AML中的微小残留白血病
Steven M. Kornblau, M.D.
Department of Leukemia
Department of Stem Cell Transplantation and
Cellular Therapy
现状
• 多数患者获得缓解
– 80% < 60岁, 无既往血液病
– 50% >60 岁或有既往血液病
• 多数复发
– 治愈率 20-25% ， 2/3rd 复发
• 我们能早期检测残留疾病吗?
• 如是, 这些信息有助于我们处理患者吗?
微小残留白血病
诊断时
诱导后 14 天
后期某个时间
Leukemia
Chemo-R
Leukemia
Chemo
Resistant?
Leukemia
Chemo-S
Normal
Is MRD
present?
CR
Leukemia
Relapse
Leukemia Chemo-R
Can we Detect it?
Chemo
Sensitive
Normal
Can we use this
information
Normal
Cure
Normal
MRD 目标
• 某个时间点残留疾病的测定
– 何时?
– 哪种标志?
• MRD 检测提供的特征可以增加预后信息
– 诊断时不能忽视
• 预测复发vs. CCR 的阈值可被定义
– 什么水平是可以被警告的?
• 治疗反应的依据
– 检测到 MRD  更多或不同的治疗
– 检测不到  需要较少的治疗, 较少的毒性.
• 作为一种有效性的替代指标?
AML 中MRD 的障碍
• 定义追踪的标志不总是存在
– 细胞遗传学
– 突变
– 流式
Co-occurrence is frequent creates added complexity
When multiple events are present which do you follow?
Are effects: Additive, cancel each other out, synergistic?
• 没有标准化的方法
• 标准化的阈值没有界定
– 测量到的连续变量, 对分的期待终点.
• 一种可以改善结果的治疗尚不存在.
• 一个时间
何时监测 MRD?
– 何时?
• 诱导后立即
• CR1时, 3 个月时? ….
• 连续地
– 何时开始?
– 频率?
针对 MRD如何反应(变换)?
– 约 2 周重复
• 相同或升高  认为分子学复发 处理?
• 下降或持平, 2 周后重复
Hokland Blood 2011; 117:2577-84
MRD 检测的方法
• 多参数流式
– 检测限度 1:10-4
– 更快
• RT-PCR
•
分析的局限性, 靶基因等.
–
–
•
•
Hokland Blood 2011; 117:2577-84
细胞系的实验 “spiked” 1:10-3 to 10-7
操作患者标本 1:10-4 to 10-5
耗时
好标致 PML-RARα, NPM1, MLL, CEPBA, WT1 EVI1(Mecom) PRAME
• 正常骨髓所有的突变在某些水平可提供阳性信号
•
•
再生骨髓与 “正常l” 骨髓不同
文献常错误地将 “检测的限度” 或 “最低可能阈值”冠以 “敏感性”
多少次是检测的时间? 有关系吗?
– AML N=79, 中位年龄 42.5 (20-67)
– RQ-PCR 的频率
• 中位n 74 每例患者标本,范围 10-237
• 但未设立计划 6-60 个月.
– 标准方案治疗, 如果 MRD+ 可做 SCT
• CR: 23 / 24, 分子学 CR (PCR-) ：11/24
• 17例33 次复发
–
–
–
–
–
PB 和 BM- 强相关性 (R= 0.8)
全BM 合 CD34+ 和 CD34- 强相关性 (R=.9)
中位时间为 25.5 天, 范围 8 to 79 天
中位 MRD+ PFS  治疗是 119天
抢先治疗延迟但没能防止复发.
Fusion
N
MRD+
Time to
Relapse-days
Outcome
TX at MRD
TX at Rel
RUNX1
12
8
26 35 60 77 79
6 Alive 1 D
1A 1D
CBFB/MYH11
6
3
19 25
1A 1D
1A
MLL
6
6
8 19 21 24 61
3A 1D
2D
• Doubek (ExpHem2009;37:659-672)
CR1 早期干预有益吗 ?
• 化疗. 延迟但不能防止复发
– Platzbecker Leukemia 2012;26:381-89
• 很多试验在进行中
– Pedi- Clofarabine + ara-C for MRD >0.1%
– Adults
» Ceplene + low dose IL2
» Anti CD33-gemtuzumab
» Dendritic cell vaccination
» Azacitidine or Decitabine
• Allo SCT- 有争议的好处
– 成人
• Walter JCO 2011; 29:1190-97
– 儿童
• Rubnitz. Lancet Oncology 2010;11:534-552
• WT1 Jacobson Br J Haem 2009:146:2709-16
• Leung Blood 2012; 120:468-72
采用突变的问题
•
•
•
•
突变部位变化, 插入部位, 长度
诊断或复发时是多克隆
小克隆扩增
诊断和复发时突变状态可改变
– 突变飘移 如. FLT3-ITD
– 丢失或获得突变
• 不稳定性影响了这些标志作为监测 MRD的应用
• 应用 下一代测序追踪随着时间延长发生的克隆演变
可能有用但昂贵.
复发的动力学影响监测的频率和标
本来源
较慢的
较快的
NPM1
NPM1-WT & FLT3-ITD
NPM1-mut & FLT3-ITD
PML-RARα
WT1
CBFB-MYH11
监测标本:
外周血
RUNX1
骨髓
APL的MRD
• PML/RARα 以定量 RT-PCR 是标准方法
– 所有还是高危患者?
• 诱导后
– ATRA & 蒽环类 –无用，因为残留的凋亡和分化细胞
– ATO – 任何阳性都是坏的
• 巩固后明确是坏的
– 转为阳性预示复发. 假阳性少见
– PCR 每月升高1 log 预示复发.
• 如果转为阳性后治疗而非等待复发结果更好
– ATRA + 化疗的时代: PETHEMA Leukemia 2007, 21:446-52
– 砷剂时代: Grimwade , JCO 2009, 27:3650-8 & Leuk Res 2011;35:3-7
– 如果MRD阳性时不做移植将影响自体移植质量 (GIMEMA)
– 持续阳性可用异体移植挽救.
• 连续监测.
– 跟随欧洲癌症项目 (Leukemia 2003, 14:2318-57)
•
– 骨髓较外周血更敏感. 1.5 Log.
– 巩固后，Q 3 个月共 36 个月
经济益处 $4-11K/QALY
APL
单用
ATO
治疗
151 例单用砷剂治疗.
2 步巢式 Q-PCR, 以BIOMED-1 方法, 定性研究欧洲癌症项目
Sensitivity 10-3 after 1st round, 10-4 after 2nd round
Ct = PML-RARα/ABL * 100 Negative if beyond 40
20.5% relapsed, median 15 mo
%+
100
RR
Sensitivity
Specificity
63% 18%
4.8
NS
86.7%
42.3%
0%
Good
Risk
WBC<5,
PLT >20
High Risk
WBC >5,
or PLT <20
% + after induction
69%
62%
Relapse in Neg
0%
10%
Relapse in Pos
22%
32%
Lead time provided by
detection of conversion
31 relapses
15 > 4 months
10 never pos
6 not done
False Positive conversion
4.6% (8/151)
Chendamarai Blood v119:3143 2012
•
•
•
•
CBFβ AML
inversion 16 假阳性很少见
qRT-PCR –标准化的欧洲癌症项目比值 w.r.t. β2M
53例 伴 inversion 16, 年龄 16-60
13 个标本/患者, blood vs. BM,
– Diagnosis, Induction cycle #1 and #2,
– Consolidation #1,2,3,
– Follow up 3 6 9 12 15 18 24 36 72 mo
•
•
•
•
骨髓更敏感
治疗前与骨髓原始细胞%相关, 与其他临床特征无关
巩固后下降的动力学与结果无关
巩固后 59% 阴性, 2年 RFS 阴性者 70% vs. 阳性者54%
– 14 例阳性, 10 r复发- 从未获得阴性 (Median 1190)
– 35 例阴性, 3复发, 2 转为 >10 copies
•
追踪- 29 阴性在某些治疗点, 10 转化, 6 例复发. 3例时间点为 3, 5 , 6个月,
但3例在复发时.
Corbaciaglu JCO 28:3724-3729 2010
Wilms Tumor 1
• 90% AML过表达, 突变 ~ 10%
– Phase I- tested 9 RQ-PCR protocols in 11 labs, cut 3
– Phase II tested 6 in 11 labs, selected best 3
– Phase III tested 3 protocols on several standards, picked the best
• 正常人作为参比-常用表达
– 118 PB, 61 BM , 25 G-CSF stim PB
• 检测
– Diagnosis 238 PB, 382 BM, 15 with WT1 mutation
– After Anthra+ ara-C therapy N=129, 16 repetitively
• 结果
– Blood = BM at Dx and MRD
– Mutant = wild type
– High levels in Inv16, FLT3itd, NPM1
诱导后下降有意义, >2 log
巩固后水平也有意义
Cilloni JCO 2009;27:5195-5201
NPM1
• 潜在的巨大靶点，约 30%有突变
• 以 PCR 检测，有17 种不同的突变.
– Type A= 80%, B ,D = 6% each
– Limit of detection 1:10,000 to 1:100,000
• 追踪252 NPM1 突变的 AML，84 例复发
–
–
–
–
–
–
47 MRD+ 15-221 days (median 62) before relapse
15 never MRD- Failure to get 3 log reduction = relapse
31 MRD not + before relapse
All relapses had the same NPM1 mutation
Sensitivity = 62/93 =66%,
Specificity? Not stated.
• 许多时间点有意义
• Allo SCT 后有预示意义
Schnittger Blood 2009;114:2220-31
ALLO SCT 后的MRD
• MRD 升高预示复发
– 如果存在可以分子学标志
– 嵌合体:
• 受-供者比例, 特别是在 CD34+细胞
– Verneris Curr Het Malig Rep 2010;5:157-162
• 快速的复发动力学导致 MRD 应用困难
• 根据的MRD反应干预显示延迟但不能阻止复发
– Azacitadine.
Platzbecker Leukemia 2012;26:381-89
多参数流式细胞仪
• 仅 50% 的患者有 PCR 适合的标志予以追踪
• 80-94% 有流式组合
– Leukemia Associated ImmunoPhenotype, 诊断时定义
– 诊断时定义“与正常不同”
• 给予定量结果
– 何时评估?
– 应用何种阈值?
• 范围 0.035 to 1%
• 常用 0.1%.
• 应用 0.01% 无预测价值 (Leung Blood 2012;120:468-472)
– 分析多少细胞?
• 如 20 个细胞为一簇可定义为 MRD
– 200,000 events 1:10:000 = 20 cells
• 推荐 1 million因非所有的原始细胞都表达这个组合.
• 几乎所有的研究应用的水平源于回顾性的并缺乏 确认的群体.
• See Ossenkoppele Br J Haem 2011;153:421-436 for review of literature
白血病相关没有表型 Vs. “与正常不同” 方法
• 必须在诊断时检测 LAIP 并追踪
• 可以多于一种 LAIP
• Must follow all of them to pick out minor clones that expand.
• 与正常不同 – 应用一个组合并寻找特征性组合.
– 不同步表达非常有用.如CD34+ 和 CD123+
– 系列不忠有用. 如. CD7 (淋系) 在 AML 原始细胞的表达
– 异常表达相关伴有细胞遗传学异常
•
•
•
•
•
AML1-ETO : CD19+, CD11a- CD56+/- cCD79a = poor prognosis
CBFβ –MYH11: CD2+
T(15:17) : CD56 in 20%= bad
NPM1: CD13, CD117 CD110 CD123
CEBPA: 7+
• S&S 最好用 6种以上颜色流式, LSC 抗体 & 多重髓系抗原
• 白血病干细胞频率
– CD34+ CD38- CD123 CLL-1 CD44 CD47 CD96 & 相同的异常标志.
– 低频不利
多参数流式细胞仪潜在的问题
• 背景 = 正常细胞表达的
– 限制了敏感性和特异性,
– 可提高检测的限度 0.1% to 1%
– 背景在 PB比. BM 低
• 非所有细胞表达异常标志
– 降低敏感性
• 免疫表型漂移可高达 91%
– 多数病例有多种 LAIPs 降低了假阴性率.
– 但寻找诊断时的组合将丢失新出现的组合
• 流式需要专业人员操作
– 标准化的流程和自动分析将有助
•
Schuurheis Expert Rev Hem 2010;3:1-5)
MPFC 在 AML的预后价值研究汇总
Ossenkoppele Gr J Haem 2011:153;421-436
作为MRD 通过流式监测 LSC
• CD34+CD38- &
– Positive for CD123 CD117 CD25
– Negative for HLA-DR
•
•
•
•
•
诊断时的频率预测复发
治疗后持续阳性预示复发
BM 优于 blood罕见
降低敏感性罕见
标志变化存在
– C-type lectin like (CLL-1), 不见于正常
MRD 在 儿童AML- AML02 研究
•
•
•
•
Induction 1 with high vs. low dose ara-C + Dauno and etoposide
MRD#1 on day 22, if >1% positive then immediately to induction 2, otherwise wait
for recovery of counts then to induction 2
Induction 2 ADE +/- Gemtuzumab-ozogamicin
MRD#2 by Flow measurement after 2nd indution
– Low  HDAC x 3. Good cyto more often negative
– High  Allo (n =59). Bad cyto more often positive
•
•
216 AML enrolled 202 evaluable for MRD #1, 193 for MRD#2
Use of high dose ara-C no effect. Use of GO increased conversion to MRD-
MRD#1
#
% Relapse
3yr EFS
Positive (>1)
50
49%
43%
Positive (>0.1)
24
17%
Negative
128 17%
74
MRD#2
#
% Relapse
3yr EFS
Positive (>1)
17
65%
36%
Positive (>0.1)
21
49
Negative
155 17%
71%
MRD most powerful in multivariate
CBF, 11q23 and FLT3 stay in the
model
Triage to ALLO didn’t seem to help
the high risk group
通过流式加细胞遗传学监测MRD
Survival
• Favorable &
Intermediate
cytogenetics
• But not to
unfavorable or
FLT3-ITD
• FLT3 WT
– MRD+ adds
% in Remission
MRD -
MRD +
MRD -
• FLT3-ITD
– Doesn’t add
MRD +
Buccisano Blood 2012;119(2);332-341
在成人AML 以流式监测MRD
• 233 consecutive Adults
>1%
– Median age 42+ 18
– Cytogenetics
>0.1%
• Fav n=49 (Includes 43 APL) Int = 35 Unfav =10 Unk=32
>0.01%
• 3 color + FSC, SSC at diagnosis and remission.
– 15K event followed by live gate on larger # of cells
– Looked for SAME phenotype as at diagnosis
 175 aberrant IP
126 CR with 3+7 x 2 + HDAC+ anthra x 2
16 to Auto SCT 12 to Allo
# MRD
N
3 yr
relapse
Median
Survival
Low Risk
<0.1%
45 14%
Not reached
Intermediate Risk
>0.1%
64 45%
79 mo
High Risk
>1%
17 85%
20 mo
<0.01%
>0.01%
>0.1%
>1%
San Miguel Blood 2001;98;1746-51
MRD- 需要什么
• 标准化分析和界值
• 前瞻性研究以评估
– 多中心
– 多中心实验室
• 临床研究证实MRD指导下的治疗改善结果
• 预后良好组结果好 , PML-RARα, CBFB-MYH11,
NPM1
• 预后不良 AML需要标志
• 有效的新治疗