Copyright © Marijke Jansen,
www.marijkejansenphotoart.nl
Summary
235
annex
Summary
This thesis addresses the concept of viral neuroinvasion, or viral infections of the central nervous system (CNS), in terms of its causes, mechanisms and potential consequences
from a clinical as well as an experimental perspective.
Chapter 1 provides an outline of the thematic backgrounds, scope and contents of the
thesis. It discusses associations between viral infections and CNS diseases, including clues
for potential involvement of viruses in the pathogenesis of the chronic neurological disorders Alzheimer’s disease, Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), Multiple Sclerosis (MS), and
Parkinson’s disease. Also, it outlines mechanistic aspects of viral neuroinvasion including
routes of viral entry into the CNS.
Chapter 2 discusses the involvement of paramyxoviruses of the morbillivirus genus in
the pathogenesis of demyelinating disease and potential associations with MS. Studies in
wildlife have shown that, apart from measles virus (MV) and canine distemper virus (CDV)
which can cause demyelinating diseases of the CNS in humans and dogs, respectively,
morbilliviruses can cause similar disease in aquatic mammals. This may provide clues concerning virus-host interactions that lead towards CNS disease at the level of related (mammalian) host species.
Chapter 3 discusses neuroinvasive flavivirus infections, with a focus on CNS complications reported for major emerging flaviviruses, in terms of their epidemiology, sympto­
matology, neuropathology and neuropathogenesis. Flaviviruses have been linked to viral
parkinsonism, in the case of Japanese encephalitis virus (JEV), and infection of ventral
horn motor neurons, as occurs in ALS, in the case of West Nile virus (WNV). In addition,
it has become clear that, beside traditional “encephalitic” viruses such as JEV and WNV,
dengue virus (DENV) has also been associated with CNS complications and neuroinvasion.
This may provide clues concerning virus-host interactions that lead towards CNS disease at
the level of related viruses.
Chapter 4 discusses CNS complications of several highly prevalent respiratory viruses,
including influenza, by means of assessing currently reported associations and discussing
potential common themes with respect to the symptomatology, neuropathogenesis and
neuropathology of CNS complications documented in the context of these infections. It
has been shown that several of these viruses are associated with CNS disorders and are
(occasionally) found in the CNS of both “healthy” as well as “affected” individuals. This
may provide clues concerning virus-host interactions that lead towards CNS disease within
an infected host species.
Chapter 5 studies the permissiveness of a panel of human neuronal and ocular cells
to influenza A/H1N1pdm virus infection. It also documents sialic-acid expression patterns
of these cells. The study addresses possible mechanisms of viral neuroinvasion, including
236
Summary
axonal, potentially olfactory-mediated, transport, neurovirulence and influenza-associated extrarespiratory complications on a cellular level. Studied cells, including human
neuroblastoma, glioblastoma and uveal melanoma cells were shown to be permissive to
influenza A/H1N1pdm infection. Several cells were, furthermore, demonstrated to express
α2,3- and/or α2,6-linked sialic acids which have been demonstrated to act as receptors for
avian and human influenza viruses, as well as other viruses, including adenoviruses and JC
virus (JCV).
As CNS and ocular complications of viral infections have been described, these results
may be clinically relevant. The permissiveness and sialic-acid expression patterns of
human uveal melanoma cells may be relevant as uveal complications and uveitis have
been described for several viruses, including influenza, and these cells can resemble olfactory receptor neurons (ORNs). Furthermore, it may be of interest that several neuroinflammatory/neurodegenerative diseases start with dysfuntioning of olfactory and optic
sensory systems, in the case of Parkinson’s disease and MS, respectively, sometimes years
prior to the development of other symptoms. Although studied cells are cell lines, they are
of human origin and it will be interesting to see to which extent these in vitro findings correlate to the human in vivo setting.
Chapter 6 describes the infection of human nasal mucosa tissue explants with influenza A/H1N1pdm virus and experimentally assesses the interactions of this virus with
human upper respiratory tract target tissue samples, with a specific focus on the potential
infection of ORNs, on a tissue level. Explants were cultured in transwell inserts for various
periods of time, and appeared to remain viable, as indicated by H/E staining results, for
total culture periods of up to 96 hr. Furthermore, viral nucleoprotein (NP) staining positivity
indicative of infection, apparently located to epithelial linings, was seen following infection
with influenza virus. Although positivity for the ORN marker olfactory marker protein (OMP)
was also observed, no definitive co-staining for NP and OMP was seen in currently performed experiments. In analogy to the study described in Chapter 5, it will be interesting to
see to which extent experimental results correlate to the human in vivo setting.
Chapter 7 presents a clinical case study describing the occurrence of an inflammatory pseudotumor of the CNS associated with human immunodeficiency virus (HIV), JCV
and the immune reconstitution syndrome. The inflammatory pseudotumor appeared to
have developed against the background of a highly active antiretroviral treatment (HAART)
regimen in an HIV-positive individual. States of immunosuppression, including the use
of immune suppressants but potentially also infections, can be associated with reactivation of latent pathogens. In this case JCV, following HAART, may have been (re)targeted
by the immune system in the context of an immune reconstitution syndrome. The above
described topics can be of clinical relevance, as several individuals are treated with antimicrobial and anti-inflammatory drugs that might have an effect on their CNS “virome”
which potentially harbours latent or opportunistic pathogens.
237
annex
Chapter 8 describes the occurrence of intravascular lymphomatosis (IVL) of the brain
in an individual diagnosed with myelodysplatic syndrome (MDS). Both disorders have
been associated with (herpes)viral infections and there might be pathogenic relations on
the hematopoietic cell level. It has been described that viruses can enter the CNS within
immune cells, the so-called “Trojan-horse” mechanism. Beside axonal transport, this may
be another specific mechanism suited for viral entry into CNS. Treatment of intravascular
lymphomatous cells within the brain, as has been described, can in that respect be of clini­
­cal relevance.
Chapter 9 provides a general discussion of the themes discussed within the thesis. It
discusses the mechanisms by which viruses can enter the CNS as well as (potential) viral
involvement in the pathogenesis of CNS diseases, including chronic neurological disorders.
As also outlined in Chapter 1, here, axonal, potentially olfactory, transport as well as hematogenous “Trojan-horse” entry within infected blood cells may provide means by which
viruses can enter the CNS whilst relatively “bypassing” peripheral immune responses. Furthermore, within the CNS, both (latently present) viruses as well as (non-cytolytic) immune
responses may be directed towards avoiding neural cell death and viruses may, in general,
affect neural cells in non-acute manners, warranting further study of potential relationships between viral infections and chronic neurological diseases.
Also, potential avenues for future research are discussed. Detection and imaging techniques play crucial roles in the establishment of (real-time) links between CNS diseases
and viral infections. Preventive and treatment options for viral CNS infections may both be
CNS- as well as virus-specific. These specificities may be reached through axonal delivery
and effective crossing of the blood-brain barrier (BBB) of virus-directed treatment modalities, or via their effectiveness before viral neuroinvasion takes place. Developments in the
fields of viral and human metagenomics provide clues as to whom to treat when, as not all
viruses may always be disease-causing in all individuals. These developments, thus, may
be highly important in personalized treatment.
238
summary
239
240
samenvatting
241
annex
Samenvatting
Dit proefschrift bespreekt de oorzaken, mechanismen en mogelijke gevolgen van virale
neuroinvasie, of virale infecties van het centrale zenuwstelsel (CZS), vanuit zowel klinisch
als experimenteel perspectief.
Hoofdstuk 1 geeft een overzicht van de achtergrondthematiek, opzet en inhoud van
het proefschrift. Het beschrijft associaties tussen virale infecties en CZS ziekten, inclusief
aanwijzingen voor mogelijke betrokkenheid van virussen bij de pathogenese van chronische neurologische aandoeningen, zoals de ziekte van Alzheimer, Amyotrofische Laterale
Sclerose (ALS), Multiple Sclerose (MS), en de ziekte van Parkinson. Tevens beschrijft het
mechanistische aspecten van virale neuroinvasie en routes van virale verspreiding naar het
CZS.
Hoofdstuk 2 bediscussieert de betrokkenheid van paramyxovirussen van het genus
morbillivirus bij de pathogenese van demyeliniserende ziekten en mogelijke associaties
met MS. Diverse studies hebben aangetoond dat, naast het mazelen virus (MV) en het
canine distemper virus (CDV), die demyeliniserende ziekten van het CZS bij respectievelijk
mensen en honden kunnen veroorzaken, morbillivirussen dergelijke pathologie ook bij
zeezoogdieren kunnen veroorzaken. Dit kan aanwijzingen geven betreffende virus-gast­
heer interacties die tot CZS pathologie leiden op het niveau van gerelateerde (zoogdier)
gastheersoorten.
Hoofdstuk 3 bediscussieert neuroinvasieve flavivirusinfecties, met een focus op CZS
complicaties die gerapporteerd zijn voor sterk in opkomst zijnde flavivirussen, in termen
van hun epidemiologie, symptomatologie, neuropathologie en neuropathogenese. Flavivirussen zijn geassocieerd met viraal parkinsonisme, in het geval van het Japanse encefalitis virus (JEV), en infectie van voorhoorn motorneuronen zoals gebeurt bij ALS, in het
geval van het West-Nijlvirus (WNV). Daarnaast is duidelijk geworden dat, naast traditionele
“encefalitische” virussen zoals JEV en WNV, het Dengue virus (DENV) ook geassocieerd is
met CZS complicaties en neuroinvasie. Dit kan aanwijzingen geven betreffende virus-gast­
heer interacties die tot CZS pathologie leiden op het niveau van gerelateerde virussen.
Hoofdstuk 4 bediscussieert CZS complicaties van diverse veelvoorkomende, via de
luchtwegen overgedragen, virussen, waaronder influenza. Het hoofdstuk onderzoekt tot
dusverre gerapporteerde associaties en bespreekt mogelijke overkoepelende thema’s met
betrekking tot de symptomatologie, neuropathogenese en neuropathologie van CZS complicaties die zijn gerapporteerd in de context van deze infecties. Het is aangetoond dat verscheidene van de besproken virussen geassocieerd zijn met CZS ziekten en (soms) aange­
troffen worden in het CZS van zowel “gezonde”, of asymptomatische, als zieke individuën.
Dit kan aanwijzingen geven betreffende virus-gastheer interacties die tot CZS pathologie
kunnen leiden binnen een geïnfecteerde gastheersoort.
242
samenvatting
Hoofdstuk 5 bestudeert de vatbaarheid van een panel humane neuronale en oculaire
cellen voor infectie met het influenza A/H1N1pdm virus. Ook beschrijft het siaalzuur-expressiepatronen van deze cellen. De studie heeft betrekking op mogelijke mechanismen
van virale neuroinvasie, inclusief axonaal, mogelijk olfactoir-gemedieerd, transport,
neurovirulentie en influenza-geassocieerde extrarespiratoire complicaties op celniveau.
Bestudeerde cellen, waaronder humane neuroblastoom-, glioblastoom- en uveale melanoomcellen bleken vatbaar te zijn voor infectie met influenza A/H1N1pdm virus. Van verscheidene cellen werd verder aangetoond dat ze α2,3- en/of α2,6-gekoppelde siaalzuren
tot expressie brengen waarvan gebleken is dat ze als receptoren voor aviaire en humane
influenza virussen, en ook andere virussen zoals adenovirussen en JC virus (JCV), kunnen
fungeren.
Aangezien CZS en oculaire complicaties van virale infecties zijn beschreven kunnen
deze resultaten klinisch relevant zijn. De vatbaarheid en siaalzuur-expressiepatronen van
humane uveale melanoomcellen kunnen relevant zijn aangezien uveale complicaties en
uveïtis voor verscheidene virussen, inclusief influenza, zijn beschreven en deze cellen
kunnen lijken op olfactoire receptorneuronen (ORNs). Verder is het interessant dat verschei­
dene neuroinflammatoire/neurodegeneratieve ziekten beginnen met dysfunctioneren
van olfactoire, in het geval van de ziekte van Parkinson, en optische, in het geval van MS,
sensorische systemen, soms jaren voor de ontwikkeling van andere symptomen. Hoewel
bestu­deerde cellen cellijnen zijn, zijn ze van humane oorsprong en het is interessant om
na te gaan in hoeverre deze in vitro bevindingen correleren met de humane in vivo situatie.
Hoofdstuk 6 beschrijft infectie van humane neusslijmvliesexplantaten met influenza
A/H1N1pdm virus en bestudeert de interacties van dit virus met humane bovenste-lucht­
­weg “target” weefselsamples, met een specifieke focus op de mogelijke infectie van ORNs,
op weefselniveau. Explantaten werden gedurende diverse periodes in “transwell inserts”
gekweekt en bleken intact te blijven, op basis van H/E kleuringsresultaten, gedurende
maximale kweekperiodes van 96 uur. Verder werd, na infectie met influenza virus, virale
nucleoproteïne (NP) kleuring, indicatief voor infectie, waargenomen, ogenschijnlijk
gelokaliseerd op het niveau van de epitheliale omlijning. Hoewel positiviteit voor de ORN
marker “olfactory marker protein” (OMP) ook werd waargenomen, werd in tot dusverre
verrichte experimenten geen definitieve co-kleuring met NP en OMP gezien. Analoog aan
de studie beschreven in Hoofdstuk 5, is het interessant na te gaan in hoeverre de experimentele resultaten correleren aan de humane in vivo situatie.
Hoofdstuk 7 geeft een klinische “case study” weer, die het optreden van een inflammatoire pseudotumor van het CZS geassocieerd met humaan immunodeficiëntie virus (HIV),
JCV en het immuunreconstitutiesyndroom beschrijft. De inflammatoire pseudotumor leek
zich te hebben ontwikkeld tegen de achtergrond van een “highly active antiretroviral treatment” (HAART) regime bij een HIV-positief persoon. Immuunsuppressie, als gevolg van het
gebruik van immuunsuppressiva maar mogelijk ook infecties, kan geassocieerd zijn met
243
annex
reactivatie van latente pathogenen. In dit geval kan het immuunsysteem, na HAART, zich
(opnieuw) gericht hebben op JCV in de context van een immuunreconstitutiesyndroom.
Bovenstaande thema’s kunnen klinisch relevant zijn, aangezien diverse personen behandeld worden met antimicrobiële en anti-inflammatoire middelen die een effect zouden
kunnen hebben op hun CZS “viroom” dat mogelijke latente of opportunistische pathogenen herbergt.
Hoofdstuk 8 beschrijft het optreden van intravasculaire lymfomatose (IVL) van de
hersenen bij een persoon gediagnosteerd met myelodysplastisch syndroom (MDS). Beide
aandoeningen zijn geassocieerd met (herpes)virale infecties en er zouden pathogenetische
relaties op hematopoietisch celniveau kunnen bestaan. Het is beschreven dat virussen zich
in immuuncellen naar het CZS kunnen verspreiden, het zogenaamde “Paard van Troje”
fenomeen. Naast axonaal transport kan dit een ander specifiek mechanisme zijn dat leidt
tot virale verspreiding naar het CZS. Behandeling van intravasculaire lymfomateuze cellen
in de hersenen, zoals in dit hoofdstuk beschreven, kan in dat opzicht van klinisch belang
zijn.
Hoofdstuk 9 biedt een algemene discussie van de thema’s die in het proefschrift aan
bod komen. Het bediscussieert de mechanismen waarlangs virussen zich naar het CZS
kunnen verspreiden alsook (mogelijke) virale betrokkenheid bij de pathogenese van CZS
ziekten, inclusief chronische neurologische aandoeningen. Zoals ook geschetst in Hoofdstuk 1 kunnen axonaal, mogelijk olfactoir, transport alsook hematogene “Paard van Troje”
verspreiding in geïnfecteerde bloedcellen hier routes vormen waarlangs virussen het CZS
kunnen binnenkomen terwijl ze daarbij perifere immuunresponsen relatief “omzeilen”.
Bovendien kunnen, binnen het CZS, zowel (latent aanwezige) virussen als (non-cyto­
lytische) immuunresponsen erop gericht zijn neurale celdood te voorkomen en kunnen, in
zijn algemeenheid, virussen neurale cellen op niet-acute wijze aantasten, hetgeen verdere
studie naar mogelijke relaties tussen virale infecties en neurologische ziekten rechtvaardigt.
Ook worden mogelijke opties voor toekomstig onderzoek besproken. Detectie en beeldvormingstechnieken spelen een cruciale rol bij het leggen van (“real-time”) verbanden
tussen CZS ziekten en virale infecties. Preventieve en therapeutische opties voor virale
infecties van het CZS kunnen zowel CZS- als virusspecifiek zijn. Deze specificiteiten kunnen
bereikt worden door axonaal transport en effectief “oversteken” van de bloed-hersenbarrière (BBB) van virus-gerichte behandelmodaliteiten, of door hun activiteit voordat
virale neuroinvasie plaatsvindt. Ontwikkelingen met betrekking tot het virale en humane
metagenoom geven aanwijzingen betreffende wie wanneer te behandelen, aangezien
niet alle virussen altijd in alle personen ziekmakend hoeven te zijn. Deze ontwikkelingen
kunnen dus erg belangrijk voor gepersonaliseerde behandelingen zijn.
244
samenvatting
245
246
acknowledgements
247
annex
248
acknowledgements
Acknowledgements
Now that it has come down to these pages, many colleagues/family members/friends
(and these terms can be used interchangeably!) have already been mentioned, referred
to, or included within this thesis. In the very “final” stages of preparing the manuscript, my
mother kindfully agreed to design the artwork on the cover and preceding thesis sections,
and my brother to act as paranymph. In this, also final, phase I really also wanted to refer
to my father (’s thesis)*. This might seem “symbolical” (and maybe it is!) but it really also
has to do with the broad manner in which he formulated his thesis’ acknowledgements,
generally thanking everyone involved, which I understand and had in mind for this section
as well... You can therefore really see it as an "ultimate reference” from my side...
As described, many people have been listed within this thesis, which I, maybe also for
that reason, really wanted to dedicate to all of you, as my family and friends! Sometimes
even also “functions” or “titles” have been named. In these respects, I can really say that I
feel this thesis, and me being at the point where I am right now, is the result of interactions
with all of you and I am very thankful for that!
I, here, maybe a bit in analogy to my father's thesis and notwithstanding the fact that
I mentioned him, my mother and brother to also explain why I formulate the acknow­
ledgements like this, in no specific order would like to express equal, heartfelt, thanks to
everyone who has stood by my side in this process also because I have the feeling that
there have been so many people of importance to me and who have “touched” me, and
just to let you know that I am really very, very grateful to each and everyone of you!!!
With best wishes!
George
Groningen, June 2014
*Sips H, The plasma membrane of the liver parenchymal cell: structure and function/ door Harmannus Johannes
Sips, Amsterdam, Rodopi, 1981
249
250
curriculum vitae
251
annex
252
curriculum vitae
Curriculum Vitae
Gregorius Johannes (George) Sips was born on the 30th of December 1981 in Rotterdam,
The Netherlands. He followed high school education at R.K. Gymnasium Beekvliet,
Sint-Michielsgestel, The Netherlands and obtained an MD at the University of Groningen,
The Netherlands. During his medical studies, he enrolled into an MD/PhD trajectory, against
the background of which the work described within this thesis was conducted. Part of the
“MD” phase of his studies consisted of a period of clinical electives at the Mount Sinai
Medical Center, New York, USA and, during the “PhD” phase, he had the opportunity to be
involved in research-related activities at the Johns Hopkins Bloomberg School of Public
Health , Baltimore, USA. The present manuscript forms a combined result of these activities and the input of- and interactions with many involved individuals.
Contact details:
University Medical Center Groningen
Department of Medical Microbiology
Hanzeplein 1
P.O. Box 30.001, HPC EB88
9700 RB Groningen
The Netherlands
g.j.sips@umcg.nl
Johan de Wittstraat 82
9716 CJ Groningen
The Netherlands
gjsips@hotmail.com
253