Seorang ibu membawa anak laki-lakinya yang berumur 10 tahun ke Unit Gawat Darurat salah satu RS Swasta. Ia baru saja membawa anaknya ke dokter gigi dan ketika itu salah satu gigi anaknya terpaksa harus dicabut. Setelah dicabut, perdarahan yang terjadi tidak dapat ditanggulangi oleh dokter gigi, dan kemudian ia dirujuk untuk segera dibawa ke rumah sakit. Dari keterangan ibunya, anak tersebut sering mengalami perdarahan sejak usia 5 tahun terutama setelah terbentur atau terjatuh. Riwayat penyakit keluarga,saudara laki-laki kandung si ibu mengalami keluhan perdarahan yang sama dan telah meninggal dunia saat usia anak-anak. Pada pemeriksaan fisik penderita tampak lemah dengan kesadaran compos mentis, dan wajah terlihat pucat. Oleh dokter jaga, pasien ini didiagnosa sementara dengan Hemofilia. Pedigree of Hemophilia in One Family female normal male hemophilic male Hemophilia Hemophilia - A sex linked genetic disorder in which blood clotting is deficient Hemophilia A - lack of antihemophilic globulin Most common type (80% of cases). Hemophilia B - defect in thromboplastic component - a milder form of the disease. Sex linked - trait found on X chromosome. How about cancer ? Chromosome, DNA, Gen 22.3 22.2 22.1 p 21.2 21.3 21.1 11.4 11.3 11.23 11.22 11.21 11.1 11.1 11.2 12 X Chromosome growth control factor, X-linked Xg blood roup ocular albinism sensorineural deafness anemia, sideroblastic, with Spinocerebellar ataxia 13 21.2 22.2 21.1 cleft palate 21.3 lymphoproliferative syndrome 22.1 22.3 23 24 25 q 26 27 28 Simpson dysmorphia syndrome coagualation factor IX, hemophilia B blue-monochr. color blindness coagulation factor VIIIc,hemophiliaA homosexuality, male Chromosomes BODY PROTEIN Enzyme Receptor Hormone Growth Factor Immunoglobulin Interferon, Interleukin, Cytokine Adhesions molecules HLA/MHC STRUKTUR PROTEIN SIFAT PROTEIN FUNGSI PROTEIN PEMBENTUKAN PROTEIN DISTRIBUSI PROTEIN PEMERIKSAAN PROTEIN Proteins are composed of subunits called amino acids Chromosomes Long strands of DNA packaged and compressed very tightly Everyone has 2 sets (1 pair) of chromosomes 1 pair of each of the 22 ‘autosomes’ plus XX for a female (46XX) or XY for a male (46XY) 1 is inherited from mum, 1 from dad You pass 1 of each pair onto each child Biokimia : DNA adalah Polymer dari Desoxyribonucleotide (Basa, zat Gula dan 1 atau lebih gugus Phosphat) Zat Gula : -D-2 Desoxyribose (Ribose) Ikatan N-Glykosida antara Desoxyribose (C1) dengan Pyrimidin (N1) atau Purin (N9) Desoxy ribonucleic acid Sanger dan Gilbert (1975) : methode sequensi Basa Nukleotida (A, T, C, G) Nukleotida : 2,9 milyar (990 mm) di Chromosome (inti sel) Telah selesai disequensi pada Juli 2000 Gen : Sepotong DNA (Intron atau Exon) A-T G-C Satuan DNA : bp (base pair) DNA Base Pairing A G C G A T C T G G T C G C T A G A C C Double helix consists of 2 complimentary strands of DNA. DNA Replication Each of the 2 DNA strands is copied by machinery in the cell Each new ‘daughter’ strand has a sequence complimentary to the original ‘template’ strand Replication essential to allow cell division (Mitosis) where 1 cell becomes 2 DNA Replication C C A T DNA unzips A T T A G T T A A New strands G formed G A T C semi-conservative 2 daughter cells Replikasi DNA berlangsung pada kedua helix dengan arah yang berlawanan 3’ 5’ 3’ 5’ DNA Replication Replication fork : leading strand and lagging strand DNA synthesized in the 5’ – 3’ The 5’-3’ synthesis of the leading strand is continuous. The lagging strand is also synthesized in the 5’3’ direction but in small segments This segments referred to as Okazaki fragments Okazaki fragments has 100 – 200 nucleotides DNA ligase joined the Okazaki fragments. 5 DNA Polymerase : α, β, δ, ε and γ DNA Replication and Chromosomes During the replication of chromosomes, there is a cross-over of portions of one DNA strand to another (of the same chromosome). This cross-over, along with randomization assures that offspring differ from the parents. meiosis + Genes Segments of DNA code for proteins (or parts of proteins) Each coding segment is called a gene One gene codes one protein (or part of) Genes contain the information which makes us what we are Gene Structure Every three bases of DNA is called a ‘codon’ Each codon specifies an amino acid which join together to form the protein eg ATG = methionine = START TAA = STOP TAG = STOP TGA = STOP Gene Structure Introns Promoter Exons ATG start TAA TAG ‘stop’ TGA Exon = coding sequence Intron= intervening sequence (non-coding) Protein Synthesis transcription DNA RNA Protein translation Nukleotida 1. (5’) U Nukleotida 2. Nukleotida 3. C A G U Phe Ser Tyr Cys U U Phe Ser Tyr Cys C U Leu Ser STOP STOP A U Leu Ser STOP Trp G C Leu Pro His Arg U C Leu Pro His Arg C C Leu Pro Gln Arg A C Leu Pro Gln Arg G (3’) U C A G A Ile Thr Asn Ser U A Ile Thr Asn Ser C A Ile Thr Lys Arg A A Met Thr Lys Arg G G Val Ala Asp Gly U G Val Ala Asp Gly C G Val Ala Glu Gly A G Val Ala Glu Gly G Perbedaan Sandi Nukleotida Nukleotida : UGA AUA AGA AGG Chr. : Mit. : Stop Ile Arg Arg Trp Met Stop Stop Mutations A change in the DNA sequence of the gene All cells acquire mutations as they divide -6 rate of approx 10 per gene per cell Mutations can alter protein product of DNA, stop gene working or activate gene Types of Mutation Deletion - DNA missing Insertion - extra DNA inserted Expansion (Amplification) - DNA repeat size has increased Point Mutation - change in one base Types of Mutation (in coding sequence) AGC TTC GAC CCG AGC TCG ACC CG AGC TTC CGA CCC G AGC TTC TTC GAC CCG ATC TTC GAC CGG Wild type Deletion Insertion Expansion Point mutation POINT MUTATION UAA (Termination Codon) UCA (Codon for Serine) UCU (Codon for Serine) CCA (Codon for Proline) PEMERIKSAAN DNA DNA di-isolasi dari sel (darah atau jaringan) DNA menjadi “template” atau “matrix” untuk proses amplifikasi Sense : 5’- ATG(Start) -GGT-TCT-GTT-GCTGCT-TGG-TAA(Stop)- 3’ Antisense : 3’ - TAC-CCA-AGA-CAA-CGACGA-ACC-ATT- 5 ‘ Exon dan/atau Intron dapat berfungsi sebagai Matrix untuk amplifikasi Polimerase Chain Reaction (PCR) Tahun 1985, Kary Mullis, California Metode untuk meng-amplifikasi (melipat gandakan) fragment DNA (Gen) Dibutuhkan : DNA atau RNA Oligonucleotidprimer (PRIMER) Enzym Taq-Polimerase Campuran dari 4 Basa Nukleotida (d’NTPs) 10 x Reactions Buffer Larutan MgCl2 Alat : Thermal Cycler Prinsip : perobahan temperatur secara otomatis dengan waktu yang telah ditentukan Dapat diatur (Program) Contoh : 95 °C------ Denaturasi 55 °C------ Hybridisasi (Annealing) 72 °C------ Synthese DNA (Extension) Lama reaksi, bervariasi tergantung panjang fragment DNA (2 min. : < 1000 Nukleotida) RNA Single strand (Uracil pengganti Thymin) Transkripsi dari DNA mRNA Mengandung informasi genetik dari Exon Dengan Enzym Reverse Transkriptase diperoleh DNA dari RNA cDNA Reaksi PCR nya disebut RT-PCR Taq-Polimerase Klenow - DNA Polymerase dari E.Coli 1988 : Taq-Polymerase dari Bakteri Thermus aquaticus Hybridisasi dan Polimerisasi berlangsung pada temp. 50-70 °C Perhatikan : Buffer yang digunakan (10 x RB) dan diperlukan MgCl2 Primer Sequence dari Nukleotida tertentu (Intron atau Exon) : 20 – 30 bp Prinsip : merupakan complementare dari kedua strand DNA (Forward Primer dan Reverse Primer). Dari kedua Primer ini disinthese DNA yang baru dan seterusnya berfungsi sebagai matrix untuk siklus berikutnya. Penentu bagi fragment DNA yang akan diamplifikasi PCR-REACTION PCR-Reaction PCR Product (Amplifikat) Gel-elektrophorese (Agarose) Southern Blot (Hybridisasi dengan Sonde DNA spesifik) Dot - Blot (deteksi : Enhanced Chemie Luminescense = ECL) Denaturating Gradient Gel Electrophorese (DGGE) atau Pulse Field Gel Electrophorese (PFGE) Enzym Restriksi : Restriction Endonuclease Sequence analysis (DNA Sequencing) cytoplasmic proteins free ribosomes RER Protein Traffic Aplikasi teknologi DNA INFEKSI SALURAN CERNA : Membedakan jenis : pathogen – non pathogen (Eschericia coli) Untuk bakteri yang sulit dikultur oleh karena memerlukan syarat tertentu (Campylobacter) Membedakan jenis bakteri dari toxin yang diproduksinya (E. coli dan Shigela sp.) Subklas bakteri : Campylobacter, Helicobacter Mengidentifikasi jenis Rotavirus (A, B, C) Aplikasi teknologi DNA Mycobacterium tuberculosis : Membedakan jenis atypic, dengan mikroskop hal ini tidak mungkin Kultur : waktu yang lama dan bakteri harus banyak (terutama untuk sensitivity test) Diagnose cepat dibutuhkan, mis. pada penderita AIDS. Ditemui jenis yang multi drug resistant (MDR) Diagnosa dengan PCR dan Hybridisasi (contoh : dot-blot) Carcinogenesis (Colorectal Cancer) Penerapan Teknologi Gen/DNA dalam Therapy Produk dari gen untuk therapy dan prophylaxis : Erythropoietin Insulin Hormon pertumbuhan Faktor pembekuan darah VIII Plasminogen aktivator Vaksin Hepatitis B Aplikasi gen dalam Forensik Sebelum teknologi DNA diterapkan (1978) biasanya digunakan protein, misalnya antigen gol.darah, HLA, dll. 1985 : DNA Polymorphismus. Nov.1987 : DNA sebagai barang bukti di pengadilan di Inggris. Sampai akhir 80-an : lebih dari 1000 perkara dibantu oleh bukti-bukti DNA Juga dapat menentukan Paternity Profil DNA tiap individu berbeda