Universidad Mayor de San Simón Facultad de Ciencias y Tecnología Carrera Biología Práctica # 1 RELACIONES HÍDRICAS Informe de laboratorio de Fisiología Vegetal GRUPO 2 Suely Basto Samuel Caero Bany Gutierrez Cochabamba – Bolivia 12 de mayo de 2023 1. INTRODUCCIÓN En la mayoría de los ecosistemas terrestres la disponibilidad de agua es considerada el principal factor limitante de la fotosíntesis, del crecimiento y de la producción vegetal, donde el déficit hídrico influye sobre la distribución y la abundancia de muchas especies de plantas. Además, se sabe que las relaciones hídricas de las plantas y los cultivos se hallan estrechamente ligadas a las relaciones hídricas de las células que componen las mismas, ya que buena parte del agua se halla dentro de las células y estas constituyen el sitio donde se cumplen casi todos los procesos fisiológicos. A los fines inmediatos, podemos visualizar a la célula como un protoplasto, limitado por una membrana extensible (el plasmalema), alojado en un receptáculo relativamente rígido constituido por la pared celular (López, 2000). Al considerar las relaciones hídricas de una célula, es de primordial importancia conocer la dirección en que se puede esperar que se mueva el agua: de la célula al medio o a la inversa. Para poder predecir la dirección de movimiento del agua, es imprescindible conocer la energía libre del agua en los distintos puntos del sistema; ya que en estos sistemas el agua (y otras sustancias) se mueven siguiendo gradientes de energía libre o potencial químico. De esta forma se tiene que el potencial hídrico, también conocido como potencial de agua, es una medida de la energía libre o disponible para realizar trabajo que posee el agua en un sistema. Se utiliza para describir la disponibilidad de agua en diferentes condiciones y entornos, se compone de varios factores como el potencial gravitacional, el potencial de presión, el potencial osmótico y el potencial matricial (Taiz & Zeiger, 2007). Existen diversas formas para determinar el potencial hídrico, donde una de ellas es el método gravimétrico, la cual se basa en la medición de la masa de un producto para determinar la masa de un analito presente en la muestra, de esta forma las determinaciones gravimétricas se basan en mediciones reiteradas de masa y en cálculos de diferencia de masa (UBA, s.f.). Las moléculas de agua se encuentran en un movimiento continuo al azar. Como resultado las moléculas migran por difusión. La difusión es un proceso muy importante en los seres vivos y se puede definir como el movimiento neto de las moléculas de regiones de mayor potencial a regiones de menor potencial hasta alcanzar una condición de equilibrio (Arntzen, 2014). Donde la plasmólisis es el fenómeno que se produce en las células vegetales por la semipermeabilidad de la membrana plasmática y la permeabilidad de la pared celular. Se produce cuando la células son sometidas a medios hipertónicos (con una concentración de solutos mayor que la contenida en el interior de la célula) el agua en la vacuola sale al medio exterior, la célula se deshidrata reduciendo su tamaño y la membrana plasmática se separa de la pared. En este proceso es posible determinar el potencial osmótico en una célula vegetal (Melgarejo et. al., 2010). En el laboratorio se estudiarán las relaciones hídricas en dos tipos de tejidos vegetales (papa y cebolla) para poder determinar el potencial hídrico y osmótico de forma experimental y de esta forma verificar el rol importante que desempeña el agua y el gradiente de potencial hídrico en el funcionamiento de estos vegetales. 2. OBJETIVOS Experimento 1: Determinación del Potencial Hídrico por el método Gravimétrico. ● Manejar una técnica que permita determinar el potencial hídrico de un tejido ● Calcular el potencial hídrico por medio de una gráfica con valores gravimétricos. Experimento 2: Determinación del Potencial Osmótico en catáfilo de cebolla (Allium cepa) ● Determinar el potencial osmótico de un tejido vegetal. 3. MATERIALES Experimento 1: Determinación del Potencial Hídrico por el método Gravimétrico. ● ● ● ● ● ● ● ● ● Tubérculo de papa. Cuchillo o bisturí. Sacabocados de 7 a 10 mm. Regla milimetrada. 7 cápsulas Petri o vasos de pp de 100 ml. Agua destilada. Solución de sacarosa del 0.15 a 0.40 M. Balanza. 8 pipetas de 10 ml. Experimento 2: Determinación del Potencial Osmótico en catáfilo de cebolla (Allium cepa) ● 7 tubos de ensayo. ● 7 cápsulas Petri chicas. ● 1 gradilla. ● Solución de sacarosa 1 M ● 7 portaobjetos. ● 7 cubreobjetos ● 2 microscopios. ● Pipetas de 2 y 10 ml. ● 7 goteros. ● 1 cebolla morada. ● 1 pinza. ● 1 aguja de disección. ● 1 hoja de bisturí. ● Papel toalla. 4. PROCEDIMIENTO (Idem guia) Experimento 1: Determinación del Potencial Hídrico por el método Gravimétrico. Se realizaron preparaciones de soluciones a diferentes concentraciones (Figura 1 y 2): 1. Enumerar las cápsulas de Petri y agregar 10 ml de las soluciones preparadas: 1.1. Agua destilada. 1.2. Solución de Sacarosa 0.15 M. 1.3. Solución de Sacarosa 0.20 M. 1.4. Solución de Sacarosa 0.25 M. 1.5. Solución de Sacarosa 0.30 M. 1.6. Solución de Sacarosa 0.35 M. 1.7. Solución de Sacarosa 0.40 M. Figura 1. Procedimiento del preparado de las soluciones para la obtención de la solución con la concentración respectiva. Figura 2. Soluciones de sacarosa a diferentes concentraciones 2. Con la ayuda de un sacabocados se obtienen 7 cilindros de una sola papa con un tamaño de 3 cm de largo. Se realiza un enjuague rápidamente con agua normal y se las seca con papel. Posteriormente se procede a pesar de forma individual (Figura 3). Se registró el peso de cada uno de los cilindros en el momento. Figura 3. Obtención y pesaje de los 7 cilindros (de 3 cm de largo) obtenidos 3. Se hizo el uso de tubos de ensayos, una vez fueron rotulados con las concentraciones respectivas. Se procede a añadir a cada tubo de ensayo 10 ml de la solución concentrada respectiva de sacarosa. Posteriormente se deposita cada uno de los cilindros de papa (Figura 4). Para finalizar , se cubre con papel estañado la parte superior de los tubos. Figura 4. Muestras preparadas con las diferentes concentraciones de sacarosa y el cilindro de papa en el interior 4. Pasadas las 48 horas de reposo aproximadamente de los cilindros de papa en las respectivas soluciones, se extrajo cuidadosamente el cilindro de papa de cada una de las soluciones haciendo uso de una pinza, se realizó un rápido secado y nuevamente se procedió a pesar, registrando el peso obtenido (peso final) (Figura 5). Figura 5. Pesaje final de las muestras Experimento 2: Determinación del Potencial Osmótico en catáfilo de cebolla (Allium cepa) 1. 2. 3. Se prepararon siete soluciones con las siguientes concentraciones de sacarosa: 0.0 M, 0.2 M, 0.3 M, 0.4 M, 0.5 M, 0.6 M, 0.8 M (Figura 1). Se procedió a poner parte la solución (de cada una de las concentraciones) en cajas Petri respectivamente rotuladas con su respectiva concentración. Con la ayuda de una pinza se introdujo un trozo de epidermis de catáfilo de cebolla morada en cada una de las cajas petri y se dejó reposar durante 20 min en sus respectivas soluciones (Figura 6). Figura 6. Cajas petri con soluciones a diferentes concentraciones rotuladas con su respectivo catafilo de cebolla. 4. Se rotuló el portaobjetos para cada una de las concentraciones respectivas. Pasados los 20 minutos de inmersión se realizó la toma de una gota de una de las soluciones para posicionarla sobre el portaobjetos, seguidamente se extrajo cuidadosamente el tejido vegetal de la solución concentrada y se extendió cuidadosamente sobre el portaobjetos correspondiente (Figura 7). Se repitió este procedimiento para cada una de las siete muestras. Figura 7. Toma de muestra de catafilo de cebolla y preparación de portaobjetos. 5. RESULTADOS Experimento 1: Determinación del Potencial Hídrico por el método Gravimétrico. Se obtuvieron los resultados mostrados en la Tabla 1 y con los datos obtenidos se graficó la variación de peso del tejido en función de la concentración como se muestra en la Figura 8. Tabla 1. Variación del peso de la papa en diferentes concentraciones de sacarosa. Molaridad Peso inicial Peso 24 [h] Pinicial-Pfinal 0.00 0.90 0.71 0.19 0.15 0.87 0.68 0.19 0.20 1.00 0.77 0.23 0.25 0.92 0.76 0.16 0.30 0.95 0.76 0.19 0.35 0.92 0.72 0.20 0.40 0.98 0.75 0.23 Figura 8. Gráfica de las variaciones de peso del tejido por cambios osmóticos. El dato que más se aproxima a cero (0.16) es con la concentración 0.25 M, lo que indica que el medio es aproximadamente isotónico y con este dato se determinó el potencial hídrico de las células de la papa: Experimento 2: Determinación del Potencial Osmótico en catáfilo de cebolla (Allium cepa) En el laboratorio se observaron los catáfilos de la cebolla en el microscopio con un aumento de 400x como se muestra en la Figura 9, donde se observa que a una concentración baja de 0.3 M (Figura 9A) las células coloreadas no presentan plasmólisis (no existe reducción del tamaño de las células), por otro lado con una concentración de 0.5 M (Figura 9B), se evidencia plasmólisis en la mayoría de las células (contenido celular reducido respecto a la pared celular) y a una concentración de 0.8 M (Figura 9C), todas las células se encuentran plasmolizadas (células bastante deshidratadas). Todos los resultados obtenidos se resumen en la Tabla 2. Posteriormente, con los datos de la Tabla 2 se obtuvo la gráfica de las variaciones del porcentaje de células plasmolizadas en las diferentes concentraciones de sacarosa como se observa en la Figura 10, en la cual cabe destacar que existe un cambio abrupto del porcentaje de células plasmolizadas de 0% a 60%. Figura 9A Concentración 0.3 M Figura 9B Concentración 0.5 M Figura 9C Concentración 0.8 M Figura 9. Catáfilos de cebolla observados en el microscopio con concentraciones de sacarosa 0.3 M, 0.5 M y 0.8 M. Tabla 2. Células plasmolizadas en el catáfilo de cebolla a diferentes concentraciones de sacarosa. Concentración de Sacarosa (M) Total de células con color observadas Células plasmolizadas (N°) Células plasmolizadas (%) 0.00 26 0 0 0.20 29 0 0 0.30 25 0 0 0.40 28 0 0 0.50 30 18 60 0.60 27 22 81 0.80 35 35 100 Figura 10. Gráfica de las variaciones de peso del tejido por cambios osmóticos. Como se observa en la Figura anterior, existe plasmólisis a una concentración 0.5 M, por lo cual se consideró este valor para determinar el potencial osmótico de las células del catáfilo de la cebolla: 6. DISCUSIÓN Para medir el potencial hídrico existen varios métodos, siendo uno de los más accesibles la medición de las variaciones de peso o volumen en un tejido u órgano determinado, colocándolos en soluciones con diferentes concentraciones de solutos que ayuden a establecer condiciones de hiper, iso e hipotonicidad donde lo que se busca es una condición isotónica, es decir, aquella donde la concentración externa e interna sean aproximadamente iguales. Una vez transformadas las concentraciones a unidades de potencial hídrico mediante la ecuación de Van't Hoff se obtendrá el del tejido en cuestión. Se infiere que la condición isotónica corresponderá aquella donde no haya cambio de estas variables, es decir ganancia o pérdida neta de agua (Azcón-Bieto & Talón, 2000). Esto se realizó en el laboratorio ya que se sometió a los cilindros de papa a diferentes concentraciones de sacarosa, donde se observó que existe un cambio casi nulo en el peso a una concentración 0.25 M. Sin embargo, comparando los resultados obtenidos en el laboratorio (Figura 8) con el trabajo realizado por Urdaneta (2020) (Figura 11) se aprecia un comportamiento atípico en los datos obtenidos, ya que la difusión de un solvente sucede siempre de mayor a menor potencial químico y está determinado por el aumento o la disminución de la presión osmótica asociado directamente con el aumento o disminución en la concentración de solutos, entonces a mayor concentración de solutos, menor es el potencial osmótico (Arntzen, 2014). De esta forma en concentraciones hipotónicas las células de la papa absorben agua y la diferencia de peso es mayor, sin embargo a concentraciones hipertónicas, el medio absorbe el agua de las células de la papa y la variación de peso se vuelve negativa. Las diferencias observadas en el laboratorio pueden deberse a errores en la manipulación de los cilindros de papa, o en el preparado de las soluciones. A pesar de lo previamente mencionado, se pudo hacer un estimado de la concentración en la que existe menor variación en el peso de los cilindros de papa (solución 0.25 M) y con este dato se determinó que el potencial hídrico de las células de la papa es igual a -6.11 [atm] = -0.62 [MPa] a una temperatura de 25°C aproximadamente, lo cual es un valor muy similar al obtenido por Urdaneta (2020), que determinó que a una concentración de 0.22 M no existe una variación en el peso, obteniendo un potencial hídrico igual a -0.53 [MPa], a una temperatura de 23°C. Figura 11. Variación del peso de discos de papa en diferentes concentraciones de sacarosa. Recuperado de: Urdaneta (2020). Por otro lado, se sabe que los fenómenos de plasmólisis se pueden estudiar en el laboratorio simplemente sometiendo los tejidos a soluciones hiperosmóticas y observando al microscopio cambios en el volumen del protoplasto (Serrano, 2000). Azcón-Bieto & Talón (2008) indican que al estar en una solución hipertónica se presenta el fenómeno de plasmólisis y a medida que progresa la plasmólisis, el volumen del protoplasto disminuye, los plasmodesmos se rompen y el protoplasto se separa de la pared celular. El espacio existente entre la superficie externa del protoplasto (membrana plasmática) y la pared celular se llena con la solución externa que fácilmente penetra la pared celular. Por esta razón, normalmente, la plasmólisis no origina sobre el protoplasto una presión negativa (o tensión) elevada. La plasmólisis constituye, esencialmente, un fenómeno de laboratorio y con la posible excepción de condiciones extremas de déficit hídrico o de salinidad, rara vez se presenta en la naturaleza (Gabriel et al. 2011). Esto se pudo observar en el laboratorio ya que en una solución de sacarosa concentrada (0.5 M) se pudo observar cómo el volúmen del protoplasto de las células coloreadas (moradas) disminuye y se distingue la pared celular, lo cual no era visible a simple vista en una solución hipotónica (0.1 M, 0.2 M, 0.3 M o 0.4 M) y es aún más notorio en la concentración hipertónica (0.8 M) donde existe un 100% de células plasmolizadas y el protoplasto es aún más reducido que con la solución 0.5 M (las células se encuentran deshidratadas) (Figura 9). En el trabajo de Navarro & Sternlieb (2012) se obtuvo que a una concentración 0.4 M existe un 62% de células plasmolizadas, mientras que en el laboratorio se determinó que a una concentración 0.5 M existe un 60% de células plasmolizadas, esta diferencia puede estar dada posiblemente por errores experimentales como un tiempo muy corto de sumergido de las células en las soluciones o una incorrecta homogeneización de las soluciones, o por factores ambientales como la temperatura. Además, se verifica el estado de plasmólisis tras comparar los resultados obtenidos en el laboratorio con los observados en una Elodea sp. como se muestra en la Figura 12, donde en ambas imágenes se aprecia la disminución del volumen del contenido celular. Allium cepa Elodea sp. Figura 12. Células plasmolizadas de Allium cepa observadas en laboratorio en comparación a células Elodea sp. plasmolizadas tras haber sido sumergidas en una solución concentrada de sacarosa. Elaborado a partir de: Biology of plants. Peter H. Raven, Ray F. Evert, Susan E. Eichhorn.. Freeman and Company Worth Publishers. 1999. 7. CONCLUSIONES Experimento 1: Determinación del Potencial Hídrico por el método Gravimétrico. Se determinó el potencial hídrico usando el método gravimétrico, mediante el cual se analizó el cambio de peso de discos de papa a temperatura ambiente, en diferentes concentraciones de sacarosa, determinando que a una concentración 0.25 M, no existe mucha variación en el peso inicial y final (lo que indica que el medio es aproximadamente isotónico) y se determinó que el potencial hídrico de las células de la papa es igual a -6.11 [atm]. Sin embargo, no se pudo obtener una gráfica de las variaciones de peso del tejido por cambios osmóticos adecuada por errores experimentales. Experimento 2: Determinación del Potencial Osmótico en catáfilo de cebolla (Allium cepa) En el caso de la cebolla morada (Allium cepa), a pesar de que presenta sus propios colorantes que le otorgan esa coloración morada, no en todas las muestras se pudo observar un buen número de células coloreadas para poder llegar a determinar el porcentaje de células plasmolizadas en las concentraciones hipertónicas. Se pudo identificar el estado de plasmólisis cuando el contenido del protoplasto se notaba claramente reducido y se podía apreciar la pared celular, lo cual sucedió desde una concentración 0.5 M, valor que se empleó para determinar el potencial osmótico = -12.22 [atm]. BIBLIOGRAFÍA ● Arntzen, D. (2014). Agua. Guía de Estudio. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales y Agrimensura UNNE. Cátedra de Fisiología Vegetal. Recuperado de: https://exa.unne.edu.ar/biologia/fisiologia.vegetal/guiadeestudio-Impdelaguaymedpotenci alhidrico.pdf ● Azcón-Bieto, J. & Talón. M. (2008). 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Rep. 7, srep43461 CUESTIONARIO 1. ¿Cuál es el PO de la solución en la que se mantiene el peso del tejido? Explique por qué se tomó este valor como el Potencial Hídrico del tejido problema (papa) de las soluciones cuando se colocan en los vasos ¿Y en el equilibrio? Expresar lo mismo en términos de potenciales (Ver Diagrama de Hofler). El potencial osmótico de la solución en la que aproximadamente se mantiene el peso del tejido (0.16) es -6.11 [atm]. Este valor se tomó como potencial hídrico de la papa debido a que cuando una célula se encuentra en un medio isotónico, se tiene un equilibrio con el medio donde se igualan los potenciales hídricos tanto dentro como fuera de la célula. Esto se respalda con lo planteado por el diagrama de Hoffler, el cual describe la relación entre el potencial hídrico y sus dos componentes principales respecto al contenido relativo de agua de la célula o el volumen celular relativo. Partiendo de un tejido completamente hidratado, en la medida que éste pierde agua, el potencial de presión (Ψp) se va reduciendo hasta hacerse cero. Ese punto corresponde al punto de pérdida de turgor. Por debajo de ese punto, el potencial hídrico (Ψ) es igual al potencial osmótico (Ψo). Figura 13. Diagrama de Hofler. Recuperado de: https://sebapereyra.wixsite.com/lfv-aulavirtual/potencialagua 2. Buscar antecedentes acerca del potencial osmótico de tejidos vegetales. ¿En qué rango se ubican la mayoría de dichos valores? Del tomate potencial osmótico: -0,23 y -1,03 MPa (Zhang et. al., 2017). El potencial hídrico del xilema y corteza calculado mediante el método gravimétrico en D. carota son respectivamente -0,98 y -1.00 MPa. Los potenciales hídricos de la hoja y raíz de P. vulgaris calculados a partir de método densitométrico de Chardakov son -0,19 ± 0,02 y -0,14 ± 0,02 MPa respectivamente. Por su parte el potencial osmótico calculado para las hojas fue de -0,86 ± 0,53 MPa. (Azcón-Bieto & Talón, 2008). 3. Si tuviese que determinar el potencial osmótico de una planta de agua dulce como la Elodea ¿Qué esperaría encontrar y por qué? En este caso, al sumergir una pequeña parte del tejido vegetal en una solución hipertónica, la mayor parte de las células entrarán en plasmólisis, mientras que el caso de que si se introducen en una disolución hipotónica pocas o ninguna de las células entrarán en plasmólisis. Al ser la Elodea una planta de agua dulce, se esperaría tener un potencial osmótico menor al obtenido en la células de catáfilo de cebolla debido a que la Elodea tiene mecanismos que le permiten soportar concentraciones mayores de azúcar en el medio. 4. Si tuviese que hacer la misma determinación en remolacha ¿Qué esperaría encontrar y por qué? En el caso de la remolacha se podría observar un comportamiento opuesto, debido a que sus células cuentan con altas concentraciones de azúcares, lo cual le hace más propensa a sufrir plasmólisis en concentraciones más bajas de sacarosa del medio.
