса.
Рецепторы хемотаксиса. Цитоплазматические сигнальные белки
и регуляторный механизм хемотаксиса. Метилазы хемотаксиса и
сенсорная адаптация.
3. Сенсорные процессы и внутриклеточная регуляция у эукариот.
Сенсорные механизмы эукариот. Компоненты сигнальных путей
(рецепторы, G-белки, адапторы, эффекторы, вторичные
мессенджеры). Киназы как компоненты сигнальных путей. Типы
протеинкиназ. Способы передачи сигнала через клеточную
112
мембрану. Типы трансмембранных рецепторов и механизмы их
активации. Тримерные и мономерные G-белки: структура и
принцип действия. Способы передачи сигнала в ядро. Контроль
специфичности сигнализации. Сигнальные пути cAMP-PKA,
TGF-Smad, JAK-STAT и RasMAPK.
4. Особенности сенсорных процессов у растений. Различия
сенсорных процессов растений и животных. Молекулярные
механизмы действия основных фитогормонов и света на
метаболизм клеток растений (на уровне транскрипционного
контроля). Особенности строения мембранных рецепторов
растений. LRR-домен. Принцип детекции патогенов и активации
защитных
ответов
растений.
Молекулярный
контроль
пролиферации и дифференциации клеток меристемы.
Практическое занятие № 5-6
113
ТЕМА: АДАПТАЦИЯ К СТРЕССОВЫМ УСЛОВИЯМ И КОНТРОЛЬ
ЛОКАЗИЗАЦИИ БЕЛКОВ. МЕХАНИЗМЫ АДАПТАЦИИ КЛЕТКИ К
СТРЕССОВЫМ УСЛОВИЯМ.
ЦЕЛЬ: усвоение механизмов адаптации клетки к стрессовым условиям.
1.
2.
3.
4.
ПЛАН
Адаптация и механизм адаптации клетки к стрессовым условиям:
клеточная адаптация, биофизические механизмы адаптации,
механизмы стресса на клеточном уровне.
Физиологические функции, находящиеся под контролем
альтернативных сигма-факторов. Промоторы и регуляторные
белки, участвующие во взаимодействии с альтернативными
сигма-факторами.
Общий стресс: регулон RpoS.
Периплазматический стресс: регулон RpoE.
ОБЩИЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ СВЕДЕНИЯ
На клеточно-молекулярном уровне под стрессом понимается угроза
нарушения динамического гармонического баланса активных компонентов
внутренней среды организма. В этом заключается представление о
гомеостазе (в широком смысле этого понятия) и о количественной градации
стресса в зависимости от степени угрозы нарушений внутреннего баланса.
Клеточная адаптация — приспоспособление клеток к условиям
окружающей среды, направленное на выживаемость и воспроизведение.
Клеточная адаптация условно разделяется на гено- и фенотипическую.
Генотипическая адаптация. возникает вследствие отбора клеток с
определенным генотипом, обусловливающим выносливость; фенотипическая
адаптация возникает как защитная реакция на действие повреждающего
фактора.
Скорость изменения резистентности клетки, как и длительность
адаптации, значительно варьирует. Степень адаптации клетки — повышение
или понижение порога чувствительности — обеспечивает уровень активной
функции (напр., функции рецепторов).
Механизмы, лежащие в основе адаптации, зависят от природы клеток и
характера повреждающего фактора. В некоторых случаях клетки способны
изменять повреждающее вещество путем физико-химического связывания
агента или путем химического превращения его в менее токсическую форму.
Бактериальные клетки могут синтезировать специальные ферменты,
расщепляющие токсическое вещество (индукция пенициллиназы в культуре
стафилококков, устойчивых к пенициллину). Повышение устойчивости
клетки к стрессу может быть обусловлено повышением устойчивости самих
белков цитоплазмы за счет изменений конформации цепей белка либо путем
114
образования комплекса фермент — субстрат, или за счет синтеза новых
белков.
Биофизические механизмы адаптации. Биофизика рассматривает
приспособительную реакцию клетки как системы, открытой по отношению к
внешней среде, т. е. свободно обменивающейся с последней энергией и
веществом. Для поддержания стационарного состояния живая система
использует принцип обратной связи, или динамической аутостабилизации,
что позволяет живой системе как бы автоматически выбирать тот режим
скоростей обменных реакций, который обеспечивает оптимальный вариант
приспособления к внешней среде. Напр., при возрастании функциональной
активности клетки (повышение теплопродукции, производство осмотической
или механической работы и др.) в ее митохондриях возникает дефицит АТФ
и накапливаются АДФ и фосфор, которые в свою очередь ускоряют процесс
биосинтеза АТФ в дыхательной цепи.
Адаптационная реакция живой системы представляет собой переход с
одного
Механизмы стресса на клеточном уровне проходят три фазы: фазу
реакции, фазу адаптации и, наконец, в случае продолжительного
губительного действия отрицательных воздействий – фазу гибели
(истощения ресурсов надежности, повреждения), в течение которой
наблюдаются необратимые деструктивные изменения (Пахомова, 1999).
В целом реакция растения на изменившиеся условия является
комплексной, включающей изменения биохимических и физиологических
процессов. Эти изменения могут носить как неспецифический, так и
специфический характер.
Неспецифическими являются однотипные реакции организма на
действие разнородных стрессоров или разных организмов на один и тот же
стресс-фактор. К специфическим относят ответные реакции, качественно
отличающиеся в зависимости от фактора и генотипа.
К первичным неспецифическим процессам, происходящим в клетках
при действии любых стрессоров, относятся следующие:
1. Повышение проницаемости мембран, деполяризация мембранного
потенциала плазмалеммы.
2. Вход ионов кальция в цитоплазму из клеточных стенок и
внутриклеточных компартментов (вакуоль, эндоплазматическая сеть,
митохондрии).
3. Сдвиг рН цитоплазмы в кислую сторону.
4. Активация сборки актиновых микрофиламентов цитоскелета, в
результате чего возрастает вязкость и светорассеяние цитоплазмы.
5. Усиление поглощения кислорода, ускоренная трата АТФ, развитие
свободнорадикальных процессов.
6. Повышение содержания аминокислоты пролина, которая может
образовывать агрегаты, ведущие себя как гидрофильные коллоиды и
способствующие удержанию воды в клетке. Пролин может связываться с
белковыми молекулами, защищая их от денатурации.
115
7. Активация синтеза стрессовых белков.
8. Усиление активности протонной помпы в плазмалемме и, возможно,
в тонопласте, препятствующей неблагоприятным сдвигам ионного
гомеостаза.
9. Усиление синтеза этилена и абсцизовой кислоты, торможение
деления и роста, поглотительной активности клеток и других
физиологических процессов, осуществляющихся в обычных условиях.
Физиологические
функции,
находящиеся
под
контролем
альтернативных
сигма-факторов.
Альтернативный σ-фактор контролирует большинство генов азотного метма. Альтернативные σ-факторы σ70 этого семейства, в свою очередь, могут
быть сгруппированы в три подсемейства, контролирующих споруляцию,
подвижность и разнообразные внецитоплазматические функции (синтез
секретируемых белков, транспорт железа, реакция на различные
стрессовые
воздействия). Представители
семейства
σ54
также
присутствуют у многих бактерий и контролируют азотный метаболизм,
синтез ряда гидролаз и жгутиковых белков.
Альтернативный сигма фактор 54 учитывает в транскрипции генов с
различными физиологическими факторами: гены ассимиляции азота Е. coli и
S. typhimurium, гены с-мы жгутиков P. aeruginosa, V. cholerae и Caulobacter
crescentus, и гены пилинов, необх-ые для вирулентности Р. aeruginosa и
Neisseria gonorrhea.
Промоторы и регуляторные белки, участвующие во взаимодействии с
альтернативными
сигма-факторами.
Узнавание промотора у бактерий требует ассоциации кор-фермента РНКполимеразы с сигма (σ) субъединицей, что дает активный холофермент.
Все свободноживущие бактерии сод-ат множественные сигма-факторы (у
некоторых описано до 10-20). К числу таковых относятся основной
сигма-фактор, контролирующий
гомеостатические
функции,
и
альтернативные сигма-факторы, активируемые специфическими сигналами
/
стрессовыми условиями. Только
один
σ-фактор
обеспечивает
транскрипцию
всех
жизненно важных
генов,
обеспечивающих
гомеостатические клеточные процессы (репликацию ДНК, транскрипцию,
трансляцию и т.д.). Этот сигма-фактор называют основным, а все
остальные – альтернативными.
Инактивация основного σ-фактора летальна, альтернативных, как
правило, – нет. Последовательности промоторов,
опознаваемых
альтернативными сигма-факторами, существенно различаются и, как
правило, не м/б распознаны более чем одной сигма-субъединицей.
Будучи глобальными регуляторами, сигма факторы, как правило, не
детектируют изменение условий сами, а полагаются в этом на др. Б. Сигмафакторы обычно являются конечным либо (реже) промежуточным звеном
какого-либо регуляторного каскада. Именно поэтому
сигма-факторы
116
обычно сами подвержены регуляции, причем осуществляется она м/т на
транскрипционном, трансляционном и посттрансляционном уровнях.
Общий
стресс:
регулон
RpoS.
Буква S в названии σs происходит от стационарной фазы роста, на
протяжении которой этот фактор был впервые обнаружен. Затем присутствие
этого сигма-фактора было обнаружено в других стрессовых условиях, и
сейчас считается, что присутствие σs является свидетельством т.н. «общего
стрессового ответа». Этот ответ наблюдается, когда клетка сталкивается с
рядом стрессовых ситуаций, видимым признаком чего является снижение
скорости роста вплоть до вхождения в стационарную фазу.
Голодание, повышение осмолярности среды или понижение pH,
неоптимальная температура – эти и другие стрессовые воздействия могут
индуцировать общий стрессовый ответ. Физиологические последствия
общего стрессового ответа включают устойчивость к многим стрессовым
воздействиям, накопление запасных питательных веществ, изменения
структуры клеточной стенки (увеличение частоты кросс-сшивок в
пептидогликане) и изменение морфологии клетки (уменьшение общего
размера и укорачивание клеток – они становятся почти сферическими).
Когда клетки E. coli входят в стационарную фазу или испытывают
ограничение в питательных веществах, у них индуцируется реакция общего
стрессового ответа, главным регулятором которой является сигма-фактор
RpoS, кодируемая геном rpoS, под контролем которого находится около 200
генов. Кроме ограничений в питательных веществах (фосфоре, азоте,
углероде, аминокислотах) и голодания, общий стрессовый ответ
индуцируется замедлением скорости роста, высоким осмотическим
давлением, низким pH, резкими скачками температуры и окислительным
стрессом.
Индукция RpoS осуществляется на нескольких уровнях рядом cis- и
trans-регуляторных элементов, а сам регулон общего стрессового ответа во
многом перекрывается с другими стрессовыми регулонами, что делает
клетки готовыми к одновременному воздействию многих стрессовых
факторов. К настоящему времени показано участие RpoS в транспозициях и
индуцированных транспозициями хромосомных перестройках при голодании
у E. coli и P. putida, хотя точная его роль в механизмах этих транспозиций
пока не определена.
Многие гены регулона общего стрессового ответа нуждаются в
(p)ppGpp- гуанозинполифосфатном нуклеотиде для своей индукции, таким
образом, регулоны жесткого и общего стрессового ответа коиндуцируются и
перекрываются.
Периплазматический стресс: регулон RpoE.
Рассмотрим принцип действия сигма-фактора E. coli, RpoE. Этот белок
принадлежит к большому семейству ECF (extracytoplasmic factors) сигмафакторов. Свое название эти сигма-факторы получили в связи с их участием
117
в регуляции экспрессии внецитоплазменных белков (периплазматических,
внешней мембраны и секретируемых во внешнюю среду). Основная функция
RpoE - обеспечивать синтез белков, ответственных за нормальный фолдинг
(сворачивание) белков внешней мембраны, но, кроме того, RpoE усиливает
транскрипцию генов теплового шока (путем активации еще oдного сигмафактора, σ32), а у патогенных бактерий родственные сигма-факторы
активируют гены вирулентности.
RpoE реагирует на белки внешней мембраны и периплазматические
белки, утратившие нормальную конформацию. Но поскольку сигма-фактор,
естественно, является цитоплазматическим, а сигнал для его активации
находится в периплазме, должен быть какой-то переносчик сигнала между
двумя клеточными компартментами. Эту функцию выполняет мембранный
белок RseA. В отсутствие сигнала RpoE инактивирован путем связывания с
RseA. Эта инактивация усиливается за счет взаимодействия RseA с
периплазматическим белком RseB. При нарушениях внешней мембраны,
предотвращающих нормальный фолдинг ее белков, RseB связывается с
неправильно свернутыми белками, освобождая RseA. Это ведет к
ослабеванию связи RseA с RpoE, а дополнительное взаимодействие
неправильно свернутых белков с RseA окончательно освобождает RpoE,
который связывается с РНК-полимеразой и активирует транскрипцию ряда
генов.
В число этих генов входят:
1.
fkpA, кодирующий периплазматический шаперон
(необходимый для нормального фолдинга периплазматических
белков и белков внешней мембраны);
2.
degP - периплазматическая протеаза, деградирующая
ненормальные или неправильно свернутые белки;
3.
rpoH - сигма-фактор, активирующий транскрипцию
генов теплового шока;
4.
собственный оперон rpoE rseABC;
5.
гены вирулентности у ряда бактерий
Поскольку RpoE активирует транскрипцию своего собственного
оперона, первоначальная индукция по механизму положительной обратной
связи резко усиливается за счет дополнительного синтеза RpoE. А поскольку
одновременно с RpoE происходит сверхпродукция негативных регуляторов
RseA и RseB, вся система быстро выключается, как только периплазма
оказывается очищенной от неправильно свернутых белков.
Индивидуальные вопросы для подготовки к семинарскому занятию:
1.
2.
3.
4.
Температурный шок.
Контроль регулона теплового шока у различных бактерий.
Тепловой шок у дрожжей.
Холодовой шок.
118
5. Кислородный стресс и редокс контроль.
6. Активные формы кислорода: их повреждающее действие и
механизм инактивации.
7. Причина кислородного стресса.
8. Механизмы окислительных повреждений клетки.
9. Защита от окислительного стресса. Регулоны SoxRS и OxyR.
10.Адаптация к анаэробиозу.
11.Белок FNR как сенсор кислорода.
12.Утилизация азота.
13.Детекция внутриклеточной концентрации азота, компоненты
регуляторной системы.
14.Структура и особенности функционирования белков RpoN и
NtrC.
Практическое занятие № 7
ТЕМА: КОНТРОЛЬ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА
119
ЦЕЛЬ: ознакомление с молекулярно-биологическими процессами,
обеспечивающими воспроизведение клеток и ядер, правильную передачу
структур носителей генетической информации у эукариот от предыдущих
поколений клеток и организмов последующим.
ПЛАН
1.
2.
3.
4.
Клеточный цикл: события в клетке от деления до деления.
Взаимосвязь инициации репликации и деления клетки.
Роль протеолиза в контроле клеточного цикла.
Деление бактериальной клетки и его регуляция
ОБЩИЕ ТЕОРЕТИЧЕСКИЕ СВЕДЕНИЯ
Большинство бактерий размножаются путем деления клетки на 2 части.
Деление грамположительной бактериальной клетки осуществляется после
репликации ДНК. Мезосомы формируют поперечную перегородку в клетке
бактерии от периферии к центру. Особенность бесполого способа
размножения грамотрицательных бактерий состоит в том, что деление
происходит путем формирования перетяжки (септального кольца) при
втягивании мембраны и клеточной стенки внутрь клетки.
Некоторые размножаются почкованием. Почкование представляет
собой процесс образования и роста почки на одном из полюсов материнской
клетки, которая проявляет признаки старения и не дает более четырех
дочерних клеток.
Половой процесс отмечен лишь в немногих случаях (у кишечной
палочки). Половое размножение у бактерий осуществляется в примитивной
форме. У бактерий не образуются гаметы, и нет слияния клеток. Однако
самое важное событие полового процесса происходит – это обмен
генетическим материалом, что именуется генетической рекомбинацией. Одна
клетка в этом случае служит донором («мужская» клетка), другая —
реципиентом («женская» клетка). Способность клетки служить донором
определяется генами, содержащимися в особой плазмиде, называемой
половым фактором или F-фактором (F от англ. fertility — плодовитость).
В этих генах закодирован белок специфических пловых пилей. Пили —
структуры полые и предполагается, что именно по этим пилям
осуществляется перенос ДНК от донора (F+) к реципиенту (F-).
Новообразованная рекомбинантная ДНК бактерии содержит гены обеих
родительских клеток.
Для бактерий характерен высокий темп размножения: деление
происходит быстро (через 20-30 минут). При такой интенсивности потомство
одной бактерии за 5 суток заполнило бы бассейны всех морей и океанов.
Однако размножение их ограничено климатическими условиями,
действием солнечного света, борьбой между видами, накопления продуктов
обмена веществ и т. д. При неблагоприятных условиях палочковидные
120
бактерии способны образовывать споры. Спорообразование не является
размножением, т.к. из каждой клетки формируется одна спора и число особей
при этом не возрастает. Спора развивается внутри клетки бактерии: до 60%
воды переходит в связанное состояние, протопласт сжимается и покрывается
очень плотной оболочкой. Оболочка бывшей клетки разрушается и спора
освобождается. Она способна сохранять жизнеспособность в течении многих
лет (устойчива против высушивания, высоких и низких температур,
ядовитых веществ). При наступлении благоприятных условий споры
набухают, оболочки разрываются и молодые сформировавшиеся клетки
выходят наружу. Таким образом, спора (у бактерий) - стадия переживания
неблагоприятных условий.
Взаимосвязь инициации репликации и деления клетки.
Регуляция процесса репликации ДНК наиболее строго
осуществляется на этапе инициации. Репликация находится под
положительным и отрицательным контролем, причем оба они
скоординированы с клеточным делением.
В общих чертах принцип такой регуляции можно сформулировать
следующим образом. При положительном контроле происходит накопление
активатора репликации до порогового, достаточного для инициации нового
цикла репликации уровня. Пороговый уровень достигается при удвоении
клеточной массы так, чтобы во вновь образовавшихся клетках процесс
репликации был бы уже запущен и успел завершиться к моменту нового
деления. При отрицательном контроле происходит накопление ингибитора
инициации репликации, который должен синтезироваться лишь в
ограниченном количестве вскоре после начала предыдущего цикла
репликации. Такой ингибитор может быть продуктом гена, локализованного
вблизи от точки начала репликации, транскрипция которого осушествляется
только в период репликации данного участка ДНК. В процессе роста клетки
ингибитор «разбавляется», а к моменту удвоения массы клетки уровень его
падает ниже критического, что позволяет клетке инициировать новый цикл
репликации. Взаимодействие этих двух механизмов и должно
координировать процессы репликации ДНК и деления клетки.
Реальные
механизмы
регуляции
репликации
еще
не
расшифрованы.
Роль протеолиза в контроле клеточного цикла.
Протеолиз — ферментативный гидролиз белков и пептидов,
катализируется протеолитическими ферментами (пептид-гидролазами,
протеазами) и играет важную роль в регуляции обмена веществ в организме.
С
протеолизом
связаны
такие
фундаментальные
процессы
жизнедеятельности, как внутриклеточный распад белков и регуляция их
кругооборота, пищеварение, оплодотворение, морфогенез, защитные
реакции, адаптационные перестройки обмена. Нарушение протеолиза и его
регуляции лежит в основе развития многих патологических состояний.
121
Различают два типа протеолиза: приводящий к полному
расщеплению белковых молекул до отдельных аминокислот и частичный, так
называемый ограниченный протеолиз, при котором избирательно
гидролизуется одна или несколько пептидных связей в молекуле
белка.Протеолиз первого типа происходит в результате согласованного
действия различных протеолитических ферментов, тогда как реакции
ограниченного П. катализируются отдельными специфическими протезами.
Полный протеолиз осуществляется при внутриклеточном распаде белков под
влиянием тканевых протеаз (часто называемых катепсинами). Он протекает
во многих случаях внутри лизосом — клеточных органелл, содержащих
набор гидролитических ферментов. Путем полного П. происходит удаление
из организма аномальных белков, образующихся в результате мутаций и
ошибок биосинтеза. Полное расщепление белковых молекул наблюдается
также при различных морфогенетических превращениях и адаптационных
перестройках обмена. В процессах пищеварения под влиянием
протеолитических ферментов желудочно-кишечного тракта пепсина,
трипсина, химотрипсина и ряда пептидаз происходит полный протеолиз
белков пищи.
Деление бактериальной клетки и его регуляция
Деление бактериальных клеток называется ―бинарным‖, во время
которого удвоенные нуклеоиды связаны с плазматической мембраной и
расходятся за счет растяжения мембраны между нуклеоидами, а затем
образуется перетяжка, делящая клетку надвое. Нуклеоид же представляет
собой циклическую молекулу ДНК, образующую многочисленные петлевые
домены в состоянии сверхспирализации.
Время между делениями бактериальных клеток в среднем составляет
20-30 мин. За это время происходят репликация ДНК нуклеоида, сегрегация,
отделение сестринских нуклеоидов и их дальнейшее расхождение,
образования септы и цитотомия, делящей исходную клетку ровно пополам.
Параллельно с синтезом ДНК происходит деспирализация петлевых
доменов за счет работы ряда ферментов (топоизомеразы, гиразы, лигазы и
др), что приводит к физическому обособлению двух дочерних хромосомнуклеоидов, которые еще находятся в тесном контакте друг с другом. После
такой сегрегации нуклеоидов происходит их расхождение от центра клетки,
места их бывшего расположения, на четверть длины клетки в двух
противоположных направлениях. В результате этого в клетке располагаются
два нуклеоида. Было устанволено, что в процессе расхождения нуклеоидов
принимают участие несколько групп специальных белков. Один из них Muk
В, представляет собой гигантский белок, состоящий из центрального
спирального участка, и концевых глобулярных участков, напоминающий по
структуре нитевидные белки эукариот. На N-конце Muk В связывается с ГТФ
и АТФ, а на С-конце – с молекулой ДНК. На этом основании белок Muk В
считают моторным белком, участвующим в расхождении нуклеоидов.
122
Кроме белка Muk В в расхождении нуклеоидов участвуют пучки
фибрилл, содержащих белок Caf A, который может связываться с тяжелыми
цепями миозина, подобно актину.
Образование перетяжки, или септы напоминает цитотомию животных
клеток. В образовании септ принимают участие фибриллярные
термочувствительные белки. Это группа из нескольких белков, среди
которых наиболее изучен белок FtsZ. Во время деления клетки весь этот
белок локализуется в зоне септы, образует сократимое кольцо напоминающее
акто-миозиновое при делении клеток животных.Параллельно образованию
септы происходит наращивание муреинового слоя бактериальной клеточной
стенки за счет работы полиферментативного комплекса РВР-3,
синтезирующего пептидогликаны.
Таким образом, при делении бактериальных клеток наблюдаются
процессы сходные с делением эукариот: расхождение хромосом
(нуклеоидов) за счет взаимодействия моторных и фибриллярных белков,
образование перетяжки за счет фибриллярных белков, образующих
сократимое кольцо. В отличие от эукариот у бактерий в этих процессах
принимают участие совсем другие белки.
Индивидуальные вопросы для подготовки к семинарскому занятию
( бригадные задания):
1. Деление бактериальной клетки и его регуляция.
2. Особенности организации генов, участвующих в делении клеток
и их функции.
3. Регуляция клеточного цикла у Escherichia coli и Caulobacter
crescentus.
4. Споруляция у Bacillus subtilis: механизм принятия решения о
начале споруляции и каскадная активация альтернативных сигмафакторов на разных стадиях споруляции.
ЛИТЕРАТУРА
1.Коваленко, Л. В. Биохимические основы химии биологически
активных веществ
2. Регуляция метаболизма клетки [Текст] : типовая учебная программа
для высших учебных заведений по направлению 1-31 01 01-03
"Биотехнология" специальности 1-31 01 01 "Биология" Утверждена учебно-
123
методическим объединением вузов Республики Беларусь по естественному
образованию. Рег. № ТД-G. 116/тип. / Белорусский государственный
университет ; сост. Е. А. Николайчик. - Минск : [б. и.], 2006. - 6 с.
3. Шлегель, Г. Общая микробиология [Электронный ресурс]: научное
издание / Г.Шлегель ; пер. с нем.: Л. В. Алексеева, Г. А. Курелла, Н. Ю.
Несытова ; ред. Е. Н. Кондратьева. - М. : Мир , 1987.
4. Гусев, М. В. Микробиология [Текст] : учебник / М. В. Гусев. - 8-е
изд. стер. - М. : Академия, 2008. - 464 с.
5. Белясова, Н. А. Биохимия и молекулярная биология [Текст] :
допущено Министерством образования Республики Беларусь в качестве
учебного пособия для студентов технологических и биологических
специальностей учреждений, обеспечивающих получение высшего
образования / Н. А. Белясова. - Минск : Книжный дом, 2004. - 416 с.
6. Орлов, Р. С. Нормальная физиология [Текст] : Учебник / Р. С. Орлов,
А. Д. Ноздрачев ; ред. Э. Г. Улумбеков. - Electronic text data. - М. : ГеотарМедиа, 2009. - 688 с : учебное пособие / Л. В. Коваленко. - М. : БИНОМ.
Лаборатория знаний, 2010. - 229 с.
7. Нетрусов, А. И. Общая микробиология [Текст] : учебник / А. И.
Нетрусов, И. Б. Котова. - М. : Издательский центр Академия, 2007. - 288 с.
8. Тейлор, Д. Биология: в 3-х т. [Текст] : учебное пособие. Т. 1 / Д.
Тейлор, Н. Грин, У. Стаут. - М. : Мир, 2007. - 454 с.
9. Крутецкая, З. И. Механизмы внутриклеточной сигнализации / З. И.
Крутецкая, О. Е. Лебедев, Л. С. Курилова. СПб.: Изд-во С. Петерб. Ун-та,
2003
10. Молекулярная биология. Структура и биосинтез нуклеиновых
кислот / под ред. А.С. Спирина. М.: Высшая школа. 1990.
11. Тарчевский, И.А. Сигнальные системы клеток растений / И.А.
Тарчевский. М.: Наука, 2002.
12. Гидранович, В.И. Биохимия: учебное пособие для студентов
высших учебных заведений по биологическим специальностям [текст] / В. И.
Гидранович, А. В. Гидранович.-2-е изд. -Минск: ТетраСистемс, [2012].-528 с.
13. Кольман, Ян. Наглядная биохимия [текст] / Я. Кольман, К.-Г. Рем;
пер. с нем. проф., д.б.н. Л. В.Козлова [и др.]; под ред. к.х.н. П. Д. Решетова,
Т. И. Соркиной.-4-е изд.. -Москва: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2012.-469 с.
14. Дмитриев, А. Д. Биохимия : учебное пособие / А. Д. Дмитриев, Е. Д.
Амбросьева. - М. : Дашков и К, 2010.
15. Молекулярная биология клетки: учебное пособие / Министерство
образования Республики Беларусь, Учреждение образования "Мозырский
государственный педагогический университет им. И.П. Шамякина" ; сост.:
М. С. Морозик, П. М. Морозик, В. Г. Сикорский. - Мозырь : УО МГПУ им.
И.П. Шамякина, 2010. - 76 с.
124
ВОПРОСЫ К ЭКЗАМЕНУ
Примерный перечень вопросов к экзамену по дисциплине «Регуляция
метаболизма клетки» для подготовки студентов специальности 1-31 01 01
Биология (по направлениям)
1. Необходимость регуляции клеточного
характеристика регуляторных механизмов.
метаболизма.
Общая
125
2. Значение контроля метаболизма клеток продуцентов в
биотехнологических процессах.
3. Уровни регуляции метаболизма у бактерий. Дополнительные уровни
регуляции метаболизма у эукариот.
4. Принципы транскрипционной регуляции
5. Единица транскрипции. Опероны у про- и эукариот.
6. Инициация и терминация транскрипции как процессы, в наибольшей
степени подверженные контролю.
7. Регуляторные белки (транскрипционные факторы): структура,
связывание с ДНК, взаимодействие с РНК-полимеразой и между собой.
8. Механизм репрессии и активации транскрипции.
9. Основные белковые домены, узнающие специфические
последовательности ДНК (спираль-поворот-спираль, спираль-петля-спираль,
гомеодомен, "лейциновая застежка", "цинковые пальцы").
10. Модули последовательностей ДНК, узнаваемые регуляторными
белками (промоторы и энхансеры, операторы).
11. Промоторы эукариот: размеры, положение, структура и механизм
распознавания различными РНК-полимеразами.
12. Промоторные элементы, контролирующие точку инициации и
интенсивность транскрипции.
13.Транскрипционный контроль
14. Стадии инициации транскрипции.
15. Различия механизмов инициации у про- и эукариот.
16. Опероны бактерий. Понятие об индуцибельных и репрессибельных
оперонах.
17.Негативная и позитивная регуляция оперонов бактерий на примере
лактозного, арабинозного и триптофанового оперона.
18. Понятие о регулоне.
19.Регуляторная роль бактериальной фосфотрансферазной системы.
Механизмы катаболитной репрессии.
20. Контроль утилизации галактозы у дрожжей. Дрожжевые
двухгибридные системы.
21. Модульная организация регуляторных белков.
22 . Контроль терминации транскрипции.
23. Антитерминация.
24. Посттранскрипционная регуляция.
25.Контроль процессинга пре-мРНК (транс-сплайсинг, альтернативный
сплайсинг, альтернативное полиаденилирование).
26. Регуляция стабильности мРНК.
27. Факторы, влияющие на стабильность мРНК. РНКазы, участвующие
в деградации мРНК.
28.Мультибелковые комплексы деградации РНК.
29. РНК-хеликазы в деградации РНК.
30.Действие полиаденилирования на стабильность бактериальных и
эукариотических мРНК.
126
31. Участие нетранслируемых молекул РНК в регуляции контроля
инициации репликации ДНК.
32.Участие нетранслируемых молекул РНК в регуляции процессинга
РНК и ее трансляции.
33. Антисмысловая РНК. МикроРНК как регулятор. РНКинтерференция.
34.Посттрансляционная регуляция. Участие молекулярных шаперонов
в регуляторных процессах.
35.Фолдинг и деградация белков как компоненты регуляторных систем.
36. Формирование нативной трехмерной структуры белков.
37. Молекулярные шапероны семейств Hsp60 и Hsp70 у про- и
эукариот.
38. Участие молекулярных шаперонов в регуляторных процессах.
39. Деградация белков: АТФ-зависимые протеазы прокариот и 26Sпротеасома эукариот.
40. Механизм распознавания аномальных белков.
41.Система убиквитинирования белков
42. Роль контролируемого протеолиза в регуляции метаболизма у прои эукариот.
43. Межклеточные коммуникации.
44. Регуляция синтеза экзоферментов и антибиотиков у Erwinia.
45.Сенсорные системы
46. Общие принципы сенсорной регуляции.
47. Передача информации через клеточную мембрану.
48. Белковые каналы, транспортеры и рецепторы. Рецепторная функция
воротных каналов.
49. Двухкомпонентные сенсорные системы.
50. Структура сенсоров и регуляторов и их функционирование.
51. Архитектура регуляторных систем.
52. Распространение двухкомпонентных сенсорных систем у
различных представителей про- и эукариот.
53. Хемотаксис у бактерий
54. Устройство и принцип действия двигательного аппарата бактерий.
55. Регуляция синтеза жгутикового аппарата.
56. Белковый аппарат хемотаксиса. Рецепторы хемотаксиса.
57. Цитоплазматические сигнальные белки и регуляторный механизм
хемотаксиса.
58.Компоненты сигнальных путей (рецепторы, G-белки, адапторы,
эффекторы, вторичные мессенджеры).
59. Киназы как компоненты сигнальных путей, типы протеинкиназ.
60. Способы передачи сигнала через клеточную мембрану.
61. Типы трансмембранных рецепторов и механизмы их активации.
62. Механизмы адаптации клетки к стрессовым условиям.
63. Контроль стрессовых регулонов бактерий
127
64. Физиологические функции, находящиеся под контролем
альтернативных сигма-факторов.
65.Промоторы и регуляторные белки, участвующие во взаимодействии
с альтернативными сигма-факторами.
66. Общий стресс: регулон RpoS.
67. Периплазматический стресс: регулон RpoE.
68. Температурный шок.
69. Контроль регулона теплового шока у различных бактерий.
70. Кислородный стресс и редокс контроль.
71. Активные формы кислорода: их повреждающее действие и
механизм инактивации.
72. Причина кислородного стресса.
73. Механизмы окислительных повреждений клетки, защита от
окислительного стресса.
74. Адаптация к анаэробиозу.
75. Утилизация азота.
76. Детекция внутриклеточной концентрации азота, компоненты
регуляторной системы.
77. Контроль клеточного цикла.
78. Взаимосвязь инициации репликации и деления клетки.
79. Роль протеолиза в контроле клеточного цикла.
80. Деление бактериальной клетки и его регуляция.
81. Особенности организации генов, участвующих в делении клеток и
их функции.
82. Регуляция клеточного цикла у Escherichia coli и Caulobacter
crescentus.
83. Споруляция.
84. Механизм принятия решения о начале споруляции
85. Споруляция у Bacillus subtilis: каскадная активация альтернативных
сигма-факторов на разных стадиях споруляции
86. Секреция белков. Сходство и различия секреторных аппаратов прои эукариот.
87. Сигналы секреции и внутриклеточной локализации белков: общие
принципы.
88.Секреция белков у прокариот: Sec-аппарат, системы секреции I-IV
типов (организация, субстратспецифичность, регуляция).
89.Отличие секреции белков у прокариот и эукариот.
90. Транспорт белков через мембраны и его контроль.
128
УЧЕБНАЯ ПРОГРАММА ДИСЦИПЛИНЫ
129
130
131
ПОЯСНИТЕЛЬНАЯ ЗАПИСКА
1 Место дисциплины в системе подготовки специалиста
Жизнедеятельность бактериальных клеток протекает в постоянно
изменяющихся условиях. Адаптация к меняющимся условиям определяет
присутствие в клетке соответствующих метаболических путей, значительная
часть которых может потребоваться только в определенных условиях и в
течение только некоторой части жизненного цикла клетки. Ограниченность
доступных клетке ресурсов определяет необходимость их строгой экономии
для сохранения конкурентоспособности организма, поэтому значительная
часть метаболических путей экспрессируется в клетке только в случае
необходимости. Контроль за экспрессией соответствующих генов
осуществляют разнообразные регуляторные системы, пониманию принципов
организации и механизмов действия которых и должно способствовать
изучение курса «Регуляция метаболизма клетки».
2 Цели и задачи учебной дисциплины
Цель курса – сформировать у студентов целостную систему знаний о
принципах контроля метаболических процессов бактериальной клетки.
В задачи дисциплины входит изучение общих принципов регуляции
клеточных процессов на различных стадиях экспрессии геномной
информации, молекулярных механизмов, определяющих перестройку
метаболических процессов при стрессовых воздействиях, молекулярных
механизмов межклеточных коммуникаций, а также механизмов контроля
локализации белков внутри клетки и за ее пределами.
Изучение учебной дисциплины «Регуляция метаболизма клетки»
базируется для усвоения материала учебных дисциплин «Селекция
продуцентов», «Трансгенные эукариотические организмы», «Генетика» и др.
3 Требования к уровню освоения учебной дисциплины
В результате изучения дисциплины студент должен закрепить и
развить академические (АК), овладеть следующими профессиональными
(ПК) компетенциями предусмотренные в образовательном стандарте 1310101 Биология (по направлениям):
а) академические:
АК-1: Уметь применять базовые научно-теоретические знания для
решения теоретических и практических задач.
АК-2: Владеть системным и сравнительным анализом.
АК-3: Владеть исследовательскими навыками.
АК-4: Уметь работать самостоятельно.
б) профессиональные:
студент должен:
научно-исследовательская деятельность
ПК-1: Квалифицированно проводить научные исследования в области
биохимии и молекулярной биологии, проводить анализ результатов
132
экспериментальных исследований, формулировать из полученных
результатов корректные выводы.
ПК-2: Осваивать новые модели, теории, методы исследования,
участвовать в разработке новых методических подходов.
ПК-3: Осуществлять поиск и анализ данных по изучаемой проблеме в
научной литературе, составлять аналитические обзоры.
ПК-4: Готовить научные статьи, сообщения, рефераты доклады и
материалы к презентациям.
ПК-5: Составлять и вести документацию по научным проектам
исследований.
научно-производственная деятельность
ПК-6: Квалифицированно проводить научно-производственные
исследования, выбирать грамотные и экспериментально обоснованные
методические подходы, давать рекомендации по практическому применению
полученных результатов.
ПК-7: Осуществлять поиск и анализ данных по изучаемой проблеме в
научно-технических и других информационных источниках.
ПК-8: Организовывать работу по подготовке научных статей и заявок
на изобретения и лично участвовать в ней.
ПК-9: Организовывать работу по обоснованию целесообразности
научных проектов и исследований.
ПК-10: Составлять и вести документацию по научно-производственной
деятельности.
Для приобретения профессиональных компетенций ПК-1 − ПК-10, в
результате изучения дисциплины студент должен:
знать:
- общие принципы регуляции клеточных процессов;
- молекулярные механизмы взаимодействия регуляторных белков с
нуклеиновыми кислотами;
- особенности регуляторных процессов в клетках про- и эукариот;
- принципы регуляции на стадии инициации и терминации
транскрипции;
- механизмы контроля стабильности мрнк, в том числе принципы
регуляции при помощи малых регуляторных рнк и механизм рнкинтерференции;
- механизмы контроля нативной структуры и деградации белков в
клетках прокариот, их транспорта за пределы клетки, отличие от механизмов
контроля в эукариотических клетках;
- принципы организации сенсорных систем и сигнальных каскадов;
- основные принципы контроля клеточного цикла;
- механизмы адаптации клетки к стрессовым условиям;
уметь:
- предложить возможные пути повышения или понижения экспрессии
определенных метаболических путей за счет воздействия на известные
регуляторные процессы;
133
- использовать знания о принципах регуляции метаболизма при
создании организмов-продуцентов каких-либо соединений;
- оценить возможные последствия изменения условий культивирования
для основных метаболических процессов модельных организмов.
4 Объем дисциплины и виды учебной работы
Общий объем часов максимально составляет 92 часа, в том числе 40
часов аудиторных: 26 – лекционных, 14 – семинарских занятий.
По курсу «Регуляция метаболизма клетки» предусмотрен экзамен по
завершению учебного курса.
Чтение лекционного курса рассчитано на использование большого
количества иллюстративного материала в виде мультимедийных
презентаций.
Теоретические положения лекционного курса развиваются и
закрепляются на семинарских занятиях, во время которых проводится также
контроль самостоятельной работы студентов.
При организации самостоятельной работы студентов по курсу следует
использовать комплекс учебных и учебно-методических материалов в
системе
eUniversity (программу,
методические пособия,
список
рекомендуемых источников литературы и информационных ресурсов, а
также ключевые обзорные и экспериментальные статьи).
134
СОДЕРЖАНИЕ УЧЕБНОГО МАТЕРИАЛА
ВВЕДЕНИЕ
Необходимость регуляции клеточного метаболизма. Значение контроля
метаболизма клеток продуцентов в биотехнологических процессах. Уровни
регуляции метаболизма. Общая характеристика регуляторных механизмов.
I ПРИНЦИПЫ ТРАНСКРИПЦИОННОЙ РЕГУЛЯЦИИ
Понятие о единице транскрипции. Опероны у про- и эукариот.
Инициация и терминация транскрипции как процессы, в наибольшей степени
подверженные контролю.
Регуляторные белки (транскрипционные факторы): cтруктура,
связывание с ДНК, взаимодействие с РНК-полимеразой и между собой,
механизм репрессии и активации транскрипции. Значение ди- и
олигомеризации регуляторных белков.
Основные
белковые
домены,
узнающие
специфические
последовательности ДНК (спираль-поворот-спираль, спираль-петля-спираль,
гомеодомен, "лейциновая застежка", "цинковые пальцы"). Модули
последовательностей ДНК, узнаваемые регуляторными белками (промоторы
и энхансеры, операторы). Промоторные элементы, контролирующие точку
инициации и интенсивность транскрипции.
II ТРАНСКРИПЦИОННЫЙ КОНТРОЛЬ
Стадии инициации транскрипции. Различия механизмов инициации у
про- и эукариот.
Опероны бактерий. Понятие об индуцибельных и репрессибельных
оперонах. Негативная и позитивная регуляция оперонов бактерий на примере
лактозного, арабинозного и триптофанового оперона. Понятие о регулоне.
Регуляторная роль бактериальной фосфотрансферазной системы. Механизмы
катаболитной репрессии.
Контроль утилизации галактозы у дрожжей. Модульная организация
регуляторных белков. Дрожжевые двухгибридные системы.
Контроль терминации транскрипции. Антитерминация. Белки N и Q
фага, nut-сайты и Nus-белки. bgl-оперон.
III ПОСТТРАНСКРИПЦИОННАЯ РЕГУЛЯЦИЯ
Контроль процессинга пре-мРНК (транс-сплайсинг, альтернативный
сплайсинг, альтернативное полиаденилирование).
Регуляция стабильности мРНК. Факторы, влияющие на стабильность
мРНК. РНКазы, участвующие в деградации мРНК (РНКаза Е, РНКаза III,
полинуклеотидфосфорилаза, РНКаза II). Мультибелковые комплексы
деградации РНК. РНК-хеликазы в деградации РНК. Действие
полиаденилирования на стабильность бактериальных и эукариотических
мРНК.
135
Участие нетранслируемых молекул РНК в регуляции: контроль
инициации репликации ДНК, процессинга РНК и ее трансляции.
Антисмысловая РНК. МикроРНК как регулятор. РНК-интерференция.
IV ПОСТТРАНСЛЯЦИОННАЯ РЕГУЛЯЦИЯ
Фолдинг и деградация белков как компоненты регуляторных систем.
Формирование нативной трехмерной структуры белков. Молекулярные
шапероны семейств Hsp60 и Hsp70 у про- и эукариот. Рабочий цикл
шаперонных комплексов GroELS и DnaKJ-GrpE. Участие молекулярных
шаперонов в регуляторных процессах.
Деградация белков: АТФ-зависимые протеазы прокариот и 26Sпротеасома эукариот. Механизм распознавания аномальных белков. Система
убиквитинирования белков эукариот. Роль контролируемого протеолиза в
регуляции метаболизма у прокариот.
V МЕЖКЛЕТОЧНЫЕ КОММУНИКАЦИИ
Автоиндукторы бактерий и их синтез. Роль АГСЛ-сигналов в экологии
бактериальных популяций. Контроль биолюминесценции у Vibrio fischeri.
Регуляция синтеза экзоферментов и антибиотиков у Erwinia.
VI СЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ
Общие принципы сенсорной регуляции. Передача информации через
клеточную мембрану. Белковые каналы, транспортеры и рецепторы.
Рецепторная функция воротных каналов. Роль киназ и G-белков в регуляции.
Двухкомпонентные сенсорные системы. Структура сенсоров и
регуляторов и их функционирование. Архитектура регуляторных систем.
Фосфотрансляционные системы. Работа двухкомпонентной системы
EnvZ/OmpR при осморегуляции.
Распространение двухкомпонентных сенсорных систем у различных
представителей про- и эукариот.
Хемотаксис у бактерий
Устройство и принцип действия двигательного аппарата бактерий.
Регуляция синтеза жгутикового аппарата. Белковый аппарат хемотаксиса.
Рецепторы хемотаксиса. Цитоплазматические сигнальные белки и
регуляторный механизм хемотаксиса. Метилазы хемотаксиса и сенсорная
адаптация.
Сенсорные процессы и внутриклеточная регуляция у эукариот.
Сенсорные механизмы эукариот. Компоненты сигнальных путей
(рецепторы, G-белки, адапторы, эффекторы, вторичные мессенджеры).
Киназы как компоненты сигнальных путей. Типы протеинкиназ. Способы
передачи сигнала через клеточную мембрану. Типы трансмембранных
рецепторов и механизмы их активации. Тримерные и мономерные G-белки:
структура и принцип действия. Способы передачи сигнала в ядро. Контроль
специфичности сигнализации. Сигнальные пути cAMP-PKA, TGF.-Smad,
JAK-STAT и Ras-MAPK.
136
VII МЕХАНИЗМЫ АДАПТАЦИИ КЛЕТКИ К СТРЕССОВЫМ УСЛОВИЯМ
Контроль стрессовых регулонов бактерий при помощи альтернативных
факторов РНК-полимеразы. Физиологические функции, находящиеся под
контролем альтернативных сигма-факторов. Промоторы и регуляторные
белки, участвующие во взаимодействии с альтернативными сигмафакторами.
Общий стресс: регулон RpoS.
Периплазматический стресс: регулон RpoE.
Температурный шок. Контроль регулона теплового шока у различных
бактерий. Тепловой шок у дрожжей.
Холодовой шок.
Кислородный стресс и редокс контроль. Активные формы кислорода:
их повреждающее действие и механизм инактивации. Причина кислородного
стресса. Механизмы окислительных повреждений клетки. Защита от
окислительного стресса. Регулоны SoxRS и OxyR. Адаптация к анаэробиозу.
Белок FNR как сенсор кислорода.
Утилизация азота. Детекция внутриклеточной концентрации азота,
компоненты
регуляторной
системы.
Структура
и
особенности
функционирования белков RpoN и NtrC.
VIII КОНТРОЛЬ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА
Взаимосвязь инициации репликации и деления клетки. Контроль
эукариотического клеточного цикла. Циклины и циклинзависимые киназы.
Роль протеолиза в контроле клеточного цикла.
Деление бактериальной клетки и его регуляция. Особенности
организации генов, участвующих в делении клеток и их функции. Регуляция
клеточного цикла у Escherichia coli и Caulobacter crescentus. Споруляция у
Bacillus subtilis: механизм принятия решения о начале споруляции и
каскадная активация альтернативных сигма-факторов на разных стадиях
споруляции.
IX КОНТРОЛЬ ЛОКАЛИЗАЦИИ БЕЛКОВ
Секреция белков. Сходство и различия секреторных аппаратов про- и
эукариот. Сигналы секреции и внутриклеточной локализации: общие
принципы.
Секреция белков у прокариот: Sec-аппарат, системы секреции I-IV
типов (организация, субстратспецифичность, регуляция).
Распределение белков по компартментам клетки эукариот.
Котрансляционная транслокация белков в полость эндоплазматического
ретикулума. SRP-частица и ее рецептор. Модификации белков в полости ЭР
и их последующая сортировка. Транспорт белков в митохондрии и
хлоропласты, контроль локализации белков внутри этих органелл. Транспорт
белков через ядерные поры и его контроль.
137
2
2.1
3
3.1
2
Принципы транскрипционной регуляции
1. Общая характеристика регуляторных механизмов.
Понятие о единице транскрипции.
2 Инициация и терминация транскрипции как процессы, в
наибольшей степени подверженные контролю.
3.Регуляторные белки (транскрипционные факторы).
4.Основные белковые домены, узнающие специфические
последовательности ДНК.
5.Промоторные элементы, контролирующие точку
инициации и интенсивность транскрипции.
Транскрипционный контроль
1.Стадии инициации транскрипции.
2.Опероны бактерий. Лактозный, арабинозный и
триптофановый опероны.
3.Понятие о регулоне. Регуляторная роль бактериальной
фосфотрансферазной системы. Механизмы катаболитной
репрессии.
4.Контроль утилизации галактозы у дрожжей.
5.Контроль терминации транскрипции. Антитерминация.
Посттранскрипционная регуляция
1.Контроль процессинга пре-мРНК .
2.Регуляция стабильности мРНК.
3.Факторы, влияющие на стабильность мРНК
3
2
2
4
4
2
2
4
4
2
2
6
Формы
Контроля
знаний
Литература
Материальное
обеспечение занятия
(наглядные,
методические пособия
и др.)
5
2
2
Управляемая
самостоятельная
работа
4
Лабораторные
занятия
Семинарские
занятия
Название раздела, темы, занятия; перечень изучаемых
вопросов
Практические
занятия
1
1
1.1
Количество аудиторных часов
Лекции
Номер раздела, темы,
занятия
УЧЕБНО-МЕТОДИЧЕСКАЯ КАРТА УЧЕБНОЙ ДИСЦИПЛИНЫ
7
8
9
10
-
Презентация
№1
УМК
[1, 2]
Опрос, обсуждение
реферата
Презентация
№2
УМК
[1,3,5]
Опрос, обсуждение
реферата
Презентация
№3
УМК
[3,4,7]
Опрос, обсуждение
реферата
138
4
4.1
5
5.1
6
6.1
4.. РНКазы, участвующие в деградации мРНК .
5. Мультибелковые комплексы деградации РНК.
6.Действие полиаденилирования на стабильность
бактериальных и эукариотических мРНК.
7.Участие нетранслируемых молекул РНК в регуляции:
контроль инициации репликации ДНК, процессинга РНК и
ее трансляции.
8. Антисмысловая РНК.
Посттрансляционная регуляция
1. Фолдинг и деградация белков.
2. Формирование нативной трехмерной структуры белков.
3.Молекулярные шапероны семейств Hsp60 и Hsp70 у прои эукариот.
4. Участие молекулярных шаперонов в регуляторных
процессах.
5.Деградация белков: АТФ-зависимые протеазы прокариот
и 26S-протеасома эукариот.
6. Механизм распознавания аномальных белков. 7.Система
убиквитинирования белков эукариот.
8. Роль контролируемого протеолиза в регуляции
метаболизма у прокариот.
Межклеточные коммуникации
1.Автоиндукторы бактерий и их синтез.
2. Роль АГСЛ-сигналов в экологии бактериальных
популяций.
3. Контроль биолюминесценции у Vibrio fischeri.
4. Регуляция синтеза экзоферментов и антибиотиков у
Erwinia.
Сенсорные системы
1.Общие принципы сенсорной регуляции.
2.Передача информации через клеточную мембрану.
3.Двухкомпонентные сенсорные системы.
4. Структура сенсоров и регуляторов и их
функционирование.
5.Распространение двухкомпонентных сенсорных систем у
4
4
2
2
2
2
4
4
Презентация
№4
УМК
[1,2,6]
Опрос, обсуждение
реферата
Презентация
№5
УМК
[2,3,5]
Опрос, обсуждение
реферата
Презентация
№6
УМК
[1,6,8]
Опрос, обсуждение
реферата
139
7
7.1
8
8.1
9
9.1
различных представителей про- и эукариот.
6.Хемотаксис у бактерий. Устройство и принцип действия
двигательного аппарата бактерий.
7. Регуляция синтеза жгутикового аппарата. Белковый
аппарат хемотаксиса.
8.Сенсорные процессы и внутриклеточная регуляция у
эукариот.
9. Отличие сенсорных механизмов прокариот и эукариот.
Механизмы адаптации клетки к стрессовым условиям
1. Контроль стрессовых регулонов бактерий.
2.Общий и периплазматический стресс.
3.Температурный шок: тепловой шок, холодовой шок.
4.Кислородный стресс и редокс контроль.
5.Утилизация азота.
Контроль клеточного цикла
1. Взаимосвязь инициации репликации и деления клетки.
Роль протеолиза в контроле клеточного цикла.
2.Деление бактериальной клетки и его регуляция.
3. Регуляция клеточного цикла у Escherichia coli и
Caulobacter crescentus.
4.Споруляция у Bacillus subtilis: механизм принятия
решения о начале споруляции и каскадная активация
альтернативных сигма-факторов на разных стадиях
споруляции.
Контроль локализации белков
1. Секреция белков.
2.Сходство и различия секреторных аппаратов про- и
эукариот.
3.Секреция белков у прокариот: Sec-аппарат, системы
секреции I-IV типов (организация, субстратспецифичность,
регуляция).
4. Транспорт белков через ядерные поры и его контроль.
ИТОГО
4
4
2
2
4
4
2
2
26
14
УМК
[2,3,7]
Опрос, обсуждение
реферата
УМК
[7,8,9]
Опрос, обсуждение
реферата
Презентация
№9
УМК
[1,2,9]
Опрос, обсуждение
реферата
140
141
ИНФОРМАЦИОННО-МЕТОДИЧЕСКАЯ ЧАСТЬ
1. Перечень основной и дополнительной литературы:
Основная литература
1.Коваленко, Л. В. Биохимические основы химии биологически
активных веществ
2. Регуляция метаболизма клетки [Текст] : типовая учебная программа
для высших учебных заведений по направлению 1-31 01 01-03
"Биотехнология" специальности 1-31 01 01 "Биология" Утверждена учебнометодическим объединением вузов Республики Беларусь по естественному
образованию. Рег. № ТД-G. 116/тип. / Белорусский государственный
университет ; сост. Е. А. Николайчик. - Минск : [б. и.], 2006. - 6 с.
3. Шлегель, Г. Общая микробиология [Электронный ресурс]: научное
издание / Г.Шлегель ; пер. с нем.: Л. В. Алексеева, Г. А. Курелла, Н. Ю.
Несытова ; ред. Е. Н. Кондратьева. - М. : Мир , 1987.
4. Гусев, М. В. Микробиология [Текст] : учебник / М. В. Гусев. - 8-е
изд. стер. - М. : Академия, 2008. - 464 с.
5. Белясова, Н. А. Биохимия и молекулярная биология [Текст] :
допущено Министерством образования Республики Беларусь в качестве
учебного пособия для студентов технологических и биологических
специальностей учреждений, обеспечивающих получение высшего
образования / Н. А. Белясова. - Минск : Книжный дом, 2004. - 416 с.
Дополнительная литература
6. Орлов, Р. С. Нормальная физиология [Текст] : Учебник / Р. С.
Орлов, А. Д. Ноздрачев ; ред. Э. Г. Улумбеков. - Electronic text data. - М. :
Геотар-Медиа, 2009. - 688 с : учебное пособие / Л. В. Коваленко. - М. :
БИНОМ. Лаборатория знаний, 2010. - 229 с.
7. Нетрусов, А. И. Общая микробиология [Текст] : учебник / А. И.
Нетрусов, И. Б. Котова. - М. : Издательский центр Академия, 2007. - 288 с.
8. Тейлор, Д. Биология: в 3-х т. [Текст] : учебное пособие. Т. 1 / Д. Тейлор,
Н. Грин, У. Стаут. - М. : Мир, 2007. - 454 с.
9. Крутецкая, З. И. Механизмы внутриклеточной сигнализации / З. И.
Крутецкая, О. Е. Лебедев, Л. С. Курилова. СПб.: Изд-во С. Петерб. Ун-та,
2003
10. Молекулярная биология. Структура и биосинтез нуклеиновых
кислот / под ред. А.С. Спирина. М.: Высшая школа. 1990.
11. Тарчевский, И.А. Сигнальные системы клеток растений / И.А.
Тарчевский. М.: Наука, 2002.
12. Гидранович, В.И. Биохимия: учебное пособие для студентов
высших учебных заведений по биологическим специальностям [текст] / В.
142
И. Гидранович, А. В. Гидранович.-2-е изд. -Минск: ТетраСистемс, [2012].528 с.
13. Кольман, Ян. Наглядная биохимия [текст] / Я. Кольман, К.-Г.
Рем; пер. с нем. проф., д.б.н. Л. В.Козлова [и др.]; под ред. к.х.н. П. Д.
Решетова, Т. И. Соркиной.-4-е изд.. -Москва: БИНОМ. Лаборатория знаний,
2012.-469 с.
14. Дмитриев, А. Д. Биохимия : учебное пособие / А. Д. Дмитриев, Е.
Д. Амбросьева. - М. : Дашков и К, 2010.
15. Молекулярная биология клетки: учебное пособие / Министерство
образования Республики Беларусь, Учреждение образования "Мозырский
государственный педагогический университет им. И.П. Шамякина" ; сост.:
М. С. Морозик, П. М. Морозик, В. Г. Сикорский. - Мозырь : УО МГПУ им.
И.П. Шамякина, 2010. - 76 с.
2 Примерный перечень лабораторных работ (по данной дисциплине
не предусмотрено)
3 Примерный перечень реферативных работ (по данной дисциплине
не предусмотрено)
4 Примерный перечень вопросов к экзамену:
1. Необходимость регуляции клеточного метаболизма. Общая
характеристика регуляторных механизмов.
2. Значение контроля метаболизма клеток продуцентов в
биотехнологических процессах.
3. Уровни регуляции метаболизма у бактерий. Дополнительные
уровни регуляции метаболизма у эукариот.
4. Принципы транскрипционной регуляции
5. Единица транскрипции. Опероны у про- и эукариот.
6. Инициация и терминация транскрипции как процессы, в
наибольшей степени подверженные контролю.
7. Регуляторные белки (транскрипционные факторы): структура,
связывание с ДНК, взаимодействие с РНК-полимеразой и между собой.
8. Механизм репрессии и активации транскрипции.
9. Основные белковые домены, узнающие специфические
последовательности ДНК (спираль-поворот-спираль, спираль-петляспираль, гомеодомен, "лейциновая застежка", "цинковые пальцы").
10. Модули последовательностей ДНК, узнаваемые регуляторными
белками (промоторы и энхансеры, операторы).
11. Промоторы эукариот: размеры, положение, структура и механизм
распознавания различными РНК-полимеразами.
143
12. Промоторные элементы, контролирующие точку инициации и
интенсивность транскрипции.
13.Транскрипционный контроль
14. Стадии инициации транскрипции.
15. Различия механизмов инициации у про- и эукариот.
16.
Опероны
бактерий.
Понятие
об
индуцибельных
и
репрессибельных оперонах.
17.Негативная и позитивная регуляция оперонов бактерий на примере
лактозного, арабинозного и триптофанового оперона.
18. Понятие о регулоне.
19.Регуляторная роль бактериальной фосфотрансферазной системы.
Механизмы катаболитной репрессии.
20. Контроль утилизации галактозы у дрожжей. Дрожжевые
двухгибридные системы.
21. Модульная организация регуляторных белков.
22 . Контроль терминации транскрипции.
23. Антитерминация.
24. Посттранскрипционная регуляция.
25.Контроль
процессинга
пре-мРНК
(транс-сплайсинг,
альтернативный сплайсинг, альтернативное полиаденилирование).
26. Регуляция стабильности мРНК.
27. Факторы, влияющие на стабильность мРНК. РНКазы,
участвующие в деградации мРНК.
28.Мультибелковые комплексы деградации РНК.
29. РНК-хеликазы в деградации РНК.
30.Действие полиаденилирования на стабильность бактериальных и
эукариотических мРНК.
31. Участие нетранслируемых молекул РНК в регуляции контроля
инициации репликации ДНК.
32.Участие нетранслируемых молекул РНК в регуляции процессинга
РНК и ее трансляции.
33. Антисмысловая РНК. МикроРНК как регулятор. РНКинтерференция.
34.Посттрансляционная регуляция. Участие молекулярных шаперонов
в регуляторных процессах.
35.Фолдинг и деградация белков как компоненты регуляторных
систем.
36. Формирование нативной трехмерной структуры белков.
37. Молекулярные шапероны семейств Hsp60 и Hsp70 у про- и
эукариот.
38. Участие молекулярных шаперонов в регуляторных процессах.
39. Деградация белков: АТФ-зависимые протеазы прокариот и 26Sпротеасома эукариот.
40. Механизм распознавания аномальных белков.
144
41.Система убиквитинирования белков
42. Роль контролируемого протеолиза в регуляции метаболизма у
про- и эукариот.
43. Межклеточные коммуникации.
44. Регуляция синтеза экзоферментов и антибиотиков у Erwinia.
45.Сенсорные системы
46. Общие принципы сенсорной регуляции.
47. Передача информации через клеточную мембрану.
48. Белковые каналы, транспортеры и рецепторы. Рецепторная
функция воротных каналов.
49. Двухкомпонентные сенсорные системы.
50. Структура сенсоров и регуляторов и их функционирование.
51. Архитектура регуляторных систем.
52. Распространение двухкомпонентных сенсорных систем у
различных представителей про- и эукариот.
53. Хемотаксис у бактерий
54. Устройство и принцип действия двигательного аппарата бактерий.
55. Регуляция синтеза жгутикового аппарата.
56. Белковый аппарат хемотаксиса. Рецепторы хемотаксиса.
57. Цитоплазматические сигнальные белки и регуляторный механизм
хемотаксиса.
58.Компоненты сигнальных путей (рецепторы, G-белки, адапторы,
эффекторы, вторичные мессенджеры).
59. Киназы как компоненты сигнальных путей, типы протеинкиназ.
60. Способы передачи сигнала через клеточную мембрану.
61. Типы трансмембранных рецепторов и механизмы их активации.
62. Механизмы адаптации клетки к стрессовым условиям.
63. Контроль стрессовых регулонов бактерий
64. Физиологические функции, находящиеся под контролем
альтернативных сигма-факторов.
65.Промоторы
и
регуляторные
белки,
участвующие
во
взаимодействии с альтернативными сигма-факторами.
66. Общий стресс: регулон RpoS.
67. Периплазматический стресс: регулон RpoE.
68. Температурный шок.
69. Контроль регулона теплового шока у различных бактерий.
70. Кислородный стресс и редокс контроль.
71. Активные формы кислорода: их повреждающее действие и
механизм инактивации.
72. Причина кислородного стресса.
73. Механизмы окислительных повреждений клетки, защита от
окислительного стресса.
74. Адаптация к анаэробиозу.
75. Утилизация азота.
145
76. Детекция внутриклеточной концентрации азота, компоненты
регуляторной системы.
77. Контроль клеточного цикла.
78. Взаимосвязь инициации репликации и деления клетки.
79. Роль протеолиза в контроле клеточного цикла.
80. Деление бактериальной клетки и его регуляция.
81. Особенности организации генов, участвующих в делении клеток и
их функции.
82. Регуляция клеточного цикла у Escherichia coli и Caulobacter
crescentus.
83. Споруляция.
84. Механизм принятия решения о начале споруляции
85. Споруляция у Bacillus subtilis:
каскадная активация
альтернативных сигма-факторов на разных стадиях споруляции
86. Секреция белков. Сходство и различия секреторных аппаратов
про- и эукариот.
87. Сигналы секреции и внутриклеточной локализации белков: общие
принципы.
88.Секреция белков у прокариот: Sec-аппарат, системы секреции I-IV
типов (организация, субстратспецифичность, регуляция).
89.Отличие секреции белков у прокариот и эукариот.
90. Транспорт белков через мембраны и его контроль.
146
ПРОТОКОЛ СОГЛАСОВАНИЯ УЧЕБНОЙ ПРОГРАММЫ
Название учебной
дисциплины, с
которой требуется
согласование
Селекция
продуцентов
Трансгенные
эукариотические
организмы
Генетика
Название
кафедры
Кафедра
биотехнологии
Кафедра
биотехнологии
Кафедра
биотехнологии
Предложения об
изменениях в
содержании учебной
программы по
учебной дисциплине
Решение, принятое
кафедрой
разработавшей
учебную программу
(с указанием даты и
номера протокола)
согласовано
Рекомендовать
к утверждению
учебную программу
(протокол № 11 от
21.06.2016 г)
согласовано
Рекомендовать
к утверждению
учебную программу
(протокол № 11 от
21.06.2016 г)
согласовано
Рекомендовать
к утверждению
учебную программу
(протокол № 11 от
21.06.2016 г)
147
ДОПОЛНЕНИЯ И ИЗМЕНЕНИЯ К УЧЕБНОЙ ПРОГРАММЕ
на______/ _______ учебный год
№№
пп
Дополнения и изменения
Основание
Учебная программа пересмотрена и одобрена на заседании кафедры
биотехнологии (протокол № от
г.)
(название кафедры)
Заведующий кафедрой
(ученая степень, ученое звание)
(подпись)
(И.О.Фамилия)
УТВЕРЖДАЮ
Декан факультета
(ученая степень, ученое звание)
(подпись)
(И.О.Фамилия)