Bases
I.
Culture cellulaire
Contrairement aux bactéries, le temps de dédoublement est beaucoup plus lent pour les
cellules (di9érence entre procaryotes et eucaryotes).
Si on laisse les cellules trop longtemps à la phase de « plateau » elles vont mourir à cause
du phénomène contact. Les eucaryotes entrent en sénescences au bout d’un moment.
Le milieu de culture est rouge car il s’agit d’un indicateur coloré informant sur le pH, cela
permet de savoir si des bactéries sont présentent en révélant la sécrétion de toxines
acides. On retrouve dans le milieu du sérum de vœu fœtal pour avoir des facteurs de
croissances, des nutriments, des antifongiques et antibiotiques. Depuis la vache folle
(année 2000), on ne peut plus utiliser le sérum de vœu fœtal, que l’on a remplacé par du
lysat plaquettaire. Le lysat plaquettaire est obtenu à partir d’un pool de 250 patients
auxquelson récupère les plaquettes que l’on lyse. Il existe également des milieux
synthétiques dont la composition n’est pas encore connue.
On lave le milieu/cellules avec une solution équilibrée en sel ce qui permet d’éviter
d’hypotonie des cellules. Le problème de cette solution est qu’elle ne contient ni
magnésium, ni calcium cela permet d’aider les cellules à se détacher. En e9et, le
magnésium et le calcium favorisent l’adhérence cellulaire. On lave avec de la trypsine
pour éliminer les traces de sérum.
On utilise du Tryptan qui pénètre dans toutes les cellules pour savoir si elles sont vivantes
ou non :
- Les cellules mortes sont bleues au bleu : Impossibilité d’expulser le Tryptan
- Seules les cellules vivantes sont transparentes : capables d’expulser le Tryptan
C’est important de compter les cellules :
- Par exemple si on cultive des cellules souches à très forte densité beaucoup de
cellules par cm2
Perte de la caractéristique naïve (= indi9érenciée)
et début de di9érenciation.
- Rappel : En fonction du substrat : s’il est trop dure = di9érenciation en ostéoblaste.
Plus on met de cellules dans le milieu plus elles sentiront les forces de tensions
ce qui entraine leur di9érenciation en ostéoblaste.
L’incubateur est régulé en CO2, en O2 pour avoir les conditions d’hypoxie, il se trouve à
37°C et 95% d’humidité. Tout cela permet d’avoir des propriétés les plus proches possible
de celles du tissu physiologique.
Les cellules en suspensions (non adhérentes) : Monocytes puisque s’ils adhèrent ils se
transforment en macrophages.
II.
Démarche scientifique
Si on veut faire du ligament ou du tendon, il faut :
- Matériaux
- Cellules
- Conditions de culture/maturation
1. Cahier des charges spécifiques au ligament
Cahier des charges
• Elasticité
spécifiques
au
• Suturabilité = Adhérence
ligament
• Structure amisotrope = Orientée
Matériau
Sca6old Electrospinning
Caractéristiques
• Polymère = Acide poly lactique (PLA)
• Tressage possible du sca9old
Avantages
Fibre de même conformation que la MEC = nanofibres donc
biomimétisme
Orientation des fibres
Inconvénient
Les fibres tombent de manière aléatoire. Or on cherche à obtenir un
alignement par conséquent pour contourner ce problème il faut
que le collecteur tourne
La porosité
MEB
La rugosité
MEB
La mouillabilité
• Si la goutte d’eau s’étale = surface hydrophile
• Il nous faut une surface hydrophile
• Vérification de l’angle
Test mécanique
• Test de Traction : le plus
avantageux pour le ligament
• Si le module d’élasticité n’est
pas assez important, on peut
exercer une tension au moment
du tressage ou on lâche un peu
plus afin d’augmenter les
contraintes mécaniques
• Il ne faut pas que le matériau
soit trop dur (type os) ni trop
élastique (type ligament)
Dégradation
•
•
•
Le tressage, les fibres, pas les mêmes surfaces d’échanges,
pas le même contact avec le milieu…font que la cinétique de
dégradation ne sera pas la même
Cinétique de dégradation = pas trop vite mais pas trop lent,
donc entre 1 an et demi et 2 ans
Vérification : On peut regarder les produits de dégradation
ou on pèse le matériau au cours du temps.
On vérifie si on a un pH inflammatoire donc acide = 6
Cellules
•
•
•
Cytotoxicité
•
•
•
•
Génotoxicité
Hémocompatible
•
•
•
•
On
met
les
fibroblastes sur le
matériau et
on
regarde s’ils
•
•
•
•
•
•
Inflammation
•
•
On récupère les fibroblastes à partir d’une biopsie de peau
On élimine la première couche afin de récupérer les
couches profondes composées de fibroblastes
On peut mettre des petits morceaux de tissu en culture ou
on utilise de la collagénase afin de dégrader le tissu puis on
ajoute nos cellules pour qu’elles puissent proliférer puis
centrifugation
Soit on met les cellules puis le matériau ou on fait vieillir le
matériau dans un milieu de culture, milieu dans lequel on
va ajouter nos cellules. (Il faut faire attention d’utiliser
100mg/mL de matériaux pour ne pas que cela soit trop
dilué)
Si le matériau flotte, on peut le mettre en contact avec les
cellules
Si le matériau ne flotte pas (= trop lourd) il écrasera nos
cellules, et donc elles vont mourir
On regarde si nos cellules respirent et on compare au
contrôle : > 70%
Test d’Ames : On utilise des bactéries
Non obligatoire car on n’est pas en contact du sang
Mais reste intéressant car on aimerait avoir des matériaux
procoagulants car cela active l’inflammation donc favorise
la réparation/régénération
On met le matériau en contact avec du sang et on regarde
si on a de la coagulation ou pas
Si pas de coagulation : Pas grave dans ce cas si
Adhèrent
Prolifèrent
Sécrétion de collagène de type I
Morphologie est très importante : Les fibroblastes doivent
s’aligner car cela permet d’avoir les propriétés mécaniques
du tendon et une MEC de bonne qualité = bon tissu
- Marquage du cytosquelette : Imagerie en
fluorescence
Si les cellules adhèrent mais qu’elles synthétisent la MEC
de manière anarchique = PAS bon
Si matériau trop inflammatoire cela peut entrainer de la
fibrose
On implante le matériau, les protéines plasmatiques vont
le recouvrir ce qui mobilise les cellules.
PNN :
• Pour récupérer les PNN, l’inconvénient majeur est la limite
de temps, max 6h car après ils entrent en apoptose
L’activation doit être présente mais pas trop importante
pour ne pas induire une inflammation chronique
- On regarde la nétose : Libération d’acides
nucléiques important si les PNN sont activés de
manière excessive
- ROS : Production d’espèces réactives à l’oxygène
qui dégradent le matériau = Test colorimétrique ou
cytométrie en flux
- Si nétose et ROS trop excessive alors risque
d’inflammation chronique et non pas à une
cicatrisation
- Contrôle de l’inflammation : On utilise du PMA qui
active les cellules inflammatoires afin de définir le
seuil max qu’il ne faut pas atteindre. On doit avoir un
contrôle positif mais on ne doit pas
atteindre/dépasser la limite supérieure
Monocytes/Macrophages :
• Il peut être pro ou anti inflammatoire
• Di9érenciation initiale en macrophages pro-inflammatoire
pour amorcer la cicatrisation
• Si di9érenciation initiale vers la forme anti-inflammatoire,
alors risque de fibrose ou synthèse de MEC. Cette
di9érenciation ne permet pas la stimulation de la
cicatrisation
• Test colorimétrique ou cytométrie en flux, test ELISA
• On peut regarder ce que les cellules libèrent : Cytokines
pro ou anti inflammatoire ?
Implantation ou
bioréacteur (voir
infra)
•
•
Maturation
bioréacteur
en
•
•
•
Note
Suturabilité
•
Soit notre matériau à toutes les caractéristiques
permettant la réaction de cicatrisation donc on peut faire
l’implantation
Ou, on peut faire maturer le tout soit en culture soit avec
un bioréacteur
Contrainte à imposer : On tire à environ 5% par rapport à la
taille
Fréquence/Temps : La stimulation entraine une
calcification du tissu
On doit faire de la recherche biblio afin de connaître ces
paramètres
A ce stade, on peut faire de l’histologie car on a
su9isamment de MEC et de tissu
•
•
Implantation
•
•
•
•
•
Cahier
charges
spécifique
ligament
des
du
•
•
•
Il faut obtenir les autorisations au préalable
Avant d’aller vers l’implantation chez le lapin il faut faire
une implantation sous cutanée chez le rat/souris pour
vérifier que l’inflammation ne soit pas délétère
On faire des sortes de poches (4) sur le dos du rat dont deux
dans lesquelles on implante le matériau et deux sans
matériau afin de déterminer l’inflammation dû à la
chirurgie
On regarde les médiateurs de l’inflammation par prise de
sang à J2-J7-J21-J56 (cicatrisation) : Augmentation ou
diminution ?
Après cicatrisation, on fait de l’histologie : On regarde l’état
de la fibrose, présence normale mais il faut déterminer si
elle est importante ou pas + calcification = Il ne faut pas
beaucoup de fibrose et pas de calcification
Ensuite on passe chez le lapin : On doit sacrifier plusieurs
lapins pour comprendre les séquences de cicatrisation (34 mois)
On cherche à aller de plus en plus vers la colle
physiologique
Élasticité
Suturabilité
Structure anisotrope = orientée
Petites notes de fin de cours :
Choix de l’animal : Selon le budget, les locaux, le tissu que l’on souhaite fabriquer
Pour le tissu vasculaire : Brebis idéale
Pour le cartilage : Cheval de course idéal
Pour les dents : Chien idéal
Comité éthique : Vétérinaire, statisticiens,