FARM5010 - Bioanalytisk kjemi
K2025 (18 oppgaver, 4 timer)
Oppgavesett:
•
•
•
7 oppgaver i prøveopparbeidelse (sample preparation / SP)
7 oppgaver i kromatografi (chromatography / CHROM)
4 oppgaver i massespektrometri (mass spectrometry / MS)
Hver oppgave tillegges lik vekt (10 poeng per oppgave)
SP oppg.1
Du skal utvikle en prøveopparbeidelsesmetode for benzodiazepinet loratadin fra plasma. Ditt
førstevalg er væske-væske ekstraksjon (LLE) da det gir svært god opprensing fra plasma.
Gjør en vurdering basert på informasjonen du finner over (strukturformel/log P og
pKa), og beskriv hvorfor/hvorfor ikke væske-væskeekstraksjon er en egnet metode for
opprensing av loratadin fra plasma.
Svar:
Analytten er en svak base som vil være uladet ved pH > pKa + 2 (4,33 + 2= 6,33), noe som
favoriserer ekstraksjon til en organisk fase og dermed gjør den egnet for væske-væskeekstraksjon (LLE).
Vi må videre vurdere polariteten, analytten har en log P på ca. 4,55 og er derfor relativt
lipofil. Dette innebærer at den vil ha høy affinitet for organiske løsemidler og dermed kunne
fordele seg effektivt fra plasma (vandig fase) til organisk fase.
Samlet sett tyder dette på at LLE er en egnet metode, og det vil sannsynligvis være mulig å
oppnå et høyt utbytte.
SP oppg.2
Væske-væske ekstraksjon kan automatiseres i et format kalt Supported liquid
extraction (SLE). Beskriv kort prinsippet for SLE.
Svar:
SLE er en variant av væske–væske-ekstraksjon der den vandige prøven immobiliseres på et
porøst, inert fast materiale (ofte kiselgur). Dette skaper et stort kontaktareal mellom prøven
og det organiske løsemiddelet, noe som maksimerer utbytte. Typiske trinn:
1
1. Den pH-justert vandige prøven påføres og absorberes i det porøst faste materialet
(kiselgur) og dispergeres som små dråper.
2. Et organisk løsemiddel (ekstraksjonsmiddel) som er ikke blandbart med vann tilsettes
og passerer gjennom materialet.
3. Analytten ekstraheres inn i det organiske løsemiddelet og samles i oppsamlingsrøret.
4. Ekstraksjonen gjentas gjerne for bedre utbytte.
SPE-prosessen utføre vha. vakuum, hvor vakuum suger organisk løsemiddelet gjennom det
faste materialet.
SP oppg. 3 (samme figur som SP oppg. 1)
Du ønsker å utvikle en prøveopparbeidelsesmetode for opprensing av loratadin fra serum
basert på fastfaseekstraksjon (SPE). På laben hvor du jobber har du tilgjengelig SPE-kolonner
med følgende fastfaseekstraksjonsmaterialer:
-
Omvendt fase (C18)
Sterk kationbytter (sulfonsyre)
Svak kationbytter (karboksylsyre)
Blandet fase (C8 og sterk kationbytter)
Hvilke(t) av ekstraksjonsmaterialene vil være egnet for opprensing av loratadin fra
plasma? Gi en kort begrunnelse for hvorfor/hvorfor ikke hver av de enkelte materialene
er egnet. Beskriv og begrunn hvilket materiale du vil teste først når du utvikler metoden
din.
2
Svar:
Loratadin er en hydrofob forbindelse med log P = 4,55, og har en svak basisk funksjonell
gruppe med pKa = 4,33. Dette betyr at analytten kan foreligge som positivt ladet ved lav pH
og uladet ved høyere pH.
Omvendt fase (C18): Denne fasen er egnet fordi loratadin er hydrofobt. Med log P = 4,55 vil
analytten kunne danne sterke hydrofobe interaksjoner med C18-materialet og dermed bli godt
tilbakeholdt. Dette gjør omvendt fase til et relevant alternativ.
Sterk katinbytter (sulfonsyre): Dette er en negativt ladet fase (sulfonsyregrupper er
deprotonert over hele pH-området) og fungerer som kationbytter ved å binde positivt ladede
forbindelser. Loratadin, som er en svak base (pKa = 4,33), vil være fullstendig protonert ved
pH < pKa − 2 (4,33 − 2 = 2,33). Under disse betingelsene vil analytten være positivt ladet og
kunne danne sterke ion–ion-interaksjoner med fasen. Dermed er sterk kationbytter godt
egnet.
Svak kationbytter (karboksylsyre): Denne fasen er kun negativt ladet når pH er høyere enn
pKa til karboksylsyregruppen (typisk pKa ≈ 4–5), altså ved pH > 6–7. Ved så høy pH vil
loratadin i stor grad være uladet (siden pH >> pKa for basen), og dermed ikke kunne danne
ionebytterinteraksjoner. Derfor er svak kationbytter ikke egnet.
Blandet fase (C8 og sterk kationbytter): Denne fasen kombinerer hydrofobe interaksjoner
(C8) og ionebytterinteraksjoner (sterk kationbytter). Siden loratadin både er hydrofobt og kan
protoneres ved pH < 2,33, vil denne fasen kunne gi dobbel retensjonsmekanisme og dermed
god selektivitet. Dette gjør blandet fase svært egnet.
Omvendt fase (C18), sterk kationbytter (sulfonsyre) og blandet fase (C8 og sterk
kationbytter) er alle egnet, mens svak kationbytter (karboksylsyre) ikke er egnet.
Ved metodeutvikling ville jeg først testet blandet fase (C8 og sterk kationbytter), fordi den
kombinerer både hydrofobe og ioniske interaksjoner. Dette gir bedre kontroll over retensjon
og eluering, samt økt selektivitet i komplekse matrikser som serum.
SP oppg.4
Når man utfører fast-fase ekstraksjon (SPE) på plasmaprøver gjennomfører man ofte
en proteinfelling før man setter prøven på SPE-kolonnene. Dette trinnet gjør man
sjelden når man skal bestemme analytter i urin. Forklar hva som er årsaken til dette.
Svar:
Plasmaprøver inneholder betydelige mengder proteiner som kan skape problemer ved direkte
påsetting på SPE-kolonner. Proteinene kan tette kolonnen. Derfor gjennomføres
proteinfelling før SPE, hvor proteiner felles ut ved tilsetning av et fellingsreagens. Etter
sentrifugering kan supernatanten, som i stor grad er fri for proteiner, brukes videre i analysen.
3
Ved analyse av urin er proteinfelling som regel unødvendig, fordi urin fra friske personer
inneholder ikke proteiner. Dermed er det liten risiko for tilstopping av SPE-kolonnen. Prøven
kan derfor ofte settes direkte på SPE-kolonnen uten forutgående proteinfelling.
SP oppg.5
Automatisering av SPE kan gjøres ved hjelp av roboter eller on-line SPE. Figuren viser en
typisk on-line SPE oppsett i oppkonsentrerings- og analysemodus (hhv til venste og høyre). I
on-line SPE snakker man ofte om back flush og fore flush/straight flush.
Hva betyr dette, og kan du fra figuren se om back flush eller fore flush/straight flush
benyttes i dette eksempelet? Begrunn svaret ditt.
Svar:
On-line SPE er et system der en oppkonsentreringskolonne (CC) er koblet direkte til en
analytisk kolonne (AC). Prøven injiseres direkte, og analytten retarderes på CC mens
interferenser vaskes bort, før analytten elueres videre til AC for separasjon og deteksjon.
I on-line SPE skiller man mellom fore flush (straight flush) og back flush, som beskriver
retningen på mobilfasen gjennom oppkonsentreringskolonnen under eluering av analytt.
Ved fore flush (straight flush) går mobilfasen i samme retning som under påsetting av prøven.
Prøven lastes på CC, interferenser vaskes til avfall, og deretter elueres analytten videre i
samme strømningsretning gjennom CC og inn på AC. Dette er et enklere oppsett, men kan gi
noe større båndspredning fordi analytten må passere hele kolonnen igjen.
Ved back flush reverseres strømningsretningen gjennom CC under eluering. Etter at analytten
er fanget opp i CC og interferenser er fjernet, endres ventilen slik at mobilfasen går i motsatt
4
retning av påsettingsretningen. Dette gjør at analytten elueres direkte ut av CC og over til AC
uten å passere hele kolonnens lengde, noe som gir smalere topper og mindre båndspredning.
Ulempen er at mer forurensning potensielt kan føres videre inn i AC dersom opprensingen
ikke er optimal.
Ut fra figuren ser man at mobilfasen under eluering går i motsatt retning av prøvelastingen
gjennom CC. Dette indikerer at det benyttes back flush i dette oppsettet, siden
strømningsretningen reverseres mellom oppkonsentrerings- og elueringstrinnet.
SP oppg.6
Loratadin skal analyseres fra plasma ved hjelp av on-line SPE. For å slippe å gjøre
proteinfelling før injeksjon på analysesystemet benytter du en såkalt restricted access media
(RAM)-kolonne som oppkonsentreringskolonne.
Hvilke egenskaper har RAM-kolonnen som gjør proteinfelling overflødig? Beskriv kort
prinsippet for RAM-materialer.
Svar:
RAM-materialer er sorbenter som er utviklet for å tilbakeholde lavmolekylære forbindelser,
samtidig som makromolekyler som proteiner og polypeptider ekskluderes. Dette gjør det
mulig å analysere plasma eller serum direkte uten å gjøre proteinfelling.
Prinsippet bak RAM-materialer er at de kombinerer både fysiske og kjemiske barrierer mot
proteiner. Materialet inneholder porer med liten størrelse (for eksempel <3 nm), som er
tilgjengelige for små molekyler som loratadin, men for små til at proteiner kan trenge inn.
Proteinene ekskluderes derfor fra porene på grunn av størrelse, noe som utgjør den fysiske
barrieren.
I tillegg er den ytre overflaten av partiklene modifisert med hydrofile funksjonelle grupper.
Disse reduserer hydrofobe interaksjoner mellom proteiner og overflaten, slik at proteinene
ikke binder seg til materialet, men vaskes bort med mobilfasen. Dette utgjør den kjemiske
barrieren.
Små analyttmolekyler kan derimot diffundere inn i porene og interagere med de funksjonelle
grupper i den indre overflaten, hvor de tilbakeholdes og oppkonsentreres før videre analyse.
Dermed blir proteinfelling overflødig ved bruk av RAM-kolonner.
SP oppg.7 (samme figur som SP oppg.1)
5
Miniatyrisering og automatisering er trender innen prøveopparbeidelse.
Væskefasemikroekstraksjon (liquid-phase microextraction, LPME) i 96-brønnsformatet
legger til rette for begge deler.
Basert på egenskapene (pKa / log P) til loratadin vil du anta at dette er en analytt som
egner seg for opprensing ved hjelp av trefase-LPME? Begrunn svaret ditt.
Svar:
For at loratadin skal være egnet for opprensing ved trefase-LPME, må analytten være
hydrofobt nok for å gå over fra vandig donor løsning til organisk membran (i uladet form),
deretter må kunne ioniseres (bli hydrofilt) for å gå over til den vandige akseptorfasen.
Loratadin har log P på 4,55, som betyr at den er relativt lipofil. Dette gir en god affinitet for
den organiske membran, og første steg (overgang fra donor til organisk fase) vil derfor være
effektivt.
Loratadin er en svak base med pKa = 4,33. I donorfasen må den være hovedsakelig uladet for
å gå inn i organisk fase, noe som krever pH > pKa + 2 (4,33 + 2 = 6,33). I akseptorfasen må
den være ionisert for å bli fanget, noe som krever pH < pKa – 2 (4,33 -2 = 2,33) for effektiv
ionisering i akseptorfasen.
På grunn av høy lipofilitet (log P = 4,55) og gunstige pKa-egenskaper som tillater effektiv
kontroll av ionisering via pH, er loratadin godt egnet for opprensing ved trefase-LPME.
CHROM oppg.1
Beskriv typiske innstillinger (kolonnedimensjoner, partikkelstørrelser, kjemi) for
UHPLC. Hva er fordelene og ulempene med UHPLC?
Svar:
UHPLC benytter kolonner med mindre partikkelstørrelse enn konvensjonell HPLC, vanligvis
rundt 1,7–1,9 µm. Den lille partikkelstørrelsen gir høyere kolonneeffektivitet og bedre
separasjon, men fører også til betydelig økt mottrykk i systemet. For å håndtere dette benyttes
ofte kortere kolonner enn i konvensjonell HPLC, typisk med lengder mellom 3 og 15 cm,
siden mottrykket øker med kolonnelengden. Kolonnene har også mindre indre diameter,
vanligvis 1–2 mm, og benytter derfor lavere flowrater, ofte mellom 100 og 1000 µL/min.
UHPLC-systemer er konstruert for å tåle høyt trykk og krever kraftige pumper som kan
presse mobilfasen gjennom kolonnen. Stasjonærfasen består ofte av små silikabaserte
partikler med høy mekanisk styrke (tåler høyt trykk).
Den viktigste fordelen med UHPLC er den høye separasjonseffektiviteten. Små partikler
reduserer båndspredning og gjør det mulig å oppnå smalere topper og kortere analysetid
sammenlignet med konvensjonell HPLC. Den lille indre diameteren bidrar også til redusert
6
fortynning av analyttene, noe som gir mer konsentrerte topper, bedre signal og lavere
deteksjonsgrenser. I tillegg gir de korte kolonnene raskere analyser.
En ulempe med UHPLC er det høye mottrykket, som kan føre til friksjonsvarme i kolonnen.
Dette kan skape varmegradienter i kolonnen og redusere separasjonseffektiviteten ved å
påvirke toppfasongen. Dersom temperaturen er høyere i midten av kolonnen enn ved kantene,
vil analyttene i sentrum elueres raskere enn analyttene nær kolonneveggen. Dette fører til økt
båndspredning og bredere topper. Bruk av kolonner med mindre indre diameter kan redusere
dette problemet, siden varmeprofilen blir mer uniform over kolonnens radius. UHPLC
krever også dyrere instrumentering som tåler høyt trykk. De korte kolonnene kan dessuten
være en ulempe dersom svært komplekse prøver krever lengre analysetid eller høy
separasjonsevne.
CHROM oppg.2
Diameterne på LC-kolonner har gradvis blitt redusert over tiårene. Hva er fordelene
med å redusere indre diameteren av en kromatografisk kolonne?
Svar:
En viktig fordel med å redusere den indre diameteren til en HPLC er redusert fortynning av
analyttene. Dette gir mer konsentrerte topper, som igjen fører til bedre signal og lavere
deteksjonsgrenser. Dette er spesielt viktig når man har begrenset prøvemengde eller
analyserer svært lave konsentrasjoner av analytter. De mer konsentrerte toppene gir økt
sensitivitet ved bruk av følsomme detektorer som UV- og MS-detektorer.
Redusert indre diameter gir også lavere flowrater og redusert løsemiddelforbruk
sammenlignet med kolonner med større diameter.
En annen fordel er redusert varmegradient i kolonnen, noe som er særlig viktig ved UHPLC
hvor høyt trykk kan gi friksjonsvarme. Temperaturforskjeller i kolonnen kan påvirke
toppfasongen ved at analyttene i midten av kolonnen elueres raskere enn analyttene nær
kolonneveggen. Dette fører til økt båndspredning og bredere topper. Kolonner med mindre
indre diameter får en mer uniform temperaturprofil, noe som bidrar til bedre
separasjonseffektivitet og smalere topper.
Mindre indre diameter vil gi bedre kompatibilitet med enkelte detektorer.
CHROM oppg.3
7
Oftest brukes LC kolonner pakket med silikapartikler dekket med en C18
stasjonærfase. Beskriv et annet kolonneformat (du bestemmer hvilket). Hva er dens
fordeler og ulemper.
Svar:
Monolittiske kolonner består av en kontinuerlig porøs struktur i stedet for pakkede partikler.
De inneholder makroporer (>50 nm, typisk 2-8 um), mesoporer (2-50 um) og mikroporer (<2
nm). En viktig fordel med monolittiske kolonner er lavt mottrykk, som gjør det mulig å bruke
høyere flow rate og dermed oppnå raskere analyser uten å miste effektivitet. Det tillater også
bruk av lengre kolonner med store toppkapasiteter.
I kapillærformat gir de også lavt løsemiddelforbruk og bedre kompatibilitet med enkelte
detektorer uten behov for flow-splitting. Dette kan bidra til forbedrede deteksjonsgrenser
(LOD), spesielt ved små prøvemengder.
En ulempe er at de ofte har lavere kolonneeffektivitet per lengdeenhet sammenlignet med
pakkede kolonner ved lave flow rate, selv om de presterer bedre ved høy flow.
CHROM oppg.4
Hvilke hensyn må du ta når du skal separere/isolere intakte, bioaktive proteiner?
Beskriv kort prinsippet for to LC-varianter for å separere proteiner.
Svar:
Når man ønsker å separere intakte, bioaktive proteiner, er det viktig å unngå betingelser som
kan føre til denaturering. Dette innebærer å unngå ekstreme pH-verdier, høye temperaturer og
sterke organiske løsemidler, siden slike forhold kan endre proteinets tredimensjonale struktur
og dermed påvirke biologisk aktivitet. Derfor benyttes ofte milde bufferbetingelser i
proteinseparasjoner. Proteiner kan separeres ved hjelp av ulike LC-teknikker, blant annet
hydrophob interaksjonskromatografi (HIC) og størrelseseksklusjonskromatografi (SEC).
HIC er basert på reversible hydrofobe interaksjoner mellom proteiner og en relativt mildt
hydrofob stasjonærfase. Separasjonen utføres under høy saltkonsentrasjon, der salt reduserer
hydratiseringslaget rundt proteinene og eksponerer hydrofobe områder, slik at binding til
stasjonærfasen øker. Eluering skjer ved gradvis reduksjon av saltkonsentrasjonen, slik at
interaksjonene svekkes.
En viktig fordel med HIC sammenlignet med vanlig omvendt fase-kromatografi er at HIC
opererer under milde, vannbaserte betingelser uten organiske løsemidler og uten sterke
denaturerende effekter. I omvendt fase-kromatografi benyttes ofte organiske modifikatorer
(som acetonitril) og lav pH, noe som typisk fører til denaturering av proteiner. HIC bevarer
8
derfor i større grad proteinets native struktur og biologiske aktivitet, og er derfor bedre egnet
for separasjon av intakte, bioaktive proteiner.
SEC baserer seg på separasjon etter molekylstørrelse ved bruk av porøse partikler med
definert porestørrelse. Store proteiner får begrenset tilgang til porene og elueres derfor først,
mens mindre proteiner diffunderer inn i porene og får lengre oppholdstid i kolonnen, og
elueres senere. For at separasjonen skal være basert utelukkende på størrelse, er det viktig å
minimere ikke-spesifikke interaksjoner med stasjonærfasen, slik at ladning og hydrofobisitet
ikke påvirker retensjonen.
CHROM oppg.5
Beskriv hva en mobilfasegradient er. Hva er fordelene med å bruke en
mobilfasegradient? Når vil det være unødvendig å bruke en mobilfasegradient
(sokratisk betingelser?)
Svar:
Gradienteluering innebærer at sammensetningen av mobilfasen endres under analysen, slik at
elueringstyrken øker over tid. I omvendt fase-kromatografi starter man typisk med en svak
mobilfase for å eluere polare forbindelser, og øker deretter andelen organisk løsemiddel for å
eluere mer hydrofobe komponenter.
En viktig fordel med gradienteluering er at analysetiden reduseres, spesielt for prøver som
inneholder både svakt og sterkt retarderte forbindelser. Metoden gir også smalere topper på
grunn av kontinuerlig refokusering under gradient. I tillegg er gradienteluering godt egnet
for komplekse prøver, da den gir et større effektivt separasjonsområde og sikrer at alle
komponenter elueres fra kolonnen. Dette kan også bidra til bedre kromatografisk oppløsning i
slike systemer.
Ulempene er at metoden er mer kompleks og vanskeligere å optimalisere enn isokratisk
eluering. Gradienteluering kan også gi grunnlinjedrift, særlig ved UV-deteksjon, fordi
mobilfasens sammensetning endres under analysen. I enkelte tilfeller kan gradienter også
redusere separasjonen mellom nærliggende topper dersom gradienten er for bratt
En annen viktig ulempe er behovet for re-kondisjonering, noe som kan ta tid.
Gradienteluering er heller ikke godt egnet for alle separasjonsmekanismer, for eksempel
normalfase.
Det er ikke nødvendig å bruke gradienteluering dersom man har en enkel prøve med få
komponenter og liten forskjell i retensjon mellom forbindelsene. I slike tilfeller vil isokratisk
eluering ofte være tilstrekkelig.
9
CHROM oppg.6
Hvis du har et massespektrometer: oppgi flere grunner til hvorfor en LC-separasjon før
MS detektering kan være viktig.
Svar:
LC reduserer kompleksiteten i prøven ved å separere komponenter i tid før de går inn i MS.
Dette gjør at forbindelser med like eller lignende m/z ikke analyseres samtidig, noe som
reduserer risiko for overlappende signaler og forenkler tolkningen av spektra.
I tillegg reduserer LC matrikseffekter, som ion suppression eller ion enhancement i
ioniseringskilden. Dette gir bedre sensitivitet og mer pålitelige kvantitative resultater.
Separasjonen bidrar også til lavere bakgrunnsstøy og forbedret signal-til-støy-forhold, noe
som gir lavere deteksjonsgrenser og mer robust analyse.
NB: LC-UV har ganske kraftig reproduserbarhet og er en rask metode.
CHROM oppg.7
En vanlig feil er å forsøke å forbedre en separasjon ved å redusere væskehastigheten
(flow rate) til mobilfasen. Hvorfor er ikke dette en god strategi? Beskriv ved hjelp av
terminologi fra Van Deemter-ligningen/grafen.
Svar:
Båndspredning i kromatografi kan forklares ved Van Deemter Equation
H = A + B/u + Cu
A term = eddy diffusion
B term = longitudinal diffusion
C term = mass transfer resistance
der H er platehøyden, og u er mobilfasehastigheten. De tre leddene beskriver ulike bidrag til
båndspredning:
Redusert vaskehastigheten kan øke longtidunal diffusion (B-term i deemter-ligningen), noe
som vil bidra med båndspredning, som påvirker effektivitet (høy H) og dermed lavere N og
lavere oppløsningsevne (Rs).
Når flow (u) reduseres, øker bidraget fra B-termen (longitudinal diffusjon), siden
analyttmolekylene får lengre tid til å diffundere langs kolonnens lengderetning fra områder
med høy til lav konsentrasjon. Dette fører til økt båndspredning.
Samtidig vil svært lav flow også gi økt total analysetid, uten nødvendigvis å gi bedre
separasjon.
10
I tillegg vil optimal separasjon ikke oppnås ved lavest mulig flow, fordi Van Deemter-kurven
viser et minimumspunkt for H (platehøyde). Ved for lav flow dominerer B-termen, mens ved
for høy flow dominerer C-termen (masseoverføringsmotstand). Best effektivitet (lavest H og
høyest N) oppnås derfor ved en optimal mobilfasehastighet, ikke ved å redusere den så mye
som mulig.
Konsekvensen av å gå bort fra optimal flow er:
-
økt platehøyde (H)
redusert antall teoretiske plater (N)
dårligere oppløsning (Rs)
og ofte lengre analysetid uten gevinst i separasjon
MS oppg.1
Forklar effekten av ionundertrykking (matrikseffekter) på følsomheten og
reproduserbarhet i LC-MS-analyser.
Svar:
Ionundertrykking (matrikseffekter) i LC-MS oppstår når andre forbindelser fra
prøvematriksen påvirker ioniseringen av analytten i ionekilden, vanligvis ved
elektrosprayionisering (ESI). Dette fører til at færre analyttioner dannes og dermed redusert
signalintensitet.
Som følge av dette blir signalet ikke lenger proporsjonalt med den faktiske
analyttkonsentrasjonen, noe som kan gi dårligere nøyaktighet og lineæritet i analysen.
Matrikseffekter kan også gi dårlig reproduserbarhet dersom graden av ionundertrykking
varierer mellom prøver. I tillegg reduseres metodens følsomhet fordi lavere signal gir
dårligere signal-til-støy-forhold og høyere deteksjonsgrenser.
MS oppg.2
Sammenlign følgende type scan-modes i massespektrometri: "full scan mode" versus
"SIM mode". Hvilken skal brukes når du vil få kvalitativ informasjon om et stoff?
Hvilken skal brukes når du vil oppnå gode deteksjonsgrenser og forklar hvorfor disse
gode deteksjonsgrensene oppnås.
Svar:
I full scan mode skanner massespektrometeret kontinuerlig over et bestemt m/z-område i
løpet av en gitt tid, for eksempel fra m/z 200 til 500 i løpet av 0,5 sekunder. Dette gir et
komplett massespektrum med informasjon om alle ioner innenfor det valgte masseområdet.
Full scan mode brukes hovedsakelig når man ønsker kvalitativ informasjon, for eksempel:
-
identifikasjon av ukjente forbindelser
11
-
bestemmelse av molekylmasse
informasjon om fragmenteringsmønster
I SIM mode overvåkes spesifikke m/z-signaler. Dette brukes når analyttene er kjent og man
ønsker kvantitativ bestemmelse.
Dette kan være nyttig hvis analyttene er kjent, men kvantitativ informasjon kreves. SIManalysen gir informasjon om intensiteten til en spesifikk masse.
SIM mode gir bedre deteksjonsgrenser enn full scan mode fordi massespektrometeret bruker
mer tid på de utvalgte ionene (m/z-verdi), noe som gir et mye høyere signal-til-støy forhold
(S/N) og dermed lavere deteksjonsgrense.
I full scan fordeles skannetiden over mange m/z-verdier, mens SIM konsentrerer all
måletiden på få ioner og oppnår derfor bedre deteksjonsgrenser.
MS oppg.3
En analytisk kjemiker ønsker å utvikle en UHPLC-Orbitrap MS metode. Det er behov for å
kunne skille m/z 512,4349 fra m/z 512,4302. Samtidig ønsker man rask kromatografi med
topper som er omtrent 6 sekund i bredden.
Under metodeutvikling er det mulighet for å bruke følgende innstillinger på Orbitrap MSen:
A) Oppløsning* (R) 60 000 (og scan hastighet** av 8 Hz)
B) Oppløsning (R) 120 000 (og scan hastighet av 4 Hz)
C) Oppløsning (R) 240 000 (og scan hastighet av 2 Hz)
D) Oppløsning (R) 480 000 (og scan hastighet av 1 Hz)
Hvilke(n) av disse innstillinger kan velges om man skal skille massene og samtidig kjøre
kromatografi med topper på omtrent 6 sekunder bred? Forklar hvorfor du kan velge
denne/disse innstillingen(e).
*Oppløsning = resolution. ** scan hastighet = scan speed
Svar:
𝑀𝑎𝑠𝑠 𝑟𝑒𝑠𝑜𝑙𝑢𝑡𝑖𝑜𝑛 =
𝑚
512,4302
=
= 109 ∗ 10!
∆𝑚 512,4349 − 512,4302
Dette betyr at man trenger en oppløsning på minst 109 * 10^3 for å kunne skille massene.
Dermed er oppløsning i B, C og D tilstrekkelig
Man trenger vanligvis omtrent 12 – 15 datapunkter per topp.
à Antall datapunkter:
-
12
A: 6 * 8 = 48
-
B: 6 * 4 = 24
C: 6 * 2 = 12
C: 6 * 1 = 6
à Dermed vil A, B og C gi nok data punkter
à kun B og C virker er egnede valg fordi de har både god oppløsning (>/= 109 * 10^3) og
tilstrekkelig scan hastighet som kan gi >/= datapunkter.
A har dårlig oppløsning, mens D har for lav scan-speed og gir for få datapunkter.
NB: scan speed i Hz sier oss hvor mange scans som tas per sekund
MS oppg.4
Her er det to massespektre (positive mode): A) er et "full scan" spektrum av en ukjent
forbindelse , B) er et MS/MS spektrum etter fragmentering av m/z 207,0 (med et filtervindu i
MS1 av 0,3 Da).
Hva er massen av den ikke ioniserte forbindelsen (som er vist i "full scan"
massespektret)?
Forklar hvorfor isotopene ikke er synlig i MS/MS spektret?
Hvilket fragment ville fungert best som "quantifier" om lave kvantifiseringsgrenser er
ønsket?
Hvorfor har noen av fragmentene (i MS/MS spektret) en høyere m/z verdi en
molekylionet
(i "full scan" spektret)?
Svar:
Masseforskjellen mellom isotopene til den ukjent istotopen er 0,5, noe som tyder på at
forbindelsen fikk 2 ladninger ettersom z = 1/dm à 1/0,5 = 2. Det observerte ionet er derfor
[M + 2H+]2+ Massen til ikke ioniserte forbindelsen blir dermed M+2/2 = 207 m/z à M = 412
I MS/MS ble bare precursorionet ved:
13
m/z=207,0
selektivt isolert i MS1 med et smalt filtervindu på 0,3 Da før fragmentering.
Isotoptoppene ligger utenfor dette isolasjonsvinduet og blir derfor ikke sendt videre til
kollisjonscellen. Dermed fragmenteres kun precursorionet ved m/z 207,0, og isotopene blir
ikke synlige i MS/MS-spekteret.
Istotopene er ikke synlig i MS/MS spektret fordi det ble valgt en bestemt m/z som er 207,0
for å bli selektrert og fragmentert, derfor ser vi kun fragmenter til denne m/z-verdi (207,0) og
ikke andre isotopene som har annerledes m/z.
Fragmentet med høyest intensitet vil vanligvis være best som quantifier fordi det gir høyest
signalintensitet, best signalt-til-støy-forhold og laveste kvantifiseringsgrense. Fragmentet
med 226 m/z har høyere signalintensitet sammenlignet med de to andre og fungerer derfor
som best quantifier.
Noen fragmenter kan ha høyere m/z enn molekylionet i full scan fordi precursorionet er
dobbeltladet i MS1 (z = 2), noe som reduserer m/z-verdien for hele molekylet. Når
fragmentene dannes i MS/MS, er de ofte enkeltladede (z = 1). Selv om fragmentene har
lavere masse enn molekylionet, vil de derfor kunne få høyere m/z-verdi enn det
dobbeltladede precursorionet.
14