Determinação de nitrato e nitrito em solução por
Espetrofotometria de UV/Vis | 2021/2022
Licenciatura em Biotecnologia
Laboratórios IIIB
Determinação de nitrato e nitrito em solução por
Espetrofotometria de UV/Vis
Trabalho prático nº2
Docentes: Profª Carla Santos
Profª Isabel Sousa
Discentes:




Catarina Palito nº 202000030
Madalena Fernandes nº 202000035
Pedro Constantinou nº 202000168
Tiago Madeira nº 202000033
Data de entrega: 29/11/2021
1
Determinação de nitrato e nitrito em solução por
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Resumo
Este trabalho prático teve como principal objetivo a determinação de nitrato e nitrito
em soluções através da técnica de espetrofotometria de UV/Vis. Para tal foram
preparadas 2 soluções mãe, sendo uma de nitrato 1M e a outra de nitrito 0,25M, e foi
utilizado o espetrofotómetro no qual efetuou medições de absorvância nos
comprimentos de onda previamente definidos nomeadamente, 302nm, 355nm, e
382nm.
Durante a realização do trabalho, foi feita uma nova preparação da solução de nitrato
100mM e consequentemente uma nova leitura, uma vez que a absorvância lida na
primeira medição apresentou um valor discrepante. Foi também diluída uma segunda
vez a amostra A, uma vez que o valor de absorção obtido num dos comprimentos de
onda saía da curva de calibração.
No final do trabalho, obteve-se em relação à amostra A, uma concentração de nitrato
de 70,222mM e uma concentração de nitrito de 53,074mM. Relativamente à amostra B,
obteve-se uma concentração de nitrato e nitrito de 172,111 mM e 36,407 mM,
respetivamente.
2
Determinação de nitrato e nitrito em solução por
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Abstract
This pratical work had as main objective the determination of the nitrate and nitrite in
solutions through the technique of UV7vis spectrophometry. For this purpose, 2 stock
solutions were prepared, one of 1M nitrate and the other of 0,25M nitrite. A
spectrophotometer was used, in wich absorbance measurements were perfomed at the
previously defined wavelengths, namely, 302nm, 355nm and 382nm.
During the performance of the work, a new preparation of the 100mM nitrate solution
was carried out and, consequently, a new reading, siince the absorbance read in the first
measurement showed a discrepante value. Sample A was also diluted a second time, as
the absorption valeu obtained at one of the wavelenghts left the calibration curve.
At the end of the work, a nitrate concentration of 70,222mM and a nitrite concentration
of 53,074mM were obtained in relation to sample A. Regarding sample B, a
concentration of nitrate and nitrite of 172,111mM and 36,407mM, respectively, was
obtained.
3
Determinação de nitrato e nitrito em solução por
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Índice
_____________________________________________________
Introdução Teórica ..................................................................................... 7
Descrição experimental ............................................................................ 11
- Materiais ................................................................................................ 11
- Equipamento.......................................................................................... 11
- Reagentes .............................................................................................. 11
- Riscos e segurança ................................................................................. 11
- Procedimento experimental................................................................... 12
Resultados experimentais ........................................................................ 13
Tratamento dos resultados ...................................................................... 17
Conclusões e Crítica ................................................................................. 24
Bibliografia ............................................................................................... 25
4
Determinação de nitrato e nitrito em solução por
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Índice de tabelas
_____________________________________________________
Tabela nº1 - Indicação dos principais risco e indicações de segurança relacionados com
os reagentes a utilizar neste trabalho experimental ............................................ 11
Tabela nº2 - Registo dos valores da preparação da diluição das soluções de nitrato 13
Tabela nº3 - Registo dos valores da preparação da diluição das soluções de nitrito 14
Tabela nº4 - Registo dos valores das absorvâncias de nitrato obtidos na primeira
medição ..................................................................................................... 15
Tabela nº5 - Registo dos valores das absorvâncias de nitrato obtidos na segunda
medição ..................................................................................................... 15
Tabela nº6 - Registo dos valores das absorvâncias de nitrito obtidos ................... 15
Tabela nº7 - Registo dos valores das absorvâncias das amostras ........................ 16
Tabela nº8 - Resultados obtidos referentes à curva de calibração do nitrato ......... 18
Tabela nº9 - Resultados obtidos referentes à curva de calibração do nitrito.......... 18
Tabela nº10 - Valores referentes à curva de calibração do nitrato ...................... 19
Tabela nº11 - Valores referentes à curva de calibração do nitrito ....................... 20
Tabela nº12 - Valores da absortividade molar e de R2 do nitrato ........................ 20
Tabela nº13 - Valores da absortividade molar e de R2 do nitrito ......................... 20
5
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Índice de figuras
_____________________________________________________
Figura 1 - Aplicação da técnica aos espectros de absorção de duas espécies hipotéticas
X e Y, e a sua sobreposição numa mistura ........................................................... 9
Figura 2 - Espectro de absorção do nitrato ...................................................... 17
Figura 3 - Espectro de absorção do nitrito ....................................................... 17
Figura 4 - Curva de calibração do ião nitrato .................................................... 19
Figura 5 - Curva de calibração do ião nitrato .................................................... 19
6
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Introdução Teórica
1. Espectrofotometria
A técnica de espectrofotometria, é o método de análises ótico mais utilizado nas
investigações biológicas e físico-químicas. Esta técnica baseia-se na medida quantitativa
da absorção da luz pelas soluções, onde a concentração na solução da substância
absorvente é proporcional à quantidade de luz absorvida.
Estas medidas são efetuadas por equipamentos denominados espectrofotómetros. O
espetrofotómetro, é um instrumento de análise, capaz de medir e comparar a
quantidade de luz (radiação eletromagnética) absorvida, transmitida ou refletida por
uma determinada amostra, seja ela solução, sólido transparente ou sólido opaco, a um
comprimento de onda definido.
A técnica de espectrofotometria é fundamentada pelos seguintes princípios: [1]
Quanto mais
concentrada
é a solução
Maior será
absorção da
luz
Quanto maior for
a distância
percorrida pelo
feixe
Maior será
absorção da
luz
Tendo em conta os princípios anteriores obtém-se a Lei de Lambert-Beer, que consiste
numa relação empírica que relaciona a absorção de luz com as propriedades do
material atravessado pela mesma. [2] A Lei de Lambert-Beer é dada pela seguinte
equação:
(1)
𝐴=𝜀×𝐶×𝑙
A - é a absorvância a comprimento de onda λ fixo;
ε - constante para comprimento de onda λ fixo;
C - a concentração da solução absorvente;
𝑙 - distância percorrida pelo feixe luminoso através da amostra.
No caso de se utilizar cuvettes com 1cm de comprimento:
𝐴=𝜀×𝐶⇔𝐶=
𝐴
𝜀
(2)
7
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Assim, a absorvância da luz a cada comprimento de onda (λ) n é diretamente
proporcional à concentração da solução contida na cuvette. Este acontecimento deixa
de ocorrer quando as concentrações das substâncias são muito elevadas, pelo que seria
necessário diluir a amostra a medir.
As técnicas de espectrofotometria em que se utilizam dois ou mais comprimentos de
onda, como é o caso desta atividade laboratorial, são bastante úteis. Se considerarmos
um sistema binário, constituído pelas espécies absorventes X e Y, com concentrações CX
e CY, pela Lei de Beer podemos escrever que aos comprimentos de onda 1 e 2, as
absorvâncias medidas são respetivamente:
(3)
(4)
A diferença entre as duas absorvâncias será (considerando 𝑙 =1cm):
(5)
Se o componente Y estiver na mesma absortividade molar () a ambos os comprimentos
de onda (𝜀𝑌λ2 = 𝜀𝑌λ1 ) a expressão anterior é simplificada:
(6)
Nestas condições, a diferença de absorvâncias (∆A) é apenas função do componente X
sendo a influência do componente Y eliminada. Se, adicionalmente, o componente X
não absorver ao comprimento de onda 1 (𝜀𝑌λ1 = 0) a expressão anterior pode ser
escrita:
(7)
As equações (6) e (7) constituem deste modo, o fundamento do método da
equiabsorção. Os comprimentos de onda 1 e 2 podem ser selecionados a partir do
conhecimento dos espectros de absorção das espécies X e Y. A figura seguinte,
demonstra a aplicação da técnica aos espectros de absorção de duas espécies
hipotéticas X e Y, e a sua sobreposição numa mistura.
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Fig.1 - Aplicação da técnica aos espectros de absorção de duas espécies hipotéticas X e Y,
e a sua sobreposição numa mistura.
2. Nitratos e nitritos
Os iões nitrato (𝑁𝑂3−) e nitrito (𝑁𝑂2−) são exemplos de espécies químicas cujos
espectros de absorção, em solução aquosa, possuem características que permitem a
utilização da espectrofotometria.
As soluções do ião 𝑁𝑂3-, apresentam um máximo de absorção a 302 nm sendo este
302nm
−
𝜀𝑁𝑂
= 7,01 M−1cm−1. Já as soluções do ião 𝑁𝑂2-, apresentam um máximo de
3
355nm
−
absorção a 355 nm sendo este 𝜀𝑁𝑂
= 22,73 M−1cm−1.
2
No comprimento de onda máximo do ião 𝑁𝑂3−, o ião 𝑁𝑂2− tem uma absorção
−1
−1
−
significativa (𝜀302nm
𝑁𝑂− = 9,09 M cm ). Em oposição, o 𝑁𝑂3 não absorve no
2
comprimento de onda que corresponde ao máximo de absorção do ião 𝑁𝑂2−. Assim,
numa solução que apresente estes iões, o ião nitrito pode ser determinado através da
curva de calibração obtida a 355 nm. Já a determinação do ião nitrato pode fazer-se do
mesmo modo, alterando apenas o valor da absorvância (sendo este 302 nm) e desde
que as leituras das absorvâncias nesse mesmo valor sejam corrigidas da ação do ião
nitrito nesse comprimento de onda.
A ação referida pode ser vista a partir da leitura da absorvância das soluções num
comprimento de onda a que o 𝑁𝑂2− apresente o mesmo coeficiente de extinção que a
302 nm e onde o ião nitrato não absorva (esse comprimento de onda é determinado a
partir do espectro de absorção do ião nitrito e localiza-se a cerca de 382 nm). [3]
9
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2.1 Importância destas espécies químicas
Os iões nitrato e nitrito fazem parte do ciclo do azoto.
O ião nitrato trata-se da forma estável do azoto, enquanto que, o ião nitrito contém
azoto num estado de oxidação relativamente instável [4]. O nitrato quando encontrado
em baixas concentrações nas águas e alimentos, torna-se um elemento inofensivo para
a saúde da população. Este composto encontra-se naturalmente em algumas águas, mas
por vezes os teores são bastante elevados, o que é resultado de algumas atividades
humanas, tais como: fertilizantes e estrume, confinamento de animais, águas urbanas
residuais e lamas, entre outros [5]. Águas com elevados teores de nitratos, podem causar
uma doença chamada metahemoglobinemia, ocorrendo especialmente em crianças.
No caso dos nitritos, estes são um potencial agente de poluição nas águas naturais, pois
encontram-se presentes devido à decomposição da matéria orgânica azotada. Através
de processos químicos e biológicos, o nitrito pode ser reduzido a diferentes compostos
ou então oxidado a nitrato. Deste modo, o ião nitrito encontra-se presente em sistemas
onde o ião nitrato atua como oxidante. As principais fontes de contaminação por
nitratos são dejetos de animais, nitrato de amónio não absorvido dos fertilizantes e
também a cloroaminação que pode dar origem à formação de nitrito nos sistemas de
distribuição de água, aumentando a concentração dos mesmos à medida que a água se
desloca para as extremidades do sistema, chegando assim até ao consumidor. Também
a nitrificação pode aumentar a quantidade de nitritos nos sistemas de distribuição de
água desde 0,2 até 1,5 mg/L [6].
10
Determinação de nitrato e nitrito em solução por
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Descrição experimental
1. Materiais:






12 tubos de ensaio;
Suporte para tubos de ensaio;
2 copos de 50 mL;
Cuvettes de quartzo ou “Uvettes” de plástico;
Micropipetas P1000 e P200;
Pontas descartáveis azuis e amarelas.
2. Equipamento:
 Espetrofotómetro de UV/Vis (SHIMADZU, MODEL: UV-1800);
 Vórtex (RSLAB-6PRO).
3. Reagentes:




Solução mãe de NaNO3 1M (SIGMA ALDRICH);
Solução mãe de NaNO2 0,25M (SIGMA ALDRICH);
Amostra 1 com concentração desconhecida;
Amostra 2 com concentração desconhecida.
4. Riscos e segurança:
Para a realização do trabalho prático, foi necessário ter em conta os dados da seguinte
tabela:
Tabela nº1: Indicação dos principais risco e indicações de segurança relacionados com os
reagentes a utilizar neste trabalho experimental.
Reagentes
Indicações de risco
Indicações de segurança
Composto comburente e nocivo.
NaNO3
Manter afastado de matérias
combustíveis;
Utilizar material de proteção.
11
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Composto comburente, tóxico por ingestão e perigoso para o
ambiente.
NaNO2
Manter afastado de fontes
de calor/faísca;
Não fumar;
Manter afastado de matérias
combustíveis;
Utilizar material de proteção.
5. Procedimento experimental:
5.1 Retirou-se cerca de 5 mL das soluções mãe de nitrato e de nitrito em copos
separados e com elas preparou-se em tubos de ensaio as seguintes soluções de nitrato
e nitrito respetivamente (Volume final = 5 mL):
Concentrações (mM)
Nitrato
NaNO3
0
20
50
100
150
200
Nitrito
NaNO2
0
10
20
30
40
50
NOTA: Identificou-se os tubos, por exemplo com números, mas evitou-se ambiguidades
(existem 2 tubos de concentração 20 mM, mas de compostos diferentes).
5.2 Com a solução de 200mM de nitrato obteve-se o espectro de absorção do ião nitrato
em solução aquosa (usou-se água destilada como branco) entre 260 e 420 nm. Localizouse o máximo de absorção;
5.3 Utilizando a solução de nitrito 50 mM obteve-se o espectro de absorção desse ião
em solução aquosa entre 260 e 420 nm. Localizou-se o máximo de absorção e verificouse o valor de absorvância ao comprimento de onda do máximo de absorção do ião
nitrato. Escolheu-se então, na zona em que o ião nitrato não absorveu, o comprimento
de onda ao qual se verificou o mesmo valor de absorvância;
5.4 Obteve-se a curva de calibração de 𝑁𝑂2− e outra de 𝑁𝑂3− ao comprimento de onda
máximo determinado para cada espécie;
5.5 Analisou-se a solução de nitratos e nitritos de concentração desconhecida
utilizando a técnica descrita, para determinar a concentração de 𝑁𝑂2− e 𝑁𝑂3-;
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Resultados experimentais
Preparação de soluções:
 Cálculos preliminares:
Determinação da massa necessária para preparar uma solução mãe de NaNO3 1M:
𝐶=
𝑛
𝑣
Dados:
 𝑛 = 𝐶 × 𝑣  𝑛 = 1 × 0,1 = 0,1 𝑚𝑜𝑙 𝑁𝑎𝑁𝑂3
Solução mãe = 1M
Volume = 10 mL
M(NaNO3) = 84,99 g/mol
𝑚 = 𝑛 × 𝑀  𝑚 = 0,1 × 84,99 = 8,499 𝑔 𝑁𝑎𝑁𝑂3
Tabela nº2: Registo dos valores da preparação da diluição das soluções de nitrato.
Tubo
Nitrato
mM)
1
2
3
4
5
6
0
20
50
100
150
200
100
250
500
750
1000
mL
mL
mL
mL
mL
5000
4900
4750
4500
4250
4000
mL
mL
mL
mL
mL
mL
5 mL
5 mL
5 mL
5 mL
5 mL
5 mL
Volume
solução mãe 0 mL
(NaNO3 1M)
Volume H2O
Volume total
Para facilitar nos cálculos:
Assim,
1M = 1000mM
5mL = 5000 mL
Tubo 2:
𝐶𝑖 × 𝑉𝑖 = 𝐶𝑓 × 𝑉𝑓  1000mM × 𝑉𝑖 = 20mM 
5000mL  𝑉𝑖 = 100 mL
Para os restantes tubos foi utilizado o mesmo processo de cálculo.
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Determinação da massa necessária para preparar uma solução mãe de NaNO2 0,25M:
𝐶=
𝑛
𝑣
 𝑛 = 𝐶 × 𝑣  𝑛 = 0,25 × 0,1 =
Dados:
0,025 𝑚𝑜𝑙 𝑁𝑎𝑁𝑂2
Solução mãe = 0,25M
Volume = 10 mL
M(NaNO2) = 69,00 g/mol
𝑚 = 𝑛 × 𝑀  𝑚 = 0,025 × 69,00 = 1,725 𝑔 𝑁𝑎𝑁𝑂2
Tabela nº3: Registo dos valores da preparação da diluição das soluções de nitrito.
Tubo
Nitrito
mM)
7
8
9
10
11
12
0
10
20
30
40
50
200
400
600
800
1000
mL
mL
mL
mL
mL
5000
4800
4600
4400
4200
4000
mL
mL
mL
mL
mL
mL
5 mL
5 mL
5 mL
5 mL
5 mL
5 mL
Volume
solução mãe
0 mL
(NaNO2 250mM)
Volume H2O
Volume total
Para facilitar nos cálculos:
Assim,
5mL = 5000 mL
Tubo 7:
𝐶𝑖 × 𝑉𝑖 = 𝐶𝑓 × 𝑉𝑓  250mM × 𝑉𝑖 = 10mM 
5000mL  𝑉𝑖 = 200 mL
Para os restantes tubos foi utilizado o mesmo processo de cálculo.
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 Curva de calibração do nitrato:
Tabela nº4: Registo dos valores das absorvâncias de nitrato obtidos na primeira
medição.
NaNO3 (mM)
0
20
50
100
150
200
Abs (302 nm)
0,000
0,150
0,361
1,141
1,440
1,825
Tabela nº5: Registo dos valores das absorvâncias de nitrato obtidos na segunda
medição.
NaNO3 (mM)
0
20
50
100
150
200
Abs (302 nm)
0,000
0,150
0,361
0,700
1,440
1,825
Nota: Foi realizada uma nova preparação da solução 100mM e consequentemente uma
nova leitura, uma vez que a absorvância lida na primeira medição apresentou um valor
discrepante.
 Curva de calibração do nitrito:
Tabela nº6: Registo dos valores das absorvâncias de nitrito obtidos.
NaNO2 (nM)
Abs (355 nm)
0
10
20
30
40
50
0,000
0,222
0,459
0,688
0,923
1,165
15
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Tabela nº7: Registo dos valores das absorvâncias das amostras.
302 nm
355 nm
382 nm
Amostra A
1,081
1,265
0,432
Amostra B
1,837
0,841
0,288
Amostra a
(diluída 2x)
0,527
0,613
0,211
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Tratamento dos resultados
Questões pós-laboratoriais:
1) Apresente graficamente os espetros de absorção do ião nitrito e ião nitrato.
Defina corretamente os limites dos eixos, em particular do eixo dos xx para apresentar
apenas a gama de comprimento de onda em que determinou a absorvância. Legende os
eixos.
Espectro de absorção do nitrato
2
Abosrvância
1,5
1
0,5
0
260
280
300
320
340
360
380
400
420
-0,5
Comprimento de onda (nm)
Fig. 2 – Espectro de absorção do nitrato.
Absorvância
Espetro de absorção do nitrito
1
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
260
280
300
320
340
360
380
400
420
Comprimento de onda (nm)
Fig. 3 – Espectro de absorção do nitrito.
17
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2) Apresente o valor do comprimento de onda de absorção máxima do ião nitrito e do
ião nitrato, identificando-o no gráfico dos espetros de absorção.
O ião nitrato apresenta a sua absorvância máxima nos 302 nm, já o ião nitrito este
apresenta a absorvância máxima nos 355 nm como se pode observar nos gráficos
anteriores.
3) Apresente em tabelas os resultados obtidos referentes às curvas de calibração,
agrupando os replicados. Identifique outliers que irá remover nos gráficos das curvas
de calibração. Não determine a média de absorção para cada concentração. Use
todos os pontos para traçar os gráficos.
Tabela nº8: Resultados obtidos referentes à curva de calibração do nitrato.
NaNO3
(mM)
0
20
50
100
150
200
Abs
(302nm)
0
0,150
0,361
0,700
1,440
1,865
Tabela nº9: Resultados obtidos referentes à curva de calibração do nitrito.
NaNO2
(mM)
0
10
20
30
40
50
Abs
(355nm)
0
0,222
0,459
0,688
0,923
1,165
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4) Trace graficamente as curvas de calibração que correlacionam a absorvância com a
concentração de ião nitrito (aos dois comprimentos de onda) e a concentração de
ião nitrato (aos dois comprimentos de onda).
Divida em 2 gráficos, um para cada ião. Legende adequadamente os eixos dos gráficos.
Ião Nitrato
2
y = 0,0095x - 0,0721
R² = 0,9826
Absorvância (nm)
1,5
1
0,5
0
0
50
100
150
200
250
-0,5
Concentraçaõ de NO3- (mM)
Fig. 4 – Curva de calibração do ião nitrato.
Tabela nº10: Valores referentes à curva de calibração do nitrato.
Declive (m)
Ordenada na origem (b)
R2
0,0095
-0,0721
0,9826
Ião Nitrito
1,4
1,2
y = 0,0233x - 0,0065
R² = 0,9999
Absorvância (nm)
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
-0,2
0
10
20
30
40
50
60
Concentração de NO2- (mM)
Fig. 5 – Curva de calibração do ião nitrato.
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Tabela nº11: Valores referentes à curva de calibração do nitrito.
Declive (m)
Ordenada na origem (b)
R2
0,0233
-0,0065
0,9999
5) Determine – por regressão linear – o valor estimado do coeficiente de absortividade
molar (ε) de cada ião, a cada comprimento de onda.
Apresente estes resultados em tabela, juntamente com os parâmetros da regressão
linear (R2, etc.). Discuta os valores obtidos. Compare com os valores dos coeficientes de
absortividade molar de cada ião (ε) tabelados. Calcule o erro relativo.
Nitrato:
Tabela nº12: Valores da absortividade molar e de R2 do nitrato.
R2
Ɛ (absortividade molar)
0,9901
0,009
𝐸𝑟𝑟𝑜 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 = |𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑡𝑎𝑏𝑒𝑙𝑎𝑑𝑜 − 𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑒𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙| 
 𝐸𝑟𝑟𝑜 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 = |0,00701 − 0,009| = 0,00199
𝐸𝑟𝑟𝑜 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜 =
𝐸𝑟𝑟𝑜 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜
× 100% 
𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑡𝑎𝑏𝑒𝑙𝑎𝑑𝑜
 𝐸𝑟𝑟𝑜 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜 =
0,00199
× 100% = 28,39%
0,00701
Nitrito:
Tabela nº13: Valores da absortividade molar e de R2 do nitrito.
R2
Ɛ (absortividade molar)
0,9999
0,0231
𝐸𝑟𝑟𝑜 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 = |𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑡𝑎𝑏𝑒𝑙𝑎𝑑𝑜 − 𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑒𝑥𝑝𝑒𝑟𝑖𝑚𝑒𝑛𝑡𝑎𝑙| 
 𝐸𝑟𝑟𝑜 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜 = |0,02273 − 0,02310| = 0,00037
𝐸 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜 =
𝐸 𝑎𝑏𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑜
× 100% 
𝑉𝑎𝑙𝑜𝑟 𝑡𝑎𝑏𝑒𝑙𝑎𝑑𝑜
 𝐸 𝑟𝑒𝑙𝑎𝑡𝑖𝑣𝑜 =
0,00037
× 100% = 1,63%
0,02273
20
Determinação de nitrato e nitrito em solução por
Espetrofotometria de UV/Vis | 2021/2022
O coeficiente de absortividade corresponde ao declive da reta de calibração quando esta
passa no ponto (0;0) do gráfico.
O R2 é uma medida estatística que mede o quão próximos os dados estão da reta de
regressão linear. Quanto maior o seu valor, mais próximos os dados estão da reta. Logo
no caso da análise dos dois iões, o gráfico em que os pontos estão mais próximos é o da
reta de calibração.
6) Determine a composição da mistura de concentrações desconhecidas. Use os
replicados para obter o valor médio e desvio padrão. Apresente os cálculos e
fundamente o raciocínio.
Abs NO2 (302nm) = Abs NO2 (382nm)
Amostra A:
Nota: A amostra A foi diluída 2x.
𝐴𝑏𝑠(302𝑛𝑚) = 𝐴𝑏𝑠 𝑁𝑂3(302𝑛𝑚) + 𝐴𝑏𝑠 𝑁𝑂2(302𝑛𝑚) 
 Abs NO3(302nm) = Abs(302nm) − 𝐴𝑏𝑠 𝑁𝑂2 (382𝑛𝑚) 
 Abs NO3(302nm) = 0,527 − 0,211 = 0,316
Abs NO3(302nm) = Ɛ 𝑁𝑂3 × [𝑁𝑂3] × 𝑙 
 [𝑁𝑂3] =
Abs NO3(302nm)
Ɛ 𝑁𝑂3 × 𝑙
=
0,316
0,009 × 1
= 35,111 𝑚𝑀(diluída)
Abs NO2(355nm) = Ɛ 𝑁𝑂2 × [𝑁𝑂2] × 𝑙 
 [𝑁𝑂2] =
Abs NO2(355nm)
Ɛ 𝑁𝑂2 × 𝑙
=
0,613
0,0231 × 1
= 26,537 𝑚𝑀 (diluída)
[𝑁𝑂3]𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 = [𝑁𝑂3]diluída × 2 = 35,111 × 2 = 70,222 𝑚𝑀
[𝑁𝑂2]𝑓𝑖𝑛𝑎𝑙 = [𝑁𝑂2]diluída × 2 = 26,537 × 2 = 53,074 𝑚𝑀
Amostra B:
𝐴𝑏𝑠(302𝑛𝑚) = 𝐴𝑏𝑠 𝑁𝑂3(302𝑛𝑚) + 𝐴𝑏𝑠 𝑁𝑂2(302𝑛𝑚) 
 Abs NO3(302nm) = Abs(302nm) − 𝐴𝑏𝑠 𝑁𝑂2 (382𝑛𝑚)
 Abs NO3(302nm) = 1,837 − 0,288 = 1,549
Abs NO3(302nm) = Ɛ 𝑁𝑂3 × [𝑁𝑂3] × 𝑙 
21
Determinação de nitrato e nitrito em solução por
Espetrofotometria de UV/Vis | 2021/2022
 [𝑁𝑂3] =
Abs NO3(302nm)
1,549
=
= 172,111 𝑚𝑀
Ɛ 𝑁𝑂3 × 𝑙
0,009 × 1
Abs NO2(355nm) = Ɛ 𝑁𝑂2 × [𝑁𝑂2] × 𝑙 
 [𝑁𝑂2] =
Abs NO2(355nm)
0,841
=
= 36,407 𝑚𝑀
Ɛ 𝑁𝑂2 × 𝑙
0,0231 × 1
Nitrito:
𝑀é𝑑𝑖𝑎 𝐴𝑏𝑠 (355𝑛𝑚) =
S =√
0 + 0,222 + 0,459 + 0,688 + 0,923 + 1,165
= 0,5762
6
(0−0,5762)2 +(0,222−0,5762)2 +(0,459−0,5762)2 +(0.688−0,5762)2 +(0,923−0,5762)2 +(1,165−0,5762)2
6−1
= 0,4360
Nitrato:
𝑀é𝑑𝑖𝑎 𝐴𝑏𝑠 (302𝑛𝑚) =
S =√
0 + 0,150 + 0,361 + 0,700 + 1,440 + 1,825
= 0,7527
6
(0−0,7527)2 +(0,150−0,7527)2 +(0,361−0,7527)2 +(0.700−0,7527)2 +(1,440−0,7527)2 +(1,825−0,7527)2
6−1
7) Discuta interferências que possam ocorrer neste procedimento, se estiver a analisar
amostras de origem biológica (em particular a presença de biomoléculas ácidos
nucleicos e proteínas). Investigue a existência de outras metodologias de
determinação de nitratos e nitritos por espectroscopia de UV-Vis.
Neste tipo de técnicas de análise há sempre a possibilidade de haver
desvios/interferências, que podem ser causados por limitações do instrumento utilizado
ou até fenómenos químicos que podem limitar a aplicação da Lei de Lambert-Beer. Estas
interferências podem ser tanto físicas como químicas.
No caso de se analisar amostras biológicas, as interferências químicas estão entre as
mais comuns, podendo ser causadas por associações moleculares, como a
polimerização, visto que as moléculas monómeras geralmente absorvem a
comprimentos de onda diferentes dos comprimentos das suas moléculas polímeras,
levando a resultados diferentes do esperado. Outro dos desvios que pode acontecer, é
22
= 0,7477
Determinação de nitrato e nitrito em solução por
Espetrofotometria de UV/Vis | 2021/2022
o da interação dos centros absorventes, que acontece quando a altas concentrações, as
partículas ficam tão próximas umas das outras que a sua capacidade de absorver a um
determinado comprimento de onda se altera.
Visto que, ambos os iões absorvem no mesmo comprimento de onda, um outro método
que poderíamos ter usado para a determinação das concentrações dos dois iões, é o
Método de Griess. Neste método, é calculado primeiramente a concentração de nitrito,
utilizando ácido sulfanílico e alfa-nafitilamina, que irá formar um azocomposto com o
nitrito. Depois procede-se à redução do ião nitrato em nitrito, e calcula-se a
concentração usando o mesmo método dito anteriormente. No final a concentração do
ião nitrato será dada pela diferença entre a concentração de nitrito e a concentração da
mistura (ião nitrito e ião nitrato reduzido a nitrito). [7]
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Determinação de nitrato e nitrito em solução por
Espetrofotometria de UV/Vis | 2021/2022
Conclusões e Crítica
Com a realização deste trabalho prático, foi utilizado o método de espetrofotometria de
UV/Vis, onde foi possível determinar as concentrações de nitrato (NaNO3) e nitrito
(NaNO2) em soluções.
Após a obtenção dos espetros de absorção, foi possível observar que o ião nitrato (NO3) e o ião nitrito (NO2-) possuem maior absorvância nos comprimentos de onda 302nm e
355nm, respetivamente. Ainda durante a leitura da absorvância da solução de nitrato,
reparou-se que a solução de concentração 100mM, possuía um valor de absorvância
relativamente “estranho” aos outros por ser muito elevado ao esperado (A=1,141), por
isso fez-se uma nova solução com as mesmas características de forma a obter um novo
valor e ignorar o antigo, tendo sido obtido um novo valor de absorvância da nova
solução (A=0,700) para a realização dos cálculos.
Determinou-se o coeficiente de absortividade para cada ião analisado na atividade
laboratorial recorrendo à equação da reta obtida, onde para o ião nitrato calculado
corresponde a 𝜀 = 0,009 mM-1cm-1 e para o ião nitrito corresponde a 𝜀 = 0,0231 mM1cm-1.
Após a análise das amostras diluídas desconhecidas A e B, foram obtidos para a amostra
A valores de absorvância maiores no comprimento de onda de 355nm do que em
302nm, indicando que existe uma maior concentração de iões nitritos do que nitratos,
não correspondendo com os valores de concentrações obtidos através de cálculos para
a amostra A, onde a concentração de nitratos é maior do que a de nitritos nessa
amostra. A causa dessa incompatibilidade pode ter sido por uma alteração da
composição original da amostra por alguma contaminação, ou até mesmo um mal
manuseamento de algum material ao longo da experiência laboratorial, ou até mesmo
um mal funcionamento de algum equipamento laboratorial. Já para a amostra B, foram
obtidos valores de absorvância maiores para o comprimento de onda de 302nm,
indicando assim que existe uma maior concentração de iões nitratos, sendo equivalente
aos resultados obtidos através de cálculos que comprovam que a concentração de
nitratos realmente é maior do que a de nitritos nessa mesma amostra.
No final do trabalho, obteve-se em relação à amostra A, uma concentração de nitrato
de 70,222mM e uma concentração de nitrito de 53,074mM. Relativamente à amostra B,
obteve-se uma concentração de nitrato e nitrito de 172,111 mM e 36,407 mM,
respetivamente. Foram também detetadas falhas durante a análise deste trabalho
prático, onde o resultado obtido não corresponde com o esperado. Como sugestão, para
evitar erros futuros, a utilização de outros métodos e equipamentos é o mais
aconselhável, como por exemplo o Método de Griess mencionado anteriormente no
ponto 7 do tratamento de resultados.
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Determinação de nitrato e nitrito em solução por
Espetrofotometria de UV/Vis | 2021/2022
Bibliografia
[1] https://pt.wikipedia.org/wiki/Espectrofotometria Acedido em: 24/11/2021
[2] https://pt.wikipedia.org/wiki/Lei_de_Lambert-Beer Acedido em: 24/11/2021
[3] Justino, Marta, Justino, Gonçalo. Trabalho Prático nº2 Determinação de nitrato e
nitrito em solução por Espetrofotometria de UV/Vis. Slides de Laboratórios IIIB, ESTBIPS, pp.22-27
Disponível em:
https://moodle.ips.pt/2122/pluginfile.php/162706/mod_resource/content/1/Protocol
os_Lab%20III%20B_versao2021_2022.pdf Acedido em: 24/11/2021
[4] World Health Organization, “Nitrate and nitrite in drinking-water, ”2005.
Disponível em:
http://www.who.int/water_sanitation_health/dwq/chemicals/nitratenitrite2ndadd.pd
f. Acedido em: 25/11/2021
[5] J. R. Self e R. M. Waskom, “ Nitrates in Drinking Water, ”2013.
Disponível em: https://www.scielo.br/j/qn/a/3XG4nwpXghskq6dggJzqykQ/?lang=pt
Acedido em: 26/11/2021
[6] L. A. Ramos, C. C. S. Cavalheiro e E. T. G. Cavalheiro, “Determinação de Nitritos em
Águas utilizando extracto de Flores ” Vol. 29 (5), pp. 1114-1120, 2006.
Disponível em: https://www.scielo.br/j/qn/a/3XG4nwpXghskq6dggJzqykQ/?lang=pt
Acedido em: 25/11/2021
[7] https://www2.ufjf.br/ufjf/?s=Espere+o+c%C3%B3pia+uv-vis
Acedido em: 28/11/2021
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