Глава 1.
Ферментативный катализ и ферментативная кинетика
Предмет и задачи курса. Строение белков.
1.1.1.
Предмет
и
задачи
ферментного
катализа
и
инженерной
энзимологии.
Энзимология или ферментология это наука об энзимах (ферментах) –
биологических катализаторах белковой природы, которая образуются живыми
клетками и обладают способностью изменять состав, состояние и свойства
химических и биохимических соединений. Энзим от греческого «эн зюме» в
дрожжах; фермент от латинского fermentium –«закваска».
Ферменты (энзимы) – рабочий аппарат, катализирующие тысячи и тысячи
химических реакций, из которых, в конечном счете, формируется метаболизм
клетки и организма в целом.
Помимо того, что ферменты представляют большой интерес для биологов,
для
медицины
и
т.д.,
как
инструмент
для
понимания
процессов
жизнедеятельности живых структур и организмов, они имеют большое
практическое значение. Многие отрасли промышленности – производство
пищевых продуктов (вино, пиво, молочные изделия, хлеб и т.д.), лекарственных
препаратов основаны на применении различных ферментных процессов.
Несмотря на то, что человек использовал ферментные процессы уже на заре
цивилизации, экспериментальное изучение ферментативных процессов началось
лишь в XVIII в, когда ученые Реомюр и Спалланциани описали свои опыты по
перевариванию мяса в желудке птиц. Мясо, вынутое из желудка птиц, оказалось
полностью растворенным через несколько часов под действием пищеварительных
соков.
Однако, первое такое химическое исследование ферментативного процесса
было осуществлено в конце XVIII в Лавуазье и Гей-Люсссака описавшие впервые
баланс продуктов спиртового брожения.
1
Позднее Кирхгоф экспериментально показал, что в вытяжке проросшего
семени ячменя содержится вещество, превращающее крахмал в сахар, т.е.
Кирхгоф впервые получил ферментный препарат амилазу. Пастер и Персо
выделили этот фермент виде порошка.
Л. Пастер в своих знаменитых работах посвященных природе брожения
высказал мысль о том, что брожение может быть вызвано только живыми
существами. В этом плане важным в истории изучение ферментов явилось
открытие Бухнера, которому удалось получить дрожжевой сок вызывающий
брожение. Т.о. было показано, что ферменты могут функционировать независимо
от клеточной структуры. Наконец, Самнер получил фермент уреазу из семян в
кристаллическом виде и показал, что это есть белки. Он также высказал мнение,
что все ферменты представляют собой белок. Эта точка зрения в дальнейшем
была подтверждена Нортроном, получившим кристаллы пепсина, трипсина и
химотрипсина.
Исследование
Сенгера,
разработавшего
методы
расшифровки
последовательности аминокислот в белках (расшифровка инсулина), позволили
выяснить строение ряда ферментов. Этому способствовали использование метода
рентгеноструктурного анализа. На основании данных о молекулярной структуре
белков в 1969 году был впервые осуществлен химический синтез фермента
рибонуклеазы.
В
последние
годы
выяснены
молекулярные
механизмы
ферментативного синтеза биополимеров.
В настоящее время бурное развитие получила инженерная (прикладная)
энзимология. Это новое научно-техническое направление основная задача,
которой получение и исследование биоорганических катализаторов с заданными
свойствами на основе ферментов, полиферментных комплексов, и клеток,
выделенных из биологических систем.
Инженерная энзимология основывается на таких разделах естествознания как
биохимия, микробиология, химическая технология, химия, физика и т.д.
2
Современная
инженерная
энзимология
базируется
на
применении
ферментов, ферментных систем и клеток в иммобилизованном виде. Дело в том,
что широкое применение ферментов на практике удерживалось рядом причин:
а) трудоемкостью выделения и отчистки ферментов до и после процесса;
б) неустойчивость ферментов при хранении и действии различных
технологических параметров (факторов);
в) иногда токсичность и не токсичность (для медицины).
Настойчивые работы и парный анализ привел ученых к выводу о том, что в
значительной
мере
перечисленные
недостатки
можно
устранить,
если
использовать не нативные ферменты или клетки, а их иммобилизованные
производные, сохраняющие все специфические свойства катализатора, но
отличающиеся
от
него
стабильностью,
не
токсичностью,
имеющей
подверженностью действию внешних факторов.
Иммобилизация ферментов и клеток – это перевод их в фиксированное на
или
в
носителе
состояние,
с
сохранением
максимально
возможной
каталитической активности.
Основные направления, которыми занимается инженерная энзимология
следующие:
1. Синтез и модификация органических соединений. Это направление решает
задачи, связанные с реализацией каталитического потенциала ферментов или
ферментной
системы
для
проведения
точного
органического
синтеза
необходимых человеку химических соединений (получение аминокислот,
антибиотиков и д.р.).
2. Биоконверсия растительного сырья.
а) получение глюкозы из отходов промышленности и с/х;
б) предварительный гидролиз растительной биомассы для повышения ее
питательности;
в) ферментативная или клеточная деструкция лигнина для получения
продуктов полимерной химии;
3
г) переработка отходов мясной и молочной промышленности;
3. Разработка высокоэффективных биосенсоров для тонкого физикохимического анализа и контроля.
4. Переработка продукции агропромышленного комплекса.
а) улучшение качества мясопродуктов;
б) увеличение эффективности переработки молока, и получение новых
продуктов;
в) улучшение качества пищевых продуктов (осветление пива, соков, вина);
г) переработка кожи животных;
5. Биологическая очистка сточных вод промышленных предприятий
6. Создание медицинских препаратов на основе иммобилизованных лекарств.
1.1.2. Первичная структура белка
В связи с тем, что ферменты в основе являются белковыми веществами, нам
следует рассмотреть строение и свойства белков. В состав всех известных белков
входит углевод, водород, азот и кислород. Очень часто присутствует сера. В
некоторых белках, помимо выше названных элементов, присутствуют фосфор,
цинк, железа, медь. Белки обладают очень большими молекулярным весом,
поэтому их называют макромолекулами. Макромолекула белка состоит из одной
или нескольких полипептидных цепей, построенных из аминокислотных
остатков. Аминокислотные остатки, последовательно соединенные друг с другом
являются
главными
компонентами
белка.
Химическая
формула
белка,
изображаемая в виде линейной последовательности аминокислотных остатков
описывает первичную структуру белка. Каждый аминокислотный остаток имеет
одинаковую для всех остатков часть, и за исключением 2-х концевых остатков,
связан двумя соседними таким образом, что формируется непрерывная,
неразветвленная цепь. Эта цепь называется основной цепью белковой молекулы.
К каждому α–углероду основной цепи присоединены вариабельные части
аминокислотных остатков (боковые или R–группы).
4
В качестве строительных блоков в белках встречаются 20 аминокислот. С
учетом заряда боковых групп все аминокислоты можно разделить на три группы:
Полярные: Лизин, Аргинин, Гистидин, Аспарагиновая кислота, Глутаминовая
кислота, Аспартин, Глутамин, Серин, Треонин. Неполярные: Фенилаланин,
Триптофан, Тирозин (ароматические), Метионин, Цистеин (серосодержащие),
Аланин, Лейцин, Валин, Изолейцин, Пролин (алифатические). Нейтральная –
Глицин
Свободная аминокислота отличается от аминокислотного остатка наличием
дополнительного атома водорода на одном конце (присутствие аминогруппы
NH2) и дополнительной гидрооксильной группы – ОН на другом конце (рис 1.1.).
Как видно аминокислоты располагаются таким образом, что конец одной
аминокислоты связан с началом другой пептидной связью. Эта связь образуется в
5
результате реакции между аминогруппой одной свободной аминокислоты и
карбоксильной
группой
другой,
или
между
аминогруппой
свободной
аминокислоты и карбоксильными концом полипептида. При этом выделяется
вода. Т.е. свободные аминокислоты представляют собой мономеры, из которых
путем конденсации строится молекула полимер белка. И полипептидная связь
синтезируется в результате повторяющихся актов образования пептидной связи.
На одном конце находится свободная - NH2 группа (N – конец), а на другом –
свободная – СООН – группа (С-конец) (Рис.1.2).
Обычно в белковых молекулах насчитывается 40 и более остатков, хотя
встречаются молекулы с 1000 и более остатками. Различные аминокислотные
остатки представлены в белках с различными частотами. К наиболее редким
остаткам относятся триптофан, метионин, цистин, к частым – аланин, серин,
глицин.
Значительная
вариабельность
последовательностей
обеспечивает
большое разнообразие структур и функций белков. Давайте сделаем небольшой
расчет. Предположим, что белок содержит 100 остатков. С учетом количества
аминокислот (20) для этого белка возможем 20100 различных вариантов
последовательности. Т.е. может быть построено 10130 белков с различными
свойствами.
6
Следует отметить, что кроме выше рассмотренных обычных и несколько
редких аминокислот, входящих в состав белков, существуют более 150 других
аминокислот, встречающихся во многих клетках и тканях как в свободном так и в
связанном состоянии, но не являющихся составными частями белков. В основном
это производные α – аминокислот, но встречаются и β, γ, δ аминокислоты. Часть
этих аминокислот играют роль предшественников или промежуточных продуктов
метаболизма (β – аланин, цитруллин), а другие являются химическими агентами
при передачи нервных импульсов (γ - аминомасляная кислота).
Ряд аминокислот, выделенных из растений токсичны для животных
(канаванин, β-цианоаланин).
Как мы с вами уже выяснили под первичной структурой белка понимают
последовательность
аминокислотных
остатков
в
полипептидной
цепи.
Существуют специальные методы расшифровки первичной структуры, которых
вы знаете из курса биохимии.
Один из этих методов основан на тем, что если кипятить полипептид или
белок с кислотой, то происходит гидролиз белка и он распадается на
аминокислоты.
Если
перед
гидролизом
обработать
белок
веществами
реагирующие со свободной концевой аминогруппой белка и образующий в ней
прочную связь, то после гидролиза мы можем определить какая кислота была N концевой и количество. Для этой цели применяют динитрофторбензол.
Второй, более удобный метод идентификации N – концевых аминокислот
основан
на
применении
фенилизотиционата.
Этот
реактив
образует
фенилкарбомоилпроизводные пептида. При обработки такого пептида слабой
кислотой
происходит
его
полимеризация
?
с
образованием
фенилтиогидантоипового производного NH2 - концевой аминокислоты. Это
производное отщепляется и пептид укорачивается на один остаток. Причем
производные можно идентифицирова хром. методом. Оставшийся пептид можно
выделить в неповрежденном виде и подвергнуть новому циклу обработки, для
следующей за NH2 – концом аминокислоты и т.д.
7
С – концевые аминокислоты идентифицируются при помощи фермента
карбоксипептидазы. Этот фермент специфически разрывает пептидную связь,
соединяющую
С-концевой
Использованием
остаток
приведенных
со
методов,
следующим
наряду
остатком
со
пептида.
специфическими
протеолитическими ферментами позволяют расшифровать аминокислотную
последовательность.
1.1.3. Основы термодинамики. Типы связей в белках и энергетика.
Прежде чем перейти к рассмотрению конформации пептидов давайте с вами
вспомним
основные
понятия,
связанные
с
энергией
и
типы
связей
присутствующие в биологических макромолекулах.
Свободная энергия (G) эта та часть внутренней энергии химической системы,
за счет которой может совершаться работы над окружающей средой. По
изменению свободной энергии ΔG можно судить о работоспособности системы.
Если ΔG < 0 – система совершает работу самопроизвольно
ΔG > 0 – нужен дополнительный приток энергии
ΔG = 0 – состояние термодинамического равновесия
Размерность ΔG Дж/моль, кДж/моль
Связывающая энергия не может быть использована для совершения работы и
определяется энтроной ТΔS мерой неупорядоченности системы.
Энтрольпия (ОН) изменение потенциальной энергии рассматриваемой
системы и связан с энергетическим состоянием молекул в данной химической
системе.
Т.о. по разнице между приростом энтальпии (ΔН) и энтропии (ТΔS) можно
судить о направлении и характере реакции
ΔG = ΔН - ТΔS
Стандартное изменение свободной энергии (ΔG0) – это изменение свободной
энергии реакции, до начала которой все исходные реагирующие вещества
находятся в своих стандартных состояниях – значениях t0, h и с. причем
8
концентрации одинаковы и равны 1 мольл-1. ΔG0 и константа равновесии
реакции связаны между собой.
Для реакции типа АВ, константа равновесия которой
([A] и [B] равновесные концентрации)
(1)
если же система не находится в равновесии то
(2)
В этом случае конец А и В не являются равновесными. При достижении
своих равновесных значений ΔG = 0 и (2) перейдет в (1).
В биохимии чаще пользуются величиной ΔG0 . Почему? Мы с вами выше
отметили, что реагирующие вещества до начала реакции должны иметь
концентрацию 1 мольл-1. значит, если в реакции участвуют ионы Н+, то и их
концентрация должна быть равна 1 мольл-1. Тогда [Н+] = 1 = 100, т.е. рН = 0. но
такое значение рН не физиологическое. Большинство биохимических реакций
происходят при рН= 7,0. поэтому биохимия и пользуются ΔG0, где концентрация
ионов Н+ принимается равной 10-7 мольл-1 (рН=7), а остальные параметры
находятся в своих стандартных условиях.
Тогда
Ковалентная связь – это химическая связь между атомами в молекуле
(сильные взаимодействия). Связывание осуществляется путем обобществления
электронов, принадлежащих к одному или нескольким атомам. Это очень
сильные связи (ΔG≈-400кДж/моль). Такие взаимодействия определяют ценное
строение полипептида – пептидная связь – которую мы рассмотрели выше.
Еще один вид ковалентной связи, который встречается в белках –
дисульфидные связи (дисульфидный мостик). Который соединяет 2 части одной и
той же полипептидной цепи, либо 2 разных полипептида. Этот мостик образуется
9
при окислении 2-х остатков цистина (т.е. при отщеплении водорода от 2-х
реакционно-способных сульфидигидрильных групп – Sn).
Дисульфидные связи разрываются при восстановлении. Эти связи имеют
большое значение для активности ферментов. Образование их в не тех местах, где
они были в нативном разрыв этих связей приводит с полной потере активности
ферментов.
Водородные связи. При связывании атома водорода с электроотрицательным
атомом кислорода или азота происходит смещение электронов, приводящее к
появлению дробного положительного заряда на атоме водорода и дробного
отрицательного заряда на его партнере. При этом образуется электрический
диполь, который может взаимодействовать с другими диполями. Связь такого
типа называется водородной.
Другими
акцепторные
словами
водородные
взаимодействия,
связи,
создаваемые
это
специфические
ковалентно
связаным
донорноатомом
водорода в группах О – Н, N – Н, F – H, CL – H иногда в S – H. водород связывает
эти группы с ковалентно-связанными атомами О, N, F.
Водородные связи определяют строение и свойства воды, играют важную
роль в формировании структуры биополимеров.
Ван-дер-Ваальсовые силы способствуют притягиванию атомов друг к другу.
Взаимное притяжение возникает чаще из-за наличия взаимодействий между
флуктуирующими (колеблющиеся) электрическими диполями, образуемыми
электронным облаком и положительным зарядом каждого атома. Но два атома
могут сближаться лишь до тех пор, пока их электронные облака не начнут
перекрываться; большее сближение приводит уже к возникновению сильного
отталкивания, т.е. наблюдается конкуренция 2-х взаимно противоположных
эффекта, при котором существует какое-то оптимальное (равновесное) расстояние
между 2-я атомами. Это приводит к понятию эффективного радиуса атома,
которое называется вандерваальсовым.
10
Ионная связь (солевой мостик) образуется при сильном сближении (0,3 нм)
2-х атомов с разноименными зарядами из основной и кислотной групп белка.
Например в белковой молекуле группа СОО- боковой цепи остатка глутаминовой
кислоты и группа NH3+ боковой цепи остатка лизина могут взаимодействовать
между собой как низкомолекулярные ионы соли, образуя солевые мостики.
Гидрофобные
взаимодействия
наиболее
слабые.
Так
называют
взаимодействие и сближения неполярных частей полипептидных цепочек,
которые сопровождается ослаблением их взаимодействия с водой. Т.е.
неполярные группы имеют тенденцию ассоциироваться друг с другом, чтобы
избежать контакта с водой. В результате этого вода как бы выталкивается из
места возникновения гидрофобных взаимодействий, нарушается структура воды,
и электронная система возрастает. Способность к гидрофобным взаимодействиям
обладают остатки боковых ароматических и алифатических аминокислот в
белках. Как и предыдущее нековалентные взаимодействие, гидрофобные эффекты
играют важную роль в создании и стабилизации специфической структуры белка,
а фермента.
1.1.4. Конформация пептидов. Вторичная структура белков
Теперь, после того как мы с вами познакомились с основными типами связей
и взаимодействий существующих в макромолекулах, перейдем к рассмотрению
возможных конформаций полипептидной цепи.
Конформацией
молекулы
называется
возможные
пространственные
расположения атомов составляющих молекулу, получаемые один из другого
вращением вокруг одинарных ковалентных связей. Конфигурация это такие
варианты взаимного расположения атомов молекулы, переходы между которыми
сопровождаются разрывом и образованием ковалентных связей.
Давайте вспомним, что такое пептидная связь?
Это связь между С=О группой одного остатка и N – H группой второго
остатка.
11
На первый взгляд связь С – N одинарная и возможны варианты вращения
вокруг этой связи. Однако, рентгенографические исследования пептидов
показали, что длина связи С – N меньше величины 0,147 нм характерной для
одиночной связи и равна 0,132 нм, что ближе к величине 0,125 нм характерной
для длины обычной двойной связи С = N.
Дело в том, что неделимая пара электронов атома азота обобществляется
между С и N давая примесь двойной связи между ними. При этом электрон С
выталкивается из двойной связи С=О и локализуется на атоме О, частично
превращая связь С=О в одиночную.
Таким образом, между атомами N, С, О происходит делокализация
электронов. Вследствие этого перераспределение атомов О, С, N, Н (пептидная
группа) и связанные с ним ковалентно два СХ – атома оказываются лежащими в
одной плоскости, называемой амидной, а вращение вокруг С – N связи становится
запрещенным.
СХ – атом связан суммарными связями с N – атомом одной пептидной
группы и с С-атомом следующей. Вокруг этих одинарного связей возможно
относительно свободное вращение. Для описания вращения вокруг этих связей
пользуются углами γ и ψ. Первый γ показывает положение всех атомов, которые
лежат в амидной плоскости, предшествующей СХ атому, а второй ψ – следующий
за СХ – атомом (Рис.1.3).
Под
вторичной
структурой
участка полипептидной цепи
понимают
конформацию основной цепи этого участка без учета конформации белковых
групп. С учетом вклада связей можно сказать, что вторичная структура это те
сегменты полипептидной цепи, которые участвуют в формировании регулярных
сетей водородных связей (Рис.1.4).
12
Рис.
1.3. Особенности пептидных связей – группы СО и NH связанные
пептидной связью расположены на одной амдной плоскости плоскости
А– Амидные плоскости. Вокруг пептидных связей расположенных в амидных
плоскостях вращение невозможно, вращение возможно вокруг связей Сα-С (φ) и
Сα-N (ψ) . Б – Стерические карты Рамачандрана. Совпадение сочетания углов
вращения амидных плоскостей φ и ψ с более окрашенными участками на карте
соответствуют
большей
вероятности
такого
взаимного
расположения
плоскостей.
В длинной полипептидной цепи при некоторых конформациях образуются
повторяющиеся структуры, стабилизированные водородными связями между N-H
и C=O группой основной цепи. В результате полипептидная цепь как бы
закручивается в спираль, т.о. возникает спиралевидная структура белковой
молекулы, которая называется α–структурой (α- спираль).
13
Рис.1.4. Вторичная структура белков стабилизирована водородными
связями
Любую спираль можно рассматривать как результат наматывания цепи на
боковую
поверхность
цилиндра.
Спираль
характеризуется
числом
повторяющихся единиц (остатков) приходящийся на один виток и расстоянием
между соседними остатками вдоль оси спирали.
Различные белки заспирализованы в разной степени. Для установления
степени спирализации измеряют удельное вращение при различной λ на
спектрополяриметрах. Степень спирализации определяют также по количеству
водородных связей в белках измеряемые с помощью тяжелой воды содержащий
изотоп дейтерия. Кроме α – структуры в белках имеется β – структура. Это
конформация не отдельной цепи, а совокупности цепей образующих сложную
структуру. Цепи связаны между собой водородными связями
Очень важна возможность образования β – формы и в отдельной цепи в
результате ее систематических изгибов. Такая форма называется кросс - βформы.
14
Т.о. водородные связи стабилизуют выделение конформации белковой
(полипептидной) цепи в растворе, т.е. α и β– структуры образуют вторичную
структуру белковой молекулы.
1.1.5. Структура глобулярных белков. Третичная и четвертичная
структура.
Под третичной структурой белка понимают расположение в пространстве
всех атомов одиночной полипептидной цепи. Некоторые белки состоят из
нескольких полипептидных цепей. Каждая цепь – одна субъединица или мономер.
Димер содержит 2 полипептидные цепи, тримеры и т.д. Например молекула
гемоглобина представляет собой тетрамер, в котором имеются 2 идентичные α цепи и 2 идентичные β– цепи (четвертичная структура).
С помощью рентгеноструктурного анализа в настоящее время установлена
третичная структура многих белков и ферментов.
Первый успех в расшифровке 3-мерной структуры глобулярных белков был
достигнут Кондрью и др. изучивших структуру миоглобина кашалота методом
ренгеноструктурного анализа. Миоглобин относительно небольшой глобулярный
белок состоящий из одной полипептидной цепи в которой содержится 153
аминокислотных остатка.
В результате были обнаружены ряд важных особенностей структуры
миоглобина присущий многим другим белкам и ферментам:
1. Молекула настолько компактна, что внутри нее может уместиться всего 4
молекулы воды.
2. Все полимерные R- группы аминокислотных остатков расположены на
внешней поверхности молекулы и находятся в гидратированном состоянии.
3. Почти все неполярные, гидрофобные R- группы расположены в глубине
молекулы и замещены от соприкосновение с водой.
4. У
миоглобинов, выделенных
из разных
видов млекопитающих,
конформация пептидных цепей в общих чертах сходна, хотя они и различаются
по аминокислотным остаткам.
15
5 Остатки пролина, не способные образовывать α– спирали находится в
местах изгиба.
Из выше сказанного можно резюмировать, что характерная для данной
полипептидной цепи третичная структура в водной системе определяется, с одной
стороны влиянием водородных связей, (которые могут быть внутрицепочными- αспираль, или межцепочными β– конформация), а с другой стремлением всей цепи
изгибаться в точках, где стабильность α– спирали нарушена, и принимать такую
конфигурацию, при которой молекулы воды могли бы находиться в условиях
обеспечивающих maxsim энтропию. Если в белке содержаться дисульфидные
мостики, то их число и расположение также играют существенную роль в
поддержание характерной третичной структуры белка (Рис.1.5).
Рис.1.5.
Третичная структура белка
Белки
обладают
максимальной
стабильностью,
при
определенной,
характерной для них температуре. Большинство стабильно в холодильниках. При
температуре
выше
разворачиваются
500С,
почти
полипептидной
все
цепи.
белки
утрачивают
Эксперименты
по
стабильность,
денатурации
показывают, что биологически активный белок после денатурации может
самопроизвольно свернуться в исходную конформацию с восстановлением
активности. Это говорит о том, что информация, необходимая для сворачивания
16
белка
в
нативную
конформацию,
заполнена
в
его
аминокислотной
последовательности.
В крупных белках при сворачивании полипептидной цепи, часто образуются
2 или более пространственно разделенные области, называемые доменами. По
своей структуру каждый домен напоминает, отдельный небольшой белок.
Биологические свойства белков, в частности их ферментативные свойства,
зависят в первую очередь от первичной структуры, т.е. аминокислотного состава
и взаимного расположения аминокислотных остатков. Они зависят также от
вторичной структуры белка. Третичная структура белка также оказывает большое
влияние на действие фермента, на проявление его каталитической активности.
Четвертичная
структура
белка
означает
взаимное
расположение
в
пространстве мономеров формирующих молекулу белка, который состоит из
нескольких субъединиц. Эти субъединицы связаны между собой непептидными
связями – водородными, ионными, или гидрофобными. Молекулы белков,
обладающих четвертичной структурой – олигомеры – при определенных условиях
диссоциируют в растворе на субъединицы, которые при других условиях могут
ассоциировать, образуя первоначальную молекулу (Рис.1.6).
17
Многие ферменты- олигомеры также обладают четвертичной структурой, что
имеет большое значение для регулирования их активности в клетке.
Например: катализа – расщепляющая Н2О2 на кислород и воду –состоит из
4-х субъединиц. Глютаминсинтеза катализирующая при участии АТР синтез
глютамина из глютаминовой кислоты и аммиаке, у разных организмов имеет
различную четвертичную структуру. У E. сoli – додекамер (12 субъединиц), у
высших растений – октомер, у хлореллы – гексамер. Субъдиницы, образующие
молекулу фермента - , могут быть различной величины.
Таким образом, суммируя наши знания о строение белков, можно сказать,
что они состоят из аминокислотных остатков, связанных между собой
пептидными связями и образующих полипептидные цепочки, которые благодаря
дисульфидным,
водородным
и
ионным
связям,
а
также
гидрофобным
взаимодействием, строго определенным образом располагаются в пространстве,
т.е. имеют при данных условиях определенную конформацию. Нативная
конформация,
создающаяся
при
нормальных
18
физиологических
условиях,
обеспечивается ковалентными и дополнительными связями для придания
жесткости, компактности и упорядоченности.
1.2.2. Методы выделения и очистки ферментов
Методы дезинтеграции клеток
Выделение и очистка ферментов, пожалуй, самый сложный процесс в
энзимологии, требующий знаний особенности выделяемого фермента и его
источника, культуры проведения тонких анализов. Каждый отдельный фермент
требует к себе особого внимания и подхода. Большинство ферментов выделяют
при низких температурах во избежание инактивации. Существует много способов
выделения ферментов, как в лабораторных условиях, так и в промышленности.
Мы с вами рассмотрим основные способы: дезинтеграция, экстракция, осаждение
(высаливание), хроматография, электрофорез.
Дезинтеграция клеток. Мы с вами уже разобрали, что в зависимости от
локализации
по
отношению
к
клеточной
мембране
ферменты
бывают
внеклеточные (экзоферменты), внутриклеточные (эндо ферменты) и мембранные
или клеточносвязанные. Если мы получили (вырастили) суспензию клеток или
культуральную жидкость, ферменты будут по-разному распределятся в этой
жидкости. Некоторые ферменты выделены клетками наружу и находятся в к/ж,
некоторые сидят в стенках клеток, некоторые заключены в клетки. Ясно, что для
выделения первых можно клетки не трогать, просто отделить, а вот для
выделения 2-х и 3-х необходимо разрушить клетки.
Процесс
разрушения
клеточной
стенки
называют
дезинтеграцией.
Существуют несколько методов дезинтеграции (разрушения).
-механические: баллистический, экструзионный, декомпрессионный;
-физические: осмос и термошоки, плазмолиз, криотехника, ультразвук,
сушка, ионизирующая радиация, температура;
-химические: действие кислот, щелочей, солей, органических растворителей,
ПАВ, сдвиг рН;
-энзиматические: действие литических ферментов (лизоцим;
19
-биологические: действие фагов, антибиотиков.
Чаще всего первой стадией получение ферментов является получение
гомогената. Гомогенат получают измельчением биологического материала
(растительная или животная ткань, мицелий и т.д.) в ступке с добавлением песка
или осколков стекла, или в специальных гомогенизаторах. В настоящие время
применяют различные модели гомогенизаторов. Основной принцип работы этих
аппаратов заключается в следующим: в стеклянной или металлическом стакане
поступательно-вращательно перемешивается хорошо подогнанный к стенкам
стакана металлический, стеклянный или фторопластовый шток. Предварительно
измельченная биологическая ткань попадая между стенкой и штоком с
наконечником
механическим
разрушаются.
Подбирая
обороты,
тип
гомогенизатора, среду можно выделить очень большой класс ферментов.
В последние время очень широко применяют УЗ-дезинтеграторы. Здесь
также необходимо подобрать такие условия, чтобы исключить максимально
инактивацию
микробных
ферментов.
клеток
встряхивании
Хорошим
является
клеток
с
способом
перематывание
маленькими
разрушения
шариками,
стеклянными
большинства
состоящие
шариками
в
во
быстро
вибрирующем сосуде.
Дезинтегрирующие
действие
химических
соединений
заключается
в
нарушение меж. И внутримолекулярных связей между структурными элементами
клеточной стенки за счет связывание ионов металлов, удаление липидов и т.д.
При энзиматической дезинтеграции можно выделять малоустойчивые
внутриклеточные структуры. Ферменты или ферментные комплексы литического
действия получают из бактерий, грибов, тканей животных и растений. Например,
в
состав
дрожжелитического
ферментного
комплекса
входят
различные
глюконазы, протеазы, хитиназы. Из-за различия в строение клеточных стенок в
зависимости от рода, вида, штамма одних и тех же клеток, в каждом конкретном
случае
необходимо
подбирать
соответствующий
20
ферментный
комплекс.
Особенно большой скачок в использовании энзиматической дезинтеграции был
сделан после применение иммобилизованных ферментов.
Биологическая дезинтеграция осуществляется фагами, бактериоцинами
вызывающих лизис клетки, ведущий и распаду клетки. Если ферменты прочно
связаны с внутриклеточными структурами, то вначале выделяют эти структуры
дифференциальном центрифугированием, а затем экстрагируют из них ферменты
органическими растворителями или водными растворами дозоксихолата, твина и
т.д. (детергенты).
Выделение ферментов
Для получения ферментного экстракта можно использовать буферные
растворы, растворы солей, воду, смесь глицерина с водой (40% и 60%0, или
органические растворители.
Раньше и сейчас для выделения ферментов чаще всего использовали ацетон и
спирт. Несмотря на простоту этот способ имеет ряд недостатков. Не все ферменты
выдерживают обработку органическими растворителями денатурируют и теряют
свою активность. Поэтому эту операцию нужно проводить при очень низких
температурах, близких к температуре замерзание смеси данного растворителя с
водой.
Наиболее широко применяют для выделения ферментов метод высаливания
(рис.1.7)
21
Высаливание чаще всего производят с помощью сернокислого аммония,
добавляемого
к
исследуемому
раствору
в
возрастающих
количествах.
Ферментный раствор вначале насыщают (NH4)2SO4 20% % от полного
насыщения. При этом выпадает, какая то часть ферментов и белков, осадок
отделяют
на
центрифуге
и
исследуют
на
наличие
соответствующей
ферментативной активности. Раствор далее насыщают сернокислым аммонием до
40% полного насыщения, до 60% и т.д., осадки оделяют и получают ряд белковых
фракций, которые исследуют на наличие в них того или иного фермента.
Для очистки ферментов применяют водорастворимые полимеры. Их
применение
основано
либо
на
осаждение
ферментов
полимерами
(полиэтиленгликоль), либо на избирательной распределение ферментов в водных
растворах 2-х несшивающихся полимеров (декстран, полиэтиленгликоль).
22
Хроматографические методы очистки. Адсорбционная хроматография –
основана на различие в адсорбционных свойствах компонентов разделяемой
смеси.
Главное требование, предъявляемое к адсорбенту для хроматографии –
отсутствие химического взаимодействия между адсорбентом и анализирующим
веществом. Адсорбент не должен оказывать каталитического действия, как на
растворитель, так и на компоненты разделяемой смеси. Для этого адсорбенты
очищают от примесей, нейтрализуют его кислотные и щелочные свойства.
Каталитическое окисление можно устранить, проводя работу в атмосфере
инертного газа.
Второе важнейшие свойство адсорбента – избирательность по отношению к
компонентам разделяемой смеси. Адсорбенты разделяют на полярные и
неполярные.
Адсорбционное
сродство
полярных
веществ
к
полярным
адсорбентам, значительно выше, чем неполярных к полярным.
Третье – размер частиц от которого зависит способность адсорбировать те
или иные вещества.
Четвертое
–
стандартность
свойств
адсорбента,
что
обуславливает
воспроизводимость и возможность сопоставить результаты.
Пятое – разделенные вещества должны легко отделяться от адсорбента.
В хроматографических исследованиях применяют адсорбенты заводского
производства. Один из наиболее распространенных адсорбентов окись алюминия,
на которой удается храмотографировать широкий круг смесей как в полярных,
так не полярных растворителях благодаря ее атмосферному характеру.
Техническая Al2O3 имеет слабощелочную реакцию (рН 9-10). Нейтральную
Al2O3 готовят промывая ее азотной или соляной кислотой (разбавленной).
Активность Al2O3 зависит от ее влагосодержания (увлажнение).
Для хроматографического разделения смесей нефтепродуктов, высших
жирных кислот, углеводов, и др. органических соединений широко применяют
силикагель (двуокись кремния). Нейтральный силикагель, который получают
23
промывая дистиллированной водой промышленный силикагель используют при
хроматографировании нестабильных веществ.
Несколько меньше применение нашли силикаты кальция и магния, активного
угля, целлюлоза, сульфат мания и др.
В последнее время большой интерес вызывают синтетические и природные
вещества – молекулярные сита. Это кристаллы синтетических и природных
минералов – цеолитов. Промышленностью выпускается четыре типа цеолитов –
А, Х, У, М имеющих различное кристаллическое строение. В цеолите могут
включены различные катионы. Марки цеолитов в зависимости от катионов
обозначаются: К+А, СаМ, КУ, СаУ.
Пары этих кристаллов имеют размеры, близкие к размерам молекул жидких
и газообразных веществ (0,8-0,2 нм). Те вещества, молекулы которых по своим
размерам могут проникнуть в эти поры, сорбируются в кристаллах цеолитов, а
более крупные молекулы остаются несорбированными. Использование цеолитов с
различными размерами пор, дает возможность очень четко разделить на цеолитах
смеси различных веществ. Природные цеолиты – большая группа минералов,
являющихся водными алюмосиликатными кальцием, натрием и др. металлов.
Правильный выбор растворителя (подвижной фазы) в адсорбционной
храмотографии имеет существенное значение и тесно связан как с природой
выбранного адсорбента, так и со свойствами компонентов анализируемой смеси.
Основным
показателем
для
растворителя
является
его
десорбирующая
способность.
Распределительная хроматография. Основано на различии в коэффициентах
компонентов разделяемой смеси между двумя несмешивающихся (или частично)
жидкостями, в которых компоненты растворяются, причем одна из жидкостей
(неподвижная фаза) удерживается твердым носителем (инертным). Растворители
прежде всего должны хорошо растворять все компоненты анализируемой смеси,
минимально адсорбироваться на выбранном адсорбенте, не взаимодействовать
химически с анализируемым веществом, ни с адсорбентом. Выбор растворителей
24
объясняется тем, что они значительно влияют на прочность адсорбции. Чем
больше полярность адсорбируемого вещества по сравнению с растворителем, тем
прочнее оно связывается с адсорбентом. Наоборот, если степень адсорбции
вещества и растворителя близки, то адсорбированная вещество вытесняется
молекулами растворителя, и степень адсорбции вещества понижается. Поэтому,
часто проводят последовательное вымывание вещества рядом растворителей с
увеличивающейся десорбционной
способностью. В результате отдельные
компоненты смеси десорбируются и вымываются из колонки последовательно.
Растворитель (подвижна фаза) продвигается через неподвижную фазу и
увлекает разделяемые вещества, находящиеся на носителе. В процессе
хроматографирование происходит распределение компонентов между подвижной
и неподвижной фазами до тех пор, пока не будет достигнуто состояние
равновесие. Константа равновесия зависит от выбранных растворителей и от
природы
хроматографируемого
вещества.
Эту
величину
К
называют
коэффициентом распределения Нерста:
С- молярные концентрации вещества в обоях фазах
Благодаря различию в значение К индивидуальные вещества перемещаются в
колонке с разной скоростью и благодаря этому достигается их разделения. В
зависимости от природы твердого носителя и свойств жидкой неподвижной фазы,
а также способа проведение эксперимента распределительная хроматография
делится на колоночную (КХ), тонкослойную (ТСХ) и бумажную (БХ). В
распределительной КХ и ТСХ может быть применен любой другой твердый
носитель, который прочно удерживает неподвижную фазу, и не вызывает
побочных явлений. В качестве таких носителей чаще всего применяют
силикагель, гипс, цеолиты, крахмал и т.д. в качестве носителя неподвижной
жидкой фазы в бумажной хроматографии применяют специальную бумагу,
способную удерживать в порах много жидкости, являющейся неподвижной
фазой.
25
Гель - хроматография. Некоторые полимеры обладают способностью
содержать значительное количество прочного связанного растворителя. Если этот
неполярный растворитель, то гель называется гидрофобным, а если вода –
гидрофильным. Хотя при этом мелкие частицы геля и выглядят сухими, масса
содержащегося в них растворителя часто во много раз превышает массу самого
геля. Так, в сефадексе G20 на 1г сухого геля содержится 20 г связанной воды. В
качестве гидрофильных гелей используют чаще всего гели из полиакриламида,
агар-агара и декстрана, в качестве гидрофобных – гели, которые набухают в
органических растворителях. Разделение на гелях основано на том, что
растворенные вещества распределяются в зависимости от размеров их молекул и
размеров пор геля между растворителем, играющим роль подвижной фазы, и тем
же самым растворителем, содержащимся в геле (стационарная фаза). Таким
образом, разделение осуществлено способностью растворенных частиц проникать
в поры геля, т.е. различной способности их к диффузии. Разделяемые вещества
должны иметь малое сродство к гелю, чтобы не накладывались адсорбционные
взаимодействия. Гели используются не только для разделения крупных
органических молекул от мелких – гель – фильтрация; но и для оценки
молекулярных масс компонентов – гель – хроматография (Рис.1.8).
26
Ионообменная хроматография – это обратимый обмен ионов, содержащихся
в растворе, на подвижные ионы вещества называемых ионитами или
ионообменниками. Разделение смеси содержащихся в растворе ионов основано на
не одинаковой способности их к обмену с ионами ионита. Ионообменники – это
нерастворимые высокомолекулярные соединения, содержащие способные к
ионизации функциональные группы и дающие с ионами противоположного
заряда нерастворимые соли. В зависимости от характера ионизирующих групп
иониты разделяют на катиониты и аниониты. Существуют также амфолиты –
способные осуществлять одновременный обмен катионов и анионов (Рис.1.9).
27
Давай для простоты представим, что ионит состоит из каркаса (или
замкнутой сетки), обладающего (+) и (–) зарядом, который компенсируется
зарядами ионов противоположительного знака (противоионов), так что в целом
ионит нейтрален. За счет подвижности противоионов в пределах каркаса, ионит
способен к обмену. Если, например, ионит, содержащий противоионы А,
поместить в раствор, в котором находятся ионы В того же заряда, то ионы А
будут покидать ионит и переходить в раствор, а ионы В будут связываться с
ионитом:
RAn-H++Na++Cl- ↔ RAn- Na++H++Cl- катионный обмен
RKt+ OH-+Na++Cl- ↔ RKt+Cl-+Na++OH- анионный обмен
28
R – полимерный радикал, образующий вместе с ионогенной группой каркас
ионита,
An-
и
Kt+
ионогенные
группы
или
фиксированные
ионы,
обуславливающий заряд каркаса.
Афинная хроматография. А сейчас мы более менее подробно остановимся на
одном из методов хроматографии - афинной хроматографии. Это метод еще
называют биоафинной ли биоспецифической хроматографией.
Суть этого метода заключается в том, что многие биологически активные
соединения
–
ферменты,
лектин
имеют
исключительную
способность
специфически и обратимо связываться с другими веществами, которые принято
называть лигандами, афинными лигандами или просто афинатами. Например:
фермент – ингибитор (субстрат), антитело – антиген, лектин – клеточная стенка.
Если такой лиганд (л) ковалентно соединить с нерастворимой инертной матрицей
29
(м), то получится специфический адсорбент, на котором будет адсорбироваться
только вещества (в), имеющие сродство к данному лиганду. Остальные же
вещества будут проходить через колонку (Рис.1.10).
Варьируя условия процесса и используя специальные элементы, изменяющие
сродство лиганда к выделяемому веществу, можно вызвать десорбцию и получить
высокоочищенный необходимый препарат. Подбор носителя к лиганду – задача
очень сложная. Редко можно найти лиганды в виде существующих соединений,
имитирующих субстраты или являющиеся настоящими субстратами, которые
можно использовать при создании афинных сорбентов. Это прежде всего,
крахмал, пектин, целлюлоза. В большинстве случаев афинные адсорбенты
требуется синтезировать с учетом свойств очищаемого вещества. Этот процесс
имеет
и
другие
сложности.
Например,
сорбенты
могут
быть
невысокоспецифичными и удерживать не только очищаемое вещество, но и ряд
других,
осложняет
и
удлиняет
очистку.
Для
афинной
хроматографии
используются различные нерастворимые сорбенты, но чаще всего получают
поперечно-сшитые
гранулы
агарозы,
т.к.
они
достаточно
прочные,
не
разрушаются и сохраняют форму под давлением, при смене буфера или в
присутствии различных растворителей.
К лигандам предъявляются ряд жестких требований: они так должны
присоединяться к матрице, чтобы не был затруднен подход вещества к лиганду;
желательно, чтобы между матрицей и лигандом был мостик, что облегчает доступ
к лиганду; необходимо, чтобы лиганд не взаимодействовал с другими
соединениями, имел прочную связь с матрицей, котором была бы стабильна при
адсорбции вещества, его последующей элюации, регенерации и очистке колонки с
адсорбентом.
Широкому внедрению афинной хроматографии способствовало создание
методов получения моноклональных антител, обладающий чрезвычайно высокой
константой связывания с соответствующим антигеном (белок или другое
вещество).
30
Клон – культура состоящая из наследственно идентичных клеток,
возникающих
в
результате
бесполого
размножения
«моноклональные
(гомогенные) антитела – это антитела однородные по своей структуре и
специфичности, которые можно производить в неограниченном количестве.
Для предотвращение концентрационной поляризации используют различные
приемы:
качественная
предварительная
очистка
растворов,
установление
мешалки, уменьшение просвета между мембранами.
Для устранения начальной адсорбции используются предварительное
фильтрование
концентрированного
раствора
через
металлокерамические
фильтры, центрифугирование и т.д.
С этой точки зрения эффективна химическая обработка раствора, при
которой удаляется часть балластных веществ солями, бентонитом и т.д., а также
изменение рН до изоэлектрического значения, при котором осаждаются
балластные вещества.
Электрофорез и изоэлектрофокусирование. Для разделения и очистки
ферментов в настоящее время очень широко применяется электрофорез в
различных гелях
– полиакриламидном, агарозном, крахмальном и т.д.,
насыщенным буферным раствором.
Разделение ферментов методом электрофореза основано на различии
подвижности заряженных белковых молекул под действием электрического поля.
Для проявления белков после электрофореза их фиксируют уксусной или
трехуксусной кислотами и окрашивают кумаси, амидочерным или другими
белковыми красителями (Рис.1.11).
31
Получаются
студенистые
цилиндрические
брусочки
с
окрашенными
полосками. На специальном приборе денситометре по степени окраски, ширине
окрашенной полосы и с использованием свидетелей определяют качественную и
количественному характеристики белков.
Кроме того, для идентификации ферментов в геле окрашивают продукт
данной ферментативной реакции, учитывая активность ферментов.
Более высокой разрешающей способностью отличается диск – электрофорез
в полиакриламидном геле, при котором используется неоднородная буферная
система и белки концентрируются в узких зонах.
Очень
хорошие
результаты
получают
при
использовании
другой
разновидности электрофореза – изотахофореза – препаративного электрофореза в
неоднородной
буферной
системе
с
использованием
амфолинов.
При
изотахофорезе заряженные молекулы белков и амфолинов располагаются в
соответствии с их подвижностью между быстрыми ведущими и медленными
32
замыкающими ионами и движутся с одинаковыми скоростями. Использованием
амфолинов позволяет разделить ферменты, близкие по электрофоретической
подвижности, которые трудно разделить обычным зональным электрофорезом.
Наиболее
высокой
изоэлектрической
Вестербергом.
разделяющей
фокусировки
белков,
способностью
разработанный
обладает
метод
Свенсоном
и
При этом методе ферменты разделяются за счет различий их
изоэлектрических точек. Фракционирование белков проводят в колонке,
заполняют синтетическими амфолинами – смесью алифатических полиаминов
поликарбоновых кислот. Сочетание аминых и карбоксильных групп каждого
отдельного амфолина смеси определяет характер его диссоциации. Под действием
электрического поля амфолины распределяются по высоте колонки в строго
определенной последовательности и создают линейный градиент рН. В
электрическом поле колонки молекулы внесенного в ее белка перемещаются к
аноду или катоду. При этом они проходят зоны с различными значениями рн. В
зоне, где рН точно соответствует значению изоэлектрической точки белка, его
молекулы становятся электронейтральными и их движение прекращается – белок
фокусируется. Т.о. в разных зонах колонки фокусируются белки с разными
значениями изоэлектрических точек различающихся на 0,02 рН.
В процессе выделения ферментов проводят их концентрирование, т. е.
удаление низкомолекулярных примесей. Наиболее эффективными методами
являются диализ и ультрафильтрация. УФ – это фильтрация под давлением через
мембраны, действующим как молекулярный фильтр. Для концетрирования
используют миофильную сушку, выпаривание в вакууме и т.д.
В промышленности ферментные препараты различной степени чистоты – от
целых клеток и бесклеточных экстрактов до высокоочищенных гомогенных
ферментов – применяют в качестве биокатализаторов. В промышленных
масштабах получать высокоочищенные ферменты очень сложно, т.к. при
использовании для этой цели наиболее эффективных, вышеприведенных методов
требуется решить целый ряд инженерно-технологических, дорогостоящих задач.
33
Эти трудности можно обойти несколькими путями:
- использовать более доступные и дешевые методы получения очищенных
ферментных препаратов – концентрирование, экстракция, осаждение;
-получать мутантные микроорганизмы с легко разрушающимся клеточными
стенками или использовать иммобилизованные литические ферменты.
-создавать
биоспецифические
процессы
выделения
и
очистки
с
использованием АСУ ТП.
- и наконец, видимо самое перспективное вместо ферментов использовать
целые иммобилизованные клетки обладающие заданной ферментативной
активностью.
1.2.3. Единицы активности ферментов. Методы определения активности
ферментов.
Каждый ферментный препарат должен быть охарактеризован по его
ферментативной активности. Что такое активность фермента в самом простом
понимании?
Это единица количества субстрата, превращенное ферментом, в единицу
времени, отнесенное к количеству самого фермента.
Международным биохимическим союзом выработана специальная понятия –
стандартная единица фермента (Е) единица на русском или (unit) – на английском.
34
Стандартная единица фермента – это такое количество фермента, которое
катализирует превращение одного микромоля данного субстрата за одну минуту
при заданных условиях. Для определения числа стандартных единиц фермента
желательно пользоваться t =250, рН оптимум, и Ссубстрат – оптимум.
Для определения числа стандартных единиц нужно знать скорость
ферментативной реакции. Из курса биохимии вы вероятно знаете что ход
ферментативной реакции можно представить в виде графика имеющего вид
(Рис.1.12):
Кривая сначала круто поднимается вверх, затем ее подъем замедляется и
наконец может замедляется и наконец становится параллельной оси абсцисс.
Замедление реакции может вызываться следующими причинами:
1. Так как в принципе каждая ферментативная реакция обратима, то в силу
закона действующих масс скорость реакции равное произведению концентрации
реагирующих веществ (и образующиеся продукты реакции будут влиять на
скорость прямой реакции)
35
2. В процессе реакции концентрация исходного материала может оказаться
ниже
насыщающей
концентрации
и
естественно
скорость
также
будет
замедляться.
3. Сам фермент во время реакции частично разрушаются и естественно
уменьшается скорость реакции
4. Торможение продуктами реакции, даже если реакция необратима.
В связи с выше изложенным, для
точного определения скорости
ферментативной реакции, измерение нужно проводить в начале реакции, когда
количество превращенного субстрата не выше 20% от исходного. В этом случае
практически можно избежать действие четырех вышеназванных артефакторов.
Важнейшим условиями правильного определения истиной начальной
скорости реакции являются:
- применение таких физических методов, которые дают возможность
наблюдать за ходом реакции непрерывно (СФ, электропроводимость и т.д.);
- применение по возможности насыщающих концентрации субстрата (SO);
Зная скорость ферментативной реакции (т.е. активность), можно рассчитать и
удельную активность биокатализатора. Удельная активность – это число единиц,
отнесенное к одному миллиграмму белка в ферментом препарате.
Официальной единицей активности ферментов является катал (кат) –
количество фермента, которое превращает один моль субстрата в одну секунду.
Это очень большая величина и активность фермента чаще выражают в
микрокаталах: 1 мкат = 1•10-6 кат
В энзимологии пользуются также понятием молекулярная активность. Под
молекулярной активностью понимают число молекул данного субстрата или
эквивалентно затронутых групп, превращаемых за одну минуту одной молекулой
фермента при оптимальной концентрации субстрата. Как следует из определения,
для
вычисления
молекулярной
активности
молекулярную массу.
36
фермента,
нужно
знать
его
Присутствие фермента в исследуемой среде (пробе) можно установить по
скорости накопления продуктов данной ферментативной реакции или по скорости
исчезновения субстрата. Для этих целей применяются самые разнообразные
методы – химические, поляриметрические, хроматографические, спектральные.
1.3.1.Класссификация ферментов.
К настоящему времени известно свыше 2,5 тысяч различных ферментов.
Название большинства ферментов образуют добавлением суффикса – аза к
названию субстрата, т.е. того соединения, на которое действует фермент.
Например, лактаза /β- галактозидаза/ гидролизует лактозу до глюкозы и
галактозы. Однако это не всегда так. Некоторые ферменты имеют тривиальные
названия – пепсин, хемотрепсин и т.д.
Согласно международной номенклатуре все ферменты подразделяют на 6
классов, подразделяющиеся на подклассы и т.д.
I
класс
–
оксидоредуктазы
или
окислительно-восстановительные
ферменты. Включает 20 подклассов, в зависимости от того, на какие соединения
действует.
Например 1 подкласс действует на группу СН - ОН
2
на
СН = О
3
на
СН-СН
4
на
СН – NH2
5
на
СН – NH и т.д.
Каждый фермент имеет свой 4-х значный шифр. Это относится ко всем 6
классам ферментов. Первая цифра означает класс, вторая подкласс, третья
подподкласс, четвертая конкретный фермент. Чаще всего мы пользуемся рабочим
названием фермента, но более точным будет систематическое название,
включающее
в
себя
химическую
информацию,
указывающую
природу
химической реакции, катализируемой данным ферментом.
Например, все наверное, слышали о ферменте глюкозооксидазе окисляющей
глюкозу до глюконовой кислоты. Шифр этого фермента I.I.3.4. Рабочее
37
(тривиальное) название глюкозооксидаза, систематическое - β-Д - глюкоза,
кислород – I – оксидоредуктаза.
Первая цифра I класс оксидоредуктазы, вторая – 1 – действеут на СН-ОН
группу глюкозы, третья – 3 – при отнятии Н+ его акцептором служит О2 –
газообразный, а не NАД+ как в случаи с дегидрогеназами, четвертая – 4 – номер
фермента в группе 1.1.3.
Другой
пример
алкогольдегидрогиназа.
Систематическое
название
–
алькоголь: NAД+ оксидоредуктаза. Шифр 1.1.1.1. Давайте вместе расшифруем.
Первая цифра – 1 – первый класс, вторая цифра 1 – действует на СН-ОН группу,
третья 1 – акцептор NАД+, четвертая 1 – номер фермента.
К оксидоредуктазам относится такие, широко известные ферменты как:
лактатдегидрогеназа, каталаза, пероксидаза, линоксигеназа и т.д.
II – класс – трансферазы, ферменты переносящие функциональные группы.
2.1.– трансферазы подкласс катализирующий перенос одноуглеродных
остатков метильные, карбоксильные, формальдегидные;
2.2. – трансферазы – альдегидные и кетонные остатки;
2.3. – ацилтрансферазы – ацильные (кетонные) остатки (ацетил СН3СО,
сукцинаты и т.д.);
2.4. – гликозилтрансферазы – гликозильные остатки;
2.5. – трансферазы – алкильные группы;
2.6. – трансферазы – группы содержащие азот (амидные, амидиновые);
2.7. – трансферазы – группы содержащие фосфор;
2.8. – трансферазы – группы содержащие серу;
К
этому
классу
относятся
протеикиназы,
гексокиназы,
тирозинаминтрансфераза.
Например, фермент протеинкиназа имеет шифр 2.7.1.37.
Давайте
расшифруем.
Систематическое
название
АТР
фосфотрансфераза : АТР + протеин = АДР + фосфопротеин
38
–
протеин
Первая цифра 2 – трансфераза, вторая 7 – переносит группу, содержащую
фосфор, третья 1 – подкласс белок, четвертая 37 номер фермента в гуппе 2.7.1.
III класс – гидролазы, ферменты катализирующие реакции гидролиза. Этот
класс включает много ферментов имеющих промышленное значение.
3.1. ферменты, действующие на сложноэфирные связи (эстеразы);
3.2. на гликозидные соединения (амилазы α и β);
3.3.на эфирные связи;
3.4.на пептидные связи (протеолитические ферменты);
3.5 на связи С-N отличие от пептидных (амидные);
3.6.на кислотно-ангидридные связи;
3.7.на С-С связи;
3.8.на С- галоидные связи;
3.9.на P-N;
3.10.на S-N;
3.11.на С-Р связи.
Пример: липазы, фофолипазы, амилазы, пектинэстеразы, целлюлазы.
Третья цифра на эфиры кислот действует фермент. Карбоновые 1.
IV класс –лиазы, ферменты катализирующие реакции расщепления.
4.1. между атомами С; 4.2. - С и О ;
4.3. - С и N :
4.4. - С и S; 4.5-С и
галоиды; 4.6. - Р и О и другие.
В промышленности широко применяют фермент аспартазу (£ - аспартат –
аммиак - лиаза) катализирующий обратимую реакцию синтеза аспарагиновой
кислоты из фумаровой кислоты и аммиака:
£- аспарат = фумарат + NH3
Фумарат - гидралаза – фермент, катализирующий обратимую реакцию
гидратации фумаровой кислоты с образованием яблочной кислоты.
V – класс – изомеразы, ферменты, катализирующие реакции изомеризации:
5.1. рацемазы и эпимеразы - 5.1.1. изомеризация аминокислот, 5.1.2. –
гидрооксикислот, 5.1.3. - углеводов
39
Пример: лактатрацемаза, £ и D молочная кислота ИДР глюкоза, эпимераза.
5.2. цис – трансизомеразы; 5.3. внутримолекулярные оксидоредуктазы; 5.4.
внутримолекулярные трансферазы; 5.5 внутримолекулярные лиазы
VI – класс лигазы, ферменты, катализирующие образование связей за счет
АТР.
6.1. лигазы образующие связи С-О (аминокислота, РНК-лигазы);
6.2. С-S присоединение ацилов (например, ацетил или суцилины к коэнзиму
А);
6.3. С-N аспарагинсинтетаза – синтез аспарагина из дикарбоновых
аминокислот;
6.4. 5
ферментов содержащих
биотин
и
катализирующих
реакции
карбоксилирования органических кислот;
6.5.
образуют
фосфоэфирные
связи
(востанавливают
фосфоэфирные
разрушения) в нуклеиновых кислотах.
1.3.2.Коэнзимы и другие кофакторы
Из предыдущих лекций мы с вами уже выяснили, что активность ферментов
во многом определяется структурой белка. Однако, помимо структуры белка
активность многих ферментов зависит от присутствия определенных групп
небелковой природы, так называемых кофакторов, ионов металлов или сложных
органических соединений – коферментов /коэнзимов/.
Термин коэнзим был введен франц. ученым Бертраном для обозначения той
части фермента, которая легко удаляется через п/п перепонку при диализе. Сейчас
уже ясно, что почти все ферменты являются 2 компонентами, состоят из белка и
связанного с ним кофермента – термостабильного органического соединения
небелковой природы.
Природный комплекс фермента с кофактором называют - холоферментом, а
неактивный белок, остающийся после удаления кофактора – апоферментом.
Коферменты, более прочно связаны с апоферментом называют простетической
группой. В отличие от субстрата коферменты в результате ферментативной
40
реакций не подвергаются изменениям. Но в случае ряда последовательных
ферментативных реакций кофермент на каком- то этапе может выступать в
качестве субстрата, хотя, в конечном счете, он и регенерирует. Большинство
коферментов являются витаминами или их производными.
Согласно
химическому
строению
коферменты
можно
разделить
на
следующие группы:
1. Коферменты алифатического ряда / глютаион – трипептид, выступает как
коэнзим
ферментов
катализирующих
реакции
изомеризации,
внутримолекулярного переноса водорода / : / липеевая кислота – ростовой фактор
для микробов/.
2. Коферменты ароматического ряда / убихиноны / коэнзим / - содержат
хиноидные группы, участвуют в процессе дыхания.
3.
Коферменты
–
гетероциклического
соединения
/
производные
пиридоксина / витамин В6 /, реакции превращения аминокислот, / ферменты
декарбоксилазы и рацемазы аминокислот /. Б) Производные витамина В1,
пищевой фактор болезнь полиневрит /бери/.
В) Биотин – необходим для
нормального роста и развития дрожжей. В качестве кофермента входит в состав
ферментов. Г) катализирующих реакции активирования и переноса СО2, т.е.
реакции карбоксилирования и деарбоксилирования, катализирующих реакции
синтеза малотил – СоА из ацетил соА и угольной кислоты в дальнейшем синтез
жирных кислот. Производные фолиевой кислоты присутствуют в ферментах
катализирующих реакции активации и переноса одноуглеродных остатков.
4. Коферменты – нуклеотиды и нуклеозиды. Нуклеотиды – соединения
азотистого основания с сахаром и остатком фосфорной кислоты. Азотистые
основания принадлежат к пуриновому или пиримидиновому ряду. Азотистые
основания соединены с остатком пентезы – рибозы или дезоксирибозы. Общая
структура нуклеотидов: азотистое основание – пентоза – фосфорная кислота.
Нуклеотид без остатка фосфорной кислоты – азотистый остаток с пентозой –
нуклеозид. В состав коферментов – нуклеотидов и нуклеозидов – входят
41
пуриновые основания – аденин /А/ и гуанин /Г/ и пиримидиновые основания –
цитозин /С/, урацил - /У/ и тимин /Т/.
Важнейшие нуклеозиды – аденозин, гуанезин, цитидин, уридин. Важнейшие
нуклеотиды - АМР, АТР, ГДР, ГТР.
Помимо того, что АДФ и АТФ источники энергии они являются
коферментами ферментов участвующих в переносе фосфатного остатка, и
аденозильного остатка /уридиндифосфатглюкоза/.
Наряду с коферментами в создании каталической активности ферментов
важную роль играют различные металлы Ca, Fe, Cu, Mn, Mg, K, Zu, Mb.
Ферменты
для
действия,
которых
необходимы
металлы,
называют
металлоэнзимами. Более четверти из известных ферментов можно отнести к
металлоэнзимам.
Металлоэнзимы условно можно разделить на металлоферментные комплексы
(гр. 1) и истинные металлоэнзимы (гр. 2).
Для первых характерна относительно небольшая связь металлом и
апоферментами. О возникновении такой связи судят обычно по появлению или
значительному возрастанию ферментативной активности при добавлении ионов
метвллов
к
апоферменту.
Металлоферментными
комплексами
являются
некоторые пептидазы, дегидрогеназы, фосфатазы и т.д.
Для вторичных истинных металлоэнзимов характерна прочная связь металла
с тем или иными химическими группами апофермента, в строго определенных
стехиометрических соотношениях. В отличии от металлоферментных комплексов,
диализ раствора металлоэнзима или обработка ионообменными смолами не
приводит к отделению металла от специфичного белка и не обнаруживается
смещения удельной активности фермента.
Включение
ионов
металлов
в
каталитические
центры
истинных
металлоэнзимов происходит в процессе биосинтеза ферментов, при добавлении
металлов in vitro к препаратам апоферментов оно не всегда возможно.
42
В активные центры истинных металлоэнзимов чаще входят строго
определенные катионы, которые трудно заменить другими, даже близкими по ф/х
свойствам ионами.
Примерами истинных металлоэнзимов являются карбоксипептидаза А (Zn),
диаминооксидаза (Cu2+), аминооксидаза (Cu2+) и т.д.
По современным представлениям, в биохимическиз системах возможны
следующие основные механизмы участия катионов металлов в ферментативных
реакциях:
- металл является составной частью каталитически активного центра
фермента;
- металл создает или стабилизирует определенную конформацию белковой
молекулы, необходимую для обеспечения каталитического действия фермента;
- металл воздействует на субстрат, изменяя его электронную структуру таким
образом, что он легче вступает в ферментативную реакцию;
- металл обеспечивает присоединение кофермента к апоферменту или
активацию кофермента;
- металл выполняет функцию «мостика», связывающего фермент и субстрат
при образовании из него промежуточного соединения, и стабилизирует это
промежуточное соединение;
- роль металла в ферментативной реакции обусловлена сочетанием тех и
других перечисленных выше механизмов.
1.3.3.Фермент-субстратные комплексы и механизм действия ферментов.
Уже исходя из названия фермента можно сказать, что он специфичен, т.е
катализирует строго определенные реакции. Это очень важное свойство живых
систем, т.к. благодаря этому и возможна тонкая упорядоченность и тесная
взаимосвязь отдельных ферментативных реакций – основы биологического
обмена веществ. Однако, специфичность у разных ферментов разная. Известны
следующие основные виды специфичности:
43
Абсолютная – фермент катализирует превращение только одного
субстрата.
Групповая – фермент действует на разные, но обладающие одинаковыми
типами атомных группировок субстраты. Например – пепсин, протеолитический
фермент, гидролизует только те пептидные связи, которые образованы
ароматическим аминокислотами.
По отношению к определенным типам реакций. Фермент катализирует
любые однотипные реакции. Например, липазы осуществляют гидролиз любых
сложных эфиров, включая липиды и фосфолипиды. Однако, в зависимости от
субстрата, например типа жирных кислот, скорость гидролиза может быть
различной.
Стереохимическая (пространственная). Фермент действует только на
превращение одной какой – либо стереохимической формы субстрата (£ и D
формы субстрата.
Таким образом под специфичностью фермента понимают его способность
отличать свой истинный субстрат от других родственных молекул. Такая
избирательность обусловлена высокой специфичностью фермент-субстратных
взаимодействий и наличием активного центра. Активный центр это особый
участок молекулы белка, где может связываться субстрат с образованием
фермент-субстратного
комплекса
(ФСК).
Причем,
хотя
эти
остатки
пространственно объединены, в линейной последовательности белка они часто
стоят далеко друг от друга. Существование ФСК доказано с помощью различных
экспериментальных методов, в том числе рентгеноструктурного анализа,
спектроскопических методов и электронного парамагнитного резонанса. Он почти
всегда построен всего лишь из нескольких аминокислотных остатков. Как
правило, формирование ФСК происходит без образования ковалентных связей, а
осуществляется за счет слабых, но более специфических типов взаимодействий –
водородных связей, солевых мостиков, гидрофобных взаимодействий и т.д.
44
Правда есть исключения, когда между ферментом и субстратом формируются
ковалентные связи – некоторые протеазы.
В настоящее время не существует единой теории, объясняющей
необычно высокую специфичность и активность ферментных катализаторов. В то
же время в отношении небольшого числа конкретных ферментов был выдвинут
целый ряд вполне вероятных гипотез, подтвержденных экспериментальными
данными. По-видимому, положенные в основу этих гипотез явления в
совокупности и обусловливают специфические свойств ферментов. В настоящем
разделе мы вкратце рассмотрим некоторые из этих гипотез. Поскольку все
рассматриваемые здесь гипотезы только частично объясняют механизм действия
ферментов, мы не будем пытаться обобщить эти данные с целью создания единой
теории ферментативной активности.
Первая, наиболее известная гипотеза, модель «ключ-замок»,
была
предложена в 90-х годах 20 века Фишером. Согласно этой модели фермент и
субстрат обладают жестким структурами, причем фермент подогнан к субстрату
как ключ к замку. Однако, эта модель не могла объяснить ряд фактов. Во-первых,
конкурентный ингибитор также подходит к ферменту как «ключ» к «замку», но
«замок» не открывается, т.е. реакция не идет. Во-вторых, физическими методами
было показано, что образование ФСК не статический, а динамический процесс.
В 1959 г. Коштландом была предложена гипотеза индуцированного
соответствия. Согласно этой общепринятой гипотезе, связывание своего
правильного субстрата индуцирует в белке небольшие конформационные
изменения. В результате этого изменения каталитические группы фермента
ориентируются таким образом, что становится возможным превращение
субстрата в продукт. Причем конформация субстрата, при связывании с
ферментом, также изменяется. Возникает напряжение в субстрате, т.е. в этой
гипотезе учтены недостатки предыдущей модели.
Для объяснения действия некоторых (гидролитических) ферментов была
выдвинута теория деформации субстрата (теория «дыбы» - напряженное
45
состояние). Эта теория объясняет механизм действия и многих лиаз, трансфераз.
Рассмотрим гидролиз соединения А-В Рис.1.13). Поверхность фермента имеет
углубления в тех участках, где происходит образование ФСК. Причем,
соединение возникает не в любом месте молекулы фермента, а лишь в двух
определенных точках. К одной точке присоединяется часть А, а к другой – В.
Связь А-В растягивается, перемещаются электроны и происходит разрыв,
сопровождающийся присоединением Н+ воды к В, а ОН- к А. Может быть и
обратная реакция.
Еще одна физическая теория предложена Перутц (Рис.1.14). Автор исходил
из того, что: во-первых, молекула фермента, всегда больше молекулы субстрата,
за редким исключением; во-вторых, полость фермента, активный центр,
преимущественно неполярна
молекулы
имеет
малую
(гидрофобна). Неполярная часть белковой
диэлектрическую
проницаемость,
практически
отсутствует ЭДС-поляризации обусловленное молекулами воды, что облегчает
46
электрические взаимодействия, т.е. фермент является не только специфическим
реагентом, но и средой реакции. Наличие фиксированных зарядов в полости
фермента может создать поле напряженностью несколько мВ на 1 нм., а это
100000 В на 1 см. Химическая связь, попадая в это поле может легко разорваться,
а в присутствии большого количества молекул воды, это не было бы возможным.
Некоторые ферменты осуществляют реакции, хорошо известные в химии.
Одной из таких реакций является общий кислотно-основной катализ, в котором
катализатор на одной из стадий процесса захватывает или отдает протон. Этот тип
катализа, в частности, лежит в основе механизма действия одного из немногих
ферментов,
для
последовательность
которых
предложена
элементарных
достаточно
стадий
убедительная
каталитического
полная
процесса.
Выделяемый из поджелудочной железы химотрипсин представляет собой
47
протеолитический
(т.
е.
гидролизующий
белки)
фермент,
специфично
расщепляющий пептидные связи, образованные карбоксильными группами
остатков тирозина, триптофана и фенила-ланина. Считается, что в реакции
химотрипсинового катализа как при отщеплении, так и при присоединении
протонов роль переносчика последних играет вода. В сущности, к общему
кислотно-основному катализу можно свести целый ряд очень важных в химии
клетки реакций, в том числе процессы присоединения к карбонильным
соединениям и гидролиз сложных эфиров.
В ферментативном катализе важную роль могут играть и другие факторы,
например ковалентный катализ, деформация связей, электростатический катализ,
многофункциональный катализ и эффекты растворителя. Детальное описание
этих эффектов можно найти в приведенной в специальной литературе, вероятно
они, как и рассмотренные в настоящем разделе факторы, могут оказывать влияние
на некоторые катализируемые ферментами реакции. Поскольку в общем случае
реакции ферментативного катализа включают в себя множество эффектов
неудивительно, что пока еще не удалость разработать простую общую схему,
которая позволила бы оценить их суммарное влияние и относительную
значимость каждого из них. К счастью, математические выражения для скоростей
катализируемых ферментами реакций можно вывести, опираясь лишь на
основную
концепцию
о
фермент-субстратном
комплексе
как
основном
промежуточном соединении.
1.3.4.Кинетика ферментативных реакций.
Браун А, и Анри В. впервые высказали мысль о том, что в основе
ферментативной реакции лежит обратимое взаимодействие S и Е с образованием
комплекса, который позже распадается с образованием продуктов и регенерацией
исходного фермента.
Ферментативную реакцию в простом случае одностороннего превращения
одного субстрата можно выразить общим уравнением:
48
В соответствии с этой схемой [S] обратимо реагирует с [E] с образованием
ФСК [ES]. Этот комплекс называют комплексом Михаэлиса.
Допустим, что ФСК все время находится в равновесии с исходными
веществами. Другими словами равновесие на первой стадии устанавливается
быстро и не нарушается высвобождением фермента от ES в направление k +2
Скорость
ферментативных
превращений
субстрата
равна
скорости
образования продукта (2-я стадия), если [S] >> [E]0, что бывает чаще, где [E]0 –
концентрация
фермента
в
начальный
момент
и
равен
Это и есть уравнение МихаэлисаМэнтен.
KS – субстратная константа = 1/KP (KP- константа равновесия).
Однако в этом уравнении отсутствует константа образования продукта k +2.
Холдейн и Бригс вывели уравнение более полно описывающее зависимость
скорости от концентрации субстрата.
Исходя из уравнения ферментативной реакции мы можем написать
уравнение скоростей образования и распада ФСК.
49
При достаточно быстром протекании стадии образование ФСК и его
превращения в продукт может быть реализовано состояние, когда концентрация
[ЕS] меняется во времени медленнее, чем концентрация [S] и [Е]. Это случай
возможен при [E]0 << [S].
Экспериментально доказано, что в реакциях при оптимальных условиях и
при [S] >> [E]0 быстро наступает стационарное течение процесса, при котором
распад [ES] по
направлению k-1 и k+2 уравновешивается его образованием в
направлении k+1. Тогда для стационарного состояния можно написать
k-1 [ES]+k+2 [ES] = k+1 [E][S]
или (k -1 +k +2) [ES] = k +1 [E] [S] (11)
Обозначим общую концентрацию фермента через [E]0, тогда
[E]0 = [E]+[ES] и отсюда [E]=[E]0-[ES](12).
Подставим [E] из уравнения 12 в уравнение 11 и получим:
(k –1 + k +2) [ES] = k +1 ([E]0 – [ES]) [S] (13). Отсюда найдем [ES].
(14)
разделим числитель и знаменатель на k +1 получим выражение:
(15)
Обозначив
Получим
(15)
(16)
50
Скорость может быть выражена
(17)
Подставим значение [ES] из уравнения 16 в уравнение 17 и получим
уравнение Холдейна-Бригс (ХБ), более известного как уравнение МихаэлисаМентен (ММ).
Получим
Рассмотрим
(18)
внимательно
выражение:
KM
–
константа
Михаэлиса, одна из важнейших констант в кинетике ферментативных реакций.
Если k–1 >> k+2, т.е. если обратный распад ФСК на исходные вещества
происходит гораздо быстрее его превращение в продукт, то можно пренебречь
k+2 и уравнение ХБ. прейдет в уравнение ММ. Это условие совпадает с
предположением о существовании равновесия на первой стадии в ходе всего
процесса. Т.е. принцип стационарности позволяет получить более общую форму
уравнения М.М., уравнение Х.Б.
Уравнение Х.Б. в целом хорошо описывает экспериментальные данные по
кинетике
ферментативных
реакций.
Чаще
всего
оно
принимается
в
дифференциальной форме, связывающий начальную скорость превращения
субстрата с его начальной концентрацией при заданном количестве внесенного
фермента:
(19)
Это объясняется тем, что в ходе реакции могут появиться некоторые
дополнительные эффекты – торможение продуктами, инактивация ферментов и
т.д., которые искажают ход временной зависимости по сравнению с уравнениями
М.М., Х.Б.
Взаимосвязь начальной скорости реакции [v]0 и начальной концентрации
субстрата [s]0 по уравнению Х.Б. представляет собой функцию имеющую свои
характерные особенности (Рис.1.15).
51
При достаточно малых концентрациях субстрата, когда KM >> [s0] уравнение
переходит в линейную форму
(20) , а при больших [s]0, если [s]0
>> KM кривая стремится к предельному значению k+2[E]0 , которую обозначают
через Vm.
Тогда Vm = k+2[E]0 (21).
Если V0=1/2 VM, то [s]0=KM. В силу
изложенного уравнения Х.Б. часто представляют в форме, удобной для
практической обработки экспериментальных данных:
(21)
Константы этого уравнения характеризуют активность фермента и его
сродство к данному субстрату, поэтому целью кинетического исследования
является прежде всего нахождение значений VM и КM . наиболее простое такое
исследование выполняется в виде серии экспериментов при постоянной
концентрации фермента [E]0 и изменяющихся начальных концентрациях
субстрата [s]0. В ходе каждого опыта изучается лишь начальный участок
кинетической кривой для определения начальной скорости реакции V0 имея набор
значений V0 при известных [s]0 легко найти кинетические константы.
Для этой цели удобны уравнения и графики Лайнуивера – Берка (Рис.1.16).
Общим свойством дробных рациональных функций, имеющих в числители
произведения, а в знаменателе сумму некоторых величин является их
52
способностью переходить в линейную форму при обращении левой и правой
части равенства:
при 1/s0=0 имеем
при 1/v0=0
(22)
т.е. прямая пересекает ось ординат в точке 1/VM, а
1/s0=- 1/KM . Таким образом, при продолжение прямой в
отрицательную область до пересечения с осью абсцисс она отсекает на оси
отрезок =- 1/КM
Недостатком координат Лайнуивера-Берка (ЛБ). является экстраполяция
прямой влево до пересечения с осями ординат, что приводит к ошибкам.
Одно из удобных решений исключающих недостаток графиков Л.Б.
заключается в использовании координат Эди-Хофсти
53
(Рис.1.17) и
описываемых
уравнением
Эди-Хофсти
(24)
В координатах с отрицательным углом наклона отсекается на осях ординат
отрезок, равный VM, а на оси абсцисс отрезок равный VM/KM.
Недостаток такого метода обработка является возможность возрастания
ошибок при делении, 2-х величин V0 и s0 каждая из которого измерена с ошибкой.
Определение VM=k2[E]0 позволяет по известной мольной концентрации
катализатора найти k
+2
– константу скорости распада ES. Константа Михаэлиса
определяет стационарную концентрацию ФСК
(25). Однако с
помощью КМ в общем случае нельзя найти ни отдельные элементарные константы
k
-1
и k+1 ни их отношение – субстратную константу КS . для определения К1
нужно изучать кинетику нестационарной реакции на самых первых стадиях, что
для быстрых каталитических реакций представляет большие экспериментальные
трудности и часто связано с диффузионными ограничениями. Поэтому обычно
величину
КМ
рассматривают
как
некоторую
54
эффективную
величину,
представляющую совокупность элементарных констант. Естественно, что при k
<< k
-1
+2
стационарная концентрация комплекса E-S мало отличается от
равновесной, а КМ равно субстратной константа КS константе диссоциации
комплекса ES: КМ=КS . Для многих ферментативных реакций раздельное
определение КS и KM показало, что эти величины отличаются мало, исключение
составляет каталаза, пероксидаза. Как обычно KM лежит в пределах 1-10-8м/л, но
чаще встречаются значения 10-4 M/л.
При
уверенности
отсутствия
посторонних
факторов
и
располагая
математическим выражением для скорости ферментативной реакции, (уравнение
Х.Б. М.М.) мы можем определить изменение концентрации реагентов во времени
путем интегрирования уравнения методом разделения переменных:
(26)
интегрирование в пределах от 0 до t и соответственно от S0 до S приводит к
уравнению Уоелкера-Шмидта (Рис.1.18).
(27)
55
Надо иметь виду, что на практике это уравнение проще использовать для
расчета времени t, необходимого для достижения определенных концентраций
субстрата, а не наоборот.
1.3.5. Влияние температуры на ферментативные реакции.
Увеличение температуры приводит к увеличению скорости ферментативной
реакции, как и любой химической реакции. Однако в первом случае это
увеличение скорости наблюдается лишь с сравнительно узком интервале
температур.
Зависимость
скорости
ферментативной
реакции
выражается колоколообразной кривой с максимумом (Рис.1.19).
56
графически
Основной причиной снижения V после Топт является тепловая денатурация.
Из-за различия в молекулярном строении белков – ферментов, ТОПТ
различно
для разных ферментов. Кроме того температура влияет на скорость расщепления
[ES], на константу k+2, на сродство фермента к субстрату КМ и т.д. далее. Вы из
курса химии знаете, что для того чтобы молекулы вступили во взаимодействие
они должны быть активированы. Путем повышения температуры увеличивают
количество молекул, находящихся в активированном состоянии и повышает
скорость реакции.В пределах температур, когда тепловая денатурация не играет
существенной роли, зависимости V ферментативной реакции от температуры
описывается уравнением (28) и графиком Аррениуса (Рис1.20):
К = e-Ea /RT
lnK=-E a/RT (28).
57
Это уравнение используют для проведения энергии активации. Тангенс угла
наклона равен –ЕA/R, если прямая имеет излом, то в процессе участвуют 2
фермента.
Для характеристики влияния температуры на скорость форм реакции
пользуются коэффициент Вант – Гоффа Q10, показывающий во сколько раз
ускоряется данная реакция при повышении температуры на 100С.
Если подставить в уравнение Аррениуса этот коэффициент получим
уравнение
или
(29)
Это выражение дает возможность определить энергию активации путем
определения Q10 для данной ферментативной реакции.
Для ферментативной реакции обычно коэффициент Вант-Гоффа =1-2 для
химических реакций без фермента 2-3 (для физических процессов 1,1 – 1,3), для
ферментативных около 1,7, для химических 2-4).
Из выше приведенного уравнения следует также, что энергия активации и
логарифм температурного коэффициента связаны линейной зависимостью.
Следовательно, реакции, имеющие более высокую энергию активации, будут
иметь более выраженную температурную зависимость. Энергия активации
58
большинства биологических процессов – того же порядка, что и для химических
реакций. Группируется у трех величин 8, 12, 18 ккал/моль.
1.3.6. Влияние рН на ферментативные реакции.
Помимо температур на фермент очень сильно влияет рН. Если выразить
графическое влияние рН на действие ферментов, то для 4-х разных ферментов мы
получим зависимость отображенную на рис.1.21.
Изменение активности фермента от рН зависит от целого ряда факторов:
-т.к. фермент является белком и содержит различные ионизирующие группы,
изменение рН среды изменяет состояние ионизации этих групп, как следствие
заряд белковых молекул. Взаимодействие субстрата с ферментом зависит от
распределения зарядов в молекуле последнего;
-если субстрат имеет заряды, то сродство его разных ионных форм к
ферменту различаются;
-превращение комплекса фермент – субстрат и комплекса фермент – продукт
может происходить лишь при каком – то определенном состоянии ионизации
комплекса;
- в некоторых окислительно-восстановительных ферментативных реакциях
водородные или гидроксильные ионы могут непосредственно участвовать в
реакции;
59
- от рН также зависит скорость денатурации и инактивации фермента;
Т.о. кривая, характеризовавшая влияние рН на активность фермента является
суммарной, отражающей весь сложный характер влияние рН целый ряд факторов.
Оптимум рН для действия фермента зависит также от концентрации тех или
иных ионов в реакционной среде.
14.1. Эффекторы ферментов. Механизмы регуляции ферментных
реакций.
Изменить или моделировать каталитическую активность Е могут не только S,
но и другие взаимодействующие с Е вещества – эффакторы. Они могут быть
обычными компонентами клетки, или могут проникать в клетку из среды, а также
действовать на изолированные ферменты. Мы в основном будем рассматривать
ингибиторы – вещества понижающие ферментативную активность, однако,
следует иметь в виду, что есть вещества, которые активируют ферменты.
Взаимодействие фермента с эффактором представляет с собой химическую
реакцию и поэтому может быть полностью или частично обратимым, или
необратимым
(например,
первопаралитические
яды).
Если
процесс
ингибирования необратим, то кинетика ингибиторзависимых реакций не
подчиняется уравнению М.М., основой которого является наличие равновесия
между свободной и связанной формами фермента. Часто по мере полной
инактивации все большего количества молекул фермента процесс необратимого
ингибирования
прогрессирует
во
времени.
А
других
случаях
фермент
инактивируется лишь частично и сохраняет каждую часть каталитической
активности (механизм не ясен).
Как вам известно микроорганизмы способны продуцировать множество
разнообразных сложных соединений из относительно небольшого числа простых
предшественников. Для достижения этой цели необходимо система эффективного
распределения поступающих предшественников по многим биосинтетическим
путем, ведущим к различным конечным продуктам метаболизма. В большинстве
60
случаев принцип оптимального усвоения доступного исходного продукта требует
синтеза любого из конечных продуктов в строго необходимом количестве.
Наряду с индукцией и репрессией изменяющих скорость синтеза белков
(ферментов) на уровне генов, одним из регуляторных механизмов, используемых
клеткой для достижения максимально эффективного усвоения питательных
веществ, является обратимая регуляция ферментативной активности.
Рассмотрим пример регуляции простой последовательности реакций (Рис.
1.22 ).
Регуляция
последовательности
реакций
представленных
на
схеме
осуществляется ингибированием по типу обратной связи, когда конечный
продукт, L-изолецин, ингибирует активность фермента Е, катализирующего
первую стадию последовательности. Т.о биосинтез L-изолецина будет тормозится
по мере ее накопления. Поскольку катализируемая ферментами Е2-Е5 реакции
находятся в состоянии равновесия, а первая реакция «необратима», то
быстродействие такой регуляции высоко. Существуют и другие способы
регуляции активности ферментов.
Аллостерическая регуляция. Фермент изменяет активность с помощью
нековалентно связанного с ним эффектора. Связывание происходит в участке,
пространственно удаленном от активного (каталитического) центра. Это
связывание
вызывает
конформационные
61
изменения
в
молекуле
белка,
приводящие к изменению определенной геометрии каталитического центра.
Активность может увеличиться - это активация фермента, или уменьшиться - это
ингибирование (1.23).
«Сообщение» о присоединении аллостерического активатора передается
посредством конформационных изменений каталитической субъединице, которая
становится комплементарной субстрату, и фермент «включается». При удалении
активатора фермент вновь переходит в неактивную форму и «выключается».
Аллостерическая
регуляция
является
основным
способом
регуляции
метаболических путей.
Регуляция
активности
ферментов
путем
фосфорилирования-
дефосфорилирования . Фермент изменяет активность в результате ковалентной
модификации. Это м ожно проиллюстрировать на примере липазы (Рис.1.24)
62
Как видно из рисунка
фосфатная группа - ОРО32- присоединяется к
гидроксильным группам в остатках серина, треонина или тирозина. В
зависимости от природы фермента фосфорилирование может его активировать
или, наоборот, инактивировать. Реакция присоединения фосфатной группы и ее
отщепление
катализируют
специальные
ферменты
-
протеинкиназы
и
протеинфосфатазы.
Регуляция путем ассоциации-диссоциации субъединиц в олигомерном
ферменте. Этот процесс иногда начинается с ковалентной или нековалентной
модификации одной из субъединиц. Например, фермент протеинкиназа в
неактивной форме построена как тетрамер R2C2 (R и С - разные субъединицы).
Активная протеинкиназа представляет собой субъединицу С, для освобождения
которой необходима диссоциация комплекса. Активация фермента происходит
при участии cAMP (циклоаденозинмонофосфорная кислота), которая способна
присоединиться к субъединице R, после чего изменяется конформация,
комплементарность субъединиц R и С и происходит диссоциация комплекса:
R2C2 + 2cАМР 2С + 2(R -сАМР) Циклический АМР является продуктом АТР,
превращение которой катализирует фермент аденилатциклаза: АТРс АМР +
Н4Р2О7
63
Аденилатциклазная
катализируют
система.
взаимосвязанные
Аденилатциклаза
реакции,
которые
и
протеинкиназа
составляют
единую
регуляторную систему (Рис.1.25).
С помощью этой системы в клетку передаются сигналы из внеклеточной
среды, и в нужном направлении изменяется метаболизм клетки. Внеклеточным
вестником сигнала могут быть разные молекулы, в том числе и гормоны. Эти
молекулы
не
проникают
внутрь
клетки,
но
«узнаются»
мембранными
рецепторами (Рис.1.26). При активации аденилатциклазы происходят следующие
этапы:
64
изменение конформации рецептора после присоединения к нему сигнальной
молекулы и увеличение его сродства к регуляторному G-белку. В результате
образуется комплекс рецептора и протомеров G-белка;
образование этого комплекса приводит к изменению конформации a протомера G-белка, который теряет сродство к GDP и происходит замена GDP на
GTP. В результате комплекс протомеров G-белка распадается;
a -протомер взаимодействует с аденилатциклазой, что ведет к изменению ее
конформации и как следствие этого - активации;
после этого аденилатциклаза катализирует синтез cAMP, который в свою
очередь активирует cAMP-зависимую протеинкиназу. Активация последней
связана с диссоциацией комплекса входящих в нее протомеров после
присоединения
cAMP.
Протеинкиназа
фосфорилирует
соответствующие
ферменты, изменяет их активность и, следовательно, скорость метаболизма в
клетке.
Активация ферментов путем частичного протеолиза. Некоторые ферменты
синтезируются первоначально неактивными и лишь после секреции из клетки
переходят
в
активную
форму.
Неактивный
предшественник
называется
проферментом. Активация профермента включает модификацию первичной
структуры с одновременным изменением конформации. Например, трипсиноген,
65
синтезированный в поджелудочной железе, затем в кишечнике превращается в
трипсин
путем
удаления
фрагмента
с
N-конца:
энтеропептидаза
трипсиногентрипсин + Val-(Acn) -Lys Расщепление определенных пептидных
связей «запускает» новые взаимодействия R-групп по всей молекуле, приводя к
новой
конформации,
в
которой
R-группы
активного
центра
занимают
оптимальное положение для катализа. Нарушения структуры какого-либо
фермента, ведущие к снижению его активности, приводят к нарушению
метаболических путей, в которых участвует этот фермент. Такие нарушения
почти всегда проявляются как болезни. Повреждения ферментов бывают двух
типов: наследственные дефекты строения фермента и повреждения, вызванные
попадающими в организм токсическими веществами, ингибирующими фермент.
Следует отметить, что изучение этого вопроса имеет и важное значение и для
биотехнологии. При использовании нативных и иммобилизованных ферментов в
технологиях, небольшие количества ингибиторов и активаторов могут попадать в
реакционную среду с ферментом, с субстратом с растворителем.
Поскольку многие
изолированные
фермент
–
субстратные
системы
подчиняются кинетики М.М., принято классифицировать ингибиторы по их
влиянию на параметры уравнением М.М. обратимые ингибиторы называют
конкурентными, если в их присутствии повышается значение К М, а VМ не
изменяется. Вызываемый ингибиторами такой эффект можно подавить путем
повышения концентрации субстрата.
Неконкурентные ингибиторы, напротив, инактивируют фермент или ФСК
путем уменьшения VМ фермента, но не влияют на КМ. Здесь уже ингибирующий
эффект субстратом снять уже невозможно.
Встречаются сочетание и варианты этих 2-х основных типов обратимых
ингибиторов.
1.4.2
Механизмы
конкурентного
реакций.
66
ингибирования
ферментативных
Многие из известных конкурентных ингибиторов по своей химической
природе близки обычным субстратом и поэтому их иногда называют
субстратными
аналогами.
Считается,
что
такие
ингибиторы
имеют
пространственную структуру типа ключа, который может входить в «замок»
активного центра фермента, однако не открывает замок, т.е. реакции не идет
(Рис.1.27). Например, конкурентное ингибировании лежит в основе механизма
действия сульфамидного препарата (стрептоцида). Структура стрептоцида очень
близка структуре α– аминобензойной кислоты – важного витамина многих
бактерий. Стрептоцид ингибирует фермент участвующий в превращение α–
аминобензойной
кислоты
в
фолиевую
кислоту,
тем
самым
блокирует
биохимический аппарат бактерий и они гибнут (Рис.1.28).
1.4.3. Механизмы неконкурентного (аллостерического) ингибирования
ферментных реакций.
При другом механизме, называемой аллостерической регуляцией, поведение
ФСК типично для неконкурентного ингибирования. Название аллостерический
(т.е. имеющий другую форму) было дано этому механизму с начало на том
основании, что по своему строению. Многие эффекторы ферментативной
67
активности существенно отличаются от субстратов. Т.е. регуляторное действие
таких эффекторов основано на их связывание со специфическим регуляторным
центром фермента, отличным от активного центра. Поэтому ферменты
обладающие центрами регуляции и катализа называют аллостерическими.
Аллостерическая регуляция может как ингибировать, так и активировать
каталитическую способность фермента.
Рассмотрим схему отображающую процесс аллостерической регуляции (Рис
.1.29).
Как видно из схемы связывания активатора А и субстрата S приводит к
каталитически активной форме (R) фермента, а связывание ингибитора изменяет
конформацию всех субъединиц в олигомерном белке таким образом, что
молекула белка принимает неактивную Т-форму.
Следует отметить, что большинство аллостерических ферментов являются
олигомерными белками, поэтому фермент на схеме изображен в виде 2-х
субъединиц.
Доказательством
ферментативной
справедливой
реакции
этой
явилось
68
аллостерической
экспериментальное
теории
изучение
аспартилтранскарбамоилазы (АТС – азы). После разделения фермента на 2
субъединицы выяснилось, что на обладающую каталитической активностью
крупную субединицу ингибитор интактного фермента ЦТФ не влияет. Напротив,
меньшая субъединица каталитически не активна, но связывает ЦТФ. Эффекторы
также могут влиять на такие параметры как сродство субстрата к ферменту,
концентрацию несвязанного фермента, скорость распада ФСК, на кофакторы.
1.4.4.Кинетика ферментных реакций при конкурентном ингибировании.
Теперь попробуем с помощью уравнений М.М. количественно описать
влияние эффекторов. Если ингибитор является химическим аналогом субстрата,
не способным претерпевать каталитическое превращение, по занимающим
активное место в молекуле катализатора (т.е. наблюдается конкурентное
ингибирование) возникает альтернатива: образуется либо неактивный продукт ЕI,
либо промежуточное соединение ЕS.
E + S ↔ ES
(1)
KS
константы
E + I ↔ EI
(2)
Ki диссоциации
Медленная стадия этих реакций
E + S → EР
(3)
Поскольку часть фермента связана в комплексе EI, не весь фермент участвует
в каталитическом превращением субстрата и скорость реакции в присутствии
ингибитора замедляется.
Общее содержание фермента состоит из свободного, и входящего в
комплексы ES и EI. Тогда уравнение материального баланса по ферменту
выглядит следующим образом:
[Е] + [ES] + [EI] = [E]0
(4)
Если допустить, что концентрации промежуточных продуктов ES и EI
равновесны и учесть уравнению общего материального баланса по ферменту, то
скорость реакции можно выразить через общую концентрацию фермента [E]0 и
концентрации свободного субстрата [S] и ингибитора [I].
69
(5)
Общая скорость реакции будет определяться медленной стадий, т.е. имеет
вид:
V =k+2 [ES]
(6)
Так как продукты реакции образуются только при распаде ES. Если
образование комплекса [EI] является обратимым процессом, то добавление
ингибитора не меняет максимальной скорости реакции:
(7) Но влияет на
эффективное значение константы Михаэлиса. Это следует из того, что в условиях
насыщения выполняются условия:
[s0 ]>>Ks ; [s0 ]>>Ki ; [s0 ]>>[I] ;
А при этих условиях весь ингибитор из комплекса EI будет вытеснен
молекулами S, т.е. концентрация ЕS будет близка к [Е]0 независимо от наличия в
системе ингибитора, который остается в свободном состоянии. А эффективна
константа Михаэлиса, как видно из уравнения (5) в присутствии конкурентного
ингибитора возрастает:
(8)
1.4.5.
Экспериментальная
оценка
кинетических
параметров
ферментативных реакций при полном конкурентном ингибировании
В координатах Лайнуивера-Берка. Если это так, т.е. VМ не изменяется, а КМ
изменяется, то при любой концентрации I экспериментальные данные υ0 от [S]0
должны образовать в координатах Лайнувера-Бэрка прямую пересекающую ось
ординат в (1) 1/ V.
Если проводить эксперименты при изменяющийся концентрации ингибитора,
то на графике Л-Б будет получаться пучок прямых пересекающихся в одной точки
на оси ординат, отсекая отрезок 1/ V( Рис.1.30 )
70
.
Так как каждая из прямых будет отсекать на оси абсцисс отрезок равный –
1/КМ, то из найденных этим способом значений КМ легко найти КS и КI строя
линейную зависимость в координатах
(Рис.1.31 )
(9)
Если значения VМ и КS для фермента известны и требуется найти лишь
константу ингибирования КI, удобно использовать координаты Диксона,
сязывающие 1/υ0 с [I].
71
Обратим
уравнение
Из уравнения следует, что в координатах 1/υ0 = f[I] можно получить пучок
прямых, угол наклона которых будет определяться начальной концентрацией
субстрата.
Проанализируем уравнение 10.
Если
[I].=
-
итого
КI,
то
заменим
[I].на
-
КI
во
втором
слагаемом
, т.е.
Так как при конкурентном ингибировании VМ не меняется, то пучок прямых
будет проходить через точку с абсциссой - КI и пересекается в точки ординаты
+1/ VМ (Рис.1.32).
72
Т.о. при полном конкурентном ингибировании серия экспериментов по
зависимости начальной скорости от концентрации ингибитора при различных
начальных концентрациях субстрата S0 и постоянном значение Е0 дает в
координатах Диксона пучок прямых, пересекающихся в одной точке. Ее абсцисса
позволяет найти константу нестойкости фермент ингибиторного комплекса.
1.4.6.
Кинетика
ферментативной
реакций
при
неконкурентном
ингибировании.
Если последовательные реакции: (1) и (2)
E+S ↔ES
KS
E+I↔ EI
Ki
ES →E+P
Дополнить реакциями
EI+S ↔EIS
KSа (11)
ES+I ↔EIS
Kiа (12)
То мы получим модель полного неконкурентного ингибирования. Как видим
в этом случае еще образуется малоактивный комплекс EIS, причем сродство
субстрата к катализатору не зависит от присоединения к нему ингибитора.
В то же время, мы примем, что связывания субстрата не связывается на
сродство фермента к ингибитору. Тогда получается, что KSа и Kiа в уравнениях
(11) и (12) идентичны соответствующим константам диссоциации в уравнениях
(1) и (2).
Причем также, что комплекс EIS не диссоциируется с образованием продукта
реакции Р. понижение скорости реакции связано с переходом некоторой части
катализатора в комплексе с EI и неактивный или малоактивный комплекс EIS.
Тогда аналогично случаи с конкурентом ингибированием, т.е. с учетом
равновесности реакций (1), (2), (11) и уравнения материального баланса по
ферменту можно получить следующее выражение для скорости реакций.
(13)
73
Нетрудно заметить, что это уравнение совпадает по форме с уравнением М.М., причем константа Михаэлиса осталась без изменений, а максимальная
скорость реакции снизились и стала зависимой от концентрации ингибитора.
(14)
Отсюда следует, что присутствии конкурентного ингибитора добавление к
реакционной смеси сколь угодно большого количества субстрата не позволит
повысить максимальную скорость реакций до той величины, которая может быть
достигнута в отсутствии ингибитора.
1.4.7.
Экспериментальная
оценка
кинетических
параметров
ферментативных реакций при полном неконкурентном ингибировании.
Рассмотрим уравнение (13). Для того, чтобы перейти на координаты
Лайнувера-Бэрка нужно обратить это уравнение:
Работаем с этим уравнением, чтобы найти точку пересечения прямой на оси
абсцисс и на оси ординат.
Вначале еще немного преобразуем последнее уравнение более удобную
форму.
(15)
Если
то, произведение справа также равно 0. Но с связи с тем, что
не может быть равно 0, а иначе теряла бы смысл все наши рассуждения
(наличие ингибитора), то
,
,
74
отсюда
(16) т.е. при
различных значениях [I] наши прямые будут пересекаться в общей точки на оси
абсцисс в точки
Ели же
Итого
(Рис .1.33)
то из уравнения (15) следует:
(17)
Из (17) следует, что обратные величины VМ. при различных концентрациях
ингибитора, будут отличаться на величину
т.е. имеют различные
величины.
Т.о. при полном неконкурентным ингибировании в координатах Л-В, для
опытов с различными значениями [I] получаются пучок прямых пересекающих
ось ординат в различных точках равных 1/Vm1 , 1/Vm2 и т.д.
Из уравнения (14) можно переписать в таком виде
75
или
(18)
Из этого уравнения следует, что в серии экспериментов по определению υ0
при различных S0 и Е0 в координатах
должна получиться прямая
отсекающая на оси ординат отрезок равный 1/к (Рис.1.34) - проверить
самостоятельно
.
Для обработки серии опытов по измерению υ0 при различных S0 и I можно
использовать координаты Диксона
Как и в случае с полным конкурентным ингибированием преобразуем (13)
для неконкурентного ингибирования.
(13)
обращаем
уравнения
(19)
76
Если
,то заменим
на
в уравнение (19)
(20)
Т.е. при
все прямые описываемые зависимостью пересекаются в
общей точки на оси абсцисс. Это позволяет легко находить константу
нестойкости комплекса фермента с полным неконкурентным
ингибитором, а
также удобно для количественного определения типа ингибитора. Вспомним
пучок прямых в координатах Диксона
пересекается во втором квадрате (а
не на абсциссе) при полном конкурентном ингибировании и в общей точке на оси
абсцисс при полном неконкурентном ингибировании. В обоих случаях абсцисса
точки пересечения равна –КI (Рис.1.35).
1.4.8. Субстратное торможение.
Экспериментально установлено, что скорость ферментативных реакций, при
увеличении концентрации субстрата, достигнув максимума начинает падать
(Рис.1.36.).
77
Такой вид торможения активности фермента носит название субстратного
торможения.
Если S больше Sопт, соответствующего Vmax , то снижение концентрации
субстрата вызывает повышение скорости реакции. Автокаталитический характер
реакций такого типа может оказывает существенное влияние на работу
биологических реакторов.
Причиной снижения скорости ферментативной реакции под влиянием
избытка субстрата является взаимодействие промежуточных соединений еще с
одной молекулой субстрата, в результате чего образуется неактивное соединение,
т.е. комплекс, не дающий конечных продуктов реакции. Другими словами
фермент
связывает
вторую
молекулу
субстрата,
причем
в
результате
присоединения S к ЕS образуется нереакционноспособное промежуточное
соединение.
В простейшим случае такой механизм субстратного торможение может быть
выражен следующей схемой:
E+S ↔ES
(1)
ES+S↔ ES2
ES →E+P
KS=(k-1)/(k+1)
(2)
(3)
Ki=(k-3)/(k+3)
медленная стадия
78
Скорость образования активного комплекса ES может быть выражена
уравнением:
(21) (4)
При стационарном течение процесса, когда ES=const,
То
Принимаем во внимание, что
(22)
и выразив концентрацию неактивного комплекса [ES2] через константу его
диссоциации KS=(k-3)/(k+3) или через концентрацию
(23) путем
нескольких преобразований, аналогичных при выводе уравнений Х-Б (сделать
самостоятельно) получим
(24)
Видно, что уравнение (7) по форме аналогично основному уравнению
ферментативной кинетики и отмечается от него добавлением в знаменателе
Проанализируем уравнение (24):
а) при низких концентрациях субстрата, т.е при
скорость
линейно возрастает с ростом S.
(25)
б) при очень высоких концентрациях субстрата, т.е.
реакции почти линейно падает с увеличением [S0].
79
скорость
(26)
При
некотором
(оптимальная
промежуточном
концентрация
[S0].опт)
значении
наблюдается
концентрации
субстрата
максимальная
скорость.
Значение [S0].опт является характерным для каждой ферментативной реакции и
определяется константами КМ и КS1
Для того, чтобы установить [S0].опт нужно найти производную
и
приравнять ее нужно. В результате получится выражение:
(27)
Для анализа экспериментальных данных ферментативной реакции при
субстратном торможение используют графическое выражение в форме двойных
обратных величин. Поскольку
то наше уравнение (7) перепишем в
таком виде:
(28)
Возьмем обратные величины (обратим уравнение)
(29)
Если провести эксперименты с различными концентрациями субстрата,
охватывающим все области зависимости
будет иметь вид кривой с минимумом (Рис.1.37).
80
то зависимость
Как видно из рисунка правая ветвь кривой в областях малых [S0], где
выполняется уравнение М.М. и член
не играет существенной роли носит
линейный характер. Продолжение линейного участка до пересечения с осью
ординат отсекает отрезок равный
равен
тангенс угла наклона линейного участка
Таким образом графически можно определить КМ и V.
Для определения КS удобнее (в области высоких концентраций [S0])
экспериментальные данные выражать в форме зависимости
В этом случае
также получается кривая с минимумом (Рис.1.38) переходящая в прямую в
81
области высоких концентраций субстрата, где член
имеет существенной роли, т.е.
уравнения (29) не
(30)
Продолжение линейного участка кривой до пересечения с осью абсцисс
отсекает на этой оси отрезок равный КS. Для более сложных по механизму
ферментативных реакций зависимость
, а также [S0].опт не могут быть
выражены вышеприведенными простыми соотношениями.
Глава 2.
Иммобилизованные ферменты и инженерная энзимология.
2.1.Носители для иммобилизации ферментов и клеток
Современная
инженерная
биокатализаторов
в
стабильностью
и
энзимология
иммобилизованном
возможностью
базируется
виде
на
применение
отличающихся
многократного
высокой
использования.
Иммобилизация биокатализаторов - это перевод их в фиксированное на или в
82
носителе состояние,
с сохранением максимально возможной каталитической
активности. Для получения иммобилизованных ферментов и клеток используют
большое число носителей – органических и неорганических которые должны
обладать следующими свойствами: .высокая химическая и биологическая
стойкость; .высокая механическая прочность; .достаточная проницаемость;
большая удельная поверхность; вместимость, пористость;.возможность получения
в виде удобных в технологическом отношении форм (гранулы, мембраны, трубы,
листы, кубики и т.д.);.легкое проведение в реакционно-способную форму
(активация);.высокая гидрофильность, обеспечивающая возможность проведения
реакции связывания фермента с носителем в водной среде; доступность,
дешевизна.
Органические полимерные носители
Применяемые
в
инженерной
энзимологии
полимерные органические
носители можно разделить на 2 больших класса: 1- природные полимеры и 2синтетические полимерные носители.
Природные носители имеют как преимущества так и недостатки. К
недостаткам можно отнести их неустойчивость к воздействию микроорганизмов,
довольно высокую стоимость и термофобность.
Полисахариды
–
наиболее
часто
для
иммобилизации
используют
полисахариды целлюлозу, декстран, агарозу, каррагинан и их производные.
Целлюлоза - представляет собой поли-1,4-β-D-глюкопиранозин - Dглюкапиранозу. Она обладает высокой гидрофильностью. Присутствие большого
количество ОН- групп дает возможность ее легко модифицировать путем
введения
различных
заместителей.
Препараты
целлюлозы
«сшивают»
эпихлоргидрином для придания им химической прочности. Для увеличения
механической прочности целлюлозу гранулируют в виде пористых сферических
гранул. Существует 2 способа гранулирования: осаждение в вводно-органической
среде и
гидролиз с разрушением аморфных участков. Гранулированную
целлюлозу легко превращают в различные ионообменные производные: ДЭАЭ –
83
целлюлоза, КМ-целюлоза и т.д. Недостатки целлюлозы – неустойчива к
воздействию сильных кислот, щелочей.
Хитин
– основной компонент наружного слоя скелета членистоногих, а
также клеточные оболочки некоторых грибов. Является отходом переработки
крабов и др. ракообразных.Не растворяется в воде, разбавленных кислотах и
щелочах. Модифицируют глутаровым диальдегидом или солями тяжелых метало
(титан IV). Хитин можно рассматривать как целлюлозу, в которой СН2ОН –
группа заменена ацетамидными остатком.
Декстран – разветвленный полисахарид из бактериальных источников,
содержащий
остатки
глюкозы.
Гели
на
основе
декстрана,
сшитые
эпихлоргидрином выпускаются под названием «сефадекс» и «моноселект».
Сефадексы очень гидрофильны. Маркировки G - для воды,
LH – для
органических растворителей. К декстранам относят крахмал, губчатый крахмал.
Агароза – из-за дороговизны ведут поиск методов модификации с целью
обеспечения легкой реакции носителя. Если охладить 2-6% водный раствор
агарозы
до
450С
образуются
крупнопористые
гели,
которые
нельзя
автоклавировать и высушивать. Различные фирмы выпускают гели на основе
агарозы под названием «сефароза», «биогель», «ультрагель».
Агар – компонент клеточных мембран некоторых красных морских
водорослей, содержит 2 полисахарида агарозу и агаропектин. Гели получают при
охлаждении 2-5% ного горячего водного раствора.
Альгиновые кислоты и их соли альгинаты – альгинат полисахарид основной
структурный, бурых морских водорослей. В присутствии моноавлентных
катионов полисахарид, даже в низких концентрациях, образует вязкий раствор, а в
присутствии 2-х валентных катионов (Са2+) наблюдается образование геля.
Каррагинаны
используют
–
гетерогенные
полисахариды.
Для
иммобилизации
κ- каррагинан – нерастворимую фракцию, получаемую путем
добавления ионов кальция к водному экстракту каррагинана в физиологическом
растворе, в присутствии ионов К+.
84
Белки – для иммобилизации используют ограниченно, из-за подверженности
воздействию микробами. Вместе с тем белки обладают и рядом преимуществ:
образуют
очень
тонкие
пленки
(мембраны),
обладают
значительной
вместимостью для ферментов, способны к биодеградации. Наиболее часто в
качестве носителей применяют структурные белки кератин, фибрион, коллаген,
двигательные – миозин, транспортные – сывороточный альбумин. Кератин,
получаемый путем специальной обработки перьев, имеет в своем составе
серосодержащую аминокислоту, цистеин, поэтому представляет особый интерес
для иммобилизации SH – ферментов. Этот белок нерастворим в воде, слабых
кислотах и щелочах, в спирте, эфире, ацетоне.
Синтетические полимерные носители
Большинство синтетических полимерных носителей используемых для
иммобилизации ферментов и клеток – полимеры на основе акриловой кислоты.
Прежде всего это акриламид – гидрофильный носитель. Обычно ферменты и
клетки включают в полиакриламидный гель (ПААГ), который получают при
сополимеризации – акриламида со сшивающим агентом N,N – метилен – бис –
акриламидом (МБАА). При этом нити акриламида, сшитые МБАА, образуют
жесткую и стойкую пространственную сетку геля. ПААГ выпускается рядом
иностранных фирм под различными названиями в зависимости от присутствия
функциональных групп - энзакрил и др. Чтобы получить реакционно-способные
полимеры для ковалентной иммобилизации, вводят активные химические группы
в готовый полимер методом химической модификации, или активируют
соответствующее
функциональное
производные
мономера.
В
качестве
активаторов чаще применяют цианогалогены. Для получения гелей, обладающих
более жесткой и инертной структурой, сшивают носители синтетического и
природного происхождения, например, ПААГ и агарозу. Носители на основе
синтетических полимеров – акрилов и виде сферических гранул, выпускаемые за
рубежом, называются «сферонами».
85
Среди других синтетических полимерных носителей следует отметить
полиамидные носители. Это гетерогенные полимеры с повторяющейся амидной
группой – С(О)-NH - , найлон 6, капрон и др. Для использования в качестве
носителей полиамиды активируют, частично гидролизуя, с последующей
обработкой глутаровым альдегидом. Достоинство носителей этого типа – можно
готовить носители в различных формах – гранулы, порошки, волокна, мембраны и
т.д.
В последнее время для иммобилизации широко применяют носители на
основе поливинилового спирта (ПВС). Гидрофильные гели на основе ПВС
получают применяя сшивающие агенты ( ксилендихлорид, хлоргидрин в
щелочной среде, глутаровый альдегид в кислой среде или облучают УФ- светом ).
Еще один способ – это получение криогелей без смешивающих агентов.
Удобным
материалом
для
включения
ферментов
в
гель
являются
гидрофильные полиуретановые полимеры. Во- первых иммобилизация с их
использованием легко достигается простым смешиванием полимера и клеток или
ферментов без дополнительного нагревания или сдвига рН; во-вторых,
гидрофильные исходные полимеры с необходимыми физическими и химическими
свойствами могут быть получены в отсутствии ферментов, т.е. исключается
инактивация ферментов мономерами.
Часто матрицы сами по себе трудно использовать в качестве факторов
способствующих удержанию – фермента или клетки на поверхности носителей.
Для того чтобы матрица могла выполнить эту функцию нужно ее активировать,
т.е. провести такую химическую реакцию, чтобы на поверхности образовались
электрофильные группы, обладающие большой реакционной способностью по
отношению к нуклеофильным группам на белке (амино -, карбокси - и ОН –
группы). Наиболее эффективными электрофильными группами являются:
имидокарбонаты,
карбонаты,
эпоксиды,
активированные атомы галогенов.
86
активированные
двойные
связи,
Получение этих производных довольно сложный процесс. Для каждого
носителя используют свои реагенты в зависимости от наличия в них тех или иных
функциональных групп (гидрооксильных, карбоксильных, аминных и др.).
Органические низкомолекулярные носители
Многие ферменты для проявления своей активности нуждаются в
присутствии липидов. Кроме того, большинство ферментативных реакций
протекают или вблизи биологических мембран, представляющих собой смесь
липидов, т.е. иммобилизация фермента на природных липидах это приближение
условий
функционирования
биокатализатора
к
условиям,
близким
к
естественным. Для этих целей чаще всего применяют фосфолипиды – основные
липиды биологических мембран. Фосфолипиды состоят из глицеринового
основания, остатка фосфорной кислоты, аминоспирта (полярная головка) и 1 или
2-х радикалов – остатков жирных кислот. Из-за особенности физико-химических
свойств, наличия гидрофобных хвостов и гидрофильной головки, фосфолипиды
способны
образовывать
мономолекулярные
и
бимолекулярные
остатки,
сферические тела, цилиндры и т.д.
В качестве носителей можно использовать также
липидов
(поверхностно-активные
(полиоксиэтиленалкилфениловые
эфиры), твин
синтетические аналоги
вещества)
тритон
(оксиэтилированные эфиры
ангидросорбита и жирных кислот), бридж (простые эфиры полиоксиэтилена).
Неорганические носители
Из-за легкости регенерации и возможности придания им различных
конфигураций неорганические носители находят все больше применение в
промышленных процессах. Эти носители применяются в виде порошков, шариков
или монолитов. Причем они могут быть пористыми или непористыми. Монолиты
чаще всего состоят из большого числа каналов разной формы сечения,
отделенных тонкой стенкой. Монолиты оказывают меньшее сопротивление
потоку.
87
Из неорганических носителей чаще всего используют макропористые стекла,
силикагель и силохромы (кремнеземы). Они обладают механической прочностью,
химически инертны, устойчивы к действию микроорганизмов. Кроме того поры
этих материалов обладают достаточной жесткостью. Силикагель аморфное
вещество,
получаемое
из
ортокремниевой
кислоты
поликонденсацией
(«старение»). Поверхности кремнеземов покрыты гидрофильными группами,
обладающие слабыми кислотами свойствами, поэтому они в щелочной среде
разрушаются и его можно устранить в органическом диапазоне рН. Но этот
недостаток можно устранить, покрывая его поверхность пленками. оксидов
металлов (алюминий, титан), полимерами (полиэтиленамин), или обработать
солями переходных металлов. Еще одним способом модификации кремнеземов
является введение в них различных реакционно-способных групп (-CN, -NO2, . Для этих целей используют кремнийорганические вещества (γ-
NH2
аминопропилтриэтоксилан для NH2), галогеналкилсиланы для СI, сложные эфиры
силилкарбоновых кислот для CON3 и т.д. ).
Среди других неорганических носителей можно отметить – глины, цеаниты,
пористую керамику, которые также можно модифицировать.
2.2.1.Физические методы иммобилизации ферментов
Методы иммобилизации, при которых фермент или клетка связываются с
матрицей без образования ковалентных связей, называют физическими. Все
существующие методы физической иммобилизации можно разделить на 4
группы:
адсорбционная
иммобилизация
на
нерастворимых
носителях,
иммобилизация путем включения в гели, иммобилизация микрокапсулированием
в полупроницаемые оболочки и волокна, включение в двухфазную реакционную
среду.
Адсорбционная иммобилизация.
При адсорбционной иммобилизации
фермент или клетка удерживается на поверхности носителя с помощью
электростатических, гидрофобных и водородных связей. Для этих целей
применяют неорганические (оксиды алюминия и титана, керамика, уголь) и
88
органические (полисахариды, ионообменные смолы белки), нерастворимые
носители в виде порошков, шариков, гранул или больших кусков с узкими
каналами.
Основные
характеристики
носителей
механическая
прочность,
химическая инертность, размер пор, удельная поверхность. Из-за простоты,
доступности, невысокой сорбентов и сохранения высокой каталитической
активности биокатализаторов адсорбционная иммобилизация наиболее часто
применяемых метод. Главный недостаток метода – возможность непрочного
связывания фермента и носителя.
Существую несколько способов получения биокатализаторов с помощью
адсорбции на носителе (Рис.2.1)
Статический способ. Носитель вносят в водный забуференный раствор
фермента и оставляют на несколько суток без перемешивания. Сорбция
достигается за счет самопроизвольной диффузия фермента к поверхности
носителя с последующей адсорбцией. Сейчас очень редко применяют из-за
длительности.
Способ
с
перемешиванием.
Смешивают
(на
качалке,
мешалкой,
покачиванием) фермент или суспензию клеток с носителем, уравновешенным
буферным
раствором.
Затем
отделяют
биокатализатор
от
раствора
центрифугированием или фильтрованием и снова ресуспендируют. Эту стадию
повторяют несколько раз, пока не исчезнут активность фермента или клетки в
промывных водах. Затем комплексы суспендируют в определенном объеме
соответствующих буферов, уравновешивают и хранят в холодильнике. Этот
способ эффективнее статического, поскольку обеспечивает более равномерное
заполнение поверхности носителя адсорбированным ферментом.
Метод элекетроосаждением. Основан на том, что молекулы ферментов
имеют на поверхности заряженные группы. Если в раствор фермента погрузить
два электрода, на поверхности, одного из которых помещен слой носителя, то при
включении электрического тока молекулы фермента начнут перемещаться в
растворе в сторону соответствующего электрода и осаждаться на носителе.
89
В промышленных условиях в технологии чаще применяют метод нанесения
на колонке (Рис.2.2). В этом случае через колонку с носителем насосом
прокачивают раствор фермента или снизу вверх, или сверху вниз. Скорость
потока подбирается так, чтобы частицы носителя оставались в взвешенном
состоянии, образуя кипящий слой. Используя этот метод можно в одной и той же
колонке проводить иммобилизацию фермента, промывку и ферментацию.
Природа адсорбционных взаимодействий фермента и носителя может быть
различной (Рис.2.1). Удержание может обеспечиваться за счет Ван-дерваальсовых взаимодействий, электростатических взаимодействий, водородных
связей и гидрофобных взаимодействий между носителем и поверхностными
группами белка. Вклад каждого из перечисленных типов зависит от химической
природе носителя и функциональных групп на молекуле фермента или белка и
липидов
на
поверхности
клетки.
Чаще
всего
основной
вклад
вносит
электростатическое взаимодействие и водородные связи.
Эффективность адсорбционной иммобилизации зависит от многих факторов.
В общем случае сорбционная емкость носителя пропорциональна его удельной
поверхности. Для ферментов это справедливо в случае, когда носитель не
пористый или диаметр пор намного больше размеров белков. Если поры
маленькие, то удельная поверхность больше. Однако количество ферментов,
способных, то удельная поверхность больше, т.к. белки не взаимодействуют с
поверхностью
выстилающей
поры
изнутри.
В
соответствии
с
экспериментальными данными считается, что диаметр пор должен быть в 2 раза
больше размера молекулы фермента в направлении его максимального
удлинения. Здесь нужно иметь в виду, что молекула субстрата меньше молекулы
фермента. В другом случае, носитель нужно подбирать по размеру субстрата.
Причём высокомолекулярный субстрат
сам может выступать носителем для
иммобилизации фермента.
Если сорбция осуществляется за счёт электростатических взаимодействий, то
естественно этот процесс будет сильно зависеть от pH среды. При изменении рН
90
изменяется состояние ионогенных групп носителя и белка. Если носитель не
является
ионообменником,
максимальная
сорбция
достигается
в
изоэлектрической точке белка. Т.е. рН зависимости адсорбции должна иметь вид
кривой с одним масимумом, соответствующим изоэлектрической точке.
Ионная сила только оказывает влияние на прочность связывания фермента с
носителем из-за конкуренции связывания с носителем между ферментом и
ионами в растворе. Тогда может наблюдаться десорбция биокатализатора. Это
зависит от ионной силы раствора, т.е. концентрации солей.
Степень адсорбции и количество адсорбированного биокатализатора на
носитель в значительной степени, зависит от концентрации фермента в растворе,
из которого происходит адсорбция. Если увеличивать концентрацию до
определенного
предела,
то
увеличивается
количество
адсорбированного
биокатализатора и, следовательно, растет удельная каталитическая активность
иммобилизованной системы. Дальнейшее повышение концентрации фермента не
91
будет приводить к повышению удельной активности иммобилизованного
препарата т.к. носитель имеет ограниченное число центрового связывания. Кроме
того, ферменты могут наслаиваться друг на друга, что приводит к появлению
диффузионного барьеру для субстрата.
Для удачного проведения адсорбции нужно подобрать оптимальную
температуру. Увеличение температуры оказывает двоякое влияние на процесс
адсорбционной
иммобилизации.
Рост
температуры
увеличивает
скорость
диффузии фермента в порах носителя, но в тоже время сильное увеличение
вызывает уже денатурацию белка.
Таким
образом,
эффективность
адсорбционной
иммобилизации
биокатализаторов зависит от целого ряда факторов, которые должны быть точно
сбалансированы.
Для повышения прочности связывания адсорбционно-иммобилизованных
ферментов часто носитель предварительно модифицирует. В данном случае под
модификацией нужно понимать не только включение в носитель каких-либо
дополнительно функциональных групп. Но и изменение его физико-химических
свойств. Например, если фермент не стабилен в кислой среде, а поверхность
носителя имеет кислый характер, то необходимо перед иммобилизацией носитель
выдерживать в соответствующем буферном растворе.
Особый подход требуется для иммобилизации металлозависимых ферментов.
Из-за способности большинства носителей селективно прочно связывать ионы
металлов, при иммобилизации металлоэнзимы могут терять ионы металлов их
активного центра. Чтобы исключить потерю металла можно предварительно
заблокировать центры связывания ионов металлов на носителе теми же (или им
подобными) ионами.
Доиммобилизационная обработка носителя ионами металлов для некоторых
ферментов служит фактором, увеличивающим прочность связывания ферментноситель. В этом случае ион металла выступает в роли мостика между
биокатализатором и носителем.
92
Среди способов усиления способности носителя к связыванию фермента
следует отметить обработку носителя веществами, молекулы которых содержат
много функциональных групп, способных к взаимодействию с группами на
поверхности глобулы фермента или клетки за счет электрических и водородных
связей. Для этого поверхность носителя полимеризуют, затем проводят
химическую модификацию полимера. За счет этого на поверхности носителя
образуется большая концентрация функциональных групп – гидроксильных,
гидрофобных и т.д. Иногда перед иммобилизацией на носитель за счет адсорбции
наслаивают сывороточный альбумин, которые затем искусственно денатурируют,
а функциональные группы на поверхности остаются.
На поверхности ферментов, наряду с полярными участками, часто
присутствуют гидрофобные зоны, т.е. связывание фермента или клетки с
носителем, имеющим гидрофобные участки, может обеспечиваться и за счет
гидрофобных
взаимодействий.
При
этом
способе
агарозы,
ковалентно
модифицируют гидрофобными группами (алкильными, фенильными). Эффект
связывания увеличивается, если на носителе присутствует еще и заряженная
группа. Т.е. наблюдается двойной эффект фермент связывается с носителем и за
счет гидрофобных и за счет электростатических взаимодействий.
В этом плане очень удобными для модификации являются липиды
являющиеся, как вам известно, амфифилами, т.е. имеют четко выраженные
гидрофильные и гидрофобные участки. По желанию монослой липидов можно
так адсорбировать на поверхности носителя, что поверхность будет иметь или
гидрофобный характер или гидрофильный.
В ряде случаев для повышение эффективности иммобилизации необходимо
модифицировать
не
носитель,
а
иммобилизации на ионообменных,
фермент.
Особенно
это
важно
при
из-за того, что иногда очень близки
изоэлектрическая точка и рН – оптимум фермента. Поэтому прочная сорбция
наблюдается лишь в областях рН, далеких от изоэлектрической точки, где
каталитическая активность мала. Для снятия этого препятствия в фермент вводят
93
дополнительные
ионогенные
карбоксиметилцеллюлозу),
группы
которые
(органические
смещают
кислоты,
изоэлектрическую
точку
фкатализатора.Чтобы исключить смывание уже иммобилизованного фермента с
носителя
адсорбированный
фермент
обрабатывают
бифункциональным
сшивающим агентом. Это приводит к тому, что на поверхности носителя
образуется сплошная пленка из сшитых между собой молекул фермента. В
качестве сшивающего агента чаще всего применяют глутаровый альдегид.
Иммобилизация включением в гели. Для проведения иммобилизации в
органические гели готовят реакционную смесь не следующих компонентов –
фермент, мономер, и при необходимости сшивающий агент, водный буферный
раствор. Часто
еще добавляют вещества, предохраняющие фермент от
инактивации при гелеобразовании. Готовую смесь подвергают воздействию
какого-либо
фактора
инициирующего
процесс
полимеризации
мономера
(рис.2.3А) При проведении полимеризации в ПААГ используют мономер и
сшивки в концентрациях 30-60 и 5% от общей массы реакционной смеси
соответственно. Инициаторами полимеризации являются радикалы. Радикалы
могут образовываться в результате некоторых окислительно-востановительных и
фотохимических реакций. Чаще применяется окислительно-востановительная
пара: персульфат калия или аммония-тетраметилэтилендиамин. При внесении
этих веществ в раствор происходит полимеризация. Для фотохимического
инициирования
применяют
рибофлавин.
Иногда
полимеризацию
можно
проводить также при воздействии ионизирующей радиации без инициатора.
94
Рис. 2.3. Иммобилизация ферментов и клеток включением в гели
включение в гели,
А –
полученные полимеризацией мономеров; Б - включение в
готовые природные гели
Процесс полимеризации ингибируется наличием молекулярного кислорода и
в процессе полимеризации выделяется большое количество тепла (нагрев до 70750С). Чтобы избегать этих артефактов можно насытить рабочий раствор
инертным газом и работу проводить при невысоких температурах. За
определенное время (мин, часы) образуется блок полимерных гелей, содержащий
иммобилизованный фермент. Этот блок измельчают, продавливая через сито, или
нарезая. Тщательно промывают буферным раствором, до тех пор, пока в
промывных водах ферментативная активность не будет минимальной. Если
95
включали клетки, то в водах определяют наличие свободных клеток. Для
длительного хранения измельченный гель с биокатализатором подвергают
лиофильной сушке.
Некоторые природные полисахариды – крахмал, агар-агар, карраганан,
агароза – способны образовывать гели при охлаждении их горячих водных
растворов.
2-5%
раствор
полисахарида
нагревают
при
постоянном
перемешивании до 80-900С и затем охлаждают постепенно. Перед началом
гелеобразования (30-500С) в систему добавляют водный раствор биокатализатора
(фермента) или суспензию клеток. При дальнейшем охлаждении образуется гель,
содержащий иммобилизованный биокатализатор (Рис. 2.3Б). Для повышения
механической прочности процесс гелеобразования иногда проводят в порах
вспененного полиуретана или выдерживают в холодных растворах хлористого
калия или кальция.
Для более прочного удерживания включенного в них фермента в полимер
вводят ковалентные сшивки. Сшивки между полимерными цепями можно
добиться при обработке их бифункциональными реапгентами. Образование
прочных связей между полимерными цепями геля может достигаться и за счет
электростатических взаимодействий. Например, в присутствии Са альгинат
натрия дает прочный гель. В этом случае в роли мостиков между полимерными
цепями выступают ионы Са, формирующие ионные связи с карбоксильными
группами альгината.
Сшитые гели для иммобилизации могут быть получены на основе
поливинолового спирта и поливинилпирролидона. Если на растворы (водные)
этих веществ воздействовать излучением или потоком электронов, то в их
полимерных цепях возникают свободные радикалы. При взаимодействии этих
свободных радикалов между цепями образуются ковалентные сшивки.
В
настоящее
биокатализаторов
время
путем
фотополимеризующихся
широко
применяют
включения
смол
в
метод
полимерную
(полимеры-макромономеры).
96
иммобилизации
матрицу
Во
из
время
иммобилизации раствор, содержащий смолу, катализатор и инициатор облучают
несколько минут УФ-лучами. Фоточувствительные группы образуют между
собой ковалентные связи, и возникает сшитые 3-х мерная полимерная сетка и
включением в нее молекулами биокатализатора.
Каталитическая активность иммобилизованного биокатализатора возрастает
с увеличением количества включенного фермента. На первый взгляд можно
такого увеличения добиться, просто повышая концентрацию фермента в исходной
смеси.
На самом деле это не так, поскольку растворимость ферментов в
гелеобразующих системах ограничена. Далее здесь важно учитывать и прочность
удерживания биокатализаторов носителем. А это зависит от размера пор. Чем
меньше диаметр пор, в сравнении с размером биокатализатора, тем меньше
вероятность смывания катализатора реакционной средой. Пористость геля можно
регулировать изменением состава исходной смеси – например мономера. Кроме
того, высокая концентрация фермента приводит к тому, что субстрат не достигает
ферментов в глубине матрицы. В этом случае препарат с иммобилизованным
биокатализатором измельчают, продавливая через сито или гомогенизируя, чтобы
увеличить удельную поверхность.
97
Чаще
получаемые частицы не очень прочны, крайне неоднородны, и поверхностные
катализаторы легко смываются. Этих недостатков можно избежать при
использовании эмульсионного способа получения гелевых частиц (Рис.2.4).
Приготовленный водный раствор с ферментом, мономером и инициатором сразу
вводят в неполярный органический растворитель с ПАВ и перемешивают.
Образуется эмульсия, состоящая из стабилизированных в органической среде
капель водного полимеризующегося раствора, стабилизированного ПАВ. После
окончания полимеризации частицы геля форме шариков промывают фильтре
98
водой. Гелевые частицы характеризуются высокой механической прочностью, и
исключается опасность инактивации фермента теплом, выделенным при
полимеризации (высокий теплообмен).
Для практических целей удобен метод двойной иммобилизации, при котором
в гель на твердом носителе, или же получение полимерного геля с включением
фермента проводится в присутствии такого носителя.
Есть
еще
один
параметр,
от
которого
зависит
эффективность
иммобилизованного биокатализатора. Как биологи мы знаем, что для работы
фермента нужно какое-то минимальное микроокружение. Вот эту оптимизацию
микроокружения можно достичь подбором соответствующей гелеобразующей
системы. Т.к. эффективность зависит от природы геля. Варьируя химическую
природу исходного мономера (материала гелеобразующего) можно получать
матрицы с подходящими для данной ферментативной реакции характеристиками
– зарядом, гидрофобностью и т.д.
Несмотря на все преимущества иммобилизации путем включения в гели,
которые вы, надеюсь, поняли, есть недостаток. Этот недостаток заключается в
том, что полимерная матрица создает значительные препятствия диффузии
субстрата к катализатору (диффузионный барьер). Этот барьер увеличивается,
если биокатализатором служит не фермент, а клетка. Для уменьшения
диффузионного барьера
применяют различные подходы – используют
органические растворители или прошивают отверстия с помощью лазера и т.д.
Иммобилизация с использованием мембран и волокон. Микрокасулирование.
В отличие от других методов иммобилизации, при микрокапсулировании главным
является удержание раствора, а не создание физических и химических сил,
необходимых для иммобилизации. Т.е. иммобилизуется целиком исходный
раствор, содержащий биокатализатор, а не отделенные молекулы или клетки.
Суть метода состоит в том, что водный раствор фермента включает внутрь
микрокапсул, представляющее собой замкнутые сферические пузырьки с тонкой
полимерной сеткой. Этот метод включает следующие стадии (Рис.2.5):
99
1.Фермент
растворяют
в
подходящем
буферном
растворе,
обычно
содержащем для защиты фермента от денатурации другие белка, например
альбумин в концентрации 10%.
2.Готовят
органическую
фазу,
содержащую
небольшое
количество
эмульгатора (ПАВ). Органическая фаза не должна смешиваться водой (эфир,
циклогексан, толуол).
3.Добавляют водный раствор фермента к органической фазе и перемешивают
в течении заданного времени (1-2 ч.) определенной скоростью вращения. От этого
зависит размер микрокапсул.
4.При
перемешивании
органический
растворитель,
к
этой
двухфазной
содержащий
смеси
полимер
добавляют
(нитрат
также
целлюлозы,
бутадиеновый каучук).
Этот полимер, соприкасаясь с поверхностью эмульсионных капель, будучи
нерастворим в воде, образует тонкую оболочку микрокапсул. Это обусловлено
также подавлением разбавлением органического растворителя.
5. При упаривании растворителя из органической фазы, из-за увеличения
концентрации полимера, происходит дальнейшее осаждение с образованием
более плотной мембраны. Толщина мембраны зависит от количества полимера,
добавленного к органической фазе и времени преципитации.
100
6.Микрокапсулы
из
органической
фазы
выделяют
осаждением,
центрифугированием или фильтрацией.
Включение в мембраны и волокна. Метод включения в волокна от
микрокапсулирования отличается в основном формой полученных препаратов –
образуются нити. Эмульсию водного раствора фермента в органическом растворе
волокнообразующего полимера (производные целлюлозы, поливинилхлорид и
т.д.) продавливают через прядильное устройство (фильтр) в коагулирующую
жидкость
(толуол).
Полученные
волокна
представляют
собой
пористые
полимерные гели, содержащие гомогенную дисперсию небольших капель водного
раствора фермента. Эти волокна обладают высокой механической прочностью. Из
них даже можно изготовить ткань, обладающую ферментативной активностью.
Для дополнительного повышения механической прочности волокна иногда
заключают в тонкую полиамидную оболочку.
Можно использовать и промышленные готовые полимерные полые волокна,
применяемые для диализа белков.
101
Хорошим материалом в качестве носителя ферментов являются липиды.
Известно,
что
липиды
обладают
ярко
выраженными
гидрофобными
и
гидрофильными свойствами. Т.е., они могут образовывать моно и бислои, сферы
(липосомы).
Причем
взаимное
расположение
молекул
липидов
в
этих
образованиях будет зависеть от окружающей среды (Рис. 2.6.).
Иммобилизация с использованием двух фазных систем. Особенностью этого
способа является то, что фермент растворяется только одной из фаз 2-х фазной
системы. А субстраты и продукты распределены между двумя фазами. Причем
система подбирается так, чтобы продукт накапливался в этой фазе, где
отсутствует фермент. После окончания процесса фазу с продуктом отделяют и
извлекают продукт, а фазу с ферментом используют вновь. Достоинство этого
метода, осуществление превращения крупных макромолекул.
102
Например, если взять 2-х фазную систему вода 1-2% и органический
неполярный растворитель, то ферменты (белки) будут в водной фазе, т.к. они не
растворяются в неполярных органических растворителях. Субстрат будет
перерабатываться
в
водной
фазе,
а
продукт
будет
диффундировать
(экстрагировать) в неполярную фазу (Рис.2.7.а). Основной недостаток –
инактивация ферментов на границе раздела.
Для увеличения эффективности в качестве ферментсодержащей фазы
применяют крупнопористые стекло частицы, которого пропитаны водным
раствором фермента (Рис. 2.7.б). В этом случае возрастает поверхность раздела и
можно перемешивать.
В этих же целях используют бездетергентные микроэмульсии. При
определенных соотношениях смеси гексан - изопропиловый спирт - вода, толуол
– изопропиловый спирт - вода, молекулы воды существуют в ней в виде
сферических капсул стабилизированных адсорбированными на их поверхности
103
молекулами изопропилового спирта. При растворении в такой смеси молекулы
фермента оказываются включением в водные микрокапли, с сохранением их
каталитической активности. Если изменить состав смеси происходит расслоение
на водную и органическую фазу содержащие, соответственно фермент и
продукты реакции.
Таким
образом,
иммобилизации:
известно
адсорбционная,
4
основных
включение
вида
в
гели,
физических
методов
иммобилизация
с
использованием мембран, и иммобилизация с использованием 2-х фазных систем.
Общим для всех этих способов иммобилизацией является то, что биокатализатор
не образует ковалентных связей с носителем, а удерживается за счет слабых
взаимодействий или за счет пространственных ограничений, или за счет различий
в растворимости.
2.2.2. Химические методы иммобилизации
Методы иммобилизации ферментов с помощью ковалентного связывания
основаны на образовании химической связи между молекулами фермента и
носителем. При этом важно, чтобы аминокислоты, необходимые для проявления
каталитической активности ферментов, не участвовали в ковалентной связывании
с носителем. Избежать этого, как правило, трудно, поэтому способ ковалентной
иммобилизации обычно приводит к снижению ферментативной активности.
Однако
инактивацию
фермента
можно
предотвратить,
если
проводить
иммобилизацию в присутствии субстрата, который защищает активный центр.
Основных
принципов
конструкции
конечного
препарата
методом
химической иммобилизации - три. Это связано с тем, что независимо от характера
процесса в иммобилизацию включают три компонента: собственно молекула
биокатализатора (Ф), носитель (Н), и сшивающий реагент (С). Последний реагент
называют еще – «вставка», «ножка», «сшивка» и т.д.
Иными словами такая иммобилизация подразумевает создание конструкций
из связанных химическими связями 3-х элементов: Н-С-Ф, Н-Ф, С-Ф. говоря
104
образно Н-Ф можно использовать термин «пришивка», для Н-С-Ф - «сшивка», для
СФ- «вшивка».
Теперь рассмотрим подробнее принципы конструирования. Если на
поверхности носителя имеются функциональные группы способные вступить в
химические реакции с функциональными группами фермента с образованием
ковалентных связей, то процесс иммобилизации сводится к необратимой
«пришивке» фермента и носителю, за счет простой адсорбции.
Может также получиться, что из-за стерических и диффузионных
ограничений тесный контакт фермента и носителя нежелателен. Тогда применяют
специальные сшивающие реагенты различной длины. Это очень удобный метод,
поскольку за счет сшивающего агента можно изменить каталитические
характеристики биокатализатора, изменять характер связи в агенте в нужном
русле и т.д.
В ряде случаев для ковалентной иммобилизации используют системы
изначально не содержащие носитель, а только фермент и сшивающий агент. Т.е.
это вначале, а в процессе иммобилизации или носитель формируется как твердое
тело или же сам фермент служит одновременно и носителем. Имеется в виду
ковалентное вшивание молекулы фермента в различные типы «сеток».
Образование ферментативных сеток (ретикуляция ферментов) обусловлено
полифункциональностью самого фермента, т.е. наличием помимо активного
центра большого количества реакционно-способных групп. За счет этого в
растворе фермента, при наличии биофункционального сшивающего агента,
отдельные молекулы фермента сшиваются друг с другом и образуют агрегаты
сетчатой структуры, где узлами служат сами ферменты.
Интересен
способ
ретикуляции
ферментов,
предварительно
модифицированных ковалентно реагентами, содержащими двойную связь,
например акрилоилхлоридом. При сополимеризации ферментного (белкового)
макромономера с низкомолекулярными мономерами (например, с акриламидом)
образуются сетчатые полимерные гели, сшитые белком или дополнительными
105
сшивающим мономером (например, N,N,N-Метилен-бис акриламидом). Причем
исходное состояние системы – жидкость, а конечные (после полимеризации) –
гель (твердое тело), в форме сосуда в котором идет реакция. Потом этот
трехмерный гель – блок можно измельчить.
Часто, для увеличения прочности уже иммобилизованные ферменты
дополнительно обрабатывают сшивающим агентом, как бы привязывают
ферменты друг другу. В дальнейшем, освободившись от твердого носителя можно
получить сшитую ферментную пленку. Связывание фермента с носителем может
осуществляться с образованием различных химических связей:
а- реакции с образованием амидной связи
Присоединить белок (Ф) к носителю (Н) или сшивающему агенту (С)
посредством амидной связи можно многими путями и при участии различных
функциональных групп. Наиболее часто применяют реакцию ацилирования
аминогрупп
фермента.
В
качестве
ацилирующих
агентов
используются
ангидриды.
С помощью ангидридного метода получено более 20 новых препаратов
иммобилизованных ферментов, таких как пенициллинамидаза, пепсин, и т.д.
Носителями
служат
в
основном
сополимеры
малеиновой
кислоты
с
ненасыщенными соединением – этиленом, акриловой кислотами или сополимеры
малеинового ангидрида.
Одним
из
вариантов
ангидридного
метода
является
использование
полимеров, содержащих ангидридные группы в качестве предшественников для
получения носителей с разнообразными функциональными группами.
В качестве ацилирующих агентов применяют также активированные эфиры.
Например,
сополимеризацией
2-оксиэтилметакрилатан
106
производными
метакриловой кислоты получают n–нитрифениловые эфиры полимеров типа
«сферон»
Эта
реакция
интересна
тем,
что
в
процессе
модификации
белка
высвобождается нитрофенил-ион, по которому можно контролировать за ходом
реакции спектрофотометрическим методом.
б- реакции образования карбомидных связей (производные мочевины)
Изоцианаты
способны
эффективно
взаимодействовать
с
различными
функциональными группами белков с образованием производных мочевины –
диалкилмочевина, уретан, уреид. Наиболее реакционными группами белков здесь
являются аминогруппы
Изоцианаты используют для активации неорганических (гидроокись титана,
кремния, алюминия) носителей и целлюлозных носителей. В первом случае
реакцию неорганического носителя с изоцианатом проводят в органическом
растворителе, причем часть изоцианатных групп образует с гидрооксидом
карбонат, а оставшиеся активные группировки могут реагировать в водном
растворе с амино-
и гидрооксидными группами белка соответственно в
щелочных и слабощелочных средах. Таким образом, были иммобилизованные
глюкозоамилаза, лактоза и т.д.
Бромциановый метод один из самых распространенных методов химической
иммобилизации ферментов. При обработке бромцианом на полисахаридных
носителях формируются реакционно-способные цианатные, имидокарбонатные
107
группы.
При
взаимодействии
фермента
с
образованным
полисахаридом
образуются изомочевины и уретаны.
В2СN + полисахарид
Обработка
полиакриламид
неорганических
носителей
(стекло,
оксид
титана,
оксид
алюминия) также существенно повышает – 10, 15 раз количество связанного
фермента. Помимо этого время функционирования иммобилизованного фермента,
например глюкозоамидазы, существенно повышается.
в- реакции образования азометиновых связей
На практике широко применяемым методом специфической модификации
аминогрупп белков является образование азометиновых связей в реакциях белков
с альдегидами:
При применении глутарового альдегида необходимо учитывать возможность
образования
побочных
продуктов
поликонденсации
и
полимеризации.
Азометиновые связи легко разрушаются в кислых средах с регенерацией
исходных веществ. Это свойство используют для удаления с носителя ковалентно
иммобилизованного фермента путем простого изменения рН среды. Для
108
устойчивости к кислым средам проводят реакции восстановления азометиновой
группировки. За последние годы глутаровый альдегид был использован для
иммобилизации пенициллинамидазы, пепсин и др. Носителями служили
целлюлозы и производные, кремнеземы и т.д.
г- реакции азосочетания
Соли диазолина могут вступать в различные реакции сочетания. В реакциях
азосочетания могут участвовать различные группы, но чаще NH2.
В слабощелочной среде основной мишенью в белке является фенольный
радикал тирозина.
Носитель с белком связывается очень прочно. Носители, содержащие связь –
N≡N получают обработкой полимера 2-(амилофенил) – диоксиланом и
диазотриванием полученной аминогруппы.
д- реакции связыванием по сульфгидрильным группам (- S-S -).
Сульфгидрильные группы в белках встречаются довольно редко, т.к. они
быстро окисляются с образованием тиоловых дисульфидных мостиков. Вот это
свойства
и используются для ковалентной иммобилизации. Если имеется
фермент с SH группой и носитель с SH группой, то в присутствии кислорода они
образуют прочную дисульфидную связь.
Для увеличения возможности протекания такой иммобилизации есть две
пути.
1 - увеличение числа сульфгидрильных групп в белке. Это можно сделать
обработав белок некоторыми восстановителями - меркаптоэтанолом, цистеином,
боргидратом натрия.
109
2 - использование носителей с большим количеством тиолов. Для этого
используют аминопроизводные сефарозы и сефадекса модифицированные
гомоцистеинтиолактоном,
сополимеры
акриламида
с
тиолосодержащими
мономерами и т.д.
е - радикальные реакции
При фотохимическом распаде алкил- и арилазидов образуются очень
реакционноспособные короткоживущие радикалы нитрены.
Часто, эти алкил- и арилазиды входят в состав носителей и сшивающих
агентов (например аминоэтилсульфанат). А нитрены реагируют с очень многими
группами белка. Если смесь носитель или сшивающий агент с алкил- и
арилазидом и белок облучают УФ лучами, то образуется очень прочная связь
между нитренами и ферментом.
Однако здесь нужно быть очень осторожным. Поскольку часто длина волны
максимума поглощения в УФ области алкил- и арилазидов может совпадать с
длиной волны при котором разрушаются белки 250-300 нм.
2.3.1. Гидролитические ферменты
Гидролазы относятся к третьему классу ферментов. Общим свойством
ферментов этого класса является то, что они катализируют реакции гидролиза, т.е.
110
расщепление более сложных соединений на более простые с присоединением
воды. Этот класс подразделяется на 11 подклассов. Многие гидролазы
компартментализированы в тех или иных структурных элементах клетки,
отделенных от цитоплазмы мембранами. Видимо такая локализация гидролаз
защищают важные биополимеры цитоплазмы от деструкции. Грамположительные
бактерии выделяют в среду много гидролаз. У грамотрицательных бактерий
хранилищем для различных гидролаз служит периплазматическое пространство
наружной оболочки,
ограниченное двумя мембранами. В клетках эуокариот
гидролазы могут локализоваться в ограниченных мембраной особых органоидах –
лизосомах, периплазме или выделяться в среду. Большинство используемых в
промышленности гидролитических ферментов представляют собой внеклеточные
продукты жизнедеятельности микроорганизмов. В то же время некоторые
гидролазы обнаружены в цитоплазме, где они участвуют в метаболических
циклах.
Амилазы – ферменты катализирующие гидролиз крахмала, относятся ко
второму подклассу гидролаз, имеют шифр 3.2.1. Эти ферменты широко
распространены
в
природе,
синтезируются
многими
микроорганизмами,
животными и растениями. К группе амилолитических ферментов относятся α и β
– амилазы, глюкоамилаза и другие.
За последние 20 лет гидролиз крахмала для получения сиропов
различного состава пробрел наибольшее значение из всех промышленных
процессов, использующих ферменты. Гидролизаты классифицируют согласно
содержанию в них редуцирующих сахаров в пересчете на глюкозу и
характеризуют декстрозным эквивалентом (ДЭ), причем чистая глюкоза
составляет 100ДЭ, а крахмал. Подобрав комбинацию ферментов и условий можно
получить продукты с точно определенными физическими и химическими
свойствами. Ниже приведена общая схема процесса (Рис.2.8).
После измельчения исходного материала крахмал диспергируют или
желатинизируют в водном растворе и ожижают с помощью термостабильной
111
бактериальной α – амилазы при температуре от 80 до 1100С. Этот этап может
быть
заменен
кислотным
гидролизом,
но,
как
правило
с
меньшей
эффективностью. Ожижение занимает от 2 до 4 часов и обычно завершается когда
величина ДЭ составляет 10-20. Ожижение сопровождается осахариванием,
процедуру которого можно варьировать в зависимости от желаемого продукта.
Добавление пуллуланазы, фермента устраняющего ветвление, и β – амилазы к
декстринам приводит к получению сиропа с высоким содержанием мальтозы.
Поскольку пригодные для этого микробные β – амилазы остаются дефицитными,
сироп с высоким содержанием мальтозы обычно готовят с помощью смеси
грибной α – амилазы и глюкоамилазы. Такой продукт содержит больше глюкозы,
но соотношение глюкозы и мальтозы можно контролировать тщательным
подбором пропорций этих двух ферментов и условий реакции.
Важный
промышленный
процесс
–
производство
глюкозы
для
изомеризации ее во фруктозу. После ожижения декстрины быстро охлаждают
примерно до 600С и обрабатывают глюкоамилазой в течение 24-90 часов в
зависимости от использованного количества фермента. Осахаренный крахмал
должен содержать не менее 94-96% глюкозы, т.к. остаточные ди- и
олиглсахариды часто обладают неприятным вкусом, а изомераза не действует ни
на один из них. После коррекции рН и ионной силы продукт обрабатывают
изомеразой.
Проблема реализации непрерывной технологии стоит в эффективной
иммобилизации второго фермента – глюкоамилазы. Во-первых, потому что α –
амилаза более доступна и дешева и
регенерации. α
в принципе нет необходимости в
– амилазой обрабатывают крахмал при кипячении в течение
нескольких минут. Во-вторых, реакция иммобилизованной α
– амилазы с
малорастворимым,
Кроме
вязким
крахмалом
проходит
с трудом.
того,
глюкоамилаза реагирует с растворимыми олигосахаридами, что сравнительно
легко осуществить и для иммобилизованного фермента.
112
Сконструированы несколько типов препаратов иммобилизованного
фермента обладающие хорошими свойствами, полученные – ковалентным
связыванием с пористому силикагелю через глутаровый диальдегид, включением
в полые волокна триацетата целлюлозы, адсорбцией на ДЕАЕ-целлюлозе и т.д.
Все эти препараты характеризуются высокой стабильностью при умеренных
температурах (< 500С),
время полуинактивации составляет
многие месяцы.
Однако, с повышением температуры стабильность препаратов резко падает, и
время полуинактивации снижается до 5-6 дней. Схема пилотной установки для
получения глюкозного сиропа с применением иммобилизованной глюкоамилазы
прведена на рис 2.9.
113
Исходный крахмал помещается в резервуар объемом 1 м3 (1) , где
обрабатывается паром в течение 3-4 мин. Под давлением, и далее перекачивается
в следующий резервуар таким же объемом (2), где подвергается обработке α –
амилазой. После фильтрования разжиженный крахмал подается в реакционную
колонну
-
биоректор
(3),
загруженный
16
кг
иммобилизованного
на
микропористом кремнеземе фермента. Гидролиз декстринов проводится при
114
температуре
400С.
Время
контакта
30%
раствора
декстринов
с
иммобилизованным ферментом составляет 9мин, в то время как при гидролизе
растворимой глюкоамилазой оно составляет, при тех же условиях, 72 часа.
β – галактозидаза – (β – D-галактозидгалактогидролаза, лактаза, КФ 3.2.1.23)
относитсяк глюкозидазам. Ферменты из разлных источников по своей структуре,
размеру молекулы, молекулярной массе и активности различаются, что позволяет
получать ферменты с широким диапазоном действия. В результате гидролиза
ферментом молочный сахар (лактоза) превращается в более сладкую и хорошо
растворимую смесь моносахаров – глюкозы и галактозы, и поэтому препараты β –
галактозидазы широко применяют в молочной промышленности и в тех отраслях,
где можно использовать отходы молокоперерабатывающей промышленности
содержащих лактозу.
C12H22O11 + H2O → C6H12O6 + C6H12O6
В Италии освоено промышленное производство безлактозного молока с
применением иммобилизованной лактазы (Рис.2.10).
115
Рис.2.10
-
Технологическая
схема
получения
безлактозного
молока
с
использованием иммобилизованной лактазы
1. резервуар с молоком; 2- биореактор с иммобилизованным ферментом; 3асептический резервуар
Снятое
молоко
из
резервуара
(1)
(температура – 1420С, время – 3 сек),
пропускают
через
стерилизатор
быстро охлаждают до 4 – 7 0С и
прокачивают через реакционную колонну (2) в асептический резервуар емкостью
500 л (3). Биореактор емкостью 20 л, содержал 4 кг иммобилизованного фермента,
включенного в волокна триацетата целлюлозы. Волокна закрепляли вертикально
в нижней и верхней точках реактора. Молоко через биореактор можно пропускать
многократно со скоростью 7 л/мин, до достижения заданной степени конверсии.
Производительность установки 10 т безлактозного молока в день.
В Англии запущен полупромышленный процесс гидролиза лактозы
в молочной сыворотке с помощью иммобилизованной β – галактозидазы.
Установка работает 5 дней в неделю непрерывно и обрабатывает 30 т сыворотки,
производя 1,7 т сахарного сиропа (рис.2.11).
116
Сыворотку перед введением в биореактор подкисляют в резервуаре (1),
пастеризуют, производят ультрафильтрацию и пропускают через ионообменники
(4) для деминерилизации. После этого подготовленную сыворотку пропускают
через реактор с иммобилизованной лактазой нисходящим потоком..
В
реакторе (5) используют лактазу, ковалентно связанную с пористым силикагелем
с помощью глутарового диальдегида. Биореактор
периодически очищают
разбавленной уксусной кислотой из резервуара (6).
Мощность установки составляет 360 л/ч, а степень гидролиза 80%.
Рис.2.11. Технологическая схема установки для гидролиза лактозы в молочной
сыворотке (компания «Милк Маркетинг», Англия)
1 – резервуар для
подготовки сыворотки; 2- контроль рН; 3- контроль температуры; 4ионообменники; 5-реакционная колонка с иммобилизованным ферментом; 6резервуар с разбавленной уксусной кислотой.
Протеолитические
ферменты
–
пептид-гидролазы,
шифр
КФ
3.4,
катализируют гидролиз пептидов и белков. Основной реакцией катализируемой
117
протеолитическими ферментами, является гидролиз пептидной связи. Ферменты
часто синтезируются в неактивной форме (зимогены), которые или хранятся в
клетке, или транспортируются от места их синтеза к тому центру, где они
необходимы в активной форме. В частности, в клетке в неактивной форме
транспортируются трипсин, пепсин, химотрипсин, карбоксидазы. Активация этих
ферментов осущест вляется по одному из двух путей: а) образование активных
ферментов из предшественников автокаталитически; б) образование активных
форм в присутствии ионов металлов. Протезы нашли широкое применение в
промышленности и в медицине (Табл.1,2).
Таблица 1. Применение протеаз из организмов животных и растений
N
фермент
Источник
Область применения
1
трипсин
Поджелудочная железа Медицина,
животных
2
Пепсин
мягчение
мяса,
мягчение
мяса,
осветление пива
Желудок животных
Медицина,
свертывание молока
3
α
– Желудок животных
Медицина
химотрипсин
4
Ренин
Желудок теленка
Производство
(химозин)
5
Панкреатиче
сыра,
свертывание молока
Поджелудочная железа Медицина,
ская протеаза животных
моющих
производство
средств,
мягчение
и
обесволашивание кожи
6
Папаин
Папайя
Медицина,
осветление
пива,
мягчение
мяса,
мягчение
мяса,
мягчение мяса
7
Бромелаин,
Ананас
Медицина,
осветление пива
8
Фицин
инжир
Медицина,
осветление пива
118
Таблица 2. Применение протеаз из микроорганизмов
N
Фермент
Источник
Область применения
1
Протеаза
Aspergillus
Осветление и вкусовая обработка сакэ
oryzea
2
Протеаза
Aspergillus niger
3
Протеаза
Bacillus subtilis
«Субтилизин»
Производство кормов, медицина
Производство
детергентов,
мягчение
мяса, производство рыбных гидролизатов
4
Протеаза
Производство
Streptomyces
детергентов,
мягчение
мяса, производство рыбных гидролизатов
griseus
Иммобилизованные протеазы можно использовать для свертывания молока.
Такой процесс необходимо проводить в два этапа – выдержки молока с
ферментом
и
непрерывность
каогуляции.
процесса,
Только
т.к.
при
в
этом
случае
одностадийном
случае
достигается
процессе
образуются
творожные сгустки вокруг частиц нерастворимого фермента, что затрудняет
доступ порции молока к ферменту. На стадии выдержки предусматривается
обработка молока иммобилизованным ферментом при температуре ниже 150С.
При этом режиме происходит гидролиз κ – казеина, но молоко не каогулирует.
Каогуляция молока после обработки ферментом на холоду осуществляется
нагреванием и термостатированием при температуре 370С. Процесс агрегации
белков молока происходит после гидролиза 80% κ – казеина. В России получены
препараты
химотрипсина
ковалентно
связанного
с
КМ-целлюлозой
и
модифицированного химотрипсина, сорбированного на анионитах. Препараты
обладают достаточно высокой активностью и испытаны на молокосвертывающую
способность. Положительные результаты дали также испытания сычужного
фермента иммобилизованного на поливинилспиртовых волокнах и включенных в
гель альгината кальция при производстве сыра. Реологические показатели и
характер
пространственной
структуры
сгустка
были
аналогичны
при
использовании иммобилизованного и свободного сычужного фермента. Однако
119
для внедрения в производство необходимо решить проблему стерилизации
иммобилизованных препаратов ферментов после нескольких циклов работы.
Аминоацилазы - относятся к подклассу 3.5 и объединяют ферменты,
действующие на C-N связи отличающиеся от пептидных. Способность
аминоацилаз различать L и D – аминокислоты используют в промышленности для
получения аминокислот, в том числе незаменимых. Получение оптически
активных аминокислот разделением их рацемических (оптически неактивных)
смесей был одним из первых процессов осуществленных с помощью
иммобилизованных ферментов на промышленном уровне. Раньше этот процесс
проводился с применением растворимого фермента – аминоацилазы, но он был
недостаточно
эффективным.
После
переходо
на
иммобилизованную
аминоацилазу эффективность процесса возросла в 1,5 раза, и в настоящее время в
Японии осуществляют на промышленном уровне производство большинства
незаменимых аминокислот.
Чтобы найти оптимальную форму иммобилизованного фермента для
этого процесса Японские ученые провели обширные исследования, результаты
которых изложены в таблице 3. Эти данные говорят о том, что для
промышленного использования помимо начальной активности необходимо
учитывать и многие другие факторы. В данном случае исследователи
остановились на аминоацилазе иммобилизованной ионными связями на ДЕАЕсефадексе, в силу высокой активности, простоты получения, возможности
регенерации и устойчивости такого катализатора. Выбранный биокатализатор без
какого-либо механического разрушения и снижения связывающей активности
функционирует 5 лет.
Технологическая
представлена
ацилированные
на
схема
рис.2.12.
установки
В
качестве
D,L-аминокислоты
для
получения
исходного
L-аминокислот
вещества
(ацил-DL-аминокислоты)
используют
полученные
обычным химическим синтезом. Его подвергают воздействию фермента
аминоацилазы, который гидролизует только один изомер, приводя к образованию
120
незамещенной
L-аминокислоты
и
оставляя
нерасщепленной
ацил-D-
аминокислоту. Отщепление ацильной группы приводит к резкому увеличению
растворимости L-аминокислоты и за счет этого аминокислоты легко отделить
друг от друга и выделяется чистая L-аминокислот. Остающаяся ацил- Dаминокислота при нагревании рацемизируется, т.е. опять переходит в смесь
ацилированных D,L-аминокислот, и процесс ферментации повторяют сначала. В
итоге
единственным
продуктом
является
L-аминокислота.
Причем
для
аминоацилазы не имеет значения, какую аминокислоту ей гидролизовать, важно
лишь строение ацильной части, к которой фермент имеет строгую специфичность.
Т.е. в принципе одна и та же реакционная колонка с иммобилизованной
аминоацилазой может быть использована в производстве самых разных Lаминокислот.
Таблица 3. Свойства иммобилизованных различными методами аминоацилаз
(субстрат – ацил - D,L-метионин)
N
свойства
Нативная Иммобилизованная аминоацилаза
аминоацилаза
Ионное
Ковалентное
связывание связывание
с
ДЕАЕ-
Включение
с В ПААГ
иодоацетилцеллюллозой
сефадексом
1
Оптимальн
7,5-8,0
7,0
7,5-8,5
7,0
ый рН
2
Оптимальн
60
72
55
65
6,9
7,0
3,9
5,3
0,5
0,5
0,5
0,5
ая температура,
0
С
3
Энергия
реактивации,
ккал/моль
4
Оптимальн
121
ая концентрация
Со2+ ,мМ
5
Км, мМ
6
Vmax,
5,7
1,5
8,7
6,7
5,0
3,3
4,6
2,3
Простая
Сложная
Сложная
Слабые
Сильные
Сильные
Возможн
Невозможна
Невозможна
мкМ/ч
7
Методика
получения
8
Связывающ
ие силы
9
Возможнос
ть регенерации
а
Препарат иммобилизованной аминоацилазы готовили следующим образом.
1000 л ДЕАЕ-сефадекса перемешивали с 1100-1700 л водного раствора
аминоацилазы при 350С и рН 7,0 в течение 10 часов. После фильтрации
иммобилизованный препарат промывали водой. Выход активности по отношению
к первоначально растворенному ферменту составлял 55-60%. Колонна с
иммобилизованной
активности
аминоацилазой
после месяца работы.
сохраняла
более
Регенерация
60%
первоначальной
катализатора
в колонне
производится путем простого добавления свежего раствора фермента, который
опять адсорбируется на носителе. Устойчивость полимерного носителя составляет
5-8 лет.
122
Рис.2.12.
Технологическая
схема
производства
L-аминокислот
из
рацемической смеси с применением иммобилизованной аминоацилазы 1- резервуар
с исходной рацемической смесью; 2-фильтр; 3- теплообменник; 4- биореактор с
иммобилизованным
ферментом;
5-
испаритель;
6-
кристаллизатор;
7-
сепаратор; 8- рацемизатор.
Пенициллинацидаза – ( пенициллинамидаза, ацил-трансфераза) относится к
третьему классу,
катализирует гидролиз боковых цепей пенициллинов и их
производных воздействуя на C-N связь. Ферменты выделенные из разных
источников имеют различные характеристики субстратов и это используется для
классификации различных типов пенициллинамидаз. Различают три типа
пенициллинамидаз. Если фермент гидролизует специфический пенициллин V то
обозначается тип I. Эти ферменты имеются в грибах и бактериях. Ферменты типа
II специфичны к пенициллину G и содержатся только в бактериях. К III типу
относят все пенициллинамидазы катализирующие гидролиз аминоациллины и
цефалоспорины.
123
При ферментативном гидролизе пенициллинов и цефалоспоринов
образуются,
соответственно
6-амнопенициллановая
(6-АПК)
и
7-
аминоцефалоспориновая кислоты, которые затем используют для получения
полусинтетических
антибиотиков.
Различными
компаниями
получены
и
производятся разные препараты иммобилизованной пенициллинамидазы. По
Итальянской технологии иммобилизованный препарат готовят смешиванием
раствора
фермента
с
триацетатом
целлюлозы
в
хлористом
метилене.
Образующуюся эмульсию с ферментом далее подвергают экструзии в нити.
Волокна триацетата целлюлозы, содержащие иммобилизованный фермент,
размещают вдоль термостатируемой колонны. Общий выход составляет 85%.
В Росси на ОАО «Биохимик» для производства :-АПК используют
пенициллинамидазу включенную в полиакриламидный гель модифицированный
глутаровым диальдегидом.
2.3.2. Применение лиаз.
Лиазы – относятся к 4 классу, катализируют отщепление от субстратов той
или иной группы (не путем гидролиза) с образованием двойной связи, или,
наоборот, присоединение групп к двойным связям. Среди них
наибольшее
промышленное значение имеют ферменты катализирующие реакции синтеза
аминокислот и других органических кислот.
аспартаза- (аспартат-аммиак-лиаза) катализирует реакцию синтеза Lаспарагиновой кислоты из фумаровой кислоты и аммиака. Этот фермент особенно
активен
у
факультативных
анаэробных
бактерий.
Содержится
также
в
бактероидах, находящихся в клубеньках бобовых растений.
Аспартаза катализирует реакцию присоединения аммиака по двойной связи
фумаровой кислоты. Катализируемая аспартазой реакция не требует присутствия
других кофакторов, кроме ионов двухвалентного магния. Фермент накапливается
в клетках бактерий при росте культур на богатых средах, содержащих мясной
бульон, пептон, дрожжевой экстракт или набор большого числа аминокислот.
124
Получение L-аспарагиновой кислоты растворимой и иммобилизванной
внутриклеточной аспартазой оказалось неэкономичным, в связи с низкой
стабильностью. Поэтому для этих целей используют целые клетки включенные в
полимерные гели, в частности в Японии клетки включают в полиакриламидный
гель (ПААГ). Время полуинактивации препарата при 370С составляет 120 дней.
Для сравнения для иммобилизованной аспартазы – 30 дней. Для иммобилизации
10 кг влажных клеток суспендируют в 40 л физиологического раствора,
добавляют 7,5 кг акриламида, 0,4 кг метиленбисакриламида, 5 л 5%-ного
диметиламинопропионитрила и 5 л 2,5%- ного персульфата калия. Смесь
оставляют на 10-15 мин и образующуюся гель формируют в кубики размером 2-3
мм.
Исходным сырьем для синтеза L-аспарагиновой кислоты служит фумарат
аммония. Раствор фумарата аммония в концентрации 1М/л, содержащий 0,001
М/л хлористого аммония, пропускают при рН 8,5 и 370С
через колонку с
иммобилизованными клетками со скоростью потока 0,6 об/ч. рН полученного на
выходе 2400л раствора доводят до 2,8 добавлением 60%-ного раствора серной
кислоты при температуре 900С, затем охлаждают до 150С и выдерживают 2 ч.
Кристаллизирующуюся аспарагиновую кислоту собирают центрифугированием и
промывают водой.
В
России
разработаны
и
испытаны
на
пилотной
установке
биокатализаторы полученные иммобилизацией клеток E.Coli -85 с аспартазной
активностью в гель каррагтнана и альгината кальция.
фумараза – (фумарат-гидротаза) катализирует реакции синтеза Lяблочной кислоты из фумаровой кислоты и воды. Яблочная кислота находит
применение в качестве заменителя лимонной кислоты в продуктах питания и
фармацевтических препаратах.
И в этой технологии используют клетки, только с фумаразной
активностью, иммобилизованные в ПААГ. Для подавления побочной реакции
образования
янтарной
кислоты,
которая
125
с
трудом
отделяется
от
непрореагировавшей
обрабатывают
фумаровой
детергантами,
кислоты,
например
иммобилизованные
экстрактом
желчных
клетки
кислот
в
концентрации 0,2%, при 370С, рН 7,5 в течение 20 ч. По спавнению с интактными
клетками иммобилизованные клетки существенно стабильнее, и время их
полуинактивации составляет около двух месяцев.
В Италии производят иммобилизованную фумаразу, где фермент
включен в полые волокна триацетата целлюлозы, с сохранением 40% активности.
2.3.3. Применение изомераз.
Изомеразы
относятся к 5 классу ферментов, катализируют реакции
изомеризации. Из этого класса ферментов в промышленности широкое
применение
нашла
глюкозоизомераза.
Существует
глюкозоизомеризующих ферментов, но не все
несмколько
типов
они обладают подлинной
глюкозоизомерующей активностью. Практическое применение нашел только
фермент
–
D-ксилозокетоизомераза,
КФ
5.3.1.5.,
применяющийся
для
производства глюкозо-фруктозного сиропа (ГФС) и фруктозы. Это связано с тем,
что данный фермент не требует присутствия NAD+
в реакционной среде и
обладает высокой термостабильностью. В связи с практическим назначением его
называют глюкозоизомеразой (ГЛИ).
Фруктоза или фруктовый (плодовый, медовый) сахар по сравнению с
обычным пищевым сахаром, в состав которого фруктоза также входит, но в виде
химического соединения с менее сладкой глюкозой, обладает более приятным
вкусом. Она на 70% слаще сахара и потреблять ее можно в меньших количествах.
Это очень важно для больных сахарным диабетом, т.к. усвоение фруктозы не
связано с инсулином. Сахар (сахарозу) нельзя заменить D-глюкозой, поскольку
глюкоза менее сладкая. Этот недостаток можно устранить, если глюкозу частично
изомеризовать во фруктозу ГЛИ.
Во многих странах освоена технология получения эффективных
иммобилизованных
биокатализаторов
с
глюкозоизомеразной
активностью,
многие из которых уже внедрены в производство. Наиболее известные препараты
126
получены следующим образом: адсорбцией ферментного экстракта на ДЕАЕцеллюлозе или на пористом алюминие или на ионообменных смолах; включением
ферментного препарата в желатиновый гель с последующей сшивкой глутаровым
диальдегидом или в полые волокна триацетата целлюлозы.
Для выбора типа иммобилизованного биокатализатора, конструкции
реактора, условий каталического процесса в реакторе необходимо проведение
большой предварительной работы. Это хорошо видно на примере того, какие
параметры
исследовали
аАмериканские
исследователи
при
внедрении
в
производство технологии получения кукурузного сиропа с высоким содержанием
фруктозы с использованием иммобилизованной ГЛИ.
Биохимические параметры – активность препарата; стабильность
фермента (время жизни и полуинактивации); производительность в используемом
диапазоне времени жизни; оптимальная концентрация субстрата; влияние
концентрации субстрата; влияние концентрации олигосахаридов; влияние
растворенного кислорода; минимальное и максимальное время контакта с
субстратом; образование побочных продуктов реакции; чувствительность к
изменению рН и температуры; устойчивость при хранении; вымываемость
фермента; рост микроорганизмов; характеристики потока на выходе (состав, цвет,
запах, рН, содержание белков и т. д.).
Механические параметры – размер, форма частиц и распределение по
размерам; насыпная масса в сухом и влажном виде; набухание; сжимаемость;
когезия; истирание частиц.
Гидромеханические параметры
(восходящий
или
каналообразование;
нисходящий);
распределение
– перепад давления; тип потока
уплотнение
времени
слоя;
осевая
пребывания;
дисперсия
и
расслаивание;
отношение длины к диаметру4 минимальная скорость начала псевдожижжения.
В
ходе
анализа
вышеприведенных
биокатализатор со следующими свойствами:
127
параметров
был
выбран
-форма катализатора – сухие гранулы; внешний вид – окрашен в желтокоричневый цвет; размер частиц, меш – наименьший размер 12 х 20; объемная
плотность в сухом состоянии, г/см3 – 0,64-0,72; объемная плотность во влажном
состоянии, г/см3 – 0,2; характерный размер пор, мкМ – 0,2; активность, ед/г – не
менее 0,04; производительность – до 907 кг 42%-ного обогащенного фруктозой
сиропа на 0,45 кг фермента в течение 1000 ч; объем пустот в слое – 45%.
Выбранный
размер
частиц
биокатализатора
удовлетворял
двум
взаимоисключающим требованиям: с одной стороны, частицы биокатализатора
достаточно малы, чтобы скорость диффузии не лимитировала скорость всего
процесса, а с другой стороны размеры достаточно велики, чтобы свести к
минимуму
перепад
иммобилизованного
давления
на
реакторе
фермента.
Ниже
колонного
приводятся
типа
оптимальные
со
слоем
условия
выбранные экспериментальным путем: - содержание сухого вещества , % - 40-45;
содержание глюкозы в исходной смеси, % - 93 – 96; требования к исходной смеси
– смесь необходимо очистить фильтрованием, обработкой активированным углем
и ионообменными смолами; рН – 8,2 – 8,5; падение рН – на 0,2 – 0,4; температура,
0С – 60; активатор, 4 *10-4 М Mg2+; время контакта фермента с субстратом, ч –
0,5 - 4;
Как следует из условий, для того чтобы процесс шел нормально необходимо
высокое содержание глюкозы в поступающей в реактор смеси. Если в нем
содержание олигосахаридов превышает 10% наблюдается снижение активности
биокатализатора. Большой диапазон времени (0,5 – 4 ч) контакта биокатализатора
с субстратом объясняется постепенной инактивацией катализатора. С течением
времени активность фермента падает и при постоянной скорости потока
реагентов степень превращения субстрата постоянно снижается. Поэтому для
обеспечения необходимого качества продукции, по мере инактивации фермента,
время его контакта с субстратом увеличивают путем уменьшения скорости
потока. Необходимо иметь в виду, что размеры реакторов колонного типа
определяются
гидромеханическими
свойствами
128
биокатализатора.
При
нисходящем потоке
реакционной смеси слой иммобилизованного фермента
может сжиматься под давлением, в результате этого сопротивление потоку
падает. Учитывая известное время контакта биокатализатора с субстратом и
заданную производительность всей установки, можно определить размеры и
количество колонных реакторов. В данном случае, в силу возможности
инактивации биокатализатора целесообразно установить несколько колонн, так
чтобы они инактивировались и, соответственно заменялись последовательно. Это
позволит максимальным образом использовать биокатализатор и в то же время
обеспечить постоянно высокую производительность установки в целом.
Технологическая схема процесса производства кукурузного сиропа с высоким
содержанием фруктозы, основанного на использовании иммобилизованной ГЛИ
представлена на рисунке 2.13. В этой технологии, для эффективной работы
фермента, необходимы множество операций предварительного разделения и и
обработки промежуточных продуктов между стадиями получения глюкозы из
крахмала (осахаривания) и изомеризациией. Для повышения термической
устойчивости α – амилазы, применяемой для гидролиза крахмала при температуре
1050С, добавляют ионы кальция. А ионы кальция ингибируют ГЛИ, поэтому,
перед поступлением глюкозы в реактор изомеризации, их удаляют из среды
связыванием Ионообменными смолами.
В России получен оригинальный иммобилизованный препарат клеток
Streptomyces albogrisedus с глюкозоизомеразной активностью. Иммобилизацию
клеток проводили путем включения в матрицу состоящую из 2-х гелей –
гидроокси Со2+
и хитозана. Термообработанные клетки, влажностью 90%
суспендировали в 6 мл 3%-ного раствора приготовленного на основе 18%-ного
ацетата кобальта.
Смесь гомогенезировали и по каплям добавляли к *5-ному водному раствору
аммиака. В качестве субстрата использовали 2 М раствор глюкозы содержащей
5*10-3 М MgSO4 * 7H2O. Ионы кобальта выполняли роль стабилизатора.
129
Испытания на пилотной установке в лабораторных условиях дали неплохие
результаты.
Рис.2.13 - Технологическая схема производства кукурузного сиропа с
высоким содержанием фруктозы.1- резервуар для ожижения и осахирования
крахмала; 2- фильтр; 3- резервуар для очистки активированным углем; 4ионообменник (связывание кальция); 5- концентратор; 6- подготовка смеси; 7колонны с иммобилизованными ферментами; 8- резервуар для очисткт
активированным углем; 9- катионообменник; 10-анионообменник; 11 –резервуар
для упаривания; 12-резервуар для охлаждения
2.3.4.Применение оксидоредуктаз.
130
Иммобилизованные ферменты этого класса по отдельности или в комплексе
с другими ферментами используют для «холодной стерилизации» молока.
Тепловая обработка оказывает отрицательное воздействие на органолептические
свойства молока, особенно при хранении. В молоке, предназначенном для
сыроделия, осле тепловой обработки снижается способность казеина к
свертыванию под действием сычужного фермента. Поэтому тепловая обработка в
некоторых
случаях
стерилизацией».
нежелательны
и
ее
лучше
заменить
«холодной
Существуют два способа «холодной стерилизации».
Первый способ заключается в обработке молока каталазой с введением
перекиси водорода. Эффект пастеризации молока, предназначенного для
производства сыра, может быть достигнут без нагревания обработкой 0,05% ным раствором перекиси водорода, за счет разрушения перекиси водорода
каталазой
и
выделения
атомарного
кислорода.
Обработка
молока
иммобилизованной каталазой делает этот способ экономически выгодным.
Однако, основным препятствием при использовании каталазы для «холодной
стерилизации» является инактивация фермента перекисью водорода. Проблему
можно решить заменой фермента животного происхождения грибными, которые
менее чувствительны к перекиси, либо созданием реакторов оптимальных для
данного
процесса.
Уже
получены
препараты
иммобилизованной
на
аминокремнеземах каталазы гриба Penicillium vitale, которые характеризуются
высокой каталитической активностью, рН и термостабильностью при хранении.
Период
сохранения
половины
начальной
активности
каталазы,
иммобилизованной на силохроме через углеводный компонент фермента,
составляет 45 месяцев.
Второй способ «холодной стерилизации» заключается в использовании
лактопероксидазной системы – лактопероксидазы – тиоцианата и непрерывно
выделяющейся перекиси водорода. Промежуточный продукт каталитического
окисления тиоцианата под действием лактопероксидазы в присутствии перекиси
водорода обладает антибактериальными свойствами. Молоко содержит все
131
компоненты лактопероксидазной антибактериальной системы, кроме перекиси
водорода.
Введение
перекиси
водорода
можно
обеспечить
проведением
соответствующих ферментативных реакций. Перекись водорода получают путем
пропускания сыворотки через колонну с иммобилизованным на пористом стекле
ферментами β-галактозидазой и глюкозооксидазой. Этот способ позволяет
обеспечить действие антибактериальной лактопероксидазной системы в молоке
при нейтральных значениях рН. Такая антибактериальная система используется
известной шведской фирмой «Альфа-Лаваль».
2.4.Применение иммобилизованных ферментов в микроанализе.
Биосенсоры.Современные прикладные и фундаментальные науки в своих
исследованиях нуждаются в высокочувствительных, быстрых и экономных
методах анализа. Этого же требуют промышленные процессы, особенно
биотехнологического
профиля,
где
необходим
точный
и
быстрый
технохимический контроль. Наряду с усовершенствованием различных физикохимических методов в последние
годы разрабатываются и находят широкое
применение методы анализа с использованием в качестве реагентов ферментов и
других биологических агентов для обнаружения разнообразных веществ.
Известно, что ферменты — это биологические катализаторы, обладающие
высокой специфичностью и
ярко выраженной способностью избирательно
катализировать многие химические превращения как в живой клетке, так и вне
организма. Замечательные свойства ферментов давно привлекали внимание
исследователей, в том числе и аналитиков, но практическому применению
ферментов, например для аналитических целей, препятствовали прежде всего
малая доступность чистых ферментов, неустойчивость во времени их растворов,
препаратов при хранении и воздействии на них различных факторов (тепловых,
химических), невозможность многократного использования одной порции
фермента из-за сложности отделения его от других компонентов раствора,
высокая стоимость очищенных препаратов. Однако выход из положения вскоре
был найден, и появилась возможность использования каталитических свойств
132
ферментов вне их связи с живым организмом и возможность сохранения этой
способности в течение длительного времени практически без изменения за счет
перевода их в иммобилизованное (нерастворимое) состояние. Достижения в этой
области биохимии и энзимологии дали начало развитию нового направления
аналитической химии — безреагентных методов анализа, основанных на
использовании различных биохимических сенсоров.
Под термином "биосенсор" следует понимать устройство, в котором
чувствительный слой, содер­жащий биологический материал: ферменты, ткани,
бактерии, дрожжи, антигены/антитела, липосомы, органеллы, рецепторы, ДНК,
непосредственно реагирующий на присутствие определяемого компонента,
генерирует сигнал, функционально связанный с концентрацией этого компонента.
Конструктивно биосенсор представляет собой комбинированное устройство,
состоящее из двух преобразователей, или трансдьюсеров, — биохимического и
физического, находящихся в тесном контакте друг с другом. На рис. 1 приведена
общая
схема
такого
устройства.
Биохимический
преобразователь,
или
биотрансдью-сер, выполняет функцию биологического элемента распознавания,
преобразуя определяемый компонент, а точнее, информацию о химических связях
в физическое или химическое свойство или сигнал, а физический преобразователь
это свойство фиксирует с помощью специальной аппаратуры. В данном случае
реализуется принципиально новый способ получения информации о химическом
составе раствора. Наличие в устройстве биоматериала с уникальными свойствами
позволяет с высокой селективностью определять нужные соединения в сложной
по составу смеси, не прибегая ни к каким дополнительным операциям, связанным
с использованием других реагентов, концентрированием и т. д. (отсюда и
название — безреагентные методы анализа).
Существует
электрохимические,
большое
разнообразие
спектроскопи­ческие,
физических
термические,
трансдьюсеров:
пьезоэлектрические,
транс-дьюсеры на поверхностных акустических волнах и т.п. На схеме 1 приведен
перечень преобразователей, используемых в биосенсорах. В настоящее время
133
наибольшее распространение получили электрохимические преобразователи.
Одни из них генерируют потенциал на специальном электроде, на поверхность
которого нанесен слой биоматериала, другие генерируют электрический ток
реакции продукта превращения определяемого вещества на поверхности
электрода, вызванного биоматериалом. Другими словами, существуют потенциои амперо-метрические биосенсоры. Если физический преобразователь использует
изменение светопоглощения в области биослоя, то такой биосенсор называется,
например, оптоволоконным, поскольку измеряемый сигнал будет передаваться
измерительному прибору по оптическому волокну. Соответствующий физический
преобразователь по аналогии с электродом называют оптродом. По названию
преобразователя (схема 1) можно сделать вывод о характере физического
свойства, которое измеряется аппаратно, причем, как правило, при таком
измерении используется микропроцессорная техника (рис. 2.14), позволяющая
сделать устройство достаточно ком­пактным.
Рис. 2.14 Принципиальная схема биохимического сенсора. 1 - исследуемый
раствор, 2 - корпус биосенсора, 3 - полупроницаемая мембрана (для
134
механического удержания биослоя), 4 - слой биоматериала, 5 - физический
преобразователь (электрод, пьезокристалл, оптоволоконный материал и т.д.)
Первое упоминание об аналитических устройствах на основе ферментов или
ферментсодержащих материалов появилось сравнительно недавно, в 60-х годах
нашего столетия. Фермент холинэстеразу включенную в крахмальный гель и
нанесенную на полиуретановую пластинку использовали для обнаружения
фосфорноорганических
инсектицидов
в
воздухе.
Холинэстераза
очень
чувствительная к фосфорноорганическим соединениям, легко ими ингибируется.
После пропускания анализируемого воздуха через ферментный1 датчик измеряют
остаточную активность холинэстеразы. По разнице между исходной активностью
фермента и активностью после контакта с воздухом по градуировочному графику
находят концентрацию этих токсичных соединений. В настоящее время
иммобилизованная холинэстераза используется в автоматических датчиках в
промышленном производстве инсекто- фунгицидов для постоянного контроля
воздушной среды цехов.
Затем в обиход вошло понятие "биосенсор" или
"биочип". Это важное событие в науке. Здесь отражаются глубокие причины,
связанные с так называемыми интеграционно-синтетическими процессами в
науке, приводящими к появлению новых знаний. Функционально, таким образом,
биосенсоры сопоставлены с датчиками живого организма — биорецепторами,
способными преобразовывать все типы сигналов, поступающих из окружающей
среды, в электрические.
135
Принцип работы биосенсора достаточно прост. Определяемое вещество
диффундирует
через
полу­проницаемую
мембрану
в
тонкий
слой
биокатализатора, в котором и протекает ферментативная реакция. Поскольку в
данном случае продукт ферментативной реакции определяется с помощью
электрода, на поверхности которого закреплен фермент, то такое устройство еще
называют ферментным электродом. Таким образом, определения "биосенсор" и
"ферментный
электрод"
в
данном
случае
синонимы.
Большинство
ферментативных процессов взимосвязаны, т.е. продукт одной ферментативной
реакции является субстратом другой. Если трудно идентифицировать продукет
первой реакции, то берется второй фермент, который превратит первый продукт в
легко определяемое вещество. С помощью таких сопряженных ферментативных
реакций можно даже увеличить чувствительность анализа.
136
По-видимому, самым распространенным в настоящее время является
амперометрический биосенсор на основе иммобилизованной глюкозокси-дазы
для определения сахара в жидкостях. В качестве физического трансдьюсера в нем
использован так называемый электрод Кларка. В настоящее время для
определения глюкозы создано наибольшее число различных биосенсоров, что
связано с необходимостью контроля за содержанием сахара в биологических
жидкостях, например в крови, при диагностировании и лечении некоторых
заболеваний, прежде всего диабета. Схема функционирования биосенсора на
глюкозу в принципе типична и для других амперометрических биосенсоров с
аналогичным трансдьюсером (рис. 3). Ток восстановления кислорода на
платиновом
катоде
прямо
пропорционален
концентрации
кислорода.
В
присутствии субстрата (например, глюкозы в крови, взятой для анализа)
ферментативная реакция понижает концентрацию O2. Таким образом, ток
восстановления
кислорода
уменьшается
пропорционально
концент­рации
субстрата
Глюкозоксидаза
Глюкоза + O2---------------- Глюконовая кислота + H2O2
Преимущество данного типа биосенсора, основанного на кислородном
электроде Кларка, состоит прежде всего в его высокой селективности.
Избирательность подобных биосенсоров определяется высокой специфичностью
глюкозоксидазы и природой электрохимической реакции, в которой участвуют
компоненты ферментативного процесса. В целом класс ферментов — оксидаз
является высокоспецифичным по отношению к определяемым субстратам.
Системы же на основе небиологического преобразователя, напротив, не столь
селективны, как этого бы хотелось, что обусловлено рядом причин. Тем не менее
имеются ограничения и по применению данной конструкции биосенсора,
обусловленные влиянием кислорода и других посторонних веществ, способных
проникать
через
биослой
(точнее,
через
137
мембрану),
а
потому
задача
совершенствования конструкций биосенсоров на глюкозу представляется весьма
актуальной.
Рис. 2.15 Схема работы
глюкозного биосенсора.1 - исследуемый раствор, 2 - корпус биосенсора, 3 внешняя мембрана, 4 - слой глюкозоксидазы, 5 - внутренняя газопроницаемая
мембрана, 6 - платинорвый электрод (проволока), 7 - усилитель сигнала, 8 самописец (дисплей, цифровой или сетевой указатель и т.д.).
Один из возможных путей такого усовершенствования заключается в
следующем. Если изменить полярность включения электрода-трансдьюсера в
глюкозном биосенсоре на противоположную, то есть платиновый катод Кларка
сделать анодом, то при потенциале +0,6 В он становится совершенно
нечувствительным к кислороду, но зато дает отклик на пероксид водорода,
который при данном значении потенциала окисляется до воды. Чувствительность
такого электрода к пероксиду водорода оказалась привлекательной, а поскольку
H2O2 образуется как продукт ферментативной реакции, по его содержанию
138
можно сделать вывод о концентрации, например глюкозы в различных объектах.
Другой способ улучшения селективности биосенсоров и устранения помех от
посторонних примесей состоит в использовании различных мембран — пленок,
предотвращающих их попадание непосредственно на электрод-преобразователь.
При этом внутренняя мембрана выполняет функцию защиты от примесей, а
внешняя мембрана пропускает субстрат в биослой. Имеются и другие способы
повышения избирательности физических преобразователей, в данном случае
электродов.
Например
с
помощью
специальных
приемов,
называемых
химической модификацией, можно до такой степени изменить свойства
поверхности электрода, что он будет "глухим" к большинству примесей и,
напротив, чувствительным к компонентам ферментативной реакции.
Биосенсоры, основанные на кислородном электроде как физическом
трансдьюсере, позволяют определять разнообразные субстраты ферментов: кроме
глюкозы — лактаты, L-аминокислоты, салицилаты, оксалаты, пируваты, то есть
анионы соответствующих карбоновых кислот. В литературе описаны другие
биосенсоры подобного типа, ряд которых применяется на практике.
Для устранения влияния мутности и цвета исследуемых объектов на
величину сигнала шведскими учеными был разработан микрокалориметрический
датчик на основе иммобилизованных ферментов (Рис.2.16).
139
Рис. 2.16 - Микрокалориметрический датчик для определения метаболитов:
а- схема измерительного блока; 1- крепление колонки; 2- металлический блок; 3термистор; 4- микроколонка, заполненная иммобилизованным ферментом; 5внутренняя часть блока; 6- водяная баня; 7- теплообменник; б-общая схема
установки: 1- измерительная колонка с ферментом; 2-теплообменник; 3-колонка
сравнения с ферментом; 4- водяная баня.
С помощью биосенсоров можно решить и обратную задачу: при некоторой
определенной
концентрации
субстрата
оценивать
активность
собственно
фермента по величине измеряемого сигнала (потенциала, тока и т. д.). Из
описания работы фермента следует, что измеряемый сигнал зависит не только от
концентрации субстрата, но и от каталитической активности биологического
преобразователя, то есть фермента. Такое использование биосенсоров позволяет
измерить активность большого числа ферментов, например в крови. Оценка
активности ферментов, связанных с сердечной деятельностью, таких, как
аспартамаминотрансфераза, креатинкиназа, позволяет в клинических условиях
оценивать глубину инфаркта миокарда. Измерения активности фермента амилазы
используются в педиатрии.
140
Многие ферменты дороги и быстро теряют свою активность, использование
выполненных на их основе биосенсоров не может быть экономически
целесообразным.
Поэтому
применение
бактерий,
мик­роорганизмов
и
биологических тканей различного происхождения более предпочтительно,
поскольку в данном случае отпадает необходимость в предварительном
получении и очистке ферментов. К существенным недостаткам таких биосенсоров
можно отнести низкую селективность определения вследствие того, что клетки
живых организмов фактически являются источником самых разнообразных
ферментов. Помимо этого время отклика биосенсоров на основе тканей и
микроорганизмов может быть достаточно большим, что также уменьшает их
практическую ценность. Тем не менее в последнее время наблюдается
повышенный интерес к разработке конструкций электродов, содержащих не сами
ферменты в очищенном виде, а их первозданные источники — биологические
материалы. Так, было установлено, что тканевые срезы в биосенсорах могут
выполнять функцию источников каталитической активности. Например, создан
биосенсор на аскорбиновую кислоту, состоящий из упомянутого электрода
Кларка и пластины кожуры огурца или тыквы, служащей источником
аскорбиноксидазы. Активность фермента в такой природной матрице достаточна
для проведения 50-80 определений аскорбиновой кислоты в различных объектах.
Установлено, что пластины биоматериала могут храниться без потери активности
в течение года в 50%-ном глицерине.
Интерес представляют биосенсоры на основе иммобилизованных на
мембране микроорганизмов, служащих элементом так называемого микробного
сенсора.
В
качестве
амперометрический
примера
сенсор
на
таких
аммиак
(в
устройств
можно
сточных
водах)
упомянуть
на
основе
иммобилизованных нитрифицирующих бактерий и кислородного электрода
Кларка. Такой биосенсор полезен при решении вопросов охраны окружающей
среды, и в частности при контроле степени очистки промышленных стоков.
141
Можно отметить также использование биосенсоров на основе гидролаз —
ферментов,
являющихся
катализаторами
гидролитического
расщепления
субстратов. Эти биосенсоры предназначаются, как правило, для экологоаналитического контроля остаточных количеств пестицидов класса фосфорорганических соединений, а также для определения некоторых ОВ. Действие таких
биосенсоров может быть основано на следующих реакциях. Если при гидролизе
какого-либо субстрата ферментом класса гидролаз образуется электрохимически
активное
соединение,
то,
контролируя
содержание
последнего,
можно
контролировать ферментативную реакцию так же, как в предыдущих случаях.
Однако в присутствии веществ, являющихся ингибиторами, активность фермента
уменьшается, что и обнаруживается по сигналу, регистрируемому электродом.
Интересно отметить высокую чувствительность такого определения: эффект
изменения активности фермента доступен для измерения уже при действии
ультраследовых количеств ингибитора — на уровне пико- и фемтограмм, то есть
10 12—10 15 моль/л.
C учетом
живом
разнообразия ферментов, присутствующих и действующих в
организме
преобразователями,
и
можно
являющихся
отметить,
потенциальными
что
существующее
биологическими
сегодня
число
конструкций биосенсоров может быть увеличено в десятки и даже сотни раз.
Биосенсоры получают распространение в биотехнологии. Хотя здесь и
встречаются трудности, связанные с невысокой термической устойчивостью
предложенных устройств, приводящей к дезактивации биослоя, есть основания
полагать, что данный недостаток будет в скором времени преодолен. Так,
полагают, что для увеличения срока службы биосенсоров в обозначенных выше
условиях можно использовать ферменты, выделенные из термофильных бактерий
и одноклеточных водорослей — микроорганизмов, устойчивых к действию
высоких температур. Некоторые биосенсоры работают по принципу да—нет, что
вполне приемлемо, когда решается вопрос о при­сутствии ультрамалых количеств
высокотоксичных веществ в объектах окружающей среды.
142
На
очереди
создание
биосенсоров,
заменяющих
рецепторы
живых
организмов, что позволит создать "искусственные органы" обоняния и вкуса, а
также применить указанные разработки для возможно более точной и
информативной диагностики ряда заболеваний. Несомненно, что в ближайшем
будущем в этой смежной области биологии и химии следует ожидать новых
открытий.
2.5 Применение иммобилизованных биокатализаторов в медицине
В настоящие время природные физиологически активные вещества (ФАВ)
белковой
природы,
перспективное
в
первую
средство
очередь
ферменты
медикаментозного
рассматривают
лечения
как
вследствие
их
чрезвычайности высокой активности и специфичности. Однако некоторые
недостатки ферментов препятствуют их действительно широкому применению в
практической медицине. Это мобильность в физиологических условиях, быстрое
выведение из организма и разрушение под действием эндогенных протеаз,
антигенность как чужеродных организму белков; нередко токсичность и малая
доступность, дороговизна. Анализ сложившегося положения привел ученых к
выводу, что эти недостатки в большинстве случаев можно устранить если
использовать
в
практической
медицине
не
нативные
ферменты,
а
их
проводится
на
иммобилизованные производные.
Иммобилизация
белковых
лекарственных
препаратов
носителях, которые сами по себе не должны оказывать осложняющих влияний и
способствуют
проникновению
фермента
к
желанной
цели.
Конечно,
применяемый полимер и сшивающий агент должны быть нетоксичными, кроме
того,
следует
исключить
возможность
повышения
токсичности
при
биодеградации коньюгата. А если фермент иммобилизуется на нерастворимом
носители с острыми углами, он не должен деформировать форменные элементы
биологических жидкостей.
Лекарственные
вещества
белкового
или
пептидного
происхождения,
иммобилизованное на соответствующем носителе, представляет собой структуру,
143
модель которой представлен на рис. 2.16. Из рисунка следует, что возможны
значительные
вариации
иммобилизованного
лекарственного
препарата.
Например, если полимер растворим то не требуется солюбилизирующего агента.
Если лекарство заключено в полимерную оболочку (капсулу) и действует на
проникающий внутрь капсулы субстрат или катализирует превращение внешнего
субстрата при постепенной деградации оболочки, то не требуется химического
связывания.
Желаемые свойства (растворимость, нетоксичность, специфичность)
может быть достигнута при связывании белка с полимерной целью, которая в
свою очередь модифицируется определенным способом. К примеру, известно, что
высокомолекулярное соединение само по себе не может проникнуть внутрь
клетки путем диффузии, но попадает в нее путем эндоцитоза, если для этого
полимер снабжен химическими группами, специфично взаимодействующими с
клеточной мембраной.
Рис. 2.17. Модель структуры лекарственного препарата
144
Вообще то нужно стремиться к созданию препаратов, в которых отмечалось
бы высокое содержание лекарства по отношению количеству носителя. Так как
молекулярные массы белка и полимера примерно одного порядка, то на одной
молекуле растворимого полимера часто оказывается не более одной молекулы
белка, часть полимера сопровождает лекарственный препарат как балласт. Если
полимер содержит заряженные группы можно ожидать большого связывания,
поскольку образуются нековалентные комплексы, разделить которые удается
только при высокой ионной силе раствора. Такие комплексы могут вести себя как
«депо» лекарственного средства, находящегося в нативном состоянии.
Препараты ферментов повышенной молекулярной массы могут быть
изготовлены путем немолекулярного сшивания бифункциональными реагентами.
Такие препараты стабильны в физиологических условиях, большая молекулярная
масса исключает немедленное их выведение почками.
Одними из перспективных направлений лечения ряда заболеваний являются
методы, основанные на гемосорбции и лимфосорбции. Эти методы основаны на
пропускании крови через колонку, заполненную соответствующим носителем с
или без иммобилизованного фермента. Носители сорбирующих колонок содержат
специфические соединения, способные связывать токсины, находящиеся в
организме. Иногда удобнее применять твердые носители, содержащие ферменты.
Основное требование к ним – они не должны вызывать деформацию ферментных
элементов крови. Модификация таких носителей (стекло, керамика, силикаты)
для
придания
им
групп,
связывающих
белки,
проводится
методами,
заставляющим вступать в реакции с ОН- группами носителей. Исходный
материал
для
матрицы
должен
выбираться
таким,
чтобы
наблюдалась
минимальная специфическая сорбция.
К лекарственным препаратам, иммобилизованных на твердых носителях,
можно
отнести,
также
перевязочные
материалы,
содержащие
обычно
протеолитические ферменты, которые применяются для очищения гнойных ран.
145
Лекарственные препараты, в которых соотношение белок: полимер по массе
очень высокое и достигает сотен тысяч и выше, могут быть изготовлены с
помощью метода «искусственной клетки» и липосом. Они представляют собой
микросферы с проницаемой оболочкой.
Первым типом «искусственных клеток» являются микрокапсулы Чанга (1965
г). Микрокапсулированные препараты ферментов представляют собой крошечные
реакторы диаметром от 103 до 5 104 нм, тонкая оболочка которых (200-400 нм)
проницаема для низкомолекулярных соединений. Фермент, находящийся внутри
оболочки, не контактируют с жидкостями и тканями организма не разрушается
протеиназами, не ингибируется, не вызывает иммунного ответа организма.
Основное достоинство микрокапсулы заключается в том, что их можно
имплантировать в нужное место, например в непосредственной близости от
опухоли, для переработки метаболитов способствующих росту опухолевой ткани.
Микрокапсулы с белковым содержимым готовятся следующим образом.
Создается
микроэмульсия
водного
раствора
вещества
в
органическом
растворителе. Полимерный материал растворен во внешней фазе, к которой
добавляют вещества, способствующие его осаждению на капле эмульсии.
Растворы содержат также мономеры, полимеризующиеся на границе раздела фаз.
Однако следует учесть, что в этом случае большой отрицательный вклад вносят
диффузионные ограничения. Фермент, включенный в капсулу, может быть
предварительно
стабилизирован.
Иногда
капсулы
могут
содержать
микроскопические участки тканей. Например, есть экспериментальные данные по
созданию депо инсулина путем имплантации микрокапсулы, содержащих
островки Лангерганса, синтезирующие в поджелудочной железе инсулин.
Полимерная стенка микрокапсулы обычно изготавливается из прочных
полимеров. Следует учитывать, что микрокапсулы, вводимые в кровь, могут
забивать кровеносные сосуды, и следовательно являться причиной образования
тромбов. Однако эффективность микрокапсул при использовании их в виде
колонок для диализа в аппарате типа «искусственная почка» несомненна. При
146
этом объем аппаратов и соответственно, количество необходимых и очень
дорогих растворов резко сокращается.
Сейчас интенсивно исследуется свойства микрокапсул, стенка которых
состоит из оболочек эритроцитов. Оболочка эритроцитов, без содержимого
называется «тенью». Вот такие тени заполняют ферментом. Большой выигрыш в
этом случае заключается в том, что носитель совместим с организмом пациента.
Введение лекарственных препаратов в клетки можно решить созданием
контейнеров – переносчиков типа липосом и мицелл. Оболочка может
представлять собой однослойную или многослойную поверхность, образованную
в свою очередь бислойной структурой, созданной соединениями, имеющими
гидрофильную группу и две достаточно длинных гидрофобных участка. Яркими
представителями этих соединений являются фосфолипиды. Фосфолипиды
содержащие насыщенные углеводородные цепи плавятся при физиологических
температурах.
Для
каждого
типа
фосфолипидов
имеется
определенная
температура, при которой твердая структура плавится.
Липосомы образуются путем обработки УЗ водной дисперсии липидов выше
температуры их застывания или впрыскиванием спиртового раствора липида в
водную фазу. Лекарство может быть введено внутри липосомы, если оно
гидрофильно, или в стенку, если оно гидрофобно. Диаметр липосом от 20 до 103
нм и поэтому применять их как контейнеры для доставки ферментов
нецелесообразно, если нет возможности с точностью нацелить липосому на
определенную клетку. Однако липосомы имеют и преимущества, т.к. их
поверхность легко может модифицироваться, они могут адсорбироваться на
клетке и поглощаться ею путем эндоцитоза.
Словарь терминов используемых в курсе “Ферментативный катализ с
основами инженерной энзимологии”
Аденозинтрифосфат - нуклеотидный кофермент [АТФ (АТР)] является
наиболее
важной
формой
сохранения
химической
энергии
в
клетках.
Расщепление АТФ — высоко экзоэргическая реакция. Химическая энергия
147
гидролиза АТФ может использоваться для сопряжения с эндоэргическими
процессами, такими, как биосинтез, движение и транспорт.
Антигены (от анти... и греч. génos - рождение, происхождение) высокомолекулярные коллоидные вещества, которые при введении в организм
животных и человека вызывают образование специфических реагирующих с ними
антител. Свойствами антигена обладают чужеродные для организма белки и
полисахариды.
Антитела - белки глобулиновой фракции сыворотки крови, образующиеся в
ответ на введение в организм человека или теплокровных животных бактерий,
вирусов, белковых токсинов и других антигенов.
Апофермент (apoenzyme) - апоэнзим, коллоидальная, белковая часть
фермента, обусловливающая специфичность его действия. Характеризуется, как
правило, в отличие от кофермента, неустойчивостью к нагреванию и другими
свойствами белков.
Биосенсор – устройство, в котором чувствительный слой, содержащий
биологический
материал:
ферменты,
ткани,
бактерии,
антитела/антигены,
липосомы, и тд. непосредственно реагирующий на присутствие определяемого
компонента, генерирует сигнал, функционально связанный с концентрацией этого
компонента.
Буферные системы, буферные растворы, буферные смеси, системы,
поддерживающие определённую концентрацию ионов водорода Н+, то есть
определённую кислотность среды.
Гели - (от лат. gelo- застываю), - дисперсные системы с жидкой
дисперсионной средой, в которых частицы дисперсной фазы образуют
пространств.
структурную
сетку.
Представляют
собой
твердообразные
("студенистые") тела, способные сохранять форму, обладающие упругостью
(эластичностью) и пластичностью.
148
Гетерогенная система (от греч. heterogenes - разнородный) - неоднородная
физико-химическая система, состоящая из различных по физическим свойствам
или химическому составу частей (различных фаз).
Гомогенная система (от греч. homogenes - однородный) - физическая
система, не содержащая частей, отличающихся по составу или свойствам и
отделённых друг от друга поверхностями раздела.
Зимоген (профермент) - неактивная форма фермента, переходящая под
воздействием различных физиологических и биохимических факторов в активную
форму. Образование профермента предотвращает саморазрушение клеток и
тканей, в которых осуществляется биосинтез ферментов.
Изоферменты - ферменты, катализирующие одну и ту же реакцию, но
различающиеся
по
структуре,
физико-химическим
и
иммунологическим
свойствам.
Ингибитор
угнетающее
ферментов
активность
-
природное
ферментов
или
или
синтетическое
полностью
вещество,
прекращающее
их
деятельность. Ингибиторы ферментов используются для изучения механизма
действия ферментов, для лечения нарушений обмена веществ, а также в качестве
пестицидов.
Катализ (от греч. katálysis - разрушение), изменение скорости химических
реакций в присутствии веществ (катализаторов), вступающих в промежуточное
химическое взаимодействие с реагирующими веществами, но восстанавливающих
после каждого цикла промежуточных взаимодействий свой химический состав.
Константа Михаэлиса - один из важнейших параметров кинетики
ферментативных реакций, введённый немецкими учёными Л. Михаэлисом (L.
Michaelis)
и
М.
Ментен
в
1913,
характеризует
зависимость
скорости
ферментативного процесса от концентрации субстрата.
Кофактор [от лат. co (cum) - вместе и factor - делающий] - небелковое
химическое соединение, необходимое для проявления максимальной активности
многих ферментов.
149
Кофермент - органическое соединение небелковой природы. Коферменты
входят в состав некоторых ферментов. Соединяясь с апоферментом, коферменты
образуют каталитически активные комплексы.
Окислительно-восстановительный
потенциал
равновесный
-
электродный потенциал, характеризующий данную электролитическую среду.
Поверхностно активные вещества -
вещества, адсорбция которых из
жидкости на поверхности раздела с др. фазой (жидкой, твердой или газообразной)
приводит к значительному понижению поверхностного натяжения.
Полисахариды - высокомолекулярные соединения из класса углеводов;
состоят из остатков моносахаридов (М), связанных гликозидными связями.
Молекулярные массы полисахаридов лежат в пределах от нескольких тыс.
(ламинарин, инулин) до нескольких млн. (гиалуроновая кислота, гликоген) и
могут
быть
определены
лишь
ориентировочно,
т.к.
индивидуальные
полисахариды обычно являются смесями компонентов, различающихся степенью
полимеризации.
Солюбилизация (от
позднелатинского solubilis
- растворимый) -
коллоидное растворение, самопроизвольное и обратимое проникание какого-либо
низкомолекулярного вещества (солюбилизата), слабо растворимого в данной
жидкой среде, внутрь находящихся в ней мицелл поверхностно-активного
вещества или молекулярных клубков (глобул) высокомолекулярного соединения.
Ферментативный катализ, биокатализ, ускорение химических реакций
под влиянием ферментов.
Ферментер - аппарат для глубинного выращивания (культивирования)
микроорганизмов в питательной среде в условиях стерильности, интенсивного
перемешивания, непрерывного продувания стерильным воздухом и постоянной
температуры.
Ферменты (от лат. fermentum - закваска) (энзимы) представляют собой
высокоспециализированный класс веществ белковой природы, используемый
живыми организмами для осуществления с высокой скоростью многих тысяч
150
взаимосвязанных
взаимопревращение
химических
огромного
реакций,
включая
множества
синтез,
разнообразных
распад
и
химических
соединений.
Флавинадениндинуклеотид
рибофлавин-51-аденозиндифосфат,
-
небелковый компонент (кофермент) большинства ферментов-флавопротеидов,
присутствующих во всех живых клетках; производное рибофлавина (витамина
B2).
Электрофорез (от электро и греч. phoresis - несение, перенесение),
направленное движение коллоидных частиц или макроионов под действием
внешнего электрического поля.
151