Федеральное государственное бюджетное образовательное
учреждение высшего образования
“Уральский государственный медицинский университет”
Министерства здравоохранения Российской Федерации
Кафедра микробиологии, вирусологии и иммунологии
Литусов Н.В.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В МЕДИЦИНСКОЙ
БАКТЕРИОЛОГИИ
Электронное учебное пособие
Екатеринбург
2021
2
УДК 579
Рецензент: доктор медицинских наук профессор кафедры эпидемиологии,
социальной гигиены и организации госсанэпидслужбы Слободенюк А.В.
Литусов Н.В. Методы исследования в медицинской бактериологии.
Электронное учебное пособие. – Екатеринбург: Изд-во УГМУ, 2021. – 232 с.
Электронное учебное пособие “Методы исследования в медицинской
бактериологии” подготовлено в качестве информационного сопровождения
изучения дисциплины “Микробиология” ординаторами и аспирантами,
осваивающими
основные
образовательные
программы
последипломного
медицинского образования. Пособие могут использовать также студенты для
углубленного изучения микробиологических методов диагностики инфекционных
болезней бактериальной природы.
За последнее время возросли возможности микробиологических
исследований. Все шире используются методы, позволяющие в короткие сроки
провести выделение, идентификацию возбудителей и определение их
чувствительности к антибиотикам. Однако в учебной литературе современные
технологии идентификации бактерий и определения их чувствительности к
антимикробным препаратам представлены в разобщенном виде.
Электронное учебное пособие учитывает требования ФГОС ВО и
Профессиональных стандартов. В пособии рассматриваются как классические
методы исследования, так и современные диагностические технологии, помогающие
выявлять и идентифицировать бактерии не только в клиническом материале, но и в
пробах с объектов внешней среды.
Для лучшего усвоения изучаемого материала пособие иллюстрировано
схемами, таблицами, рисунками авторского исполнения или заимствованными из
Интернет-ресурсов.
© ФГБОУ ВО УГМУ, 2021
© Литусов Н.В.
3
Содержание
Введение............................................................................................................................ 5
1. Классификация микроорганизмов по степени патогенности и группы риска
микробиологических лабораторий ................................................................................. 8
2. Микробиологическая лаборатория .......................................................................... 14
2.1. Устройство и оборудование микробиологической лаборатории....................... 14
2.2. Техника безопасности при работе в микробиологической лаборатории .......... 22
2.3. Подготовка принадлежностей к микробиологическому исследованию ........... 26
2.4. Приемы асептической работы с микроорганизмами .......................................... 32
3. Правила отбора, хранения и транспортировки материала для
микробиологического исследования ........................................................................... 38
4. Отбор и анализ проб с объектов внешней среды ................................................... 48
4.1. Отбор и анализ проб почвы ................................................................................... 48
4.2. Отбор и анализ проб воды...................................................................................... 52
4.3. Отбор и анализ проб воздуха ................................................................................. 55
5. Классические методы выделения и идентификации бактерий ............................. 60
5.1. Бактериоскопическое исследование ..................................................................... 60
5.1.1. Оборудование рабочего места для микроскопирования ................................. 60
5.1.2. Приготовление препаратов для микроскопирования ....................................... 62
5.1.3. Микроскопирование микробов в живом состоянии ......................................... 66
5.1.4. Микроскопирование микробов в окрашенном состоянии .............................. 69
5.2. Культуральное исследование................................................................................. 90
5.2.1. Питательные среды для выделения, культивирования и идентификации
бактерий .......................................................................................................................... 90
5.2.2. Системы создания специальных атмосферных условий культивирования . 102
5.2.3. Получение чистой культуры бактерий ............................................................ 106
5.2.4. Биохимическая идентификация бактерий ....................................................... 117
5.2.5. Микротест-системы для идентификации бактерий........................................ 128
5.2.6. Полуавтоматические и автоматические системы идентификации
микроорганизмов и определения антибиотикочувствительности .......................... 134
6. Фагоидентификация и фаготипирование .............................................................. 140
7. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам................................. 144
8. Биологический метод исследования ...................................................................... 154
8.1. Лабораторные животные, правила работы с ними ............................................ 154
8.2. Методы заражения и вскрытия лабораторных животных ................................ 156
8.3. Определение вирулентности бактерий ............................................................... 161
9. Иммунодиагностические реакции.......................................................................... 163
9.1. Реакция агглютинации и ее разновидности ....................................................... 164
9.1.1. Ориентировочная (пластинчатая) реакция агглютинации на стекле ........... 164
9.1.2. Развернутая реакция агглютинации ................................................................. 168
9.1.3. Реакция коагглютинации .................................................................................. 170
9.1.4. Реакция латекс-агглютинации .......................................................................... 171
9.2. Реакция прямой гемагглютинации ...................................................................... 173
9.3. Реакция непрямой гемагглютинации .................................................................. 174
9.4. Реакция торможения гемагглютинации ............................................................. 177
4
9.5. Иммуноферментный анализ ................................................................................ 179
9.6. Иммуноблоттинг ................................................................................................... 188
9.7. Реакция иммунофлюоресценции ......................................................................... 188
9.8. Реакция преципитации и ее варианты ................................................................ 191
9.8.1. Реакция кольцепреципитации........................................................................... 191
9.8.2. Реакции преципитации в геле ........................................................................... 193
9.9. Реакция нейтрализации токсина антитоксином с биопробой на белых мышах
........................................................................................................................................ 195
9.10. Реакция связывания комплемента ..................................................................... 197
9.11. Иммунохроматографический анализ ................................................................ 200
9.12. Феномен набухания капсулы ............................................................................. 204
9.13. Реакция бактериолизиса ..................................................................................... 204
10. Аллергологическая диагностика .......................................................................... 206
11. Молекулярно-генетические методы исследования ............................................ 209
11.1. Плазмидное типирование ................................................................................... 209
11.2. Рестрикционно-эндонуклеазный анализ .......................................................... 210
11.3. Молекулярная гибридизация ............................................................................. 210
11.4. Полимеразная цепная реакция........................................................................... 211
11.5. Лигазная цепная реакция ................................................................................... 219
11.6. Секвенирование................................................................................................... 219
11.7. Петлевая изотермическая амплификация нуклеиновых кислот .................... 221
12. Методы масс-спектрометрии ................................................................................ 225
5
Введение
Потребность в обнаружении бактерий в клиническом материале, в пробах с
объектов окружающей среды и их идентификация возникает перед исследователями
в следующих ситуациях:
- микробиологическая диагностика инфекционных болезней;
- установление этиологии и причин вспышек инфекционных заболеваний;
- выявление контаминации объектов окружающей среды микроорганизмами,
в том числе патогенными;
- анализ микробиологического загрязнения продуктов питания,
косметических и лекарственных препаратов и другой продукции;
- производство вакцин, антибиотиков и других биологически активных
продуктов;
- микробиологический мониторинг производственной среды.
Таким образом, целью микробиологических исследований является
установление факта наличия или отсутствия возбудителей (микроорганизмов) в
организме больного и на объектах окружающей среды, а также их идентификация
(определение видовой принадлежности). Одной из задач микробиологических
исследований в клинической практике является установление чувствительности
выделенных микроорганизмов к антимикробным препаратам.
Все методы исследования при диагностике инфекционных болезней и
идентификации бактерий можно разделить на 2 группы:
1. Методы с выделением чистой культуры бактерий на питательных
средах.
2. Методы без выделения чистой культуры бактерий.
Золотым
стандартом
микробиологии
являются
исследования,
предусматривающие выделение чистой культуры бактерий и их последующая
идентификация (определение родовой и видовой принадлежности). Чистая
культура – это популяция микроорганизмов одного вида, полученная из
изолированной колонии микробов с плотной питательной среды.
Идентификация без выделения чистой культуры микроорганизмов
необходима для детекции возбудителей непосредственно в биологическом
материале, что позволяет проводить экспресс-диагностику заболеваний, а также
выявлять некультивируемые микроорганизмы. Для осуществления идентификации
бактерий без выделения чистой культуры используют генетические и
серологические методы.
К генетическим методам относятся ПЦР, ЛЦР, гибридизация,
секвенирование. Эти методы являются перспективными для идентификации любых
микроорганизмов и определения их чувствительности к противомикробным
препаратам, что обусловлено крайне высокой чувствительностью методов и
быстротой получения результатов. Эти методы в настоящее время широко
используются для идентификации длительно культивируемых бактерий (например,
микобактерий туберкулёза), облигатных внутриклеточных паразитов (хламидий), а
также вирусов (в частности, ВИЧ, возбудителей вирусных гепатитов).
6
К серологическим методам относятся РИФ, ИФА, иммуноблоттинг.
Наибольшее распространение эти методы получили для идентификации
возбудителей бактериальных инфекций и вирусных антигенов.
В последние годы широкое распространение получают методы массспектрометрии, газовой и жидкостной хроматографии и сочетание методов массспектрометрии и хроматографии.
Классическая схема диагностики инфекционных болезней включает
следующие этапы:
- отбор исследуемого материала;
- приготовление микроскопического препарата, его окраска по Граму и
микроскопирование с иммерсией;
- посев исследуемого материала на плотную питательную среду для
получения изолированных колоний;
- микроскопическое исследование выросшей культуры и пересев материала
из изолированных колоний для накопления культуры (получение чистой культуры);
- идентификация чистой культуры, то есть установление видовой
принадлежности микроба путем изучения биохимических свойств чистой культуры,
ее чувствительности к бактериофагам и антибиотикам;
- выдача заключения.
При идентификации бактерий используют следующие показатели:
- фенотипические (морфологические, тинкториальные, культуральные,
биохимические, антигенные свойства);
- генотипические (соотношение гуанина и цитозина, плазмидный профиль,
рестрикционный анализ);
- филогенетические (анализ РНК-последовательностей, секвенирование 16S
и 23S рРНК).
Классическими методами микробиологических исследований являются
следующие:
- микроскопический метод – изучение морфологических особенностей
(форма клеток) и тинкториальных свойств (отношение к красителям)
микроорганизмов;
- культуральный (бактериологический, микологический) метод –
изучение культуральных (характер роста микробов на питательных средах) и
биохимических свойств (изучение каталазной и оксидазной активности,
ферментативной активности микробов: сахаролитических, протеолитических,
липолитических свойств бактерий, реже – тесты ассимиляции азота, определение
уреазной активности и активности отдельных ферментов), чувствительности к
бактериофагам и антибиотикам;
- биологический метод – изучение влияния микробов на организм
лабораторных животных (определение вирулентности и токсигенности бактерий,
биопробы);
- иммунологический (серологический и аллергологический) метод –
изучение антигенных свойств бактерий и реакций организма на эти антигены;
- молекулярно-генетический метод – обнаружение в исследуемом
материале фрагментов генома бактерий.
7
Однако по фенотипическим признакам ошибочно идентифицируется до 3050% культур. Основные недостатки фенотипической идентификации бактерий:
- ограниченность набора исследуемых признаков;
- высокая изменчивость свойств микроорганизмов;
- малая информативность;
- высокая трудоемкость;
- низкая стандартизация;
- высокая стоимость исследования;
- длительность исследования;
- продолжительное культивирование (некультивируемость) некоторых
возбудителей.
Поэтому
основными
тенденциями
развития
современных
микробиологических исследований являются автоматизация; централизация;
внедрение в практику молекулярно-генетических и экспресс-методов исследования
(point of care) “у постели больного”.
За последние годы возросли возможности автоматизированных
микробиологических исследований. Все шире используются методы, позволяющие
в короткие сроки получать окончательный ответ. Эти методы характеризуются
высокой воспроизводимостью, точностью и приемлемой стоимостью оборудования.
При выделении и идентификации бактерий ориентируются на следующие
регламентирующие документы:
- “Приказ об унификации микробиологических методов исследования №535
от 1985 г.”;
- ГОСТ Р 53079.4-2008 Группа Р20 “Национальный стандарт Российской
Федерации. Технологии лабораторные клинические. Обеспечение качества
клинических лабораторных исследований”;
- МУК 4.2.2886-11 “Идентификация микроорганизмов и определение
чувствительности их к антибиотикам с применением автоматизированной системы
для биохимического анализа”;
- МУК 4.2.1890-04 “Определение чувствительности микроорганизмов к
антибактериальным препаратам”;
- рекомендации по выделению и идентификации некоторых возбудителей,
издаваемые Межрегиональной Ассоциацией Клинической Микробиологии и
Антимикробной Химиотерапии (МАКМАХ).
Кроме классических методов все более широкое распространение получают
современные полуавтоматические и автоматические методы исследования.
8
1. Классификация микроорганизмов по степени патогенности и
группы риска микробиологических лабораторий
Биологическая опасность – это отрицательное воздействие биологических
патогенов любого уровня и происхождения (от прионов и микроорганизмов до
многоклеточных паразитов), создающих опасность в медико-социальной,
технологической, сельскохозяйственной и коммунальной сферах. Биологическую
опасность или риск для здоровья людей и окружающей среды в
микробиологических лабораториях может представлять исследуемый материал,
содержащий микроорганизмы или токсины биологического происхождения. В
лабораториях могут присутствовать как патогенные, так и непатогенные для
человека микробы.
Патогенные микроорганизмы, токсины и паразиты, вызывающие заболевания
человека, животных, растений, деградацию материалов, резкое ухудшение качества
окружающей среды определяются как опасные биологические агенты.
Поэтому важным направлением микробиологических исследований является
обеспечение безопасности проводимых лабораторных работ. Биологическая
безопасность – это предотвращение ущерба и достижение защищенности личности,
общества и государства от потенциальных и реальных биологических угроз.
Поэтому основными мероприятиями биологической защиты являются обеспечение
охраны, контроля и учета биологических агентов и токсинов внутри лабораторий с
целью предотвращения их утраты, кражи, использования не по назначению,
несанкционированного доступа или преднамеренного несанкционированного
высвобождения.
В Российской Федерации принята “Классификация микроорганизмов –
возбудителей инфекционных заболеваний человека, простейших, гельминтов и ядов
биологического происхождения по группам патогенности”. По степени
патогенности (биологической опасности) в Российской Федерации все
микроорганизмы разделены на 4 группы:
I группа – возбудители особо опасных инфекций (Yersinia pestis,
геморрагические лихорадки Ласса, Эбола и др.);
II группа – возбудители высоко контагиозных эпидемических заболеваний
человека бактериальной, грибковой и вирусной этиологии (Bacillus anthracis,
Brucella abortus, Francisella tularensis, возбудители сыпного тифа, лихорадки
Скалистых гор, бластомикоза и др.);
III группа – возбудители инфекционных болезней, выделяемых в
самостоятельные нозологические группы (Bordetella pertussis, Clostridium botulinum,
Mycobacterium tuberculosis, Neisseria meningitidis и др.);
IV группа – условно-патогенные микробы (возбудители оппортунистических
инфекций – Bacillus cereus, Clostridium perfringens, Escherichia coli и др.) и
непатогенные микроорганизмы.
Аттенуированные штаммы возбудителей I-II групп патогенности относятся к
микроорганизмам III группы патогенности, а аттенуированные штаммы III-IV групп
– к IV группе патогенности.
Эта классификация разработана в соответствии с рекомендациями ВОЗ, но
отличается от классификации ВОЗ обратным порядком (отечественная I группа
9
микроорганизмов соответствует IV группе патогенных биологических агентов по
классификации ВОЗ). Классификация микроорганизмов по группам риска ВОЗ
выглядит следующим образом.
Группа риска 1 – отсутствие или низкая индивидуальная и общественная
опасность. Микроорганизмы этой группы потенциально не являются возбудителями
болезней человека или животных.
Группа риска 2 - умеренная индивидуальная опасность, низкая общественная
опасность. К этой группе относятся патогенные микроорганизмы, которые могут
вызывать заболевание у человека или животных, но не представляют серьезного
риска для лабораторного персонала, населения, домашнего скота или окружающей
среды. Неосторожность в лаборатории может вызвать серьезную инфекцию, однако
существуют доступные лечебные и профилактические меры и риск ее
распространения ограничен.
Группа риска 3 – высокий индивидуальный и низкий общественный риск.
Патогенный агент этой группы обычно вызывает серьезное заболевание человека
или животных, однако, как правило, не распространяется от больного к здоровому.
Существуют эффективные лечебные и профилактические меры.
Группа риска 4 – высокий индивидуальный и общественный риск.
Патогенный агент этой группы обычно вызывает серьезные заболевания у человека
или животных и легко распространяется от больного к здоровому прямо или
опосредованно. Эффективных лечебных мер в большинстве случаев нет.
В Российской Федерации работа с материалом, содержащим микроорганизмы
I-II групп патогенности, регламентируется Санитарно-эпидемиологическими
правилами СП 1.3.3118-13 “Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп
патогенности (опасности)”.
Исследования с микроорганизмами I-II групп патогенности проводятся в
специальных режимных микробиологических лабораториях обученным персоналом.
Обязательным условием является вакцинация персонала (при наличии
соответствующих вакцин). При выполнении работ требуется строгое соблюдение
мер безопасности с целью предупреждения случаев внутрилабораторного
заражения, выноса инфекции за пределы лаборатории и недопущения контаминации
окружающей среды.
Работа с материалом, содержащим микроорганизмы III-IV групп
патогенности, регламентируется Санитарно-эпидемиологическими правилами СП
1.3.2322-08 “Безопасность работы с микроорганизмами III-IV групп патогенности
(опасности) и возбудителями паразитарных болезней”.
Эти исследования осуществляются в микробиологических лабораториях
лечебно-профилактических учреждений и подобных лабораториях других
организаций.
Вопросы биологической безопасности при обращении с потенциально
инфекционными материалами изложены в “Практическом руководстве по
биологической безопасности в лабораторных условиях”, периодически издаваемом
Всемирной Организацией Здравоохранения. В настоящее время действует Третье
Издание этого Руководства.
В зависимости от выполняемых исследований, микробиологические
лаборатории подразделяют на диагностические, производственные и научно-
10
исследовательские. В соответствии с типами исследуемых микроорганизмов
выделяют
бактериологические,
вирусологические,
микологические
и
протозоологические лаборатории.
Соответствующие санитарно-эпидемиологические правила устанавливают
требования
к
организационным,
санитарно-противоэпидемическим
(профилактическим) мероприятиям, направленным на обеспечение личной и
общественной безопасности и защиту окружающей среды при работе с патогенными
микроорганизмами. Биологическая безопасность предусматривает порядок
осуществления лабораторных исследований и специальное оснащение
микробиологических лабораторий, которые защищают персонал лабораторий и
окружающую среду при работе с потенциально опасными микроорганизмами.
Уровень мер предосторожности, необходимых при работе с потенциально опасными
биологическими агентами, представляет собой уровень биобезопасности.
В зависимости от степени патогенности (биологической опасности)
микроорганизмов микробиологические лаборатории подразделяют на категории. По
номенклатуре ВОЗ выделяют 3 категории микробиологических лабораторий:
- базовые (основные или общего типа), оборудованные различными
защитными устройствами;
- режимные (изолированные) или лаборатории удержания;
- лаборатории особого режима (максимально изолированные), или
лаборатории максимального удержания.
Указанные категории микробиологических лабораторий в свою очередь
подразделяют на 4 группы риска (таблица 1):
I группа – базовые (основные) лаборатории с низким индивидуальным и
общественным риском (BSL-1, помещения, где проводят работы с
микроорганизмами IV групп патогенности);
II группа – базовые (основные) лаборатории с умеренным индивидуальным и
ограниченным общественным риском (BSL-2, помещения, где проводят работы с
микроорганизмами II-IV групп патогенности);
III группа – режимные лаборатории (изолированные) с высоким
индивидуальным и низким общественным риском (BSL-3, помещения, где проводят
работы с возбудителями II группы патогенности);
IV группа – лаборатории особого режима (максимально изолированные) с
высоким индивидуальным и общественным риском (BSL-4, помещения, в которых
проводят работы микроорганизмами I группы патогенности).
Таблица 1 – Группы риска микробиологических лабораторий
Груп- Характериспа
тика
риска
1
Низкий индивидуальный и
низкий
общественный риск
Категории
лабораторий
Базовые
(основные)
Пример
лабораторий
Базовые
(основные),
учебные
лаборатории
Характеристика
исследуемых микробов
Микроорганизмы,
потенциально не
являющиеся
возбудителями
заболеваний человека
или животных
Пример
исследуемого
микроба
Кишечная
палочка,
эпидермальный стафилококк
2
Умеренный
индивидуальный и
ограниченный
общественный риск
Базовые
(основные) с
защитными
устройствами
и средствами
Лаборатории
службы здравоохранения
первичного
звена, больницы
первичного
звена, диагностические
лаборатории
3
Высокий
индивидуальный и
низкий
общественный риск
Режимные
(изолированные) или
лаборатории
удержания
Специальные
диагностические
лаборатории
4
Высокий
индивидуальный и
высокий
общественный риск
Особого
режима
(максимально
изолированные) или
лаборатории
максимального
удержания
Лаборатории
особо опасных
инфекций
Патогенный
микроорганизм,
который может вызвать
заболевание, но не
представляет
серьёзного риска для
персонала, населения,
домашнего скота или
окружающей среды.
Неосторожность в
лаборатории может
вызвать инфекцию,
однако существуют
доступные лечебные и
профилактические
меры. Риск
распространения
ограничен.
Патогенный агент,
который обычно
вызывает серьёзное
заболевание человека
или животных, но, как
правило, не
распространяется от
больного к здоровому.
Существуют
эффективные лечебнопрофилактические
процедуры.
Патогенный агент
вызывает обычно
серьёзное заболевание у
человека или животных
и легко
распространяется от
больного к здоровому
или опосредованно.
Эффективных мер в
большинстве случаев не
существует.
11
Сальмонеллы,
микобактерии
туберкулеза
Бруцеллы,
возбудитель
сибирской
язвы
Возбудитель
чумы, вирус
Эбола
В таблице 2 представлена взаимосвязь групп риска и уровней
биобезопасности, практики и оборудования, представленная в “Практическом
руководстве по биологической безопасности в лабораторных условиях” (третье
издание, Женева, 2004 г.).
Таблица 2 - Взаимосвязь групп риска и уровней биобезопасности, практики и
оборудования
Группа
риска
Уровень
биобезопасности
Тип лаборатории
Работа в лаборатории
Безопасное
оборудование
12
Базовый уровень
биологической
безопасности 1
Базовый уровень
биологической
безопасности 2
Базовые учебные,
исследовательские
3
Изолированный
уровень
биологической
безопасности 3
Специальные
диагностические
исследовательские
лаборатории
4
Максимально
изолированный
уровень
биологической
безопасности 4
Лаборатории для
работы с опасными
патогенными
агентами
1
2
Службы
здравоохранения
первичного уровня,
диагностические и
исследовательские
лаборатории
Надлежащая техника
микробиологических
исследований (НТМ)
НТМ и защитная
одежда, обозначение
биологической
опасности
Аналогично 2-му
уровню плюс
специальная одежда,
ограниченный
допуск, управляемая
вентиляция
Аналогично 3-му
уровню плюс
входные боксы,
душевые на выходе,
специальные стоки
Нет. Работа на
открытых столах
Работа на
открытых столах и
в боксах
биологической
безопасности (БББ)
для предохранения
от потенциальных
аэрозолей
БББ и/или иная
первичная
изоляция для всех
видов работ
БББ класса III или
костюмы с
притоком воздуха в
сочетании с БББ
класса II,
автоклавы с двумя
крышками
(вмонтированные в
стены), воздушные
фильтры
В сводной таблице 3 представлены требования к оборудованию для каждого
уровня биологической безопасности (заимствовано из Руководства ВОЗ).
Таблица 3 – Сводная таблица требований к биологической безопасности
Требования
Изоляция лаборатории
Герметичные камеры для
обеззараживания
Вентиляция:
- приточная
- контролируемая
- с НЕРА-фильтрами на выходе
Вход в виде бокса
Воздушный бокс
Воздушный бокс с душем
Тамбур
Тамбур с душем
Обработка сточных вод
Автоклав:
- на месте работы
- в помещении лаборатории
- автоклав с двумя крышками
1
Нет
Нет
Уровень биологической безопасности
2
3
Нет
Да
Нет
Да
4
Да
Да
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Желательно
Желательно
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Нет
Да
Да
Да/Нет
Да
Нет
Нет
Да
Да/Нет
Да/Нет
Да
Да
Да
Да
Да
Да
Нет
Да
Нет
Нет
Нет
Желательно
Нет
Нет
Да
Желательно
Желательно
Да
Да
Да
13
Боксы биологической безопасности
Индивидуальные средства контроля
безопасности (системы
телевизионного наблюдения,
телефонная связь)
Нет
Нет
Желательно
Нет
Да
Желательно
Да
Да
Наиболее распространенными причинами возможного заражения в
микробиологической лаборатории являются прямой контакт и манипуляции с
культурами микроорганизмов, контакт с инфицированными животными, работа с
применением контаминированного оборудования. Поэтому основным принципом
биологической безопасности является ограничение распространения или
предотвращение утечки инфицированного материала из лабораторной среды, в
которой проводятся манипуляции с биологическими агентами. В связи с этим
выделяют первичное и вторичное ограничение распространения биологического
поражающего агента. Первичное ограничение распространения (защита
персонала лаборатории и непосредственно среды лаборатории от воздействия
инфекционных
агентов)
обеспечивается
использованием
специфических
микробиологических приемов и методов работы, специальной защитной одежды и
средств защиты и специального оборудования. Вторичное ограничение
распространения (защита окружающей среды от воздействия инфицированного
материала)
обеспечивается
инженерно-технологической
конструкцией
и
технологическим оборудованием лабораторий.
14
2. Микробиологическая лаборатория
2.1. Устройство и оборудование микробиологической лаборатории
Деятельность бактериологических лабораторий в Российской Федерации
регламентируется следующими основными документами:
- СанПиН 2.1.3.2630-10 “Санитарно-эпидемиологические требования к
организациям, осуществляющим медицинскую деятельность”;
- СНиП-СП 1.3.2322-08 “Безопасность работы с микроорганизмами III-IV
групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней”;
- ГОСТ Р ИСО 15189-2015 “Лаборатории медицинские. Частные требования
к качеству и компетентности”;
- Приказ от 22 апреля 1985 г. №535 “Об унификации микробиологических
(бактериологических) методов исследования, применяемых в клиникодиагностических лабораториях лечебно-профилактических учреждений”;
- СанПиН 2.1.7.2790-10 “Санитарно-эпидемиологические требования к
обращению с медицинскими отходами”.
Работа с возбудителями инфекционных заболеваний проводится в
специализированных лабораториях. Такие лаборатории по своей структуре и
оборудованию должны обеспечивать биологическую безопасность проводимых
диагностических
и
экспериментальных
исследований.
Диагностические
исследования проводятся для обнаружения и идентификации возбудителей, их
антигенов или антител к ним, а экспериментальные исследования
осуществляются с живыми культурами возбудителей инфекционных заболеваний.
Основные исследования, проводимые в микробиологических клинических
лабораториях:
- диагностика инфекционных заболеваний;
- определение микробиологических показателей, характеризующих объекты
окружающей среды;
- контроль напряженности специфического постинфекционного или
поствакцинального иммунитета.
Структура микробиологической лаборатории зависит от задач и
особенностей её деятельности. Микробиологические лаборатории, независимо от
специализации, должны размещаться в чистых светлых помещениях с необходимым
оборудованием и мебелью. Их следует изолировать от других исследовательских
лабораторий. Микробиологические лаборатории целесообразно размещать в
отдельном здании или в отдельной секции здания с изолированным входом. Эти
помещения должны быть обеспечены электроэнергией, горячим и холодным
водоснабжением, газом, снабжены эффективной вентиляцией и канализацией.
Стены помещений облицовывают кафелем или окрашивают масляной краской
светлых тонов. Полы покрывают керамической плиткой, а в некоторых помещениях
(комната для переодевания, препараторская) в качестве покрытия полов используют
линолеум. В лабораторных помещениях должна быть достаточная освещенность,
обеспечивающая удобство в работе.
15
Микробиологическая лаборатория должна иметь достаточное количество
комнат, отдельный вход для сотрудников и для посетителей с тамбуром, обязателен
гардероб и душевая. В составе лаборатории должны быть помещения для приема
материала (приемная), автоклавные, моечная, помещения для хранения
химреактивов, виварий и другие помещения. Часто в современных лабораториях
виварий отсутствует, так как многие исследования на лабораторных животных
заменяются методами, проводимыми in vitro.
При проведении исследований в лабораториях необходимо поддерживать
чистоту. Кроме ежедневной влажной уборки помещения периодически
обрабатывают растворами дезинфицирующих веществ (карболовой кислоты,
хлорной извести, хлорамина и т. п.) и подвергают ультрафиолетовому облучению –
текущая дезинфекция. При необходимости проводят заключительную дезинфекцию.
Типовое
расположение
оборудования
в
лаборатории
для
микробиологических исследований микроорганизмов 3-4 групп патогенности
представлено на рисунке 1.
Рисунок 1 - Расположение оборудования в лаборатории для исследований
микроорганизмов 3-4 групп патогенности. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Регистрация поступающего на исследование патологического материала
проводят в приемной. Пол в ней должен быть бетонный (выложен кафельной
плиткой), стены покрыты масляной краской или керамической плиткой. При входе в
16
приемную располагают коврик, пропитанный дезинфицирующим раствором. В
приемной размещают несколько столов, покрытых материалом, стойким к
химическим веществам, емкость с дезинфицирующим раствором, письменный стол,
стулья (рисунок 2).
Рисунок 2 – Приемная. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
В комнате для предварительной обработки материала проводят
подготовку поступившей пробы для дальнейшего исследования. В комнате должны
быть бокс с предбоксником. В боксе разбирают поступившие на анализ пробы,
готовят и фиксируют мазки-отпечатки, проводят другие предварительные
исследования. В комнате для предварительной обработки материала располагают
столы, шкафы со стерильными инструментами (ножницы, пинцеты, скальпели,
корнцанги) и стерильной посудой для сбора материала, емкости с
дезинфицирующими растворами.
Комнаты, предназначенные для непосредственной работы с патогенными
микроорганизмами, должны быть хорошо освещены, и состоять из двух отделений,
разобщенных стеклянной перегородкой. Эти отделения называются боксом и
предбоксником (рисунок 3).
Рисунок 3 – Бокс и предбоксник для работы с микроорганизмами. Заимствовано из
Интернет-ресурсов.
17
В боксах над рабочим столом на расстоянии 50-70 см от поверхности
устанавливают бактерицидные лампы. Для этих целей можно использовать
передвижную кварцевую лампу. Для обеззараживания воздуха широко
используются бактерицидные облучатели настенные или потолочные. Открытые
ультрафиолетовые лампы включаются только при отсутствии в помещениях людей.
Экранированные бактерицидные облучатели могут использоваться в присутствии
персонала. В последние годы широкое применение находят системы стерилизации
воздуха непрерывного действия (например, ультрафиолетовая система стерилизации
воздуха “Germredue”). В таких системах воздух с помощью насосов пропускается
через камеру, в которой подвергается УФ-облучению. В боксе, кроме рабочих
столов и стульев, должны быть все необходимые для работы принадлежности:
стерилизаторы для инструментов, емкости с дезинфицирующими растворами для
отработанных пипеток и другой стеклянной посуды, бак с дезраствором для сбора
отработанных материалов, баночки со спиртом, йодом, штативы для пробирок,
пробирки с питательными средами, стерильные пипетки, ступки и т. д.
У входа в бокс помещают коврик, пропитанный дезраствором. По мере
высыхания дезраствора коврик смачивают. В предбокснике должны находиться
сменная обувь (тапочки), стерильные халаты, шапочки, маски, которые одевают
перед работой с культурами в боксе. В предбокснике можно размещать
дополнительное оборудование: термостаты, холодильники, лабораторные
центрифуги, микроскопы и другое оборудование.
Боксы и предбоксники, кроме ежедневной влажной дезинфекционной
обработки, облучают бактерицидными лампами в течение 30-40 минут перед
началом работы и после работы.
Альтернативой боксированного помещения являются вытяжные шкафы и
ламинарные боксы (рисунок 4).
а
б
Рисунок 4 – Вытяжной шкаф (а) и ламинарный бокс (б). Заимствовано из Интернетресурсов.
Проведение работ с непатогенными культурами, антигенными препаратами,
диагностикумами и химическими реактивами проводят в обычных лабораториях.
Потолок и стены лабораторных комнат покрывают масляной краской (кафельной
плиткой), пол – линолеумом или кафельной плиткой. Лабораторию оборудуют
18
термостатами, холодильниками, центрифугами, весами различных типов,
электроплитками, водяными банями, электромагнитными мешалками и другими
приборами, необходимыми для проведения исследований. Лабораторию снабжают в
достаточном количестве биксами, фильтрами Зейтца, ящиками для хранения сред,
эмалированной и стеклянной посудой – матрацами, флаконами, колбами разных
объемов, градуированными пипетками, микропипетками, цилиндрами, стаканами,
пробирками серологическими, бактериологическими и центрифужными, ампулами
и резиновыми пробками разных размеров, металлическими или пластмассовыми
штативами для пробирок, карандашами по стеклу, фильтровальной бумагой. В
лабораториях для определенных операций закрепляют рабочее место. На столах
размещают необходимую аппаратуру, соответствующие дезинфицирующие
средства, краски, реактивы.
В автоклавной необходимо иметь два автоклава: для чистых материалов
(для стерилизации посуды, питательных сред, инструментов) и для
инфицированных материалов (для обезвреживания заразного материала).
Допускается наличие в автоклавной сухожаровых шкафов, сушильных шкафов,
дистилляторов, столов и шкафов для стерильной посуды (рисунок 5).
Рисунок 5 – Автоклавная. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Моечная предназначена для мытья посуды и принадлежностей. В ней
располагают машины для мытья посуды и стирки белья, сушильные шкафы,
необходимую мебель. Посуду, пипетки и инструменты, загрязненные
инфицированным материалом, моют только после автоклавирования или
использования другого способа дезинфекции. Оснащение моечной представлено на
рисунке 6.
19
Рисунок 6 – Моечная. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Виварием называется помещение, используемое для содержания
лабораторных животных и работы с ними. В виварии должно быть карантинное
отделение, комнаты для экспериментальных и здоровых животных, помещение для
мытья и дезинфекции клеток, инвентаря и спецодежды, кухня для приготовления
кормов для животных, кладовая, фуражная и другие помещения. Все помещения
вивария должны быть изолированы друг от друга и иметь самостоятельные входы с
дезинфицирующими ковриками. Кроме того, они должны быть недоступны для
грызунов и насекомых. Виварий должен быть теплым, светлым и сухим (рисунок 7).
Рисунок 7 – Помещение для содержания лабораторных животных. Заимствовано из
Интернет-ресурсов.
Лабораторных животных в виварии содержат в клетках или коробках с
сетчатыми крышками (рисунок 8).
20
Рисунок 8 – Коробки для содержания мелких лабораторных животных.
Заимствовано из Интернет-ресурсов.
В одной клетке может быть 1-2 кролика, 5-6 морских свинок, 8-10 крыс, 1520 мышей. На каждой клетке с животными вывешивают паспорт с отметкой даты
поступления в виварий, даты заражения и вида используемого инфицированного
материала. Чистку клеток и уборку помещения вивария проводят ежедневно.
Набор помещений и их оснащение приборами и оборудованием могут
варьировать в зависимости от целей и задач конкретной лаборатории с учетом
группы патогенности микроорганизмов, с которыми осуществляются исследования
в данной лаборатории. При этом помещения лаборатории разделяют на “заразную”
(“грязную”) зону, предназначенную для манипуляций с патогенными
биологическими агентами и их хранения, и “чистую” зону, где не проводят работ с
патогенными микробами и не хранят их.
В “чистой” зоне располагаются следующие помещения:
- гардероб для верхней одежды персонала;
- помещения для проведения подготовительных работ (препараторская,
помещения для приготовления питательных сред и др.);
- помещение для стерилизации питательных сред и лабораторной посуды
(стерилизационная);
- помещение с холодильниками для хранения питательных сред и
диагностических препаратов;
- помещение для переодевания персонала в рабочую одежду;
- помещение для работы с документами и литературой;
- комната отдыха персонала;
- кабинет заведующего лабораторией;
- подсобные помещения;
- туалет.
В лабораториях, проводящих исследования с микроорганизмами 1-2 групп
патогенности, в “заразной” зоне располагаются:
- лабораторные помещения, оснащенные боксами биологической
безопасности, для проведения микробиологических исследований;
- блок для работы с инфицированными животными, состоящий из комнаты
для приема и первичной обработки поступающего материала, комнаты для
заражения и вскрытия лабораторных животных, комнаты для содержания
21
зараженных животных, комнаты для обеззараживания инвентаря (клетки, садки и
др.), комнаты для надевания и снятия защитной одежды;
- комнаты для проведения серологических исследований;
- комната для люминесцентной микроскопии;
- помещения для ПЦР-диагностики;
- автоклавная для обеззараживания инфицированных объектов и материалов;
- термостатная (термальная) комната;
- комната для ведения записей в рабочих журналах;
- туалет.
В лабораториях, проводящих исследования с микроорганизмами 3-4 групп
патогенности, в “заразной” зоне располагаются:
- помещения для приема и регистрации поступающего на исследование
материала;
- лабораторные помещения, оснащенные боксами биологической
безопасности;
- комнаты для проведения бактериологических исследований;
- комнаты для проведения серологических исследований;
- комнаты для люминесцентной микроскопии;
- комнаты для гельминтологических исследований;
- термостатная комната;
- автоклавная для обеззараживания материала.
В лабораториях, проводящих исследования с микроорганизмами 4 группы
патогенности, в “заразной” зоне располагаются:
- комната для посевов и проведения исследований с микроорганизмами;
- комната для обеззараживания и стерилизации используемых материалов.
На границе “чистой” и “заразной” зон находится санпропускник,
включающий в себя комнату для снятия личной одежды, душевую и комнату для
надевания рабочей одежды.
В “заразной” зоне персонал работает в рабочей одежде. В помещениях, где
проводится непосредственная работа с патогенными биологическими агентами,
надевается дополнительная защитная одежда. Тип защитной одежды зависит от
характера выполняемой работы и патогенности возбудителя. Надевают защитную
одежду в предбокснике или при входе в комнату для микробиологических
манипуляций, а снимают - в предбокснике или на выходе из этой комнаты.
К внутренней отделке и оборудованию помещений “заразной” зоны
предъявляются специфические требования. Так, поверхность пола, стен и потолка
должна быть гладкой, без щелей, устойчивой к действию моющих и
дезинфицирующих средств, полы не должны быть скользкими. Трубопроводы и
батареи отопления должны располагаться на некотором расстоянии от стен для
проведения их дезинфекции. Места ввода инженерных коммуникаций в эти
помещения герметизируются. Системы водоснабжения защищаются техническими
средствами от подсоса и обратного тока воды. Категорически запрещается слив
необеззараженных отходов в канализационную систему. Окна в помещениях
“заразной” зоны не открываются, а двери должны плотно закрываться.
Боксированные помещения для работы с инфицированными материалами и
животными оборудуются автономной системой приточно-вытяжной вентиляции. От
22
других вентиляционных систем здания эти системы изолируются и оборудуются
специальными фильтрами тонкой очистки выводящего воздуха.
Лабораторное оборудование и мебель (столы, стеллажи для содержания животных, стулья и т. д.) должны быть гладкими, без острых краев и шероховатостей и
иметь покрытие, устойчивое к действию моющих и дезинфицирующих средств.
Поверхность столов не должна иметь швов и трещин. Покрытие мебели
изготавливают из химически устойчивого пластика или другого материала, который
легко очищается и дезинфицируется. Деревянную мебель красят масляной или
эмалевой краской светлых тонов.
Лабораторные помещения оборудуют системой пожарной сигнализации и
обеспечивают средствами пожаротушения.
2.2. Техника безопасности при работе в микробиологической
лаборатории
Основными опасными факторами в микробиологической лаборатории
являются:
1. Микробы, их токсины и материалы, подозрительные на инфицирование.
2. Огнеопасные и взрывоопасные химические вещества.
3. Кислоты, щелочи и другие токсичные соединения.
4. Электрические приборы.
В процессе работы в микробиологической лаборатории должны соблюдаться
правила, предотвращающие воздействие этих факторов на людей и окружающую
среду, предупреждающие попадание бактерий и плесневых грибов в исследуемый
материал, а также исключающие возможность внутрилабораторных заражений
персонала и распространения инфекции за пределы лаборатории. К таким правилам
работы в микробиологической лаборатории относятся:
1. Проведение исследований в защитной одежде (халат, шапочка или
косынка). Защитная одежда одевается перед входом в лабораторию и снимается
после выхода из нее. Выход за пределы лаборатории в защитной одежде запрещен.
Запрещается также без необходимости ходить в защитной одежде из одной
лаборатории в другую или надевать верхнюю одежду на халат.
2. Дополнительное использование при работе с микробными культурами
резиновых перчаток и ватно-марлевой повязки (маски). При работе в боксе
применяют стерильные халат, маску и шапочку, при этом обязательно меняют
обувь. При необходимости (в случае работы с опасными и особо опасными
микроорганизмами, при работе в виварии) дополнительно надевают вторую пару
резиновых перчаток, передник, нарукавники, защитные очки, а на ноги – резиновые
сапоги.
3. Строгое соблюдение правил личной гигиены: содержание в чистоте рук,
применение косынки для защиты волос.
4. В лаборатории строго запрещено пить, принимать пищу, курить, хранить
продукты питания, вносить посторонние личные вещи.
5. Не допускаются хождение и разговоры во время работы.
23
6. Строгое соблюдение правил асептики в процессе работы с микробными
культурами, в том числе соблюдение определенного порядка посевов, пересевов и
приготовления микробных препаратов.
7. Весь материал, поступающий в лабораторию на анализ, должен
рассматриваться как инфицированный.
8. При распаковке поступившего материала необходимо соблюдать
осторожность. Емкости снаружи протирают дезинфицирующим раствором и
помещают на подносы или в кюветы с ковриком, смоченным дезсредством.
9. Переливание жидкостей, содержащих микроорганизмы, производят над
емкостью, наполненной дезинфицирующим раствором.
10. Все операции с микробными культурами выполняются очень осторожно,
не допуская возможности образования микробных аэрозолей.
11. Категорически запрещается насасывание суспензий микробов и
реактивов ртом в пипетки. При работе с пипетками и жидкими инфицированными
материалами применяют резиновые баллончики (груши) небольшого объема или
автоматические (полуавтоматические) пипетки.
12. Все отработанные материалы подлежат дезинфекции или
обеззараживанию. Зараженный материал подлежит обязательному уничтожению
(автоклавированию, сжиганию), по возможности в тот же день. Инструменты, а
также поверхность рабочего стола после работы сразу же дезинфицируют. Пипетки,
предметные и покровные стекла и другую посуду, бывшую в употреблении,
обеззараживают, погружая в 5% раствор перекиси водорода, лизола, фенола или
серной кислоты, которые всегда должны быть на рабочих столах. Запрещается
оставлять на рабочих столах бактериологические чашки, пробирки и другую посуду
с заразным материалом по окончании работы.
13. По окончании работы культуры микроорганизмов, необходимые для
дальнейших исследований, убирают в холодильник. Руки тщательно
дезинфицируют 70% спиртом или другими растворами. Лабораторию закрывают.
14. В случае аварии, приведшей к обсеменению микробами рук, стола или
других предметов, немедленно докладывается руководителю работ, и под его
контролем проводится дезинфекция. Пролитую суспензию микробов собирают
тампоном (ветошью), смоченным дезраствором. При подозрении на заражение
необходимо обратиться к врачу.
15. Соблюдать противопожарную безопасность при работе со спиртовками.
Во избежание взрыва не зажигать одну спиртовку от другой.
16. Соблюдать правила техники безопасности при работе с
электроприборами.
17. В специальном журнале регистрации ежедневно производятся записи по
использованию инфицирующего материала и его уничтожении.
18. Запрещается выносить из лаборатории оборудование, инвентарь,
материалы и другие предметы без предварительной их дезинфекции и
обеззараживания.
Для полного устранения или минимизации воздействия опасных
биологических материалов используют принадлежности и оборудование, которое
является первичными барьерами. К первичным барьерам относятся средства
индивидуальной защиты персонала, боксы биологической безопасности,
24
герметичные устройства для центрифуг и транспортировки инфицированного
материала.
К средствам индивидуальной защиты персонала относятся лабораторная
одежда (куртки, халаты, комбинезоны), пластиковые передники, защитные очки,
лицевые щитки, респираторы, перчатки (рисунок 9).
Рисунок 9 – Средства индивидуальной защиты персонала. Заимствовано из
Интернет-ресурсов.
Для работы с микроорганизмами I-II групп патогенности используют
костюмы изолирующего типа с принудительной подачей воздуха (рисунок 10).
Рисунок 10 – Костюм изолирующего типа с принудительной подпчей воздуха для
работы с особо опасными возбудителями инфекций I-II групп патогенности.
Заимствовано из Интернет-ресурсов.
25
Боксы биологической безопасности используются для ограничения
распространения биологических аэрозолей, образующихся при проведении
микробиологических исследований. В микробиологических лабораториях
используются боксы первого, второго и третьего класса биологической
безопасности (рисунок 11).
а
б
Рисунок 11 – Боксы биологической безопасности 3 (а) и 2 (б) класса. Заимствовано
из Интернет-ресурсов.
Боксы 1 и 2 классов являются эффективной системой ограничения
распространения возбудителей, относящихся к III-IV группам патогенности
(российская классификация). Боксы 3 класса обеспечивают максимально
возможную защиту персонала и окружающей среды от воздействия биологических
агентов I-II групп патогенности (российская классификация). Основные различия
классов боксов заключаются в направленности воздушных потоков внутри боксов, в
выходе выводящего воздуха внутрь лаборатории или во внешнюю среду через
систему вентиляции и количеством ступеней фильтрации воздуха.
К вторичным барьерам относится оборудование для проведения
деконтаминации инструментов и принадлежностей (автоклавы), система вентиляции
для обеспечения направленного потока воздуха, шлюзовые двери на входе в
лабораторию, соответствующая мебель.
В бактериологической лаборатории ведется следующая документация:
1. Инвентарная книга музейных штаммов микроорганизмов.
2. Журнал учета движения материала в лаборатории.
3. Журнал учета стерилизации и уничтожения инфицированного материала.
4. Журнал учета зараженных подопытных животных.
5. Журнал исследований (экспертиз).
26
2.3. Подготовка принадлежностей к микробиологическому
исследованию
Первым этапом всей микробиологической работы является подготовка
используемых в работе принадлежностей, посуды, материалов к стерилизации и
стерилизация этих предметов. При микробиологических исследованиях широко
используют
такие
принадлежности
как
бактериологическая
игла,
бактериологическая петля, пипетки разного объема, чашки Петри, пробирки, колбы,
флаконы.
Бактериологическая игла предназначена для извлечения и инокуляции
микробной культуры. Она состоят из стальной иглы (проволоки) и держателя. Ее
стерилизуют фламбированием (прокаливанием в пламени горелки).
Бактериологическая петля предназначена для извлечения и пересева
микробных культур. Она состоит из ручки, покрытой термоизоляционным
материалом (длинна 60-80 мм), держателя петли - хромированного прута
(диаметром 3-5, длиной 100-150 мм) и непосредственно самой петли - термостойкой
платиновой или нихромовой проволоки (диаметром 1-2 мм, длина 60-80 мм) с
круглой петлей на конце (диаметром 3-4 мм). Правильно изготовленная петля
должна быть замкнута в кольцо, иначе в ней не будет удерживаться капля
микробной культуры. Петлю и ее держатель стерилизуют фламбированием.
Строение бактериологической иглы и бактериологической петли
представлено на рисунке 12.
А
Б
В
Г
Рисунок 12 – Бактериологическая игла (А) и бактериологическая петля,
подготовленная неправильно (Б, В) и правильно (Г). Заимствовано из Интернетресурсов.
В настоящее время в практической работе часто используют пластиковые
стерильные иглы и петли одноразового использования (рисунок 13).
27
Рисунок 13 - Пластиковые стерильные иглы и петли одноразового использования.
Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Жидкости объемом от нескольких капель до десятков миллилитров (см3)
извлекают с помощью пипеток. В бактериологической лаборатории применяются
пипетки Пастера, мерные пипетки и пипетки Мора. Пипетку Пастера используют
для асептического извлечения жидкостей объемом в несколько капель; мерную
пипетку – для извлечения жидкостей объемом от долей до нескольких миллилитров;
пипетку Мора - от 1 до 50 мл (рисунок 14).
Рисунок 14 – Стеклянные мерные пипетки. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Пипетка Пастера – это стеклянная трубка диаметром 5-6 мм, с толщиной
стенки 1-2 мм. Ее длина составляет 80-220 мм, длина толстой части 50-80 мм, длина
оттянутой тонкой части с запаянным концом - 100-120 мм (рисунок 15).
28
Рисунок 15 – Пастеровские пипетки. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Перед стерилизацией в тупой конец пипетки помещают комочек ваты,
пипетку заворачивают в бумагу или вкладывают в пенал. Подготовленные пипетки
стерилизуют в сухожаровом шкафу при температуре 160-165ОС в течение 60-120
минут.
Ватно-марлевые пробки готовят следующим образом: скатывают валик из
ваты по диаметру, соответствующему горловине сосуда (пробирки, колбы,
флакона); покрывают валик марлей; перевязывают приготовленный ватно-марлевый
валик ниткой у края; обрезают избыток марли и ниток; проверяют соответствие
пробки сосуду (при ее извлечении из сосуда должен быть слышен хлопок).
В настоящее время в практической работе используют пробки,
изготовленные из прессованной целлюлозы, или силиконовые пробки (рисунок 16).
Рисунок 16 – Пробки из прессованной целлюлозы. Заимствовано из Интернетресурсов.
Подготовка пробирок для стерилизации (рисунок 17):
- пробирки моют и высушивают;
- в сухую пробирку помещают ватно-марлевую пробку;
- горловину и пробку одиночных пробирок заворачивают перед
стерилизацией бумагой в виде колпака; несколько пробирок (5, 10, 20, 100 штук)
можно одновременно завернуть полностью в бумагу или поместить в бикс;
29
- стерилизация приготовленного пакета.
Рисунок 17 – Подготовка пробирок к стерилизации.
Подготовка колб для стерилизации осуществляют аналогичным образом:
после мойки и высушивания горловину колбы с пробкой обертывают бумагой и
колбы стерилизуют.
Подготовка пипеток для стерилизации:
- пипетки моют и высушивают;
- с тупого конца внутрь пипетки вставляют вату для фильтрации воздуха и
задержки жидкости в случае чрезмерного ее всасывания;
- волоски ваты обжигают на пламени спиртовки, чтобы они не мешали
надевать резиновую трубку с баллончиком на пипетку при работе;
- подготовленные пипетки помещают в пенал или обертывают бумагой. При
завертывании одной пипетки (рисунок 18) полоску бумаги размером 6х30 см
помещают на стол и закатывают пипетку. Свободный конец полоски бумаги
закручивают.
Рисунок 18 – Подготовка пипеток для стерилизации.
Заготовку подписывают, указав объем пипетки. Одновременно можно
завернуть несколько пипеток (3-5 штук) аналогичным образом.
Подготовка чашек Петри для стерилизации:
- чашки моют и высушивают;
- чашку накрывают крышкой;
- чашки помещают в контейнер (бикс) или заворачивают бумагой (рисунок
19). Для этого одну или несколько чашек помещают на квадратный лист бумаги,
последовательно заворачивают углы и закрепляют последний угол за боковыми
углами.
30
Рисунок 19 – Подготовка чашек Петри к стерилизации.
Чашки Петри можно не заворачивать в бумагу, а стерилизовать в
металлических биксах, расположив их слоями.
Современные чашки Петри – пластиковые. Они выпускаются стерильными,
запакованными в полиэтиленовую пленку (рисунок 20).
Рисунок 20 – Стерильные пластиковые чашки Петри. Заимствовано из Интернетресурсов.
Стеклянный шпатель Дригальского моют, высушивают, обертывают
бумагой каждый шпатель по-отдельности или несколько штук вместе и стерилизуют
(рисунок 21).
Рисунок 21 – Подготовка шпателя для стерилизации.
В настоящее время наряду со стеклянными шпателями Дригальского
используют металлические и пластиковые шпатели разных форм, выпускаемые в
стерильных упаковках (рисунок 22).
31
Рисунок 22 – Бактериологические шпатели. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Подготовленные
принадлежности
стерилизуют
в
цилиндрических решетчатых корзинах или в биксах (рисунок 23).
специальных
а
б
Рисунок 23 – Биксы без бактериального фильтра (а) и с бактериальным фильтром
(б). Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Стерилизацию подготовленных материалов проводят, как правило, в
паровых стерилизаторах (автоклавах) с вертикальной или горизонтальной загрузкой
(рисунок 24).
Рисунок 24 – Различные марки паровых стерилизаторов. Заимствовано из Интернетресурсов.
32
К основному оборудованию бактериологических лабораторий относятся
также штативы, колбы, световые и люминесцентные микроскопы, термостаты и др.
В современных бактериологических лабораториях широкое распространение
получают
автоматизированные
системы,
например,
система
WASP
(автоматизированная система посева клинических образцов, Copan, Италия),
система BD Phoenix 50 (автоматизированная система идентификации
микроорганизмов и определения антибиотикочувствительности, Becton Dickinson,
США); система ADAGIO (анализатор антибиотикограмм ДДМ, Bio-Rad, США);
система MALDI Biotyper (система быстрой идентификации микроорганизмов,
Bruker Daltonik, Германия); система Anoxomat (система для создания специальной
атмосферы, Advanced Instruments Inc., США).
К вспомогательному оборудованию относятся боксы микробиологической
безопасности, холодильники, морозильники, микробиологические инкубаторы,
сухожаровые шкафы, СО2-инкубаторы, весы, рН-метры, шейкеры, центрифуги,
системы очистки воды и др.
2.4. Приемы асептической работы с микроорганизмами
При работе в микробиологической лаборатории необходимо соблюдать
правила асептики, препятствующие с одной стороны загрязнению чистой культуры
бактерий посторонними микроорганизмами и с другой стороны - распространению
микробов во внешней среде.
Асептическое извлечение микробной культуры бактериологической
петлей из пробирки производится следующим образом (рисунок 25):
- поставить в штатив пробирку с исследуемой культурой и
бактериологическую петлю ручкой вниз;
- зажечь горелку;
- взять левой рукой пробирку как карандаш пробкой вверх, правой рукой бактериологическую петлю за ручку кольцом вниз;
- профламбировать петлю, прокалив ее до красного каления, и держатель
петли в пламени горелки;
- над пламенем горелки извлечь из пробирки пробку, прижав ее к ладони
правой руки;
- над пламенем ввести петлю в пробирку, прикоснуться ею к стенке
пробирки для охлаждения, погрузить петлю в культуру или прикоснуться к газону
культуры на поверхности среды;
- извлечь петлю с культурой, профламбировать край пробирки и пробку,
вставить пробку в пробирку, поставить пробирку в штатив;
- каплю культуры с петли использовать по назначению;
- профламбировать бактериологическую петлю и поставить ее в штатив
ручкой вниз.
33
Рисунок 25 – Схема асептического извлечения культуры микробов из пробирки
бактериологической петлей. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Асептическое извлечение микробной культуры бактериологической
петлей с питательного агара из чашки Петри:
- поставить бактериологическую петлю в штатив, чашку Петри с культурой перед спиртовкой;
- профламбировать петлю;
- приоткрыть покровную чашку, удерживая ее большим и средним пальцами
левой руки;
- прикоснуться петлей к среде рядом с колонией, из которой предполагается
взять микробную массу, для охлаждения петли;
- прикоснуться петлей к колонии микробов;
- закрыть чашку.
Аналогично извлекают микробную культуру из пробирки и чашки Петри
бактериологической иглой. Извлеченная культура используется в основном для
приготовления мазков для микроскопирования.
Асептическое извлечение жидкой микробной культуры пипетками
производится следующим образом (рисунок 26):
- поставить в штатив пробирку с культурой;
- положить рядом пенал со стерильными пипетками;
- зажечь горелку;
- извлечь пипетку и взять ее в правую руку как карандаш тонким концом
вниз;
34
- взять пробирку с культурой левой рукой как карандаш, извлечь над
пламенем спиртовки пробку, прижав ее мизинцем к ладони правой руки;
- опустить пипетку в наклоненную пробирку, погрузить его в жидкую
культуру; после заполнения культурой части пипетки, плотно закрыть ее толстый
конец указательным пальцем правой руки, извлечь пипетку с культурой;
- профламбировать край пробирки и пробку, закрыть пробирку пробкой,
поставить пробирку в штатив;
- вылить культуру из пипетки по назначению (на стекло, в среду);
- поместить пипетку в дезраствор.
Рисунок 26 – Асептическое извлечение жидкой культуры пипеткой Пастера.
Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Наполнение пипетки Пастера жидкой культурой осуществляется за счет
капиллярных сил, а слив - под действием силы тяжести. Для наполнения пипеток
больших объемов (мерных пипеток, пипеток Мора) необходимо создавать
разрежение, а для слива - давление. Это достигается специальными
приспособлениями (резиновыми баллончиками, дозаторами и пр.). В современных
лабораториях широкое распространение получают автоматические пипетки со
стерильными съемными наконечниками.
Пересев культуры микробов из пробирки в пробирку (рисунок 27)
производится в следующей последовательности:
- поместить в штатив бактериологическую петлю, пробирки с культурой и со
средой, подписать их;
- зажечь горелку;
- взять пробирки как карандаш в левую руку и разъединить их на 1-1,5 см
средним пальцем;
- профламбировать бактериологическую петлю; затем края пробирок;
извлечь пробки из пробирок правой рукой, зажав одну пробку между ладонью и
мизинцем, вторую - между мизинцем и безымянным пальцами;
- ввести бактериологическую петлю в пробирку с культурой, прикоснуться
петлей к стенке для охлаждения;
- погрузить петлю в культуру, извлечь каплю и перенести ее в питательную
среду;
35
- извлечь петлю;
- профламбировать края пробирок и пробки и закрыть ими пробирки;
- профламбировать петлю и поставить ее в штатив.
Рисунок 27 – Пересев культуры микробов из пробирки в пробирку. Заимствовано из
Интернет-ресурсов.
Пересев культуры микробов из пробирки в чашку Петри (рисунок 28)
производится в следующей последовательности:
- поместить пробирку с культурой и бактериологическую петлю в штатив, а
чашку – перед горелкой;
- зажечь горелку;
- взять левой рукой пробирку с культурой как карандаш;
- профламбировать петлю;
- профламбировать край пробирки, правой рукой извлечь пробку, прижав ее
мизинцем к ладони правой руки;
- опустить бактериологическую петлю в пробирку, прикоснуться к стенке,
извлечь каплю культуры;
- профламбировать край пробирки и пробку, закрыть пробирку пробкой и
поставить ее в штатив;
- приподнять большим и средним пальцами левой руки крышку чашки
Петри, прикоснуться петлей к среде у края под левой ладонью, провести
параллельные штрихи от края до края (на расстоянии 3 мм) вплоть до края правой
руки, извлечь петлю, накрыть чашку крышкой;
- профламбировать петлю, поместить ее в штатив;
- поместить чашку Петри в термостат вниз крышкой.
36
Рисунок 28 – Посев на плотную питательную среду в чашку Петри. Заимствовано из
Интернет-ресурсов.
Пересев микробной культуры в питательную среду с помощью пипетки
проводится следующим образом:
- поместить в штатив пробирки с культурой и питательной средой;
- зажечь горелку;
- извлечь пипетку из пенала (обертки) правой рукой, взяв ее как карандаш;
- взять левой рукой пробирки, как карандаш, разъединив их средним
пальцем и извлечь над пламенем горелки пробки;
- опустить пипетку в микробную культуру;
- после накопления пипетки требуемым объемом культуры, закрыть ее тупой
конец указательным пальцем;
- извлечь пипетку с культурой из пробирки и перенести ее в пробирку с
питательной средой;
- погрузить конец пипетки в среду, отпустить палец и вылить культуру;
- профламбировать края пробирок и закрыть их пробками;
- пипетку поместить в дезраствор, пробирки поставить в штатив.
Посев культуры микроба на поверхность плотной питательной среды
шпателем Дригальского (рисунок 29):
- поместить в штатив стерильную мерную пипетку, развернув бумагу с
тупого конца, стерильный шпатель Дригальского, перед спиртовкой - чашку Петри с
питательной средой;
- взять левой рукой пробирку с культурой, правой рукой - стерильную
пипетку с резиновой грушей;
- извлечь пробку из пробирки, прижав ее мизинцем к ладони,
профламбировать край пробирки и пробку;
- профламбировать пипетку, опустить ее в пробирку, набрать культуру,
извлечь пипетку;
- профламбировать край пробирки и пробку, закрыть пробирку пробкой,
поставить ее в штатив;
- приоткрыть крышку чашки Петри, вылить на среду определенный объем
культуры, закрыть чашку крышкой;
- пипетку погрузить в дезраствор;
- извлечь из бумаги стерильный шпатель Дригальского, приоткрыть крышку
и тщательно растереть каплю по всей поверхности среды, закрыть чашку;
- профламбировать шпатель или поместить его в дезинфицирующий раствор.
37
Рисунок 29 – Схема посева культуры микроба на поверхность плотной питательной
среды шпателем Дригальского. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Посевы в пробирках помещают в штативы, чашки Петри с посевами
размещают на поддонах или в лотках. Посевы инкубируют в термостате в
большинстве случаев при температуре 36ОС в течение 18-24 часов.
38
3. Правила отбора, хранения и транспортировки материала для
микробиологического исследования
Отбор, хранение и транспортировка материала составляют так называемый
преаналитический этап лабораторных исследований. Правила отбора, хранения и
транспортировки
материала
для
микробиологических
исследований
регламентированы:
- Национальным стандартом Российской Федерации ГОСТ Р 53079.4-2008
“Технологии лабораторные клинические. Обеспечение качества клинических
лабораторных исследований. Часть 4. Правила ведения преаналитического этапа”;
- МУ 4.2.2039-05 “Техника сбора и транспортировки биоматериалов в
микробиологические лаборатории”.
В микробиологических исследованиях используют разные виды материалов:
клинический материал из организма больного или носителя, пробы из объектов
внешней среды, пробы пищевых продуктов, лекарственных и косметических
препаратов и др. Материал для культурального исследования из организма больного
отбирается из мест локализации патологического процесса. В качестве
клинического материала из организма больного могут быть использованы гной,
кровь, мокрота, испражнения, моча, промывные воды, ликвор, рвотные массы,
смывы с кожи и слизистых оболочек и другие жидкости и ткани организма.
Пробами из объектов внешней среды могут служить вода, воздух, почва, продукты
питания, смывы с предметов и др.
Материал для исследования отбирают с соблюдением правил асептики. При
лабораторной диагностике инфекционных заболеваний необходимо отбирать
материал до начала антимикробной терапии. Для взятия проб следует использовать
стерильные инструменты, а для их транспортировки - стерильные пробирки или
контейнеры. Использование нестерильных сухих, чистых пробирок допускается
только для отбора и транспортировки крови на серологические исследования.
Количество материала должно быть достаточным для проведения исследования.
Для взятия и транспортировки биологического материала следует
использовать одноразовые стерильные тубсеры (пробирки с тампонами)
промышленного производства или транспортные системы со средой. Нативный
материал доставляют в лабораторию в максимально короткие сроки (для
большинства образцов не позднее 1,5-2 часов после их получения). Допускается
хранение материала в холодильнике при 4ОС. При использовании транспортных
сред биологический материал можно хранить в течение 24 часов. Жидкий
биологический материал можно транспортировать непосредственно в шприце, на
кончик которого надет стерильный колпачок.
Для исследования на анаэробы биологический материал помещают в
анаэробные условия. Для жидких образцов (кровь, гной, экссудат, жидкости из
стерильных полостей) используют специальные флаконы с жидкой питательной
средой, заполненные газовой смесью определенного состава, куда из шприца
уколом иглы через резиновую крышку вносят материал.
Транспортировка осуществляется в металлических биксах (пеналах),
термоконтейнерах, которые должны легко подвергаться обработке.
39
К отобранному материалу прилагают сопроводительный документ, где
указывают наименование, источник и метод получения биологического материала,
дату и время его взятия; фамилию, имя и отчество, пол и возраст больного; название
учреждения, отделения, номер палаты; предполагаемый диагноз и предшествующую
антибактериальную терапию; фамилию и подпись врача, направившего материал
для проведения бактериологического исследования.
Гной отбирают из очагов инфекции пункцией шприцем, а из открытых
очагов – пипеткой или сухим тампоном.
Слизь из зева и носа отбирают стерильным тампоном (рисунок 30).
Рисунок 30 – Тампоны и транспортные среды для отбора проб. Заимствовано из
Интернет-ресурсов.
Полученный материал с тампона немедленно высевают на плотные
питательные среды, а также наносят на предметное стекло, подсушивают и
направляют в лабораторию.
Мокроту собирают в утренние часы после полоскания рта кипяченой водой.
Мокрота собирается после откашливания в стерильную сухую банку с крышкой.
Кровь отбирают шприцем и разводят жидкой питательной средой в
соотношении 1:10 с соблюдением правил асептики. Среду выбирают в зависимости
от биологических особенностей возбудителя предполагаемой инфекции. В
настоящее время кровь для бактериологического исследования отбирают
стерильной вакуумной системой для забора крови одноразового использования
(рисунок 31).
Рисунок 31 – Вакуумные системы и отбор крови для исследования. Заимствовано из
Интернет-ресурсов.
40
Для получения гемокультуры материал отбирают непосредственно во
флаконы, содержащие одновременно плотную и жидкую питательные среды, так
называемые двухфазные системы (рисунок 32).
Рисунок 32 – Флакон с двухфазной системой. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Для получения сыворотки крови или плазмы для серологических
исследований кровь берут натощак в количестве 1 мл в чистую пробирку. При
постановке серологических реакций допускается повторно замораживать и
оттаивать сыворотку до 3 раз при хранении при температуре минус 20ОС. После
размораживания сыворотку следует тщательно перемешать
Ликвор отбирают при спинномозговой пункции.
Рвотные массы собирают в стерильные банки с притертыми пробками и
нейтрализуют 10% раствором карбоната натрия (кальцинированной содой).
Промывные воды желудка собирают в стерильную емкость при
промывании желудка стерильным физраствором.
Испражнения (2–3 г) берут стерильным деревянным шпателем или
стеклянной палочкой из судна, горшка или непосредственно из прямой кишки с
помощью ватных тампонов, металлических петель или через трубку ректоскопа. В
судне не должно быть следов дезинфектантов. Для отбора проб испражнений
используют стерильные одноразовые контейнеры с ложечкой (рисунок 33).
Рисунок 33 – Посуда для отбора проб испражнений. Заимствовано из Интернетресурсов.
41
При исследовании на кишечную и тифо-паратифозную группу
(сальмонеллы, шигеллы) применяют мазок из прямой кишки. В этом случае забор
материала производят в пробирку со средой Кэри-Блейр.
При отборе испражнений из судна стараются отобрать слизь, гной,
фибриновые пленки. При отборе испражнений петлей или тампоном целесообразно
сразу же сделать посев материала на питательную среду. При невозможности
проведения посева у постели больного допускается смыть материал с петли или
тампона в пробирку со стерильным физраствором для отправки в лабораторию.
Желчь (10–20 мл) отбирают во время дуоденального зондирования. В
отдельные пробирки собирают все три порции желчи (А, В и С). Конец зонда
предварительно обрабатывают спиртом, затем после выделения 1–2 мл желчи (для
исследования не используется) наполняют пробирки непосредственно через зонд
или с помощью стерильного шприца.
Мочу (20–30 мл) собирают в стерильную, плотно закрывающуюся посуду
при помощи стерильного катетера после предварительного обмывания половых
органов с мылом и ополаскивания их стерильным физраствором. Для
бактериологического исследования мочи используют среднюю порцию мочи в
количестве 20-40 мл. Для сбора мочи на бакпосев используют также вакуумную
систему для сбора мочи и систему UriSwab с тампоном-губкой (рисунок 34).
а
б
Рисунок 34 – Емкости для отбора мочи (а) и система UriSwab с тампоном-губкой (б).
Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Трупный материал забирается при вскрытии трупа. Для этого поверхность
внутренних органов прижигают раскалённым пинцетом, затем вырезают кусочки
органов 1–2 см3.
При подозрении на анаэробную инфекцию (неприятный запах отделяемого,
гнилостный характер поражения, экссудат серо-зеленого цвета, наличие газа в
тканях и др.) материал отбирают во время вскрытия или дренирования очага в
строго анаэробных условиях. Содержимое замкнутых полостей пунктируют
стерильным шприцем, и материал вносят во флакон с бескислородной газовой
смесью либо в специальную транспортную среду для анаэробов. При анаэробной
инфекции не допускается отбор проб с помощью тампонов и с поверхности ран.
42
Для транспортировки исследуемого материала в лабораторию используют
специальные транспортные среды: Эймса, Кэри-Блейр, Стюарта. Среды
выпускаются в индивидуальных упаковках, стерилизованы оксидом этилена, стик
(палочка) полистироловый, тампон вискозный.
Транспортная среда Эймса (Amies) содержит агар и набор солей (натрия
хлорид, динатрия гидрофосфат, калия дигидрофосфат, калия хлорид, магния хлорид,
натрия тиогликолят). Она используется для транспортировки широкого круга
биоматериалов: отделяемого из наружного уха (на аэробные и факультативно
анаэробные микроорганизмы), слизи и пленок из носа и зева (на возбудителя
дифтерии, стафилококк, возбудителей коклюша и паракоклюша, гемолитический
стрептококк и др.), отделяемого раневых поверхностей (на аэробные и
факультативно анаэробные микроорганизмы), отделяемого урогенитального тракта
(на гонококк) и др. Среда Эймса позволяет более 3 дней поддерживать
жизнеспособность таких
микроорганизмов
как
Neisseria, Haemophilus,
Corynebacterium, Streptococcus, Enterobacteriaceae (рисунок 35).
Рисунок 35 – Транспортная среда Эймса. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Транспортная среда Кэри-Блейр (Cary-Blair) содержит агар и соли (натрия
хлорид, динатрия гидрофосфат, кальция хлорид, натрия тиогликолят). Среда
предназначена для транспортировки возбудителей кишечных инфекций (рисунок
36). Среда Кэри-Блейр позволяет сохранять большинство патогенов, включая
требовательные микроорганизмы (Neisseria sp., Haemophilus sp., Streptococcus sp.).
Данная среда является стандартной для транспортировки анаэробов.
43
Рисунок 36 – Транспортная среда Кэри-Блейр. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Транспортная среда Стюарта (Stuart) содержит агар, натрия тиогликолят,
натрия глицерофосфат, кальция хлорид и метиленовый синий. Среда предназначена
для сохранения и транспортировки широкого спектра патогенных бактерий
(Neisseria gonorrhoeae, Haemophilus influenzae, Corynebacterium diphtheriae и др.).
Наиболее требовательные микроорганизмы сохраняются в данной среде сутки,
остальные – несколько дней. Наличие в среде тиогликолата натрия подавляет
ферментативную активность бактерий, а отсутствие азота предотвращает их
размножение (рисунок 37).
Рисунок 37 – Транспортная среда Стюарта. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Материал для микробиологического исследования от пациента может быть
отобран в лаборатории, в процедурном кабинете или в кабинете лечащего врача.
Отобранный материал отправляют в лабораторию не позднее 24 часов с момента
забора в биксах или в специальных контейнерах (рисунок 38).
44
УКП-50-1
УКП-50-2
УКП-120
Рисунок 38 – Укладка-контейнер для доставки биоматериалов в лабораторию.
Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Транспортировку биологического материала в лабораторию проводят при
соблюдении температурного режима. При невозможности быстрой доставки пробы
в лабораторию материал хранят в холодильнике при температуре плюс 4ОС.
Материал без консерванта допускается хранить в холодильнике при температуре
+4ОС в течение 1-2 суток, а консервированные в 50% глицерине кусочки органов – в
течение нескольких недель.
При необходимости транспортировку биологического материала в
лабораторию осуществляют в термоконтейнерах (рисунок 39).
Рисунок 39 – Медицинский термоконтейнер. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Материал, содержащий анаэробные бактерии, транспортируют в условиях,
исключающих воздействие кислорода. Для взятия такого материала используют
специальные флаконы, заполненные бескислородной газовой смесью и специальной
транспортной средой (рисунок 40).
45
Рисунок 40 – Флаконы для культивирования анаэробов. Заимствовано из Интернетресурсов.
Не подлежат исследованию на анаэробы отделяемое поверхностных ран и
язв, мазки из зева, носа и ротовой полости, мазки из влагалища и цервикального
канала, мокрота и бронхиальные смывы, фекалии (за исключением предполагаемой
Clostridium difficile-ассоциированной диареи).
На транспортировочной таре должна быть этикетка с указанием фамилии
больного и даты забора материала. В сопроводительном документе (направлении)
обязательно указывают название медицинского учреждения, направившего
материал, вид материала, цель исследования, фамилию больного, возраст больного,
предполагаемый клинический диагноз.
В настоящее время маркировка бланка-направления и пробы с
биологическим материалом унифицирована. Для маркировки используют 2 штрихкода с одинаковым номером (рисунок 41).
Рисунок 41 – Штрих-коды для маркировки направления и пробы. Заимствовано из
Интернет-ресурсов.
Один штрих-код наклеивают на бланк-направление в специально
предназначенное для этого место, а другой штрих-код наклеивают на пробу. К
маркировке бланка-направления и пробы предъявляются определенные требования,
которые необходимо строго соблюдать (рисунок 42).
46
Рисунок 42 – Маркировка флаконов и пробирок. Заимствовано из Интернетресурсов.
Для маркировки предметных стекол используют специальные уменьшенные
штрих-коды. При этом штрих-код наносится на шлифованную часть стекла.
При взятии материала для проведения бактериологического исследования
необходимо соблюдать следующие правила:
- биологический материал для исследования отбирается непосредственно из
очага инфекции; в случае отсутствия четко выраженного очага исследуют жидкости
организма (кровь, мочу, спинномозговую жидкость);
- материал для исследования отбирают до начала антибактериальной терапии
или через определенный промежуток времени, необходимый для выведения
антимикробного препарата из организма (от 8 часов до 3 суток в зависимости от
препарата и предполагаемого возбудителя);
- отбор материала производят во время наибольшего содержания в нем
возбудителя заболевания (например, кровь для выделения гемокультуры при
повышении температуры в начале периода озноба);
- при отборе материала необходимо соблюдать правила асептики во
избежание контаминации пробы представителями нормальной микробиоты
организма и микроорганизмами из окружающей среды;
- отбор материала производят стерильными ватными тампонами, шприцами,
другими специальными приспособлениями (петлями, трубками) в стерильную
посуду. Материал для выделения строгих анаэробов получают из патологического
очага путем пункции шприцем, из которого предварительно удален воздух. При
отборе образцов тканей их берут из глубины очага. При использовании тампонов их
после отбора пробы погружают в транспортную среду;
- количество материала должно быть достаточным для повторного
исследования в случае необходимости;
- транспортировку проб материала в лабораторию производят в максимально
короткие сроки для предотвращения размножения посторонних микроорганизмов;
- к направляемой в лабораторию пробе прилагают сопроводительный
документ, содержащий сведения о больном, предполагаемом диагнозе, характере
материала, названии учреждения или отделения, номере истории болезни,
предшествующей антимикробной терапии, дате и времени взятия материала,
подпись врача, направляющего материал для исследования.
47
При отборе проб для микробиологического исследования строго
соблюдают правила асептики для предотвращения заражения людей и среды
обитания микробами, находящимися в пробах, а также загрязнения проб
посторонними микроорганизмами. При отборе материала исключают попадание в
него антибиотиков, антисептиков, дезинфектантов.
Для отбора проб с объектов внешней среды используют стерильные емкости
для образцов (пробирки, колбы, флаконы, пакеты), стерильные приспособления для
отбора проб (пинцеты, шпатели, пипетки). После отбора проб образцы помещают в
стерильные емкости, а приспособления для отбора проб дезинфицируют.
Поступающий в лабораторию для исследования материал регистрируют в
специальном журнале. На пробирках (чашках Петри, колбах) пишут номер
экспертизы. В микробиологической лаборатории поступивший на исследование
материал сохраняют до конца исследования, а по окончании исследования остатки
материала уничтожают путем автоклавирования, посуда и инструменты, бывшие в
контакте с биоматериалом, обеззараживаются.
48
4. Отбор и анализ проб с объектов внешней среды
4.1. Отбор и анализ проб почвы
Микробиологическое исследование почвы проводят для ее санитарной
оценки, изучения процессов обезвреживания отбросов и самоочищения почвы, при
определении пригодности участков для строительства, а также при эпидемиологических и эпизоотологических обследованиях с целью выяснения путей заражения
почвы и продолжительности сохранения в ней патогенных микробов.
Цели санитарно-микробиологического исследования почвы:
- санитарная оценка почвы населенных пунктов и новых участков для
заселения и размещения зданий;
- решение вопросов водоснабжения, канализации и очистки населенных
пунктов;
- санитарная оценка почвы, загрязненной химическими веществами;
- контроль процессов самоочищения почвы, подвергшейся биологическому
загрязнению;
- эпидемиологическое обследование почвы для выяснения путей ее
заражения.
В зависимости от поставленной задачи применяют краткий или полный
санитарно-микробиологический анализ почвы.
Краткий санитарно-микробиологический анализ почвы предусматривает
определение общего микробного числа (ОМЧ), количества бактерий группы
кишечной
палочки
(БГКП),
энтерококков,
Clostridium
perfringens,
термофильных
бактерий,
нитрифицирующих
бактерий.
Полученные
результаты позволяют оценить наличие и степень фекального загрязнения
почвы. Краткий анализ почвы осуществляют при проведении текущего
санитарного надзора за состоянием почвы.
Полный санитарно-микробиологический анализ почвы включает
определение всех показателей краткого анализа, а также общей численности
сапрофитов, общего числа споровых микроорганизмов, количества актиномицетов
и грибов, количества аэробных бактерий, разрушающих клетчатку, и бактерийаммонификаторов.
Полный
анализ
проводят
при
осуществлении
предупредительного санитарного надзора и при первичном обследовании почвы с
целью выбора территории для размещения некоторых объектов (оздоровительных
лагерей, детских учреждений и т. д.).
Обнаружение патогенных микробов в почве проводят только при
расследовании вспышек инфекционных заболеваний. В качестве косвенных
показателей возможного загрязнения окружающих объектов (в том числе и почвы)
патогенными микроорганизмами служат санитарно-показательные микроорганизмы
(СПМ).
Основные характеристики санитарно-показательных микроорганизмов:
- СПМ должны постоянно обитать в организме человека или животных и
постоянно выделяться во внешнюю среду;
- СПМ не должны размножаться на объектах окружающей среды;
49
- длительность выживания СПМ во внешней среде должна соответствовать
длительности выживания патогенных микроорганизмов;
- методы идентификации и дифференциации СПМ должны быть простыми и
надежными.
Количество СПМ выражают в титрах и индексах.
Титр СПМ – это наименьший объём (в мл) или весовое количество (в г)
исследуемого материала, в котором еще присутствует хотя бы одна особь СПМ.
Индекс СПМ – это количество клеток СПМ, обнаруженных в определённом
объёме или весовом количестве исследуемого материала.
Для выявления общей микробной обсемененности определяют общее
микробное число (ОМЧ) путем подсчета всех колоний микроорганизмов,
выросших на питательной среде при посеве 1 г или 1 мл исследуемого материала.
Санитарно-микробиологическая
оценка
почвы
регламентируется
руководящими документами, в частности МУ 2.1.7.730-99 “Гигиеническая оценка
качества почвы населенных мест” и СанПиН 2.1.7.1287-03 “Санитарноэпидемиологические требования к качеству почвы”.
Отбор проб почвы производят с квадратного участка (не менее 5x5 м) из 5
точек - из каждого угла и центра квадрата (“метод конверта”). Образцы почвы
отбирают с соблюдением правил асептики с глубины 20-30 см. Общий объем
отобранной пробы составляет 1 кг (рисунок 43).
Обследуемая территория
Точки отбора
Рисунок 43 – Схема отбора проб почвы.
Доставленную в лабораторию почву освобождают от крупных включений
(камней, корней и др.). Навеску почвы заливают стерильной водопроводной водой в
соотношении 1:10. Полученную суспензию встряхивают, отстаивают и готовят 10кратные разведения от 1:10 до 1:100 при исследовании чистых почв или до 1:10000
при исследовании сильно загрязненных почв.
Для определения общего микробного загрязнения почвенные разведения
высевают в 1,5% мясопептонный агар. Для этого 1 мл почвенной суспензии
(разведения) переносят на дно стерильной чашки Петри. Из каждого разведения
проводят посев в 2 чашки. Затем в каждую чашку вливают 15-20 мл питательного
агара, предварительно расплавленного и остуженного до температуры 45 ОС. Чашки
Петри с агаром и почвенной суспензией осторожно тщательно перемешивают.
50
О
Посевы инкубируют при температуре 37 С в течение 24 часов. После инкубации
подсчитывают выросшие колонии и проводят перерасчет на 1 г сухой почвы.
Для определения БГКП используют метод мембранных фильтров. При этом
через стерильные мембранные фильтры профильтровывают 5-10 мл почвенной
суспензии. По окончании фильтрования фильтры пинцетом переносят на
поверхность среды Эндо, разлитой в чашки Петри. В одну чашку помещают до 4
фильтров. Чашки инкубируют при температуре 37ОС в течение 24 часов.
Для определения в почве Cl. perfringens почвенные разведения (до
1:10000000) по 1 мл переносится в 2 ряда пробирок. Один ряд пробирок прогревают
при температуре 80ОС в течение 15 минут или при температуре 90 ОС в течение 10
минут. Затем во все пробирки вносят по 9-10 мл среды Вильсона-Блэра (или
сульфит-полимиксин-неомициновой среды). Посевы инкубируют при 37ОС в
течение 24 часов. Наличие Cl. perfringens проявляется образованием колоний
черного цвета.
Определение
термофильных
бактерий,
свойственных
почвам,
загрязненным навозом или компостом, производят на мясопептонном агаре. Посев
проводят из разведений 1:10 – 1:10000000. Посевы инкубируют при температуре
60ОС в течение 24 часов.
Присутствие нитрифицирующих бактерий в почве указывает на степень
органического загрязнения, скорость и окончание распада органики в почве.
Определение нитрификаторов проводят путем посева разведений почвенной
суспензии в тонкий слой минеральной среды Виноградского во флаконах. Посевы
инкубируют при температуре 28ОС в течение 14-15 суток. При размножении
нитрифицирующих бактерий в среде появляются азотистая и азотная кислоты. Для
их определения используют качественную пробу с дифениламином. Для этого
несколько капель содержимого флаконов переносят на стеклянную пластинку и
добавляют несколько капель раствора дифениламина в концентрированной серной
кислоте. Появление синего окрашивания свидетельствует о присутствии нитратов
(результат размножения нитрифицирующих бактерий).
Показатели чистоты почв по санитарно-показательным микроорганизмам
представлены в таблице 4.
Таблица 4 – Показатели чистоты почв по СПМ
Категория почвы
Чистая
Загрязненная
Сильно загрязненная
Коли-титр
Перфрингенс-титр
1,0 и выше
0,9-0,01
0,009 и ниже
0,01 и выше
0,009-0,0001
0,00009 и ниже
Количество
термофильных
бактерий в 1 г
102-103
103-105
От 105 до 4х106
Наличие в почве бактерий группы кишечной палочки свидетельствует о ее
свежем фекальном загрязнении. На свежее фекальное загрязнение почвы
указывают не только высокие титры БГКП, но и низкие титры нитрификаторов
и термофилов, а также относительно высокое содержание вегетативных
форм Cl. perfringens. Появление нитрифицирующих бактерий указывает на
развитие процесса самоочищения, так как они завершают цикл разложения
51
азотсодержащих соединений, превращая аммиак в азот. При свежем фекальном
загрязнении нитрификаторов не будет, поскольку отсутствует субстрат для их
развития. В ходе жизнедеятельности микроорганизмов, разлагающих
органические вещества, образуется аммиак, что приводит к накоплению
нитрификаторов. Через 4-5 месяцев после фекального загрязнения БГКП в почве
уже не обнаруживаются, а CI. perfringens еще обнаруживается в титре 0,01.
Следовательно, CI. perfringens свидетельствует о давнем фекальном загрязнении.
Выявление в почве бактерий рода Proteus свидетельствует о загрязнении ее
органическими веществами животного происхождения или фекалиями людей.
Термофильные микроорганизмы попадают в почву с перепревшим навозом
или компостом. В чистых почвах термофилов не обнаруживают. Термофильные
бактерии целесообразно выявлять для выяснения характера и давности
загрязнения почвы органическими веществами. Свежий навоз, сточные воды
обычно содержат много БГКП, но мало термофильных бактерий. По мере
разложения органических веществ количество термофилов увеличивается.
Результаты, полученные при санитарно-микробиологическом анализе
почвы, позволяют оценить также степень ее эпидемической опасности (таблица
5).
Таблица 5 – Оценка степени эпидемической опасности почвы
Категория
загрязнения почвы
Чистая
Умеренно опасная
Опасная
Чрезвычайно
опасная
Индекс БГКП
1-10
10-100
100-1000
1000 и выше
Индекс
энтерококков
1-10
10-100
100-1000
1000 и выше
Патогенные бактерии, в
том числе сальмонеллы
0
0
0
0
Для оценки активности почвенной микрофлоры используют показатель
биологической активности почвы. Биологическую активность почвы определяют
следующими способами:
- подсчетом общего количества почвенных микроорганизмов;
- определением количества отдельных физиологических групп микробов,
например, нитрифицирующих или целлюлозоразлагающих бактерий;
- определением выделяемого почвой диоксида углерода - основной
биохимический способ определения биологической активности почвы. Чем
интенсивнее выделяется углекислый газ из почвы, тем активнее происходят
в ней биологические процессы.
Выделение углекислого газа из почвы в приземный слой атмосферы
называют дыханием почвы. Интенсивность дыхания почвы зависит от ее свойств,
гидротермических
условий,
характера
растительности,
агротехнических
мероприятий. Выделение углекислого газа почвой усиливается при ее
окультуренности.
Уменьшение
выделения
углекислого
газа
почвой
свидетельствует об ухудшении поступления кислорода в почву и способствует
образованию токсичных веществ.
52
Периодичность санитарно-микробиологического контроля почвы зависит
от контролируемых объектов, но не реже 1 раза в год. При изучении динамики
самоочищения почвы на загрязненных территориях пробы берут в течение первого
месяца после загрязнения еженедельно, в последующие месяцы - 1 раз в
месяц в течение вегетационного периода до завершения активной фазы
самоочищения.
4.2. Отбор и анализ проб воды
При санитарно-микробиологической оценке воды ориентируются на
следующие руководящие документы:
- ГОСТ Р 51593-2000 “Вода питьевая. Отбор проб”;
- МУК 4.2.1884-04 “Санитарно-микробиологический и санитарнопаразитологический анализ воды поверхностных водных объектов”;
МУК
4.2.1018-01
“Методические
указания
по
санитарномикробиологическому анализу питьевой воды”;
- СанПиН 2.1.4.1074-01 “Питьевая вода. Гигиенические требования к
качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения. Контроль
качества”;
- СанПиН 2.1.4.1175-02 “Микробиологические нормативы качества воды
нецентрализованного водоснабжения (колодцев, скважин, родников)”.
Показатели санитарно-микробиологического состояния питьевой воды:
- общее микробное число (ОМЧ);
- бактерии семейства Enterobacteriaceae и термотолерантные колиформные
бактерии;
- споры сульфитредуцирующих клостридий;
- колифаги;
- патогенные бактерии кишечной группы.
Определение общего микробного числа (ОМЧ) в питьевой воде проводят
следующим образом. Из каждой пробы делают посев не менее 2 объемов по 1 мл. В
стерильную чашку Петри вносят 1 мл пробы воды и вливают 8-12 мл
расплавленного и остуженного до 45-49ОС питательного агара. Затем содержимое
чашек перемешивают. После застывания агара чашки с посевами помещают в
термостат вверх дном и инкубируют при температуре 37ОС в течение 24 часов.
После этого подсчитывают все выросшие на обеих чашках колонии, суммируют их
и делят на 2. Результат выражают числом колониеобразующих единиц (КОЕ) в 1 мл
исследуемой воды. Если подсчет колоний на чашках невозможен, то в протоколе
отмечают “сплошной рост”.
ОМЧ при оценке качества питьевой воды позволяет оценить уровень не
только фекального загрязнения, но и загрязнения из других источников (например,
промышленных сбросов). Неожиданное увеличение ОМЧ (даже в пределах
норматива), выявленное повторно, служит сигналом для поиска причины
загрязнения. Этот показатель незаменим также для срочного обнаружения в
питьевой воде массивного микробного загрязнения неизвестной природы.
53
Определение общих и термотолерантных колиформных бактерий
проводят методом мембранной фильтрации или титрационным методом. Общие
колиформные бактерии (ОКБ) представляют собой грамотрицательные,
оксидазоотрицательные, не образующие спор палочки, способные расти на
дифференциальных содержащих лактозу средах, ферментирующие лактозу до
кислоты, альдегида и газа при температуре 37ОС в течение 24-48 часов.
Термотолерантные колиформные бактерии (ТКБ) входят в число общих
колиформных бактерий, обладают всеми их признаками, но кроме того способны
ферментировать лактозу до кислоты, альдегида и газа при температуре 44ОС в
течение 24 часов.
Мембранный метод основан на фильтрации определенного объема воды
через мембранные фильтры, инкубировании посевов на дифференциальной
питательной среде с лактозой (среде Эндо) при температуре 37ОС в течение 24
часов и идентификации выросших колоний по культуральным и биохимическим
свойствам. При исследовании используют 3 объема воды по 100 мл. Типичные
лактозоположительные колонии (темно-красные, красные с металлическим блеском
или без него) исследуют на наличие оксидазной активности, отношение к окраске
по Граму и ферментацию лактозы до кислоты и газа. Указанные признаки
определяют с помощью тестов, регламентированных Методическими указаниями.
Грамотрицательные колонии учитываются как ОКБ при отрицательном
оксидазном тесте и ферментации лактозы при температуре 37ОС с образованием
кислоты и газа.
Грамотрицательные колонии учитываются как ТКБ при отрицательном
оксидазном тесте и ферментации лактозы при температуре 44ОС с образованием
кислоты и газа.
Титрационный метод основан на накоплении бактерий при посеве
определенного объема воды в жидкую питательную среду с последующим
пересевом на дифференциальную плотную питательную среду с лактозой и
идентификации колоний по культуральных и биохимическим свойствам. Количество
исследуемых проб и объем исследуемой воды регламентируется Методическими
указаниями. В качестве жидкой питательной среды используют лактозо-пептонную
среду, в качестве плотной питательной среды – агар Эндо. Идентификация колоний
производится аналогично исследованиям при использовании мембранного метода.
Обнаружение в питьевой воде бактерий семейства Enterobacteriaceae
указывает на потенциальную эпидемическую опасность такой воды. Показатель
“бактерии семейства Enterobacteriaceae” - основной нормируемый показатель,
обеспечивающий наиболее надёжный контроль присутствия в воде практически
всех представителей кишечных бактерий.
Термотолерантность быстро утрачивается, поэтому обнаружение бактерий с
таким свойством свидетельствует о недавнем попадании в воду кишечных бактерий
(свежее фекальное загрязнение). Бактерии семейства Enterobacteriaceae и
термотолерантные бактерии должны отсутствовать в 300 мл питьевой воды.
Определение спор сульфитредуцирующих клостридий производят путем
выращивания посевов в железо-сульфитном агаре в анаэробных условиях и
последующего подсчета количества колоний черного цвета. Сульфитредуцирующие
клостридии представляют собой спорообразующие анаэробные палочковидные
54
микроорганизмы, редуцирующие сульфит натрия на железо-сульфитном агаре при
температуре 44ОС в течение 16-18 часов. Количество проб и объем исследуемой
воды регламентируется Методическими указаниями. Перед посевом воду
прогревают при температуре 75ОС в течение 15 минут. Исследование проводят
фильтрационным методом или прямым посевом воды в питательную среду.
Споры
сульфитредуцирующих
клостридий
более
устойчивы
к
обеззараживанию и действию неблагоприятных факторов окружающей среды, чем
другие индикаторные бактерии. На основании этого свойства показатель
рекомендован для оценки эффективности технологических процессов очистки воды.
Особое значение этот показатель имеет при оценке первичного хлорирования, так
как хлорирование инактивирует практически все индикаторные бактерии.
Обнаружение клостридий в воде перед поступлением в распределительную сеть
указывает на недостаточную очистку и на то, что устойчивые к обеззараживанию
патогенные микроорганизмы, вероятно, не погибли при очистке. Споры сульфитредуцирующих клостридий должны отсутствовать в 20 мл исследуемой
питьевой воды.
Определение колифагов в питьевой воде заключается в предварительном
накоплении фагов в среде обогащения на культуре E. coli и последующем
выявлении зон лизиса (просветления) газона кишечной палочки на питательном
агаре. Исследования проводят по методике, изложенной в Методических указаниях,
прямым или титрационным методом. В 100 мл исследуемой воды должны
отсутствовать бляшкообразующие единицы (БОЕ) колифагов.
Для определения микроорганизмов в воде используют приборы вакуумного
фильтрования (рисунок 44), снабженные мембранными фильтрами. После
фильтрования фильтры извлекают и инкубируют на поверхности плотной
питательной среды.
Рисунок 44 – Прибор вакуумного фильтрования.
Принцип метода мембранных фильтров представлен на рисунке 45.
55
Рисунок 45 – Принцип метода мембранных фильтров.
Требования к воде централизованных систем водоснабжения представлены в
таблице 6.
Таблица 6 – Требования к питьевой воде
Наименование объекта
контроля
Вода
централизованных
систем питьевого
водоснабжения
Определяемые
показатели
1. Общее микробное
число (КОЕ/мл)
2. Термотолерантные
колиформные
бактерии (в 100 мл
воды)
3. Общие
колиформные
бактерии (в 100 мл
воды)
4. Коли-фаги (БОЕ в
100 мл воды)
5. Споры сульфитредуцирующих
клостридий (в 20 мл
воды)
Требование
Не более 50
Нормативный
документ
СанПиН 2.1.4.1074-01
Отсутствие
Отсутствие
Отсутствие
Отсутствие
Требования к воде открытых источников, плавательных бассейнов, сточным
водам также регламентированы соответствующими нормативными документами.
4.3. Отбор и анализ проб воздуха
Санитарно-микробиологические показатели воздуха нормируются только
для закрытых помещений в зависимости от их типа и назначения. В таблице 7
представлены критерии оценки воздуха жилых помещений.
56
Таблица 7 – Критерии оценки воздуха жилых помещений
Оценка воздуха
Лето:
чистый
загрязненный
Зима:
чистый
загрязненный
Общее количество бактерий в
1 м3
Количество стрептококков в 1
м3
до 1500
до 2500
до 16
до 36
до 4500
до 7000
до 36
до 124
Исследование воздуха на наличие микроорганизмов осуществляют
седиментационным или фильтрационным методами.
Седиментационный метод Коха предусматривает использование чашек
Петри с питательной средой. Открытую чашку помещают на горизонтальную
поверхность на уровне стола на определенное время. Затем чашку закрывают и
инкубируют в термостате. Ориентировочно по количеству выросших колоний судят
о чистоте воздуха. Воздух оценивается чистым при количестве колоний менее 250,
средне загрязненный – при количестве 250-500 колоний и загрязненный – при числе
колоний более 500. Для выявления стафилококков используют желточно-солевой
агар (ЖСА), стрептококков – кровяной агар (КА), грибов – среду Сабуро.
С помощью седиментационного метода Коха можно определить количество
микроорганизмов в 1 м3 воздуха. Для этого используют перерасчет по формуле В.Л.
Омелянского, с учетом того, что за 5 минут на площади 100 см2 оседает такое
количество бактерий, которое находится
в 10 л воздуха:
Формула
Омелянского
А х 100 х 100
Х = ————————
75 см2
3
Х - количество
в 1 м 3;
Х – количество микроорганизмов
в 1 ммикробов
воздуха;
- количество
колоний
на агаре в чашке
А – количество колонийАна
агаре в чашке
Петри;
2
Петри.
75 см – площадь стандартной
чашки Петри;
100 – коэффициенты перевода на 100 см2 поверхности и 1 м3 объема.
Аспирационный метод основан на принудительном осаждении
микроорганизмов на поверхности плотной питательной среды или в улавливающей
жидкости. С этой целью используют аппарат Кротова, бактериоуловитель
Речменского, прибор ПОВ-1 и другие приборы-аспираторы.
Принцип работы аппарата Кротова для бактериологического исследования
воздуха и его аналога пробоотборника бактериологического Тайфун-Р40 (М)
(рисунок 46) основан на просасывании воздуха через клиновидную щель в крышке
аппарата. Микроорганизмы, находящиеся в воздухе, попадают внутрь камеры и
прилипают к плотной питательной среде в открытой чашке Петри, находящейся под
крышкой аппарата.
Тайфун-Р40 (М), аналог прибора
Кротова
57
а
б
Рисунок 46 – Аппарат Кротова (а) и пробоотборник Тайфун-Р40М (б). Заимствовано
из Интернет-ресурсов.
Аппарат Кротова позволяет контролировать объем отбираемой пробы.
Обычно отбор проб производят со скоростью 20-25 л/мин в течение 5 минут. После
отбора воздуха чашки закрывают крышкой и помещают в термостат.
В некоторых приборах отбираемый воздух фильтруют через жидкость
(рисунок 47). По окончании отбора воздуха с использованием таких приборов
производят
посев жидкостивоздуха
на плотнуючерез
питательную среду. В этом случае можно
Фильтрация
применять элективные питательные среды и проводить специальные
жидкость (прибор
бактериологические исследования.
Дьяконова)
1- трубка для
поступления
воздуха.
2 – трубка,
выводящая воздух
Рисунок 47 – Фильтрация воздуха через жидкость (прибор Дьяконова): 1 – трубка
для поступления воздуха; 2 – трубка, выводящая воздух. Заимствовано из Интернетресурсов.
Современные пробоотборники воздуха (Bio Sas Super, Mas 100 и др.)
отличаются компактностью, дизайном, удобством в работе и другими
преимуществами (рисунок 48).
58
а
б
в
Рисунок 48 – Пробоотборники воздуха: а - Bio Sas Super, б - Mas 100, в – Sampl Air
Lite. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Для помещений разного функционального предназначения установлены
определенные требования к уровням бактериальной обсемененности воздуха. В
частности, СанПиН 2.1.3.1375-03 регламентирует уровни бактериальной
обсемененности воздуха лечебных учреждений в зависимости от их
функционального назначения и класса чистоты (таблица 8).
Таблица 8 – Допустимые уровни бактериальной обсемененности воздушной
среды помещений лечебных учреждений в зависимости от их функционального
назначения и класса чистоты
№№
пп
Класс
чистоты
Название
помещения
1.
Особо
чистые
(А)
2.
Чистые
(Б)
Операционные,
родильные залы,
асептические боксы
для гематологических, ожоговых
пациентов, палаты
для недоношенных
детей, асептический
блок аптек, стерилизационная
(чистая половина),
боксы бактериологических
лабораторий
Процедурные,
перевязочные,
предоперационные,
палаты и залы
Санитарно-микробиологические показатели
Общее
Количество
Количество
количество
колоний S. aureus
плесневых и
микроорганизмов
в 1 м3 воздуха
дрожжевых
3
3
в 1 м воздуха
(КОЕ/м )
грибов в 1 дм3
3
(КОЕ/м )
воздуха
до
во
до
во
до
во
начала
время
начала
время
начала
время
работы работы работы работы работы работы
Не
Не
Не
Не
Не
Не
более
более
должно должно должно должно
200
500
быть
быть
быть
быть
Не
более
500
Не
более
750
Не
должно
быть
Не
должно
быть
Не
должно
быть
Не
должно
быть
59
3.
4.
реанимации,
детские палаты,
комнаты сбора и
пастеризации
грудного молока,
ассистентские и
фасовочные аптек,
помещения
бактериологических
и клинических
лабораторий,
предназначенные
для проведения
исследований
Условно Палаты хирургичесчистые ких отделений,
(В)
коридоры,
примыкающие к
операционным,
родильным залам,
смотровые, боксы и
палаты инфекциионных отделений,
ординаторские,
материальные,
кладовые чистого
белья
Грязные Коридоры и
(Г)
помещения
административных
зданий, лестничные
марши лечебнодиагностических
корпусов, санитарные комнаты,
туалеты, комнаты
для грязного белья
и временного
хранения отходов
Не
более
750
Не
более
1000
Не нормируется
Не
должно
быть
Не
более 2
Не нормируется
Не
должно
быть
Не
должно
быть
Не нормируется
Обеззараживание воздуха закрытых помещений проводят разными
способами, в том числе с использованием газов, аэрозолей или УФЛаэроионизаторов.
60
5. Классические методы выделения и идентификации бактерий
5.1. Бактериоскопическое исследование
5.1.1. Оборудование рабочего места для микроскопирования
Рабочее место для микроскопирования должно быть оснащено всем
необходимым для приготовления препаратов живых или фиксированных микробов,
проведения непосредственно микроскопии и предотвращения контаминации
изучаемыми микробами окружающей среды. Микроскоп должен располагаться на
рабочем столе, устойчивом к сотрясению. Его покрывают материалом (стекло,
пластик), стойким к дезинфектантам. Рабочее место должно иметь хорошее
искусственное освещение. К работе приступают лишь после проверки полной
готовности рабочего места (рисунок 49).
Рисунок 49 – Оборудование рабочего места для микроскопирования. Заимствовано
из Интернет-ресурсов.
Для приготовления препарата для микроскопирования на рабочем столе
кроме микроскопа должны находиться следующие принадлежности и материалы:
штатив, горелка (спиртовка), спички, предметные и покровные стекла в склянке со
спиртом, бактериологическая петля, бактериологическая игла, дезраствор, вата,
салфетки, бутыль с сифоном и с дистиллированной водой для промывания
препаратов, мостик, чашка для окраски препаратов и сбора мусора (кристаллизатор),
кювет с ковриком, склянки с красителями и фиксирующими жидкостями,
карандаши и другие необходимые материалы. Принадлежности рабочего места для
приготовления препаратов для микроскопических исследований представлены на
рисунках 50-53.
61
Рисунок 50 – Устройство для окраски и промывания препаратов.
Рисунок 51 – Пружинный зажим для предметных стекол.
Рисунок 52 – Подставка для предметных стекол.
Рисунок 53 – Набор склянок с пипетками для растворов красок.
Вместо пружинного зажима для предметных стекол используется также
анатомический пинцет. В настоящее время растворы красителей выпускаются в
виде рабочих растворов в полиэтиленовых флаконах.
Уход за световым микроскопом предусматривает соблюдение следующих
правил:
1. Защита микроскопа от пыли колпаком.
2. Исключение прикасания пальцами оптических поверхностей.
3. Чистка и смазка при необходимости движущихся частей с применением
специальной смазки.
4. Регулярная чистка предметного столика.
62
5. Очистка линз от иммерсионного масла после каждого использования
иммерсионной системы тканью, смоченной ксилолом или бензолом. Запрещается
использовать эфир и ацетон.
В таблице 9 представлены основные неисправности светового микроскопа и
способы их устранения.
Таблица 9 - Неисправности микроскопа, их причины и способы устранения
Неисправность
Макровинт вращается с
трудом
Микровинт не движется в
одну из сторон
Возможная причина
Неправильная регулировка
Загрязнение реечного
механизма
Винт находится в крайнем
положении
Расфокусировка при
Объективы плохо
незначительном движении ввинчены в револьвер
микровинта
К объективу пристало
покровное стекло
Неясное пятнистое
Загрязнение линз окуляра,
изображение
объектива или
предметного стекла
Неясное изображение
Загрязнение фронтальной
линзы объектива
Остатки масла на
препарате
Предметное стекло лежит
препаратом вниз
Поле зрения освещено не
Луч света перекрыт
полностью
держателем светофильтра
Объектив не зафиксирован
Поле зрения освещено не
Неправильно расположено
равномерно
зеркало
Нерезкие, яркие пятна в
Загрязнения поверхности
изображении микроба
линз, воздух в
иммерсионном масле
Способ устранения
Отрегулировать
Почистить, смазать
Установить объектив 8х и
микровинт в среднее
положение
Ввинтить объективы
Применить менее вязкое
масло
Проверить вращением
окуляра и перемещением
препарата, очистить
Очистить ксилолом линзу
Удалить
Перевернуть стекло
Убрать держатель
Зафиксировать объектив
Исправить положение
Установить и устранить,
открыть диафрагму
5.1.2. Приготовление препаратов для микроскопирования
Микроскопическое исследование бактерий проводят с целью выявления их
морфологических и тинкториальных особенностей. В зависимости от состояния
микробов в препарате различают препараты живых и неживых (убитых,
фиксированных, окрашенных) микробов. Препараты, приготовленные из живых
микробов, используют для изучения размеров и формы клеток, способа их
63
размножения, подвижности, спорообразования, структуры колоний и других
признаков. Для повышения контрастности изображения клеток микробов и изучения
их субклеточных структур микроорганизмы окрашивают различными красителями.
Для
микроскопического
изучения
формы,
размеров
микробов
(морфологические признаки) и их отношения к красителям (тинкториальные
свойства) готовят препарат на предметном стекле. В качестве исследуемого
материала используют инфицированный материал от больного (кровь, гной,
мокрота и т. д.), чистую бактериальную культуру, выросшую на плотной или в
жидкой питательной среде, другие материалы. Из таких материалов готовят
препарат – мазок. Кроме того, можно использовать отпечаток пораженной ткани
прижизненно или отпечаток ткани отдельных органов при посмертной диагностике
заболевания (препарат – отпечаток). Для приготовления препаратов используют
предметные стекла. Для длительного сохранения препаратов применяют покровные
стекла.
Подготовка предметных и покровных стекол. Прежде чем приступить к
приготовлению микроскопических препаратов, необходимо обработать предметные
и покровные стекла. Они должны быть чистыми и хорошо обезжиренными.
Доказательством хорошего обезжиривания предметных и покровных стекол
является равномерное распределение капли жидкости на их поверхности. Перед
использованием стекло фламбируют.
Новые стекла, не бывшие в употреблении, вначале моют в воде, затем
выдерживают в смеси спирта с эфиром (соотношение 1:1). Из смеси спирта и эфира
стекла фламбируют над пламенем горелки, чем и достигается их обезжиривание.
Новые стекла можно подготовить к работе путем кипячения их в течение 10 минут в
1% растворе натрия гидрокарбоната (соды), промывания в дистиллированной воде
(добавляя к ней до 0,5% соляной кислоты для нейтрализации) и окончательного
ополаскивания в дистиллированной воде.
Стекла, бывшие в употреблении, обрабатывают в концентрированной
серной кислоте или в смеси серной кислоты с калием двухромовокислым (хромовой
смеси). Смесь готовят путем добавления к серной кислоте 5% калия
двухромовокислого. Смесь взбалтывают и оставляют на сутки, после чего он
приобретает темно-оранжевое окрашивание. Хромовая смесь - сильный окислитель,
хорошо удаляющий органические загрязнения. Стекла в моющую смесь погружают
на 1-2 часа, затем промывают в проточной воде, переносят в 5% раствор натрия
гидрокарбоната и кипятят в течение 30 минут. После ополаскивания в чистой воде
их высушивают в сушильном шкафу или при комнатной температуре.
Обработанные стекла хранят в банке с притертой пробкой сухими, со спиртом или в
смеси спирта и эфира (в соотношении 1:1).
Приготовление
мазка
для
микроскопирования.
Мазок
для
микроскопирования должен быть тонким, иметь определенную форму и размеры.
Материал в мазке должен быть распределен равномерно как в центре, так и на
периферии. Хорошо приготовленный тонкий мазок должен быть размером 1-2 см2 и
иметь круглую или овальную форму.
Для приготовления мазка из культуры с плотной питательной среды на
середину чистого предметного стекла наносят небольшую каплю воды. Соблюдая
правила асептики, бактериологической петлей берут немного материала (с
64
булавочную головку) и погружают его в каплю, слегка растирая в ней. Остаток
культуры в петле сжигают на пламени горелки. Остудив петлю, сначала ее краем
равномерно размешивают культуру в капле, а затем равномерными круговыми
движениями распределяют каплю смеси на площади примерно в треть предметного
стекла. После приготовления мазка петлю сразу же фламбируют в пламени горелки
и помещают в штатив.
Для приготовления препарата из жидкой микробной культуры
бактериологическую петлю прожигают на пламени горелки и каплю материала
наносят на поверхность стекла, соблюдая при этом правила асептики. Легкими
круговыми движениями распределяют каплю по стеклу, затем препарат
высушивают на воздухе, а петлю прожигают. Для приготовления препарата в этом
случае можно использовать пастеровскую пипетку, которую после использования
помещают в дезинфицирующий раствор.
Порядок приготовления препарата из микробной суспензии представлен на
рисунке 54.
Рисунок 54 – Схема приготовления препарата – мазка из микробной суспензии.
Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Аналогичным образом готовят мазки из жидкого клинического материала –
ликвора, мочи.
65
Из мокроты и гноя мазки готовят следующим образом: материал петлей
наносят на середину предметного стекла, затем плотно прикрывают его другим
предметным стеклом. Раздвигая предметные стекла в противоположных
направлениях за свободные концы, получают два равномерных мазка (рисунок 55).
Рисунок 55 – Приготовление мазка из мокроты. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Мазок из крови готовится следующим образом. Предметным стеклом
прикасаются к капле крови, выступающей при уколе. Затем стекло берут в левую
руку, а правой рукой к капле придвигают под углом в 45° стекло со шлифованной
стороной, по краю которой капля крови равномерно растекается. Плотно прижимая
стекло и не меняя угла его наклона, продвигают его по предметному стеклу, получая
равномерный мазок (рисунок 56).
1
2
Рисунок 56 - Приготовление мазка крови: 1 – взятие капли крови на предметное
стекло; 2 – мазок из капли делается шлифованным ребром другого стекла.
Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Правильно приготовленный мазок должен быть равномерно тонким,
желтоватого цвета, располагаться на 1–1,5 см от краёв, занимать 2/3 длины стекла и
заканчиваться “метёлочкой”. Густые мазки нецелесообразно использовать, так как в
них морфология клеток плохо различима.
Для приготовления мазка крови “толстая капля” на середину предметного
стекла наносят каплю крови и петлёй распределяют ее по площади около 1 см2.
Стекло оставляют в горизонтальном положении до подсыхания.
Для приготовления мазка – отпечатка стерильным предметным стеклом
прикасаются к пораженной поверхности, затем высушивают и фиксируют препарат.
При исследовании патологического материала (ткань, орган) ножницы, смоченные в
спирте, обжигают на пламени горелки, остужают их и срезают кусочек ткани
66
(органа). Срезом ткани прикасаются к предметному стеклу, оставляя след –
отпечаток.
Высушивание мазков. После приготовления препарат высушивают обычно
при комнатной температуре на воздухе. Хорошо приготовленный тонкий мазок
высыхает равномерно и быстро. Если же высушивание препарата замедлено, то для
ускорения высыхания препарат подогревают, держа стекло мазком вверх, в струе
теплого воздуха высоко над пламенем горелки. Это нужно производить крайне
осторожно, не допуская перегревания мазка, так как при этом может произойти
слишком быстрое свертывание белков в цитоплазме микробной клетки, что
приводит к нарушению ее структуры. Высушивание можно проводить также в
термостате при температуре 36-38°С. Высушивание проводится до появления
сплошного белого налета на поверхности предметного стекла.
Фиксирование препарата. Высохший препарат фиксируют – закрепляют на
стекле. Цели фиксации препарата: инактивация микробов и обеспечение
безопасности дальнейшей работы; плотное прилегание мазка к стеклу; разрушение
микробных мембран для лучшего восприятия красителей. Фиксацию проводят с
использованием физического или химического способа. Чаще пользуются
физическим способом: препарат 2-3 раза проводят над пламенем горелки, не
допуская сильного нагревания стекла.
Из фиксирующих химических средств используют эфир, этиловый или
метиловый спирт, формалин, смеси формалин-спирт, спирт-эфир, ацетон. Для
фиксации высушенный препарат помещают в стаканчик с фиксирующей жидкостью
(или 1-2 капли жидкости наносят на препарат) и выдерживают в среднем 3-5 минут.
Затем мазок промывают водой и высушивают фильтровальной бумагой.
Иногда препараты фиксируют парами альдегидов или кислот. При
фиксировании парами формалина предметные стекла помещают на стеклянные
палочки или спички мазком вниз. При слабом подогревании формалина в чашке
Петри образуются пары, которыми и фиксируется мазок.
По окончании фиксирования на стекле с обратной стороны мазка восковым
цветным карандашом или маркером обводят границу (зону) препарата, чтобы после
окраски точно знать место его нахождения.
5.1.3. Микроскопирование микробов в живом состоянии
Препараты живых микробов используют для изучения размеров и формы
клеток, способа их размножения, подвижности, процесса спорообразования,
структуры колоний и других признаков. Особенность этих препаратов состоит в
том, что в них микробы находятся в естественном, неизмененном состоянии.
Преимуществом этого метода является то, что наблюдение микробов в живом виде
позволяет выявить ряд свойств, не обнаруживаемых у фиксированных микробов,
например, их подвижность.
Вместе с тем микроскопирование микробов в живом состоянии имеет ряд
недостатков: низкая контрастность живых клеток, трудность исследования
неокрашенных микробов ввиду их малой величины, невозможность длительного
67
наблюдения за микробной клеткой в связи с ее быстрым перемещением в поле
зрения (как при активной ее подвижности, так и в силу броуновского движения). В
связи с этим исследование микробов в живом состоянии дает возможность получить
только самое общее представление об их морфологии. Однако исследование в
живом состоянии крупных микроорганизмов (грибки, простейшие и др.) позволяет
изучить тонкую структуру их клетки лучше, чем в окрашенном препарате. При этом
обращение с живыми патогенными микробами требует исключительной
осторожности и соблюдения правил техники безопасности (например, обязательное
погружение препарата в дезинфицирующий раствор после микроскопирования).
Изучение колоний микробов. Для изучения формы и структуры колоний
микробов их выращивают на прозрачных плотных питательных средах, разлитых в
чашки Петри, дно которых ровное, гладкое, без царапин и деформаций, создающих
искаженные изображения или помехи проходящему свету. Колонии изучают в
проходящем свете или при боковом освещении, обращая внимание на форму краев и
поверхности, структуру, размер, окраску колоний. Для микроскопии используют в
этом случае объектив малого увеличения.
Препарат “отпечаток колонии”. Для изучения состояния клеток микробов
в колонии, их взаимного расположения, формы спор и спороносцев мицелиальных
грибов готовят препарат “отпечаток колонии”. С этой целью из плотной
питательной среды вырезают стерильным скальпелем блок с единичной колонией
размером 1x1 см. Блок извлекают и переносят на предметное стекло колонией
кверху. К колонии прикладывают второе обезжиренное сухое предметное стекло
так, чтобы отпечаток колонии пришелся на его середину, слегка прижимая к колонии. Затем верхнее стекло с отпечатком колонии переворачивают отпечатком
кверху, на отпечаток наносят каплю воды, перемешивают. Полученную суспензию
накрывают покровным стеклом, и препарат микроскопируют.
Чаще всего для исследования микробов в живом состоянии готовят
препараты “раздавленной капли” или “висячей капли”. В некоторых случаях
применяют прижизненную (витальную) окраску микробов. Раздавленную или
висячую каплю микроскопируют с помощью сухих систем или с иммерсионной
системой в затемненном поле зрения - при суженной диафрагме и опущенном
конденсоре. Лучше всего их микроскопировать в микроскопе с темным полем
зрения.
Препарат “раздавленная капля” готовится следующим образом. На
середину сухого чистого предметного стекла с соблюдением правил асептики
наносят бактериологической петлей или пастеровской пипеткой каплю
дистиллированной воды или физиологического раствора. В эту каплю
бактериологической петлей вносят микробную массу из колонии и тщательно
перемешивают, получая взвесь бактерий. Жидкую культуру наносят на стекло
пастеровской пипеткой. Каплю осторожно накрывают чистым покровным стеклом
так, чтобы в суспензии не образовались пузырьки воздуха. Для этого краем
покровного стекла прикасаются к поверхности предметного стекла рядом с каплей,
наклоняют покровное стекло над каплей и опускают его. Иногда покровное стекло
слегка прижимают к предметному стеклу, чтобы выдавить пузырьки воздуха из
препарата (рисунок 57).
68
Рисунок 57– Приготовление препарата “раздавленная капля”.
Правильно приготовленная раздавленная капля заполняет все пространство
между покровным и предметным стеклом, но при этом жидкость не выступает за
края покровного стекла. Препарат микроскопируют. С таким препаратом можно
работать в течение 2-4 часов до появления признаков подсыхания. После
микроскопии препарат помещают в дезраствор. Иногда этот препарат называют
препаратом “придавленная капля”. Если требуется рассматривать препарат
продолжительное время, то края покровного стекла предварительно смазывают
вазелином.
Препарат “висячая капля”. Для более длительного (в течение 1-2 суток)
изучения живых микробов готовят препарат “висячая капля”, в котором предотвращают высыхание препарата посредством помещения капли в герметичную камеру
(рисунок 58). В этих условиях изучают размножение, спорогенез и другие свойства
живых микробов.
Рисунок 58 – Процесс приготовления препарата “висячая” капля.
На середину стерильного обезжиренного покровного стекла наносят каплю
жидкой культуры микроба. Края лунки чистого стерильного предметного стекла с
лункой смазывают вазелином. Предметное стекло переворачивают лункой вниз,
слегка прижимают его к покровному стеклу с каплей так, чтобы капля оказалась в
центре лунки, а лунка герметично закрылась покровным стеклом. После этого
предметное стекло вместе с покровным переворачивают. В этом случае капля
должна свободно свисать в лунку предметного стекла, не соприкасаясь с ее дном и
краями.
Препарат рассматривают в слегка затемненном поле (диафрагму сужают),
что увеличивает контрастность неокрашенных форм. При необходимости препарат
помещают в термостат для роста культуры и последующего изучения. После
микроскопирования препарат помещают в дезраствор.
69
5.1.4. Микроскопирование микробов в окрашенном состоянии
Микроскопический метод в диагностике инфекционных болезней носит
ориентировочный характер, так как позволяет выявлять наличие микробов в
препарате, определять форму, размеры, взаимное расположение клеток и их
структуру (морфологические свойства) а также
способность бактерий
окрашиваться определенными красителями, то есть способность воспринимать
красители (тинкториальные свойства). Ценность бактериоскопического метода
состоит в простоте выполнения методик, доступности материалов, в быстроте
получения результатов. Однако специфичность микроскопического метода мала, так
как многие микроорганизмы по морфологии близки друг другу. Чувствительность
этого метода также ограничена, так как концентрация микробных клеток в 1 мл
материала должна составлять в среднем 10·105 клеток и более.
Для бактериоскопического исследования используют световую, фазовоконтрастную, темнопольную, флюоресцентную (люминесцентную) и электронную
микроскопию в зависимости от вида возбудителя. При световой микроскопии
требуется окрашивание исследуемого материала. С этой целью применяют как
простые (щелочной синькой, фуксином), так и сложные методы окраски (по Граму,
Цилю-Нельсену, Бурри-Гинсу, Лёффлеру и др.).
Для повышения контрастности изображения микробных клеток и изучения
их субклеточных структур микроорганизмы окрашивают различными красителями
органической природы. Изучение морфологии микробов в окрашенном состоянии
является наиболее распространенным в микробиологии методом. Он позволяет
изучить морфологические особенности микробов и дает возможность найти
различия между ними, иногда даже точно определить изучаемый микроорганизм.
Этот метод удобен в практической работе, так как значительно легче производить
исследование, пользуясь убитыми микробами, чем живыми (особенно при изучении
патогенных микроорганизмов). Он весьма доступен благодаря сравнительной
простоте техники окрашивания.
Окрашивание микробов не является механическим процессом проникновения
краски в микробную клетку. Механизм окраски микробов следует рассматривать
как физико-химический процесс (адсорбцию краски микробной клеткой). В ряде
случаев различные составные части микробной клетки избирательно окрашиваются
различными красителями.
Фиксированные и окрашенные препараты неживых микробов не опасны,
сохраняются без изменений в течение нескольких недель.
Этапы приготовления препаратов окрашенных микробов:
1. Подготовка предметного стекла: мытье, обезжиривание, высушивание и
фламбирование. На подготовленном стекле делают необходимые надписи.
2. Приготовление мазка микробов на предметном стекле. При
приготовлении препарата каплю суспензии микробов тщательно и равномерно
распределяют по поверхности предметного стекла петлей, создавая пленку в виде
квадрата площадью 1x1 или 1,5х1,5 см. Распределение суспензии по стеклу
проводят до подсыхания жидкости, появления белых пятен по краям пленки. После
этого бактериологическую петлю фламбируют и ставят в штатив.
70
3. Высушивание мазка. Влажный мазок высушивают при комнатной
температуре, в струе теплого воздуха высоко над пламенем спиртовки или в
термостате при температуре 36-38°С до появления сплошного белого налета на
поверхности предметного стекла. Нагревать мазок на пламени горелки для его
высыхания нельзя, так как при этом происходит деструкция микробных клеток.
4. Фиксирование микробов в мазке. Фиксирование препаратов проводят
физическим или химическим способом. При использовании химического способа
высушенный препарат помещают в стаканчик с фиксирующей жидкостью или 1-2
капли фиксирующей жидкости наносят на препарат. Экспозиция - 3-5 минут. В
качестве фиксирующих химических средств чаще всего используют эфир, этиловый
или метиловый спирт, смесь спирта с эфиром в соотношении 1:1 (смесь
Никифорова).
Физический способ фиксации заключается в том, что высушенный
препарат медленно проводят 2-3 раза через верхнюю часть пламени горелки. Затем
препарат остужают на воздухе (рисунок 59).
Рисунок 59 – Физический способ фиксирования препарата.
5. Окрашивание микробов в препарате. Если мазок тонкий и трудно
определить, на какой стороне стекла он находится, достаточно слегка поцарапать
мазок петлей: должен остаться след на месте мазка. Препараты для
микроскопирования окрашивают органическими красителями. После окрашивания
избыток красителя удаляется промыванием струей воды.
Для окрашивания микробов применяются анилиновые краски, поступающие
в продажу в виде сухих порошков, концентрированных растворов или рабочих
растворов. В лабораториях из сухих порошков сначала готовят насыщенные
спиртовые растворы красителей, сохраняющиеся в течение длительного времени, но
сами по себе не пригодные для окраски бактерий. Поэтому из насыщенных
растворов готовят разведенные (рабочие) растворы, которые применяют в
повседневной практике.
Количество красителя при окрашивании препарата должно быть таким, чтобы
покрывать всю поверхность мазка; излишек краски затрудняет его последующее
микроскопирование. Обычно достаточно несколько капель краски, наливаемых при
71
помощи пипетки или капельницы. По истечении времени окрашивания краску
сливают, и препарат промывают легкой струей воды.
6. Высушивание препарата. После промывания препарата от избытка
красителя остатки воды удаляют с предметного стекла. Для этого стекло берут за
края с одного конца пинцетом и, ударяя ребром о мостик, добиваются удаления
больших капель воды. Оставшуюся жидкость удаляют с верхней поверхности
покровного стекла промоканием ее ребром фильтровальной бумаги, с нижней
поверхности - протиранием фильтровальной бумагой. Досушивают препарат на
воздухе. Окрашенный мазок должен быть совершенно сухим, так как остаток воды
образует с иммерсионным маслом, нанесенным на мазок, мутную эмульсию, что
мешает микроскопированию.
Порядок микроскопирования:
1. Установить зеркало микроскопа в соответствии с освещением
(естественное или искусственное) и под малым увеличением (объектив х40, окуляр
х7) отрегулировать совершенно светлое поле зрения.
2. Установить окрашенный препарат с каплей иммерсионного масла на предметный столик микроскопа и закрепить его держателями.
3. Заменить обычный объектив на иммерсионный (х90).
3. Под контролем глаза сбоку осторожно опустить макрометрическим винтом
тубус до погружения иммерсионного объектива в масло.
4. Наблюдая в окуляр, при осторожных поворотах макрометрического винта
определить контуры микробных клеток и с помощью микрометрического винта
добиться их ясного изображения. Изучить препарат. В правильно окрашенном и
хорошо промытом мазке поле зрения остается совершенно светлым и чистым, а
окрашенными оказываются только микробные клетки.
5. Поднять тубус. Убрать препарат. Протереть объектив мягкой салфеткой,
смоченной бензином, чтобы убрать остатки масла.
9. Поставить револьвер в нейтральное положение, подложить под него
салфетку, опустить его до салфетки, закрыть микроскоп колпаком.
При микроскопировании окрашенных мазков полностью открывают
диафрагму и поднимают конденсор до уровня предметного столика микроскопа.
Красители. При окрашивании мазка краситель проникает в микробную
клетку. Это дает возможность рассматривать не только ее внешние признаки, но и
некоторые особенности внутренней структуры клетки. В микробиологической
практике для окрашивания клеток микробов применяют кислотные (кислые,
протоплазматические), нейтральные и щелочные (основные, ядерные) органические
красители. Кислотные красители реагируют со щелочными группами компонентов
клеток, щелочные - с кислотными. Протеины окрашиваются и кислыми, и
щелочными красителями.
Из основных красителей чаще применяют:
- красные красители: фуксин основной феноловый, сафранин, нейтральный
красный, пиронин;
- фиолетовые красители: метиловый фиолетовый, генциановый фиолетовый
(генциан виолет), кристаллический фиолетовый;
- синие красители: метиленовый синий, метиленовый голубой, азур II,
виктория;
72
- зеленые красители: малахитовый зеленый, метиленовый зеленый;
- желто-коричневые красители: везувин, хризоидин.
Из кислых красителей используют:
- красные красители: фуксин кислый, эозин, эритрозин, конго красный;
- желтые красители: пикриновая кислота, конго;
- черные красители: нигрозин.
Растворы красителей могут быть как спиртовые, так и водные. Спиртовые
растворы красителей более устойчивы. Их готовят заранее. Для этого порошок
краски заливают этиловым спиртом (96%) в соотношении 1:10. Насыщенные
растворы хранят в банках с притертыми пробками. Водные растворы красителей нестойки и окрашивают медленно. Для усиления действия красителя к нему
добавляют протравляющее вещество, которое повышает стойкость водно-спиртовых
растворов, способствует разрыхлению оболочки и лучшему прокрашиванию
микробов. В качестве протравляющих веществ используют спирт, формалин, фенол,
щелочи.
В лабораторной практике наиболее часто применяют следующие красители и
растворы.
Красные
красители
представлены
преимущественно
фуксином
(солянокислым, уксуснокислым или сернокислым розанилином, дериватом
трифенилметана), который употребляется в микробиологической практике чаще
всего. Он готовится в виде концентрированного карболового раствора - фуксина
Циля, очень стойкого и пригодного для окраски в течение многих месяцев. В таком
виде он употребляется только для бактерий, с трудом воспринимающих окраску
(для окрашивания кислотоустойчивых и спорообразующих бактерий). Для окраски
большинства бактерий фуксин Циля разводят в 10 раз дистиллированной водой,
получая так называемый “разведенный фуксин” или “водный фуксин”. Разведенный
фуксин очень нестоек и поэтому готовится непосредственно перед применением.
Фуксин основной, насыщенный спиртовый раствор:
Фуксин основной
10 г
Этанол (96%)
100 мл
Фуксин основной вносят в этанол, перемешивают, смесь оставляют на сутки
для насыщения раствора.
Фуксин основной карболовый (фуксин Циля):
Насыщенный спиртовый раствор основного фуксина
10 мл
Водный раствор фенола (5%)
100 мл
Растворы спешивают, через 48 часов смесь фильтруют. Краситель отличается
устойчивостью.
На практике применяют также следующий рецепт приготовления
карболового фуксина:
Фуксина (основного)
1г
Карболовой кислоты кристаллической
5г
Спирта 96°
10 мл
Глицерина
несколько капель
Воды дистиллированной
100 мл
Порошок фуксина тщательно растирают с карболовой кислотой в ступке,
добавив несколько капель глицерина; во время растирания приливают понемногу
73
спирт. Когда смесь превратится в полужидкую кашицу (без комков), приливают
понемногу, продолжая все время размешивать, дистиллированную воду. Дают
постоять 2 суток, после чего фильтруют.
Фуксин основной, водно-спиртовый или водный (Пфейффера):
Карболовый фуксин Циля 1 мл
Вода дистиллированная
9 мл
Разбавленный раствор фенола нестоек, поэтому его готовят перед
применением.
Синие красители представлены метиленовым синим и метиленовым
голубым.
Метиленовая синька, метиленовый синий или метиленовая синь (тиазин,
тетраметилтионин) готовится заранее в виде насыщенного раствора.
Метиленовый синий, насыщенный раствор:
Метиленовый синий 3 г
Этанол (96%)
100 мл
Компоненты смешивают, оставляют на 2-3 суток при периодическом
перемешивании, затем фильтруют. Раствор устойчив при хранении.
Метиленовый синий, разбавленный раствор:
Насыщенный раствор метиленового синего 1 мл
Вода дистиллированная
40 мл
Уксуснокислая синька Нейссера:
Метиленовый синий
0,1 г
Этанол (96%)
2 мл
Уксусная кислота
5 мл
Дистиллированная вода
100 мл
Метиленовый синий по Лёффлеру:
Насыщенный раствор метиленового синего 30 мл
Вода дистиллированная
100 мл
Гидроокись калия, 1% раствор
1 мл
После смешивания компонентов смесь выдерживают в течение суток и
фильтруют, после чего краситель готов к употреблению. Раствор стойкий и хорошо
хранится в течение длительного времени.
Фиолетовые красители представлены генциановым фиолетовым,
кристаллическим фиолетовым и эритрозином.
Генциановый фиолетовый феноловый раствор:
Раствор I.
Генциановый фиолетовый
1г
Этанол (96%)
10 мл
Раствор 2.
Фенол
2,5 г
Вода дистиллированная
до 100 мл
После полного растворения генцианового фиолетового растворы смешивают.
Карболовый генцианвиолет готовят по следующему рецепту:
Генцианвиолет
1г
Карболовая кислота кристаллическая
5г
Спирт (96%)
10 мл
74
Глицерин
несколько капель
Вода дистиллированная
100 мл
Порошок генцианвиолета тщательно растирают с карболовой кислотой в
ступке, добавив несколько капель глицерина; во время растирания приливают
понемногу спирт. Когда смесь превратится в полужидкую кашицу (без комков),
приливают понемногу, продолжая все время размешивать, дистиллированную воду.
Дают постоять 2 суток, после чего фильтруют.
Кристаллический фиолетовый (по Хукеру):
Раствор I.
Кристаллический фиолетовый
2г
Этанол (96%)
20 мл
Раствор 2.
Аммоний щавелевокислый
0,8 г
Вода дистиллированная
80 мл
Растворы смешивают и выдерживают перед использованием 2 суток.
Раствор эритрозина:
Эритрозин
3г
Вода дистиллированная
200 мл
Фенол
5г
После растворения эритрозина и фенола смеси дают отстояться сутки.
Из числа черных красителей применяют жидкую тушь. Жидкую
натуральную тушь разводят водопроводной водой в десять раз (1 мл туши в 9 мл
воды), разливают в пробирки по 3-5 мл, автоклавируют при 0,5 ати. После этого
суспензии дают отстояться 2 недели и используют для окраски некоторых
компонентов клетки, в частности – капсул.
Сафранин. 2 г краски растворяют в 100 мл смеси спирта этилового 96%-ного
и дистиллированной воды поровну или в 100 мл кипящей дистиллированной воды.
Фильтруют.
Малахитовый зеленый (водный раствор). 1 г краски растворяют в 100 мл
дистиллированной воды. Фильтруют.
Конго красный. 3 г краски растворяют в 100 мл дистиллированной воды.
Раствор Люголя. 2 г калия йодида растворяют в 25 мл дистиллированной
воды. Затем к раствору добавляют 1 г йода кристаллического, доводят до 300 мл
дистиллированной водой, фильтруют.
Раствор везувина:
Везувин
2г
Спирт (96%)
60 мл
Дистиллированная вода
40 мл
Смесь кипятят, после охлаждения – фильтруют.
Для выявления и дифференциации различных структур клеток микробов
разработано большое количество способов окрашивания фиксированных препаратов
микробов. В зависимости от числа применяемых красителей принято подразделять
способы окрашивания на простые и сложные (дифференциальные). В простых
способах применяют один краситель, в сложных – несколько красителей. Простая
окраска позволяет изучать общую морфологию микробов. При этом вся клетка
окрашивается в один цвет, но разные структуры клетки окрашиваются с разной
75
интенсивностью. При сложных (дифференциальных) способах окраски разные
структуры клетки окрашиваются в разные цвета.
Простой метод окрашивания. При простой окраске обычно употребляется
только одна краска, чаще всего красная (фуксин Пфейффера) или синяя
(метиленовая синька по Лёффлеру). Фуксин красит быстрее (1-2 минуты) и
интенсивнее и окрашивает одинаково все виды бактерий. Синька красит медленнее
(3-5 минут), менее ярко, но она дает окраску различной интенсивности у разных
видов бактерий.
Техника простого окрашивания. Фиксированный препарат помещают на
мостик, находящийся над кристаллизатором. На препарат из капельницы наносят 12 капли раствора красителя. Окрашивание препарата можно также производить в
емкости с раствором красителя или с помощью полоски фильтровальной бумаги. В
этом случае полоску бумаги помещают на препарат и смачивают 2 каплями раствора
красителя, добиваясь плотного прилегания полоски к поверхности стекла. Для
окрашивания используют также полоски фильтровальной бумаги, предварительно
пропитанные красителем и высушенные. Такую полоску бумаги накладывают на
препарат, наносят на нее несколько капель дистиллированной воды и выдерживают
необходимое для окрашивания время.
При всех способах окраски краситель на препарате выдерживают в течение
1-2 минуты. По истечении этого времени избыток красителя сливают (убирают
полоску бумаги), остатки красителя смывают дистиллированной водой и препарат
высушивают.
Сложные методы окрашивания основаны на особенностях физикохимического строения отдельных структур микробной клетки. Эти методы
применяются для детального изучения структуры клетки, а также для
характеристики и дифференциации одних микробов от других. Для сложного
окрашивания используют несколько красителей. В лабораторной практике из
сложных методов окрашивания применяют метод Грама, Циля-Нельсена, и
некоторые другие. Чаще всего в микробиологических лабораториях используют
окраску по Граму.
Окраска бактерий по Граму. Метод окраски по Граму является самым
универсальным из сложных способов окраски. Все бактерии по своему отношению
к этому методу разделяются на две группы: красящиеся по Граму грамположительные (грампозитивные), и не красящиеся по Граму грамотрицательные (грамнегативные). Отношение к окраске по Граму является
важным дифференцирующим признаком бактерий и обязательно используется при
их характеристике. Окраска по Граму позволяет предварительно оценить морфотип
бактерий (в первую очередь - отношение бактерий к группе грамотрицательных или
грамположительных микроорганизмов) и их морфологию (кокки, палочки и др.).
Окрашивание микробов по Граму зависит от химического состава клеточной
стенки бактерий (рисунок 60).
грамположительных бактерий
Тейхоевые кислоты
Пептидогликан
Наружная
мембрана
Клеточная стенка
грамотрицательных бактерий
Липополисахарид
Фосфолипид
76
НМ
Липопротеин
Пептидогликан
Цитоплазматическая
Цитоплазмамембрана
тическая
мембрана
Пептидогликан
Периплазматическое
пространство
Цитоплазматическая
мембрана
а
б
Рисунок 60 – Схема строения оболочек грамположительных (а) и
грамотрицательных (б) бактерий.
В стенке грамположительных микробов содержится большое количество
пептидогликана, поры которого при обработке этиловым спиртом сужаются и
препятствуют выходу комплекса, образующегося при взаимодействии генцианового
фиолетового с компонентами клетки в присутствии йода. Поэтому
грамположительные микробы прочно удерживают краситель и бывают окрашены в
фиолетовый цвет.
У грамотрицательных микробов не образуется прочного соединения основных
красителей, они легко обесцвечиваются этиловым спиртом, и краситель
вымывается. Такие клетки дополнительно окрашивают другим красителем –
фуксином в красный (розовый) цвет.
Методика окрашивания бактерий по Граму: на фиксированный препарат
наносят несколько капель раствора генцианового фиолетового или помещают
полоску фильтровальной бумаги, на которую наливают раствор красителя.
Краситель выдерживают в течение 1-2 минут, после чего избыток красителя
сливают или снимают фильтровальную бумагу. Не промывая препарата, наносят
несколько капель раствора Люголя и выдерживают в течение 1-2 минут до
почернения препарата. Избыток красителя сливают. На препарат наносят несколько
капель этилового спирта (96%) и выдерживают в течение 30 секунд. После этого
спирт сливают, препарат промывают водой, избыток воды сливают. На препарат
наносят несколько капель раствора фуксина и выдерживают в течение 1-2 минут.
Избыток красителя смывают водой. Препарат высушивают фильтровальной бумагой
и досушивают на воздухе. После высушивания препарат микроскопируют с
иммерсионной системой.
Метод Грама в модификации А.В. Синева предусматривает использование
фильтровальной бумаги, пропитанной генциановым фиолетовым, приготовленным
по следующему рецепту: генциановый фиолетовый - 1 г, спирт этиловый 96% - 100
мл, глицерин - 5 мл. Фильтровальную бумагу пропитывают красителем,
высушивают и нарезают полосками по размеру покровного стекла. При
окрашивании на фиксированный мазок помещают полоску фильтровальной бумаги,
наносят несколько капель дистиллированной воды и выдерживают в течение 2
минут. После этого бумагу снимают, оставшуюся жидкость сливают, препарат
промывают водой. Затем на препарат последовательно наносят раствор Люголя на 2
минуты, этиловый спирт на 20-30 секунд и снова промывают водой. В заключении
на препарат на 1-2 минуты наносят раствор фуксина, избыток красителя смывают
77
водой, препарат высушивают при комнатной температуре или фильтровальной
бумагой (рисунок 61).
Рисунок 61 – Грамположительные кокки (синие) и грамотрицательные палочки
(розовые) при окраске по Граму. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Прибор для автоматической
Для окраски бактерий по Граму выпускаются специальные приборы
окраски по Граму
PREVI®Color, позволяющие автоматизировать процесс окрашивания (рисунок 62).
Рисунок 62 – Прибор для окраски бактерий по Граму. Заимствовано из Интернетресурсов.
Прибор PREVI®Color позволяет окрашивать до 30 слайдов за 5 минут,
причем все слайды окрашиваются стандартно.
Окраска по Граму может быть заменена тестом Грегерсена, не требующим
микроскопирования. Тест Грегерсена заключается в следующем: в капле 3%
водного раствора едкого калия на предметном стекле эмульгируют бактерийную
массу, взятую с плотной питательной среды. После нескольких секунд
перемешивания петлей взвесь ослизняется и за петлей тянутся слизистые нити, что
указывает на принадлежность испытуемой культуры к грамотрицательному виду
бактерий. У грамположительных бактерий слизистые нити не образуются - реакция
отрицательная.
Окраска кислотоустойчивых бактерий. Кислотоустойчивыми называют
бактерии, которые с трудом воспринимают красящие вещества в результате наличия
в клеточной стенке специфических компонентов (липиды, воска). Предложено
78
несколько способов воздействия на клеточную стенку кислотоустойчивых
бактерий (карболовой кислотой, высокой температурой). Основным способом
окраски кислотоустойчивых бактерий является способ Циля-Нельсена. Именно этим
способом пользуются для обнаружения кислотоустойчивых туберкулезных палочек
в мокроте больных туберкулезом.
Для окраски по Цилю-Нельсену на фиксированный мазок помещают
полоску фильтровальной бумаги и наносят несколько капель карболового фуксина
Циля. Можно использовать заранее заготовленную пропитанную фуксином и
высушенную фильтровальную бумагу, на которую наносят 2-3 капли воды. Мазок с
краской 2-3 раза подогревают на пламени спиртовки до появления паров, каждый
раз отставляя препарат в сторону для охлаждения. Бумажку с краской снимают, и
остывший препарат промывают водой. Препарат обесцвечивают 5% раствором
серной кислоты и тщательно промывают водой. Докрашивают препарат раствором
метиленовой синьки в течение 3-5 минут. Кислотоустойчивые бактерии по методу
Окраска микобактерий по ЦилюЦиля-Нельсена окрашиваются в красный цвет, некислотоустойчивые бактерии - в
Нильсену
синий цвет (рисунок 63).
Рисунок 63 – Окрашивание микобактерий туберкулеза (рубиново-красные палочки)
методом Циля-Нельсена. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Для окрашивания некоторых бактерий (в частности, спирохет) используют
метод Романовского-Гимзы. Краска Романовского-Гимзы – это смесь азура, эозина
и метиленовой синьки. Раствор этой краски сине-фиолетового цвета. Она
окрашивает цитоплазму клеток в голубой цвет, а ядра клеток, зернистость, слизь,
капсулы бактерий - в красно-фиолетовый цвет. Окрашивание по РомановскомуГимзе позволяет обнаружить различные структурные компоненты клеток.
Непосредственно перед окрашиванием бактерий к 10 мл дистиллированной воды
добавляют 10 капель краски Романовского-Гимзы и тотчас же наливают на
фиксированный препарат (или погружают препарат в стаканчик с краской). Через 1
час краску сливают, препарат промывают водой, высушивают на воздухе и
микроскопируют (рисунок 64).
79
Рисунок 64 – Микроскопическая картина боррелий, окраска по РомановскомуГимзе. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Для выявления некоторых структурных компонентов бактериальной клетки
разработаны специальные методы окраски.
Для выявления капсулы у бактерий применяют метод окрашивания Бурри
или Бурри-Гинса. Для окраски по методу Бурри на предметное стекло наносят
каплю туши, а рядом с ней - каплю исследуемого материала. Обе капли тщательно
перемешивают и с помощью стекла со шлифованным ребром из полученной смеси
готовят толстый мазок. После высыхания на мазок наносят иммерсионное масло и
микроскопируют с иммерсионной системой. На черном фоне микробные клетки
выглядят в виде темных тел, окруженных светлой зоной (рисунок 65).
Рисунок 65 – Окраска капсулы по методу Бурри. Заимствовано из Интернетресурсов.
При окраске капсулы по методу Бурри-Гинса мазок высушивают,
фиксируют на пламени спиртовки и окрашивают тушью и фуксином или
сафранином в течение 2-3 минут. Краситель сливают, мазок высушивают и
микроскопируют с иммерсионной системой. Бактерии окрашиваются в красный
цвет, капсулы остаются неокрашенными и четко выделяются на черном фоне
(рисунок 66).
80
Рисунок 66 – Окрашивание капсулы методом Бурри-Гинса. Заимствовано из
Интернет-ресурсов.
Для выявления капсулы бактерий используют также метод Ольта. При этом
мазок окрашивают 2-3% раствором сафранина. Краситель готовят перед
употреблением, растворяя его в горячей воде с последующим фильтрованием.
Окрашивают при легком нагревании в течение 1-3 минут и быстро промывают
водой. Препарат не высушивают, на нем должна быть вода, накрывают покровным
стеклом и рассматривают под иммерсионной системой микроскопа. Световые лучи,
проходя через слой воды, усиливают разницу в преломлении лучей от капсулы и
тела микробной клетки. В поле зрения микроскопа видно, что тела микробных
клеток окрашены в красный цвет, капсулы - в желтый (рисунок 67).
Капсула
Бактерия
Рисунок 67 – Окрашивание капсулы по методу Ольта. Заимствовано из Интернетресурсов.
Метод Михина также используется для выявления капсулы бактерий.
Фиксированный мазок окрашивают метиленовым голубым Лёффлера в течение 2-3
минут при подогревании. Краситель быстро смывают водой, мазок высушивают.
При микроскопировании микробные клетки выглядят темно-синими, капсулы светло-розовыми (рисунок 68).
81
Рисунок 68 – Окрашивание капсулы по методу Михина. Заимствовано из Интернетресурсов.
Окраска спор бактерий. Споры с трудом подвергаются окрашиванию. В
обычных методах окрашивания споры не прокрашиваются красителями, оставаясь
совершенно бесцветными внутри окрасившихся вегетативных клеток. Это позволяет
изучать расположение, величину и форму споры. Для прокрашивания спор требуется специальная обработка мазка путем предварительного прогревания в кислоте
для размягчения споровых оболочек или протравливания с помощью
концентрированных щелочных растворов красок при высокой температуре.
Окрашивание спор бактерий проводят методами Циля-Нельсена или Ауески
(Ожешко).
При окрашивании спор по методу Ауески (Ожешко) на предметном стекле
готовят густой мазок исследуемой культуры, высушивают его и, не фиксируя,
наливают на него 0,5% раствор соляной кислоты. Препарат подогревают в течение 2
минут до появления паров. Кислоту сливают. После этого препарат промывают
водой, высушивают и фиксируют. Далее препарат окрашивают по методу ЦиляНельсена. Для этого на препарат помещают полоску фильтровальной бумаги и
наносят несколько капель карболового фуксина Циля. Препарат вновь подогревают
на пламени спиртовки до появления паров. Затем препарат обесцвечивают 5%
серной кислотой и докрашивают дополнительно метиленовой синькой в течение 3-5
минут. Споры окрашиваются фуксином в ярко-красный цвет, а вегетативные клетки
обесцвечиваются серной кислотой и окрашиваются метиленовой синькой в синий
цвет (рисунок 69).
Рисунок 69 – Окраска спор Bacillus cereus методом Ауески. Заимствовано из
Интернет-ресурсов.
82
Окрашивание спор по методу Златогорова. Мазок фиксируют над
пламенем горелки. Затем на поверхность мазка помещают полоску фильтровальной
бумаги, пропитанной основным феноловым фуксином Циля. Бумагу смачивают 3-5
каплями воды. Препарат подогревают в течение 5-7 минут, обесцвечивают 3%
водным раствором серной кислоты в течение 5-10 секунд и промывают водой.
Дополнительное окрашивание проводят метиленовым голубым в течение 2-3 минут,
после чего мазок промывают водой и высушивают. Споры окрашиваются в красный
цвет, а вегетативные клетки - в синий.
Окрашивание спор по Пешкову. После фиксации препарата над пламенем
горелки мазок окрашивают метиленовым голубым Лёффлера в течение 15-20
секунд, подогревая над пламенем спиртовки. Препарат промывают водой.
Дополнительное окрашивание проводят 0,5% водным раствором нейтрального
красного в течение 30 секунд. Затем препарат промывают водой и высушивают. При
этом методе споры окрашиваются в красный цвет, а вегетативные формы – в синий
или фиолетовый цвет (рисунок 70).
Рисунок 70 – Окраска спор по методу Пешкова. Заимствовано из Интернетресурсов.
Окрашивание жгутиков по методу Лайфсона. Для окраски жгутиков
используют три основных раствора: основный фуксин в 95% этиловом спирте –
1,2%, таниновая кислота в дистиллированной воде – 3%, хлористый натрий в
дистиллированной воде – 1,5%. Краску готовят, смешивая равные части трех
основных растворов. На высушенный препарат бактерий с помощью пастеровской
пипетки наносят 1 мл краски и окрашивают в течение 5 - 15 минут. Осадок краски
на жгутиках делает их толще и окрашивает в красный цвет (рисунок 71).
83
Рисунок 71 – Жгутики Bacillus cereus, окраска по Лайфсону. Заимствовано из
Интернет-ресурсов.
Окрашивание жгутиков бактерий по методу Леффлера (щелочным
метиленовым синим). Взвесь бактерий вносят в каплю воды (не размазывая ее
петлей), нанесенную на предметное стекло, и дают высохнуть. Для обеспечения
сохранности жгутиков необходимо чрезвычайно осторожное обращение с мазком во
время всех манипуляций. Обрабатывают 15-20 минут при комнатной температуре
протравой следующего состава: 1 мл насыщенного спиртового раствора фуксина и
смесь из 10 мл 25% водного раствора танина с 5 мл насыщенного водного раствора
сернокислого железа (протраву готовят за несколько суток до употребления; перед
употреблением ее отфильтровывают). Препарат тщательно промывают водой,
высушивают на воздухе. Докрашивают фуксином Циля в течение 3-4 минут при
легком подогревании (без образования паров). Затем препарат промывают водой,
высушивают над пламенем горелки. Жгутики окрашиваются в красный цвет.
Окрашивание жгутиков по Морозову (серебрение). Предварительно
осторожно готовят взвесь культуры бактерий в 1% растворе формалина. Несколько
капель полученной взвеси наносят на предметное стекло. Капли высушивают на
воздухе, не распределяя их по поверхности стекла. Затем на высушенный препарат
наносят ледяную уксусную кислоту с формалином на 1 минуту. Остаток протравы
сливают, и препарат промывают водой. После подсыхания на препарат наносят
раствор танина с карболовой кислотой и в течение 1 минуты препарат прогревают
над пламенем горелки до появления паров. Препарат снова промывают водой. На
подсушенный препарат наносят раствор нитрата серебра и выдерживают до
появления темно-коричневой окраски. Окрашенный препарат промывают водой,
высушивают и микроскопируют. Тела микробных клеток окрашиваются в черный
цвет, жгутики приобретают коричневый цвет (рисунок 72).
84
Рисунок 72 – Окраска жгутиков бактерий по Морозову. Заимствовано из Интернетресурсов.
Окрашивание зерен волютина по методу Нейссера. Фиксированный мазок
окрашивают уксуснокислой синькой в течение 1 минуты. Затем краску сливают,
препарат промывают водой и обрабатывают раствором Люголя в течение 20-30
секунд. Не промывая водой, мазок окрашивают везувином в течение 10-15 секунд.
Затем препарат промывают водой, высушивают и исследуют с иммерсионной
системой. Тела бактерий окрашиваются в нежный светло-коричневый цвет, зерна
волютина - в темно-синий, почти черный цвет (рисунок 73).
Рисунок 73 – Окраска зерен волютина в клетках C. diphtheriae по Нейссеру.
Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Окрашивание зерен волютина методом Омелянского. Приготовленный
мазок фиксируют над пламенем горелки и окрашивают в течение 30 секунд
карболовым фуксином Циля. После промывания мазок обесцвечивают 1%
раствором серной кислоты в течение 20-30 секунд. Затем мазок вновь промывают
водой и дополнительно окрашивают слабым раствором метиленового голубого
(1:40) в течение 15-20 секунд. Микроскопическая картина: гранулы волютина
красные, цитоплазма синяя.
Окрашивание гликогена проводится путем добавления к капле культуры
такого же количества раствора Люголя. При соединении с раствором Люголя
гликоген приобретает красно-бурую окраску.
85
Окрашивание зерен гранулезы осуществляется следующим образом. К
капле микробной культуры добавляют каплю раствора Люголя и накрывают
покровным стеклом. Под иммерсионной системой микроскопа видны микробные
клетки и окрашенные в синий цвет зерна гранулезы.
Окрашивание капель жира производят спиртовым раствором Судана III
(0,05 г Судана III в 100 мл 96% этилового спирта). Для этого к капле культуры
добавляют краситель и тщательно перемешивают. Препарат высушивают и
микроскопируют. Капли жира окрашиваются в красный цвет, а цитоплазма
бактерий остается неокрашенной.
Более демонстративно окрашивается жир при добавлении к капле культуры
40% раствора формалина. Через 5 минут после этого на препарат наносят каплю
метиленового голубого (1:40), а по истечении 10 минут столько же Судана III.
Капли жира принимают розовую или оранжевую окраску, цитоплазма клетки синюю.
Для выявления отдельных структур бактериальной клетки применяют и
другие сложные методы окрашивания (таблица 10).
Таблица 10 – Сложные методы окрашивания клеточных структур бактерий
Структура бактерий
Клеточная стенка
Метод окрашивания
У некислотоустойчивых –
метод Грама
У кислотоустойчивых – метод
Циля-Нельсена
Споры
Метод Ауески
Капсула
Метод Бурри-Гинса
Жгутики
Метод Морозова
Нуклеоид
Метод Романовского-Гимзы
Зерна волютина
Метод Нейссера
Вид препарата
Грамположительные бактерии
– фиолетовые
Грамотрицательные бактерии розовые
Кислотоустойчивые бактерии –
красные
Некислотоустойчивые
бактерии - синие
Споры – красные
Вегетативные клетки - синие
Капсула бесцветная
Микробная клетка - красная
Жгутики – светло-желтые
Микробная клетка – темнокоричневая
Нуклеоид – фиолетовый
Цитоплазма – бледно-розовая
Зерна волютина – синие
Микробная клетка - желтая
Фазово-контрастная
микроскопия
(метод
фазового
контраста)
представляет собой метод микроскопического исследования малоконтрастных
неокрашенных объектов, не видимых при обычной световой микроскопии
(например, неокрашенных живых бактерий). Для фазово-контрастной микроскопии
используют специальное устройство, состоящее из фазового конденсора, фазовых
объективов, вспомогательного микроскопа и светофильтров. Получаемое
изображение называется фазово-контрастным (рисунок 74).
86
Рисунок 74 – Фазово-контрастная микроскопия Bacillus cereus. Заимствовано из
Интернет-ресурсов.
При темнопольной микроскопии (при использовании метода темного поля)
объект освещается сбоку, поэтому исследователем воспринимаются отраженные
лучи. При темнопольной микроскопии можно обнаружить частицы, которые при
светлопольной микроскопии не видны. При темнопольной микроскопии изучают
движение живых неокрашенных бактерий, например, спирохет. Препарат для
темнопольной микроскопии готовят методом “раздавленная” или “висячая” капля.
Неосвещенное поле зрения остается темным, а бактерии выглядят ярко светящимися
(рисунок 75).
Рисунок 75 – Treponema pallidum при исследовании методом темнопольной
микроскопии. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
При темнопольной микроскопии можно увидеть только контуры объекта, но
невозможно изучить их структуру.
Фазово-контрастная и темнопольная микроскопия позволяют провести
прижизненное изучение микроорганизмов.
Люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия основана на явлении
люминесценции (флюоресценции) - способности объекта под влиянием падающего
света (сине-фиолетового света или ультрафиолетовых лучей) испускать лучи с
большей длиной волны и другого цвета. При люминесцентной микроскопии
используют как естественную (первичную, собственную) люминесценцию
микробов, так и искусственную (вторичную, наведенную) люминесценцию.
Собственная люминесценция наблюдается без предварительного окрашивания
изучаемого объекта специальными красителями. Большинство биологических
87
объектов имеют неяркую собственную люминесценцию, поэтому для их изучения
используют вторичную люминесценцию. Вторичная люминесценция возникает
после окраски препарата специальными люминесцирующими красителями
(флюорохромами,
люминофорами),
которые
способны
связываться
со
специфическими структурами бактериальных клеток. Например, акридиновый
оранжевый связывается с нуклеопротеидами клетки, аурамин – с воскоподобными
веществами. В люминесцентном микроскопе имеется система светофильтров,
пропускающих определенные лучи и задерживающих остальные. При
люминесцентной микроскопии наблюдаемые объекты выглядят в виде светящихся
форм (рисунок 76).
Рисунок 76 – Люминесцентная микроскопия микобактерий туберкулеза (палочки
желтого цвета). Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Люминесцентная микроскопия используется как метод экспрессдиагностики, она проводится в прямом и непрямом вариантах. Исследование носит
ориентировочный характер.
В последние годы широко используется иммунолюминесцентная
микроскопия – реакция иммунофлюоресценции (РИФ) с применением
специфических иммуноглобулинов, меченых флюорохромами. В качестве метки
чаще всего используют флуоросцеина изотиоцианат (ФИТЦ). Комплекс “антитело +
ФИТЦ” позволяет выявлять в РИФ очень низкие концентрации микробных клеток
(рисунок 77).
Рисунок 77 – Выявление пневмококков с помощью РИФ. Заимствовано из
Интернет-ресурсов.
88
Преимуществами люминесцентной микроскопии являются цветное
изображение изучаемого объекта, выявление в исследуемом материале
микроорганизмов в небольшой концентрации, возможность использования
люминесцентной микроскопии в качестве экспресс-метода обнаружения и
идентификации конкретных антигенов (возбудителей).
Электронная микроскопия используется в основном в научноисследовательских лабораториях, так как требует наличия дорогостоящего
оборудования, специфической подготовки препаратов для исследования и
квалифицированного персонала. Оснащение кабинета электронной микроскопии
представлено на рисунке 78.
Рисунок 78 – Оснащение кабинета электронной микроскопии. Заимствовано из
Интернет-ресурсов.
В
электронно-микроскопических
исследованиях
используют
просвечивающую (трансмиссионную) и сканирующую электронную микроскопию
Электронная микроскопия
(рисунок 79).
а
б
Просвечивающая
Рисунок 79– Препараты
бактерий, полученныеСканирующая
при просвечивающей (а) и
электронная микроскопия
электронная микроскопия
сканирующей (б) электронной микроскопии.
При просвечивающей (трансмиссионной) микроскопии ультратонкие срезы
клеток обрабатывают солями тяжелых металлов (свинца, ртути, хрома, вольфрама),
позволяющими сделать изображение контрастным. Для выявления окислительновосстановительных ферментов используют теллурит калия или соли тетразолия. В
трансмиссионных (просвечивающих) электронных микроскопах электроны, проходя
89
через образец, частично задерживаются. Прошедшая через образец часть
электронной попадает на экран микроскопа и создает изображение. Те участки
клетки, которые слабо рассеивают электроны, выглядят на экране светлыми, а те
участки, которые сильно рассеивают электроны, выглядят темными.
При сканирующей электронной микроскопии на изучаемые объекты в
вакуумной камере напыляют электронно-плотные вещества. В сканирующих
электронных микроскопах тонкий пучок электронов сканирует поверхность клетки.
Отраженные от поверхности образца электроны собираются и образуют на экране
объемное изображение.
Бактериоскопические методы исследования имеют как достоинства, так и
недостатки. Основными достоинствами бактериоскопических методов являются
простота, доступность, быстрота проведения исследования, экономичность.
Основными же недостатками бактериоскопических методов исследования являются
низкая чувствительность и низкая специфичность.
90
5.2. Культуральное исследование
Культуральное исследование предусматривает выделение чистой культуры
бактерий на питательных средах и ее идентификацию до вида и рода путем
изучения морфологических, культуральных, биохимических, генетических,
серологических, биологических свойств. Для изучения указанных свойств
используют стандартные диагностические схемы, утвержденные Министерством
здравоохранения (“Приказ об унификации микробиологических методов
исследования №535 от 1985 г.”). Культуральное исследование позволяет установить
этиологический диагноз заболевания путем выделения чистой культуры и ее
идентификации, определить дополнительные свойства возбудителя (например,
чувствительность к антибиотикам), типировать микроорганизмы (определить
внутривидовые различия по генетическим и эпидемическим маркерам).
5.2.1. Питательные среды для выделения, культивирования и
идентификации бактерий
Культивирование бактерий (накопление микробной биомассы) производится
на питательных средах. Облигатные внутриклеточные паразиты (хламидии,
риккетсии, вирусы) культивируются исключительно в биологических системах (на
культурах клеток, в куриных эмбрионах, в организме чувствительных лабораторных
животных).
Культуральное исследование включает в себя посев материала, взятого от
больного или с объектов внешней среды, на питательные среды, выделение чистой
культуры возбудителя и его идентификацию. Для выращивания бактерий
используют различные питательные среды. Питательные среды должны содержать
питательные вещества в доступной для усвоения форме, иметь оптимальное
значение рН, быть стерильными.
Питательные среды классифицируются на группы.
По происхождению выделяют естественные, полусинтетические и
синтетические среды. Естественные питательные среды представляют собой
природные органические соединения непостоянного состава, которые включают
продукты животного или растительного происхождения: пептоны, кровь, экстракты
и отвары мяса, рыбы, круп.
Полусинтетические питательные среды кроме органических и
неорганических веществ известного состава содержат продукты природного
происхождения (картофельная среда с глюкозой, дрожжевая среда, сахарный
бульон).
Синтетические питательные среды состоят из определенных количеств
органических и неорганических химических соединений известного состава. Их
рецептура всегда постоянная.
По составу выделяют простые и сложные питательные среды. В состав
простых питательных сред входят источники азота (пептон, мясной экстракт) и
соли. К простым (обычным) питательным средам относятся пептонная вода, мясо-
91
пептонный бульон, мясопептонный агар. В состав сложных сред дополнительно к
простым средам входят соли, сахара, экстракты, микроэлементы, витамины и другие
компоненты. К сложным (богатым) питательным средам относятся кровяной агар,
асцитический агар, сывороточный агар.
По консистенции выделяют жидкие, полужидкие и плотные среды. Жидкие
среды представляют собой настои, отвары, бульоны, приготовленные на основе
мяса, рыбы, овощей (естественные среды), а также композиции определенных
концентраций химических соединений (искусственные среды). Широко
распространенной жидкой питательной средой является мясопептонный бульон
(МПБ). Полужидкие среды получают путем добавления к жидким средам 0,5-0,9%
агара или желатина (в частности, мясопептонный желатин - МПЖ). К плотным
питательным средам относят среды, содержащие 1,5-3% агара, в частности,
мясопептонный агар - МПА (рисунок 80).
а
б
в
Рисунок 80 – Питательные среды: а – МПБ, б – МПЖ, в – МПА.
Агар – это полисахарид сложного состава из морских водорослей, основной
отвердитель для плотных питательных сред.
В качестве универсального источника углерода и азота применяют пептоны
(продукты расщепления белков пепсином) или различные гидролизаты (мясной,
рыбный, казеиновый, дрожжевой).
По назначению среды подразделяются на основные (универсальные) и
специальные. Основные (универсальные) среды пригодны для роста большинства
бактерий. К ним относятся мясопептонный агар (МПА) и мясопептонный бульон
(МПБ).
Специальные среды предназначены для культивирования тех бактерий,
которые не растут или очень плохо растут на универсальных средах. В частности,
среда Китта-Тароцци (мясопептонный печеночный бульон, МППБ) используется
для культивирования анаэробов. В ее состав входят: питательный бульон, 0,5%
натрия хлорида, кусочки печени или мяса для адсорбции кислорода. На поверхность
среды наслаивают тонкий слой вазелинового масла и стерилизуют при 120°С в
течение 30 минут. Перед посевом из среды удаляют воздух прогреванием ее на
кипящей водяной бане в течение 15 минут.
Для выделения облигатных анаэробных бактерий используют также
следующие питательные среды:
- анаэробный кровяной агар с гентамицином;
92
- анаэробный кровяной агар с неомицином и налидиксовой кислотой;
- анаэробный кровяной агар с канамицином и ванкомицином;
- фруктозо-циклосерин-цефокситиновую среду (для Clostridium difficile);
- тиогликолевую полужидкую среду;
- среду Вильсона-Блера (железо-сульфитный агар).
К специальным средам относятся дифференциально-диагностические,
селективные, элективные, накопительные (среды обогащения), транспортные и
консервирующие питательные среды.
Дифференциально-диагностические среды представляют собой сложные
среды, позволяющие выделять чистую культуру бактерий с одновременной их
идентификацией по какому-либо биохимическому признаку. Дифференциальнодиагностические среды содержат питательную основу, дифференцирующее
вещество (субстрат) и индикатор. Например, дифференциально-диагностические
среды позволяют идентифицировать бактерии по следующим признакам:
- гликолитическая (сахаролитическая) активность (разложение углеводов) –
среды Гисса (содержат 1 углевод), Эндо, Левина, Плоскирева, Рассела (содержат 2
углевода), Клиглера (содержат 3 углевода) и др.;
- протеолитическая активность (разложение белков) – МПЖ, свернутая
сыворотка, молочный агар;
- гемолитическая активность (разрушение эритроцитов) – кровяной агар.
Элективные питательные среды содержат вещества, ингибирующие рост
посторонней микрофлоры, но не влияющие на жизнедеятельность искомого вида
бактерий. В качестве таких веществ используют анилиновые красители, желчь,
натрия хлорид и др.
Селективные питательные среды содержат не только вещества,
подавляющие рост одних микроорганизмов, но и вещества, стимулирующие рост
других видов бактерий.
В таблице 11 приведены наиболее часто используемые в микробиологии в
составе питательных сред индикаторы.
Таблица 11 – Индикаторы, наиболее часто используемые в микробиологии
Название
индикатора
Андреде
Бромтимоловый
синий
ВР (водный
голубой и
розоловая кислота
Феноловый
красный
Окраска среды в зависимости от величины рН
щелочная
нейтральная
кислая
бесцветный
бесцветный
красный
бирюзовый
зеленый
желтый
малиновый
бесцветный
синий
малиновый
красный
желтый
Жидкие среды Гисса состоят из пептонной воды, 0,5% углевода (сахара или
многоатомного спирта) и 0,5% индикатора Андреде (0,5 г кислого фуксина, 16 мл
4% раствора едкого натра, 100 мл дистиллированной воды). Среды с углеводами
93
разливают в пробирки с “газовками” (поплавками, трубками Дюлхема),
опущенными в пробирки вверх дном. Среды Гисса могут быть жидкие и
полужидкие (без “газовок”), содержащие 0,25% агара. В жидких средах с реактивом
Андреде при ферментации углевода образуется кислота, под действием которой
изменяется окраска среды (среда меняет желтый цвет на красный). Образовавшиеся
при ферментации углевода газообразные продукты скапливаются в поплавках
(рисунок 81).
1
2
3
Рисунок 81 – Среды Гисса с реактивом Андреде: 1 – исходная среда; 2 –
ферментация углевода до кислоты; 3 – ферментация углевода до кислоты и газа.
Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Полужидкие среды Гисса с реактивом ВР (смесь водного голубого и
розоловой кислоты) при разложении углевода до кислоты меняют окраску с желтой
на синюю, а газообразование проявляется пузырьками в толще среды (рисунок 82).
1
2
3
Рисунок 82 – Среды Гисса с реактивом ВР: 1 – исходная среда; 2 – разложение
углевода до кислоты; 3 – разложение углевода до кислоты и газа. Заимствовано из
Интернет-ресурсов.
Вариантом сред Гисса в пробирках являются картриджи с питательной
средой и индикатором. Внесение исследуемого материала в них осуществляется
через центральный капилляр (рисунок 83).
94
Контроль
Рисунок 83 – Картриджи “пестрого ряда”: 1 – глюкоза; 2 – лизин; 3 – орнитин; 4 –
индол; 5 – адонит; 6 – лактоза; 7 – арабиноза; 8 – сорбит; 9 – тест ФогесаПроскауэра (образование ацетоина при анаэробном превращении глюкозы); 10 –
дульцит; 11 – мочевина; 12 – цитрат натрия.
Среда Левина состоит из МПА, лактозы и индикатора (метиленовый синий,
эозин и фосфорнокислый калий). Среда имеет первоначально фиолетовый цвет. На
среде
Левина
лактозоположительные
колонии
E.
coli
имеют
темно-фиолетовый (черный) цвет с зеленым блеском (рисунок 84).
Рисунок 84 - Лактозоположительные колонии E. coli на среде Левина. Заимствовано
из Интернет-ресурсов.
Среда Эндо состоит из МПА, 0,5-1% лактозы и 0,5% насыщенного спиртового раствора основного фуксина, обесцвеченного 10% сернокислым натрием.
Среда Эндо предназначена для выделения энтеробактерий и родственных
микроорганизмов с одновременной их дифференцировкой по способности
утилизировать лактозу. На такой среде лактозопозитивные бактерии (E. coli)
образуют темно-красные колонии с металлическим блеском, а лактозонегативные
бактерии (шигеллы, сальмонеллы) – колонии серо-белого цвета (рисунок 85).
95
Рисунок 85 – Рост лактозоположительной кишечной палочки на среде Эндо.
Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Среда
Плоскирева
предназначена
для
выделения
патогенных
энтеробактерий (шигеллы, сальмонеллы) с одновременным подавлением роста
кишечной палочки. Элективным фактором этой среды являются соли желчных
кислот. Так как рост кишечной палочки подавляется не полностью, для ее
выявления в среду добавлена лактоза (дифференцирующее вещество).
Лактозонегативные бактерии (шигеллы, сальмонеллы) образуют на этой среде
бесцветные колонии, а лактозоположительные бактерии (кишечная палочка) –
темно-красные колонии (рисунок 86).
Рисунок 86 – Рост лактозоположительной кишечной палочки и лактозонегативных
бактерий на среде Плоскирева. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
К дифференциально-диагностическим средам относят также комбинированные полиуглеводные среды (двухсахарная среда Рассела, трехсахарная
среда Клиглера, трехсахарный железосодержащий агар Олькеницкого и др.).
Например, среда Олькеницкого содержит: 100 мл МПА, 1 г лактозы, 1 г сахарозы,
0,1 г глюкозы, 1 г мочевины, 0,02 г соли Мора, 0,003 г тиосульфата натрия, 0,4 мл
фенолового красного (0,4%-го раствора); рН7,2-7,4 (рисунок 87).
96
1
2
3
4
5
Рисунок 87 – Среда Олькеницкого (1) и рост на ней бактерий: Salmonella
typhimurium (2), Escherichia coli (3), Shigella flexneri (4) и Salmonella typhi (5).
Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Висмут-сульфит агар (среда Вильсона-Блера) является дифференциальнодиагностической средой при выделении сальмонелл. Среда состоит из МПА и
индикатора, содержащего лимоннокислый висмут, сернокислый натрий, соль Мора
(серноаммонийная соль железа), двухосновной фосфорнокислый натрий, глюкозу и
бриллиантовую зелень. Сальмонеллы образуют на этой среде колонии черного цвета
(рисунок 88).
Рисунок 88 – Рост сальмонелл на висмут-сульфитном агаре. Заимствовано из
Интернет-ресурсов.
Протеолитическую активность бактерий (рисунок 89) определяют по
разжижению столбика желатина (наличие желатиназы) или по образованию зон
просветления вокруг колоний на молочном агаре (наличие казеиназы).
агаре)
97
1
2
Рисунок 89 – Протеолитическая активность бактерий в столбике желатина (1) и на
молочном агаре (2). Заимствовано из Интернет-ресурсов.
21
Гемолитическая активность бактерий определяется на кровяном агаре
(рисунок 90).
Рисунок 90 – Рост бактерий на кровяном агаре. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Селективные питательные среды содержат вещества, препятствующие
росту одних видов бактерий, и вещества, способствующие росту других видов
микроорганизмов. Селективные питательные среды позволяют направленно
отбирать определенные виды бактерий. К ним относятся желточно-солевой агар для
выделения стафилококков, щелочной агар для выращивания холерного вибриона и
др. Например, солевой агар, предназначенный для выделения стафилококков, в
качестве элективного фактора содержит повышенную концентрацию (10%) хлорида
натрия. Желточно-солевой агар содержит не только элективный фактор (хлорид
натрия), но и дифференцирующее вещество (желток куриного яйца), позволяющее
определять у стафилококков наличие лецитиназы (рисунок 91).
98
Рисунок 91 - Желточно-солевой агар для выделения стафилококков. Заимствовано
из Интернет-ресурсов.
Элективные питательные среды содержат вещества, подавляющие рост
одних бактерий, но не влияющие на рост других бактерий. Эти среды служат для
выделения определенных видов бактерий из смешанных популяций. К элективным
средам относятся, например, селенитовая среда, среда Мюллера.
Накопительные среды (обогатительные среды, среды обогащения) - это
жидкие среды, на которых определенные виды культур растут быстрее и
интенсивнее сопутствующих микроорганизмов. Такие среды могут содержать
вещества, подавляющие рост посторонних микробов, или вещества,
способствующие росту требуемых бактерий. К накопительным средам относятся,
например, солевой бульон для стафилококков, селенитовый бульон для сальмонелл
(рисунок 92).
а
б
Рисунок 92 – Накопительные среды: а - солевой бульон, б - селенитовый бульон.
Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Так, солевой бульон (обогатительная среда для стафилококков) в качестве
элективного фактора содержит 10% хлорида натрия, селенитовый бульон
(обогатительная среда для сальмонелл) в качестве элективного фактора содержит
селенит натрия, а сахарный бульон (обогатительная среда для стрептококков)
содержит глюкозу в качестве ростового фактора.
Для длительного хранения микроорганизмов в условиях холодильника
применяют консервирующие среды, содержащие криопротекторы (например,
глицерин).
99
Транспортные среды используются на этапах доставки биоматериала в
лабораторию. Состав таких сред способствует сохранению микробов в
жизнеспособном состоянии без размножения. В связи с этим в биоматериале
количественный и качественный состав микробиоты не изменяется.
Введение в питательные среды дифференцирующих субстратов (углеводов,
белков, мочевины и др.) и соответствующих индикаторов позволяет по окраске
колоний и среды вокруг них отличать одни бактерии от других. Дифференциация
бактерий при таком подходе осложняется тем, что сахаролитические и
протеолитические ферменты микроорганизмов многообразны и универсальны
(встречаются у представителей разных видов). Это обусловливает относительно
невысокие дифференцирующие свойства традиционных питательных сред. Для
более четкой дифференциации бактерий целесообразно определять родо- и
видоспецифические ферменты.
Таким образом, в состав питательных сред могут входить различные
компоненты, позволяющие не только создавать благоприятные условия для
размножения бактерий, но и стимулировать рост одних микробов и угнетать рост
других микроорганизмов. Назначение наиболее распространенных компонентов
питательных сред представлено в таблице 12.
Таблица 12 – Компоненты питательных сред и их назначение
Компоненты питательных
сред
Агар
Акрифлавин
Антибиотики
Висмута сульфит
Глюкоза
Глицерин
Желатин
Желчь
Калия теллурит
Крахмал
Кровь
Натрия азид
Натрия дезоксихолат
Пептон
Сыворотка крови
Углеводы
Предназначение компонентов
Отвердитель питательных сред
Подавление грамположительных бактерий
Селективное подавление роста и размножения тех
или иных бактерий
Подавление роста сопутствующих микробов
Источник энергии, дифференцирующий углевод
Компонент сред для транспортировки и хранения
микроорганизмов
Желеобразующий компонент, позволяет изучать
протеолитическую активность бактерий
Подавляет рост некоторых бактерий, является
дифференцирующим компонентом
Подавляет рост некоторых бактерий, придает
колониям черный цвет
Дифференцирующий компонент
Выявляет гемолитическую активность бактерий
Подавляет рост грамотрицательных бактерий
Подавляет рост грамположительных бактерий
Стабилизирует питательные среды
Источник питательных веществ, компонент сред для
прихотливых бактерий
Источники энергии, дифференцирующие
компоненты сред Гисса
100
Уголь активированный
Фосфаты
Яичный желток
Сорбент токсических соединений
Стабилизируют рН среды
Выявляет лецитиназу
В таблице 13 приведены примеры наиболее часто используемых в
бактериологии питательных сред.
Таблица 13 – Часто используемые в бактериологии питательные среды
Тип среды
Основная (простая,
универсальная)
Среда специального
назначения (сложная):
- обогащенная
(специальная)
- селективная
- накопительная
- дифференциальнодиагностическая
Транспортная и
консервирующая среды
Среда для хранения
культур
Пример среды
жидкой
Мясопептонный бульон
плотной
Мясопептонный агар
Сахарный бульон,
сывороточный бульон,
асцитический бульон и др.
Щелочная пептонная вода,
желчный бульон, среды с
антибиотиками и др.
Сахарный агар,
сывороточный агар,
кровяной агар и др.
Солевой агар, желточносолевой агар (ЖСА),
среды с антибиотиками и
др.
Нет
Селенитовый бульон,
полужидкая среда для
контроля стерильности
(СКС) и др.
Среды Гисса
Агар Эндо, Левина,
Олькеницкого, среды
Гисса (полужидкие) и др.
Среда Эймса (полужидкий агар с активированным
углем), глюкозо-дрожжевая среда, СКС и др.
Глицерин (для хранения
Среда Дорсе и др.
О
при минус 20 С)
Во второй половине ХХ века в бактериологическую практику были введены
хромогенные питательные среды, принцип действия которых состоял в выявлении
высокоспецифичных бактериальных ферментов. Хромогенные питательные среды
позволяют уже на первом этапе через 24 часа культивирования получить результат о
видовой принадлежности микроба. К таким высокоспецифическим ферментам
относятся β-D-глюкуронидаза Escherichia coli или β-D-глюкозидаза энтерококков.
На хромогенных питательных средах по цвету колоний можно проводить
предварительную идентификацию бактерий.
Для обнаружения такого уникального фермента в состав хромогенной
питательной среды вводят вещество (хромогенный субстрат), при расщеплении
которого этим ферментом образуются окрашенные или флюоресцирующие
продукты, выявляемые по изменению окраски колоний или их флюоресценции при
101
ультрафиолетовом облучении. Хромогенные питательные среды используют уже
при первичном посеве исследуемого материала для выделения чистой культуры.
Поэтому идентификация культуры возможна уже в течение первых суток
исследования. Использование хромогенных питательных сред ускоряет процесс
идентификации бактерий до 24 часов при первичном посеве до рода и вида.
Основными производителями хромогенных питательных сред являются
компании HiMedia, CHROMagar, Merck, Oxoid. Разработанные хромогенные
питательные среды предназначены для быстрого обнаружения в исследуемом
материале кишечной палочки, сальмонелл, энтерококков, стафилококков,
клостридий, синегнойной палочки, устойчивого к метициллину стафилококка и
других бактерий. На рисунке 93 представлен вариант использования хромогенной
питательной среды для выявления кишечной палочки, клебсиеллы и протея.
Использование хром
с селективными
Рисунок 93 – Использование хромогенных сред для первичной идентификации
бактерий. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Идентификация
Лидером производителей высококачественных хромогенных сред для
микробов до рода,
микробиологических исследований является компания HiMedia (Индия). Эта
компания поставляет на
рынок хромогенные среды для выделения в течение 24
вида
часов целого ряда микроорганизмов: Escherichia coli и других колиформных
бактерий,
сальмонелл,
энтерогеморрагических
эшерихий,
энтерококков,
Staphylococcus aureus, клостридий, синегнойной палочки, Candida albicans и др.
(таблица 14).
Таблица 14 – Примеры выпускаемых компанией HiMedia хромогенных сред
Обозначение
М1078/М1082
Наименование
Salmonella Differential Agar/ Modified
Назначение
Для идентификации и
М1293
(RajHans Medium) Дифференциальный агар
для сальмонелл
Дифференциальный агар для сальмонелл,
модифицированный (среда Радж-Ханса)
HiCrome ECC Agar
Хромогенный агар ECC
М1294
HiCrome ECC Selective Agar Base
Основа хромогенного селективного агара
ECC
М1295/
М12951
HiCrome E. coli Agar
Хромогенный агар для обнаружения и
подсчета E. coli
102
дифференциации сальмонелл
от других энтеробактерий,
особенно протеев
Для предварительной
идентификации Escherichia coli
и других колиформных
бактерий в пищевых продуктах
и в пробах из окружающей
среды
Для обнаружения Escherichia
coli и других колиформных
бактерий в пищевых продуктах
и пробах воды
Для обнаружения и подсчета
Escherichia coli в пищевых
продуктах без дальнейшего
подтверждения на мембранных
фильтрах или реактивом на
индол
Компания Merck выпускает хромогенные питательные среды для выявления
сальмонелл, листерий, кишечной палочки и колиформных бактерий.
Агаризованную питательную среду асептически разливают в чашки Петри в
расплавленном состоянии при температуре 45-50°С. Среду, разлитую в чашки
Петри, больше не стерилизуют.
5.2.2. Системы создания специальных атмосферных условий
культивирования
Для культивирования некоторых бактерий (облигатных анаэробов,
микроаэрофилов, капнофилов) необходимо создать специальные атмосферные
условия. Посевы анаэробов культивируют в атмосфере с содержанием кислорода не
более 0,1%. Инкубирование посевов анаэробных бактерий проводят в термостатах в
герметически закрытых емкостях – эксикаторах, микроанаэростатах, анаэробных
пакетах или в специальных анаэробных камерах, снабженных термостатом.
Просто устроенные системы для культивирования анаэробных бактерий
представлены на рисунке 94.
103
а
б
в
Рисунок 94 – Системы для выращивания анаэробных бактерий: а – эксикатор, б –
анаэростат, в – использование стеклянной емкости и зажженной свечи.
Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Для поглощения кислорода в замкнутой воздушной среде таких систем
используют раствор пирогаллола, гидросульфит натрия, для получения углекислого
газа применяют смесь лимонной или серной кислоты с бикарбонатом натрия.
Например, при использовании эксикатора на дно помещают открытую чашку Петри
с химическими веществами, связывающими кислород (например, пирогаллол с
едким натром). Сверху на специальный выступ эксикатора ставят фарфоровую
решетку, а на нее – пробирки или чашки с посевами. Крышку эксикатора плотно
закрывают. Для герметичности края эксикатора смазывают вазелином. После этого
эксикатор помещают в термостат.
В настоящее время для создания анаэробных или микроаэрофильных
условий в основном применяют герметичные контейнеры и специальные
газогенерирующие пакеты. Производителями подобных герметичных контейнеров и
газогенерирующих пакетов являются специализированные компании.
Контейнеры представляют собой пластиковые герметически закрывающиеся
емкости, в которых сохраняется создаваемая с помощью генерирующих пакетов
газовая атмосфера (рисунок 95).
Рисунок 95 – Герметичные контейнеры для создания специальной атмосферы.
Заимствовано из Интернет-ресурсов.
104
Газогенерирующие пакеты содержат химические соединения, способные
создавать определенную атмосферу (таблица 15). В газогенерирующих системах
водород генерируется таблетками боргидрида натрия, углекислый газ
вырабатывается при взаимодействии лимонной кислоты с бикарбонатом натрия и
т.д.
Таблица 15 – Примеры газогенерирующих пакетов фирмы GasPak для создания
специальных атмосферных условий для культивирования бактерий
Тип пакета
GasPak
CampyPak
GasPak Н2/СО2
Создаваемая атмосфера
17-19% О2
5-10% СО2
5-8% О2
5-10% СО2
<1,2% О2
5-10% СО2
Тип микроорганизмов
Аэробные капнофилы
Микроаэрофилы
Строгие анаэробы
Внешний вид газогенерирующих пакетов представлен на рисунке 96.
Рисунок 96 – Газогенерирующие пакеты. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Анаэробная камера (рисунок 97) представляет собой герметичный бокс,
оснащенный термостатом, системой подачи “анаэробного газа”. “Анаэробный газ”
может быть трехкомпонентным (смесь азота, углекислого газа и водорода) или
двухкомпонентным (смесь азота и водорода). Все манипуляции в такой камере
выполняются в бескислородных условиях. Вместимость анаэробной камеры – до
200 чашек Петри. В основном такими камерами оснащаются референс-лаборатории.
105
Рисунок 97 – Анаэробная камера. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Микроанаэростат (рисунок 98) представляет собой герметично
закрывающуюся емкость объемом 3-7 л и вместимостью 10-12 чашек Петри.
Бескислородные условия в микроанаэростате создаются путем создания в нем
вакуума и последующего заполнения “анаэробным газом” или путем химического
связывания кислорода газогенерирующими системами. Создание бескислородных
условий в микроанаэростатах контролируется с помощью индикаторной тестполоски, импрегнированной метиленовой синью, которая обесцвечивается в случае
образования бескислородной атмосферы.
Рисунок 98 – Микроанаэростаты. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
В лабораторной практике часто используются СО2-термостаты, позволяющие
создавать атмосферу углекислого газа (рисунок 99).
106
Рисунок 99 – СО2-инкубатор. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Анаэробные пакеты представляют собой пластиковые прозрачные
герметически закрывающиеся пакеты вместимостью 1-2 чашки Петри. Анаэробные
условия в пакете создаются путем химического связывания кислорода. Анаэробные
условия также контролируются тест-полоской. Анаэробные пакеты удобны для
использования в небольших лабораториях, для транспортировки материалов в
лабораторию, в полевых условиях.
5.2.3. Получение чистой культуры бактерий
Классический культуральный (бактериологический) метод остается “золотым
стандартом” диагностики большинства инфекционных заболеваний. Он
осуществляется в несколько этапов.
1 этап. Посев исследуемого материала на питательные среды.
2 этап. Пересев изолированных колоний на скошенный агар в пробирки для
получения чистой культуры бактерий.
3 этап. Идентификация чистой культуры бактерий (определение рода и вида),
определение чувствительности чистой культуры к антибиотикам и бактериофагам.
4 этап. Выдача заключения.
Основной недостаток культурального метода – длительность исследования.
Например, для быстрорастущих микроорганизмов результат может быть получен
через 2-3 суток после посева на плотную питательную среду, а для медленно
растущих бактерий и микроскопических грибов – от 5-7 до 21 суток.
Чистой культурой называют популяцию микроорганизмов одного вида,
выращенную из изолированной колонии на плотной или в жидкой питательной среде.
Методы получения чистой культуры бактерий:
- методы механического разобщения бактерий;
107
- биологический метод (заражение чувствительных лабораторных
животных);
- методы, основанные на избирательной чувствительности бактерий к
физическим факторам (высокая и низкая температура) или химическим веществам
(кислотам, щелочам, солям, антибиотикам, красителям).
Наиболее часто для получения чистой культуры бактерий используют
принцип механического разобщения. При этом исследуемый материал высевают на
плотную питательную среду таким образом, чтобы получить изолированные
колонии для последующего их пересева на скошенный агар в пробирках.
Методы механического разобщения бактерий:
- посев исследуемого материала на питательный агар в чашки Петри с
помощью бактериологической петли, шпателя, пипетки. При таком способе
материал, находящийся на петле (шпателе, пипетке), расходуется постепенно и
переносится на среду по линиям посева все в меньшем и меньшем количестве;
- посев исследуемого материала путем последовательных разведений в
питательной среде;
- посев подвижных бактерий в конденсационную воду на скошенный агар.
В настоящее время исторический интерес представляют методы получения
изолированных колоний, предложенные Пастером и Кохом. Однако эти методы до
сих пор описывают в учебной литературе, хотя в практической работе они не
используются.
Метод Пастера представляет собой последовательные разведения
исследуемого материала в жидкой питательной среде до тех пор, пока в среде не
окажется одна микробная клетка, давшая рост.
Метод Коха представляет собой последовательные разведения исследуемого
материала в расплавленном агаре с последующим переносом агара с разведенной
культурой в чашку Петри (рисунок 100).
Разведения
Исследуемый
материал
1:10
1:100
1:1000
1:10000
1:100000
Рисунок 100 – Получение изолированных колоний методом Коха.
В настоящее время посев исследуемого материала на питательные среды для
получения чистой культуры проводится методом механического разобщения
бактерий путем посева исследуемого материала на поверхность плотной
питательной среды штрихом или с помощью шпателя Дригальского.
Посев однократным истощающим
108
Чаще проводятштрихом
посев штрихом,
используя
для этого различные варианты
и посевы
по секторам
посева (рисунок 101).
а
б
Рисунок 101 – Посев однократным истощающим штрихом (а) и посевы по секторам
(б). Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Техника посева штрихом представлена на рисунке 102.
Рисунок 102 – Посев бактериологической петлей по поверхности
питательного агара в чашке Петри для выделения чистой культуры (Воробьев А.А. и
др., 2006).
Результаты посева штрихом представлены на рисунке 103.
Рисунок 103 - Результаты посева штрихом. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
109
При посеве методом Дригальского используют несколько чашек с
питательной средой. Исследуемый материал наносят на первую чашку, растирают
шпателем круговыми движениями по поверхности агара, а затем этим же шпателем
последовательно наносят оставшийся на шпателе материал на другие чашки
Посев по Дригальскому
(рисунок 104).
Рисунок 104 – Посев по Дригальскому: 1 – шпатель; 2 – техника посева; 3 –
результат посева. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
В
современных
микробиологических
диагностических
системах
используются новые инновационные принципы посева исследуемого материала на
плотные питательные среды в чашках Петри: посев по кругу с помощью
пластикового аппликатора или посев магнитным крутящимся шариком.
В частности, посев по кругу с помощью пластикового аппликатора
применяется в системе PREVI Isola (рисунок 105).
Рисунок 105 - Система PREVI Isola. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
110
В системе PREVI Isola посев осуществляется с помощью одноразового
пластикового аппликатора, автоматически производящего круговое движение по
поверхности агара. В результате этого обеспечивается хорошая изоляция колоний
(рисунок106).
1
2
Рисунок 106 – Ручной посев штрихом (1) и посев с помощью PREVI Isola (2).
Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Система PREVI Isola позволяет засевать исследуемый образец одновременно
на различные среды, подаваемые в аппарат автоматически по заранее установленной
программе (до 10 сред).
Посев
магнитным
крутящимся
шариком
используется
в
высокотехнологичной системе WCA-3 (BD Kiestra). В этой системе металлический
шарик с исследуемым материалом на своей поверхности под действием магнитных
сил совершает вращение и движение по пластинке агара, покрывая до 95% площади
чашки (рисунок 107).
Рисунок 107 – Высокотехнологичная система WCA-3 (BD Kiestra). Заимствовано из
Интернет-ресурсов.
111
Система позволяет выполнять любой заданный рисунок посева. Рост
изолированных колоний отмечается по ходу движения шарика (рисунок 108).
Рисунок 108 – Рост колоний по ходу движения металлического шарика.
Заимствовано из Интернет-ресурсов.
При выделении и культивировании некоторых бактерий применяют
дополнительное воздействие физическими и химическими факторами. В частности,
при выделении спорообразующих бактерий используют предварительное
прогревание материала, йерсинии культивируют при пониженных температурах,
для выделения кислотоустойчивых бактерий исследуемый материал обрабатывают
кислотой для уничтожения некислотоустойчивых микробов. При выделении
спорообразующих бактерий часто используют биопробу: прогретый исследуемый
материал вводят подкожно лабораторным животным (белые мыши, морские
свинки), после гибели животных производят вскрытие и посев из внутренних
органов на питательные среды.
В случае природной устойчивости микроорганизмов к антибиотикам,
анилиновым красителям и другим химическим веществам эти соединения
добавляют в питательные среды. Эти вещества, угнетая рост одних видов бактерий,
не влияют на рост других. На этом принципе основано применение многих
элективных сред с красителями: яично-крахмальные среды для выделения
микобактерий туберкулеза, глюкозо-печеночная среда с генцианвиолетом (или
кристаллвиолетом) для роста бруцелл и подавления роста других видов
микроорганизмов.
Для выделения чистой культуры подвижных видов бактерий пользуются
методом Мечникова и Шукевича. С этой целью каплю исследуемого материала
наносят в нижнюю часть пробирки со скошенным агаром в конденсационную воду.
При наличии в материале подвижного микроба через 12-18 часов на поверхности
скошенного агара отмечается рост бактерий. Для пересева используют культуру с
верхней части агара.
Выделение чистой культуры анаэробных бактерий имеет определенные
особенности. Для культивирования анаэробных микроорганизмов применяют
специальные среды: анаэробный кровяной агар с антибиотиками, тиогликолевую
112
полужидкую среду, жидкую среду Китта-Тароцци с кусочками мяса и слоем
вазелинового масла на поверхности, среду Вильсона-Блера (железо-сульфитный
агар) и др. Получить изолированные колонии в жидкой питательной среде
невозможно, поэтому вначале используют посев материала штрихом на плотную
питательную среду и культивирование посевов в анаэробных условиях (метод
Цейсслера). В последующем для накопления чистой культуры анаэробов можно
использовать жидкую питательную среду. Характер роста анаэробов в жидких
питательных средах представлен на рисунках 109 и 110.
а
б
в
Рисунок 109 – Рост клостридий на среде Китта-Тароцци: а – контроль, б, в - опыт.
Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Микроаэрофилы
Облигатные Факульта- Облигатные
тивные
аэробы
анаэробы
анаэробы
Рисунок 110 – Рост бактерий на тиогликолевой среде. Стрелками указаны зоны
роста культуры. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
113
При выращивании анаэробных бактерий в высоком столбике агара можно
разобщить микробные клетки и получить рост изолированных колоний в толще
питательной среды. Для этого питательный агар разливают в пробирки, прогревают
на кипящей водяной бане для удаления кислорода, после чего охлаждают до
температуры 45°С, вносят исследуемый материал и тщательно перемешивают.
После инкубирования в термостате в толще агара появляются изолированные
колонии, для отбора которых столбик агара требуется перенести в чашку Петри и
вырезать отдельную колонию (рисунок 111).
Рисунок 111 – Рост анаэробных бактерий в высоком столбике агара. Заимствовано
из Интернет-ресурсов.
Исторический интерес представляют такие методы культивирования и
получения изолированных колоний анаэробов как метод Вейнберга, метод Перетца,
метод Виньяля-Вейона и др. Эти методы до сих пор описывают в учебной
литературе. Однако они не используются в практической работе.
Метод Вейнберга заключается в посеве разведений материала в пробирки с
расплавленным и остуженным сахарным агаром (рисунок 112).
Рисунок 112 – Получение изолированных колоний анаэробов по методу Вейнберга.
Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Метод Перетца представляет собой выращивание культуры в слое агара под
стеклянной пластинкой, расположенной на двух стеклянных или деревянных
палочках (рисунок 113).
114
Рисунок 113 – Метод Перетца. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Метод Виньяля-Вейона предусматривает выращивание культуры в 0,5%
агаре в капилляре пастеровской пипетки.
Метод Аристовского представляет собой выращивание культуры в чашках
Петри, помещенных в эксикатор с химическим поглотителем кислорода.
Метод “перевернутых чашек” заключается в выращивании культуры на
агаре, разлитом в крышку чашки Петри. Сверху крышку закрывают стерильным
донышком чашки, а щель между краями крышки и дном чашки Петри заливают
расплавленным парафином.
Метод Фортнера (биологический способ культивирования микробов)
заключается в совместном культивировании в одной герметически закрытой чашке
Петри аэробов и анаэробов. Пока в атмосфере присутствует кислород, растут
аэробы, а при снижении концентрации кислорода начинается рост анаэробов
(рисунок 114).
Рисунок 114 – Метод Фортнера. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Визуально чистая культура характеризуется однородным ростом. При
микроскопическом исследовании окрашенного мазка, приготовленного из такой
культуры, в разных полях зрения обнаруживаются морфологически и
тинкториально однородные клетки. Однако в случае выраженного плеоморфизма,
присущего некоторым видам бактерий, в мазках из чистой культуры могут
встречаться одновременно клетки с различной морфологией.
115
Культивирование микроорганизмов производят в специальных шкафах
– термостатах, в которых постоянно поддерживается необходимая температура.
Лабораторный термостат представляет собой шкаф, имеющий снаружи слой
теплоизоляционного материала. Термостаты бывают водяные и суховоздушные. В
настоящее время наиболее распространенными являются суховоздушные
термостаты. Внутри термостатов располагаются сетчатые полки для размещения
посевов. Температуру в термостате поддерживают с помощью автоматических
терморегуляторов. Внешний вид термостата представлен на рисунке 115.
Рисунок 115 – Лабораторный термостат. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Для большинства бактерий оптимальная температура выращивания
составляет 36-37ОС. В лабораториях, где проводится большой объем работы,
оборудуются специальные термальные комнаты, оснащенные нагревателями.
Признаки роста бактериальных клеток в жидких и на плотных питательных
средах характеризуют культуральные свойства микроорганизмов.
В жидкой питательной среде рост микроорганизмов проявляется либо
равномерным помутнением среды (диффузный рост культуры), либо образованием
осадка (придонный рост культуры), либо формированием пленки на поверхности
среды.
Осадок может быть рыхлый, легко разбивающийся при встряхивании
пробирки, слизистый, поднимающийся в виде “косички”, либо в виде сплошной
массы на дне пробирки. Для некоторых микроорганизмов характерен особый вид
осадка. Например, сибиреязвенный микроб формирует осадок в виде нежного
комочка ваты.
Пленка на поверхности питательной среды может быть сухой и слизистой,
гладкой и складчатой. Для возбудителя туберкулеза характерно образование грубой
морщинистой пленки на поверхности среды со свисающими вниз косичками. В ряде
случаев бактериальные культуры дают одновременно помутнение среды, обильный
осадок и пристеночное кольцо на поверхности.
На плотной питательной среде культуральные свойства определяют по
характеру развивающихся колоний. При внесении на поверхность среды большого
116
количества микробных клеток наблюдают сплошной рост бактерий в виде газона.
При небольшой концентрации клеток образуются изолированные колонии.
Выросшие изолированные колонии характеризуют по величине, форме,
контуру края, рельефу, поверхности, цвету, структуре и консистенции. Величина
колоний определяется по ее диаметру. Различают точечные (диаметр менее 1 мм),
мелкие (диаметр 1-2 мм), средние (диаметр 2-4 мм) и крупные (диаметр 4-6 мм и
более) колонии. По форме колонии бывают правильными (круглая форма),
неправильными (амебовидная форма), ризоидными (корневидная форма). Характер
контура края определяют при рассмотрении колонии под лупой или под
микроскопом при малом увеличении. Различают ровные и неровные края колоний.
Рельеф колонии характеризуется приподнятостью ее над поверхностью
питательной среды и контуром формы в вертикальном разрезе. Поверхность
колонии бывает матовая или блестящая с глянцем, сухая или влажная, гладкая или
шероховатая. Гладкие колонии обозначают буквой S (smooth - гладкий),
шероховатые - буквой R (rough – шероховатый). Цвет колоний определяется
пигментом, продуцирующим микробом. Большинство патогенных бактерий
пигмента не образуют, поэтому их колонии бесцветны или серовато-белого цвета.
Пигментообразующие бактерии формируют кремовые, желтые, синие, красные
колонии. Консистенцию колонии определяют при взятии из нее части материала
бактериальной петлей. Различают вязкие или слизистые колонии, прилипающие и
тянущиеся за петлей. Признаки колоний представлены на рисунке 116.
Форма
Округлая
Точечная
Неправильная
Волокнистая
Веретенообразная
Ризоидная
Профиль
Плоский
Выпуклый
Приподнятый
Пуповидный
Подушкообразный
Край
Гладкий
Дольчатый
Волокнистый
Волнистый
Эрозированный
Складчатый
Рисунок 116 – Признаки колоний микроорганизмов. Заимствовано из Интернетресурсов.
К микроорганизмам, продуцирующим пигменты, относятся Staphylococcus
aureus (оранжево-желтый пигмент), Pseudomonas aeruginosa (сине-зеленый
пигмент), Serratia marcescens (оранжево-красный пигмент), Peptostreptococcus niger
(коричнево-черный пигмент) и другие бактерии (рисунок 117).
117
а
б
Рисунок 117 – Пигментообразующие бактерии: а - Pseudomonas aeruginosa; б Serratia marcescens. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Несмотря на большое количество признаков, по которым различаются
колонии разных видов бактерий, в практической работе используют следующие
основные морфотипы колоний:
- колонии S-формы (англ. smooth – гладкий) имеют ровные края и гладкую
поверхность;
- колонии R-формы (англ. rough – шероховатый) имеют изрезанный край,
шероховатую поверхность;
- колонии М-формы (англ. mucus – слизистый) имеют слизистую или
мукоидную консистенцию.
Под действием некоторых факторов (химиопрепаратов, факторов
макроорганизма и др.) у бактерий может отмечаться переход от S-формы в R-форму.
Такое явление называется диссоциацией.
При наличии в исследуемом материале большого количества микробов на
плотной питательной среде бактерии растут в виде пленки, покрывающей всю
поверхность среды. Такой характер роста называется газоном. Посев газоном
проводят для получения большого количества чистой культуры бактерий.
При необходимости чашки с посевами просматривают с помощью лупы или
микроскопа при малом увеличении. В случае наличия нескольких типов колоний
каждый исследуется в отдельности. Для определения тинкториальных свойств из
части колонии готовят мазок, окрашивают по Граму или другими методами и
микроскопируют. Другую часть колонии используют для посева штрихом на
скошенный агар в пробирки с целью получения чистой культуры. Посевы
инкубируют в термостате при 37ОС. Такая температура является оптимальной для
большинства микроорганизмов.
5.2.4. Биохимическая идентификация бактерий
При культуральном исследовании для установления родовой и видовой
принадлежности бактерий определяют характер роста культуры в жидких и на
118
плотных питательных средах (культуральные признаки), разложение углеводов
(сахаролитические или гликолитические свойства), белков (протеолитические
свойства) и липидов (липолитические свойства), чувствительность к бактериофагам
и антибиотикам, бактериоциночувствительность, токсигенность и другие признаки.
Окончательная идентификация чистой культуры основывается на изучении
биохимических, генетических, серологических и биологических признаков (таблица
16).
Таблица 16 – Признаки, учитываемые при идентификации бактерий
(критерии вида)
Признаки
Морфологические
Тинкториальные
Культуральные
Биохимические
Генетические
Серологические
Биологические
Характеристика признаков
Размеры клеток
Форма клеток
Взаимное расположение клеток
Окраска по Граму
Окраска дифференциально-диагностическими методами
Вид колоний на плотной питательной среде
Характер роста культуры в жидкой среде
Разложение белков (выявление протеаз)
Разложение углеводов (выявление карбогидраз)
Разложение липидов (выявление липаз)
Выявление оксидоредуктаз (оксидазы, каталазы, дегидразы)
Выявление ферментов агрессии (лецитиназы,
плазмокоагулазы, ДНКазы, гиалуронидазы)
Выявление экзотоксинов (дифтерийного, гемолизина)
Определение профиля летучих жирных кислот для
анаэробов
Содержание Г+Ц-пар в ДНК
Последовательность нуклеотидов в ДНК
Антигенная структура микроба
Серовары бактерий
Вирулентность для животных
Токсигенность
Чувствительность к бактериофагам (определение фаговара)
Чувствительность к антибиотикам
Биохимическая идентификация бактерий основана на выявлении
определенных ферментов по способности разлагать те или иные субстраты. Для
такой идентификации требуется чистая культура бактерий. Получение чистой
культуры бактерий продолжается в течение 2 суток. Процесс биохимической
идентификации чистой культуры занимает в среднем 18-24 часа. Таким образом,
результат идентификации возможен, в крайнем случае, через 3 суток. При
биохимической идентификации выявляют ферменты, разлагающие углеводы
(сахаролитические ферменты), белки (протеолитические ферменты), липиды
(липолитические
ферменты),
окислительно-восстановительные
ферменты.
Дополнительно на соответствующих питательных средах можно определить
наличие ферментов – токсинов (гемолизина, плазмокоагулазы и др.).
119
Согласно международной биохимической классификации в зависимости
от катализируемой реакции выделяют 6 основных классов ферментов:
оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы. Отдельные
представители каждого класса ферментов имеют систематическое название, а также
четырехуровневый числовой код, который отражает класс, подкласс, под-подкласс и
серийный номер фермента в под-подклассе. Кроме систематического названия
ферменты микроорганизмов в зависимости от субстратной специфичности имеют
традиционные (тривиальные) названия: сахаролитические, протеолитические,
липолитические, окислительно-восстановительные ферменты, а также ферментытоксины, которые определяют с помощью специальных сред или тестов.
Возможности биохимической идентификации бактерий на питательных средах
представлены в таблице 17.
Таблица 17 – Биохимическая идентификация бактерий
Группа
выявляемых
ферментов
Сахаролитические
ферменты
Название
ферментов
Амилаза
Карбогидразы
Протеолитические
ферменты
Протеазы и
пептидазы
Питательная среда для
выявления ферментов
Агар с 0,2% крахмала
Реакция на присутствие
ферментов
Нанесение раствора йода на
18-24 часовую культуру
бактерий при наличии амилазы
вокруг колоний формируется
светлый ореол при синефиолетовой окраске остальной
части среды
Среды с лактозой и
Лактозоположительные
анилиновыми
энтеробактерии (E. coli, K.
красителями (Эндо,
oxytoca, K. pneumonia),
Левина, Плоскирева)
образуют ярко окрашенные
темные колонии,
лактозоотрицательные
энтеробактерии (Salmonella,
Shigella) – бледно-розовые или
бесцветные колонии
Жидкие или полужидкие При разложении углеводов
моноуглеводные среды
образуются кислые продукты,
Гисса; содержат один из снижающие рН среды, в
углеводов и индикатор
результате чего индикатор рН
рН. Для выявления
изменяет цвет. Газы,
газообразования в
образующиеся в жидких
жидкие среды вносят
средах, накапливаются в
поплавок
поплавке, в полужидких средах
газы разрывают среду или
накапливаются в виде
пузырьков в среде
5% обезжиренное
Свёртывание молока с
молоко
образованием сгустков казеина
и пептонизация
Свёрнутая сыворотка
Разжижение сгустка
Столбик желатина
Разжижение желатина
Молочный агар
Зоны просветления вокруг
Дезаминазы
аминокислот
Среда с одной из
аминокислот и
индикатором рН
Декарбоксилазы
Среда с одной из
основных аминокислот
(аргинином, лизином,
орнитином, гистидином,
тирозином, глутамином)
и индикатором рН
Мясопептонный бульон
или среда с
триптофаном, а также
индикаторная бумажка,
смоченная щавелевой
кислотой и закреплённая
под пробкой над
питательной средой
Среды с цистеином,
метионином и
реактивом на
сероводород
Триптофаназа
Десульфуразы
(цистиназы)
Уреаза
Липолитические
ферменты
Липаза
Лецитиназа
ОкислительноОксидаза
восстановительные
ферменты
Каталаза
Дегидразы
Пероксидаза
120
колоний на фоне мутно-белой
среды
Образование аммиака
приводит к защелачиванию
среды и изменению цвета
индикатора
При образовании диаминов
среда подщелачивается, что
вызывает изменение цвета
индикатора
Образование индола приводит
к покраснению индикаторной
бумажки
Образующийся сероводород
взаимодействует с
индикатором с образованием
сульфида железа, что вызывает
почернение среды
Среда с мочевиной и
Образование аммиака
индикатором рН
приводит к изменению окраски
феноловым красным
среды из красно-оранжевой в
малиново-лиловую
Желточный агар или
Вокруг колоний образуется
среда с твином-80
радужный ореол
Желточный агар (агар с Вокруг колоний появляется
куриным желтком)
опалесцирующая зона
(венчики помутнения)
Фильтровальная бумага, При нанесении петлей 18-24
смоченная 1%
часовой культуры на
раствором
поверхность фильтровальной
тетраметилпарафенилен- бумаги в течение 1 минуты
диамина (реактив на
появляется пурпурнооксидазу)
фиолетовое окрашивание
3% раствор Н2О2
При нанесении перекиси
водорода на культуру в чашке
Петри или при внесении
культуры в каплю перекиси на
предметном стекле появляются
пузырьки газа (тест не
используется на кровяных
средах)
Сахарный полужидкий
Образующиеся дегидразы
агар с 1% метиленовым обесцвечивают метиленовый
синим
синий
Бензидиновый тест: на
При наличии пероксидазы
предметное стекло
бесцветная среда приобретает
Ферменты токсины
Гемолизины
О-стрептолизин
наносят суточную
бактериальную
культуру, раствор
метилпарааминофенолсульфата и раствор
перекиси водорода
Кровяной агар
К жидкой культуре
добавляют эритроциты
кролика
Плазмокоагулаза Стерильная цитратная
плазма крови в
пробирках
Фибринолизин
Сгустки фибрина
121
розовую или вишнёво-красную
окраску
α-гемолизины приводят к
неполному гемолизу с
образованием вокруг колоний
зоны неполного просветления
среды с зеленовато-бурым
оттенком; β-гемолизины
вызывают полный гемолиз с
образованием прозрачной зоны
вокруг колоний; γ-гемолизины
не дают гемолиза
При наличии О-стрептолизина
происходит гемолиз
эритроцитов (лаковая кровь),
при отсутствии Острептолизина эритроциты
выпадают в осадок
После внесения суточной
культуры и 5 часов инкубации
в термостате происходит
свёртывание плазмы
Растворение сгустков фибрина
Для идентификации выделенных культур по биохимическим свойствам в
состав питательных сред вводят дифференцирующие субстраты и соответствующие
индикаторы. В качестве субстратов используют углеводы (глюкоза, сахароза,
лактоза и др.), белки, липиды, мочевину и другие соединения. При расщеплении
субстратов изменяется рН среды или окислительно-восстановительный потенциал
среды. В результате этого индикатор изменяет цвет среды или вокруг колоний
бактерий формируются специфические зоны расщепления субстратов.
Для определения пути расщепления глюкозы (окислительный или
бродильный) проводят тест ОФ (тест окисления/ферментации): культуру высевают
уколом в две пробирки с полужидкой питательной средой, содержащей глюкозу и
бромтимоловый синий. Исходный цвет среды – зеленый. В одну из пробирок после
посева наносят слой вазелинового масла (для создания анаэробных условий). Обе
пробирки инкубируют при температуре 37°С. Изменение цвета среды на желтый в
обеих пробирках свидетельствует о ферментации глюкозы. Изменение цвета среды
только в пробирке без масла свидетельствует об утилизации глюкозы путем
окисления. Отсутствие кислотообразования в обеих пробирках и сохранение
исходного цвета свидетельствует о том, что тестируемые микроорганизмы не
утилизируют глюкозу ферментацией и окислением. В этом случае микроорганизмы
могут относиться к неферментирующим видам (рисунок 118).
122
К1
К2
а
б
в
г
д
е
Рисунок 118 – Рост псевдомонад (а, б) и эшерихий (в-е) на среде ХьюЛейфсона в аэробных (без масла) и анаэробных (с маслом) условиях (тест ОФ). К1 и
К2 – контрольные среды для анаэробных и аэробных условий (Воробьев А.А. и др.,
2006).
Для определения каталазы на поверхность суточной культуры на
питательном агаре наносят несколько капель 3% раствора перекиси водорода
(нельзя использовать кровяной агар, так как каталаза эритроцитов может дать
ложноположительную реакцию). Другим способом определения каталазы является
Выявление
каталазы
внесение культура в каплю перекиси водорода
на предметном
стекле. Появление
пузырьков газа расценивают как положительную реакцию (рисунок 119).
Тест на каталазу
–
ющий
водорода
анием
а
б
и
Рисунок 119 – Определение каталазы на предметном стекле (а) и на питательном
а.
агаре (б). Заимствовано из Интернет-ресурсов.
ть
можно по Для выявления микробной нитратредуктазы ставят тест на
восстановление нитрата в нитрит (последний в присутствии N,N-диметил-1м
нафтиламина образует диазосоединение, которое окрашивает среду в красный цвет).
Культуру выращивают на полужидкой среде, содержащей 0,1% нитрата, и
а, которые
8
добавляют смесь указанного реактива с сульфаниловой кислотой, наблюдая в
течение нескольких минут за развитием красного окрашивания среды (свися после
детельствует о присутствии нитрита). 7
Для выявления цитохромоксидазы используют слайды, содержащие
ия
реактив Ковача (N, N-диметил-n-фенилендиамин). При нанесении культуры в случае
х клеток
с
положительной
реакции слайд меняет цвет на темно-фиолетовый (рисунок 120).
ром
водорода.
ьною реакцию лекулы
123
ется кислород.
дазу
смачиванием
альным
спиртовый
ола; 1% водный
етил-βРисунок 120 – Определение цитохромоксидазы с реактивом Ковача. Заимствовано из
Интернет-ресурсов.
на
да). Нанесение на
Определение цитохромоксидазы возможно также другим способом. На
суточной
поверхность чашки Петри наносят крупную 9 каплю реактива Ковача на
ерий приводит
к из флакона. Запаянным концом пастеровской пипетки
цитохромоксидазу
его перемещают в каплю реактива часть исследуемой культуры. Учет результатов
проводят через 1 минуту. При наличии цитохромоксидазы комочек бактерий
Используют
ьные окрашивается
слайды. в фиолетовый цвет, при отсутствии цитохромоксидазы окраска
культуры не изменяется.
Способность бактерий расщеплять углеводы называется сахаролитической
активностью бактерий. При расщеплении бактериями углеводов образуется кислота
(молочная, уксусная, муравьиная) или кислота и газ (углекислый газ, водород).
Поэтому по образованию конечных продуктов расщепления углеводов судят о
спектре гликолитической активности бактерий.
Для выявления гликозидаз используют жидкие или полужидкие среды Гисса
(“пестрый ряд”). Жидкие среды Гисса представляют собой пептонную воду,
содержащую один из углеводов (лактозу, глюкозу, мальтозу, сахарозу и т. д.) и
индикатор Андреде (кислый фуксин, обесцвеченный щелочью). Для улавливания
образующихся газов в пробирку помещают поплавок или “газовку” (микропробирку
вверх дном). Во время стерилизации поплавок заполняется средой. Исходный цвет
среды – соломенно-желтый. При расщеплении углевода до кислоты наблюдается
только изменение цвета среды на красный, а при образовании еще и газа последний
скапливается в поплавке. Если углевод не расщепляется, цвет среды не изменяется.
Полужидкие среды Гисса содержат 0,2-0,5% МПА, 1% одного из углеводов
и индикатор ВР (смесь водного голубого и розоловой кислоты). Исходный цвет
среды – розово-серый. При расщеплении углевода цвет среды становится голубым, а
при образовании газа отмечаются разрывы среды или пузырьки газа в толще среды.
Каждый вид бактерий ферментирует только определенный спектр углеводов,
поэтому в одних пробирках цвет среды меняется, а в других – остается исходным.
Поэтому набор пробирок со средами для выявления спектра сахаролитических
свойств и называют “пестрым рядом”. Это позволяет отличить один вид бактерий от
другого.
Протеолитическую активность бактерий выявляют при посеве чистой
культуры на специальные питательные среды (мясопептонный желатин - МПЖ,
молочный агар, мясопептонный бульон, свернутая сыворотка крови). Результат
124
оценивают по разжижению желатина, разложению казеина молока вокруг
колоний или по конечным продуктам распада белков. Протеолитическая активность
одного и того же вида микроба проявляется по-разному на разных питательных
средах, что обусловлено специфичностью ферментов.
Разные виды бактерий имеют разную форму разжижения желатина:
золотистый стафилококк – в виде воронки, холерный вибрион – в виде гвоздя
(рисунок 121).
Изучение протеолитических
свойств по способности
разжижать желатин
• Разные виды
бактерий имеют
разную форму
разжижения
желатина; S. aureus –
в виде воронки; B.
antracis – в виде
опрокинутой
елочки; Vibrio
cholerae
– в121
виде
Рисунок
– Характер разжижения желатина разными бактериями. Заимствовано
гвоздя и т.д.
из Интернет-ресурсов.
Разжижают желатин
18
Протеолитическое
можно наблюдать
бактерии,
имеющие действие ферментов микроорганизмов
при посевах бактерий на свернутую сыворотку, при этом вокруг колоний
фермент
наблюдается разжижение среды.
коллагеназу
Способность микробов гидролизовать казеин определяют на молочном
агаре Эйкмана (10 мл стерильного расплавленного МПА и 3 мл обезжиренного
стерильного молока). Посев производят таким образом, чтобы получить
Протеолиз
казеина
изолированные колонии. Посевы
инкубируют
в термостате в течение 24-48 часов.
Протеолиз проявляется
пептонизацией казеина
и образованием вокруг колоний
(выращивание
на молочном
прозрачной зоны (рисунок 122).
агаре)
Рисунок 122 – Протеолиз казеина. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
21
При посеве в жидкое молоко протеолиз выражается просветлением столбика молока, водянистым содержимым и слизистым осадком на дне.
Конечными продуктами распада белков могут быть индол, сероводород и
аммиак. Для обнаружения этих газообразных продуктов используют индикаторные
бумажки, которые помещают внутрь пробирки между стенкой пробирки и ватномарлевой пробкой. Индикатором на индол (продукт разложения триптофана)
125
является щавелевая кислота. Пропитанная щавелевой кислотой бумажка при
наличии индола меняет белый цвет на розовый. Тестирование культур на
образование индола проводят также с помощью реактива Ковача или реактива
Эрлиха. Основой этих реактивов является 4-диметиламинобензальдегида. При
Тест
на индол
положительной реакции наблюдается красная
окраска
(рисунок 123).
25
а
б
Рисунок 123 – Тест на индол с помощью индикаторных полосок (а) и реактива
Ковача (б). Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Индикатором на сероводород (продукт разложения серосодержащих
аминокислот – цистина, цистеина, метионина) является ацетат свинца. При наличии
сероводорода белая бумажка приобретает черный цвет за счет образования сульфита
свинца (рисунок 124).
Тест на сероводород
26
а
б
Рисунок 124 – Тест на сероводород: а – положительный тест; б – контроль.
Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Индикатором на аммиак (продукт разложения фенилаланина) является
лакмусовая полоска бумаги. При наличии аммиака красная лакмусовая бумажка
приобретает синий цвет.
126
Липолитическую активность бактерий определяют на агаре с водным
раствором твина разной концентрации (твин 80, 40 или 20). На поверхность агара с
твином высевают штрихом исследуемый микроорганизм. О наличие липазы судят
по образованию вокруг штриха или колонии непрозрачной зоны кальциевых солей
жирных кислот, освобожденных из твина.
Редукция нитратов (денитрификация) - способность микробов
восстанавливать соли азотной кислоты (нитраты) в соли азотистой кислоты
(нитриты), а затем в аммиак и свободный азот. Редукцию нитратов определяют
посевом на специальную среду, состоящую из МПБ и 2% азотнокислого калия
(калийная селитра). После внесения исследуемой культуры посевы инкубируют в
течение 48-72 часов при температуре 37-38°С. Затем добавляют 1 мл реактива,
содержащего йодистый калий и серную кислоту. При редукции нитратов в нитриты
проявляется темно-синее окрашивание среды.
На питательных средах (in vitro) можно определить некоторые свойства
бактерий, характеризующие их патогенность: гемолиз эритроцитов, наличие
лецитиназы и др.
Определение гемолитических свойств производят путем посева культуры
на МПА, содержащий 5% дефибринированной крови (кровяной агар). При росте на
кровяной среде микроорганизмов, обладающих гемолитическими свойствами,
вокруг колонии в результате лизиса эритроцитов образуется прозрачная зона (βгемолиз) или зона, окрашенная в зеленоватый цвет (α-гемолиз). Разные виды
гемолиза на кровяном агаре представлены на рисунке 125.
Рисунок 125 – Виды гемолиза на кровяном агаре. Заимствовано из Интернетресурсов.
В жидких питательных средах с кровью при гемолизе среда делается
прозрачной (красная лаковая кровь).
Наличие лецитиназы определяется на средах, содержащих желток куриного
яйца, содержащего большое количество лецитина. Под действием бактериальной
лецитиназы лецитин питательной среды подвергается гидролизу с отложением
вокруг микробных колоний продуктов распада в виде отчетливой зоны
опалесценции (рисунок 126).
127
Рисунок 126 – Выявление лецитиназы на желточном агаре. Заимствовано из
Интернет-ресурсов.
Тест на дезоксирибонуклеазу (ДНКазу) применяют для дифференциальной
диагностики и идентификации S. aureus, S. marcescens и других бактерий. Посев
исследуемой культура производят бляшками или штрихом. Посевы инкубируют при
температуре 36ОС в течение 20-24 часов. Затем в чашку вносят 5 мл 0,1N раствора
соляной кислоты на 3-5 минут. Раствор сливают. При положительном результате на
фоне мутной от осадка среды (взаимодействие высокомолекулярной ДНК с
хлоридом натрия) вокруг посева образуется прозрачная зона деполимеризованной
ДНК (рисунок 127).
Рисунок 127 – Выявление бактериальной ДНКазы у золотистого стафилококка
(указано стрелкой) при посеве штрихом. Справа – отрицательный контроль.
Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Тест на плазмокоагулазу и фибринолизин проводится в пробирке,
содержащей плазму крови кроликов, в которую вносят исследуемую культуру.
Результаты учитывают через 1, 2 и 4 часа инкубирования посевов в термостате при
температуре 36ОС. При положительном результате через 2-4 часа жидкость
превращается в сгусток, который не разрушается при легком встряхивании
пробирки. При дальнейшем выдерживании такой пробирки при комнатной
128
температуре наблюдается растворение сгустка под действием фибринолизина
(рисунок 128).
Рисунок 128 – Действие плазмокоагулазы (свертывание плазмы, верхняя пробирка)
и фибринолизина (разжижение сгустка, нижняя пробирка) на плазму крови.
Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Ферменты, обусловливающие сахаролитические и протеолитические
свойства, часто встречаются у представителей разных видов бактерий. Поэтому
дифференцирующие свойства традиционных схем идентификации бактерий
относительно невысокие. Для более четкой дифференциации культур необходимо
определять у них родо- и видоспецифические ферменты.
Классические пробирочные тесты при исследовании биохимической
активности бактерий сохраняют свое значение и в настоящее время. Но эти тесты
трудоемки и требуют больших временных и материальных затрат. Особое значение
пробирочные тесты имеют в период внедрения новых тест-систем для
идентификации бактерий, при анализе деятельности лабораторий и отдельных
специалистов в ходе лицензирования и сертификации.
5.2.5. Микротест-системы для идентификации бактерий
Дифференциация и идентификация бактерий предусматривает установление
родовой, видовой и типовой принадлежности микроорганизмов. Эти исследования
составляют основную часть культурального метода. Продолжительность
культурального классического пробирочного метода для выдачи окончательного
результата, особенно с учетом определения чувствительности культуры к
антимикробным препаратам, составляет от 4 до 10 дней в зависимости от вида
возбудителя. Международные стандарты ориентируют методы культурального
исследования на срок 48-72 часа (в идеале – первые сутки после получения
клинического материала на исследование). Поэтому важным направлением
культурального исследования является разработка ускоренных методов
идентификации бактерий.
Сокращение сроков идентификации чистой культуры и объемов
культурального исследования возможно при использовании биохимических тест-
129
систем (миниатюризированных систем идентификации бактерий или СИБ, а
также специальных коммерческих наборов для ускоренной идентификации).
Биохимические тест-системы выпускаются в виде пластин, полосок, стрипов,
слайдов, планшетов. Такие тест-системы представляют собой панели или
полистироловые планшеты с сухими дифференцирующими средами. В основе этих
тест-систем лежат модификации классических пробирочных биохимических
методов. Подобные тест-системы позволяют одновременно изучать 20, 32, 64
биохимических признака. В работе с тест-системами необходимо использовать
только чистую культуру бактерий. Так как в таких системах используются малые
объемы субстратов и культуры, то такой метод часто называют микрообъемной
биохимической идентификацией.
Биохимические тест-системы выпускаются разными отечественными и
зарубежными фирмами: АО “Аллерген”, Ставрополь; НИИЭМ, Нижний Новгород;
НИИЭМ им. Пастера, Санкт-Петербург; PLIVA-Lachema, Чехия; bioMerieux,
Франция; Dade, США и др. Фирмы-производители предлагают тест-системы для
биохимической
идентификации
энтеробактерий,
стафилококков,
неферментирующих грамотрицательных бактерий, стрептококков, энтерококков и
других групп бактерий. Кроме тест-систем производители выпускают
диагностические полоски и диски для предварительной идентификации некоторых
бактерий (например, диски с оптохином для предварительной идентификации S.
pneumoniae), для определения некоторых признаков бактерий (например, ОКСИтест
для выявления бактериальной цитохромоксидазы, ОНПтест для обнаружения бетагалактозидазы).
Тест-системы, позволяющие одномоментно определять большое количество
признаков, подразделяются на следующие группы:
- системы с бумажной основой (СИБ, Имбио, Micro-ID, Patho-Tec, spot-test
system и др.);
- системы с высушенными или замороженными субстратами в
микроемкостях в виде специальных планшетов (ПБДЭ, ПБДС, ДС-ДИФ-ЭНТЕРО12, API, API 20E, API-Staph-system и др.);
- автоматизированные системы с плотными пластическими средами
(Repliscan, Enteric Tec system, MicroScan-system и др.);
- автоматизированные системы для идентификации и экспрессного
выявления чувствительности к антибиотикам (AMS, MS-2, Autobac, AMS GPI и др.).
Пластины биохимические дифференцирующие ПБДЭ для энтеробактерий
и ПБДС для стафилококков (НИИЭМ, Нижний Новгород) являются заменой
классических пробирочных методов. Они содержат лиофилизированные
питательные среды с субстратами. В них вносится небольшое количество суспензии
исследуемых культур. Они позволяют минимизировать объем используемых
культур при большом количестве тестов, визуально оценивать результаты по
изменению окраски сред в лунках, сократить время исследований (рисунок 129).
ПБДЭ
дифференцирующие
энтеробак
для стафи
130
• Среды
на
лиофилиз
состоянии
работе.
• Визуальн
результат
• Заменой классических
пробирочных сред
являются ПБД (ПБДЭ для
энтеробактерий и ПБДС
ПБДЭ
для стафилококков).
ПБДС
• Среды на пластинах в
Рисунок 129 – Пластины биохимические дифференцирующие.
Заимствовано из
лиофилизированном
Интернет-ресурсов.
состоянии, что удобно в
работе.
Пластины биохимические, дифференцирующие
энтеробактерии (ПБДЭ),
выпускаются в комплекте с необходимыми
(рисунок
• реактивами
Визуальный
учет 130).
ПБДС
результатов.
Рисунок 130 – Набор пластин биохимических, дифференцирующих энтеробактерии.
Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Биохимические дифференцирующие энтеробактерии пластины могут
использоваться в лабораториях разного уровня. Они предназначены для
энзимоидентификации энтеробактерий по 20 биохимическим признакам в течение
18-24 часов.
Наборы
ДС-ДИФ-ЭНТЕРО-12
и
ДС-ДИФ-ЭНТЕРО-24
(НПО
“Диагностические системы”, Нижний Новгород) предназначены для идентификации
энтеробактерий. Они позволяют за 24 часа определить биохимическую активность
исследуемых энтеробактерий соответственно по 12 или 24 признакам. На пластины
в лаборатории наносится небольшое количество исследуемой культуры. Учет
результатов производится визуально по изменению окраски лунок (рисунки 131 и
132).
131
Рисунок 131 - Пластина ДС-ДИФ-ЭНТЕРО-12 для дифференциации
энтеробактерий. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Рисунок 132 - Пластина ДС-ДИФ-ЭНТЕРО-24 для дифференциации
энтеробактерий. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Тест-системы ЭНТЕРОтест 24 (PLIVA-Lachema, Чехия) предназначены
также для идентификации энтеробактерий по 24 признакам в течение 18-24 часов
(рисунок 133). Учет результатов этих тестов производится как визуально по
изменению окраски, так и с помощью анализаторов (Multiscan, iEMS-reader,
Финляндия).
132
Рисунок 133 - Тест-система ЭНТЕРОтест 24. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
В настоящее время компания “ERBA-Lachema Diagnostika” производит и
поставляет наборы MICRO-LA-TEST, представляющие собой микротитровальные
стриппированные 96-луночные пластины с одно-, двух- или трехрядными
вертикальными стрипами для постановки 8, 16 или 24 биохимических реакций.
Лунки стрипов содержат лиофилизированные субстраты. При добавлении суспензий
микроорганизмов субстраты растворяются, в ходе инкубации происходят
биохимические реакции, результаты которых можно регистрировать по изменению
цвета индикатора или после добавления реактива либо визуально, либо
автоматически при наличии фотометров.
Тест-системы API 20E и API 20 STAPH (bioMerieux, Франция)
предназначены
для
идентификации
соответственно
энтеробактерий
и
стафилококков в течение 18-24 часов по 20 признакам с учетом результатов как
визуально, так и с помощью анализаторов (MiniAPI). Тест-системы API
выпускаются в виде стрипов с овальными лунками (рисунок 134).
Рисунок 134 – Стрипы тест-системы API 20Е. Верхний стрип – все лунки
отрицательный результат, нижний стрип – все лунки положительный результат.
Заимствовано из Интернет-ресурсов.
133
Кроме стрипов для биохимической идентификации бактерий выпускаются
панели, питательные субстраты в которых находятся в лунках округлой формы
RapID STAPH PLUS Panel
(рисунок 135).
Рисунок 135 – Биохимическая панель RapID STAPH PLUS Panel для идентификации
стафилококков. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Для идентификации энтеробактерий разработана специфическая система
Enterotube (США), представляющая собой пробирку с 12 отсеками, заполненными
различными агаровыми средами. Некоторые среды покрыты слоем воска для
защиты от воздуха. Через отсеки проходит канал с тонким металлическим стержнем
(рисунок 136).
Рисунок 136 - Система Enterotube. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Выступающим концом стержня под белой крышкой касаются колонии и
затем протягивают стержень через все отсеки. Таким способом засевают все среды в
отсеках. Порядок проведения посева подробно описан в прилагаемой инструкции.
Инкубируют системы в течение 24 часов при температуре 36ОС. Дальнейшая
идентификация происходит с использованием кодовой книги.
Стрипы биохимической идентификации используются для идентификации
бактерий до вида за 24 часа. Метод биохимической идентификации бактерий с
помощью стрипов признан референсным методом во многих странах, в том числе в
России.
Методика работы с микротест-системами состоит в следующем. Вначале
выделяют чистую культуру бактерий и путем микроскопического исследования
окрашенных по Граму мазков устанавливают принадлежность бактерий к
134
грамположительным или грамотрицательным палочкам или коккам для выбора
необходимой тест-системы. При необходимости с помощью экспресс-тестов
определяют каталазу и оксидазу. Затем готовят бактериальную суспензию с
определенной концентрацией клеток по стандарту мутности. Полученную
бактериальную суспензию аккуратно вносят в каждую лунку или ячейку,
содержащую дифференциально-диагностические среды и индикаторы (субстратноиндикаторные питательные среды). Содержимое ячеек некоторых тест-систем
стабилизировано поливиниловым спиртом. В некоторые лунки для создания
анаэробных условий добавляют стерильное вазелиновое масло или расплавленный
парафин в соответствии с инструкцией. Инкубируют тест-системы в термостате при
рекомендованной инструкцией температуре в течение необходимого времени в
зависимости от вида бактерий. При необходимости для выявления тех или иных
соединений в некоторые ячейки добавляют дополнительные ингредиенты,
прилагаемые к тест-системам. Учет результатов проводится визуально или с
помощью микробиологических анализаторов. Идентификация осуществляется при
помощи
таблиц
биохимической
активности,
профильных
индексов,
диагностических регистров или компьютерных программ в зависимости от вида
используемых тест-систем.
5.2.6. Полуавтоматические и автоматические системы
идентификации микроорганизмов и определения
антибиотикочувствительности
Повышение точности идентификации бактерий возможно с использованием
бактериологических полуавтоматических и автоматических анализаторов и систем
для экспресс-диагностики. Недостатком полуавтоматических и автоматических
анализаторов является обязательное наличие чистой культуры возбудителя. Тем не
менее, автоматические анализаторы идентификации бактерий позволяют за 24-48
часов получить информацию о виде возбудителя заболевания и его
чувствительности к антимикробным препаратам.
Полуавтоматические и автоматические системы выпускаются многими
производственными компаниями (“bioMerieux”, Франция; “Beckman” США;
“LACHEMA”, Чехия; “Labsystems”, Финляндия).
Системы Microscan (“Beckman” США) используют турбидиметрические,
колориметрические и флюориметрические методы идентификации бактерий. Они
состоят из комплектов пластиковых планшетов, содержащих различные субстраты
(96 лунок). Эти системы позволяют дифференцировать грамположительные и
грамотрицательные бактерии с помощью флюоресцирующих субстратов за 2 часа.
Система позволяет идентифицировать грамположительные и грамотрицательные
бактерии, сложные для культивирования микробы (анаэробы, нейссерии, гемофилы,
моракселы, грибы). Для идентификации гемофилов, анаэробов и дрожжей
используют хромогенные субстраты, изменяющие свою окраску (время анализа – 46 часов). Минимальные ингибирующие концентрации различных антибиотиков эти
системы определяют по изменению оптической плотности. Системы Microscan
135
компьютеризированы и автоматически проводят все необходимые расчеты.
Общее
время
идентификации
бактерий
и
определения
антибиотикочувствительности (к более 50 препаратам) с помощью системы
Microscan составляет 4-24 часа (рисунок 137).
Рисунок 137 - Система Microscan. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Бактериальная суспензия вводится в панели системы Microscan с помощью
инокулятора или приспособлением для взятия колоний с питательного агара.
Идентификация проводится по более чем 30 биохимическим реакциям
одновременно.
Система Vitek (“bioMerieux”, Франция) представляет собой автоматический
анализатор
для
идентификации
бактерий
и
определения
их
антибиотикочувствительности (от 32 до 120 тестов одновременно в режиме
реального времени). Метод идентификации основан на хромогенных реакциях,
проходящих в специальных герметичных пластиковых картах. В системе Vitek
используются планшеты с 30 лунками. Предусмотрено автоматическое внесение в
каждую лунку микробной суспензии с известной концентрацией бактерий. Принцип
работы системы основан на турбидиметрии (изменение интенсивности света). Время
для идентификации составляет от 4-8 до 18 часов. Система полностью
компьютеризирована и работает автоматически (рисунок 138).
Рисунок 138 - Система Vitek. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
136
Система Vitek 2 (“bioMerieux”, Франция) представляет собой
автоматическую
усовершенствованную
систему
для
идентификации
микроорганизмов и определения чувствительности к антимикробным препаратам.
Она предназначена для идентификации более 450 таксонов (грамотрицательных
палочек, грамположительных кокков, анаэробных бактерий, нейссерий,
гемофильных палочек, других прихотливых бактерий, коринебактерий,
лактобактерий, бацилл, грибов). Она позволяет также определять чувствительность
к антимикробным препаратам и минимальную ингибирующую концентрацию
антибиотиков. Среднее время получения результата идентификации чистой
культуры составляет 5-6 часов. Среднее время получения результата
чувствительности к антимикробным препаратам - 7-8 часов. Внешний вид системы
Vitek-2представлен на рисунке 139.
Автоматические бактериологические
Рисунок 139 - Система Vitek 2. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
анализаторы Vitek 2
В зависимости от комплектации приборов и количества одновременно
выполняемых анализов выпускается несколько модификаций анализаторов Vitek 2
(рисунок 140).
Рисунок 140 – Модификации автоматических бактериологических анализаторов
Vitek 2. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Анализатор mini API (“bioMerieux”, Франция) представляет собой
полуавтоматизированный настольный анализатор для быстрой идентификации и
определения антибиотикочувствительности бактерий. Позволяет по 25 стрипам
137
определять энтеробактерии, стрептококки, стафилококки, анаэробные бактерии,
дрожжи. Время исследования – от 4 до 24 часов (рисунок 141).
Рисунок 141 - Анализатор mini API. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Система МикроТакс (SY-LAB Geraete GmbH, Австрия) представляет собой
автоматизированную систему для идентификации микроорганизмов и определения
их чувствительности к антибиотикам. Система предназначена для тестирования
микроорганизмов на планшетах. Принцип ее действия состоит в фотометрической
регистрации результатов биохимических реакций и компьютерной обработке
данных. В состав системы входят МикроТакс Ридер МТ-1, МикроТакс Инкубатор
МТ-5, МикроТакс Диспенсер Мт-10 и МикроТакс компьютер с программным
обеспечением для автоматической регистрации и обработки данных (рисунок 142).
Рисунок 142 - Система МикроТакс. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Экспрессность системы МикроТакс заключается в том, что бактериальная
суспензия вносится вручную (при малом количестве исследуемых проб) или
автоматически с помощью программируемого диспенсера (при большом количестве
проб). После инкубации планшеты прочитываются в ридере, и с помощью
компьютерных программ производится обработка данных. Результаты
идентификации бактерий выдаются через 4,5-6 часов, а данные по чувствительности
138
микроорганизмов к антибиотикам – через 6-24 часа. Для идентификации в
системе МикроТакс достаточно одной колонии суточной культуры бактерий,
выросших на агаризованной среде.
Анализатор микробиологический Phoenix 100 (Becton Dickinson, США)
для видовой идентификации микроорганизмов и определения чувствительности к
антибиотикам позволяет идентифицировать 160 видов грамотрицательных
микроорганизмов, 145 видов грамположительных микроорганизмов, 64 вида грибов
и дрожжей. Скорость идентификации составляет от 2 до 5 часов. В анализаторе
одновременно используются хромогенные, флуорогенные, индикаторные
биохимические субстраты, а система измерений основана на колориметрическом,
турбидиметрическом и флуорометрическом методах исследования (рисунок 143).
Рисунок 143 - Анализатор микробиологический Феникс 100. Заимствовано из
Интернет-ресурсов.
Среди других анализаторов используются микробиологический экспрессанализатор БиоТрак 4250 (исследование, контроль качества и сертификация
продуктов питания, сырья, напитков, воды, косметических средств, контроль
стерильности материалов и растворов), бактериологический анализатор гемокультур
BACTEC 9050 (диагностика сепсиса в максимально короткие сроки), баканализатор
Адажио (система считывания антибиотикограмм и расчета минимальных
ингибирующих концентраций антибиотиков), автоматизированные системы
гемокультивирования (например, BD BACTECTM).
Ведущая международная компания по разработке и производству
медицинского оборудования BD (Becton Dickinson) предлагает уже полностью
автоматизированную бактериологическую рабочую станцию (BD Kiestra WCA) и
автоматизированную микробиологическую лабораторию (BD Kiestra TLA),
позволяющие не только автоматизировать процесс, но и автоматически
визуализировать результаты исследования в динамике.
Уникальную
станцию
полностью
автоматизированного
микробиологического посева WASP предлагает фирма Copan (Италия). Эта
роботизированная система объединяет в себе процесс микробиологического посева,
приготовления мазка и пересев в бульон (рисунок 144).
139
Рисунок 144 – Станция WASP фирмы Copan (Италия). Заимствовано из Интернетресурсов.
Разработка новых автоматизированных комплексов для микробиологических
исследований продолжается.
140
6. Фагоидентификация и фаготипирование
Высокая чувствительность бактерий к специфическому бактериофагу
позволяет отличить одни виды бактерий (даже близкородственные виды) от других
видов (возбудителя чумы от возбудителя псевдотуберкулеза, холерный вибрион от
холероподобного). С помощью бактериофагов можно определить типы (варианты)
внутри одного вида бактерий (например, измененные штаммы бруцелл). Поэтому
бактериофаги используются для фагодиагностики инфекций (фагоидентификации и
фаготипирования бактерий).
При проведении фагодиагностики культивирование бактерий осуществляют
на плотной или в жидкой питательной среде. Размножение фагов в бактериальных
культурах на плотных питательных средах сопровождается лизисом бактерий и
образованием зон просветления (стерильных пятен, бляшек или негативных
колоний). Разные фаги формируют негативные колонии определенных размеров и
формы. Размножение бактериофагов в жидких культурах сопровождается
просветлением среды, бывшей перед заражением фагом мутной.
Фагоидентификация бактерий – это установление вида бактерий с
помощью бактериофагов. Фаготипирование – это установление типа (варианта)
бактерий с помощью бактериофага. Фагодиагностика проводится методами Отто,
Фишера и Фюрта.
Метод Отто (метод стекающей капли) используется для идентификации
неизвестных бактерий с помощью известных диагностических фагов. Для
выполнения этого метода на чашку с МПА наносится капля суточной бульонной
культуры и шпателем круговыми движениями распределяется по поверхности агара.
Затем на поверхность культуры наносится капля суспензии известного бактериофага
и наклоном чашки дают капле стечь по поверхности агара. Посевы инкубируют в
термостате в течение суток, после чего учитывают результаты. При соответствии
фага и бактерий в месте нанесения диагностического фага рост культуры
отсутствует (рисунок 145).
Рисунок 145 - Фагоидентификация бактерий по методу Отто. Заимствовано
из Интернет-ресурсов.
Метод Фишера также используется для идентификации неизвестных
бактерий с помощью известных фагов. Для выполнения этого метода каплю
141
испытуемой суточной бульонной культуры наносят на МПА и шпателем
распределяют по поверхности агара. Затем чашку условно делят на квадраты. В
каждый квадрат наносят по капле суспензий разных бактериофагов. После
суточного культивирования в термостате учитывают результаты. При соответствии
бактерий и фага обнаруживаются зоны лизиса (рисунок 146).
Рисунок 146 – Фаготипирование бактерий по методу Фишера. Заимствовано
из Интернет-ресурсов.
Метод Фюрта используется для типирования нескольких неизвестных
бактерий с помощью одного известного бактериофага. При выполнении этого теста
в расплавленный и остуженный до 45-50ОС МПА добавляют суспензию известного
бактериофага и тщательно перемешивают. Полученную смесь разливают в чашки
Петри. Каждую чашку условно делят на несколько секторов, в которые высевают
штрихом разные исследуемые культуры. Чашки инкубируют в термостате, после
чего учитывают результаты. Рост культуры будет отсутствовать в том секторе, в
котором бактерии и фаг соответствуют друг другу (рисунок 147).
Рисунок 147 – Фагоидентификация бактерий по методу Фюрта. Заимствовано
из Интернет-ресурсов.
Фаготипирование часто используют для выявления источника и путей
распространения инфекции (эпидемиологическое маркирование). При этом
142
выделение бактерий одного фаговара от разных больных указывает на общий
источник их заражения.
Присутствие каких-либо микроорганизмов в исследуемой пробе (вода,
пищевые продукты) можно установить с помощью бактериофагов. Этот прием
основан на специфичности действия бактериофагов: бактериофаг E. coli лизирует
только кишечную палочку, холерный бактериофаг вызывает лизис только холерного
вибриона и т. д. Для установления присутствия определенных бактерий в
исследуемую пробу добавляют известное количество специфического фага. При
наличии гомологичных бактерий фаг размножается, в результате чего нарастает его
титр (количество). Следовательно, реакция нарастания титра фага основана на
увеличении количества фага при его контакте с возбудителем непосредственно в
исследуемом материале. Реакцию нарастания титра фага используют при
диагностике дизентерии и брюшного тифа, для выявления бактерионосительства
при брюшном тифе, для обнаружения брюшнотифозных и дизентерийных бактерий
в воде и молоке, для обнаружения дизентерийных микробов на предметах внешней
среды, для выявления чумного микроба и холерного вибриона в воде.
Реакция нарастания титра фага проводится следующим образом. К
исследуемому материалу добавляется определенное количество индикаторного
бактериофага. Смесь инкубируют при температуре 37ОС в течение 4,5-16 часов.
Затем пробу прогревают при температуре 58ОС в течение 30 минут и определяют
количество (титр) бактериофага методом агаровых слоев по Грациа. Для этого в
чашку Петри наливают слой МПА. После застывания на этот слой наливают 2 мл
расплавленного и охлажденного до 45ОС полужидкого (0,7%) агара, в который
предварительно добавляют каплю бактериальной суспензии и определенный объем
суспензии бактериофага. После застывания верхнего слоя агара чашку инкубируют
в термостате при температуре 37ОС в течение 18-24 часов (рисунок 148).
Рисунок 148 – Определение количества фаговых частиц методом агаровых
слоев по Грациа. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
143
Бактерии размножаются внутри верхнего слоя агара, образуя сплошной
непрозрачный фон, на котором хорошо видны негативные колонии фага в виде
стерильных пятен. Считается, что каждая негативная колония образуется за счет
размножения одной фаговой частицы. Метод Грациа позволяет рассчитывать
концентрацию (титр) фага в исходной суспензии (рисунок 149).
Рисунок 149 – Негативные колонии бактериофага в агаре. Заимствовано из
Интернет-ресурсов.
Количества фаговых частиц выражают в бляшкообразующих единицах
(БОЕ/мл). Титр фага в исходной суспензии рассчитывают по формуле:
N = y/vx,
где: N - титр фага;
y - количество негативных колоний;
v - объем использованного фильтрата фага;
х - разведение суспензии фага.
Например, если 0,1 мл фильтрата фага в разведении 10-5 образует 250
негативных колоний, то титр равен 250:0,1 x 10-5 = 2,5 x 108 БОЕ/мл.
144
7. Определение чувствительности бактерий к антибиотикам
Определение чувствительности бактерий к антибиотикам проводят согласно
утвержденным документам (стандартам или приказам), которые регламентируют
процедуру определения антибиотикорезистентности микроорганизмов. В
Российской Федерации существуют соответствующие методические указания по
определению антибиотикорезистентности (МУК 4.2.1890-04. Определение
чувствительности
микроорганизмов
к
антибактериальным
препаратам.
Методические указания), в США и Европе – стандарты и рекомендации Института
клинических и лабораторных стандартов (Clinical and Laboratory Standards Institute –
CLSI, до 2005 г. - National Committee for Clinical Laboratory Standards - NCCLS). В
Российской Федерации большую исследовательскую и образовательную работу по
вопросам клинической микробиологии и антимикробной резистентности
осуществляет Межрегиональная ассоциация по клинической микробиологии и
антимикробной терапии (МАКМАХ).
Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам показано в
следующих случаях:
- выявление чувствительности бактерий к новому антибиотику,
рекомендованному к применению;
- периодический мониторинг распространения антибиотикорезистентности в
отдельных регионах;
- обоснование адекватной антибиотикотерапии у некоторых пациентов (при
выделении бактерий из первично стерильных тканей и органов, при изоляции
возбудителей, резистентных к используемым антибиотикам, при отсутствии опыта
лечения новых инфекций).
При тестировании чувствительности микроорганизмов к антибиотикам
используют чистую культуру бактерий. Определение чувствительности без
выделения чистой культуры возможно только в исключительных случаях. При этом
исследование повторяют после выделения чистой культуры бактерий.
При изучении чувствительности бактерий к антибиотикам используют
следующие специфические термины.
Минимальная ингибирующая или минимальная подавляющая
концентрация (МИК или МПК) - наименьшая концентрация антибиотика, которая
подавляет видимый рост исследуемого микроорганизма in vitro (в жидких или на
плотных питательных средах) в стандартных условиях постановки опыта. МПК
выражается в мкг/мл (мг/л) или ед/мл.
Минимальная бактерицидная концентрация (МБК) - наименьшая
концентрация антибиотика, которая при исследовании in vitro вызывает гибель
99,9% микроорганизмов от исходного уровня в течение определённого периода
времени.
Чувствительный микроорганизм – это микроорганизм, который не имеет
механизмов резистентности к данному антибиотику. Его рост на питательной среде
прекращается при использовании антибиотика в терапевтической дозе.
Умеренно-резистентный (умеренно-устойчивый) микроорганизм - это
микроорганизм, рост которого на питательной среде прекращается только при
использовании антибиотика в повышенной дозе. Лечение инфекций, вызываемых
145
умеренно-резистентными
микроорганизмами,
в
случае
отсутствия
альтернативных препаратов, проводится высшей (максимальной терапевтической)
дозой антибиотика.
Резистентный (устойчивый) микроорганизм - это микроорганизм,
который имеет механизмы резистентности к данному антибиотику. Его рост на
питательной среде прекращается лишь при использовании очень высоких
концентраций препарата, которые нельзя создать в организме из-за их высокой
токсичности. При лечении инфекций, вызванных этим микроорганизмом,
клинический эффект от терапии отсутствует даже при использовании высшей дозы
антибиотика. При этом могут наблюдаться побочные эффекты от действия
антибиотика.
В настоящее время на практике используются следующие методы
определения чувствительности микроорганизмов к антибактериальным
препаратам:
- метод серийных разведений антибиотиков в жидких средах;
- метод серийных разведений антибиотиков в плотных средах;
- диффузионный метод классический;
- диско-диффузионный метод;
- комбинированный метод (Е-тест).
Метод серийных разведений в жидких средах предусматривает
определение минимальной ингибирующей (подавляющей) рост микроорганизмов
концентрации антибиотиков. Для этого готовят 8-12 двукратных серийных
разведений антибиотика и суспензию исследуемого микроорганизма с
концентрацией микробных клеток 106 КОЕ/мл. В жидкие среды с серийными
разведениями антибиотиков вносят исследуемую культуру в соотношении 1:1
(посевная доза – 5·105 КОЕ), инкубируют посевы в течение 10-18 часов при
температуре 37°С, и учитывают результаты визуально или нефелометрически. В
качестве контроля используют пробирку с питательной средой без антибиотика.
МПК соответствует наибольшему разведению препарата, тормозящему рост
культуры (рисунок 150).
лм/гк м ,акитоибитна яица ртн ецноК
Концентрация антибиотика, мкг/мл
2323 6161
88
44
Рост отсутствует
т еу вт сту сто тсоР
МПК
КПМ
22
11 50,5
,0 50,25
2,0 00
Рост бактерий
йи реткаб тсоР
Рисунок 150 – Определение МПК методом разведения в жидкой питательной среде.
Иногда в среду культивирования добавляют глюкозу и индикатор, что
позволяет учитывать результаты также по изменению окраски среды. Этот метод
146
позволяет установить минимальную ингибирующую концентрацию (МИК) или
минимальную подавляющую концентрацию (МПК) препарата для конкретного
возбудителя. В качестве питательной среды используют МПБ или другую среду,
соответствующую питательным потребностям возбудителя.
Серийные разведения антибиотиков в жидких средах можно проводить
микрометодом в лунках планшетов (рисунок 151), используя в планшете один
антибиотик и разные культуры или разные антибиотики и одну культуру. Именно
этот принцип используется в тех микробиологических анализаторах, которые
предусматривают возможность определения чувствительности исследуемой
культуры к антибиотикам.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
Рисунок 151 – Определение чувствительности бактерий к антибиотикам
микрометодом серийных разведений в лунках планшета (концентрация антибиотика
убывает сверху вниз; 1-11 – номера культур). Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Метод серийных разведений в плотных средах аналогичен предыдущей
процедуре, но проводится с использованием плотных питательных сред. Для
проведения исследований готовят 8-12 серийных двукратных разведений
антибиотиков в пробирках, содержащих охлажденную агаровую среду. Содержимое
пробирок перемешивают и переносят в чашки Петри до застывания агара. Затем на
поверхность агара проводят посев исследуемой культуры в количестве 1-2 мкл
(посевная доза 1-2·104 КОЕ). Посевы инкубируют в течение 18-20 часов при
температуре 35-37°С. МПК антибиотиков устанавливают по отсутствию роста
культуры на агаре с определенной концентрацией антибиотика.
Диффузионные методы менее чувствительны, чем методы стандартных
разведений, но проще в исполнении. На практике их применяют чаще. Эти методы
являются качественными и позволяют определять чувствительность бактерий к
нескольким антибиотикам одновременно.
Классический диффузионный метод осуществляется следующим образом.
В чашки Петри вносят тонкий слой (4-5 мм) агара. После застывания на поверхность
агара наносят микробную взвесь и равномерно распределяют по поверхности. После
подсушивания чашек в термостате в агаре пробивают лунки диаметром 5 мм и в
147
каждую лунку вносят по 0,1 мл раствора исследуемого антибиотика. Чашки
инкубируют в термостате при температуре 36ОС в течение 18-24 часов. После
культивирования измеряют диаметр зоны подавления роста вокруг лунки для
каждого препарата (рисунок 152).
Рисунок 152 – Результат классического диффузионного метода определения
чувствительности бактерий к антибиотикам. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Метод бумажных дисков (диско-диффузионный метод, ДДМ) является
наиболее распространенным и технически простым полуколичественным методом
определения антибиотикочувствительности бактерий. При выполнении этого метода
необходимо выполнять некоторые условия: слой агара должен быть 4,0±0,5 мм (в
чашку Петри диаметром 90 мм вносят строго 20 мл агара), а поверхность агара –
строго горизонтальной.
Для постановки теста готовят суспензию исследуемых бактерий с
концентрацией 1,5·108 КОЕ/мл и 1 мл суспензии наносят на чашку Петри с плотной
питательной средой. Суспензию распределяют равномерно по поверхности агара,
избыток суспензии удаляют, поверхность среды подсушивают и наносят диски с
антибиотиками на расстоянии 2 см друг от друга и от края чашки. На одну чашку
Петри наносят не более 6 дисков. Посевы с дисками инкубируют при температуре
35ОС в течение 18-24 часов.
Для постановки диско-диффузионного теста используют коммерческие
диски размером 6,25 мм в диаметре из специального фильтровального картона.
Диски пропитаны антибиотиком в определенной концентрации (рисунок 153).
Рисунок 153 – Диски с антибиотиками для диско-диффузионного метода.
Заимствовано из Интернет-ресурсов.
148
Вокруг дисков в зависимости от концентрации антибиотика и
чувствительности к нему культуры образуются разной величины зоны задержки
роста исследуемого микроба (рисунок
154).
Результат
4
Рисунок 154 – Результаты диско-диффузионного метода определения
чувствительности бактерий к антибиотикам. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
С помощью линейки измеряют диаметры зон задержки роста вокруг дисков и
по специальным таблицам определяют степень чувствительности микроба к тому
или иному антибиотику (рисунок 155).
Рисунок 155 – Измерение диаметра зоны задержки роста культуры. Заимствовано из
Интернет-ресурсов.
За рубежом выпускаются гексадиски (6 объединенных дисков) и октодиски
(8 объединенных дисков), позволяющие определять чувствительность бактерий
одновременно к 6 или 8 антибиотикам. Для нанесения таких дисков на поверхность
агара разработаны специальные диспенсеры (рисунок 156).
149
а
б
в
Рисунок 156 – Диспенсеры (а) для размещения гексадисков (б) и октодисков (в) при
определении чувствительности бактерий к антибиотикам. Заимствовано из
Интернет-ресурсов.
Зоны задержки роста культур вокруг дисков измеряют с помощью линейки.
Полученные размеры зон сравнивают с величинами зон задержки роста, указанными
в инструкции, после чего микроорганизмы относят к той или иной группе
(чувствительным, умеренно чувствительным или резистентным). Показатели
активности основных антибиотиков, определяемые методом стандартных
индикаторных дисков, представлены в таблице 18.
Таблица 18 – Показатели активности основных антибиотиков, определенные
методом стандартных индикаторных дисков
№№
пп
Антибиотики
1.
Азтреонам
2.
3.
Амоксициклин
(амоксиклав)
Ампициллин
4
Бензилпенициллин
5.
Ванкомицин
6.
Гентамицин
7.
Доксициклин
8.
Канамицин
9
Карбенициллин
10.
Клиндамицин
11.
12.
Левомицетин
Линкомицин
Код
диска
(лат.)
АТМ
(Ао)
АКК
(Ас)
АМП
(А)
ПЕН
(Р)
ВА
(Va)
ГЕН
(G)
ДОК
(Do)
КАН
(К)
КАР
(Cb)
КЛ
(Cd)
ЛЕВ
ЛИН
Содержание
антибиотика в
диске, мкг
30
Диаметр зоны отсутствия роста, мм
устойчивые
умеренно
чувствиустойчивые
тельные
≤15
16-21
≥22
10
≤10
11-12
≥13
10
≤9
10-13
≥14
6
≤11
12-21
≥22
30
≤14
15-16
≥17
10
≤13
-
≥14
10
≤12
13-19
≥20
30
≤14
15-18
≥19
25
≤14
15-18
≥19
2
≤14
15-20
≥21
30
15
≤14
≤19
15-18
20-23
≥19
≥24
150
13.
14.
Линезолид
Меропенем
15
Метициллин
16.
17.
Мономицин
Неомицин
18.
Нетилмицин
19.
20.
Нитрофурантоин
Оксациллин
21.
Олеандомицин
22.
23.
Офлоксацин
Полимиксин - В
24.
25.
Ристомицин
Рифампицин
26.
Стрептомицин
27.
Тетрациклин
28.
Триметоприм
29.
30.
Триметоприм /
сульфаметоксазол
Фузидин
31.
Фуродонин
32.
Цефазолин
33.
34.
Цефалексин
Цефоперазон
35.
Цефоперазон /
сульбактам
Цефтазидим /
клавулановая кислота
Эритромицин
36.
37.
(L)
(Lz)
МПН
(Mr)
МЕТ
(М)
МОН
НЕО
(N)
НИЦ
(Nt)
(Nf)
ОКС
(Ox)
ОЛЕ
(Ol)
(Of)
ПОЛ
(Pb)
РИС
РИФ
(R)
СТР
(S)
ТЕТ
(Т)
ТМ
(Nr)
ТС
ФУЗ
(Fc)
ФД
(Fr)
ЦЗ
(Cz)
ЦФЛ
ЦПН
(Cs)
ЦПС
(Cfs)
(Cac)
ЭРИ
(Е)
30
25
≤20
≤13
21-22
14-15
≥23
≥16
10
≤13
14-17
≥18
30
30
≤13
≤13
14-17
14-17
≥18
≥18
30
≤12
13-14
≥15
300
10
≤14
≤19
15-16
20-23
≥17
≥24
15
≤12
13-17
≥18
5
300 ЕД
≤12
≤8
13-16
9-12
≥17
≥13
30
5
≤9
≤9
10-11
10-12
≥12
≥13
30
≤13
14-16
≥17
30
≤15
16-19
≥20
25
≤10
11-15
≥16
1,25 / 23,75
≤10
11-15
≥16
10
≤12
13-19
≥20
300
≤14
15-16
≥17
30
≤14
15-17
≥18
30
75
≤11
≤15
12-16
16-20
≥17
≥21
75 / 30
≤15
16-20
≥21
30 / 10
≤14
15-17
≥18
15
≤14
15-18
≥19
В случае, когда используются антибиотики, не указанные в представленной
таблице, используют универсальную оценочную шкалу (таблица 19).
Таблица 19 – Ориентировочная (универсальная) шкала оценки
чувствительности микроорганизмов к антибиотикам при использовании дискодиффузионного метода
151
Диаметр зоны торможения роста (в мм)
 10
10 – 15
15 – 20
 20 – 25
Чувствительность микроорганизмов
нечувствительны
слабо чувствительны
чувствительны
высокочувствительны
Таким образом, если зона задержки роста составляет 15-25 мм, то микробы
считают чувствительными к антибиотикам, до 15 мм - малочувствительными, а
отсутствие зоны указывает на резистентность бактериальной культуры к данному
антибиотику. Этот метод используется только для “быстрорастущих”
микроорганизмов, образующих сплошной рост на плотной питательной среде (в
виде “газона”) через 18-20 часов экспозиции.
Е-тест (эпсилометрический метод) представляет собой модификацию метода
дисков. В то же время Е-тест позволяет получать как качественный
(чувствительный, резистентный), так и количественный (МПК) результат
исследования. В этом тесте вместо дисков используется пластиковая полоска,
содержащая экспоненциально убывающие концентрации антибиотика (например, от
256 до 0,016 мкг/мл). Каждая зона полоски имеет соответствующую маркировку.
Для постановки теста готовят суспензию бактерий в концентрации 108
КОЕ/мл. Приготовленной суспензией смачивают стерильный тампон и равномерно
штриховыми движениями распределяют суспензию по всей поверхности агара.
После подсушивания на чашку диаметром 90 мм наносят не более 2, а на чашку
диаметром 150 мм - не более 6 полосок Е-теста. Посевы с полосками инкубируют
при температуре 35ОС в течение 16-18 часов.
Зона задержки роста культуры в Е-тесте имеет эллипсовидную
(каплевидную) форму. Минимальной ингибирующей концентрации антибиотика
Е-тест
соответствует тот участок
полоски, где ее пересекает зона задержки роста
исследуемой культуры (рисунок 157).
Вариант постановки Е-теста
Зона роста бактерий
Зона подавления роста
МПК 2 мкг/мл
86
а
б
85
Рисунок 157 – Схема интерпретации результатов опыта (а) и определение МПК с
помощью Е-теста (б). Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Автоматические системы учета результатов метода серийных разведений
представляют собой инкубационные системы со встроенными фотометрами,
регистрирующими рост бактерий в лунках микропанелей, содержащих антибиотики.
Например, устройство VITEK 2 позволяет получать результаты уже через 4-10
Vitek 2. Автоматическая система для иденти
152
микроорганизмов
и
определения
чувствител
часов. Этот анализатор не только проводит идентификацию культуры, но и
АМП
определяет минимальную ингибирующую концентрацию более
100 антимикробных
препаратов (рисунок 158).
• Обеспечивают по
результата вмест
антибиотикограм
день получения ч
культуры
• Идентификация б
таксонов
• Определение
чувствительности
Рисунок 158 – Устройство VITEK 2 для автоматической идентификации и
(минимальных
определения чувствительности бактерий к антимикробным препаратам.
ингибирующих
Заимствовано из Интернет-ресурсов.
концентраций) к
антимикробных
Автоматизированный метод определения чувствительности
бактерий к
препаратов
антибиотикам предусматривает использование пластиковых карт с лунками,
заполненными антибиотиками, углеводами, индикаторами рН. Все компоненты
находятся в высушенном состоянии. Для постановки теста готовят суспензию
чистой культуры исследуемых бактерий. Анализатор автоматически вносит
суспензию микроорганизмов в тест-систему, инкубирует при 35ОС в течение суток,
учитывая результаты каждые 2 часа. Прибор автоматически проводит
нефелометрию и спектрофотометрию и по изменению мутности и цвета среды
определяет МИК исследуемой культуры, сравнивает ее со стандартными
величинами МИК и относит бактерии к чувствительным, умеренно чувствительным
или резистентным. По мере готовности результатов анализатор выдает протокол
испытаний (электронный или печатный). Этот метод прост в исполнении, позволяет
получать результаты через 5–8 часов, способен создавать электронную базу данных.
Однако для этого метода требуется дорогостоящий автоматический анализатор.
Карты-тест-системы для идентификации бактерий и определения
чувствительности к антимикробным препаратам выпускаются к анализаторам
VITEK 2 и VITEK 2 Compact. Они поставляются отдельно. Определение
чувствительности к антибиотикам осуществляется методом, аналогичным методу
двойных разведений в жидкой (полужидкой) среде. Карта для определения
чувствительности имеет 64 лунки и содержит 18-22 антимикробных препарата в
нескольких концентрациях. После заполнения суспензией бактерий карта
запаивается и становится полностью герметичной и безопасной.
При определении чувствительности микроорганизмов к антибиотикам
целесообразно соблюдать следующие условия:
- использование в работе чистых культур бактерий и выполнение
исследований с соблюдением правил асептики;
- применение стандартных питательных сред, соответствующих питательным
потребностям исследуемого микроорганизма;
153
использование
исследуемой
культуры
в
установленной
соответствующими инструкциями дозе с соблюдением соотношения культуры и
среды;
- использование оптимального режима инкубирования.
В некоторых случаях в бактериологии используют генетические методы,
направленные на определении маркёров резистентности к антибиотикам. Выявление
генетических маркёров резистентности целесообразно в тех случаях, когда
традиционные
фенотипические
методы
определения
чувствительности
микроорганизмов неприменимы или недостаточно эффективны. Например,
определение чувствительности Mycobacterium tuberculosis к противотуберкулёзным
препаратам с помощью фенотипических методов занимает 4-8 недель. При
длительном культивировании микобактерий антибиотики снижают свою
активность, что приводит к искажению получаемых результатов.
В последние годы в лабораторной практике стали применять метод ПЦР для
выявления у микробов специфических генов, ответственных за формирование
лекарственной устойчивости (геноиндикация антибиотикоустойчивых культур).
154
8. Биологический метод исследования
Биологический (экспериментальный) метод (биопроба) позволяет выделять
патогены из организма зараженных животных, воспроизводить инфекционный
процесс (качественный показатель), определять вирулентность культур
(количественный показатель) и токсичность. В некоторых случаях с помощью
биопробы можно изучать аллергическое действие микробов на макроорганизм.
8.1. Лабораторные животные, правила работы с ними
Выбор лабораторных животных определяется целью работы. Наиболее часто
используют для заражения белых мышей, морских свинок и кроликов. Они
восприимчивы к возбудителям многих инфекционных заболеваний человека,
удобны в обращении и легко размножаются в питомниках. Реже заражают хомяков,
обезьян и других животных. В некоторых лабораториях для заражения используют
так называемых линейных животных, выведенных путем родственного братскосестринского скрещивания на протяжении более 20 последовательных поколений.
Линейные животные являются генетически однородными и отличаются от
нелинейных животных постоянными реакциями на воздействие различных
факторов.
Лабораторные животные характеризуются видовой, возрастной и
индивидуальной чувствительностью к микроорганизмам. В связи с этим при выборе
животных для исследований необходимо учитывать их вид и возраст. У
беспородных животных чувствительность характеризуется значительными
индивидуальными колебаниями. Использование линейных животных, обладающих
определенной постоянной восприимчивостью к микроорганизмам, позволяет
исключить
индивидуальные
колебания
чувствительности
и
получить
воспроизводимые результаты.
Животных заражают для выделения чистой культуры возбудителя в тех
случаях, когда нельзя получить ее другими способами (например, незначительное
содержание микроорганизмов в пробе). Так, при исследовании разложившихся
трупов грызунов на присутствие возбудителей чумы суспензией органов заражают
морских свинок, которые погибают через 3-7 дней при явлениях септицемии
(размножение микроорганизмов в крови). Из крови и внутренних органов павшей
морской свинки можно легко выделить чистую культуру возбудителя.
Отбор животных. Опыты проводят только на здоровых животных.
Желательно использовать животных одинакового возраста, пола, массы. Перед
заражением животных взвешивают и измеряют у них температуру тела.
Взвешивание и измерение температуры производят до заражения и в течение всего
опыта. Нормальная температура тела у лабораторных животных колеблется в
следующих пределах: у морских свинок - 37,8-39,5°С, у кроликов - 37,7-38,8°С, у
мышей – 37-39°С.
Маркировка (метка) мелких животных (например, мышей) заключается в
окрашивании различных участков шерсти растворами анилиновых красителей,
пикриновой кислоты или в нанесении маркерных знаков на уши. Маркерные знаки
155
выпускаются в виде колец или жетонов из мягкой белой жести. Их закрепляют на
лапках или ушах животных. Для маркировки морских свинок отмечают характер
рисунка шерсти в виде схемы.
Место введения материала готовят накануне проведения опыта, чтобы к
моменту введения исчезло раздражение кожи. На ограниченных участках шерсть
выстригают, выбривают (выщипывание волос не рекомендуется) или удаляют с
помощью депиляторов. Для депиляции смесь одной части бария сульфата и двух
частей оксида цинка разводят водой до получения массы в виде густой сметаны и
накладывают эту массу на 3 минуты на шерсть, после чего удаляют ее вместе с
шерстью, а кожу тщательно промывают водой. Непосредственно перед инъекцией
кожу дезинфицируют спиртом или йодной настойкой. У мелких животных шерсть
не удаляют, а обрабатывают стерильным физраствором.
Фиксация животных. Неподвижность животного во время опыта достигается
применением специальных станков, досок-фиксаторов, ящиков или приемов, с
помощью которых помощник фиксирует животное в нужном положении.
Для проведения подкожных и внутрикожных инъекций кроликов и морских
свинок кладут на бок, одной рукой держат задние конечности, а другой
обхватывают грудную клетку, вводя пальцы в подмышечные впадины.
При взятии крови из сердца животных или при введении материала их кладут
на спину, растягивая передние конечности в стороны и немного вверх (рисунок
159).
Рисунок 159 – Взятие крови из сердца кролика. Заимствовано из Интернетресурсов.
Мышь берут левой рукой за хвост, опускают на стол, туловище быстро
прижимают к столу двумя пальцами правой руки и, передвигая их по спине,
захватывают кожу над головой. Животное слегка растягивают. Чтобы держать
мышь без помощника (одной рукой), кожу головы фиксируют пальцами левой руки,
а хвост - мизинцем и ладонью той же руки (рисунок 160).
156
Рисунок 160 – Заражение мыши внутрибрюшинным способом. Заимствовано
из Интернет-ресурсов.
Инструменты, необходимые для заражения и вскрытия животных, кипятят в
течение 30 минут. Патологический материал или взвесь микроорганизмов набирают
в шприц над кюветой с дезинфицирующим раствором. Для предупреждения
разбрызгивания при удалении пузырьков воздуха иглу вводят в стерильную вату,
поворачивают шприц иглой вверх и выталкивают воздух вместе с небольшим
количеством материала. Загрязненную вату снимают пинцетом и погружают в
дезинфицирующий раствор. После заражения шприц и инструменты вновь кипятят
30 минут и более в зависимости от устойчивости микроорганизмов в материале к
температуре. При использовании одноразовых шприцов и инструментов их
помещают в дезраствор, подвергают автоклавированию и уничтожают.
8.2. Методы заражения и вскрытия лабораторных животных
При заражении лабораторных животных исследуемый материал вводят
различными путями: накожно, внутрикожно, подкожно, внутримышечно,
внутривенно, перорально, интрацеребрально. Способ введения материала зависит от
тропизма возбудителя к определенным тканям организма, а объем вводимого
материала - от метода его введения и вида животных (таблица 20).
Таблица 20– Основные способы заражения лабораторных животных
Путь введения
материала
В мозг
Внутрикожно
В брюшную полость
Внутривенно
Через нос
Подкожно
Внутримышечно
В переднюю камеру
глаза
мышь
0,02
0,1-0,2
До 1,0
До 1,0
0,03-0,05
До 0,5
0,25
-
Объем вводимого материала, мл
морская свинка
0,1
0,1-0,2
До 5,0
До 2,0
До 2,0
3,0-5,0
2,0
0,05-0,1
кролик
0,2-0,3
0,1-0,2
До 10,0
До 5,0
До 2,0
3,0-5,0
5,0
0,05-0,1
157
Заражение через рот осуществляется путем добавления инфицирующего
материала к корму или питьевой воде. Перед заражением животных не кормят в
течение суток. Пероральное заражение можно производить с помощью зонда или
эластичного катетера, шприца и иглы, сточенной под прямым углом или с оливой на
конце.
Подкожное заражение проводят следующим образом. Двумя пальцами левой
руки захватывают кожу и в образовавшуюся складку вводят иглу (рисунок 161).
Рисунок 161 – Подкожное заражение морской свинки. Заимствовано из
Интернет-ресурсов.
Проколов кожу, слегка меняют направление иглы, чтобы после ее извлечения
материал не выливался, затем вводят содержимое шприца, надавливая на поршень
правой рукой, и быстро извлекают иглу, предварительно положив на нее вату,
смоченную в спирте. Кроликам и морским свинкам подкожные инъекции делают на
спине и животе, а крысам и мышам - на спине, у корня хвоста.
Внутрикожное заражение требует более тщательного удаления шерсти
животного. Кожу растягивают двумя пальцами левой руки и вводят тонкую иглу
под острым углом отверстием кверху в поверхностный слой эпидермиса так, чтобы
конец ее просвечивал через кожу. При правильном введении жидкости появляется
четко отграниченное возвышение, не исчезающее в течение 3-5 минут. Кожа над
ним приобретает вид лимонной корочки. Внутрикожно вводят не более 0,1-0,2 мл
жидкости.
Накожное заражение - способ, при котором исследуемый материал втирают
стеклянной палочкой в неповрежденную или скарифицированную кожу. Скарификацию (насечки) делают скальпелем или специальным пером. Материал втирают в
местах, недоступных для слизывания (на спине, ближе к голове).
Внутрибрюшинное заражение проводят так, чтобы инфицирующий
материал попал в нижний отдел брюшной полости. При этом животное держат
головой вниз, чтобы кишечник переместился к диафрагме. Толчкообразным
движением прокалывают брюшную стенку и вводят содержимое шприца.
Внутривенное заражение различно у разных видов животных. Кроликам
инфицирующий материал вводят в краевую вену уха. Удалив шерсть вдоль
наружного края уха, для лучшего кровенаполнения зажимают основание его, растирают или смазывают ксилолом. Иглу вводят в вену под острым углом (рисунок
162) по направлению тока крови, перед инъекцией сдавливание прекращают.
158
Рисунок 162 – Внутривенное заражение кролика. Заимствовано из Интернетресурсов.
Перед извлечением иглы вену сдавливают стерильной сухой ватой и не
снимают ее до прекращения кровотечения,
Мышам инъекции осуществляют в хвостовую вену. Помощник держит мышь
и сдавливает корень хвоста. Для более полного кровенаполнения сосудов хвост
погружают на 1-2 минуты в воду, нагретую до 50°С. Прокол лучше делать у
основания хвоста, где сосуды расположены поверхностно, а вены шире. Во время
введения материала сдавливание у корня хвоста прекращают.
Морским свинкам материал вводят в вену на внутренней поверхности бедра,
предварительно разрезав и отсепарировав кожу. После инъекции на рану
накладывают швы.
Внутрисердечное заражение по технике не отличается от взятия крови из
сердца. Кролика или морскую свинку фиксируют, как описано выше, при этом
голова животного должна находиться слева от экспериментатора. Шерсть с левой
стороны груди выстригают, кожу дезинфицируют спиртом или йодом. Большим
пальцем левой руки экспериментатор слегка надавливает на правую сторону
грудной клетки животного, а указательным пальцем нащупывает толчок сердца и
одновременно определяет положение ребер. Иглу вводят в межреберный
промежуток в месте толчка сердца перпендикулярно грудной клетке. Если игла
находится в полости сердца, в шприц толчками поступает кровь. После заражения
место прокола дезинфицируют спиртовым раствором йода.
Заражение через нос производят за защитным стеклом. Материал вводят под
наркозом (эфирным), для чего животных (крыс, мышей) помещают в плотно
закрываемую банку, на дно которой помещают вату, смоченную эфиром. При
оптимальном наркозе у животных наблюдается глубокое ритмичное дыхание.
Материал вводят в каждый носовой ход при помощи шприца с надетой на него
иглой или пастеровской пипетки. При неглубоком наркозе у животных сохраняется
чихательный рефлекс, и материал может быть разбрызган, что создает опасность
заражения экспериментатора. При слишком глубоком наркозе дыхание животных
поверхностное, и материал не втягивается в носовые ходы.
Заражение в переднюю камеру глаза. Животное фиксируют спиной кверху.
В конъюнктивальную полость закапывают 1-2 капли 2% раствора новокаина или
другого анестетика. Об анестезии глаза свидетельствует исчезновение роговичного
рефлекса. Помощник фиксирует голову кролика к поверхности стола на боку и
159
тупым концом пинцета выводит глазное яблоко из глазницы со стороны ее
внутреннего угла. Левой рукой захватывают глазное яблоко за конъюнктиву с помощью глазного пинцета, а тонкой иглой, находящейся в правой руке, прокалывают
роговицу параллельно радужной оболочке. Иглу медленно продвигают к центру
роговицы, пока в ее просвете не окажется жидкость. После истечения 2-3 капель
жидкости на иглу надевают шприц и в переднюю камеру глаза вводят 0,05-0,1 мл
инфицирующего материала.
Заражение в мозг. Мышей и крыс фиксируют большим и указательным пальцами левой руки за кожу головы, а мизинцем и безымянным пальцем - за хвост.
Череп прокалывают иглой, надетой на туберкулиновый шприц, латеральнее средней
линии после предварительной обработки кожи 3% спиртовым раствором йода.
Кроликам и морским свинкам материал вводят через суборбитальную борозду.
Животных фиксируют, кожу освобождают от волос и обрабатывают 3% спиртовым
раствором йода, прощупывают борозду, несколько смещают кожу и прокалывают
кость у внутреннего угла глаза укороченной иглой (длиной 4-5 мм), направляя ее к
срединной линии и вверх. Морских свинок и кроликов можно заражать также через
трепанационное отверстие.
После заражения животных помещают в клетки или емкости, закрывающиеся
сверху металлической сеткой. Помещение должно быть теплым и сухим. Особенно
чувствительны к холоду мыши; морские свинки чувствительны, помимо холода, к
повышенной влажности воздуха. Животные должны регулярно получать пищу с
достаточным количеством витаминов, воду; за их состоянием нужно
систематически следить.
Вскрытие павших животных проводится для извлечения пораженных органов,
обнаружения возбудителя, вызвавшего гибель животного, выделения чистой
культуры возбудителя и определения места его локализации. Заболевших животных
забивают с помощью эфирного наркоза или воздушной эмболии. Вскрытие следует
производить как можно раньше после гибели животного, так как кишечная
микрофлора быстро проникает в ткани, кровь и органы. При комнатной температуре
это происходит через 10-18 часов, а при температуре холодильника - через 20-22
часа, поэтому труп до вскрытия сохраняют на холоде. Животных вскрывают с
соблюдением правил асептики, используя только стерильные инструменты.
Перед вскрытием шерсть животного смачивают дезинфицирующим
раствором. Трупы вскрывают на доске, помещенной в металлическую кювету с
дезинфицирующим раствором. Труп животного кладут на спину, растягивают в
стороны лапы, осматривают наружные покровы, отмечая наличие язв, выпадение
шерсти и изменение цвета кожи и т. п. Затем труп животного фиксируют к доске
иглами или острыми гвоздями (рисунок 163).
160
Рисунок 163 – Фиксация и вскрытие трупа белой мыши. Заимствовано из
Интернет-ресурсов.
Вскрытие наружных покровов начинают с продольного разреза кожи от
нижней челюсти до лобка. Кожу отделяют от подлежащих тканей, обнажая всю
переднюю поверхность туловища животного. Отмечают состояние подкожной
клетчатки и лимфатических узлов и при наличии в них изменений делают посевы в
питательные среды и препараты-отпечатки (прикасаясь предметным стеклом к
месту разреза). Использованные инструменты погружают в дезинфицирующий
раствор.
При вскрытии грудной полости всю область, освобожденную от кожи,
смачивают спиртом и поджигают. Пинцетом захватывают мечевидный отросток,
делают поперечный разрез под ним и два продольных, перерезая ребра в местах их
соединения с хрящами. Полученный лоскут в виде треугольника (основание у диафрагмы, а вершина у ключицы) откидывают вверх и изучают состояние органов
грудной клетки, отмечают наличие экссудата, делают посев крови и препаратыотпечатки из ткани легких. Кровь из сердца берут пастеровской пипеткой.
Предварительно разрезают эпикард и прижигают поверхность мышцы сердца,
прикладывая к ней раскаленный скальпель, затем капилляр пипетки вводят в сердце.
Кровь, поступившую в капилляр, высевают на питательные среды и используют для
приготовления мазков.
Вскрытие брюшной полости производят осторожно, чтобы не захватить петлю
кишки. Для этого приподнимают пинцетом брюшную стенку, делают ножницами
продольные разрезы от диафрагмы до лобка и два поперечных разреза по
направлению к конечностям. Отвернув мышечные лоскуты, исследуют состояние
органов брюшной полости, обращая особое внимание на величину, цвет и
консистенцию селезенки, печени, надпочечников.
Затем делают посевы из ткани селезенки, печени, брыжеечных лимфатических
узлов и экссудата. Поверхность органа прижигают раскаленным скальпелем и в
этом участке производят разрез. В месте разреза петлей делают соскоб и высевают в
питательные среды. Для приготовления мазка вырезают небольшой кусочек ткани,
161
берут его пинцетом и прикасаются к поверхности предметного стекла (препаратотпечаток) или распределяют по стеклу тонким слоем.
После вскрытия труп животного утилизируют после автоклавирования. Все
инструменты, кювету и доску для фиксации обрабатывают дезинфицирующими растворами или стерилизуют.
8.3. Определение вирулентности бактерий
При изучении свойств микроорганизмов в ряде случаев определяют их
вирулентность. Это необходимо для характеристики возбудителей, выделенных от
больных, бактерионосителей и из внешней среды, установления остаточной
вирулентности живых вакцин, выявления напряженности иммунитета у животных и
т. д.
Вирулентность выражают количественно в виде летальной или
инфицирующей дозы:
- DLm (Dosis letalis minima) - минимальная летальная доза - минимальное
количество возбудителя, вызывающее гибель 95% взятых в опыт лабораторных
животных;
- DCL (dosis certae letalis) - абсолютно летальная доза - минимальное
количество возбудителя, вызывающее гибель 100% взятых в опыт лабораторных
животных;
- LD50 - минимальное количество возбудителя, вызывающее гибель 50%
взятых в опыт лабораторных животных.
LD50 является более достоверным показателем вирулентности, так как в
меньшей степени зависит от индивидуальной чувствительности животных. При
определении LD50 вид, пол, вес животных, условия содержания, кормления должны
быть строго стандартизованными. Для определения LD50 из культуры бактерий
готовят 10-кратные разведения, каждое из которых вводят не менее чем 5-10 животным. Через определенный промежуток времени отмечают количество погибших
животных в каждой группе и вычисляют LD50. Для вычисления LD50 существует
несколько методов. Наиболее распространенным является расчет величины LD50 по
методу Кербера в модификации И.П. Ашмарина по формуле:
lg LD50 = lgDmax – lgN·(ΣLi – 0,5), где
Dmax – максимальная из использованных доз;
N – кратность разведения доз;
Li – отношение числа погибших от данной дозы животных к общему числу
животных, которым была введена эта доза;
ΣLi – сумма отношений Li.
В настоящее время определение вирулентности бактерий проводят только в
лабораториях научно-исследовательских организаций.
162
Многие патогенные свойства микроорганизмов коррелируют с легко
выявляемыми in vitro фенотипическими признаками (маркерами вирулентности).
Поэтому в ряде случаев для определения вирулентности достаточно обнаружить
такие признаки у исследуемых культур. Так, у энтеропатогенных иерсиний (возбудителей иерсиниоза и псевдотуберкулеза) определяют кальций-зависимость роста
при 37°С (на кальций-дефицитной среде), у возбудителей кишечных и мочевых
эшерихиозов - соответствующие адгезины (в реакции агглютинации), у
дифтерийной палочки - экзотоксин (в реакции иммунодиффузии) и т.д.
163
9. Иммунодиагностические реакции
Одним из широко применяемых в диагностике инфекций является
серологический (лат. serum – сыворотка, logos – учение) метод, в основе которого
лежит взаимодействие антигенов и антител. Этот метод позволяет выявлять
неизвестные антигены микроорганизмов при взаимодействии с известными
антителами или неизвестные антитела при взаимодействии с известными
антигенами. Результатом взаимодействия антигенов и антител может быть
образование осадка в результате склеивания частиц, лизис клеток, набухание капсул
и др. Наибольшую ценность эти методы имеют в тех случаях, когда выделить
возбудитель не представляется возможным, но можно определить наличие
антигенов возбудителя.
В иммунологической диагностике применяют специфические препараты –
диагностические сыворотки и диагностикумы.
Диагностические сыворотки представляют собой иммунные сыворотки,
содержащие антитела известной специфичности в известном титре.
Диагностические сыворотки получают путем иммунизации (гипериммунизации)
животных соответствующими антигенами.
Диагностикумы представляют собой взвесь в физиологическом растворе
известных микроорганизмов или извлеченных из них антигенов.
Иммунологическая диагностика инфекционных заболеваний проводится с
целью обнаружения в сыворотке крови антител или для обнаружения в
биологических жидкостях, в тканях или в пробах из внешней среды антигенов
возбудителей.
Для иммунологического исследования используют сыворотки крови
пациентов, чистые культуры микроорганизмов, выделенные от больного или из
объектов внешней среды, патологический материал от больного (соскобы,
пунктаты) для экспресс-обнаружения антигенов микроорганизмов.
Достоинства иммунологического исследования:
- высокая специфичность (способностью антигенов взаимодействовать
только с гомологичными антителами);
- высокая чувствительность (реакция агглютинации выявляет 100 мг антител
в 1 л, ИФА и РИА выявляют до 0,00001 мг антител в 1 л);
возможность
проведения
ретроспективных
эпидемиологических
исследований на основании обнаружения антител;
- быстрота получения результатов (результаты при реакции агглютинации на
стекле выявляются через 5 минут, результаты ИФА, РИА – через 4 часа, РП в геле –
через 24 часа).
Выявление и идентификацию возбудителей по их антигенным свойствам
проводят в реакциях агглютинации (ориентировочной агглютинации, коагглютинации, латексной агглютинации), преципитации и ее модификациях,
иммунофлюоресценции (прямой или непрямой варианты).
Антитела к возбудителю определяют в таких серологических реакциях как
развернутая реакция агглютинации, реакция непрямой гемагглютинации, реакция
преципитации, реакция связывания комплемента, иммуноферментный анализ и др.
164
Широкое распространение в настоящее время в лабораторной практике
получили методы латекс-агглютинации и серологические реакции с использованием
метки (реакция иммунофлюоресценции - РИФ, иммуноферментный анализ - ИФА и
иммуноблоттинг - ИБ).
9.1. Реакция агглютинации и ее разновидности
Реакция агглютинации (лат. agglutination – склеивание) позволяет выявлять
корпускулярные антигены, то есть антигены, локализованные на поверхности
крупных частиц (микроорганизмов, клеток различного происхождения,
неорганических частиц). Механизм реакции агглютинации (РА) заключается в том,
что антитело взаимодействует одним активным центром с антигенной
детерминантой одной молекулы антигена, а другим активным центром - с
антигенной детерминантой второй молекулы антигена. В результате подобного
взаимодействия образуется агглютинат (рисунок 164).
Рисунок 164 – Варианты реакции агглютинации бактерий с различными антителами.
Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Реакция агглютинации проявляется склеиванием корпускулярных антигенов
(агглютиногенов) с антителами (агглютининами) и реализуется в изотоническом
растворе электролита, например в 0,9% растворе хлорида натрия. Реакция
агглютинации проявляется выпадением осадка (агглютината). Реакция
агглютинации проводится либо на стекле (ориентировочная или пластинчатая
реакция агглютинации), либо в пробирках (развернутая реакция агглютинации).
9.1.1. Ориентировочная (пластинчатая) реакция агглютинации на
стекле
Ориентировочная (пластинчатая) реакция агглютинации позволяет
идентифицировать возбудителя с помощью известной сыворотки или определить
антитела в сыворотке крови с помощью известных антигенов (бактерий). При
определении возбудителя используют агглютинирующую диагностическую
сыворотку, а при определении антител – антигенный диагностикум.
165
Диагностические агглютинирующие сыворотки содержат известные
антитела. Их получают путем многократной иммунизации (гипериммунизации)
лабораторных животных (чаще всего - кроликов) соответствующими антигенами. В
качестве антигенов выступают либо целые микробные клетки, убитые нагреванием
или обработкой формалином, либо очищенные отдельные антигены бактерий (О, К,
Н). Для получения антитоксической диагностической сыворотки иммунизацию
осуществляют соответствующим анатоксином. Гипериммунизацию животных
проводят внутривенно, подкожно или внутрибрюшинно взвесью убитых бактерий,
начиная с дозы 200 млн., затем 500 млн., 1 млрд., 2 млрд. микробных тел в 1 мл, с
интервалами 5 дней. Через 7-8 дней после последней инъекции у животных
забирают кровь и определяют титр антител. Титром агглютинирующей сыворотки
называется то максимальное разведение сыворотки, при котором происходит
агглютинация с соответствующим антигеном.
После гипериммунизации сыворотка животных содержит антитела ко всем
антигенам бактерий, поэтому ее называют “нативной” или “неадсорбированной”
сывороткой (рисунок 165).
Антигены
АВС
Нативная сыворотка
Антитела А В С
Рисунок 165 – Получение нативной сыворотки. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Нативная сыворотка способна агглютинировать все бактерии той же группы
(семейства, рода). Групповая агглютинация затрудняет определение вида
выделенного
микроба
и
серологическую
диагностику
заболевания.
Неадсорбированные агглютинирующие сыворотки обладают высоким титром - до
1:12800 - 1:25600.
Для выделения из нативной сыворотки антител к отдельным антигенам
используют метод адсорбции по Кастеллани. Метод адсорбции по Кастеллани
состоит в том, что при добавлении к нативной агглютинирующей сыворотке
родственных бактерий происходит адсорбция (связывание) групповых антител при
свободном состоянии видовых специфических антител. В зависимости от полноты
истощения групповых агглютининов можно получить монорецепторные
сыворотки (сыворотки, имеющие антитела только к одному антигену) или
поливалентные сыворотки (сыворотки, дающие реакцию агглютинации с двумя тремя родственными бактериями). В качестве адсорбента могут применяться живые
или убитые бактерии. Наилучшей адсорбционной способностью обладает живая
культура. Вначале нативная сыворотка выдерживается с адсорбентом в термостате
166
О
при 37 С в течение 2-18 часов, затем в холодильнике в течение 6-20 часов.
Истощаемая сыворотка после каждой адсорбции проверяется в реакции
агглютинации на стекле как с культурами того вида, которыми ведется истощение,
так и с родственными культурами.
Адсорбированные моновалентные (монорецепторные) сыворотки содержат
антитела только к одному виду антигенов (рисунок 166).
Антитела А
Антигены
В С Е
Антитела АВС
Рисунок 166 – Метод адсорбции агглютиногенов по Кастеллани. Заимствовано из
Интернет-ресурсов.
Полностью адсорбированные сыворотки освобождаются от микробных
клеток путем центрифугирования. Затем к ней добавляют консервант и фильтруют
через стерилизующий бактериальный фильтр. После выдерживания в течение 2
суток при комнатной температуре сыворотка проверяется на стерильность,
специфичность и величину титра.
Агглютинирующие сыворотки наиболее широко применяются при
диагностике заболеваний, вызываемых бактериями семейства Enterobacteriaceae.
Например, при идентификации эшерихий используются поливалентные и типовые
ОК-сыворотки. При дифференциации сальмонелл используют набор сывороток. В
частности, агглютинирующая адсорбированная поливалентная сальмонеллезная Осыворотка (групп А, В, С, Д, Е) предназначена для определения принадлежности к
отдельным группам рода Salmonella. В случае положительного результата
определяют серологическую группу отдельно с каждой сывороткой (входящей в
смесь), а затем устанавливают серологический тип выделенного возбудителя с
монорецепторными Н-сыворотками сальмонелл, входящих в данную группу.
Антигенные диагностикумы содержат известные антигены бактерий.
Антигенные диагностикумы представляют собой инактивированные нагреванием
или воздействием формалина цельные микробные клетки (корпускулярные
антигены), или выделенные тем или иным способом и очищенные антигенные
субстанции микробов (молекулярные антигены), сорбированные на частицах
нейтрального носителя (эритроциты, латекс, целлюлоза и др.). Антигенные
диагностикумы используются при постановке серологических реакций (прямых или
непрямых). Они предназначены для определения антител к возбудителям
инфекционных заболеваний в пробах сыворотки крови.
Для постановки ориентировочной реакции агглютинации при идентификации
бактерий необходимо 3 компонента: антиген (агглютиноген, неизвестный микроб),
антитело (агглютинин, диагностическая агглютинирующая сыворотка) и электролит
167
(изотонический раствор хлорида натрия). Ориентировочная реакция
агглютинации проводится на предметном стекле при комнатной температуре. Для
этого на обезжиренное предметное стекло пастеровской пипеткой наносят каплю
диагностической сыворотки в разведении 1:10 - 1:20 и каплю раствора хлорида
натрия (контроль). Бактериологической петлей берут чистую культуру
исследуемого микроорганизма с поверхности скошенного агара (или часть
изолированной колонии, или каплю бульонной культуры), переносят как в каплю
сыворотки, так и в каплю раствора хлорида натрия и перемешивают. Результат
реакции учитывают визуально через 3-5 минут или с помощью лупы (увеличение
х5). При положительной реакции в капле прозрачной сыворотки отмечают
появление хлопьев (крупных или мелких), особенно хорошо видимых на темном
фоне при покачивании предметного стекла. В случае отрицательной реакции
жидкость остается равномерно мутной (рисунок 167).
Рисунок 167 - Ориентировочная реакция агглютинации на стекле. Заимствовано из
Интернет-ресурсов.
В зависимости от природы антигена (О-антиген или Н-антиген) различают Оагглютинацию и Н-агглютинацию. Соматические О-антигены термостабильные и
выдерживают кипячение в течение 2 часов. При взаимодействии с антителами
образуют мелкие плотные зерна. О-агглютинация проявляется медленно. Нантигены (жгутиковые) термолабильные, быстро разрушаются при 100°С, а также
под действием этанола. В реакциях с Н-антисывороткой Н-антигены образуют
рыхлые крупные хлопья (образованы бактериями, склеившимися между собой
посредством антител, прикрепившихся к жгутикам). Н-агглютинация проявляется
быстро (рисунок 168).
О-агглютинация
Н-агглютинация
а
б
Рисунок 168 – О-агглютинация (а) и Н-агглютинация (б) бактерий. Заимствовано из
Интернет-ресурсов.
168
При определении антител в сыворотке крови с помощью известных
антигенов можно использовать О-диагностикум и Н-диагностикум. Одиагностикум представляет собой взвесь бактерий, убитых нагреванием. Ндиагностикум представляет собой взвесь бактерий, убитых формалином. При
обработке формалином сохраняется Н-антиген (жгутиковый антиген бактерий).
Разновидностями реакции агглютинации для выявления антител являются
кровяно-капельная проба на туляремию и реакция Хаддльсона на бруцеллёз.
Кровяно-капельная проба на туляремию представляет собой реакцию
агглютинации на стекле. В качестве антигена используют туляремийный
диагностикум. При наличии у больного антител к возбудителю туляремии при
смешивании сыворотки крови с антигеном на стекле немедленно наступает реакция
агглютинации.
Реакция Хаддльсона на бруцеллёз представляет собой метод экспрессдиагностики бруцеллеза. Для проведения этой реакции каплю сыворотки крови
помещают на предметное стекло и смешивается с бруцеллезным диагностикумом. В
контроле капля сыворотки смешивается с физраствором. Положительная реакция
проявляется образованием хлопьев (агглютината).
9.1.2. Развернутая реакция агглютинации
Развернутая реакция агглютинации может использоваться как для
определения антител и установления их титров в сыворотке крови, так и для
определения антигенов (возбудителя).
Для определения антител и их титров в сыворотке крови больного
развернутую реакцию агглютинации проводят следующим образом. К серии
разведений сыворотки крови добавляют антигенный диагностикум - взвесь
известных убитых микроорганизмов или частицы с сорбированными на них
известными антигенами. Максимальное разведение, дающее агглютинацию
антигена, называют титром сыворотки крови. При постановке развернутой
реакции агглютинации в ряд агглютинационных пробирок вносят по 1 мл
физиологического раствора. В первую пробирку прибавляют равный объем
исследуемой сыворотки крови. Готовят последовательные двукратные разведения
сыворотки (титрование сыворотки), после чего в каждую пробирку вносят по 2
капли взвеси инактивированных бактерий (антигенный диагностикум),
содержащей до 3 млрд. микробных тел в 1 мл. Пробирки помещают на 2 часа в
термостат при температуре 37ОС. Реакция протекает с образованием мелких
хлопьев, невидимых невооруженным глазом, поэтому учет результатов проводят
под небольшим увеличением, используя для этого иногда специальный прибор –
агглютиноскоп (рисунок 169).
169
Рисунок 169 – Агглютиноскоп. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Интенсивность агглютинации учитывают по системе “четыре плюса”: полная
агглютинация обозначается 4+, частичная агглютинация – 3+ или 2+, сомнительный
результат - +. В контрольных пробирках агглютинации не должно быть. За титр
антител в исследуемой сыворотке принимают последнее разведение, в котором
наблюдается агглютинация на 2+ (рисунок 170).
Агглютинация
Контроль Контроль
сыворотки антигена
Рисунок 170 - Развернутая РА для определения титра антител в сыворотке крови.
Заимствовано из Интернет-ресурсов.
При определении возбудителя к разведениям агглютинирующей сыворотки
добавляют взвесь бактерий, выделенных от больного. Положительная реакция
проявляется образованием хлопьевидного осадка.
Реакцию агглютинации в пробирках (развернутую реакцию агглютинации)
проводят для определения титра антител к возбудителям брюшного тифа и
паратифов (реакция Видаля), бруцеллеза (реакции Райта).
Реакция Видаля предназначена для определения титра антител в сыворотке
крови к возбудителям брюшного тифа и паратифов. Реакцию проводят следующим
образом. Сыворотку крови разводят изотоническим раствором хлорида натрия
(например, 1:20, 1:40, 1:80 и так далее). Затем к разведениям сыворотки крови
добавляют О-диагностикум (культура бактерий, убитая спиртом или кипячением)
или Н-диагностикум (культура бактерий, убитая формалином). Реакция Видаля с Viантигеном не используется, так как Vi-агглютинины появляются в сыворотке
170
больного нерегулярно и в невысоких титрах. Результаты Н-агглютинации
учитываются через 2 часа инкубирования в термостате, а результаты Оагглютинации – через 2 часа пребывания в термостате и 18-24 часа – при комнатной
температуре. Диагностическим титром реакции Видаля считают разведение
сыворотки 1:200.
Реакция Райта предназначена для определения титра антител в сыворотке
крови больных бруцеллезом. Сыворотку крови разводят изотоническим раствором
хлорида натрия (например, 1:50, 1:100, 1:200 и так далее). К разведениям сыворотки
крови добавляют единый бруцеллезный диагностикум (взвесь убитых бруцелл),
содержащий в 1 мл 1 млрд. микробных клеток. Диагностическим считается титр
выше 1:200.
9.1.3. Реакция коагглютинации
Реакция коагглютинации (РКоА) основана на способности белка А
золотистого
стафилококка
неспецифически
связывать
Fc-фрагменты
иммуноглобулинов, оставляя свободными их Fab-фрагменты. На этом принципе
основано изготовление диагностикумов, состоящих из стафилококков с
сорбированными на их поверхности известными антителами. При добавлении к
такому диагностикуму соответствующих антигенов происходит их связывание с
активными центрами антител (Fab-фрагментами). В результате такой
коагглютинации образуются хлопья, состоящие из стафилококков, антител
диагностической сыворотки и антигенов исследуемого микроба (рисунок 171).
Рисунок 171 – Схема реакции коагглютинации (Воробьев А.А. и др., 2006).
Реакцию коагглютинации используют для определения вида шигелл. Эту
реакцию можно проводить уже на второй день исследования при наличии на среде с
лактозой лактозонегативных колоний. С этой целью на типичную колонию наносят
каплю суспензии белка А стафилококка, сенсибилизированного антителами против
шигелл. Чашку осторожно покачивают и через 15 минут под микроскопом
наблюдают появление агглютината.
Реакция коагглютинации используется также для идентификации
холерных вибрионов. В этом случае она проводится на стекле с помощью
диагностикумов, коагглютинирующих О1 и О139 холерные вибрионы. Эти
171
диагностикумы представляют собой препараты, содержащие белок А
стафилококков, сенсибилизированный кроличьими О1 и О139 холерными
сыворотками. Холерные антитела, сорбированные на стафилококковом белке, при
соединении с холерными антигенами вызывают реакцию коагглютинации.
9.1.4. Реакция латекс-агглютинации
Реакция агглютинации латекса или реакция латекс-агглютинации (РАЛ или
РЛА) предусматривает использование латексного диагностикума. Латексный
диагностикум представляет собой частицы латекса (полистирола), покрытые
антигенами (латексный антигенный диагностикум) для выявления антител или
антителами (латексный антительный диагностикум) для выявления антигенов.
Частицы латекса, используемые в серологических реакциях, имеют размер 0,79-0,81
мкм. Взвесь таких частиц латекса разводится в соотношении 1:10 боратным или
глициновым буфером (рН 8,2). Приготовленную взвесь “нагружают” антигеном или
антителами в соотношении 1:10 и выдерживают в течение 2 часов при температуре
37ОС.
Частицы латекса, нагруженные антигеном или антителами, используют в
реакции определения неизвестного антигена по известной сыворотке или
неизвестных антител по известному антигену. Реакция латекс-агглютинации
проявляется в течение 2-3 минут. Наступившая реакция латекс-агглютинации
хорошо видна невооруженным глазом особенно на темном фоне или под малым
увеличением микроскопа. При положительной реакции наблюдают образование
фестончатого осадка - “розетки агглютинации”. При отрицательном результате
отмечается образование “пуговки”.
Структура и механизм действия латексных диагностикумов представлены на
рисунке 172.
Частица
латекса
Частица
латекса
Антиген
Антиген
Антитело
Антитело
Патоген
а
б
Рисунок 172 – Структура и механизм действия антигенного (а) и антительного (б)
латексных диагностикумов. Заимствовано и адаптировано из Интернет-ресурсов.
172
Наборы для идентификации и дифференциации бактерий из клинического
материала методом латексной агглютинации выпускаются в жидком или сухом
виде. Сухие наборы предпочтительнее, так как латексный реагент нанесен на
реакционную карточку и лиофилизирован. Такие наборы можно хранить при
температуре плюс 2-25ОС в течение 2 лет.
Механизм взаимодействия антительного латексного диагностикума с
бактериальными антигенами представлен на рисунке 173.
Бактериальные антигены
Антитела к бактериальным
антигенам
Частицы латекса
Рисунок 173 – Механизм взаимодействия антительного латексного диагностикума с
бактериальными антигенами. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Учёт результатов латекс-агглютинации проводят через 10-15 минут при
косом освещении лучше на тёмном фоне. Результат латекс-агглютинации
представлен на рисунке 174.
а
б
Рисунок 174 – Отрицательный (а) и положительный (б) результат реакции латексагглютинации. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Латекс-агглютинация используется для выявления антигенов в небольшом
объеме материала при индикации S. pneumoniae, H. influenzae, N. meningitides в
различных биологических жидкостях (ликвор, сыворотка крови, моча), при
диагностике сальмонеллезов, иерсиниозов и других заболеваний. Разработаны также
наборы для выявления антигенов стрептококков группы А в мазках из зева; для
первичной экспресс-идентификации колоний стрептококков групп А, В, С, F,
энтерококков, золотистого стафилококка, Neisseria gonorrhoeae, кампилобактера,
173
Clostridium difficile, хеликобактера, кишечной палочки, легионелл и других
бактерий (рисунок 175).
Рисунок 175 – Наборы для выявления Staphylococcus aureus и Salmonella spp.
методом латекс-агглютинации. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Чувствительность метода латекс-агглютинации составляет 103-106 клеток в 1
мкл.
9.2. Реакция прямой гемагглютинации
Реакция прямой гемагглютинации представляет собой способность
эритроцитов склеиваться при адсорбции на них определенных антигенов. Так как
это склеивание происходит без участия иммунной сыворотки (антител), реакция
прямой гемагглютинации не является серологической.
К реакциям прямой гемагглютинации относятся реакции определения групп
крови в системе АВ0 и вирусная гемагглютинация.
Самой распространенной реакцией прямой гемагглютинации является
гемагглютинация, применяемая для определения групп крови в системе АВО
(реакция гемагглютинации – РГА). Для определения агглютинации (или её
отсутствия) используют стандартные антисыворотки с анти-А и анти-Вагглютининами. Реакция называется прямой, так как исследуемые антигены
являются естественными компонентами эритроцитов.
Компоненты РГА: исследуемая кровь (антигены), стандартные сыворотки
(антитела) групп Оab(I), Ab(II) и Ba(III). На стекло или планшет наносят по 2 капли
стандартной сыворотки разных групп. Рядом со стандартными сыворотками наносят
по 1 капле исследуемой крови. Встряхиванием перемешивают сыворотку с кровью,
периодически покачивают и через 5 минут учитывают результат:
- нет агглютинации во всех сыворотках - Оab(I) группа крови;
- агглютинация в сыворотках Оab(I) и Ba(III) - Ab(II) группа крови;
- агглютинация в сыворотках Оab(I) и Ab(II) - Ba(III) группа крови;
174
- агглютинация во всех сыворотках – Ab0(IV) группа крови.
Результат РГА при определении групп крови представлен на рисунке 176.
а
б
Рисунок 176 – Результат РГА при определении групп крови: а – отрицательная РГА;
б – положительная РГА. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Общие с прямой гемагглютинацией механизмы имеет вирусная гемагглютинация. Например, вирусы гриппа способны спонтанно агглютинировать
эритроциты птиц и млекопитающих в результате наличия на поверхности вирусных
частиц гемагглютинина. При добавлении таких вирусов к суспензии эритроцитов
наблюдается образование сгустков, состоящих из эритроцитов и вирусных частиц
(рисунок 177).
Эритроциты
Вирусы
Гемагглютинация
Рисунок 177 – Вирусная гемагглютинация. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
9.3. Реакция непрямой гемагглютинации
Реакцию непрямой или пассивной гемагглютинации (РНГА или РПГА) с
танизированными (обработанными танином) эритроцитами проводят в двух
вариантах: с известным антигеном для обнаружения антител и с известными
антителами (сывороткой) для выявления неизвестного антигена. Поэтому в РНГА
используют эритроцитарные диагностикумы: эритроцитарный антигенный
диагностикум (для обнаружения антител) или эритроцитарный антительный
диагностикум (для обнаружения антигенов).
РНГА для обнаружения антител в сыворотке крови проводят с помощью
эритроцитарных антигенных диагностикумов, представляющих собой
фиксированные на эритроцитах антигены возбудителя (рисунок 178).
175
Антигены
Эритроцит
Рисунок 178 – Структура антигенного эритроцитарного диагностикума и схема
РНГА. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
РНГА для обнаружения антигенов в исследуемом материале проводят с
помощью эритроцитарных антительных диагностикумов, представляющих
собой фиксированные на эритроцитах антитела. Такая разновидность РНГА
называется реакцией обратной непрямой гемагглютинации (РОНГА). В
эритроцитарных антительных диагностикумах антитела соединены с эритроцитами
своими Fc-фрагментами (рисунок 179).
Рисунок 179 – Структура антительного эритроцитарного диагностикума и схема
РОНГА. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Приготовление эритроцитарных диагностикумов для РНГА включает следующие этапы:
1 этап - фиксация эритроцитов формальдегидом, глютаровым или акриловым
альдегидами. Такие обработанные эритроциты длительно сохраняются. Для
изготовления диагностикумов используют эритроциты барана, человека, кур и др.
2 этап - обработка фиксированных эритроцитов раствором танина. В
результате этого эритроциты приобретают свойство необратимо адсорбировать на
своей поверхности антигены или антитела.
3 этап - сенсибилизация танизированных эритроцитов антигенами или
антителами.
РНГА может осуществляться в следующих вариантах:
- определение титра антител в сыворотке крови больного с использованием
соответствующего эритроцитарного антигенного диагностикума;
выявление в сыворотке крови больного антигенов возбудителя с
использованием соответствующего эритроцитарного антительного диагностикума.
176
При постановке РНГА для определения титра антител в сыворотке крови
используют агглютинационные пробирки или полистироловые планшеты. С этой
целью к разведениям сыворотки крови больного добавляют эритроцитарный
антигенный диагностикум. При положительной реакции склеенные антителами
эритроциты выпадают на дно в виде фестончатого осадка (“перевернутого
зонтика”). При отрицательной реакции эритроциты оседают на дно в виде плотного
осадка (“пуговки”). Результаты РНГА представлены на рисунке 180.
Рисунок 180 – Результат РНГА в планшетах при установлении титра антител в
сыворотке крови больного. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Отличительные особенности осадка при положительной и отрицательной
РНГА представлены на рисунке 181.
1:20
1:40
1:80 1:160 1:320 1 :640 Контроль
“Зонтик”
“Пуговка”
Рисунок 181 - Особенности осадка при положительной и отрицательной РНГА.
Заимствовано из Интернет-ресурсов.
177
РНГА используется с целью обнаружения ботулинического токсина в
исследуемых пробах, например, в сыворотке крови больного. Возбудитель
ботулизма вырабатывает токсины семи типов, однако чаще других у человека
вызывают поражения токсины типов А, В и Е. Для постановки РНГА используют
сыворотку больного и эритроциты, нагруженные антителами антитоксических
противоботулинических сывороток типов А, В и Е (эритроцитарные антительные
диагностикумы). В качестве контроля используют нормальную сыворотку крови.
Схема РНГА представлена в таблице 21.
Таблица 21 – Постановка РНГА при диагностике ботулизма
Компоненты
Исследуемая сыворотка, мл
Нормальная сыворотка, мл
Диагностикум ботулинический
эритроцитарный антительный:
- тип А
- тип В
- тип Е
Результат
1
0,5
2
0,5
Лунки
3
0,5
0,1
4
5
6
0,5
0,5
0,5
0,1
0,1
-
-
0,1
0,1
+
-
-
0,1
-
В положительном случае эритроциты оседают на дно лунки в виде зонтика,
а при отрицательной реакции эритроциты оседают в виде пуговки. Результаты
реакции представлены на рисунке 182.
1
2
3
4
5
6
Рисунок 182 – Результаты РНГА при установлении типа ботулинического токсина.
Номера лунок соответствуют номерам, представленным в таблице. Положительный
результат в 3 лунке. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
РНГА при диагностике ботулизма исключает использование лабораторных
животных (белых мышей), издавна используемых в установлении типа
ботулинического токсина (реакция нейтрализации токсина в биопробе на
лабораторных животных).
9.4. Реакция торможения гемагглютинации
Реакция торможения гемагглютинации (РТГА) широко используется при
исследовании гемагглютинирующих вирусов. Она основана на том, что некоторые
вирусы (в частности, вирусы гриппа) обладают гемагглютинирующей способностью
за счет наличия у них гемагглютининов. При контакте таких вирусов с
эритроцитами наступает гемагглютинация (рисунок 183).
178
Эритроциты
Вирусы
Гемагглютинация
Рисунок 183 – Реакция гемагглютинации (Воробьев А.А., Быков А.С., 2003).
При наличии в сыворотке крови соответствующих антител гомологичный
вирус (антиген) связывается с этими антителами и утрачивает свою
гемагглютинирующую активность, так как образуется комплекс антиген + антитело.
В результате этого вирусы нейтрализуются антителами и теряют способность
агглютинировать эритроциты. В РТГА эритроциты являются индикатором наличия
вируса в смеси. Агглютинация эритроцитов указывает на наличие в смеси
свободного вируса, а отсутствие гемагглютинации (торможение гемагглютинации) на нейтрализацию вируса антителами (рисунок 184).
Эритроциты
Вирусы
Антивирусные
антитела
Нейтрализация вирусов
антителами,
торможение гемагглютинации
Рисунок 184 – Схема реакции торможения гемагглютинации (Воробьев А.А., Быков
А.С., 2003).
РТГА применяют для диагностики многих вирусных болезней, возбудители
которых могут агглютинировать эритроциты различных животных (вирусы гриппа,
кори, краснухи, клещевого энцефалита).
РТГА ставят в пробирках (макрометод) или в специальных полистироловых
планшетах (микрометод). РГТА позволяет обнаружить и определить титр антител в
сыворотке крови больного с помощью известного вируса или идентифицировать
неизвестный вирус путем постановки реакции с заведомо известными сыворотками
(антителами).
Определение титра антител в сыворотке крови больного с помощью
РТГА. Для постановки реакции используют пластиковые планшеты. В лунках
готовят 2-кратные разведения исследуемой сыворотки в объеме 0,25 мл. Затем в
лунки добавляют по 0,25 мл взвеси вируса и инкубируют 2 часа при температуре
37°С. Затем добавляют по 0,5 мл 1% взвеси эритроцитов, инкубируют еще 2 часа и
оценивают результат по наличию гемагглютинации.
179
При положительной реакции (торможении гемагглютинации) образуется
плотный осадок эритроцитов на дне лунки в виде “пуговки”. Отрицательная реакция
(гемагглютинация) проявляется образованием фестончатого осадка в виде
“зонтика”. Титр антител определяют по последней лунке с положительной РТГА
(рисунок 185).
Разведение сыворотки
1:10
1:20
1:40
1:80
1:160
Рисунок 185 – Определение титра противовирусных антител с помощью РТГА.
Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Идентификация (типирование) вируса с помощью РТГА проводят с
набором типоспецифических сывороток. Результаты реакции учитывают по
отсутствию гемагглютинации.
Достоинства РТГА - простота техники постановки и быстрый результат.
Однако эту реакцию можно использовать только для гемагглютинирующих вирусов.
9.5. Иммуноферментный анализ
Иммуноферментный анализ (ИФА, enzyme-linked immunosorbent assay,
ELISA) представляет собой метод, основанный на специфическом связывании
антигена с антителом. При этом один из компонентов (антиген или антитело)
конъюгирован (связан) с ферментом (так называемый конъюгат). В качестве
маркировочных ферментов используют пероксидазу, щелочную фосфатазу или бетагалактозидазу. При добавлении в реакционную смесь хромогенного субстрата
(вещества, меняющего цвет под влиянием фермента) образуется окрашенный
продукт. В частности, при использовании пероксидазы среда окрашивается в желтокоричневый цвет, а при использовании щелочной фосфатаза – в желто-зеленый
цвет. Интенсивность окраски прямо пропорциональна количеству связавшихся
молекул антигена и антител, что учитывается с помощью фотометра. При работе с
тест-системами ИФА кроме фотометра используются термостат-встряхиватель
(шейкер) и автоматический промыватель планшетов (вошер). Оборудование,
используемое в ИФА, представлено на рисунке 186.
180
а
б
в
Рисунок 186 – Оборудование для ИФА: шейкер (а), вошер (б) и фотометр (в).
Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Для осуществления этого анализа коммерческие фирмы выпускают наборы, в
которых предварительно на твердом носителе (лунки пластикового планшета)
сорбируют антигены (для выявления антител) или антитела (для выявления
антигенов). Затем в лабораторных условиях в лунки добавляют остальные
ингредиенты (сыворотку или антиген, конъюгат, субстрат). В положительном
случае антитела соединяются с антигенами, ферменты разлагают субстрат и
проявляются окрашенные продукты реакции (рисунок 187).
Методика постановки ИФА для определения антител. Исследуемый
материал (сыворотка крови) вносят в лунки планшета, содержащие фиксированный
антиген. Если в сыворотке присутствуют антитела к фиксированному на дне лунок
антигену, после непродолжительной инкубации происходит их связывание. Затем
лунки промывают буферным раствором, чтобы убрать несвязанные антитела, и
добавляют конъюгат (антииммуноглобулины, меченные ферментом). При этом
антииммуноглобулины связываются с искомыми иммуноглобулинами из
исследуемой сыворотки (если таковые имелись, если нет – реакция дальше не
протекает). Промывают лунки, чтобы убрать несвязанные антииммуноглобулины, и
добавляют субстрат. После инкубирования учитывают результаты. Под действием
фермента,
конъюгированного
на
антииммуноглобулинах,
происходит
преобразование субстрата в цветной продукт, что сопровождается изменением
окраски индикатора.
181
+ сыворотка крови больного
+ сыворотка больного
+ диагностическая сыворотка
против антигена
+ меченая сыворотка против
Ig человека (конъюгат)
+ меченые антитела против
диагностической сыворотки
+ субстрат
+ субстрат
а
б
Рисунок 187 – Схема ИФА: а - определение антител; б – определение антигенов.
Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Результаты ИФА регистрируются фотометрическим, флуориметрическим,
биолюминесцентным и хемилюминесцентным методами.
ИФА отличается высокой чувствительностью (достаточно присутствия
антигена в концентрации 1 нг/мл). К настоящему времени созданы многочисленные
модификации базовой методики. Наибольшее распространение получил
гетерогенный ИФА на твёрдой фазе (твердофазный ИФА). Для этого коммерческие моноклональные антитела или антиген фиксируют в лунках пластиковых
панелей, куда затем вносят исследуемый материал (содержащий соответственно
антигены или антитела). В крупных диагностических лабораториях применяют
полностью автоматизированные установки (ридеры) для проведения твердофазного
ИФА, позволяющие анализировать от 1000 до 4000 проб ежедневно.
На практике ИФА широко применяют для выявления антигенов Chlamydia
trachomatis в мазках из мочеиспускательного канала и влагалища, стрептококков
группы А в мазках из зева и токсина Clostridium difficile в фекалиях. Метод
позволяет не только выявлять антитела, но и определять их принадлежность к
различным классам иммуноглобулинов, например, выявлять IgM к антигенам
Mycoplasma pneumoniae.
Буферные растворы для проведения ИФА.
Буфер сенсибилизации - 0,05 М натриево-карбонатно-бикарбонатный буфер
(рН 9,5-9,7) для сорбции антигенов или антител на твердом носителе. Состав
буфера: 1,18 г Na2CO3; 3,47 г NaНСО3; 200 мг NaNO3. Объем буфера доводят до 1 л
дистиллированной водой. Возможно использование фосфатного буфера (буфера
инкубации).
Буфер инкубации - фосфатно-солевой раствор (рН 7,3-7,5), который
используют для разведения компонентов, вводимых в реакцию после сорбции
182
первого компонента на носителе. Состав буфера: 17,9 г Na2НРО4·12Н2О; 0,8 г
NaН2РО4·2Н2О; 42,5 г NaCl; 2,5 мл твина-20. Объем буфера доводят до 5 л
дистиллированной водой, хранят при 20-25°С.
Буфер для отмывания компонентов реакции – изотонический раствор
хлорида натрия, содержащий 0,05% твина-20. В качестве отмывочного буфера
можно также использовать фосфатно-солевой раствор с 0,05% твина-20.
Ортофенилендиамин готовят ex tempore следующим образом: 10 мг
ортофенилендиамина, 6,1 мл 0,1 М лимонной кислоты, 6,4 мл 0,2 М Na2НРО4·12Н2О
(для полного растворения подогреть на водяной бане), 12,5 мл дистиллированной
воды, 0,35 мл 3% Н2О2. Растворяют 80 мг 5-аминосалициловой кислоты в 100 мл
дистиллированной воды, доводят рН раствора до 6,0 ex tempore с помощью 1 М
NaОН. Перед использованием на каждые 9 мл раствора добавляют 1 мл 0,05%
перекиси водорода.
Методика проведения ИФА в лунках планшета. Первый этап ИФА сорбция соответствующего разведения антител или антигенов (в концентрации 1020 мкг/мл) в карбонатно-бикарбонатном буфере (в объеме 0,1 мл) на твердую фазу в
течение 1-2 часов при температуре 37°С и 10-12 часов при 4°С (сенсибилизация).
Затем отмывают лунки (для удаления несорбированных на носителе антител или
антигенов) водопроводной водой, отмывочным буфером с 0,05% твина-20 в течение
5 минут (два раза) при комнатной температуре. После этого вносят в каждую лунку
(твердую фазу) по 0,1 мл 1% раствора бычьего сывороточного альбумина на
карбонатно-бикарбонатном буфере и инкубируют в течение 1 часа при температуре
37°С для закрытия участков поверхности лунок, оставшихся свободными после
сенсибилизации. Лунку отмывают от несвязанного бычьего сывороточного
альбумина и вносят исследуемый материал (антигены или антитела) по 0,1 мл в
разведениях на фосфатно-солевом растворе (рН 7,2) с 0,05% твина-20. Каждое
разведение материала вводят в две лунки, и планшеты помещают в термостат на 1-3
часа при температуре 37°С. Непрореагировавшие в иммунной реакции антигены или
антитела отмывают и в лунки вносят по 0,1 мл конъюгированных антител против
исследуемого антигена или антитела в рабочем разведении на фосфатно-солевом
растворе с 0,05% твина-20. Затем планшеты инкубируют в течение 2 часов при
37OС. Несвязавшийся конъюгат трижды отмывают буфером.
В лунку вносят 0,1 мл смеси растворов субстрата и хромогена и выдерживают
30 минут в темноте при комнатной температуре. В процессе инкубации пероксидаза
разрушает субстрат (Н2О2) с образованием активного кислорода, который окисляет
хромоген. В результате хромоген меняет цвет: ортофенилендиамин окрашивается в
желтый цвет, а аминосалициловая кислота - в коричневый.
Для остановки реакции расщепления субстрата в лунку добавляют по 0,1 мл
1N H2SO4 (или 1М NaОН).
Контроль реакции - исследуемые антигены или антитела заменяют
гомологичным компонентом реакции.
Контроль конъюгата - 0,1 мл 1% бычьего сывороточного альбумина на
карбонатно-бикарбонатном буфере + 0,1 мл конъюгированных антител в рабочем
разведении.
При визуальном учете выявляют то наибольшее разведение исследуемого
материала, в котором окраска интенсивнее, чем в контроле (с бычьим
183
сывороточным альбумином). При учете результатов реакции с помощью
фотоэлектроколориметра положительным считается то наибольшее разведение
исследуемого материала, где уровень экстинкции не менее чем в 2 раза превышает
уровень экстинкции соответствующего разведения гетерологичного компонента
реакции.
Для получения антител, конъюгированных ферментом, необходимы высокоактивные преципитирующие сыворотки против антигенов или против
глобулинов животных или человека, из которых выделяют гамма-глобулиновую
фракцию. Иммуноглобулины конъюгируют с ферментом при помощи
глютаральдегида. Несвязанный фермент удаляют диализом или хроматографией на
сефадексе. Для предупреждения микробной деградации в конъюгаты вносят
мертиолят до 0,01% и хранят при 4°С в замороженном или лиофильно высушенном
состоянии.
Принципы иммуноферментного анализа используются для дифференциации
инфицированности организма микобактериями и инфекционного туберкулезного
процесса, начиная со стадии латентной туберкулезной инфекции. Указанная
технология иммунодиагностики туберкулеза была разработана в начале 2000-х
годов. Эта технология получила название “тест высвобождения гаммаинтерферона” – Interferon-gamma release assays (IGRA). Суть этого теста
заключается в том, что в организме, в котором идет инфекционный процесс,
вызванный Mycobacterium tuberculosis, Т-лимфоциты под воздействием
микобактериальных антигенов, специфичных именно для этого возбудителя,
начинают выделять гамма-интерферон (INF-γ). В организме, где туберкулезного
процесса нет, такой реакции не будет. Следовательно, “тест высвобождения гаммаинтерферона” не позволяет установить факт инфицированности, а выявляет только
наличие активной инфекции, начиная со стадии латентной туберкулезной инфекции,
не затрагивая стадию инфицирования.
Для проведения IGRA-теста берут кровь пациента, выделяют лимфоциты,
добавляют к ним микобактериальные антигены и определяют выделение Тлимфоцитами гамма-интерферона. Для активации Т-лимфоцитов используют смесь
2 или 3 выборочных антигенов микобактерий, не встречающихся в вакцинном
штамме БЦЖ и отсутствующих у нетуберкулезных микобактерий. Эти антигены
присутствуют только у возбудителя туберкулеза человека (Mycobacterium
tuberculosis) и у микобактерий “туберкулезного комплекса” (M. bovis, M. africanum,
M. microti, M. canetti).
В России доступны 2 вида IGRA-тестов: QuantiFERON и T-SPOT.TB. Эти
тесты различаются методикой учета результатов. QuantiFERON-тест определяет
количество (концентрацию) гамма-интерферона в исследуемом образце. TSPOT.ТВ-тест проводит подсчет количества клеток, выделяющих гаммаинтерферон. Подсчет ведут по окрасившимся “отпечаткам” лимфоцитов на дне
лунки, где проводилась инкубация.
QuantiFERON-TB Gold Plus (QFT-Plus-тест) зарегистрирован в РФ в 2010
г. QFT-Plus-тест выявляет клеточный иммунный ответ на пептидные антигены,
симулирующие микобактериальные протеины. Антигены, используемые в QFTPlus-тесте, представляют собой пептидную смесь протеинов ESAT-6 и CFP-10. Эти
184
антигены стимулируют образование гамма-интерферона в Т-клетках лиц,
инфицированных M. tuberculosis и микобактериями “туберкулезного комплекса”.
В состав QFT-Plus-теста входят 2 пробирки ТВ1 и ТВ2. Пробирка ТВ1
содержит пептиды ESAT-6 и CFP-10, стимулирующие CD4-лимфоциты. Пробирка
ТВ2 содержит дополнительные пептиды, стимулирующие CD8-лимфоциты (ЦТЛ).
Забор крови производят в четыре специальные пробирки: две пробирки
содержат микобактериальные антигены, одна пробирка является нулевым
контролем и одна пробирка включает митоген – положительный контроль (рисунок
188).
Рисунок 188 – Тест-система QuantiFERON. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
После забора крови (по 1 мл в каждую пробирку) пробирки тщательно
перемешивают и инкубируют при температуре 37ОС в течение 16-24 часов. Затем
пробирки центрифугируют в течение 15 минут при 2000-3000 q, осторожно
отбирают плазму крови и исследуют ее на наличие гамма-интерферона.
Обнаружение гамма-интерферона (в МЕ/мл) в квантифероновом тесте проводится
по методике твердофазного гетерогенного иммуноферментного анализа в 96луночном планшете. Для этого в лунки вносят образцы исследуемой плазмы и
конъюгат, тщательно перемешивают на шейкере в течение 1 минуты и инкубируют
при комнатной температуре в течение 120 минут. После этого каждую лунку
промывают не менее 6 раз буферным раствором с использованием автоматической
мойки для планшетов. Затем в каждую лунку вносят раствор ферментного
субстрата, перемешивают на шейкере и инкубируют при комнатной температуре в
течение 30 минут. После инкубации в лунки добавляют стоп-реагент, перемешивают
и измеряют оптическую плотность в каждой лунке планшета с помощью
считывающего устройства для микропланшетов (рисунок 189).
185
Рисунок 189 – Квантиферроновый тест, ИФА. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Положительный результат – INF-γ-ответ в пробирке с микобактериальным
антигеном значительно превышает ответ в нулевой контрольной пробирке.
Сомнительный результат – слабый ответ на митоген (<0,5 МЕ/мл) при
отрицательном ответе на антиген. Интерпретация результатов проводится с
помощью рекомендуемого программного обеспечения.
T-SPOT.TB (Т-спот, иммунологический тест на туберкулез) зарегистрирован
в РФ в 2012 г. Иммунологический тест на туберкулез представляет собой
исследование
иммунного
Т-клеточно-опосредованного
ответа,
то
есть
количественное определение в крови эффекторных Т-клеток (CD4 и CD8),
вырабатывающих гамма-интерферон, который продуцируется в ответ на
стимуляцию микобактериальными антигенами ESAT-6 и CFP-10. Этот тест является
упрощенным вариантом иммуноферментного метода, в котором продуцируемый
гамма-интерферон связывается с соответствующими антителами рядом с
секретирующей его клеткой еще до захвата рецепторами соседних клеток или
разрушения. В состав набора входят следующие компоненты:
- микротитровальный планшет (в рамке 12 стрипов по 8 лунок в каждом), на
котором сорбированы мышиные поликлональные антитела к гамма-интеферону
человека (IFN-y);
- антиген ESAT-6;
- антиген CFP-10;
- положительный контрольный образец (положительный контроль) фитогемагглютинин (ФГА) для контроля функциональных свойств клеток;
- коньюгат: мышиные моноклональные антитела к гамма-интерферону,
конъюгированные со щелочной фосфатазой;
186
- субстрат: раствор 5-бромо-4-хлоро-3-индол-фосфата с нитротетразолиумом синим.
Диагностический набор для T-SPOT.TB – теста представлен на рисунке 190.
Рисунок 190 – Диагностический набор для тест-системы T-SPOT.TB. Заимствовано
из Интернет-ресурсов.
Забор крови производят в пробирки для забора крови, рекомендуемые
инструкцией. В лаборатории из крови получают мононуклеарные клетки методом,
описанным в инструкции к тесту (промывание и центрифугирование в среде для
выделения мононуклеаров). Затем подсчитывают в суспензии количество
мононуклеарных клеток и готовят клеточную суспензию с концентрацией 2,5х105
клеток/100 мкл. Мононуклеарные клетки инкубируют с микобактериальными
антигенами ESAT-6, CFP-10 для стимуляции имеющихся сенсибилизированных Тклеток. Секретированный этими клетками гамма-интерферон связывается и
удерживается специфическими антителами, находящимися на поверхности
мембраны, выстилающей лунку, остальные клетки удаляются при промывании.
Затем в лунки добавляются специфические антитела, конъюгированные с щелочной
фосфатазой (конъюгат). Несвязавшийся конъюгат удаляется при промывании. После
этого в каждую лунку добавляется субстрат, который расщепляется связанным
ферментом. В месте реакции образуется пятно нерастворимого преципитата,
соответствующее одной Т-клетке, секретирующей гамма-интерферон. Количество
образующихся пятен является количественной характеристикой содержания
сенсибилизированных микобактериями Т-клеток.
Принцип T-SPOT.TB-теста представлен на рисунке 191.
187
Внесение в лунки Т-клеток и антигенов.
Т-клетки высвобождают интерферон.
Добавление конъюгированных с
ферментом антител к
интерферону
Интерферон захватывается
антителами
Добавление субстрата, оценка
результатов по количеству пятен
Рисунок 191 – Принцип T-SPOT.TB-теста. Заимствовано и адаптировано из
Интернет-ресурсов.
Интерпретация результатов: отрицательный результат – менее или равный 4,
пограничный – от 5 до 7, положительный – более или равный 8.
Сравнительные характеристики указанных тестов представлены в таблице 22.
Таблица 22 – Сравнительные характеристики тестов T-SPOT.TB и QuantiFERON
Характеристики
Исследуемый образец
Детекция
Обработка крови
Антигены
Тип клеток
Срок годности вскрытых
реактивов
T-SPOT.TB
Изолированные и
очищенные мононуклеары
(4 мл крови). Требуется
строго определенное
количество клеток на
лунку
Число Т-клеток,
продуцирующих гаммаинтерферон
В течение 8 часов после
взятия крови
ESAT-6, CFP 10
CD4, CD8
8 недель при 2-8ОС
QuantiFERON
2-3 мл цельной крови
Концентрация гаммаинтерферона,
секретируемого Тклетками
В течение 16 часов после
взятия крови
ESAT-6, CFP 10, TB 7,7
CD4
12 недель при 2-8ОС
188
9.6. Иммуноблоттинг
Иммуноблоттинг (ИБ, вестернблоттинг, англ. blot – пятно) представляет
собой высокочувствительный метод выявления белков, основанный на сочетании
электрофореза и ИФА. Для осуществления этого метода предварительно готовятся
стрипы, представляющие собой полоски нитроцеллюлозной мембраны с
нанесенными белками (антигенами). Для получения стрипов антигены возбудителя
разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят их
из геля на нитроцеллюлозную мембрану, которую разрезают на полоски (стрипы). В
лаборатории обработку стрипов проводят как в ИФА: на полоски наносят сыворотку
больного,
затем
несвязавшиеся
антитела
отмывают
и
наносят
антииммуноглобулиновую
сыворотку,
меченую
ферментом
(конъюгат).
Образовавшийся комплекс (антиген + антитело больного + антитело против
иммуноглобулина человека) выявляют с помощью хромогенного субстрата,
изменяющего окраску под влиянием фермента. При наличии комплекса антигенантитело-антисыворотка к иммуноглобулинам на стрипе появляются окрашенные
зоны (рисунок 192).
Рисунок 192 – Схема иммуноблоттинга (Воробьев А.А., Быков А.С., 2003 г.).
9.7. Реакция иммунофлюоресценции
Реакция иммунофлюоресценции (РИФ, метод флюоресцирующих антител,
МФА) основана на применении антител, меченных флуорохромными красителями
(чаще всего флуоресцеина изотиоцианатом). Такие антитела, связываясь с
соответствующим антигеном, вызывают свечение иммунных комплексов в УФлучах люминесцентного микроскопа. Имеющиеся в настоящее время
автоматизированные технологии позволяют анализировать в одном образце около
189
50 различных антигенов с использованием набора различных флуоресцентных
маркеров. Иммунофлуоресцентный анализ позволяет выявлять как антигены, так и
антитела.
Существует 3 модификации иммунофлуоресцентного анализа:
- метод прямой иммунофлуоресценции применяют для выявления
антигенов, сорбированных на твердой подложке, с помощью меченых антител.
Реакция оценивается с помощью флуоресцентного микроскопа;
- метод непрямой иммунофлуоресценции позволяет выявлять немеченые
антитела к известному антигену, сорбированному на твердой подложке. Комплексы
антигена с антителом в этом случае выявляются с помощью меченых антител к
иммуноглобулинам;
- метод конкурентной иммунофлуоресценции основан на связывании
антител, сорбированных на твердой подложке, с меченым стандартным антигеном и
немеченым антигеном, присутствующим в пробе. Так как меченый и немеченый
антигены конкурируют за связывание с антителами, то по количеству связанного
меченого антигена можно определить концентрацию антигена в пробе.
Наиболее
часто
используют
методы
прямой
и
непрямой
иммунофлуоресценции.
Прямая
РИФ
предусматривает
использование
коммерческих
диагностических сывороток, содержащих антитела, меченые флюорохромами. На
исследуемый препарат или в суспензию клеток вносят раствор меченых
флюоресцентным красителем антител. Меченые антитела взаимодействуют с
антигенами микроорганизмов с образованием комплексов, которые дают свечение в
УФ-лучах люминесцентного микроскопа (рисунок 193).
РИ
Бактерия
Флюорохром
Рисунок 193 – Схема прямой РИФ. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Прямая РИФ
Непрямая РИФ
Прямая РИФ используется в диагностике многих бактериальных инфекций:
коклюша, псевдотуберкулеза, чумы и др. (рисунок 194).
190
а
б
Рисунок 194 – Прямая РИФ в диагностике сифилиса (а) и риккетсиозов (б).
Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Непрямая РИФ предусматривает использование 2 видов антител: кроличьи
антитела к антигенам бактерий и антиглобулиновые антитела к иммуноглобулинам
кролика. Антиглобулиновые антитела мечены флюорохромами. Непрямая РИФ
ставится в два этапа. Вначале на препарат к бактериям добавляются кроличьи
антитела, а затем – меченые антиглобулиновые антитела. Комплекс антигенантитело дает флюоресцентное окрашивание только после связывания двух антител
между собой. Положительная реакция также оценивается по интенсивности
свечения (рисунок 195).
РИФ
• Меченые а
вступают в
взаимодейс
строго
определенн
Рисунок 195 – Схема непрямой РИФ. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Прямая РИФ
Непрямая РИФ
корпускул
Использование биоинженерных иммуноглобулинов и высокая
степень
очистки антител позволили практически свести на нет неспецифические реакции,
антигенам
что сделало возможным дальнейшее технологическое развитие
метода
иммунофлюоресценции.
(клетками
возбудител
Бактерия
Флюорохром
Shigella flexneri: а – окраска по Граму, б – прямая РИФ
191
9.8. Реакция преципитации и ее варианты
Реакции преципитации (лат. praecipito – осаждать) основаны на феномене
образования видимого осадка (преципитата) в растворе или в виде полос
преципитации в геле после взаимодействия растворимых антигенов
(преципитиногенов) со специфическими антителами (преципитинами). Реакции
преципитации проводят в пробирках, в агаре, в гелях. Гелевой основой служат агар,
агароза, карбоксиметилцеллюлоза и другие соединения. В качестве реагентов в
реакциях преципитации используют гипериммунные преципитирующие сыворотки
с высокими титрами антител к гомологичным антигенам.
Выделяют следующие наиболее распространенные разновидности реакции
преципитации:
- реакция кольцепреципитации;
- реакции преципитации в геле (реакция простой иммунодиффузии, реакция
радиальной иммунодиффузии по Манчини и реакция встречной иммунодиффузии
по Оухтерлони);
- иммуноэлектрофорез;
- реакция флоккуляции.
9.8.1. Реакция кольцепреципитации
Реакцию
кольцепреципитации
проводят
в
специальных
узких
преципитационных пробирках (диаметр 0,4-0,5 см, высота 7-8 см). В пробирку
вносят 0,2-0,3 мл преципитирующей сыворотки. Затем на слой сыворотки
осторожно по стенке пробирки в наклонном положении наслаивают такое же
количество жидкости, содержащей растворимый антиген. После этого пробирку
осторожно ставят вертикально в штатив. Через несколько секунд наблюдают
образование белого кольца преципитата (рисунок 196).
Рисунок 196 – Схема постановки и результат реакции кольцепреципитации.
Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Разновидностью
реакции
кольцепреципитации
является
реакция
термопреципитации Асколи на антигены возбудителя сибирской язвы. Реакция
Асколи позволяет обнаруживать антигены возбудителя сибирской язвы,
192
экстрагированные кипячением из различного сельскохозяйственного сырья и
объектов внешней среды (органы животных, шкуры, шерсть, войлок, мясо, почва и
др.). Для постановки этой реакции готовят экстракт антигена из исследуемого
материала: исследуемый материал кипятят в изотоническом растворе хлорида
натрия в соотношении 1:10 в течение 5-10 минут или экстрагируют антиген
карболовой или уксусной кислотой. Экстракт фильтруют через бумажный фильтр
или асбестовую вату или центрифугируют при 1000-3000 об/мин. В узкую пробирку
для
преципитации
вносят
0,2-0,3
мл
иммунной
преципитирующей
противосибиреязвенной сыворотки и осторожно наслаивают на нее 0,2-0,3 мл
испытуемого экстракта. В течение 10 минут на границе между сывороткой и
экстрактом в положительных случаях появляется кольцо помутнения
(кольцепреципитация).
Реакция кольцепреципитации также позволяет выявлять антитела к
возбудителю бруцеллеза в молоке животных (кольцевая проба Банга). Сущность
кольцевой пробы Банга состоит в том, что при наличии в молоке специфических
антител происходит их связывание с окрашенным бруцеллезным антигеном и
образование окрашенного кольца. При постановке этой пробы в пробирку с 2 мл
молоком вносят 0,1 мл антигена (взвесь убитых бруцелл, окрашенных
гематоксилином). Смесь энергично встряхивают и выдерживают при температуре
37-38ОС в течение 1 часа. При наличии в молоке специфических антител происходит
связывание бактерий с антителами и образование темно-синего кольца в верхнем
слое сливок. При отсутствии антител молоко гомогенно окрашивается в синий цвет,
а слой сливок остается белым или слегка желтоватым (рисунок 197).
Рисунок 197 – Положительная (три пробирки слева) и отрицательная (три пробирки
справа) кольцевая проба Банга на присутствие бруцелл в молоке. Заимствовано из
Интернет-ресурсов.
Кольцевая проба Банга используется для проверки благополучия стада по
бруцеллезу крупного рогатого скота и при исследовании молока на наличие
бруцелл. Необходимо учитывать, что молоко вакцинированных коров также дает
положительную пробу Банга.
193
9.8.2. Реакции преципитации в геле
Реакции преципитации в геле основаны на том, что антигены и антитела,
встречаясь в геле, образуют видимые невооруженным глазом белые линии
преципитата. Для приготовления геля используют агар или агарозу в количестве 1,52,0%.
Различают следующие разновидности реакций преципитации в геле:
- реакция простой иммунодиффузии;
- реакция радиальной иммунодиффузии по Манчини;
- реакция встречной иммунодиффузии по Оухтерлони.
Реакция простой иммунодиффузии (реакция диффузионной преципитации)
используется в диагностике дифтерии. При диагностике дифтерии все изоляты
возбудителя необходимо тестировать на способность продуцировать дифтерийный
экзотоксин. Для этого используют реакцию преципитации в агаре (тест Илека или
Элека). При проведении этой реакции на поверхность агара в чашке Петри
помещают полоску фильтровальной бумаги, пропитанной антитоксической
дифтерийной сывороткой. Вдоль полоски производят посевы исследуемых культур
в виде макроколоний (бляшек). Между бляшками исследуемых культур высевают
контрольный (лабораторный) заведомо токсигенный штамм возбудителя дифтерии.
Через 24-48 часов инкубирования при температуре 37ОС между бляшками и
полоской фильтровальной бумаги, пропитанной антитоксической сывороткой,
образуются тонкие линии преципитации, свидетельствующие о продуцировании
данной культурой дифтерийного экзотоксина (рисунок 198).
Рисунок 198 – Определение токсигенности C. diphtheriae in vitro методом
иммунодиффузии. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Реакция радиальной иммунодиффузии по Манчини осуществляется
следующим образом. Иммунную сыворотку смешивают с расплавленным агаровым
гелем и наливают тонким слоем на стеклянную пластину или в чашку Петри. После
застывания в геле делают лунки, в которые вносят антиген в разных разведениях.
Антиген диффундирует в гель и формирует с антителами кольцевые зоны
преципитации вокруг лунок. Диаметр кольца преципитации пропорционален
концентрации антигена (рисунок 199).
194
Рисунок 199 – Схема реакции радиальной иммунодиффузии по Манчини.
Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Реакцию радиальной иммунодиффузии по Манчини используют для
определения в сыворотках крови иммуноглобулинов разных классов, компонентов
комплемента.
Диаметр кольца преципитации прямо пропорционален количеству
внесенного в лунки антигена. Количество антител устанавливают по калибровочной
кривой.
Реакция встречной иммунодиффузии по Оухтерлони проводится на
стеклянной пластинке. Для этого на пластинку наливают тонкий слой агарового геля
и после застывания вырезают лунки. В одни лунки геля вносят антигены, а в другие
лунки – иммунные сыворотки. Антигены и антитела диффундируют навстречу друг
другу и в месте встречи образуют преципитат в виде белой полосы. У идентичных
антигенов линии преципитата сливаются, а у неидентичных антигенов линии
преципитации пересекаются (рисунок 200).
Идентичные
Неидентичные
Частично
идентичные
Антигены
Антитела
Рисунок 200 – Схема реакции встречной иммунодиффузии по Оухтерлони.
Заимствовано из Интернет-ресурсов.
195
9.9. Реакция нейтрализации токсина антитоксином с биопробой на
белых мышах
Реакция нейтрализации токсина антитоксином с биопробой на белых
мышах предназначалась для выявления ботулинического и столбнячного токсинов.
Однако в настоящее время эти реакции в лабораторной клинической практике не
используются. Вместо реакции нейтрализации токсина антитоксином с биопробой
на белых мышах используют РНГА (см. раздел 9.3).
Для обнаружения ботулинических токсинов для каждой исследуемой пробы
используют 4 белых мышей. Первое животное подкожно заражают только
исследуемым материалом, а остальных мышей - смесью исследуемого материала с
200 МЕ антитоксической ботулинической диагностической сыворотки типов А, В и
Е. Предварительно смеси выдерживают при комнатной температуре в течение 40
минут дня нейтрализации токсина антитоксином. Наблюдение за животными
проводят в течение 4 дней. При наличии в материале токсина в течение 4-5 часов
погибают все животные, кроме той мыши, которой была введена смесь токсина и
гомологичной антитоксической сыворотки (рисунок 201).
Смеси исследуемого материала
с антитоксическими сыворотками
Рисунок 201 – Схема постановки биопробы на белых мышах при диагностике
ботулизма. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
При введении материала, содержащего ботулинический токсин, у мышей
отмечается учащенное дыхание, полное расслабление мышц, развивается типичный
симптом поражения - “осиная талия” и вытянутое в линию тело и хвост животного
(рисунок 202).
196
Рисунок 202 – Внешнее проявление действия ботулинического токсина на белых
мышей. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Для обнаружения столбнячного токсина также использовалась реакция
биологической нейтрализации (РБН) на белых мышах. В настоящее время эта
реакция не используется в клинических лабораториях. Для нейтрализации
столбнячного токсина использовали специфическую антитоксическую сыворотку.
Подкожное введение мышам фильтрата исследуемого материала при наличии
столбнячного токсина наблюдается спазм мышц и искривление тела в сторону места
введения токсина (рисунок 203).
Рисунок 203 – Биологическая проба на белых мышах при столбняке. Заимствовано
из Интернет-ресурсов.
В настоящее время для обнаружения и идентификации ботулинического
токсина используют РПГА с эритроцитарными иммуноглобулиновыми
диагностикумами моноспецифическими типов А, В и Е или с диагностикумом
ботулиническим эритроцитарным иммуноглобулиновым поливалентным типов А, В
и Е. Иммуноглобулиновый (антительный) диагностикум представляет собой
эритроциты, сенсибилизированные ботулиническим антитоксином (антитела против
ботулинического токсина) соответствующего типа.
Для обнаружения столбнячного токсина также разработаны серологические
реакции: реакция непрямой гемагглютинации (РНГА), иммуноферментный анализ
(ИФА), реакция латекс-агглютинации и реакция коагглютинации.
197
9.10. Реакция связывания комплемента
Реакция связывания комплемента (РСК) предложена Ж. Борде и О. Жангу.
Реакция включает две фазы.
В первой фазе (специфической) искомый антиген (или антитело) реагирует с
диагностической антисывороткой (или антигенным диагностикумом). При
соответствии
антигена
и
антитела
образуется
иммунный
комплекс
“антиген+антитело”. Этот комплекс через Fc-фрагмент антител связывается с
комплементом. В случае несоответствия антигена и антитела иммунного комплекса
не образуется, и комплемент остается свободным.
Во второй фазе (индикаторной) определяют наличие или отсутствие
свободного комплемента путем внесения в реакционную смесь так называемой
“гемолитической системы” (эритроцитов барана с антителами к этим эритроцитам).
При наличии в смеси свободного комплемента он соединяется с “гемолитической
системой” (комплексом “эритроциты+антитела к ним”) и вызывает гемолиз
эритроцитов (феномен “лаковой крови”). Такую реакцию считают отрицательной,
она характерна для здорового человека (рисунок 204).
Рисунок 204 – Отрицательная РСК (Воробьев А.А., Быков А.С., 2003).
При отсутствии в смеси свободного комплемента разрушения эритроцитов
(гемолиза) не наблюдается, эритроциты оседают на дно пробирки в виде осадка.
Такую реакцию считают положительной (рисунок 205).
198
Рисунок 205 – Положительная РСК (Воробьев А.А., Быков А.С., 2003).
В РСК используются следующие компоненты:
- испытуемая сыворотка, инактивированная прогреванием при температуре
О
56 С в течение 30 минут;
- антиген (взвесь убитых микробов, лизат микробов, полные антигены,
гаптены, экстракты тканевых липидов);
- комплемент (свежая или высушенная сыворотка крови морских свинок;
перед постановкой РСК проводят титрование комплемента в реакции гемолиза и
определение рабочей дозы);
- гемолитическая сыворотка (прогретая при температуре 56ОС сыворотка
крови кроликов, иммунизированных 50% взвесью эритроцитов барана);
- 3% взвесь эритроцитов барана;
- физиологический раствор;
- контрольная сыворотка.
Основными недостатками РСК является сложность проведения и лабильность
некоторых компонентов. Однако РСК до сих пор применяют в диагностике
некоторых заболеваний, в частности, при диагностике сифилиса (реакция
Вассермана), хронической гонореи (реакция Борде-Жангу), при идентификации
бактерий.
Реакция Вассермана (RW) основана на способности сыворотки крови
больного сифилисом человека (в отличие от сыворотки крови здоровых лиц)
образовывать со специфическими антигенами (трепонемным и кардиолипиновым
антигенами) комплекс, связывающий комплемент. При постановке РСК с
трепонемным антигеном (РСКт) используется озвученный ультразвуком антиген,
полученный из нескольких штаммов бледной трепонемы. При постановке РСК с
кардиолипиновым антигеном (РСКк) применяют антиген, представляющий собой
высокоочищенный спиртовой экстракт из мышц бычьего сердца.
Реакция Вассермана оценивается по степени задержки гемолиза.
Положительная реакция отмечается при частичной, выраженной и полной задержке
гемолиза. Положительная реакция определяется по степени окрашивания
содержимого пробирок от светло-розового до ярко-красного. Негемолизированные
эритроциты впоследствии образуют осадок красного цвета (рисунок 206).
199
а
б
в
г
д
Рисунок 206 – Оценка реакции Вассермана: а – полная задержка гемолиза (++++); б
– выраженная задержка гемолиза (+++); в – частичная задержка гемолиза (++); г –
слабая задержка гемолиза (+); д – полный гемолиз (-). Заимствовано из Интернетресурсов.
Реакция Вассермана может быть отрицательной в первичном серонегативном
и вторичном рецидивном сифилисе, а также ложноположительной при токсикозах
беременных, при злокачественных новообразованиях.
В настоящее время при диагностике сифилиса используется реакция
связывания комплемента с кардиолипиновым антигеном (РСКк).
Реакция Борде-Жангу используется для диагностики хронической гонореи
с целью обнаружения антител к гонококку. В реакции используются две системы:
основная система – сыворотка крови пациента, антиген (взвесь убитых гонококков)
и комплемент (сыворотка крови морской свинки); вспомогательная система
(индикаторная или гемолитическая) – эритроциты барана и гемолитическая
сыворотка (сыворотка кроликов, иммунизированных эритроцитами барана).
Вначале в 2 пробирки вносят испытуемую сыворотку. Затем в одну из них
добавляют антиген, а в другую – физиологический раствор. После этого в обе
пробирки добавляют комплемент. Компоненты реакции смешивают, и пробирки
помещают в термостат при температуре 37ОС на 30 минут (либо в холодильник при
температуре минус 4ОС на 18 часов). Затем в пробирки добавляют гемолитическую
систему, и пробирки помещают в термостат на 2 часа. Предварительный результат
учитывают по истечении времени инкубирования в термостате. Окончательный
результат учитываю на следующий день после выдерживания пробирок при
комнатной температуре. Степень интенсивности реакции оценивается в плюсах:
полная задержка гемолиза – 4 плюса, неполная – три плюса, два плюса, один плюс,
полный гемолиз обозначается минусом.
Реакцию Борде-Жангу становится положительной с 3-4 недели заболевания.
При острой форме болезни она положительна у 35% больных, при хронической
форме - у 65% (слабоположительная у 100%). В качестве антигена для РСК
применяют гоновакцину или антиген из убитых гонококков. Однако реакция БордеЖангу имеет вспомогательное значение, она непригодна для доказательства
гонококковой инфекции и установления излеченности. Поэтому в последние годы
эта реакция используется крайне редко.
200
9.11. Иммунохроматографический анализ
Иммунохроматографический
анализ
(ИХА) представляет
собой
иммунохимический метод, основанный на принципе тонкослойной хроматографии и
включающий реакцию между антигеном и соответствующим ему антителом. ИХА
проводится с помощью специальных тест-полосок, панелей или тест-кассет. ИХА
основан на современных технологиях получения моноклональных и
поликлональных антител к специфическим антигенам. ИХА обладает относительно
невысокой чувствительностью, но при этом крайне прост в исполнении, а учет
результатов осуществляется визуально и не требует наличия сложных дорогих
приборов и высокой квалификации исполнителя. Особенно удобен этот метод в
условиях поликлинического звена.
Принцип метода состоит в том, что образец (цельная кровь, сыворотка крови,
плазма крови, моча, экстракт тканей или фекалий), нанесенный на подложку,
движется по мембране и доходит до зоны, где находятся специфически
связывающиеся агенты (антитела или антигены). Здесь происходит специфическое
связывание тестируемого белка (антигена), находящегося в образце, со
специфическими антителами к нему. При наличии тестируемого белка в пробе на
мембране появляются одна или две четко окрашенные полосы, свидетельствующие
о негативном или позитивном результате теста (конкретная информация – в
инструкциях к каждому тесту). Для визуализации комплексов “антиген - антитело”
используются конъюгированные красители на основе коллоидного золота.
Преимущества использования иммунохроматографических тест-полосок:
- простота и удобство – метод позволяет получить результат (анализ и
первичное представление о причине заболевания) без оборудования и специальных
навыков;
- надежность – достоверность тестов достигает 100%, при этом каждый тест
имеет встроенный внутренний контроль;
- анонимность – что особенно важно при выявлении заболеваний,
передаваемых половым путем, других инфекционных заболеваний, а также при
выявлении фактов употребления наркотических веществ;
- независимость – не требует предварительной медицинской консультации и
рецепта врача.
Различают 2 варианта ИХА: прямой и конкурентный метод.
В прямом (сэндвичном) ИХА используется конъюгат антитела и метки,
нанесенный на мембрану. На тестовой линии иммобилизованы антитела,
специфические к данному аналиту, а на контрольной линии – антивидовые
антитела, специфические к первичным антителам. При нанесении образца,
содержащего анализируемое вещество, при попадании образца на мембрану с
конъюгатом, происходит связывание аналита с конъюгатом антитела и метки. Затем
иммунный комплекс попадает в тестовую зону, где он связывается со
специфическими антителами, образуя “сэндвич” (антитело-антиген-антитело-метка).
Избыток несвязавшегося конъюгата связывается с антивидовыми антителами на
контрольной линии. Таким образом, выявление 2-х линий на тест-полоске является
положительным результатом теста. При отсутствии аналита в образце конъюгат
201
связывается с антивидовыми антителами только на контрольной линии, образуя
одну линию на тест-полоске.
Метод прямого ИХА используется для выявления высокомолекулярных
соединений – вирусов, различных гормонов (например, в тестах на беременность),
возбудителей бактериальных инфекций.
Метод
конкурентого
ИХА,
используемый
для
определения
низкомолекулярных соединений, основан на конкуренции аналита и
иммобилизованного конъюгата аналит-белок-носитель за ограниченное количество
центров связывания специфических антител, содержащихся в конъюгате “антителометка”. При нанесении образца, содержащего аналит, он связывается с конъюгатом
“антитело-метка” на мембране. Далее иммунокомплекс проходит через тестовую
зону, где иммобилизован конъюгат “аналит-белок-носитель”. Иммунокомплекс не
может связаться с этим конъюгатом из-за стерических затруднений:
низкомолекулярные соединения обычно имеют одну антигенную детерминанту и,
соответственно, антитела имеют один центр связывания с антигеном, который уже
занят аналитом. Далее иммунный комплекс связывают антивидовые антитела,
находящиеся на контрольной линии. В результате, отсутствие окрашенной полосы в
тестовой зоне и наличие окраски в контрольной зоне свидетельствует о том, что
концентрация определяемого вещества в исследуемом образце превышает его
пороговое значение для данного теста.
При отсутствии анализируемого вещества в образце конъюгат “антителометка” связывается с конъюгатом “антиген-белок-носитель”, иммобилизованным в
зоне тестовой линии. Несвязавшийся конъюгат “антитело-метка” попадает в зону
контрольной линии и связывается там с антивидовыми антителами. Таким образом,
наличие двух окрашенных линий (тестовой и контрольной) является отрицательным
результатом анализа.
Формат
конкурентного
ИХА
используется
для
выявления
низкомолекулярных соединений, в том числе метаболитов наркотических
соединений в моче, жидкости ротовой полости, экстрактах тканей.
Преимуществом метода является быстрота и легкость его применения. В
этом методе не требуется использование сложного оборудования, и анализ может
быть проведен неспециалистом в любых условиях, в том числе в “полевых”.
Существуют также приборные полуколичественные и количественные
форматы ИХА, в которых используются специальные ридеры для регистрации
интенсивности метки в тестовой зоне тест-полоски.
В качестве меток в ИХА используются следующие вещества:
1. Красящие вещества (нано-частицы коллоидного золота или углерода, или
частицы окрашенного латекса). В этом случае используется визуальная детекция
результата, либо приборное колориметрическое определение (или сканирование).
Использование различных красящих меток, присоединенных к частицам латекса,
позволяет проводить мультианализ, в котором линии разного цвета соответствуют
различным аналитам. Наиболее часто используемой меткой является нано-частицы
коллоидного золота.
2. Флуоресцентные, фосфоресцентные и биолюминесцентные метки,
ковалентно связанные с частицами латекса. Эти метки используются только в
202
приборных вариантах ИХА, когда результат регистрируется специальным
ридером. Среди вышеуказанных наиболее распространены флуоресцентные метки.
3. Парамагнитные метки (также закрепленные на частицах латекса).
Данный вид меток используется в ИХА с применением приборов, регистрирующих
силу магнитного поля.
4. Ферментные метки используются по тому же принципу, что и в ИФА.
Ферментативная реакция регистрируется с помощью окрашивания субстратов, и
результат анализа является визуальным, или считывается с помощью ридера.
Иммунохроматографические тесты выпускаются для конкретных целей.
Например, обнаружение гемолизина BL и негемолитического энтеротоксина NHE B.
cereus в пищевых продуктах осуществляют с помощью иммунохроматографического экспресс-теста Duopath® Cereus Enterotoxin (рисунок 207).
Рисунок 207 - Иммунохроматографический экспресс-тест Duopath® Cereus
Enterotoxin для обнаружения энтеротоксинов B. cereus в пищевых продуктах.
Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Для предварительного выявления сальмонелл в пищевых продуктах
применяют экспресс-тест Singlepath® Salmonella – иммунохроматографический тест
на основе меченных золотом антител. При наличии в пробе антигена (сальмонелл)
образуется четкая красная линия (рисунок 208).
а
б
Рисунок 208 – Положительный (а) и отрицательный (б) результаты экспресс-теста
Singlepath® Salmonella. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
203
В настоящее время в диагностику сифилиса активно внедряется
иммунохроматографический анализ, позволяющий определять антитела к
антигенам T. pallidum, иммобилизированным на мембране (тест-полоске). Этот тест
позволяет провести диагностику сифилиса в домашних условиях (рисунок 209).
Рисунок 209 – Набор “Иммуно Хром-анти ТР-Экспресс” для экспресс-диагностики
сифилиса. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Для выявления кампилобактерий в пищевых продуктах фирма Merck
(Германия) выпускает экспресс-тест Singlepath-Campylobacter, представляющий
собой иммунохроматографический тест на основе меченных золотом антител
(рисунок 210).
Рисунок 210 - Экспресс-тест Singlepath-Campylobacter для обнаружения
кампилобактерий в пищевых продуктах. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
В иммунохроматографических тестах исследуемый материал вносится в
круглую лунку, где антиген адсорбируется подложкой и часть его взаимодействует с
меченными антителами. Комплекс “антиген+антитело” мигрирует в тестовую зону
(Т), где связывается с антителами к этому комплексу. В результате взаимодействия
образуется четкая красная полоса. Оставшаяся часть образца мигрирует далее в
контрольную зону (С), где образует четкую красную полосу, указывающую на
специфичность теста.
204
9.12. Феномен набухания капсулы
В начале ХХ века немецкий бактериолог Ф. Нейфельд впервые с помощью
типоспецифических антисывороток разделил пневмококки на серотипы. В
настоящее время в соответствии с особенностями капсульных полисахаридов
описано более 90 серотипов пневмококка. Для серотипирования пневмококков Ф.
Нейфельд использовал метод набухания капсулы: при добавлении к взвеси бактерий
противокапсульной сыворотки, содержащей антитела против капсульных
полисахаридов данного серотипа пневмококков, происходит резкое увеличение
(набухание) капсулы, которое хорошо видно при фазово-контрастном
микроскопическом исследовании (рисунок 211).
а
б
Рисунок 211 – Реакция набухания капсулы по Нейфельду: а - отрицательная
реакция, б – положительная реакция (Алябьева Н.М., 2014 г.).
Реакция набухания капсулы (реакция Нейфельда, quellung reaction) остается
основным методом серотипирования пневмококков и считается “золотым
стандартом” дифференцировки пневмококков.
9.13. Реакция бактериолизиса
Реакция бактериолизиса проявляется растворением бактерий в результате
взаимодействия с антителами в присутствии комплемента. Антитела, вызывающие
лизис бактерий, называются бактериолизинами. В пробирочных тестах применяют
иммунные сыворотки, инактивированные прогреванием на водяной бане при
температуре 37ОС в течение 30 минут, что приводит к разрушению комплемента.
Для проведения реакции в опытную пробирку вносят 0,5 мл разведенной 1:10
инактивированной иммунной сыворотки, добавляют 0,1 мл взвеси живых микробов
(концентрация – 1 млрд. микробных клеток в 1 мл) и 0,1 мл комплемента. Во вторую
пробирку вносят только иммунную сыворотку и микробную взвесь. В третью
пробирку вносят только взвесь микробов и комплемент. Затем во все пробирки
добавляют изотонический раствор хлорида натрия, доводя объем до 2 мл.
Пробирки помещают в термостат при температуре 37ОС на 2 часа. После
инкубации производят высев из всех пробирок в чашки Петри с плотной
питательной средой. Посевы инкубируют в термостате при температуре 37ОС в
205
течение 18-24 часов и подсчитывают количество выросших колоний. Число
выросших колоний из опытной пробирки должно быть в десятки и даже сотни раз
меньше, чем из контрольных пробирок.
206
10. Аллергологическая диагностика
Особое место в диагностике инфекционных болезней принадлежит
внутрикожным пробам с бактериальными аллергенами. В таблице 23 представлены
некоторые диагностикумы, применяемые в аллергологических исследованиях.
Таблица 23 – Диагностические внутрикожные пробы
Заболевание
Бруцеллез
Туляремия
Сибирская язва
Чума
Туберкулез
Сап
Дизентерия
Диагностикум,
проба
Бруцеллин, проба
Бюрне
Тулярин
Антраксин
Пестин
Туберкулин, проба
Манту
Малеин
Дизентерин, проба
Цуверкалова
Период острых
проявлений
++
Период
реконвалесценции
++
++
+
++
+
++
++
+
++
++
++
+
Примечание: “+” - положительная реакция; “++” - резко положительная
реакция; “-“ - отрицательная реакция.
Внутрикожные пробы в основном используются с диагностической целью.
Они позволяют выявлять в организме антитела или сенсибилизированные к
аллергену Т-лимфоциты. Кожно-аллергические реакции при инфекционных
заболеваниях появляются с 4-5 дня болезни и достигают наибольшей интенсивности
на 2-3 неделе болезни.
Аллерген вводят внутрикожно или наносят на скарифицированную кожу. У
больного, сенсибилизированного к данному возбудителю, на месте введения
аллергена через 24-48 часов развивается воспалительная реакция (положительный
результат).
Проба Манту проводится путем внутрикожного введения туберкулина в
объеме 0,1 мл. Туберкулин вводят строго внутрикожно на внутреннюю поверхность
средней трети предплечья до образования “пуговки”. Суть реакции Манту состоит в
том, что вводимые фрагменты микобактерий как бы притягивают к себе из
кровеносных сосудов лимфоциты, уже встречавшиеся с туберкулезными
бактериями. Чем больше в организме таких лимфоцитов, тем интенсивнее будет
воспаление (положительная реакция). Результаты пробы учитывают через 48-72
часа по наличию индурации – очерченного или расплывчатого уплотнения тканей
или образования папулы (рисунок 212).
Проба Манту оценивается следующим образом:
- отрицательная - наличие реакции от укола до 2 мм в диаметре;
- сомнительная - папула диаметром 2-4 мм или гиперемия;
207
- положительная - папула диаметром 5-17 мм у детей и подростков и 5-21
мм у взрослых;
- гиперэргическая - папула диаметром более 17 мм у детей и подростков и
более 21 мм у взрослых.
Рисунок 212 – Проведение пробы Манту и учет результатов. Заимствовано из
Интернет-ресурсов.
Однако проба Манту дает положительную реакцию у людей, привитых
вакциной БЦЖ. Кроме того, с помощью реакции Манту нельзя провести границу
между инфицированием и латентной туберкулезной инфекцией (ЛТИ). Поэтому до
последнего
времени
остается
актуальным
вопрос
дифференцировки
поствакцинальной (Mycobacterium bovis, штамм БЦЖ) и постинфекционной
(Mycobacterium tuberculosis) чувствительности к туберкулину.
Определенную помощь в решение этого вопроса оказывает Диаскинтест. В
основе этого теста лежит использование для внутрикожного введения
синтетических белков, характерных исключительно для возбудителя туберкулеза
(Mycobacterium tuberculosis). Положительная проба Манту означает, что человек
либо контактировал с возбудителем туберкулеза, либо недавно получил прививку
БЦЖ, либо его организм инфицирован непатогенными микобактериями.
Диаскинтест дает положительный результат только в том случае, когда человек
инфицирован возбудителем туберкулеза или уже болеет туберкулезом (рисунок
213).
Рисунок 213 – Результаты Диаскинтеста через 72 часа. Заимствовано из Интернетресурсов.
208
Аллергеном для постановки пробы Бюрне служит бруцеллин,
представляющий собой 0,1%-ный раствор полисахаридно-белкового комплекса,
полученного из вакцинного штамма B. abortus 19-ВА. Применяется для выявления
аллергической перестройки у инфицированных, больных, переболевших и лиц,
вакцинированных против бруцеллеза. Вводится в дозе 0,1 мл внутрикожно в
сгибательную поверхность предплечья. Реакция оценивается через 24 и 48 часов по
размеру отека:
- диаметр отека 1-3 см – реакция слабо положительная;
- отек размером 3-6 см – умеренно выраженная реакция;
- отек более 6 см – сильно выраженная реакция.
Внутрикожное введение аллергена у больного бруцеллезом вызывает развитие
местной реакции (отек, гиперемия, болезненность). Отрицательная проба Бюрне
позволяет исключить бруцеллез. Положительная реакция Бюрне отмечается у
больных и вакцинированных лиц (рисунок 214).
Рисунок 214 – Внутрикожная аллергическая проба Бюрне при бруцеллезе.
Заимствовано из Интернет-ресурсов.
209
11. Молекулярно-генетические методы исследования
Молекулярно-генетические методы исследования позволяют выявлять
фрагменты генома возбудителя в исследуемом материале с помощью молекулярной
гибридизации или полимеразной цепной реакции. Для молекулярно-генетических
исследований используется такой же материал, как и для бактериологического
исследования: клинический биологический материал от больного (кровь, смывы,
соскобы, слюна, гной, мокрота, спинномозговая жидкость, желудочный сок,
отделяемое из уретры, моча, испражнения, биоптаты тканей и органов), пробы из
объектов внешней среды (пищевые продукты, вода, почва) и чистая культура
микроорганизмов.
К молекулярно-генетическим методам исследования относятся:
- методы, основанные на изучении фрагментов ДНК (плазмидное
типирование, рестрикционно-эндонуклеазный анализ);
- методы, основанные на гибридизации нуклеиновых кислот (молекулярная
гибридизация);
- методы амплификации нуклеиновых кислот (МАНК): полимеразная
цепная реакция (ПЦР) и изотермальная амплификация (LAMP).
11.1. Плазмидное типирование
Плазмидное типирование заключается в том, что из бактерий с помощью
специальных методов выделяют тотальную ДНК и разделяют ее путем
электрофореза в агарозном геле. При этом выявляют наличие хромосомной и
плазмидной ДНК. Присутствие в бактериальной клетке несколько разных плазмид
позволяет при электрофорезе разделить их по молекулярной массе. Обработка
плазмидной ДНК перед проведением электрофореза рестриктазами позволяет
определить количество и размер образующихся рестрикционных фрагментов.
Плазмидное типирование используется в эпидемиологических исследованиях при
расследовании вспышек инфекционных заболеваний (рисунок 215).
Рисунок 215 - Установление идентичности Salmonella typhimurium, выделенных от
разных пациентов, по присутствию в них одинаковых плазмид. Заимствовано из
Интернет-ресурсов.
210
11.2. Рестрикционно-эндонуклеазный анализ
Сущность рестрикционно-эндонуклеазного анализа заключается в
обработке ДНК рестриктазами (эндонуклеазами), разрезающими молекулу ДНК по
определенным последовательностям нуклеотидов. Рестрикционно-эндонуклеазный
анализ (REA) предусматривает обработку рестриктазами ДНК бактериальной
хромосомы. После разрезания ДНК проводят электрофорез в пульсирующем
электрическом поле, в результате чего образующиеся фрагменты ДНК
распределяются в зависимости от размера в уникальный видоспецифический
профиль (рисунок 216). По сходству рестрикционных профилей изучаемого микроба
и известных видов можно идентифицировать и типировать микроорганизмы.
Рисунок 216 – Пример рестрикционно-эндонуклеазного анализа бактерий.
Заимствовано из Интернет-ресурсов.
11.3. Молекулярная гибридизация
Молекулярная гибридизация основана на определении уникальных
последовательностей генома микроорганизмов, отражающих свойства вида или
варианта. Сущность обнаружения таких участков ДНК основана на способности
комплементарных последовательностей нуклеиновых кислот к гибридизации. В
исследованиях
используют
меченые
ферментом,
радионуклидом
или
флюорохромом нуклеиновые зонды, представляющие однонитевые фрагменты
ДНК, комплементарные уникальным участкам микробного генома. Образующиеся
гибридные комплексы выявляются по изменению окраски реакционной смеси,
флюоресценции или радионуклидным анализом.
Молекулярная гибридизация позволяет выявлять степень сходства двух
молекул ДНК, что используется для эволюционного анализа, для идентификации и
типирования микроорганизмов, а также для изучения экспрессии генов. В основном
211
метод молекулярной гибридизации используется при идентификации трудно
культивируемых или медленно растущих микробов (представителей родов
Mycobacterium, Neisseria, Campylobacter).
Метод молекулярной гибридизации требует большого количества
молекулярных зондов, времени, сложен в постановке, не отличается высокой
чувствительностью и широкого практического применения не нашел.
Молекулярная гибридизация проводится в растворах, в тканевых срезах, на
микрочипах (эррей гибридизация) и на мембранах. Наиболее распространенной
является гибридизация на мембранах. Для этого исследуемую ДНК с помощью
рестриктаз разрезают на мелкие фрагменты, которые фиксируют на мембране.
Фрагменты наносят в виде точек (дот-блоты) или в виде полосок (слот-блоты).
Затем к фрагментам ДНК добавляют специфические меченые зонды. Гибридизацию
проводят при температуре 65ОС. В случае комплементарности зонд связывается с
ДНК. Некомплементарные несвязавшиеся зонды удаляются промыванием. В месте
связывания зонда регистрируют флюоресценцию или изменение цвета.
11.4. Полимеразная цепная реакция
Полимеразная цепная реакция (ПЦР, Polymerase chain reaction, PCR)
позволяет обнаруживать геном возбудителя в исследуемом материале без выделения
чистой культуры. Метод амплификации ДНК (многократного увеличения числа
копий специфического фрагмента нуклеиновых кислот) в пробирке разработал в
1983 г. американский биохимик К. Муллис. За разработку метода ПЦР он в 1993 г.
получил Нобелевскую премию по химии.
Суть ПЦР состоит в циклическом удвоении (амплификации) определенного
участка ДНК с помощью специфических праймеров (затравок) и особых ферментов
(полимераз). На каждом цикле амплификации синтезированные ранее фрагменты
вновь копируются ДНК-полимеразой. В результате амплификации образуется
множество копий (ампликонов) ДНК размером до 5000 п. о. В качестве
амплифицируемых участков ДНК микроорганизмов могут выступать уникальные
гены, характерные только для данного вида бактерий.
Принцип ПЦР. После температурной денатурации двухцепочечной ДНК
образуются одноцепочечные молекулы, к которым присоединяются небольшие
синтетические олигонуклеотиды – праймеры, комплементарные концам известного
уникального фрагмента генома возбудителя. Праймеры присоединяются только к
комплементарному участку на обеих цепях ДНК и ограничивают амплифицируемый
фрагмент с двух сторон. К 3'-концу праймера прикрепляется ДНК-полимераза и на
ДНК-матрице синтезируется копия ДНК. Синтез ДНК протекает только на участке
между праймерами.
Каждая
стадия
происходит
при
определенной
температуре.
Каждый вновь синтезируемый фрагмент ДНК служит матрицей для синтеза двух
новых нитей в следующем цикле амплификации. Переход от одной стадии к другой
достигается изменением температуры инкубационной смеси. При многократном
(30-40 раз) повторении этих циклов и оптимальном сочетании компонентов
212
реакционной смеси происходит экспоненциальное увеличение количества
ампликонов. При наличии в исследуемом образце даже одной молекулы
нуклеиновой кислоты образуется достаточное количество ДНК, которое можно
выявить физико-химическими методами.
Исследуемый материал для ПЦР: соскобы эпителиальных клеток, кровь,
плазма и сыворотка крови, плевральная и спинномозговая жидкости, моча, мокрота,
слизь и другие биологические выделения, биоптаты тканей. Забор материала
проводится с помощью стерильного, желательно одноразового, инструментария в
одноразовые стерильные пластиковые пробирки или в стеклянные пробирки,
обработанные предварительно хромовой смесью, промытые дистиллированной
водой и прокаленные в сушильном шкафу при температуре 150ОС в течение 1 часа.
Отобранные образцы могут храниться при комнатной температуре не более
2 часов. При необходимости пробы можно хранить в холодильнике при температуре
2-8ОС не более суток. Более продолжительное хранение (до 2 недель) возможно в
морозильной камере при температуре минус 20ОС. Не допускается повторное
замораживание – оттаивание проб.
Полимеразная цепная реакция включает в себя несколько этапов.
1. Подготовка пробы биологического материала (выделение ДНК из
образцов). Суть этого этапа заключается в экстракции ДНК из биопрепарата и
удалении или нейтрализации посторонних примесей для получения чистого
препарата ДНК, пригодной для амплификации. Метод выделения ДНК зависит от
вида исследуемого материала. Чаще всего ДНК выделяют методом твердофазной
сорбции. Для этого биоматериал обрабатывают лизирующим раствором,
содержащим гуанидин изотиоцианат, для денатурации белков и высвобождения
ДНК. Затем ДНК адсорбируют на сорбентах, многократно отмывают сорбенты от
остатков лизирующего раствора и смывают нуклеиновую кислоту с сорбента
буферным раствором.
При обработке сыворотки, плазмы или цельной крови используют метод
фенольной
экстракции.
Этот
метод
включает
депротеинизацию
фенолом/хлороформом с последующим осаждением ДНК этанолом или изопропанолом.
2. Приготовление реакционной смеси. Компоненты реакционной смеси
вносят микропипеткой в микропробирку, причём каждый раз наконечник
микропипетки меняют во избежание контаминации.
Компонентами ПЦР являются:
- материал, содержащий искомую ДНК возбудителя - ДНК-матрица;
- смесь четырёх дНТФ (дезоксинуклеотидтрифосфатов);
- ДНК-полимераза (Taq-полимераза), катализирующая полимеризацию ДНК;
- два синтетических праймера (искусственно созданные затравки
одноцепочечной ДНК длиной 18-30 оснований), комплементарные концам
требуемого конкретного фрагмента ДНК возбудителя;
- специфический буфер, содержащий ионы магния, некоторые соли и
имеющий определенное значение рН.
Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) является “строительным
материалом”, который использует Taq-полимераза для синтеза второй цепи ДНК. В
213
смесь входят дезоксиаденозинтрифосфат (дАТФ), дезоксигуанозинтрифосфат
(дГТФ), дезоксицитозинтрифосфат (дЦТФ) и дезокситимидинтрифосфат (дТТФ).
Taq-полимераза является термостабильным ферментом, обеспечивающим
достраивание 3'-конца второй цепи ДНК по принципу комплементарности. Этот
фермент выделен из Thermophilus aquaticus. Кроме Taq-полимеразы в ПЦР
применяют Pfu-полимеразу (выделена из Pyrococcus furiosus), Pwo-полимеразу
(выделена из Pyrococcus woesei) и другие ферменты.
Праймеры представляют собой пару искусственно синтезированных
олигонуклеотидов, имеющих размер от 15 до 30 п. н., идентичных соответствующим
участкам ДНК-матрицы. Праймеры получают, исходя из известных генов
возбудителей в специальных аппаратах – синтезаторах. Для получения праймеров
необходимо знание нуклеотидной последовательности микроорганизмов. Для
проведения ПЦР необходимо два праймера, каждый из которых комплементарен
одной из цепей ДНК. Правильно подобранные праймеры обеспечивают
специфичность и чувствительность тест-системы.
Буфер содержит смесь катионов и анионов в определенных концентрациях,
обеспечивающих оптимальные условия для реакции.
Во избежание испарения реакционной смеси в пробирки добавляют
высококипящее вазелиновое масло или используют амплификатор с
подогревающейся крышкой.
Основные исходные компоненты ПЦР представлены на рисунке 217.
Рисунок 217 – Исходные компоненты ПЦР. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
3. Проведение амплификации ДНК (собственно ПЦР). При проведении
ПЦР выполняются 25-30 циклов амплификации (термоциклирования), каждый из
которых состоит из трех стадий.
3.1. Денатурация (плавление ДНК) протекает при температуре 93-95ОС в
течение 30-40 секунд. В результате этого разрушаются водородные связи между
двумя цепями ДНК, молекула ДНК “расплетается” и образуются одноцепочечные
фрагменты. Иногда перед первым циклом проводят предварительный прогрев
реакционной смеси в течение 2-5 минут для полной денатурации матрицы и
праймеров. Такой прием называется горячим стартом.
3.2. Отжиг (присоединение праймеров) происходит при температуре 50О
65 С. Время отжига составляет 20-60 секунд. На этой стадии праймеры
присоединяются к комплементарным участкам ДНК-мишени с образованием
дуплексов. Праймеры подбираются таким образом, что они ограничивают
214
(фланкируют) искомый фрагмент ДНК и комплементарны противоположным
цепям ДНК. Участок ДНК-матрицы, с которым связывается праймер, должен быть
уникальным только для данного возбудителя.
3.3. Элонгация (достраивание цепей ДНК). На этой стадии ДНК-полимераза
реплицирует матричную цепь от 3‫׳‬-конца праймера, который связался с матрицей.
Температура элонгации обычно составляет 70-72ОС. Время элонгации составляет
20-40 секунд.
В дальнейшем новые цепи ДНК служат матрицами для последующих циклов
амплификации, и количество ампликонов с каждым циклом увеличивается в
геометрической прогрессии (рисунок 218).
Рисунок 218 – Экспоненциальное накопление копий ДНК в ходе ПЦР. Заимствовано
из Интернет-ресурсов.
Поэтому за 30 циклов количество ампликонов, полученных из одной
молекулы ДНК, достигает примерно 230 копий участка ДНК.
4. Детекция (визуализация ампликонов) производится несколькими
способами:
- электрофоретическая детекция в агарозном или полиакриламидном геле;
- гибридизационно-ферментная детекция;
- гибридизационно-флуоресцентная детекция (регистрация продукта после
окончания реакции амплификации – “анализ по конечной точке” и детекция
продукта в режиме “реального времени”).
Наиболее распространенным до недавнего времени был метод
горизонтального электрофореза, основанный на разделении молекул ДНК по
размеру в агарозном или полиакриламидном геле с бромистым этидием. Для
выявления ДНК проводили электрофорез в агарозном геле, содержащем
флюоресцирующий в УФ-свете бромид этидия. После электрофореза гель извлекали
из электрофоретической камеры и переносили на столик трансиллюминатора
(источника УФ-света), где бромистый этидий, связавшийся с ДНК, флюоресцирует в
УФ-свете (оранжевое свечение).
В электрофоретической дорожке, соответствующей положительному
контролю, должна присутствовать оранжевая светящаяся полоса.
215
В электрофоретической дорожке, соответствующей отрицательному
контролю, такая полоса должна отсутствовать. Наличие такой полосы в
отрицательном контроле свидетельствует о контаминации (загрязнении) пробы.
Гибридизационная
детекция
проводится
с
использованием
олигонуклеотидных зондов, содержащих метку (флуорофоры или интеркалирующие
красители).
ПЦР проводится в амплификаторе (термоциклере) – приборе, который
обеспечивает автоматическое периодическое охлаждение и нагревание пробирок с
реакционной смесью (рисунок 219). Температурные режимы циклов в термоциклере
изменяются автоматически в соответствии с заданной программой.
Рисунок 219 – Амплификатор для проведения ПЦР. Заимствовано из Интернетресурсов.
Схема ПЦР представлена на рисунке 220.
95 С Денатурация
Образец ДНК
Праймеры
Taq-полимераза
Буфер
Нуклеотиды
55 С
Отжиг
72 С
Элонгация
Пробирка
Термоциклер
Рисунок 220 – Схема ПЦР. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
216
Полученные результаты можно документировать, фотографируя
электофореграммы с использованием оранжевого светофильтра (рисунок 221).
Рисунок 221 – Источник тока и камера для электрофореза. Заимствовано из
Интернет-ресурсов.
Существуют автоматизированные системы визуализации гелей, включающие
трансиллюминатор, видеокамеру и компьютер.
В настоящее время разработаны методы ПЦР для выявления многих
бактерий (микобактерии, хламидии, микоплазмы, сальмонеллы, легионеллы и др.) и
вирусов (ВИЧ, вирусы герпеса, цитомегаловирус, вирусы папилломы, вирус
краснухи и др.).
Преимущества ПЦР перед другими методами диагностики инфекционных
заболеваний:
- прямое определение наличия возбудителей (выявление участка ДНК
конкретного возбудителя);
- высокая специфичность (выявление уникального фрагмента ДНК,
характерного только для данного возбудителя);
- высокая чувствительность (присутствие в пробе 10-100 микробных клеток);
- универсальность процедуры выявления различных возбудителей;
- высокая скорость получения результатов анализа (4-5 часов);
- возможность диагностики не только острых, но и латентных инфекций
(диагностика трудно культивируемых, некультивируемых и персистирующих форм
микроорганизмов).
Ограничения метода ПЦР:
- амплификация ДНК как живых, так и погибших микроорганизмов;
- возможность перекрестной реакции и ложноположительных результатов;
- изменчивость микроорганизмов.
Различают несколько разновидностей ПЦР.
1. ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ, Real-time PCR, RT-PCR) позволяет
отслеживать накопление ампликонов непрерывно в ходе реакции по флюоресценции
зондов и не требует проведения электрофореза. Для проведения ПЦР-РВ в
реакционную смесь добавляется специфический флуоресцентный зонд (например,
217
TaqMan) или интеркалирующий краситель (например, SybrGold или SybrGreen).
Флуоресцентный зонд предусматривает использование неинтеркалирующих
флуорофоров и гасителей флуоресценции. Интеркалирующий флуоресцирующий
краситель включается в состав двухцепочечной молекулы ДНК. По мере накопления
ампликонов интенсивность флуоресценции возрастает. Периодически в ходе
реакции детектирующая камера определяет уровень флуоресценции.
При этом амплификатор детектирует флюоресценцию каждый цикл и
наблюдает рост количества ПЦР-продукта в каждой пробирке. По имеющейся
калибровке амплификатор устанавливает точное исходное количество образца в
пробе. Для осуществления ПЦР в реальном времени используют специально
сконструированные амплификаторы, регистрирующие флуоресценцию (рисунок
222).
Рисунок 222 – Марки амплификаторов для ПЦР в реальном времени. Заимствовано
из Интернет-ресурсов.
ПЦР в реальном времени позволяет осуществлять количественную оценку
содержания ДНК в исследуемом материале по мере прохождения реакции (онлайн).
Такую реакция можно отнести к разряду количественной ПЦР в реальном времени
(Quantitative real-time PCR). Преимуществами ПЦР-РВ являются также
минимальный риск контаминации пробы, объединение этапов амплификации и
детекции результатов анализа, высокая эффективность анализа, автоматический
учет результатов.
2. ПЦР с “горячим” стартом (Hot-start PCR) предусматривает
предотвращение возможности начала реакции до момента достижения в пробирке
условий, обеспечивающих специфический отжиг праймеров. Для этого разными
способами блокируют активность ДНК-полимеразы и полимеразу отделяют от
реакционной смеси с помощью легкоплавкого парафина или специального масла.
До начала реакции амплификатор прогревают до температуры плавления парафина
(60-80ОС).
3. Мультиплексная (мультипраймерная) ПЦР (мПЦР) позволяет
одновременно использовать несколько пар праймеров в одной реакционной
пробирке, что обеспечивает одновременную амплификацию ДНК различных
возбудителей (до 7-8 возбудителей). Например, с помощью мПЦР возможна
диагностика гнойных бактериальных менингитов, обусловленных Neisseria
218
meningitidis, Haemophilus influenzae, Streptococcus pneumoniae. В мультиплексной
ПЦР используются меченые флуорофорами пробы. Для каждого возбудителя проба
помечена определенным красителем, что позволяет дифференцировать ампликоны.
4. ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР, Reverse Transcription PCR,
RT-PCR) используется для выявления РНК-содержащих вирусов путем синтеза на
матрице вирусной РНК с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы (обратной
транскриптазы или ревертазы) комплементарной ДНК, которую в последующем
применяют в качестве матрицы в стандартной ПЦР.
В качестве праймеров используют случайные (рэндом) праймеры, состоящие
из 6 нуклеотидов. Такие праймеры могут использоваться обратной транскриптазой.
Обратная транскрипция проводится при стабильной температуре 37ОС. Праймеры
связываются с молекулами РНК, после чего обратная транскриптаза достраивает
комплементарную цепочку ДНК. Причем, обратной транскрипции подвергаются все
виды РНК, присутствующие в реакционной смеси.
В качестве праймеров используются также олиготимидиновый праймер.
Такой праймер не связывается с клеточными рибосомными и транспортными РНК,
что позволяет избавиться от значительной части балластной РНК.
5. Гнездовая (“вложенная”) ПЦР (Nested PCR) осуществляется
последовательно с двумя парами праймеров (ДНК продукты, образуемые в реакции
с первой парой праймеров, используют для последующего взаимодействия со
второй парой праймеров). Вторая пара праймеров амплифицирует участок ДНК
внутри продукта первой реакции.
6. ПЦР с использованием произвольных праймеров, ПЦР со случайной
амплификацией полиморфной ДНК (ПП-ПЦР, Random Amplification of
Polymorphic DNA PCR, RAPD-PCR) основана на использовании коротких
праймеров, способных связываться с разными участками ДНК. В результате этого
происходят амплификации нуклеотидных последовательностей в различных
областях генома с образованием многочисленных фрагментов разной длины, по
количеству и размерам которых судят о групповой или видовой принадлежности
микроорганизма. Указанная ПЦР используется при необходимости отличить
близкие по генетической последовательности организмы.
7.
Широкодиапазонная
ПЦР
предусматривает
использование
универсальных праймеров, взаимодействующих с высоко консервативными
участками ДНК, встречающимися у многих микроорганизмов (например, гены,
кодирующие рибосомы 16S и 23S). В частности, широкодиапазонную ПЦР
применяют для выявления в клиническом материале неизвестных и
некультивируемых микроорганизмов.
8. “Инвертированная” ПЦР (Inverse PCR) используется в том случае, если
известен лишь небольшой участок внутри нужной последовательности. Этот метод
особенно полезен, когда нужно определить соседние последовательности после
вставки ДНК в геном. Для осуществления инвертированной ПЦР проводят ряд
разрезаний ДНК рестриктазами с последующим соединением фрагментов
(лигирование). В результате известные фрагменты оказываются на обоих концах
неизвестного участка, после чего можно проводить ПЦР как обычно.
9. “Ассиметричная” ПЦР (Asymmetric PCR) проводится тогда, когда нужно
амплифицировать преимущественно одну из цепей исходной ДНК. Используется в
219
некоторых методиках секвенирования и гибридизационного анализа. ПЦР
проводится как обычно, за исключением того, что один из праймеров берется в
большом избытке.
10. Ступенчатая ПЦР (Touchdown или Stepdown PCR) позволяет уменьшать
влияние неспецифического связывания праймеров на образование продукта. Первые
циклы проводят при температуре выше температуры отжига, затем каждые
несколько циклов температуру снижают. При определенной температуре система
пройдет через полосу оптимальной специфичности праймеров к ДНК.
11. ПЦР длинных фрагментов (Long-range PCR) является модификацией
ПЦР для амплификации протяженных участков ДНК (10 тысяч оснований и
больше). Используют 2 полимеразы, одна из которых – Taq-полимераза с высокой
процессивностью (то есть способная за один проход синтезировать длинную цепь
ДНК), а вторая – ДНК полимераза с 3'-5' эндонуклеазной активностью. Вторая
полимераза необходима для того, чтобы корректировать ошибки, внесенные первой.
11.5. Лигазная цепная реакция
В основе метода лежит способность специфического фермента ДНКзависимой ДНК-лигазы сшивать цепь ДНК в присутствии АТФ и ионов магния при
наличии разрыва фосфоэфирной связи. Используется термостабильная лигаза и 4
специфических олигонуклеотида, добавляемых в реакционную смесь в избытке.
Каждые 2 олигонуклеотида комплементарны к детектируемому специфическому
фрагменту цепи ДНК-матрицы и непосредственно примыкают друг к другу,
одновременно они комплементарны и второй паре олигонуклеотидов. После
денатурации
ДНК-матрицы
при
95ОС
олигонуклеотиды
связываются
специфическими фрагментами цепей ДНК-матрицы и лигируются при 50ОС. Далее
эти две стадии цикла повторяются много раз, в результате чего происходит
экспоненциальное возрастание соединенных ковалентной связью олигонуклеотидов.
Для быстрого количественного обнаружения лигированных олигонуклеотидов
применяют 2 метки: биотин на одном конце и флуоресцеин – на другом конце
лигированных олигонуклеотидов. В последующем фрагменты связываются
антифлуоресцеиновыми антителами на поверхности мембраны или микропланшета.
Антибиотиновые антитела, конъюгированные с щелочной фосфатазой, также
количественно взаимодействуют с образовавшимся фиксированным комплексом и
после добавления субстрата дают окрашенный продукт.
11.6. Секвенирование
Секвенирование представляет собой метод, позволяющий определять
последовательность нуклеотидов (аденина, тимина, гуанина и цитозина) в молекуле
ДНК. Цели секвенирования:
220
- расшифровка генома – определение количества генов, их
протяжённости, локализации, функций;
- идентификация неизвестных микроорганизмов путем сравнения
нуклеотидной
структуры
некоторых
их
генов
с
соответствующими
последовательностями известных видов;
- определение мутаций в генах для выявления резистентных
микроорганизмов и изучения молекулярных механизмов устойчивости;
- эпидемиологические исследования (определение генетических различий
штаммов одного вида, выделяемых в разное время и из разных источников для
определения связей между циркулирующими в различных регионах и стационарах
микроорганизмов);
- оценка сходства микроорганизмов и их происхождения.
Методика секвенирования. Готовят реакционную смесь, состоящую из
изучаемой ДНК, праймера, ДНК-полимеразы, дезоксинуклеотидтрифосфатов
(дАТФ,
дТТФ,
дГТФ,
дЦТФ),
меченых
флюоресцентной
меткой
дидезоксинуклеотидов.
Затем
проводят
ПЦР,
позволяющую
получить
множественные копии небольших фрагментов ДНК размером от 300 до 1000
нуклеотидов. Секвенирование больших фрагментов затруднено, так как при
проведении их электрофореза невозможно выявить фрагменты, отличающиеся в
один нуклеотид. После этого очищают амплифицированные фрагменты ДНК от
остатков ПЦР (праймеров, несвязавшихся нуклеотидов) и проводят электрофорез в
полиакриламидном геле для разделения фрагментов ДНК, отличающихся в один
нуклеотид. Результатом секвенирования является первичная структура
секвенированного фрагмента ДНК, которую идентифицируют с помощью
компьютерных программ.
Другие варианты секвенирования.
Крупномасштабное секвенирование, позволяющее секвенировать большие
фрагменты ДНК, например, целую хромосому микроорганизмов. ДНК нарезают на
фрагменты при помощи рестриктаз. Эти небольшие фрагменты при помощи вектора
переносят в Escherichia coli (клонируют). Микроорганизмы, размножаясь, приводят
к накоплению клонированной ДНК (клональная амплификация). Далее все
разновидности клонированных фрагментов ДНК секвенируют и при помощи
компьютера собирают в единую длинную цепочку. Такой подход не требует
предварительной информации об изучаемой ДНК, поэтому относится к
секвенированию de novo.
Секвенирование с использованием гибридизации. В его основу положены
гибридизационные биочиповые технологии. При этом неизвестная ДНК
обрабатывается флюоресцентным красителем и наносится на чип с большим
количеством зондов разной специфичности, находящихся в разных участках чипа.
Тот участок чипа, где отмечается сильная флюоресценция, свидетельствует о
комплементарности зонда и изучаемой ДНК, что позволяет идентифицировать ДНК,
зная характер зонда.
Микрожидкостное секвенирование по Сенджеру. Проводится с
использованием всех стадий секвенирования по Сенджеру: ПЦР, очистки продуктов
амплификации, электрофореза. Реакция осуществляют в специальных чипах, при
этом объем реакции измеряется в нанолитрах, что способствует меньшему расходу
221
дорогостоящих реагентов. Чип состоит из трех функциональных частей: камеры
для ПЦР; камеры для очистки ампликонов; камеры для капиллярного электрофореза
(капилляр имеет длину 30 см и компактно скручен).
В клинической лабораторной практике секвенирование не используется.
Секвенирование – это направление работы исследовательских лабораторий.
11.7. Петлевая изотермическая амплификация нуклеиновых кислот
Петлевая изотермическая амплификация нуклеиновых кислот (LAMP –
Loop-Mediated Isothermal Amplification) описана в 2000 г. японским ученым
Цугунори Нотоми (Tsugunori Notomi) и в отличие от ПЦР осуществляется при
постоянной температуре и не требует точного термоциклирования. Для
амплификации нуклеиновой кислоты в этом методе используется термостабильная
Bst-полимераза Bacillus stearothermophilus. Для практического использования
предлагается несколько вариантов Bst-полимеразы, позволяющих готовить
реакционную смесь при комнатной температуре, проводить реакцию RT-LAMP без
добавления обратной транскриптазы и др.
Целевая последовательность нуклеиновой кислоты амплифицируется при
постоянной температуре 60-65ОС в течение 15-60 минут. Для осуществления
реакции используют 4 разных праймера (олигонуклеотиды F3, B3, FIP и BIP,
являющиеся обязательными), специфичных к 6 участкам целевого фрагмента
нуклеиновой кислоты (прямой наружный или внешний праймер, обратный
наружный или внешний праймер, прямой внутренний праймер и обратный
внутренний праймер). Строение праймеров для LAMP представлено на рисунке 223.
Рисунок 223 – Строение праймеров для LAMP. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
F3 – прямой наружный праймер, комплементарный участку F3c, B3 – обратный
наружный праймер, комплементарный участку B3c, FIP – прямой внутренний
праймер состоит из двух частей: F1c (5’) и F2 (3’), комплементарных участкам F1 и
222
F2c, соответственно, BIP – обратный внутренний праймер состоит из двух
частей: B1c (5’) и B2 (3’), комплементарных участкам B1 и B2c, соответственно.
Для эффективной LAMP достаточно менее 10 копий целевого участка
нуклеиновой кислоты в исходной реакционной смеси.
Процесс амплификации нуклеиновой кислоты при этом методе включает 3
основных этапа:
- образование базовой гантелеобразной (петлеобразной) структуры;
- циклическая амплификация;
- элонгация и повторение циклов.
Процесс амплификации в LAMP-методе представлен на рисунке 224.
Рисунок 224 – Процесс петлевой изотермической амплификации нуклеиновых
кислот. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Внешние праймеры (F3 и B3) необходимы лишь в самом начале реакции для
разделения двух материнских цепей. Образование гентелевидной структуры
происходит с помощью специально подобранных внутренних праймеров. Именно
они формируют петли на концах искомого фрагмент. Для этого к 5′-концу праймера
F2 прикреплена вторая часть (F1c), комплементарная F1 части матрицы.
Полученный фрагмент F1c-F2 представляет собой прямой внутренний праймер (FIP)
длинной до 50 нуклеотидов (обозначение F происходит от англ. forward – “прямой”).
223
F2 регион внутреннего праймера FIP гибридизируется с мишенью, а цепь
достраивается с помощью ДНК-полимеразы. Затем внешний праймер
F3присоединяется к F3c фрагменту мишени, и ДНК-полимераза достраивает цепь,
смещая синтезированную последовательность, которая формирует петлеобразную
структуру на 5′-конце, так как F1с-участок гибридизируется с F1-регионом.
То же самое происходит и с праймерами, садящимися на противоположный
3′-конец матрицы (обозначение B происходит от англ. backward – “обратный”).
В конечном итоге, формируется одноцепочечный фрагмент ДНК с петлями с обеих
сторон – своеобразная гантелевидная структура (dumbbell structure). С образованием
такой структуры завершается первый этап LAMP.
После образования петлеобразной структуры с 3′-конца Bst-полимераза
продолжает синтез к 5′-концу, в результате чего образуется “рукоятка” (stemloop).
Концы “рукоятки” также замыкаются в петли, в результате чего формируются
загзагообразные продукты.
Использование в дальнейших разработках петлевых праймеров позволило
проводить синтез с петель в обе стороны. В результате этого уже через 10-20 минут
возможно регистрировать продукт в достаточном количестве.
В качестве матрицы при проведении LAMP можно использовать как ДНК,
так и РНК. В случае использования в качестве матрицы РНК в реакционную смесь
добавляют обратную транскриптазу. Такой вариант метода называется RT-LAMP
(reverse transcription-coupled LAMP).
Этапы проведения LAMP:
- начало амплификации – посадка олигонуклеотидов FIP и BIP и наработка
гантелевидных ДНК-структур с двумя петлями;
- циклическая амплификация – наработка ДНК-продуктов с гантелевидной
структурой;
- элонгация – наработка ДНК-продуктов различной длины и с множеством
петель.
Детекцию продуктов LAMP можно проводить методом агарозного гельэлектрофореза, однако этот способ трудоемкий и длительный. Проще добавить к
реакционной смеси интеркалирующий краситель (например, бромистый этидий,
пропидиум йодид и др.) и наблюдать за изменением флюоресценции в ходе
процесса с помощью специального реал-тайм флуориметра для LAMP. Вместо
красителей можно использовать специальные флюоресцентные зонды.
Выделяют следующие методы детекции, используемые в LAMP-методе:
- визуализация продуктов реакции электрофорезом с окрашиванием
бромидом этидия;
- флюоресцентная детекция в растворе с интеркалирующими агентами;
- турбидиметрическая визуализация (образование нерастворимого
пирофосфата);
- турбидиметрия с флюоресценцией;
- BART - турбидиметрия с люминесценцией;
- электрохимическое определение продуктов;
- использование флюоресцентно-меченых праймеров.
Некоторые способы детекции представлены на рисунке 225.
224
Рисунок 225 - Способы детекции продуктов реакции LAMP / RT-LAMP: слева –
агарозный гель-электрофорез с окраской бромистым этидием; справа – окраска
реакционной смеси интеркалирующим красителем.
В таблице 24 представлена сравнительная характеристика методов ПЦР и
LAMP.
Таблица 24 - Сравнительная характеристика ПЦР и LAMP
Характеристика
Этап денатурации
Температурный режим
Количество используемых
праймеров
Чувствительность к
примесям
Время реакции
Приборное оснащение
Работа с РНК-матрицей
Визуальные методы
детекции
ПЦР
Требуется
О
94 С, 55-60ОС, 72ОС
2
LAMP
Отсутствует
60-65ОС
4-6
Высокая
Низкая
45 мин – 3 ч
Амплификатор
Предварительный этап
обратной транскрипции,
наличие фермента
(обратной транскриптазы)
Нет
5-60 мин
Термоблок или термостат
Обратная транскрипция
проводится при той же
температуре без
специфического фермента
Есть
225
12. Методы масс-спектрометрии
Масс-спектрометрия позволяет проводить идентификацию более 4000 видов
микроорганизмов, сокращая при этом сроки идентификации на 24-72 часа. Один из
важных показателей – экономичность методики, которая почти не требует затрат на
реактивы и расходные материалы. В клинической микробиологии массспектрометрия позволяет с высокой точностью определить количественный и
качественный состав вещества, его структуру, физико-химические свойства.
Масс-спектрометрия представляет собой физический метод измерения
отношения массы заряженных частиц вещества к их заряду (m/z). Приборы, которые
реализуют этот метод, называются масс-спектрометрами. Они состоят из источника
ионов, системы разделения ионов (анализатор) и детектора. Чтобы получить массспектр надо превратить молекулы и атомы органического вещества в заряженные
частицы – ионы (осуществляется в источнике ионов), разделить полученные ионы в
пространстве и времени (осуществляется в анализаторе) и зафиксировать сигнал от
полученных заряженных частиц (осуществляется в детекторе).
Масс-спектрометры
используются
в
следующих
направлениях
микробиологии:
- идентификация микроорганизмов в биологических средах;
- видовое и родовое типирование бактерий;
- определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам.
Способы масс-спектрометрии (MS):
1 способ – по спектру белков микробов – белковое профилирование
(MALDI-TOF MS);
2 способ – по клеточным липидам – метод газовой хроматографии в
сочетании с масс-спектрометрией (ГХ-МС) и метод жидкостной хроматографии в
сочетании с масс-спектрометрией (ЖХ/МС).
Масс-спектрометрия наиболее полно реализована в технологии MALDI-TOF.
MALDI (МАЛДИ, матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация)
представляет собой “мягкий” способ ионизации твердого вещества, обусловленный
воздействием лазерного излучения на смесь матрицы с анализируемым веществом.
Иными словами, МАЛДИ - это система получения ионов из твердой фазы.
Вспомогательная матрица снижает разрушительные свойства лазерного излучения,
что обеспечивает ионизацию крупных биомолекул без деградации.
TOF (Time of Flight) – это принцип работы анализатора масс-спектрометра,
заключающийся в разделении ионов в вакууме и фиксации времени пролета ионов в
зависимости от их массы (измерение скорости дрейфа частиц в специальной трубе).
Метод фиксирует время пролета заряженными частицами конкретного расстояния и
разделяет ионы по этому признаку. Время пролета пропорционально отношению
массы частицы к ее заряду. Фиксируемые время-пролетные характеристики
неизвестных микроорганизмов сравниваются с имеющейся базой данных.
Преимущества метода масс-спектрометрии:
- быстрота проведения исследования;
- точность и достоверность результатов;
подключение
масс-спектрометра
к
автоматическим
системам
идентификации микроорганизмов;
226
- экстракция белков может быть проведена непосредственно на слайде;
- уверенность: одноразовые слайды исключают риск контаминации и не
требуют мытья;
- высокое разрешение: высокая воспроизводимость идентификации спектров
белков микроорганизмов в диапазоне более 10 кДа. Возможность сканирования
веществ массой до 500 кДа;
- база данных состоит из клинически значимых видов и более 25000
спектров. Надежная валидация с использованием Расширенного Классификатора
Спектров для достоверной идентификации. Для каждого вида в базе данных
получены спектры большого количества штаммов.
Метод позволяет проводить и субтипирование микроорганизмов.
Этапы масс-спектрометрического анализа:
- пробоподготовка (первичный посев клинического материала на
питательную среду);
- мягкая ионизация - MALDI;
- сортировка ионов по массам и по времени пролета (TOF);
- идентификация (Biotyper).
Возможности и преимущества метода MALDI:
- замена всех морфологических и биохимических методов идентификации;
- точность исследования приближается к 100%;
- одинаковая простота идентификации анаэробов и аэробов;
- возможность идентификации микобактерий и плесневых грибов в день
обнаружения роста.
Использование масс-спектрометрии в медицине:
- MALDI Biotyper - экспресс идентификация микроорганизмов;
- GENOLINK - генотипирование олигонуклеотидных полиморфизмов и
оценка качества олигонуклеотидов;
- CLINPROT - поиск пептидных маркеров заболевания (белковое
профилирование);
- ImagePrep - поиск молекулярных маркеров на гистологических срезах
(молекулярная гистология);
- ProteinScape – исследования в области протеомики.
Метод матрично-активированной лазерной десорбции / ионизации был
разработан для анализа высокомолекулярных соединений в 1985 г. немецкими
учеными Францем Хилленкампом и Михаелем Карасом. В этом методе в качестве
матрицы использовалось низкомолекулярное органическое соединение. Но для
ионизации белков они этот метод не применяли. Дело в том, что при массспектрометрическом методе анализируемая молекула ионизируется и переводится в
газовую фазу под действием лазера. Это воздействие приводит к разрушению таких
макромолекул как белки.
В 1985 г. Танака Коити запатентовал методику под названием SLD (soft laser
desorption) - мягкая лазерная десорбция для масс-спектрометрического анализа. Он
предложил использовать тонкий металлический порошок в глицерине в качестве
матрицы. В этом случае макромолекулярные аналиты ионизируются без разрушения
структуры самого вещества. В 1987 г. он доложил эту методику на ежегодной
конференции Японского масс-спектрометрического общества. С этого времени
соединений в середине 1980 гг.
• Разработчики - немецкие исследователи Франц Хилленкамп
227
и Михаель Карас.
методика была внедрена в клиническую микробиологию. В 2002 году Танака
• Внедрение в клиническую микробиологию – японский
Коити получил за свою разработку Нобелевскую премию по химии (рисунок 226).
исследователь Танака Коити – Нобелевская пренмия 2002 г.
б
в Карас
Танакаа Коити
Франц Хилленкамп
Михаель
Рисунок 226 – Разработчики метода матрично-активированной лазерной десорбции /
(1959)
(1936-2014)
(1952)
ионизации: а – Танака Коити (род. в 1959 г.); б – Франц Хилленкамп (1936-2014 гг.);
в – Михаель Карас (род. в 1952 г.). Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Сущность метода MALDI-TOF MS состоит в том, что с помощью лазерных
импульсов органическое вещество микроорганизмов превращается в заряженные
частицы – ионы (ионизация). При этом молекулы вспомогательного вещества
(матрицы) и изучаемого белка под воздействием лазера переходят в газовую фазу.
Под влиянием электрического поля ионы движутся от источника ионизации к
детектору с ускорением, обратно пропорциональным атомным массам. Затем
проводится сортировка ионов по массам (по отношению массы к заряду) и
построение масс-спектр-графика. Сопоставление полученного спектра с имеющейся
базой данных позволяет идентифицировать микроорганизмы. Идентификация
микроорганизмов учитывает уникальный для каждого вида микроорганизмов набор
белков – своеобразный “отпечаток пальца” (фингерпринтинг), “протеомная
дактилоскопия”. Определение спектра белков проводится для бактериальных клеток
из изолированной колонии с чашки первичного посева исследуемого материала.
Идентификация осуществляется в основном по рибосомальным белкам, которые
присутствуют во всех микроорганизмах. Принцип метода представлен на рисунке
227.
Время-пролетная масс-спектрометрия основана на измерении скорости
пролёта каждой частицы микроорганизма и выведении на экран результатов
“старта” и “финиша”. Вся процедура длится считанные секунды. Для молекул,
полученных от разных микроорганизмов, характеристики уже известны, и прибору
остаётся сравнить результаты с базой данных. Этот метод позволяет определять
больше 4 тысяч видов микроорганизмов.
228
Рисунок 227 – Принцип MALDI-TOF MS. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Методика идентификации микроорганизмов с помощью масс-спектрометрии
включает следующие этапы (рисунок 228):
1 этап: подготовка образца (смешивание материала из отдельной колонии с
раствором специальной матрицы на подложке масс-спектрометра). Время – 10-33
минуты. В качестве матрицы используют 2',5'-дигидроксибензойная кислота.
2 этап: идентификация (смесь помещают в прибор и подвергают воздействию
неносекундных лазерных импульсов) – сравнивание масс-спектра исследуемого
материала со спектрами из базы данных. Время – 12-43 минуты. За 1 загрузку
можно идентифицировать 192 образца.
Последовательность операций
Шаг 1
Выбор колонии и
нанесение ее
на подложку
Шаг 3
Добавление
матрицы
Шаг 2
Идентификация
по базе данных
Получение
масс-спектра
Рисунок 228 – Последовательность операций при масс-спектрометрии.
Заимствовано из Интернет-ресурсов.
229
Технология идентификации микроорганизмов методом MALDI-TOF
реализована в нескольких анализатора, в том числе в лабораторном комплексе Vitek
MS (БИОМЕРЬЕ, Франция). В этом анализаторе на идентификацию одного
микроорганизма требуется 2 минуты. Затраты по времени для подготовки 24
изолятов составляют 10 минут, для 96 изолятов – 33 минуты.
Совмещение анализаторов Vitek MS и Vitek 2 позволило компании
БИОМЕРЬЕ обеспечить решение двух задач – идентификации бактерий и
определения чувствительности микроорганизмов к антибиотикам.
Анализатор Vitek MS (рисунок 229) позволяет проводить идентификацию и
определение чувствительности культур к антибиотикам. Микроорганизмы
наносятся на слайд, добавляется матрикс и запускается анализ. За 1 загрузку
анализируется до 192 образцов.
Рисунок 229 - Анализатор Vitek MS. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Приборное оснащение микробиологических масс-спектрометрических
исследований постоянно совершенствуется. Например, времяпролетный МАЛДИ
масс-спектрометр Bruker Microflex LT представляет собой настольный вариант
для клинических лабораторий (рисунок 230).
Времяпролетный МАЛДИ массспектрометр Bruker Microflex LT
230
• Настольный массспектрометр для
проведения
исследований в
клинических
лабораториях.
Рисунок 230 – Времяпролетный масс-спектрометр Bruker Microflex LT.
Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Система MALDI Biotyper является революционной разработкой в области
микробиологии. Система за несколько секунд оценивает наличие уникального
набора белков неизвестного микроорганизма. Принцип Biotyper основан на
сопоставлении полученных масс-спектров рибосомальных белков с базой данных,
содержащей спектры большинства микроорганизмов. После нахождения
уникального набора масс-пиков программа выдает наиболее вероятный результат
(рисунок 231).
Система MAL
• Револ
облас
за нес
налич
белко
микро
• Систе
микро
спект
Рисунок 231 - Система MALDI Biotyper. Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Система идентификации микроорганизмов Axima@SARAMIS •
построена
Систе
на базе Maldi-Tof. Достоверный результат выдается за 2 минуты. Система обладает
полож
высокой воспроизводимостью результатов и позволяет значительно экономить
средства и время (рисунок 232).
гемок
жидки
231
Рисунок 232 - Система идентификации микроорганизмов Axima@SARAMIS.
Заимствовано из Интернет-ресурсов.
Таким образом, современные методы лабораторных микробиологических
исследований ориентированы на высокую чувствительность, воспроизводимость и
экономию времени и материалов.
232
Литусов Николай Васильевич
Методы исследования в медицинской бактериологии
Электронное учебное пособие