‫روشهای تشخیص مولکولی‬
‫• آنزیم ها و عملکردشان‬
‫آنزیم‬
‫عملکرد‬
‫پلیمراز‪ DNA:‬پلیمرازها‬
‫‪RNA‬پلیمرازها‬
‫سنتز رشته دختر از ´‪ 5‬به ´‪3‬‬
‫آنزیم رونویسی کننده معکوس‬
‫سنتز‪ DNA‬از روی الگوی ‪RNA‬‬
‫‪ DN A‬لیگاز‬
‫اتصال قطعات ‪ DNA‬منقطع‬
‫اندونوکلئاز‬
‫اگزونوکلئاز‬
‫هضم اسیدنوکلئیک از وسط مولکول‬
‫هضم اسیدنوکلئیک ازانتهای مولکول‬
‫اندونوکلئاز محدود کننده‬
‫اندونوکلئازباکتریایی که ‪DNA‬‬
‫راازناحیه خاص می شکافد‬
Restriction Endonuclease
SOUTHERN BLOT HYBRIDIZATION
‫• ساترن بالت‪:‬‬
‫در این روش ‪ DNA‬مورد سنجش قرار می گیرد‬
‫مراحل کار ‪:‬‬
‫جداسازی ‪DNA‬‬‫هضم ‪ DNA‬با اندونوکلئازهای محدود کننده‬‫جداسازی براساس اندازه با الکتروفورزدرآگاروز‬‫انتقال اجزاء متفاوت به نیترو سلولز با عمل موئینگی‬‫تثبیت کردن با حرارت یا ‪ UV‬برروی غشاء‬‫هیبرید نمودن‪:‬‬‫ ذوب نمونه‬‫اتصال پراب نشاندار‬‫ شستشو‬‫ردیابی‪:‬باندهای حاوی توالی های مکمل با پراب ‪،‬با اتورادیوگرافی‪ ،‬کلریمتری‬‫یا کمیلولومینانس ردیابی می شوند‬
Southern Blot
Restriction enzyme
DNA of
various sizes
Electrophorese on agarose gel
gel
Denature - transfer to
filter paper.
blot
Denature- transfer to
filter paper.
blot
Hybridize to probe
Visualize
S
o
u
t
h
e
r
n
B
lo
t
‫• نورترن بالت‪:‬‬
‫دراین روش ‪ RNA‬مورد سنجش قرار می گیرد‬‫‪-‬دراین تکنیک ‪ RNA‬از سلول جدا وبدون هضم وبرش الکتروفورز میشود‬
‫نکته‪:‬‬
‫تکنیک حساستر برای شناسایی ‪ RNA‬سنجش محافظت در مقابل ‪ RNase‬است‬
‫دراین روش‪:‬‬
‫‪ RNA‬با پراب نشاندار هیبرید می شود‬‫‪ RNase‬به مخلوط اضافه می شود که فقط ‪ RNA‬تک رشته ای وپراب غیر‬‫هیبرید را هضم می کند‬
‫مولکول های دو رشته های از هضم در برابر آنزیم ‪RNase‬محافظت می‬‫شوند و ‪ RNA‬هیبرید با پراب با الکتروفورز جدا می گردند‬
Northern Hybridization
Isolate mRNA
(Different Lengths)
Probe with labeled DNA
‫• هیبریدیزاسیون در جا)‪(In situ hybridyzation‬‬
‫در این روش پرابها به‪ DNA‬موجود در کروموزوم های ثابت شده روی‬‫صفحات میکروسکوپ هیبرید می شوند‬
‫‪DNA‬برروی اسالیدثابت شده انددرهمان جا دناتوره می شوند تا دو رشته در‬‫معرض پراب نشاندار شده قرار بگیرند به همین دلیل به این روش‬
‫هیبریدیزاسیون درجا می گویند‬
‫شایعترین روش نشاندار کردن پرابها برای هیبریدیزاسیون درجاکروموزومها‬‫با رنگ فلورسنت است به این تکنیک هیبریدیزاسیون فلورسنت در جا‬
‫)‪(FISH‬می گویند‬
‫کاربرد ‪:‬‬
‫سیتوژنتیک تشخیصی بالینی‬‫‪-‬نقشه برداری ژنی‬
High Resolution Banding and FISH
Control Signals
Region-Specific Signal
The chromosome banding technique performed 20 years ago missed the
small deletion. High resolution banding developed more recently can
elucidate the abnormality. Fluorescence in situ Hybridization (FISH) is a
powerful technique in that it can reveal submicroscopic abnormalities even
in non-dividing cells.
‫• روشهای آمپلیفیکاسیون‪:‬‬
‫درسه سطح زیرصورت می گیرند‪:‬‬
‫ آمپلیفیکاسیون هدف‬‫ آمپلیفیکاسیون پراب‬‫ آمپلیفیکاسیون سیگنال‬‫روشهای آمپلیفیکاسیون هدف شامل‪:‬‬
‫انواع واکنش های زنجیره پلیمراز‬‫ آمپلیفیکاسیون باواسطه رونویسی‪ /‬آمپلیفیکاسیون برپایه توالی اسید نوکلئیک‬‫ آمپلیفیکاسیون با جابجایی رشته‬‫روشهای آمپلیفیکاسیون پراب شامل‪:‬‬
‫واکنش زنجیره لیگاز‬‫تکنولوژی‪ /‬تهاجمی کلیواز‬‫ ‪Q beta‬رپلیکاز‬‫روشهای آمپلیفیکاسیون سیگنال شامل‪:‬‬
‫ ‪ DNA‬شاخه ای‬‫‪ -‬سنجش های تسخیر هیبرید‬
‫•‬
‫تعریف‪:‬‬
‫)‪polymerasechain reaction (PCR‬‬
‫روشی ساده وسریع برای ساخت نسخه های متعددی از توالی های حدود یک‬
‫کیلوبازی ‪DNA‬میباشد‬
‫مراحل انجام واکنش‪:‬‬
‫‪:Denaturation‬تبدیل ‪ DNA‬دورشته ای به ‪ DNA‬تک رشته ای دردمای ‪94‬‬‫‪:Primer Annealing‬اتصال پرایمرها به انتهای ‪ 3‬زنجیره‪ DNA‬تک رشته ای‬‫دردمای ‪50-58‬‬
‫‪:Extention‬آنزیم ‪ DNA‬پلیمراز دردمای ‪ 72‬ازانتهای ‪3‬هر پرایمر زنجیره مکمل را‬‫می سازد‬
‫رنگ آمیزی اتیدیوم بروماید روی ژل آگاروز‬
‫‪bacterium Thermus aquaticus‬‬
‫حداقل ‪2‬پرایمر‬
‫اختصاصیت‬
‫رشته‬
‫تک‬
‫→‬
‫نسبی‬
‫موقعیت‬
‫محدودیت فاصله‬
‫قطعات‪ 22‬باز‬
‫‪-17‬‬
‫←‬
Animation for PCR
http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcrani.html
30x
Temperature
100
Melting
94 oC
Extension
Annealing
Primers
50 oC
50
0
72 oC
3’
5’
3’
5’
3’
5’
5’
5’
3’
5’
5’
5’
94 oC
T i m e
3’
3’
5’
Melting
3’
5’
5’
5’
5’
3’
5’
5’
3’
5’
3’
Number
12
0 1
Cycles
4
8
16
32
2
3
4
5
64
6
‫یک قطعه ی دقیق با‬
‫سایز مشخص دریک‬
‫ژل آکریل آمید رنگ‬
‫آمیزی شده با اتیدیوم‬
‫بروماید درتمامی‬
‫نمونه ها به جز نمونه‬
‫بالنک‬
‫فرایند تکثیر‬
‫موفق‬
‫فنل‬
‫وجود فرآورده در کنترل‬
‫بالنک‬
‫↓دما ↑منیزیم‬
‫استخراج‬
‫مجدد‬
‫کلروفرم‬
‫استات‬
‫امونیوم‬
‫حضور قطعات‬
‫غ اختصاصی یا‬
‫مقادیر کم فراورده‬
‫عدم حضور یک‬
‫قطعه در تمام‬
‫مسیر ها‬
‫↓منیزیم ↑دما‬
‫عدم موفقیت فرایند‬
‫تکثیر‬
‫محصول نهایی واکنش ‪:PCR‬‬‫قطعات دورشته ای ‪ DNA‬که ´ ‪ 5‬از شروع میشوند وطول این ‪ DNA‬بین دوپرایمر قرار‬
‫دارد‬
‫‪-‬آنزیم ‪ DNA‬پلیمراز‪:‬‬
‫‪DNA‬پلیمرازی که ازباکتریهای مقاوم به حرارت به نام ‪ Thermus aquaticus‬بدست می‬
‫آید‬
‫نکته ‪:‬‬
‫تمام واکنشها در یک لوله حاوی اسیدنوکلئیک هدف‪،‬پرایمر‪،‬بافر تریس ‪,dNTP,‬‬
‫‪,kcl,mgcl‬در دستگاهی به نام ترموسایکلرانجام میگیرد‪.‬این دستگا ه مراحل د ناتوره‬
‫‪ Annealing, Extension،‬رابه طور خودکار کنترل میکند‬
‫رعایت نکات الزم وضروری‪:‬‬
‫انتخاب پرایمر‬‫بافر‬‫حرارت ‪ Annealing‬راباال برده تا واکنش اختصاصی تر گردد‬‫زمان ‪ Extention‬را تا حد ممکن پایین آورده تا شانس ‪ Mis priming‬کاهش یابد‬‫‪-‬بخاطر اختصاصی بودن ‪ PCR‬الزم است که از آلودگی با ‪ DNA‬خارجی اجتناب شود‬
DNA Gel Electrophoresis
• Melted agarose is poured into
a form equipped with
removable comb
• Comb “teeth” form slots in
the solidified agarose
• DNA samples are placed in the
slots
• An electric current is run
through the gel at a neutral
pH
5-26
DNA Separation by Agarose Gel
Electrophoresis
• DNA is negatively charged due to
phosphates in its backbone and
moves to anode, the positive pole
– Small DNA pieces have little frictional
drag so move rapidly
– Large DNAs have more frictional drag
so their mobility is slower
– Result distributes DNA according to
size
• Largest near the top
• Smallest near the bottom
• DNA is stained with fluorescent dye
5-27
Electrophoresis of Large DNA
• Special techniques are required for DNA
fragments larger than about 1 kilobases
• Instead of constant current, alternate long
pulses of current in forward direction with
shorter pulses in either opposite or sideways
direction
• Technique is called pulsed-field gel
electrophoresis (PFGE)
5-28
Protein Gel Electrophoresis
• Separation of proteins is done using a gel
made of polyacrylamide (polyacrylamide gel
electrophoresis = PAGE)
– Treat proteins to denature subunits with
detergent such as SDS
• SDS coats polypeptides with negative charges so all
move to anode
• Masks natural charges of protein subunits so all move
relative to mass not charge
– As with DNA smaller proteins move faster toward
the anode
5-29
PCR Reaction Components
•
•
•
•
•
•
•
•
Water
Buffer
DNA template
Primers
Nucleotides
Mg++ ions
DNA Polymerase
Extras
PCR Reaction Components
• Water
• Purity
• Contamination
– Amplification Products
PCR Reaction Components
• Buffer
• Must match polymerase
• Typically contain KCl and Tris
• Can vary over a slight range:
– Not much difference in range
from 0.8 X to 2.0 X
– Primer efficiency reduced outside
this range
http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/p06.html
PCR Reaction Components
• DNA template
• Amount of DNA present
– Less DNA means more cycles
• Complexity of DNA
– Eg. plasmid vs. whole genome
• Purity
– Interfering factors, eg. enzymes, salts
• Degradation
– PCR more forgiving of degraded DNA
• Contamination
– Amplification products
• Presence of “poisons”
– Eg. EDTA which scavenges Mg++
PCR Reaction Components
• Primers
•
•
•
•
Age
Number of freeze-thaws
Contamination
Amount
–
–
–
–
Can vary over a wide range (50X)
100-500 nM typical
Too low: low amplification
Too high: low amplification
http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/p05.html
PCR Reaction Components
• Nucleotides
• 20-400 uM works well
– Too much: can lead to mispriming and
errors
– Too much: can scavenge Mg++
– Too low: faint products
• Age
• Number of freeze-thaws
– Just 3-5 cycles is enough to make PCRs not
work well
• Dilute in buffer (eg. 10mM Tris pH 8.0
to prevent acid hydrolysis)
• Contamination
http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/p13.html
PCR Reaction Components
• Mg++ ions
• Mg is an essential cofactor of
DNA polymerase
• Amount can vary
– 0.5 to 3.5 uM suggested
– Too low: Taq won’t work
– Too high: mispriming
http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/p14.html
PCR Reaction Components
• Bottom Line:
All components work over a wide range. –
Need to avoid contamination. –
Optimization by trial-and-error. –
PCR Reaction Components
• DNA Polymerase
• Thermostable?
– Activity declines with time at
95C
•
•
•
•
Matches buffer?
Age
Contamination
Concentration: Typically 0.5 to
1.0 U/rxn
http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/p12.html
PCR Reaction Components
• Extras
• Proprietary or added by user
• Glycerol, DMSO
– Stabilize Taq, decrease secondary structure
– May help or hurt, depending on primers
– Typically already in the Taq stock
• BSA
– Frequently helps, doesn’t hurt
• Betaine
– Useful for GC-rich templates
http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/p16.html
http://taxonomy.zoology.gla.ac.uk/~rcruicks/additives.htm
PCR Cycling Parameters
Denaturation Temp
Annealing Temp
Extension Temp
Time
Number of Cycles
Reaction Volume
“Odd” Protocols
•
•
•
•
•
•
•
PCR Cycling Parameters
Must balance DNA •
Denaturation Step •
denaturation with Taq damage
95C for 30 - 60s typically is •
enough to denature DNA
Taq loses activity at high •
temps:
Half-life at 95C: 40 min –
Half-life at 97.5C: 5 min –
http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/p08.html
PCR Cycling Parameters
• Annealing Step
• Most critical step
• Calculate based on Tm
– Often does not give expected results
• Trial-and-Error
– Almost always must be done anyway
– Too hot: no products
– Too cool: non-specific products
• Gradient thermocyclers very useful
• Typically only 20s needed for primers
to anneal
http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/p08.html
PCR Cycling Parameters
• Extension Step
• Temperature typically 72C
– Reaction will also work well at
65C or other temps
• Time (in minutes) roughly
equal to size of the largest
product in kb
– Polymerase runs at 60bp/s
under optimum conditions
• Final “long” extension step
unnecessary
http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/p08.html
http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/p10.html
PCR Cycling Parameters
• Number of Cycles
• Number of source molecules:
–
–
–
–
>100,000: 25-30
>10,000: 30-35
>1,000: 35-40
<50: 20-30 fb. nested PCR
• Do not run more than 40
– Virtually no gain
– Extremely high chance of nonspecific products
• Best optimized by trial-and-error
http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/p08.html
PCR Cycling Parameters
• Reaction Volume
• Doesn’t affect PCR results as
long as volume is within limits.
• Heated lid important.
• 5ul, 20ul, 100ul all work.
• Slightly higher yield with lower
volumes.
http://info.med.yale.edu/genetics/ward/tavi/p03.html
PCR Cycling Parameters
• “Odd” Protocols
• Hot-Start PCR
– Taq is added last
• Touchdown PCR
– Annealing temp is progressively
reduced
Experimental Design: Controls
No positive or negative controls…
What does this result mean??
U
U
U
Only a positive control…
How do we know the result isn’t due to
contamination?
+
-
+
Both positive and negative controls…
Results can be interpreted with
confidence.
Experimental Design: Replication
-
-
Our unknown is definitely positive...
…but how sure are we?
+
+
U
U
U
We ran the same sample three
times…. Is our unknown really
positive?
‫• )‪Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR‬‬
‫در این روش ‪ RNA‬توسط آنزیم )‪ (RT‬به ‪ CDNA‬تبدیل می شودوبه روش ‪ PCR‬معمولی به‬
‫تکثیر ‪ CDNA‬می پردازند‬
‫با این روش میزان ‪ RNA‬درمحیط نیز قابل اندازه گیری است‬
‫دو آنزیم بکار میرود ‪:‬‬
‫ ناپایدار گرمایی‬‫پلیمراز پایدار به گرما‬‫با توسعه این روشها ‪DNA‬پلیمراز پایدار به گرما از ترموس ترموفیلوس به دست آمده است‬
‫که بطور موثر در حاالت ‪ RT‬و‪ DNA‬پلیمراز عمل می کند‬
‫‪RT-PCR‬تک آنزیمی ویژه تر و کاراتر از‪ RT-PCR‬با آنزیمهای ناپایدار به گرما است‬
‫کاربرد‪:‬‬
‫ردیابی ‪ RNA‬ویروس هپاتیت ‪C‬‬‫‪-‬سنجش کمیت ‪HIV-1,HCV‬‬
‫• ‪Quantitative PCR‬‬
‫یک رابطه خطی ممکن است بین کمیت الگوی وارد شده و مقدار محصول امپلیفیکاسیون‬‫دادهشده وجود دارد‬
‫برهمین اساس روشهای برپایه برای تعیین کمیت هدفهای و درنمونه های کلینیکی توسعه‬‫داده شده است‬
‫‪-‬یکی از روشهای قابل اطمینان وقدرتمند در‪ PCR‬کمی ‪PCR ,‬رقابتی(‪(CPCR‬است‬
‫• اساس ‪:CPCR‬‬
‫امپلیفیکاسیون دو الگوی متفاوت با طول یکسان یا مساوی وبا توالی های اتصال پرایمر‬
‫یکسان‬
‫دراین روش ‪:‬‬
‫مقدار یکی از الگوها باید مشخص باشد‬‫پس از امپلیفیکاسیون هر دو الگو قابل شنا سایی باشند‬‫نکته‪:‬‬
‫رقیب هایی موثرتر عمل می کنند که در اندازه وترکیب باز با هدف مشابه باشند‬
‫)‪y=I(1+e‬‬
‫معادله بازده محصول‪:‬‬
‫معادله بازده محصول در برای هر دو الگو نوشته میشود‬
‫در حالیکه ‪ e,n‬برای هردو رقیب وهدف یکسان باشد نسبت نسبی محصول )رقیب ‪ /‬تست (‬
‫مستقیما بستگی به نسبت غلظت آغازین الگوی تست ورقیب دارد‬
‫کاربرد‪:‬‬
‫سیتومگالوویروس‬‫‪HIV-1‬‬‫‪HCV-‬‬
‫•‪: Nested PCR‬‬
‫دراین روش از دو جفت پرایمراستفاده میکنند محصول تکثیر اولیه توسط پرایمر اول‬
‫بعنوان ‪ DNA‬مدل جهت انجام ‪ PCR‬برای پرایمر جفت دوم استفاده میشود‬
‫امتیازاین روش‪:‬‬
‫حساسیت واختصاصی بودن‬
‫معایب‪:‬‬
‫بزرگترین عیب‪ Nested PCR‬میزان باالی آلودگی در هنگام انتقال محصوالت دوره اول به‬
‫لوله دوم برای دوره دوم امپلیفیکاسیون میباشد‬
‫• ‪:Multiplex PCR‬‬
‫دراین روش بیش از یک جفت پرایمر در یک مخلوط ‪ PCR‬مورد استفاده قرار می گیرد ‪:‬‬
‫یک جفت پرایمر کنترل‬‫‪-‬یک جفت پرایمر تست‬
‫نکته‪:‬‬
‫این واکنش باید دقت شود که پرایمرها دمای ‪ Annealing‬یکسانی داشته باشند و مکمل‬
‫یکدیگر نیز نباشند‬
‫معایب‪:‬‬
‫از‪ PCR‬با پرایمر تکی حساسیت کمتری دارد‬
‫مزیت‪:‬‬
‫چند نوع هدف رااز یک نمونه انفرادی دریک واکنش ردیابی می کند‬
‫• ‪: Real time PCR‬‬
‫با این روش امپلیفیکاسیون هدف و مراحل ردیابی آن به طور همزمان در تیوپ انجام می‬‫گردد‬
‫روش بسیار دقیق وقابل اطمینان در سنجش کمیت ‪PCR‬است‬‫در این روش از یک پراب فلورسنت الیگو نوکلئوتید استفاده می شود‬‫این پراب یک قسمت‪ reporter‬ویک قسمت ‪ quenchen Dye‬دارد‬‫اگرپراب دست نخورده بماند قسمت خاموش کننده رنگ مانع از بروز فلورسنت می شود‬‫درصورتی که پراب به هدف متصل شودآنزیم ‪ Taq‬پلیمراز با عمل اگزونوکلئازی قسمت‬‫خاموش کننده رنگ پراب را برش می دهد ورنگ فلورسنت ظاهر می شود‬
‫‪-‬میزان رنگ فلورسنت متناسب با میزان تکثیر است‬
‫روشهای ردیابی هدف‪:‬‬
‫رنگ های فلورسنت مثل ‪SYBR Green1‬‬
‫‪ -‬آنالیز منحنی ذوب‬
‫‪--‬‬
‫مزیت‪:‬‬
‫کاهش زمان الزم برای انجام سنجش های اسید نوکلئیک‬‫کاهش آلودگی آزمایشگاهی‬‫‪-‬تعیین کمیت هدف‬
‫• ‪ARMS-PCR‬‬
‫تکنیکی قدرتمند برای مشخص کردن جهش های نقطه ای است‬‫پراپمر جهش یافته ونرمال در دو لوله جداگانه قرار داده میشود‬‫اگرعمل پلیمریزاسیون در لوله حاوی پرایمر نرمال انجام شود نشان از نبود‬‫جهش های نقطه ای است‬
‫ اگرعمل پلیمریزاسیون درلوله حاوی پرایمر جهش یافته انجام شود نشان دهنده‬‫حضور جهش نقطه ای درباز مورد نظر است‬
‫• ‪ANCHORD-PCR‬‬
‫دراین روش قطعه اسید نوکلئیکی داریم که بخشی از توالی آن مشخص وباقی‬‫نامشخص است‬
‫در ابتدا به انتهای توالی نامشخص‪ ،‬یک توالی به نام ‪ Linker‬اضافه می شود‬‫سپس دو پرایمر طراحی می شود یکی برای توالی ‪ Linker‬ودیگری برای‬‫توالی مشخص اسید نوکلئیک و واکنش ‪ PCR‬صورت می گیرد‬
‫موارد كاربرد‪:‬‬
‫تشخیص اختالالت ژنتیکی‬
‫تشخیص سرطان‬
‫پزشکی قانونی‬
‫شناسایی عفونت‬
59
Relative Sensitivities of Major Techniques used to Detect
Leukemia or Lymphoma-Associated Translocation Fusion Genes
60