实验６ 果蝇遗传性状观察与饲养
advertisement
实验６ 果蝇遗传性状观察与饲养 一、原理 1、果蝇的分类：昆虫纲，双翅目，果蝇科，果蝇属。果蝇属 (Drosophila)有3000多种，我国已发现800多种，遗传学研究中 常用的是黑腹果蝇（D.melanogaster)。 2、果蝇的优点 形体小，生长迅速，繁殖率高，饲养方便，世代周期短 （12天可繁殖一代），突变性状多，染色体数目少，基因组小， 实验处理方便，容易重复实验，便于观察和分析。 3、意义 是遗传学、细胞生物学、分子生物学、发育生物学等研 究中的模式动物。 果蝇生活史 1）卵：成熟的雌蝇交 尾后2-3d将卵产在培养 基的表层(b)； 2）幼虫：果蝇的受精 卵经过一天的发育即 可孵化成幼虫(c)； 3）蛹：幼虫经4-5d的 发育开始化蛹(d)； 4）成虫：刚羽化出的 果蝇虫体较长，翅膀 也没有完全展开，体 表未完全几丁质化所 以成半透明乳白色(a)。 果蝇的生活周期长短与温度关系很密切，低温使生活周期 延长，生活力减低，高于30℃使果蝇不育甚至死亡。 果蝇的最佳培养温度是20~ 25℃， 25℃培养条件下果蝇从 受精卵到成虫约10d。成虫果蝇在25℃时约成活15d. 4、果蝇生 活史 5、一些常见的突变性状 果蝇成虫有雌雄之分，其主要区别如下： 雌果蝇 雄果蝇 1、 个体较大 1、个体较小 2、 腹部末端较尖 2、腹部末端钝园 3 、腹部背面有5条黑条纹 3、腹部背面有3条黑条纹 4、外生殖器较简单 4、外生殖器复杂 5、 腹部腹面有6个腹片 5、腹部背面有4个腹片 6、第一对足跗界节表面 6、第一对足跗界节表面 无黑色鬃毛流苏-性梳 有黑色鬃毛流苏-性梳 二、目的 认识不同类型的果蝇，鉴别其雌雄，了解其生活史及饲养条件， 学习培养基的配制。 三、材料 野生型（wild type) 黑腹果蝇品系 （Drosophila melanogaster) 突变型（mutant type） 四步骤 （一） 形态观察 1、将用做观察的果蝇倒入麻醉瓶中，往瓶中加入数滴乙醚，塞上 棉塞，至果蝇完全麻醉为止。 2、将麻醉后的果蝇倒在白瓷板上，然后置于解剖镜的低倍镜下观 察如下内容：眼色、腹部背面环纹、刚毛、体色、雄蝇的性梳。 二）、果蝇的饲养-培养基的配制 配方：A 玉米粉 8.25g, dH2O 38ml B 蔗糖 6.2g, C 丙酸0.5ml, 配法； 琼脂0.62g, dH2O 38 ml 酵母粉0.7g 1、往8.25g 玉米粉中加入38 ml DH2O 预湿， 2、往38 ml DH2O 中加入0.62g 琼脂，煮溶，再加入6.2g蔗 糖，溶解后加入预湿的玉米粉，煮沸。 3、数分钟后（如3-5min)后离开火源，稍冷却，先加入丙酸 0.5ml，再加入酵母粉0.7g，搅拌均匀。 4、将培养基倒入干净的（即水洗后再用酒精棉球檫试干净 的）指管瓶中，厚度约1cm。 5、用挤干的酒精棉球檫净指管瓶壁，再往培养基表面撒上 一层干玉米粉，塞上已灭菌的棉塞，备用。 注意： 在分装培养基前，培养瓶应经过灭菌处理。既可防止真菌感 染，也可以杀灭瓶中残留的幼虫或蛹，防止混杂。 五 作业 绘制雌雄果蝇腹部形态图及雄蝇性梳图形。 雌雄外形比较 性梳 眼睛颜色变异 白色white：眼睛的颜色有红变成白色。这也是摩 尔根科学研究的第一个变异，通过实验，他验证 了孟德尔遗传定律的正确性。 粉红色pink：眼睛颜色由红色变成粉红色 翅膀形态 退化的rudimentary：体形正常，但翅膀退化 截短的truncate：体形正常，但翅膀短小 微型的miniature：体形正常，但翅膀极为小型 其实我们都知道这只是果蝇变异的一小部分， 具之前的表格可知果蝇翅形的变异就有好几种~ 常见突变 基因符号 染色体 号 棒眼 B 1 复眼呈狭窄垂直棒形，小眼数少 褐眼 bw 2 眼呈褐色 卷曲翅 Cy 2 翅膀向上卷曲，纯合致死 小翅 m 1 翅膀小，长度不超过身体 白眼 w 1 复眼白色 黑檀体 e 3 身体呈乌木色，黑亮 黑体 b 2 体黑色，比黑檀体深 黄体 y 1 全身呈浅橙黄色 残翅 vg 2 翅明显退化，部分残留，不能飞 叉毛 f 1 毛和刚毛分叉且弯曲 猩红眼 st 3 复眼呈明亮猩红色 墨色眼 se 3 羽化时眼呈褐色并深化成墨色 突变性状 性状特征 野生型 突变型之黄体 突变型之白眼 突变型之朱红眼 突变型之墨黑眼 突变型之棒眼 突变型之小翅 突变型之卷翅 突变型之残翅 突变型之短翅 突变型之无横隔脉 突变型之短刚毛 突变型之叉毛 黑腹果蝇-作为遗传学研究对象历史 • 黑腹果蝇在20世纪前半叶成为动物学家和遗传学家汤 玛斯•亨特•摩尔根及其学派实验研究对象。它只有四对染 色体。一对性染色体,通常被记作第一对染色体或者是X-和 Y-染色体，和三对常染色体,後者被记作第二，三和四对染 色体。第四对染色体很小，所含的基因也很少。果蝇非常 合适用于研究，在一个瓶子里就可以培育大量的果蝇，繁 殖速度快。“用半瓶牛奶和一只开始腐烂的香蕉就够了， 14天就可以得到200只果蝇”马田•布克斯在他2002年出版 的书Drosophila里写道。科学家用果蝇进行了无数次杂交, 其中包括确定了基因里面的基因连锁群，它们位于同一基 因上面,科学家也因此发现了联会现象，并且对某些变异进 行了描述和研究,例如眼睛颜色有红变异为白色或者是微型 翅膀,这种果蝇丧失了飞行能力。赫尔曼•穆勒是第一位发 现伦琴射线对遗传物质具有的诱变作用。从此射线就被大 量使用，以诱发果蝇发生变异。 History Thomas Hunt Morgan (born Sept. 25, 1866, Lexington, Ky., U.S. — died Dec. 4, 1945, Pasadena, Calif.) U.S. zoologist and geneticist. He received his doctorate from Johns Hopkins University. As a professor at Columbia University (1904 – 28) and California Institute of Technology (1928 – 45), he conducted important research on heredity. Like many of his contemporaries, Morgan found Charles Darwin's theory of natural selection implausible because it could not be tested experimentally, and he objected to Mendelian and chromosome theories, arguing that no single chromosome could carry specific hereditary traits. His opinion changed as a result of his studies of Drosophila. He developed the hypothesis of sex-linked traits. He adopted the term gene and concluded that genes were possibly arranged in a linear fashion on chromosomes. He was awarded the Nobel Prize in 1933. 果蝇打开生命科学之门的金钥匙 突变更多的突变 就在摩尔根快绝望的时候，1910年5月，一只白眼果蝇出现在 了摩尔根实验室的培养瓶中。而且摩尔根慧眼识英才，先后将 两名本科生——斯图蒂文特和布里奇斯——招入他的实验室， 以及威尔逊的一位研究生缪勒，他们四人默契的组合，成为科 学史上的佳话。 然而这只即将名垂青史的白眼果蝇身体却万般虚弱，或许摩尔 根对此已经从卢茨的实验中有所了解。他将这只“白眼儿”单 独放在一只培养瓶中随身携带，晚上睡觉前置于床头。当时正 是摩尔根的第三个孩子问世之时，当他前往医院看望妻子时， 摩尔根夫人的第一句话就是“白眼儿还好吗？”。十天以后， 这只白眼果蝇在和一只正常的红眼雌蝇交配后死去，传下了 1240个后代。这些后代，后来繁衍成一个大的家系，正是它们 建立起了经典遗传学的宏伟大厦，将染色体、基因及生物基本 遗传模式的混乱认识清扫一空。 到1912年底，摩尔根和他的助手们，一共 发现了40种果蝇突变。为了快速鉴定每种 突变究竟属于哪一组，摩尔根将已研究清 楚的白眼突变定为第一组，斑点突变为第 二组，橄榄体色突变为第三组，因为这三 个突变彼此之间是标准的自由组合关系。 在实验室传代这三种突变果蝇，将新突变 分别与它们杂交，所得子一代进行姊妹交、 回交等育种手段，然后仔细统计分析后代 的性状，就可将其归组。当然，这件事从 理论上说起来简单，做起来就需要培养万 计的果蝇，难怪摩尔根能发现商店里比香 蕉更廉价的香蕉汁已经可以满足果蝇的需 要了。很多哥伦比亚大学的学生都参与进 来，将果蝇带回家数，以至于某个学生的 孩子，自豪的跟别人说，‘我爹的工作是 给哥伦比亚大学数苍蝇’。 Morgan‘s Legacy In 1915 Morgan, Bridges, Sturtevant, and Muller published The Mechanism of Mendelian Heredity, a highly influential textbook laying out the evidence for the chromosomal theory of heredity and illustrating their methods so others could apply them in further research. In 1928 Morgan moved to the California Institute of Technology to found the Division of Biology. Sturtevant and Bridges went with him. Five years later Morgan was awarded the Nobel Prize in physiology or medicine for his work in genetics. He shared the prize money with Sturtevant and Bridges. Besides his own discoveries, Morgan's intellectual legacy includes the historically important researchers who trained with him, including Theodosius Dobzhansky, who applied the new genetics to an understanding of evolution. Another of his students was George Beadle, who discovered that mutations affect the working of proteins, and proposed the "one gene-one enzyme" definition of the gene. 伴性遗传：第一次把一个特定的基因与一个特定的染色体 联系起来。 机遇：果蝇的野生型颜色都是红眼，发现一只雄蝇，复眼是白色 杂交实验： (P) white eye（♂）× red eye(♂, ♀) (F1) (F2) red eye(♀ ） ½ red eye:1/2 white eye (♂); red eye(♀) 3red eye:1white eye (♂, ♀) back cross experiment: (P) white eye（♂）× red eye(♁）(daughter) (F1) ¼ red eye （♂）, ¼ white eye (♀ ） ,1/4 red eye（♂）,1/4 white eye (♀ ）. Hypothesis: 1、控制白眼性状的基因位于X染色体上，是隐性的。因为Y染色体上没有这个基 因的显性等位基因，所以最初发现的那只雄蝇的基因型是XwY, 表现为白眼，跟 这只雄蝇交配的红眼果蝇是显性基因的纯合体，基因型是 X +X +。这里白眼基因 w是突变基因，红眼基因是野生型基因。 red eye ♀ white eye ♂ P X +X + × Xw Y F1 Xw Y X+Xw Red eye X+Y sperm ovum X+ ♀ Red eye ♂ 白眼雄蝇与纯种红眼雌蝇杂交，子代不论雌雄都是红眼 F1 Red eye ( ♀ ) X+Xw Red eye (♂) × X+Y X+ Y X+ X+ X+Y Sperm ovum X+ Red eye (♀ ) Red eye (♂) Xw X+ Xw XwY Red eye (♀ ) white eye (♂) 子一代红眼雌蝇与红眼雄蝇交配，子二代雌蝇全为红眼，而雄蝇 中，红眼和白眼各占一半。 摩尔根的回交实验 F1 Red eye ( ♀ ) X+Xw white eye (♂) × XwY Xw Y X+ Xw (♀) X+ Y (♂) Red eye Red eye Xw Xw (♀) XwY (♂) White eye white eye Sperm ovum X+ Xw 白眼雄蝇与子一代红眼雌蝇交配，下代雌蝇和雄蝇中，红眼与白 眼各占一半。 果蝇的传奇 今日世界上最为人所知的果蝇产自东南亚，在1830年它 被命名为Drosophila melanogaster，意即黑腹果蝇。或许改 名确实给果蝇带来了奇迹般的好运，这个体型微不足道的昆 虫，在约百年后，一跃成为人世间最知名的昆虫之一。但在 此之前它首先得去往新大陆才行，不过这件事难不倒它。持 续数百年的大航海时代，使得东南亚的香蕉得以在十九世纪 晚期被贩卖到新大陆，黑腹果蝇追随而去，旋即在新大陆繁 衍开来，生生不息，由此开创出一段生物学史中最令人瞩目 的传奇之一，人类文明也就此奠定经典遗传学的根基。现在， 就让我们追随着果蝇的翅膀，再次回到那段生命科学史上激 情肆溢、英豪辈出的纷争岁月，重温一次经典诞生的历程。 摩尔根的成长 1866年，摩尔根在美国南方的列克星敦出世，但他总喜欢说 自己在1865年获得生命。 摩尔根在十四岁时进入肯塔基州立学院预科学习博物学，于 1886年获得理学学士学位，是当年唯一一位获得该学位的毕业 生。不愿意经商的摩尔根选择了去霍普金斯大学攻读生物学硕士 学位。正是在那里——当时全美最适合学习生物学的地方——摩 尔根从一个单纯的描述生物现象的博物学家转变为一个实验生物 学家，并由此获得了他终生信奉的科学研究原则，“实验方法的 本质在于要求每一种见解（或假说）都必须通过实验的检验，然 后才得以承认其科学地位……研究者必须养成一种对一切假说 （特别是对自己提出的假说）的怀疑心理，而且一旦证明其谬误， 要勇于抛弃之。”这种信念使得摩尔根既敢于反对权威也勇于犯 错和改正自己的错误，这种勇气和理性是他同时代的科学家中非 常罕见的。实际上，摩尔根常常自嘲自己所做的实验可以分为三 类：愚蠢的实验和蠢得要命的实验以及比第二类还糟糕的实验。 “用进废退”的果 蝇 1908年，摩尔根让他的研究生佩恩——曾研究过无眼盲 鱼——用果蝇验证用进废退学说。佩恩在窗台上放香蕉诱捕 不幸的果蝇，在长达两年的时间里，将它们置于黑暗中繁殖。 试图通过在黑暗的环境中传代果蝇，以产生一种丧失视觉甚 至眼睛的果蝇。结果自然是让人失望，两年的时间太短，不 足以发生什么了不起的变化。 在验证用进废退失败后，他和佩恩一起再次使用果蝇，试 图通过某种人工方法诱使其突变。他们用射线照射它，不让它 睡觉整日整夜的摇动它，给它喝糖水、咸水、酸水或碱水，改 变光照强度时间等等，一切能想到能做到的“蠢事”似乎都做 了，然而果蝇们不为所动，伤透了摩尔根的心。当布林莫尔学 院的老同事哈里森来访时，他沮丧的心情也到达顶点。 事实上，摩尔根不是第一个使用果蝇来研究突变的人。最 初是哈佛大学的卡斯尔提出使用果蝇来进行研究，他的学生伍 德沃德使用它来做近交研究，他还将果蝇推荐给了卢茨。卢茨 利用果蝇发现了一种突变，当摩尔根对人工诱变产生兴趣时， 他推荐了他所研究的果蝇给摩尔根。于是摩尔根的实验室有了 两种家系的果蝇，一种来自佩恩诱捕的野外果蝇，另一种来自 卢茨，这给后来的果蝇传奇带来了一点小波折。 果蝇的传奇白眼 就在摩尔根快绝望的时候，1910年5月，一只白眼果蝇出 现在了摩尔根实验室的培养瓶中。而且摩尔根慧眼识英才， 先后将两名本科生——斯图蒂文特和布里奇斯——招入他的 实验室，以及威尔逊的一位研究生缪勒，他们四人默契的组 合，成为科学史上的佳话。有了得力助手，以及奠定经典遗 传学的宏伟大厦基石的白眼果蝇，摩尔根至此已经注定要以 遗传学家的身份名留后世，他坚持未放弃的胚胎学研究除了 科学史上会有所介绍外，将再无人关注。 合作分工的科学团队 摩尔根富有实验热情、创造性思维、渊博的知识、精湛的实验技术,但不擅 长数学,并对细节不总是感兴趣或者不可能解决其详细细节,他便挑选了那些与 他自己能力互补的、各有所长的人在果蝇实验室工作。斯特蒂文特擅长绘图, 绘制了染色体图谱以及通过对育种结果的分析而绘制的种质结构图。布里奇 斯在果蝇小组中主要关注的是细胞学工作,他对细节有极大的耐心,最擅长的是 实验技术操作。穆勒思想颇具创造性,擅长数学和定量工作,主要贡献在于交换、 干扰的分析,以及发展了用于跟踪染色体从父本传到子代的标记。 T. H. Morgan Nobel Prize 1933 Calvin B. Bridges Alfred H. Sturtevant Herman Joseph. Muller Nobel Prize 1946 但是，这只白眼果蝇的来源却颇为含糊。卢茨说，白眼果蝇 最先出现在他的实验室，他把这个虚弱的突变体的后代送给了 摩尔根，而摩尔根通过杂交实验，再次使这个性状出现，但摩 尔根对此表示否认。他说虽然他在卢茨的实验室看到过几只白 眼果蝇，但它们都已经死亡。他宁可认为这只白眼果蝇是天赐 之物，它的祖宗更可能是从窗外飞进来的，而不是来自卢茨所 赠送的果蝇。不过，纠缠在这种事情上没有实际意义。卢茨自 己也说，当初他根本没有认识到白眼果蝇的重大价值，不然他 也不会将它的后代慷慨相送。 然而这只即将名垂青史的白眼果蝇身体却万般虚弱，或许摩 尔根对此已经从卢茨的实验中有所了解。他将这只“白眼儿” 单独放在一只培养瓶中随身携带，晚上睡觉前置于床头。当时 正是摩尔根的第三个孩子问世之时，当他前往医院看望妻子时， 摩尔根夫人的第一句话就是“白眼儿还好吗？”。十天以后， 这只白眼果蝇在和一只正常的红眼雌蝇交配后死去，传下了 1240个后代。这些后代，后来繁衍成一个大的家系，正是它们 建立起了经典遗传学的宏伟大厦，将染色体、基因及生物基本 遗传模式的混乱认识清扫一空。 突变更多的突变 如果说这世上真有吉星高照这回事，那么在随后的几个月 里，摩尔根所在的实验室就是好运发生器，原本罕见的突变 现象开始频频发生，几乎每月都能发现一个新的突变，以至 于后来同时代的遗传学家们感叹果蝇是属于摩尔根。遗憾的 是，由于他当时并未仔细统计突变的频率，今日我们只能猜 测或许是最初摩尔根对果蝇百般折磨——尤其是放射线照 射——自己付出千般辛苦后，回报终于到来。 随白眼突变后，摩尔根的实验室又得到了粉红眼色和朱砂 眼色突变，其中硃砂眼色突变和白眼突变一样是限性遗传， 而粉红眼色和白眼这对性状则完全符合孟德尔自由分离定律。 摩尔根开始相信染色体学说很可能是正确的，基因位于染色 体上，至于孟德尔遗传学说摩尔根则已无怀疑。下一步就是 证明，性状的遗传是分组进行的，同组的也即位于同一条染 色体上是连锁遗传，而不同组的性状之间则遵从自由组合定 律。 不过在提出这个关键假说的时候，摩尔根正面对一个难题， 小翅突变。这也是一种伴性遗传突变，按连锁假说，小翅应该 和白眼同属一组。也就是说，那些同时携带白眼和小翅的杂合 体雌性果蝇的子代，应该同时出现或者不出现这两种突变性状， 但是有很少的一些后代是白眼正常翅或者正常眼小翅。看起来 发生了一定程度的自由组合，但和正常的自由组合相比，比例 明显不对。1911年下半年，摩尔根受到1909年詹森提出的同源 染色体的某些对应片断可能发生了交换的启发，提出了同在一 条染色体上的基因，可以发生互换，并且他还认为基因是线性 的排列在染色体上的，相距越远发生互换的可能性越高。这个 假说发表在《科学》杂志上，接下来的任务就是验证它或者推 翻它。而斯图蒂文特率先想到，可以利用交换发生的频率作染 色体上的基因图谱，也即基因之间的相对位置关系，他利用已 知的几个突变基因画了第一张果蝇的染色体基因连锁图谱。 到1912年底，摩尔根和他的助手们，一共发现了40种果蝇 突变。为了快速鉴定每种突变究竟属于哪一组，摩尔根将已研 究清楚的白眼突变定为第一组，斑点突变为第二组，橄榄体色 突变为第三组，因为这三个突变彼此之间是标准的自由组合关 系。在实验室传代这三种突变果蝇，将新突变分别与它们杂交， 所得子一代进行姊妹交、回交等育种手段，然后仔细统计分析 后代的性状，就可将其归组。当然，这件事从理论上说起来简 单，做起来就需要培养万计的果蝇，难怪摩尔根能发现商店里 比香蕉更廉价的香蕉汁已经可以满足果蝇的需要了。很多哥伦 比亚大学的学生都参与进来，将果蝇带回家数，以至于某个学 生的孩子，自豪的跟别人说，‘我爹的工作是给哥伦比亚大学 数苍蝇’。 1915年，摩尔根和他的三位助手合著了《孟德尔遗传机制》 一书。这本专著对果蝇研究作了全面总结，并且这是第一本尝 试仅使用染色体，来解释遗传学问题的书。要知道，人们当时 对染色体还所知不多。这本专著彻底奠定了摩尔根在遗传学研 究上的地位，他也由此被誉为20世纪的孟德尔。 其后，布里奇斯又发现了染色体不分离现象，因此子代果蝇 中的染色体数将多于或少于普通果蝇，对这些果蝇进行的遗传 学分析，进一步体现出染色体遗传学说的威力，这使得少数怀 疑染色体遗传学说的学者也开始承认摩尔根是正确的。 此后，摩尔根学派在此基础上，为解释各种果蝇中出现的 遗传现象，推论出染色体上某些片断会出现缺失、重复和倒位 等现象。 1933年，在诺贝尔诞辰一百周年之际，摩尔根获得诺贝尔 生理或医学奖。在此之前他已经两次被提名，但该奖项此前 一直只发给医生或医学院教授。但是，摩尔根却委婉的拒绝 出席诺贝尔诞辰那天在斯德哥尔摩举行的盛大宴会，说愿意 在次年夏天去瑞典，理由是工作正忙无法分身，比如筹建生 理学研究中心等事宜。 不过，另一个理由可能更加真实，1933年初，海茨和鲍尔 重新发现了果蝇唾液腺中所存在的巨型染色体。此前，摩尔 根学派所做一切有关染色体的推论，现在将面临真正的考验， 那些巨型染色体上经染色所呈现的无数条纹，将使得一切都 可以通过显微镜直接观察。摩尔根的假说也因此面对严峻的 考验，不知是我们的幸运还是摩尔根的幸运，研究最终证明 染色体遗传学说是正确的，而连锁图也基本准确。 永恒的果蝇 摩尔根的故事到此已经结束，但果蝇 还在飞翔。生物学上最深奥的胚胎发育进 程以及神经系统的运作，我们都已从果蝇 身上得到诸多启示。 1983年，格林（Gehring）实验室在 研究果蝇胚胎发育时，意外发现了控制体 节发育的同源异形基因，都拥有一套高度 相似的DNA片断，他们将之称为同源盒。 随后的研究发现，这个DNA片断，在自然 界各种生物——包括人——中广泛存在， 序列高度保守，功能相似。这个发现，激 起了许多惊奇，我们和果蝇的祖先彼此间 在数亿年前就已经分道扬镳，但是在胚胎 发育的基础结构上，我们和它们都仍然使 用的是共同祖先传承的方案。
