130
Capítulo 4
L A E S T R U C T U R A Y F U N C I Ó N D E L A M E M B R A N A P L A S M ÁT I C A
REV I SI Ó N
?
1. Dibuje la estructura básica de los principales tipos de lípidos que hay en las membranas celulares. ¿En qué difieren
los esfingolípidos de los glicerolípidos?, ¿cuáles son los
fosfolípidos?, ¿qué son los glucolípidos?, ¿cómo se organizan estos lípidos en una capa doble?, ¿qué importancia
tiene la bicapa para las actividades de la membrana?
2. ¿Qué es un liposoma?, ¿cómo se usan los liposomas en
los tratamientos médicos?
3. ¿Qué es un oligosacárido?, ¿en qué forma se vincula con
las proteínas de la membrana?, ¿cómo se relaciona con los
tipos sanguíneos humanos?
Proteínas integrales de la
membrana
(a)
Proteína periférica de membrana
4.4 LA ESTRUCTURA Y FUNCIONES
DE LAS PROTEÍNAS DE LA MEMBRANA
Dependiendo el tipo celular y el organelo en particular
dentro de esa célula, una membrana puede contener cientos de
proteínas diferentes. Cada proteína de la membrana posee una
orientación definida en relación con el citoplasma para que las
propiedades de una superficie de la membrana sean muy distintas respecto de las de otra superficie. Esta asimetría se conoce
como “lateralidad” de la membrana. Por ejemplo, en la membrana plasmática las partes de las proteínas de membrana que
interactúan con otras células o con ligandos extracelulares se
proyectan hacia fuera, al espacio extracelular, en tanto que las
partes de las proteínas de membrana que interactúan con moléculas del citoplasma se proyectan hacia el citosol. Las proteínas
de membrana pueden agruparse en tres clases distintas que se
distinguen por su estrecha relación con la bicapa lipídica (fig.
4-12). Éstas son las siguientes:
1. Proteínas integrales que penetran la bicapa de lípidos. Las
proteínas integrales son proteínas transmembranosas, esto
es, que cruzan toda la bicapa de lípidos y tienen dominios
que sobresalen por ambos lados de la membrana, extracelular y citoplásmico. Algunas proteínas integrales tienen sólo
un segmento que abarca la membrana, mientras que otras la
cruzan varias veces. Los estudios de secuencia del genoma
sugieren que las proteínas integrales de la membrana constituyen de 20 a 30% de todas las proteínas codificadas.
2. Proteínas periféricas que se localizan en su totalidad fuera
de la bicapa de lípidos, ya sea en el lado citoplásmico o extracelular, aunque se relacionan con la superficie de la membrana mediante enlaces no covalentes.
3. Proteínas fijadas con lípidos que se localizan fuera de la
bicapa de lípidos, ya sea en la superficie extracelular o la citoplásmica, pero que tienen enlaces covalentes con una molécula de lípidos que se sitúa dentro de la bicapa.
Proteínas integrales de membrana
La mayoría de las proteínas integrales de membrana participan
en las siguientes funciones: como receptores que se unen a sustancias específicas en la superficie de la membrana, como cana-
(b)
Proteínas periféricas
de membrana
Etn
P
Proteína fijada con GPI
0
C Etn P
Man
GlcNAc
0
0
Man
0
0
I
P
Man
P
Etn
Citoplasma
(c)
FIGURA 4-12 Tres clases de proteína de membrana. a) Por lo general, las
proteínas integrales contienen una o más hélices transmembranosas (véase
la figura 5-4 en relación con una excepción). b) Las proteínas periféricas se
unen mediante enlaces no covalentes con los grupos cabeza polares de la
bicapa de lípidos o una proteína integral de la membrana, o ambos. c) Las
proteínas fijadas con lípidos se unen a través de enlaces covalentes con un
grupo lipídico que reside en la membrana. El lípido puede ser fosfatidilinositol, un ácido graso o un grupo prenilo (un hidrocarburo de cadena larga
formado con unidades isoprenoides de cinco carbonos). I, inositol; GlcNAc,
N-acetilglucosamina; Man, manosa; Etn, etanolamina; GPI, glucosilfosfatidilinositol.
4.4 L A E S T R U C T U R A Y F U N C I O N E S D E L A S P R O T E Í N A S D E L A M E M B R A N A
les o transportadores implicados en el movimiento de iones y
solutos a través de la membrana, o como agentes que transfieren
electrones durante los procesos de fotosíntesis y respiración. Al
igual que los fosfolípidos de la bicapa, las proteínas integrales de
membrana también son anfipáticas y tienen porciones hidrófobas e hidrofílicas. Como se describe más adelante, las porciones
de una proteína integral de membrana que residen dentro de la
bicapa lipídica tienden a tener un carácter hidrófobo. Los residuos de aminoácidos de estos dominios transmembranosos forman interacciones de van der Waals con las cadenas acilo grasas
de la bicapa, lo cual sella a la proteína dentro de la “pared” de
lípidos de la membrana. Como resultado, se conserva la barrera permeable y la proteína queda en contacto directo con las
moléculas de lípido circundantes. Las moléculas de lípidos que
tienen una relación estrecha con una proteína de membrana
pueden tener un papel esencial en la actividad de la proteína.
Las porciones de la proteína integral de membrana que se proyectan hacia el citoplasma o el espacio extracelular tienden a ser
más parecidas a las proteínas globulares descritas en la sección
Exterior
Cara de fractura E
Cara de fractura P
Citoplasma
(a)
131
2.5. Estos dominios no embebidos en la membrana poseen a
menudo superficies hidrofílicas que interactúan con las sustancias hidrosolubles (sustratos de bajo peso molecular, hormonas
y otras proteínas) en el borde de la membrana. Varias familias
grandes de proteínas de membrana contienen un canal interior
que constituye una vía de paso acuosa a través de la bicapa de
lípidos. El recubrimiento de estos canales casi siempre contiene
residuos hidrofílicos en sitios clave. Como se describe más adelante, no es necesario que las proteínas integrales estén fijas, sino
que pueden moverse en sentido lateral dentro de la membrana
misma.
Distribución de proteínas integrales: análisis por congelamiento y fractura El concepto de que las proteínas penetran
las membranas en lugar de sólo mantenerse en la superficie de
ellas derivó sobre todo de los resultados de una técnica llamada
replicación con fractura-congelamiento (véase sección 18.2).
En este procedimiento, el tejido se congela y luego se golpea
con una navaja, lo cual fractura el bloque en dos fragmentos.
Cuando esto ocurre, el plano de fractura sigue a menudo un
trayecto entre las dos hojas de la bicapa lipídica (fig. 4-13a). Una
vez que las membranas se separan de esta manera, se depositan
metales sobre las superficies expuestas para formar una réplica
sombreada que se observa al microscopio electrónico (véase fig.
18-17). Como se muestra en la figura 4-13b, la réplica parece un
camino salpicado de guijarros, llamados partículas asociadas con
la membrana. Como el plano de fractura pasa por el centro de la
capa doble de lípidos, la mayoría de estas partículas corresponde
a proteínas integrales de la membrana que se extienden por lo
menos hasta la mitad de la distancia al centro lipídico. Cuando
el plano de fractura llega a una partícula determinada, la rodea
en lugar de partirla por la mitad. Por consiguiente, cada proteína
(partícula) se separa con una mitad de la membrana plasmática
(fig. 4-13c) y deja un hoyuelo correspondiente en la otra mitad
(véase fig. 7-30c). Uno de los grandes valores de la técnica por
congelamiento y fractura es que permite investigar la heterogeneidad microscópica de la membrana. Las diferencias localizadas
FIGURA 4-13 Congelamiento y fractura: una técnica para investigar la
P
(b)
Citoplasma
(c)
estructura de la membrana celular. a) Cuando un bloque de tejido congelado se golpea con la hoja de una navaja, un plano de fractura recorre el tejido y muchas veces sigue un trayecto que pasa por la parte intermedia de la
bicapa lipídica. El plano de fractura pasa alrededor de las proteínas en lugar
de romperlas por la mitad y se separan con alguna de las dos mitades de la
bicapa. Las caras expuestas en el centro de la bicapa pueden cubrirse con un
depósito metálico para formar una réplica metálica. Estas caras expuestas se
conocen como cara E, o ectoplásmica, y cara P, o protoplásmica. b) Réplica
de un eritrocito humano congelado y fracturado. La cara de fractura P se
ve cubierta con partículas de unos 8 nm de diámetro. Una pequeña cresta
(flecha) marca la unión de la cara de partículas con el hielo circundante.
c) Esta micrografía muestra la superficie de un eritrocito que se congeló y
luego fracturó, pero en lugar de preparar una réplica, la célula se descongeló,
fijó y trató con un marcador para los grupos carbohidrato que se proyectan
desde la superficie externa de la proteína integral glucoforina (fig. 4-17).
Los cortes delgados de la célula fracturada y marcada revelan que las moléculas de glucoforina (partículas negras) se separaron en forma preferencial
con la mitad externa de la membrana. La línea roja muestra el trayecto del
plano de fractura. (B, tomada de Thomas W. Tillack y Vincent T. Marchesi, J Cell Biol 45:649, 1970; C, tomada de Pedro Pinto Da Silva y
Maria R. Torrisi, J Cell Biol 93:467, 1982. B, C, con autorización de
los derechos reservados de Rockefeller University Press.)
132
Capítulo 4
L A E S T R U C T U R A Y F U N C I Ó N D E L A M E M B R A N A P L A S M ÁT I C A
en partes de la membrana sobresalen en estas réplicas y pueden
identificarse (como lo ilustra la réplica de una zona de oclusión
que se muestra en la figura 7-32d). En cambio, los análisis bioquímicos proporcionan un promedio de tales diferencias.
Bicapa
lipídica
Detergente
no iónico
Estudio de la estructura y propiedades
de las proteínas integrales de la membrana
A causa de sus dominios hidrófobos transmembranosos, las proteínas integrales de la membrana son difíciles de aislar en su
forma soluble. Por lo general, la extracción de estas proteínas de
la membrana requiere el uso de un detergente, como el detergente iónico (cargado) SDS (que desnaturaliza las proteínas) o
el no iónico (sin carga) Triton X-100 (que casi nunca altera la
estructura terciaria de la proteína).
CH3 (CH2)11 OSO3–Na+
Sulfato de dodecilo sódico (SDS)
CH3
Proteína de
la membrana
Proteína disuelta
con detergente
FIGURA 4-14 Disolución de las proteínas de membrana con detergentes.
Los extremos no polares de las moléculas de detergente se relacionan con
los residuos no polares de la proteína que estaban en contacto con las cadenas de ácido graso de la bicapa lipídica. En cambio, los extremos polares de
las moléculas detergentes interactúan con las moléculas de agua circundantes, lo que mantiene la proteína en solución. Como se muestra aquí, los
detergentes no iónicos disuelven las proteínas de membrana sin romper su
estructura.
CH3
CH3 C CH2 C
CH3
Solución
acuosa
(O
CH2
CH2)10
OH
CH3
Triton X-100
Al igual que los lípidos de la membrana, los detergentes son
anfipáticos y se componen de un extremo polar y una cadena de
hidrocarburo no polar (véase fig. 2-20). Como consecuencia
de esta estructura, los detergentes pueden sustituir a los fosfolípidos para estabilizar a las proteínas integrales mientras las vuelven solubles en solución acuosa (fig. 4-14). Una vez que las
proteínas ya se disolvieron por acción del detergente, pueden
realizarse varios procesos analíticos para identificar su composición de aminoácidos, masa molecular, secuencia de aminoácidos,
etcétera.
Los investigadores han tenido muchas dificultades para
obtener cristales de la mayoría de las proteínas integrales de la
membrana para usarlos en la cristalografía con rayos X. De
hecho, menos de 1% de las estructuras proteínicas de alta resolución conocidas representan proteínas integrales de membrana
(véase una galería actualizada en http://blanco.biomol.uci.edu/
Membrane_Proteins_xtal.html).2 Además, la mayoría de estas
estructuras representan versiones procariotas de una proteína
específica, que a menudo son más pequeñas que sus homólogas
eucariotas y más fáciles de obtener en grandes cantidades. Una
de las primeras proteínas de membrana cuya estructura tridimensional completa se conoció mediante cristalografía con
rayos X se muestra en la figura 4-15. Esta proteína, el centro de
2 Muchas proteínas integrales de membrana tienen una porción considera-
ble presente en el citoplasma o el espacio extracelular. En muchos casos, esta
porción soluble se separó del dominio transmembranoso, se cristalizó y se
identificó su estructura terciaria. Aunque esta técnica aporta datos valiosos
sobre la proteína, no suministra información sobre la orientación de la proteína dentro de la membrana. En la sección Vías experimentales de la página 173 se analiza otro método cristalográfico para el estudio de las proteínas
de membrana, en el que se usa el microscópio electrónico en vez de la
difracción de rayos X.
reacción fotosintético bacteriano, posee tres subunidades que
contienen 11 hélices alfa que cruzan toda la membrana. Algunas
de las dificultades técnicas para preparar cristales de proteínas de
membrana se han salvado con las nuevas metodologías y con
grandes esfuerzos. Por ejemplo, en un estudio reciente los investigadores pudieron obtener cristales de alta calidad de un transportador bacteriano después de probar y depurar más de 95 000
condiciones diferentes para la cristalización. A pesar del éxito
creciente obtenido en la cristalización de proteínas, los investigadores aún dependen en buena medida de técnicas indirectas
para conocer la organización tridimensional de la mayoría de las
proteínas de membrana. En los párrafos siguientes se analizan
algunas de estas medidas.
FIGURA 4-15 Proteína integral que reside en la membrana plasmática.
Estructura terciaria del centro de la reacción fotosintética de una bacteria
reconocida por cristalografía por rayos X. La proteína contiene tres polipéptidos diferentes que cruzan la membrana, mostrados en amarillo, azul
claro y azul oscuro. Es evidente la naturaleza helicoidal de cada uno de los
segmentos transmembranosos. (Tomada de G. Feher, J. P. Allen, M. Y.
Okamura et al.; reimpresa con autorización de Nature 339:113,
1989; © 1989, Macmillan Magazines Limited.)
133
4.4 L A E S T R U C T U R A Y F U N C I O N E S D E L A S P R O T E Í N A S D E L A M E M B R A N A
Arriba
Exterior
Citoplasma
3
4
1
3
2
4
5
1
5
1 2
Control
(a)
FIGURA 4-16 Procedimiento experimental para identificar la orientación
de la proteína dentro de una membrana plasmática. La membrana hipotética que se estudia contiene cinco proteínas distintas. a) El tratamiento de
las células intactas con la enzima no penetrante tripsina produce digestión
de las porciones de las proteínas que se proyectan hacia el medio externo.
En cambio, cuando una célula que se volvió permeable (por extracción con
detergentes no iónicos o por exposición a un medio hipotónico), las porciones de las proteínas de membrana que se proyectan al citoplasma también
Determinación de la lateralidad de la membrana. ¿Qué partes de
una proteína integral de membrana se proyectan en el citoplasma y cuáles sobresalen hacia el exterior de la célula? La respuesta puede obtenerse en forma experimental con agentes no
penetrantes que marcan o modifican las proteínas. ¿Qué sucedería si una preparación de células intactas se tratara con una
enzima proteolítica, como la tripsina, que es demasiado grande
para penetrar la membrana plasmática (fig. 4-16a, flecha superior)? Las partes de las proteínas de membrana que se sitúan en
la superficie externa de la bicapa de lípidos se someterían a la
digestión por la enzima agregada, pero las partes interiores de
la bicapa o en la cara citoplásmica de la membrana quedarían
intactas. El efecto del tratamiento puede vigilarse si se extraen
las proteínas y se las somete a electroforesis en gel con SDSpoliacrilamida (se describe con detalle en la sección 18.7). Las
proteínas de las que se digirió una proporción significativa de
su estructura migrarían a una posición más baja en el gel que la
misma proteína de una membrana no tratada (fig. 4-16b). Para
establecer si una porción de una proteína sobresale por la cara
citoplásmica de la membrana, las células pueden volverse permeables mediante el tratamiento con detergentes no iónicos o
por choque osmótico (véase fig. 4-31b). En estas condiciones, la
membrana plasmática ya no actúa como barrera a la penetración
de la enzima proteolítica, por lo que las porciones citoplásmicas de
la proteína también se someten a la digestión (porciones inferiores en la figura 4-16a, b).
Identificación de dominios transmembranosos. ¿Qué segmentos
de la cadena polipeptídica están incrustados en la bicapa de lípidos? La identificación de estos dominios transmembranosos
casi siempre se predice con base en la secuencia de aminoácidos
de la proteína, la cual se infiere de la secuencia de nucleótidos de
un gen aislado. Los segmentos de una proteína que se presupo-
3
4
1
5
la
a da
ina za
ps ili
tri eab
de rm
ón pe
ici la
Ad célu
5
2
Ad
a ició
la n
cé d
lul e t
a rip
int si
ac na
ta
2
Abajo
3
4
Tratamiento con tripsina de célula control
2
3
4
2,3,4
Tratamiento con tripsina
de célula permeabilizada
(b)
son accesibles a la digestión proteolítica. b) Esquema de los resultados de la
electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) que muestra
el patrón de bandas obtenido del experimento descrito en a. La velocidad
con la que una proteína migra durante la electroforesis es inversamente proporcional a su masa molecular. Por lo tanto, la eliminación de partes de la
proteína hace que se mueva con más rapidez hacia el fondo del gel. La figura
4-31c muestra un ejemplo de un gel SDS-PAGE.
ne cruzan la membrana casi siempre consisten en una cadena
de alrededor de 20 aminoácidos de predominio no polar que
adoptan una estructura secundaria helicoidal alfa.3 La figura
4-17 muestra la estructura química de una sola hélice transmembranosa, que tiene la estructura bidimensional de la glucoforina A, la principal proteína integral de la membrana plasmática
eritrocitaria. De los 20 aminoácidos que constituyen la única
hélice alfa de la glucoforina (aminoácidos 73 a 92 de la figura
4-17), todos excepto tres tienen cadenas laterales hidrófobas (o
un átomo H en el caso de los residuos de glicina). Las excepciones son serina y treonina, que son residuos sin carga localizados
principalmente en el extremo del segmento embebido cerca de
los grupos cabeza lipídicos.
Al conocer la secuencia de aminoácidos de una proteína
integral de la membrana, casi siempre pueden identificarse los
segmentos transmembranosos si se utiliza la gráfica hidropática,
en la que a cada sitio del polipéptido se le asigna un valor que
proporciona una medida de la hidrofobicidad del aminoácido en
ese sitio, así como la de sus vecinos. Esta técnica suministra un
“promedio continuo” de la hidrofobia de secciones cortas del
3 En la página 55 se señaló que la hélice alfa es una conformación favorecida
porque permite la formación de un número máximo de enlaces hidrógeno
entre los residuos de aminoácidos vecinos, lo que crea una configuración
muy estable (de baja energía). Esto adquiere importancia particular para un
polipéptido que abarca la membrana y está rodeado por cadenas de ácido
graso, por lo que no puede formar enlaces de hidrógeno con un solvente
acuoso. Las hélices transmembranosas tienen por lo menos 20 aminoácidos
de longitud porque ésta es la extensión mínima de un polipéptido capaz de
abarcar la bicapa de lípidos de 30 Å de espesor. Se ha encontrado que unas
pocas proteínas integrales de membrana contienen hélices que penetran la
bicapa pero no la atraviesan. Un ejemplo es la hélice P de la figura 4-38.
134
Capítulo 4
L A E S T R U C T U R A Y F U N C I Ó N D E L A M E M B R A N A P L A S M ÁT I C A
Superficie exterior
IIe
Tir
Leu Ile
Fen IIe
Gli
Val 80
Ala
Met
Bicapa
Gli
Tir
Ile
Ile
90 Leu Leu
lle
–
+
Pro Ser
–
+
–
+
Lis Lis
–
+
Arg
Leu Arg
Ser
Superficie interior
(citosol)
Ile
Determinación de la relación espacial dentro de una proteína integral de membrana. Supóngase que ya se aisló el gen para una
proteína integral de la membrana y, con base en su secuencia de
nucleótidos, se establece que contiene cuatro hélices alfa aparentes que cruzan la membrana. Tal vez se desearía conocer la
orientación de estas hélices entre ellas y qué lado de la cadena de aminoácido de cada cara de la hélice se proyecta hacia el
ambiente lipídico. Aunque estas determinaciones son difíciles
de realizar sin modelos estructurales detallados, puede obtenerse información relevante por la mutagénesis dirigida a sitios
G
específicos, es decir, mediante la introducción de cambios en el
gen que codifica la proteína (sección 18.18). Por ejemplo, puede
usarse la mutagénesis dirigida a un sitio específico para sustituir
los residuos de aminoácidos en hélices vecinas con residuos de
cisteína. Como se explica en la página 53, dos residuos de cisteína son capaces de formar un puente disulfuro covalente. Si dos
hélices transmembranosas de un polipéptido tienen un residuo
de cisteína cada una y estos dos residuos de cisteína pueden formar un puente disulfuro entre sí, estas hélices deben estar muy
0
G
+
_
Hidrofobicidad
polipéptido y garantiza que uno o algunos aminoácidos polares de una secuencia no alteren el perfil de todo el segmento.
La hidrofobicidad de los aminoácidos puede determinarse con
varios criterios, como su solubilidad en lípidos o la energía necesaria para transferirlos de un medio acuoso a uno lipídico. La
figura 4-18 muestra una gráfica de hidropatía para la glucoforina A. Por lo general, los segmentos transmembranosos se
identifican como el pico irregular que se extiende dentro del lado
hidrófobo del espectro. Las más de las veces puede formularse una
suposición racional de la orientación del segmento transmembranoso dentro de la bicapa si se examina la naturaleza de los residuos
de aminoácidos que flanquean dicho segmento. En la mayoría de los casos, como se ilustra con la glucoforina en la figura
4-17, esas partes del polipéptido en el flanco citoplásmico de un
segmento transmembranoso tienden a mostrar una carga más
positiva que los que están en el flanco extracelular.
No todas las proteínas integrales de membrana contienen
hélices alfa transmembranosas. Varias proteínas de membrana
poseen un canal relativamente grande situado al interior de un
círculo de cadenas beta que cruzan la membrana organizadas
en forma de barril, como se ilustra en la figura 5-4. Hasta ahora
sólo se han encontrado los canales acuosos formados por barriles beta en las membranas externas de bacterias, mitocondrias y
cloroplastos.
FIGURA 4-17 Glucoforina A, una proteína integral con
un solo dominio transmembranoso. La hélice alfa única
que pasa por la membrana consiste sobre todo en residuos hidrófobos. Los cuatro residuos de aminoácidos con
carga positiva del dominio citoplásmico de la membrana forman enlaces iónicos con los grupos cabeza de los
lípidos que tienen cargas negativas. Los carbohidratos se
unen con varios residuos de aminoácidos en la superficie
externa de la proteína (mostrada en el inserto). Excepto
por uno, los 16 oligosacáridos son cadenas pequeñas con
enlace O (la excepción es un oligosacárido más grande
enlazado con el residuo de asparagina en la posición 26).
El papel de la glucoforina en la membrana eritrocitaria se
describe en la página 146.
Gli Val
50
100
# de residuo de aminoácido
Extremo C
Extremo N
FIGURA 4-18 Gráfica de hidropatía para la glucoforina A, una proteína
única que cruza la membrana. La hidrofobia se mide por la energía libre
requerida para transferir cada segmento del polipéptido de un solvente no
polar a un medio acuoso. Los valores por arriba de la línea cero requieren
energía (+ΔG), lo que indica que consisten en series de aminoácidos que
tienen cadenas laterales de predominio no polar. Los picos que se proyectan
por arriba de la línea roja se interpretan como un dominio transmembranoso.
4.4 L A E S T R U C T U R A Y F U N C I O N E S D E L A S P R O T E Í N A S D E L A M E M B R A N A
XI
XII
X
IX
52
245
II
VII
53
242
VIII
29
28
I
III
V
VI
IV
FIGURA 4-19 Determinación del empaque de hélices en una proteína de
membrana por enlaces cruzados dirigidos a un sitio. En estos experimentos se introducen pares de residuos de cisteína en la proteína por mutagénesis dirigida a un sitio particular y se identifica la capacidad de las cisteínas
para establecer enlaces disulfuro. Las gráficas de hidropatía y otros datos
indican que la permeasa de lactosa tiene 12 hélices transmembranosas. Se
encontró que una cisteína introducida en la posición 242 de la hélice VII
puede establecer enlaces cruzados con la cisteína introducida en la posición
28 o 29 de la hélice I. Una cisteína en la posición 245 de la hélice VII puede
establecer enlaces cruzados con las cisteínas en la posición 52 o 53 de la
hélice II. Así se establece la proximidad de estas tres hélices. (La estructura
por rayos X de esta proteína se publicó en 2003.) (Reimpresa a partir de
H. R. Kaback, J. Voss y J. Wu; Curr Opin Struct Biol 7:539, 1997; ©
1997, con autorización de Elsevier Science.)
135
próximas entre sí. En la figura 4-19 se muestran los resultados
de un estudio de enlaces cruzados dirigidos a sitios específicos
sobre la permeasa de lactosa, una proteína transportadora de
azúcar de las membranas celulares bacterianas. En este caso se
encontró que la hélice VII está muy cercana a las hélices I y II.
La identificación de las relaciones espaciales entre los aminoácidos en una proteína de membrana puede aportar más que
datos estructurales; puede informar a un investigador sobre
algunos de los fenómenos dinámicos que ocurren cuando una
proteína lleva a cabo su función. Una forma de conocer la distancia entre residuos seleccionados de una proteína consiste en
introducir grupos químicos cuyas propiedades sean sensibles a la
distancia que los separa. Los nitróxidos son grupos químicos que
contienen un electrón non, lo cual produce un espectro característico cuando se evalúa con una técnica llamada espectroscopia
por resonancia paramagnética electrónica (EPR). Puede introducirse un grupo nitróxido en cualquier sitio en una proteína si
primero se muta ese sitio para que tenga una cisteína y luego se
une el nitróxido al grupo —SH del residuo de cisteína. La figura 4-20 muestra cómo se usó esta técnica para descubrir los
cambios en la conformación que ocurren en una proteína de
membrana cuando su canal se abre como respuesta a los cambios
en el pH del medio. La proteína en cuestión, un canal bacteriano
para el potasio, es un tetrámero compuesto por cuatro subunidades idénticas. La abertura citoplásmica al canal está limitada por
cuatro hélices transmembranosas, una de cada subunidad de la
proteína. La figura 4-20a muestra los espectros EPR que se obtuvieron cuando se introdujo un nitróxido cerca del extremo citoplásmico de cada hélice transmembranosa. La línea roja muestra
el espectro obtenido a pH 6.5 cuando el canal está cerrado y
la línea azul el espectro a pH 3.5 cuando el canal está abierto.
Medio externo
Vía de
permeabilidad
Ion K+
deshidratado
pH 3.5
pH 6.5
(a)
Membrana
plasmática
FIGURA 4-20 Uso de la espectroscopia por RPE
para vigilar los cambios de la conformación de un
canal iónico bacteriano para K+ cuando se abre
y cierra. a) Espectros por RPE de los nitróxidos
que se unieron con residuos de cisteína cerca del
extremo citoplásmico de las cuatro hélices transResiduo de cisteína
membranosas que recubren el canal. El residuo
marcado con nitróxido
de cisteína de cada hélice sustituye a un residuo de
Ion K+
glicina que normalmente ocupa esa posición. Las
hidratado
CERRADO
ABIERTO
formas de los espectros dependen de las distancias
entre los electrones nones en los nitróxidos en las
Citoplasma
diferentes subunidades. (Los nitróxidos se descri(b)
ben como “etiquetas de giro” y esta técnica se conoce como etiquetado de giro dirigido a un sitio.) b)
movimiento de los cuatro grupos nitróxido para separarse unos de otros. (A,
Un modelo muy esquemático del canal iónico en sus estados abierto y cerratomada de E. Perozo et al., Nature Struct Biol 5:468, 1998.)
do con base en los datos de la parte a. La abertura del canal se acompaña del
136
Capítulo 4
L A E S T R U C T U R A Y F U N C I Ó N D E L A M E M B R A N A P L A S M ÁT I C A
La forma de cada línea depende de la proximidad de los nitróxidos entre sí. El espectro es más ancho en un pH de 6.5 porque
los grupos nitróxido de las cuatro subunidades están más próximos entre sí. El espectro es más amplio a pH de 6.5 porque los
grupos nitróxido sobre las cuatro subunidades están más cerca
entre sí a este pH, lo cual disminuye la intensidad de sus señales
de EPR. Estos resultados indican que la activación del canal se
acompaña de un aumento de la separación entre los residuos
marcados de las cuatro subunidades (fig. 4-20b). Un aumento
del diámetro de la abertura del canal permite que los iones del
citoplasma lleguen a la vía permeable real (mostrada en rojo)
dentro del canal, lo que posibilita sólo el paso de los iones K+
(descrito en la página 153). También puede recurrirse a una técnica alternativa, llamada FRET, para medir los cambios en la
distancia entre los grupos marcados dentro de una proteína,
como se ilustra en la figura 18-8.
Proteínas periféricas de membrana
Las proteínas periféricas se relacionan con la membrana mediante enlaces electrostáticos débiles (véase la figura 4-12b). Por lo
general, las proteínas periféricas pueden solubilizarse mediante
la extracción con soluciones salinas en altas concentraciones que
debilitan los enlaces electrostáticos que mantienen las proteínas
periféricas en una membrana. En realidad, la distinción entre las
proteínas integrales y periféricas es vaga porque muchas proteínas integrales de membrana están formadas por varios polipéptidos, algunos de los cuales penetran la bicapa lipídica y otros
permanecen en la periferia.
Las proteínas periféricas mejor estudiadas se localizan en
la superficie interna (citosólica) de la membrana plasmática,
donde forman una red fibrilar que actúa como “esqueleto” de la
membrana (véase fig. 4-31d). Estas proteínas brindan soporte
mecánico a la membrana y funcionan como un ancla para las
proteínas integrales. Otras proteínas periféricas en la superficie
interna de la membrana plasmática funcionan como enzimas,
cubiertas especializadas (véase fig. 8-24) o factores que transmiten señales transmembranosas (véase fig. 15-17). Por lo general, las proteínas periféricas tienen una relación dinámica con
la membrana, se atraen hacia la membrana o se liberan de ésta,
según sean las condiciones prevalecientes.
Proteínas de membrana fijadas a lípidos
Se pueden distinguir varios tipos de proteínas de membrana
fijadas a lípidos. Muchas proteínas presentes en la superficie
externa de la membrana plasmática están unidas a ésta mediante un pequeño oligosacárido complejo unido con una molécula
de fosfatidilinositol que está incrustada en la hoja externa de la
bicapa lipídica (véase fig. 4-12c). Las proteínas periféricas de
membrana que contienen este tipo de enlace glucosilfosfatidilinositol se llaman proteínas fijadas con GPI. Éstas fueron descubiertas cuando se demostró que ciertas proteínas de membrana
podían liberarse con una fosfolipasa que reconociera y separara
en forma específica los fosfolípidos que contenían inositol. La
proteína celular normal de la encefalopatía espongiforme ovina PrPC (pág. 65) es una molécula unida por GPI, al igual que
varios receptores, enzimas y proteínas de adhesión celular. Un
raro tipo de anemia, la hemoglobinuria paroxística nocturna, se
debe a la deficiencia de la síntesis de GPI que vuelve a los eritrocitos susceptibles a la lisis.
Otro grupo de proteínas presente en el lado citoplásmico de
la membrana plasmática está fijado a la membrana mediante
una o más cadenas largas de hidrocarburos embebidas en la hoja
interna de la bicapa lipídica (véase fig. 4-12c). Por lo menos dos
proteínas relacionadas de esta forma con la membrana plasmática (Src y Ras) se han referido en la transformación de una célula
normal en una maligna.
REVISIÓN
?
1. ¿Por qué son necesarios los detergentes para disolver
las proteínas de membrana?, ¿cómo podría identificarse
la diversidad de proteínas integrales que residen en una
fracción purificada de membrana?
2. ¿Cómo puede determinarse: a) la lateralidad de la membrana; b) la localización de los segmentos transmembranosos en la secuencia de aminoácidos, o c) las
localizaciones relativas de las hélices transmembranosas?
3. ¿Qué significa la declaración de que las proteínas de una
membrana se distribuyen en forma asimétrica?, ¿también
es verdad esto para los carbohidratos de la membrana?
4. Describa las propiedades de las tres clases de proteínas
de membrana (integrales, periféricas y fijadas a lípidos),
en qué difieren entre sí y cómo varían las de cada grupo
individual.
4.5 LÍPIDOS DE MEMBRANA Y FLUIDEZ
DE LA MEMBRANA
El estado físico del lípido de una membrana se describe
por su fluidez (o viscosidad).4 Considérese una bicapa artificial
simple formada por fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina,
cuyos ácidos grasos sean en su mayoría insaturados. Si la temperatura de la bicapa se mantiene relativamente tibia (p. ej., 37°C),
el lípido se encuentra en un estado líquido (fig. 4-21a). En esta
temperatura, la bicapa de lípidos puede describirse como un
cristal líquido bidimensional. Como en un cristal, las moléculas
aún permanecen en una orientación específica; en este caso, los
ejes longitudinales de las moléculas tienden a mantener una disposición paralela, aunque los fosfolípidos individuales pueden
rotar alrededor de su eje o moverse en sentido lateral dentro del
plano de la bicapa. Si la temperatura se reduce con lentitud, se
llega a un punto en el que la bicapa muestra cambios distintivos
(fig. 4-21b). El lípido pasa de una fase cristalina líquida a un gel
cristalino congelado en el que se limita en gran proporción el
movimiento de las cadenas de ácido graso del fosfolípido. La
temperatura en la que ocurre este cambio se llama temperatura
de transición.
4 La fluidez y la viscosidad mantienen una relación inversa; la fluidez es la
medida de la facilidad para fluir y la viscosidad es la medida de la resistencia
al flujo.
4.5 L Í P I D O S D E M E M B R A N A Y F L U I D E Z D E L A M E M B R A N A
(a)
FIGURA 4-21 La estructura de la bicapa lipídica depende de la tempe-
137
(b)
ratura. La bicapa que se muestra se compone de dos fosfolípidos: fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina. a) Por arriba de la temperatura de
transición, las moléculas de lípido y sus colas hidrófobas son libres de moverse en ciertas direcciones, aunque conservan un grado de orden considerable.
b) Por debajo de la temperatura de transición, se limita mucho el movimiento de las moléculas y toda la bicapa puede describirse como un gel cristalino. (Tomada de R. N. Robertson. The lively membranes, Cambridge
University Press, 1983. Reimpresa con autorización de Cambridge University Press.)
La temperatura de transición de una bicapa particular
depende de la capacidad de las moléculas de lípido para agruparse, lo que a su vez depende de los lípidos particulares con los
que está formada. Los ácidos grasos saturados tienen la forma
de un bastón recto y flexible. Por otro lado, los ácidos grasos
cis-insaturados tienen dobleces en los sitios con doble enlace
(figs. 2-19 y 4-21). Por consiguiente, los fosfolípidos con cadenas saturadas se agrupan con mayor firmeza que los que poseen
cadenas insaturadas. Mientras mayor sea el grado de insaturación de los ácidos grasos de la bicapa, menor es la temperatura
antes que la bicapa se gelifique. La introducción de un enlace
doble en una molécula de ácido esteárico disminuye la temperatura de fusión casi 60°C (cuadro 4-2).5 Otro factor que influye
en la fluidez de la bicapa es la longitud de la cadena de ácidos
grasos. Mientras más cortas sean las cadenas de ácidos grasos
de un fosfolípido, es menor la temperatura de fusión. El estado
físico de la membrana también lo modifica el colesterol. A causa
de su orientación dentro de la bicapa (fig. 4-7), las moléculas de
colesterol interrumpen el empaque ajustado de las cadenas acilo
grasas e interfieren con su movilidad. La presencia de colesterol
tiende a suprimir las temperaturas de transición precisas y crea
una condición de fluidez intermedia. En términos fisiológicos,
el colesterol tiende a aumentar la durabilidad y atenuar la permeabilidad de una membrana.
brana establece un compromiso perfecto entre una estructura
rígida y ordenada, en la que la movilidad sería nula, y un líquido
completamente fluido, sin viscosidad, en el que los componentes
de la membrana no podrían orientarse ni existirían organización
estructural ni soporte mecánico. Además, la fluidez permite las
interacciones dentro de la membrana. Por ejemplo, este estado de la membrana hace posible que los cúmulos de proteínas
de membrana se ensamblen en sitios particulares dentro de la
membrana y formen estructuras especializadas, como las uniones intercelulares, los complejos fotosintéticos que captan luz y
las sinapsis. Gracias a la fluidez de la membrana, las moléculas
que interactúan pueden reunirse, llevar a cabo la reacción necesaria y separarse.
La fluidez también tiene un papel clave en la formación
de la membrana, un tema que se trata en el capítulo 8. Las
membranas sólo se originan de membranas preexistentes y su
crecimiento se logra mediante la inserción de componentes lipídicos y proteicos en la matriz fluida de la hoja membranosa.
Muchos de los procesos celulares más elementales, incluidos el
movimiento, el crecimiento, la división celular, la formación de
uniones entre células, la secreción y la endocitosis, dependen del
movimiento de los componentes de la membrana y es probable
que resultaran imposibles si las membranas fueran estructuras
rígidas y no fluidas.
La importancia de la fluidez de la membrana
¿Qué efecto tiene el estado físico de la bicapa lipídica en las
propiedades biológicas de la membrana? La fluidez de la mem5 El efecto de la saturación del ácido graso en la temperatura de fusión se
ilustra con productos alimentarios familiares. Los aceites vegetales permanecen líquidos en el refrigerador, mientras que la margarina es un sólido.
Los aceites vegetales contienen ácidos grasos poliinsaturados, en tanto que
los ácidos grasos de la margarina se saturaron por un proceso químico
que hidrogena los enlaces dobles de los aceites vegetales empleados como
materia prima.
Cuadro 4-2
Puntos de fusión de ácidos grasos
de 18 carbonos frecuentes
Ácido graso
Enlaces
dobles cis
Ácido esteárico
Ácido oleico
Ácido linoleico
Ácido linolénico
Ácido eicosapentanoico (EPA)*
*El EPA tiene 20 carbonos.
0
1
2
3
5
Punto de
fusión (°C)
70
13
–9
–17
–54
138
Capítulo 4
L A E S T R U C T U R A Y F U N C I Ó N D E L A M E M B R A N A P L A S M ÁT I C A
Mantenimiento de la fluidez de la membrana
La asimetría de los lípidos de membrana
La bicapa de lípidos consiste en dos hojas distintas que tienen
una composición lipídica muy diferente. Una línea de experimentos que lleva a esta conclusión aprovecha el hecho de que las
enzimas que digieren lípidos no pueden penetrar la membrana
plasmática y, en consecuencia, sólo pueden digerir los lípidos
que están en la hoja externa de la bicapa. Si se tratan eritrocitos
intactos con fosfolipasa para digerir los lípidos, se hidroliza casi
80% de la fosfatidilcolina (PC) de la membrana, pero sólo ataca
a 20% de la fosfatidiletanolamina (PE) de la membrana y menos
de 10% de la fosfatidilserina (PS). Estos datos indican que, en
comparación con la hoja interna, la exterior tiene una concentración relativamente alta de PC (y esfingomielina) y una concentración baja de PE y PS (fig. 4-22). De lo anterior se deduce
que puede pensarse que la bicapa de lípidos está compuesta por
dos capas sencillas independientes más o menos estables con
propiedades físicas y químicas diferentes.
Todos los glucolípidos de la membrana plasmática están
en la hoja externa, donde es probable que sirvan como receptores para los ligandos extracelulares. La fosfatidilserina, que se
concentra en la hoja interna, tiene una carga negativa en el pH
fisiológico, lo que la hace candidata para unirse con residuos de
lisina y arginina que tienen carga positiva, como los adyacentes
SM
% del lípido total de membrana
La temperatura interna de la mayoría de los organismos (distintos a las aves y mamíferos) fluctúa con la temperatura del
ambiente exterior. Puesto que para muchas actividades es indispensable que las membranas de una célula permanezcan en
estado fluido, las células responden a las condiciones cambiantes
mediante la alteración de los tipos de fosfolípidos de los cuales
se componen. El mantenimiento de la fluidez de la membrana
es un ejemplo de homeostasis a nivel celular y puede demostrarse de varias maneras. Por ejemplo, si se reduce la temperatura de
un cultivo celular, las células tienen una respuesta metabólica.
La respuesta inicial de “emergencia” está mediada por las enzimas que remodelan las membranas, lo que vuelve a la célula más
resistente al frío. La remodelación se logra mediante: a) desaturación de enlaces simples en las cadenas acilo grasas para formar
enlaces dobles, y b) el recambio de las cadenas entre diferentes
moléculas de fosfolípido para producir otra que contenga dos
ácidos grasos insaturados, lo que reduce en gran medida la temperatura de fusión de la bicapa. La desaturación de los enlaces
sencillos para formar enlaces dobles está catalizada por enzimas
llamadas desaturasas. El recambio se logra mediante la acción de
fosfolipasas, que dividen a los ácidos grasos de la base de glicerol,
y aciltransferasas, que los transfieren a un fosfolípido diferente.
Además, la célula cambia los tipos de fosfolípidos que se sintetizan en favor de aquellos que contengan más ácidos grasos
insaturados. Como resultado de las actividades de estas enzimas
diversas, las propiedades físicas de las membranas de una célula se adaptan a las condiciones ambientales prevalecientes. El
mantenimiento de las membranas fluidas mediante el ajuste de
la composición de acilos grasos ya se demostró en diversos organismos, incluidos mamíferos en hibernación, peces que viven en
estanques cuya temperatura corporal cambia en grado notorio
del día a la noche, plantas resistentes al frío y bacterias que viven
en manantiales de agua caliente.
Exoplásmico
25
PC
PS
PE
PI
Cl
0
25
Citosólico
FIGURA 4-22 Distribución asimétrica de los fosfolípidos (y el colesterol)
en la membrana plasmática de los eritrocitos humanos. (SM, esfingomielina; PC, fosfatidilcolina; PS, fosfatidilserina; PE, fosfatidiletanolamina; PI,
fosfatidilinositol; Cl, colesterol.)
a la hélice alfa de la glucoforina A que cruza la membrana en
la figura 4-17. La aparición de PS en la superficie externa de
los linfocitos viejos marca estas células para que las destruyan los
macrófagos, en tanto que su aparición en la superficie externa de
las plaquetas conduce a la coagulación sanguínea. El fosfatidilinositol, que se concentra en la hoja interna, tiene un papel clave
en la transferencia de estímulos de la membrana plasmática al
citoplasma (sección 15.3).
Balsas lipídicas
Periódicamente surge un tema que divide a la comunidad de
biólogos celulares en creyentes y no creyentes. El tema de las
balsas de lípidos cae en esta categoría. Cuando los lípidos de la
membrana se extraen de las células y se usan para crear bicapas
lipídicas artificiales, colesterol y fosfolípidos tienden a autoensamblarse en microdominios que están más gelificados y altamente ordenados que las regiones circundantes, que consisten
en mayor medida en fosfoglicéridos. Debido a sus propiedades
físicas distintivas, tales microdominios tienden a flotar dentro
del ambiente más fluido y desordenado de la bicapa artificial
(fig. 4-23a). Como resultado, estos parches de colesterol y esfingolípido se denominan balsas lipídicas. Cuando se agregan a
estas bicapas artificiales, determinadas proteínas tienden a concentrarse en las balsas, mientras que otras tienden a permanecer
fuera de sus fronteras. Las proteínas ancladas a GPI muestran
una especial afinidad por las regiones ordenadas de la bicapa
(fig. 4-23a).
Surge la controversia acerca de si en las células vivas existen
tipos similares de balsas lipídicas ricas en colesterol, como la que
se ilustra en la figura 4.23b. La mayoría de las pruebas a favor
de las balsas lipídicas proviene de estudios en que se emplean
tratamientos artificiales, como extracción con detergente o
agotamiento de colesterol, lo cual hace que los resultados sean
difíciles de interpretar. Los intentos por demostrar la presen-
4.6 L A N AT U R A L E Z A D I N Á M I C A D E L A M E M B R A N A P L A S M ÁT I C A
139
Proteína fijada
con GPI
Proteína de
señalización
(b)
(a)
FIGURA 4-23 Balsas lipídicas. a) Imagen de la superficie de una bicapa de
lípidos que contiene fosfatidilcolina, la cual se ve como el fondo negro, y
moléculas de esfingomielina, que se organizan en forma espontánea en las
balsas de color naranja. Los picos amarillos muestran las posiciones de una
proteína fijada con GPI, que se relaciona casi en forma exclusiva con las balsas. Esta imagen se obtuvo mediante un microscopio de fuerza atómica, que
mide la altura de varias partes de la muestra al nivel molecular. b) Modelo
esquemático de una balsa lipídica dentro de una célula. La hoja externa de
la balsa consiste sobre todo en colesterol y esfingolípidos (grupos cabeza
rojos). Las moléculas de fosfatidilcolina (grupos cabeza azules) con ácidos
cia de balsas lipídicas en células vivas por lo general han sido
infructuosos, lo cual podría significar que tales balsas no existen
o que son tan pequeñas (5 a 25 nm de diámetro) y efímeras que
resulta difícil detectarlas con las técnicas actuales. El concepto de balsas de lípido es muy atractivo porque proporciona un
medio para introducir orden en un mar aparentemente aleatorio
de moléculas de lípido. Se postula que dichas balsas sirven como
plataformas flotantes que concentran proteínas específicas, con
lo cual organizan la membrana en compartimientos funcionales
(fig. 4-23b). Por ejemplo, se piensa que las balsas lipídicas proporcionan un ambiente local favorable para que los receptores
de superficie celular interactúen con otras proteínas de membrana que transmiten señales desde el espacio extracelular hacia
el interior de la célula.
RE V I SI Ó N
?
1. ¿Cuál es la importancia de la insaturación de los ácidos grasos para la fluidez de la membrana y las enzimas
que son capaces de disminuir la saturación de los ácidos
grasos?
2. ¿A qué se refiere la temperatura de transición de la membrana y cómo la afectan el grado de saturación o la lon-
grasos saturados de cadena larga también tienden a concentrarse en esta
región. Una proteína fijada con GPI se localiza en la balsa. Los lípidos de la
hoja externa de la balsa tienen un efecto organizador en los lípidos de la hoja
interna. Como resultado, los lípidos de la balsa de la hoja interna consisten
sobre todo en colesterol y glicerofosfolípidos con colas acilo grasas saturadas. La hoja interna tiende a concentrar las proteínas fijadas con lípidos
(como la cinasa Src), que participan en las señales celulares. (A, tomada de
D. E. Saslowsky, et al., J Biol Chem 277, cover of #30, 2002; cortesía
de J. Michael Edwardson.)
gitud de las cadenas acilo grasas?, ¿qué relevancia tienen
estas propiedades en la formación de las balsas lipídicas?
3. ¿Por qué es importante la fluidez de la membrana para
la célula?
4. ¿Cómo es posible que los dos lados de una bicapa lipídica tengan diferentes cargas iónicas?
4.6 LA NATURALEZA DINÁMICA
DE LA MEMBRANA PLASMÁTICA
Con base en la descripción previa, resulta aparente que
la bicapa lipídica puede existir en un estado relativamente fluido.
Como resultado, un fosfolípido puede moverse en sentido lateral dentro de la misma hoja con facilidad considerable. La movilidad de las moléculas individuales de lípidos dentro de la bicapa
de la membrana plasmática puede observarse en forma directa
al microscopio si se unen las cabezas polares de los lípidos con
partículas de oro o compuestos fluorescentes (véase fig. 4-28).
Se estima que un fosfolípido puede difundirse de un extremo
de una bacteria al otro en uno o dos segundos. En cambio,
se requieren horas a días para que una molécula de fosfolípido se
mueva a través de la otra hoja. Por lo tanto, de todos los movi-