UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
INSTITUTO DE BIOFÍSICA CARLOS CHAGAS FILHO
ALVARO ANTONIO CARDOSO BASTOS
MODELO DE LESÃO PULMONAR AGUDA INDUZIDA POR HIPERÓXIA
HIPERBÁRICA EM CÂMARA HIPERBÁRICA PARA PEQUENOS ANIMAIS
RIO DE JANEIRO
2019
ii
ALVARO ANTONIO CARDOSO BASTOS
MODELO DE LESÃO PULMONAR AGUDA INDUZIDA POR HIPERÓXIA
HIPERBÁRICA EM CÂMARA HIPERBÁRICA PARA PEQUENOS ANIMAIS
Dissertação de Mestrado submetida ao
Programa
de
Pós-graduação
em
Ciências Biológicas (Fisiologia), Instituto
de Biofísica Carlos Chagas Filho, da
Universidade Federal do Rio de Janeiro –
UFRJ, como parte dos requisitos
necessários à obtenção do título de
Mestre
em
Ciências
Biológicas
(Fisiologia).
Orientador: Walter Araújo Zin
Universidade Federal do Rio de Janeiro
Centro de Ciências da Saúde
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
2019
iv
ALVARO ANTONIO CARDOSO BASTOS
MODELO DE LESÃO PULMONAR AGUDA INDUZIDA POR HIPERÓXIA
HIPERBÁRICA EM CÂMARA HIPERBÁRICA PARA PEQUENOS ANIMAIS
Dissertação de Mestrado submetido ao
Programa
de
Pós-graduação
em
Ciências Biológicas (Fisiologia), Instituto
de Biofísica Carlos Chagas Filho, da
Universidade Federal do Rio de Janeiro –
UFRJ, como parte dos requisitos
necessários à obtenção do título de
Mestre
em
Ciências
Biológicas
(Fisiologia).
Aprovada em 25 de julho de 2019
_________________________________________________________________
Prof. Walter Araújo Zin – Orientador
Prof. Titular UFRJ
_________________________________________________________________
Prof. José Roberto Lapa e Silva
Prof. Titular UFRJ
_________________________________________________________________
Prof. Zilton Farias Meira de Vasconcelos
Pesquisador Adjunto Fundação Oswaldo Cruz
_________________________________________________________________
Prof. Pedro Leme Silva
Prof. Adjunto UFRJ
_________________________________________________________________
Prof. Rodrigo Soares Fortunato – Revisor
Prof. Adjunto UFRJ
_________________________________________________________________
Profa. Cláudia Farias Benjamin - Suplente
Prof. Associada UFRJ
À minha amada esposa Cristiane,
inseparável companheira e amiga,
exemplo de inteligência e dedicação.
vi
AGRADECIMENTOS
A DEUS, sem o qual nada seria possível. Pelo dom da vida e pela luz da
inteligência.
Ao Prof. Dr. WALTER ARAÚJO ZIN, pelos ensinamentos, dedicação, apoio e
compreensão durante a realização deste trabalho. A confiança em mim depositada
será sempre motivo de gratidão.
Ao Prof. Dr. RODRIGO SOARES FORTUNATO, pelo auxílio e presteza em
todos os momentos, colocando-se sempre à disposição e todo seu conhecimento no
que fosse necessário para a concretização desta obra.
À Profa. Dra. CHRISTINA MAEDA TAKIYA, pelo auxílio e orientação no
estudo de apoptose.
Aos meus chefes navais durante este período, principalmente os Capitães de
Mar e Guerra ALEXANDRE MADUREIRA DE SOUZA, HUMBERTO DA CUNHA
LIMA, LUIZ CLÁUDIO DE ALMEIDA BARACHO e MANOEL LUIZ PAVÃO
BARROSO, aos Capitães de Fragata MICHAEL BILAC BARBOSA DE OLIVEIRA,
LUCIANO DE ASSIS LUIZ e TÁCITO DA GAMA LEITE FILHO que acreditaram no
potencial desta pesquisa e de seus frutos.
A todos os meus subordinados, principalmente ao Capitão de Corveta (Md)
ALEXANDRE PIRES DE FREITAS, que com seu inquebrantável esforço e árdua
dedicação, substituiu-me a contento, nas ausências necessárias.
Aos Drs. JOAQUIM DUARTE SILVA e IRIANO DA SILVA ALVES, pelo
empréstimo da câmara hiperbárica experimental, recurso imprescindível à realização
desta pesquisa.
Aos demais professores do Laboratório de Fisiologia Respiratória (LFR), Prof.
Dr. ALYSSON RONCALLY SILVA CARVALHO e Prof. Dra. MARIANA BOECHAT
DE ABREU, pelo tratamento cortês e afável e às orientações sempre precisas.
À doutoranda CAROLINE COELHO DE FARIA, pelo auxílio inestimável nos
experimentos da atividade REDOX.
À colaboradora do LFR, ALÉXIA NASCIMENTO, pelo auxílio inestimável nos
experimentos da mecânica pulmonar e pela análise das lâminas de histopatologia.
Aos queridos colegas do LFR, pela preocupação, compreensão, paciência,
carinho e, também, pelos momentos de descontração. Com certeza, nesses anos de
convivência no laboratório, foram criados laços de amizade que perdurarão para o
resto da vida. Que a vida lhes retorne em dobro todas as coisas boas que fizeram por
mim.
Aos funcionários do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, em especial aos
técnicos de laboratório Sr. ANTÔNIO CARLOS DE SOUZA QUARESMA e ao Sr.
DIEGO VINICIUS DA SILVA RIBEIRO, sempre dispostos a ajudar.
À minha mãe, MARÍLIA CARDOSO BASTOS, que se doou por inteiro e muita
vez renunciou aos próprios sonhos para que eu pudesse realizar os meus, a quem
tudo devo em minha existência, e que nesses anos de crescimento me foi orientadora
de largas vistas, a conselheira de todos os momentos. É mais dela do que meu o
pequeno patrimônio de minha vida, e nesse trabalho quanto exista de proveitoso, eu
atribuo, com ufania e sinceridade, à valia de seus ensinamentos e à abnegação de
sua alma. Espero ser sempre motivo de orgulho.
A minha esposa, Prof.ª Dra. CRISTIANE CRUXEN DAEMON D’OLIVEIRA E
BASTOS, pelo amor, ajuda nos momentos difíceis, carinho, amizade, respeito e
compreensão. Agradeço a você pela enorme contribuição a este trabalho, por me
fortalecer internamente e por tanto me incentivar, não apenas para a consecução do
mestrado, mas ao longo de toda nossa vida juntos.
Aos CAMUNDONGOS, meus animais de experimentação, que pelo
involuntário sacrifício de suas vidas, nos ensinaram a compreendê-la.
Por fim, a todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para a
elaboração deste trabalho. Muito obrigado!
viii
“A descoberta consiste em ver o que todos
viram e pensar o que ninguém pensou”.
Albert von Szent-Györgyi Nagyrápolt
RESUMO
Introdução: A hiperóxia hiperbárica causa uma lesão pulmonar bem conhecida, porém
seus mecanismos ainda não são totalmente compreendidos. Objetivo: Validar um
modelo de lesão pulmonar desenvolvido em uma câmara hiperbárica experimental
para pequenos animais submetidos ao ambiente hiperóxico e hiperbárico. Métodos:
95 camundongos BALB/c foram utilizados em três protocolos de estudo (aprovados
pelo Comitê de Ética em Pesquisa - CEUA 016/17 e A05/18). No protocolo I, 45
animais foram distribuídos em cinco grupos (n = 9/grupo). Cada um desses grupos foi
exposto à hiperóxia, em câmara hiperbárica, sob pressões de 1, 1,5, 2, 2,5, e 3
atmosferas absolutas (ata). Ao final, as curvas de sobrevida foram calculadas para
cada pressão de exposição. Com os tempos obtidos de sobrevida para cada pressão,
a concentração letal mediana (CL50) foi calculada por análise probits. Para realização
do protocolo II, 25 animais foram distribuídos em cinco grupos (n = 5/grupo) e expostos
a 50% da CL50 obtida para os mesmos níveis de pressão ambiental e imediatamente
após, os animais foram encaminhados para avaliação de mecânica pulmonar
(FlexiVent, prime 8) para obtenção de resistência newtoniana (Rn), amortecimento
tecidual (G), elastância tecidual (H) e histeresividade (), com posterior coleta de
amostras para histopatologia e imunohistoquímica para caspase-3, e finalmente,
avaliação da atividade REDOX. Por fim, no protocolo III, 20 camundongos foram
distribuídos em 4 grupos (n = 5/grupo) (3ATA, expostos a hiperóxia hiperbárica a 3 ata;
HIPEROX, expostos à hiperóxia normobárica; HIPERBAR, expostos a normóxia
hiperbárica a 3 ata; CTRL, isentos de alterações ambientais). Após o período de
estudo, foram encaminhados para coleta das mesmas variáveis do protocolo II.
Resultados: O tempo de sobrevida foi inversamente proporcional a pressão parcial de
oxigênio (ppO2) interna da câmara e apresentou uma distribuição polinomial de 3º
grau. No protocolo II, o G foi maior no grupo 1ATA do que nos outros grupos, como
também, a H entre 1ATA e CTRL. O grupo 1ATA apresentou mais colapsos de
alvéolos e células inflamatórias do que os outros grupos. A atividade da superóxido
dismutase (SOD) nos grupos 2,5 e 3ATA foi maior do que no CTRL. Houve queda dos
grupamentos tióis no grupo 1ATA quando comparado aos grupos 2 e 2,5ATA. A
expressão de caspase-3 ativada foi mais evidente no grupo 3ATA e 1ATA. Quanto ao
protocolo III, a Rn foi maior nos grupos 3ATA, HIPEROX e HIPERBAR e o G foi maior
no grupo 3ATA quando comparado ao HIPEROX e CTRL. Nos grupos 3ATA e
x
HIPEROX, houve maior presença de células inflamatórias. A SOD aumentou nos
grupos 3ATA, HIPEROX e HIPERBAR em relação ao CTRL. E o maior estímulo
apoptótico foi encontrado nos grupos 3ATA e HIPERBAR. Conclusão: O presente
estudo mostra a validade de uma modelo de lesão pulmonar desenvolvido em uma
câmara hiperbárica experimental para pequenos animais submetidos ao ambiente
hiperóxico e hiperbárico. Por fim, observou-se que o padrão da lesão pulmonar muda
conforme a exposição migra pelo espectro hiperóxico normobárico para o hiperóxico
hiperbárico, acompanhado de uma resposta bimodal, tanto na atividade antioxidante
quanto no estímulo apoptótico.
Palavras-chave:
Camundongos.
Oxigênio.
Hiperóxia.
Hiperbárico.
Lesão
pulmonar
aguda.
ABSTRACT
Introduction: Despite hyperbaric hyperoxia is a well-known lung injury, its mechanisms
are still not clearly understood. Objective: To validate a model of lung injury developed
in an experimental hyperbaric chamber for small animals submitted to hyperoxia and
hyperbaric environment. Methods: For this purpose, 95 BALB/c mice were used in
three study protocols (approved by the Research Ethics Committee - CEUA 016/17
and A05/18). In protocol I, 45 animals were divided into five groups (n = 9/group). Each
of these groups was exposed to 100% oxygen in a hyperbaric chamber under
pressures of 1, 1.5, 2, 2.5, and 3 atmospheres absolute (ata). After that, survival curves
were calculated for each exposure pressure. The median lethal concentration (LC 50)
for each pressure, derived from the survival time, was calculated using probits analysis.
For protocol II, 25 animals were distributed into five groups (n = 5/group) and then
exposed to 50% of the LC50 obtained at the same environmental pressure levels (1,
1.5, 2, 2.5 and 3 ata) and subsequently, the animals were referred for pulmonary
mechanics evaluation through the constant phase linear model (FlexiVent, prime 8) to
obtain Newtonian resistance (Rn), tissue damping (G), tissue elastance (H) and
hysteresivity (), followed by histopathology analysis and activated caspase-3
immunohistochemistry, and finally, REDOX activity evaluation. Lastly, in protocol III,
20 mice were distributed in 4 groups (n = 5/group) (3ATA, exposed to hyperbaric
hyperoxia at 3 ata; HIPEROX, exposed to normobaric hyperoxia; HIPERBAR, exposed
to hyperbaric normoxia at 3 ata; CTRL, no environmental changes). After the
pressurization period, the animals were sent to assemble the same variables of
protocol II. Results: Survival time was inversely proportional to the internal oxygen
partial pressure (ppO2) of the chamber and presented a 3rd degree polynomial
distribution. In protocol II, G was significantly higher in group 1ATA than other groups
as well as H between 1ATA and CTRL. Group 1ATA presented more alveoli collapse
and inflammatory cells when compared to all other groups. Superoxide dismutase
(SOD) activity in groups 2.5 and 3ATA was statistically higher than CTRL. There was
a significant drop in thiol levels in group 1ATA when compared to groups 2 and 2.5ATA.
Activated caspase-3 expression was most evident in group 3 and 1ATA. Concerning
protocol III, Rn was increased in groups 3ATA, HIPEROX and HIPERBAR, and G was
higher in group 3ATA when compared to HIPEROX and CTRL. In groups 3ATA and
HIPEROX, there was a higher presence of inflammatory cells. SOD increased in
xii
groups 3ATA, HIPEROX, and HIPERBAR. And the greatest apoptotic stimulus was
found in groups 3ATA and HIPERBAR. Conclusion: The present study shows the
validity of a lung injury model developed in an experimental hyperbaric chamber for
small animals submitted to the hyperoxic and hyperbaric environments. Finally, the
pattern of lung injury changes as exposure migrates across the normobaric hyperoxia
to hyperbaric hyperoxia spectrum, accompanied by a bimodal response to both
antioxidant activity and apoptotic stimulus.
Keywords: oxygen, hyperoxia, hyperbaric, acute lung injury, mice.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1. Material usado por Priestley para a descoberta do gás oxigênio ............. 20
Figura 2. Modelo de compartimento único de mecânica do sistema respiratório .... 38
Figura 3. Espécies reativas de oxigênio .................................................................. 48
Figura 4. Reações catalisadas pelas enzimas antioxidantes .................................. 49
Figura 5. Desenho da pesquisa............................................................................... 70
Figura 6. Distribuição dos camundongos nos grupos do estudo na segunda fase.. 71
Figura 7. Distribuição dos camundongos nos grupos do estudo na terceira fase ... 71
Figura 8. Câmara hiperbárica para pequenos animais com sistema de vigilância
instalado. .................................................................................................. 72
Figura 9. Caixa em acrílico fenestrada para manutenção dos animais no interior da
câmara. .................................................................................................... 73
Figura 10. Depurador artesanal de CO2. ................................................................... 74
Figura 11. Fluxo de coleta de amostras. ................................................................... 75
Figura 12. Quantificação dos parâmetros morfométricos. ......................................... 77
Figura 13. Quantificação da celularidade. ................................................................. 78
Figura 14. Curva de distribuição do tempo de sobrevida presuntiva em ambiente
hiperóxico. ................................................................................................ 88
Figura 15. Curvas de sobrevida presuntiva estimada ............................................... 89
Figura 16. Parâmetros da mecânica respiratória....................................................... 91
Figura 17. Fotomicrografias de parênquima pulmonar esquerdo .............................. 92
Figura 18. Fração de área de alvéolos colapsados no parênquima pulmonar. ......... 93
Figura 19. Células polimorfonucleares (PMN). .......................................................... 94
Figura 20. Geração de H2O2 do pulmão dos animais expostos a diferentes condições
de hiperóxia hiperbárica comparadas com o grupo CTRL. ...................... 95
Figura 21. Atividade das enzimas antioxidantes. ...................................................... 96
Figura 22. Quantificação dos grupamentos tióis no homogenato pulmonar. ............. 97
Figura 23. Fotomicrografias de parênquima pulmonar esquerdo. ............................. 98
Figura 24. Quantificação da expressão de caspase-3 ativada. ................................. 99
Figura 25. Parâmetros da mecânica respiratória pela técnica de oscilação forçada de
baixa frequência (TOF). .......................................................................... 100
Figura 26. Fotomicrografias de parênquima pulmonar esquerdo ............................ 101
Figura 27. Fração de área de alvéolos colapsados no parênquima pulmonar. ....... 102
xiv
Figura 28. Células polimorfonucleares (PMN). ........................................................ 103
Figura 29. Geração de H2O2 do pulmão dos animais expostos a hiperóxia hiperbárica
comparada com os grupos HIPEROX, HIPERBAR e CTRL. ................. 104
Figura 30. Atividade das enzimas antioxidantes. .................................................... 105
Figura 31. Medidas do dano oxidativo pela quantificação dos grupamentos tióis no
homogenato pulmonar. ........................................................................... 106
Figura 32. Fotomicrografias de parênquima pulmonar esquerdo ............................ 107
Figura 33. Quantificação da expressão de caspase-3 ativada. ............................... 108
Figura 34. Análise de Sobrevivência de estudo de Demchenko e colaboradores. .. 115
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Regulação das citocinas durante hiperóxia................................................54
Tabela 2. Tempo de sobrevida dos camundongos expostos à atmosfera com oxigênio
a 100% em diferentes pressões ambientais absolutas (tempo em min).....87
Tabela 3. CL50 e tempo de exposição........................................................................90
xvi
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
G -– energia livre de Gibbs
V – variação de volume gasoso mobilizado
7-NI – 7-nitroindazol
ADP – adenosina difosfato
Akt – proteína quinase B
ATP - adenosina trifosfato
BE – excesso de base (do inglês, base excess)
CL50 – concentração letal mediana
CONCEA - Conselho Nacional de Controle de Experimentação Animal
Crs – complacência do sistema respiratório
CTRL – grupo controle
Cu-Zn-SOD – Superóxido dismutase com cobre e zinco
CVF – capacidade vital forçada
DL50 – dose letal mediana
DTNB -– ácido 2,2’-dinitro-5,5’-ditiodibenzóico (do inglês, 5,5'-dithiobis-(2nitrobenzoic acid)
E – elastância
EC-SOD – Superóxido dismutase extracelular
EL – elastância do pulmão
ERN – espécies reativas do nitrogênio
ERO – espécies reativas de oxigênio
Ers – elastância do sistema respiratório
Ew – elastância da parede torácica
G – resistência tecidual
G-CSF – fator estimulador de colônias granulocitárias (do inglês, granulocyte-colony
stimulating factor
GM-CSF – fator estimulador de colônias de granulócitos e macrófagos (do inglês,
granulocyte-macrophage colony stimulating factor
GPx – glutationa peroxidase
GSH – glutationa reduzida
GST – glutationa s-transferase
H – elastância tecidual
HE – hematoxilina e eosina
HHA – eixo hipotálamo-hipófise-adrenal
i.p. – intraperitoneal
i.t. – intratraqueal
i.v. – intravenoso
IGF - Fator de crescimento semelhante à insulina (do inglês, insulin-like growth
factor)
IGFR – Receptor do fator de crescimento semelhante à insulina (do inglês, insulinlike growth factor receptor)
IGR-BP – Proteína Ligadora do IGF
IL – Interleucina
KGF – fator de crescimento de queratinócitos (do inglês, keratinocites growth factor)
L-NAME – cloridrato de N-omega-Nitro-L-arginina metil ester
MCTI - Ministério de Ciência, Tecnologia e Inovação
Mn-SOD – Superóxido dismutase com manganês
NADPH -– fosfato de dinucleotídeo de nicotinamida e adenina
NANC – não adrenérgico, não colinérgico
NF-kB – fator de transcrição nuclear kB (do inglês, nuclear factor kappa-light-chainenhancer of activated B cells)
nNOS – óxido nítrico sintase neuronal (do inglês, neuronakl nitric oxide sythase)
NOS – óxido nítrico sintase (do inglês, nitric oxide sythase)
OHB – oxigenoterapia hiperbárica
P – pressão
p.o. – via oral (do latim, per os)
PA – pressão arterial
PaCO2 – pressão arterial do gás carbônico
PaO2 – pressão arterial do oxigênio
PDGF - Fator de crescimento derivado de plaquetas (do inglês, platelet-derived
growth factor beta)
Pel,rs – pressão elástica do sistema respiratório
PMN – célula polimorfonuclear
ppCO2 – pressão parcial do gás carbônico, na atmosfera
ppO2 – pressão parcial do oxigênio, na atmosfera
r - raio
xviii
R – resistência
Raw – resistência das vias aéreas
Rn – resistência newtoniana
Rrs – resistência do sistema respiratório
Rtis – resistência tecidual
SNC – sistema nervoso central
SOD – superóxido dismutase
SR – sistema respiratório
T – tensão
Ti – tempo inspiratório
TNF – Fator de Necrose Tumoral (do inglês, Tumor Necrosis Factor)
TOF – técnica de oscilação forçada
VEGF – O fator de crescimento endotelial vascular (do inglês, vascular endotelial
growth factor)
Vt – volume corrente
Zin – impedância de entrada no sistema respiratório
LISTA DE SÍMBOLOS
𝑉̇ – fluxo aéreo
ata – atmosfera absoluta
atm – atmosfera padrão
NO – óxido nítrico
O2• - – radical superóxido
OH• – radical hidroxila
ONOO- – peroxinitrito
Pa – pascal, SI
xx
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 11
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ................................................................................... 17
3 JUSTIFICATIVA ..................................................................................................... 61
4 OBJETIVOS ........................................................................................................... 65
5 MATERIAIS E MÉTODOS...................................................................................... 69
6 RESULTADOS ....................................................................................................... 87
7 DISCUSSÃO ........................................................................................................ 111
8 CONCLUSÕES .................................................................................................... 135
9 PERSPECTIVAS FUTURAS ................................................................................ 139
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................... 143
APÊNDICES ......................................................................................................... 175
Apêndice A: Ficha de Registro de Compressão .................................................... 175
Apêndice B: Cálculo probit de acordo com BLISS e FINNEY ............................... 176
ANEXOS ............................................................................................................... 179
Anexo A: Parecer da Comissão de Ética no Uso de Animais: 16/2017 ................ 179
Anexo B: Adendo ao parecer da Comissão de Ética no Uso de Animais: A05/18-0162017 ...................................................................................................................... 180
INTRODUÇÃO
“O oxigênio foi um encrenqueiro desde o
começo.”
Doris Abele
1.
Introdução, 11
11
1 INTRODUÇÃO
Apesar do gás oxigênio (O2) ser necessário para sustentar a vida aeróbica,
concentrações suprafisiológicas (hiperóxia) rotineiramente usadas para tratar a
hipoxemia e a insuficiência respiratória aguda, podem resultar em danos aos tecidos,
especialmente ao pulmão (CLARK; LAMBERTSEN, 1971a; WISPE; ROBERTS,
1987). A cada ano, mais de 800.000 indivíduos necessitam de terapia com oxigênio
inalatório, resultando em uma despesa anual de 1,8-2 bilhões de dólares (NEUMAN;
THOM, 2008).
Apesar de existir uma variedade de efeitos e diferentes níveis de
susceptibilidade dependendo do tipo celular, nenhuma célula viva está completamente
imune aos efeitos deletérios do O2 (HUBER; DRATH, 1981). Os mais reconhecidos
efeitos do O2 sobre órgãos específicos incluem: dano pulmonar culminando em
hipoxemia, acidose e morte (CLARKE; SANDISON; LEDINGHAM, 1969; FUSON et
al., 1965; HYDE; RAWSON, 1969; KNOWLES; BLENNERHASSETT, 1967);
convulsão central, paralisia permanente e morte; toxicidade ocular, contração do
campo visual, dano retiniano e cegueira (BEEHLER, 1964; BEEHLER et al., 1964;
BEHNKE; FORBES; MOTLEY, 1935; BUTLER; HAGAN, 2008; BUTLER JR.; HAGAN;
MURPHY-LAVOIE, 2008; BYFIELD; BUDD; ELIZABETH HARTNETT, 2009; CLARK
et al., 1991; ELIZABETH HARTNETT, 2010; NICHOLS; LAMBERTSEN, 1969;
SCHAAL et al., 2003); e outros efeitos, tais como, lesão testicular e hemólise
eritrocitária (MENGEL et al., 1964, 1965).
Os pulmões são particularmente vulneráveis a inalantes exógenos, devido à
grande superfície epitelial e à sua localização anatômica (CLARK; LAMBERTSEN,
1971a). A exposição prolongada a pressões de oxigênio de até 101,3 KPa ou uma
atmosfera absoluta – 1 ata1 (oxigênio normobárico) resulta em dano pulmonar difuso
com inflamação extensa, acúmulo de líquido pleural, ruptura da membrana alveolar, e
1
Denomina-se pressão à grandeza física que mede a força que se exerce por unidade de área. No
Sistema Internacional (SI), a unidade padrão é o pascal (Pa) (INSTITUTO NACIONAL DE
METROLOGIA QUALIDADE E TECNOLOGIA, 2012). Apesar de haver diversas formas de medi-la e
expressá-la, na atividade de mergulho e na bibliografia relacionada é comum o uso da unidade
atmosfera padrão (atm) ou atmosfera absoluta (ata), equivalentes a 101.325 Pa (100 kPa) ou
706 mmHg. Por familiaridade, serão utilizadas neste trabalho as unidades atm ou ata, seguidas por
sua correlação do SI, entre parênteses.
12
eventualmente, trocas gasosas prejudicadas, insuficiência respiratória e morte
(CAPELLIER et al., 1999; CRAPO, 1986).
A hiperóxia duradoura e intensa causa uma reação inflamatória com a
migração de células polimorfonucleares (PMN), seguida pela proliferação celular
intersticial, principalmente formada por fibroblastos e monócitos e por hipertrofia de
células epiteliais do tipo II, o que leva a um aumento da liberação de citocinas, da
atividade apoptótica e, por fim, à evidência morfológica de lesão pulmonar. As
primeiras 24 a 48 horas de exposição ao oxigênio constituem a fase inicial da
intoxicação pulmonar pelo gás (CRAPO, 1986). Além disso, quando a pressão
ambiente excede 1 ata (oxigênio hiperbárico), o desenvolvimento da lesão pulmonar
é acelerado e agravado (BAO et al., 2014).
A inalação de ar ambiente resulta em um aporte de 21% de O2 e nos
momentos de maior necessidade metabólica, pacientes podem receber terapia de
oxigênio por meio de máscaras de fluxo de pressão positiva com proporções entre 24100%. No entanto, alguns indivíduos, mesmo com o aporte de uma maior
percentagem de oxigênio (90-100%), ainda enfrentam um reduzido fornecimento do
gás aos tecidos. Isto é devido à saturação limitada da hemoglobina e à pouca
dissolução do oxigênio no plasma sanguíneo. A perda de oxigênio das hemácias pela
dissolução no plasma resulta na entrega de apenas 1/3 do oxigênio necessário para
as células do tecido em repouso (PITTMAN, 2011).
Para resolver esse impasse, a oxigenoterapia hiperbárica (OHB) surge como
opção, oferecendo altas doses do gás a uma pressão parcial maior que uma atmosfera
nos pacientes com deficiência grave de oxigênio. A exposição ao oxigênio, a uma
pressão três vezes a ambiental, resulta em um incremento na dissolução no plasma e
um aumento no aporte do gás para as células em repouso, independentemente do
envolvimento da hemoglobina (PITTMAN, 2011).
Embora a terapia com oxigênio seja uma forma necessária de suporte, que
não pode ser contornada devido à premente necessidade de oxigênio pelo tecido, há
um estreito limite entre a dose eficaz e a tóxica. Margem essa ainda não totalmente
compreendida (BITTERMAN, 2009). O fornecimento elevado do gás pode resultar na
hiperóxia dos tecidos e, portanto, levar à toxicidade pelo oxigênio. Como dito
anteriormente, não há órgão mais susceptível a esta toxicidade do que os pulmões,
que pode desenvolver uma doença conhecida como lesão pulmonar aguda hiperóxica
(KALLET; MATTHAY, 2013).
13
Isso se reveste de grande importância, posto que a utilização de oxigênio
hiperbárico como tratamento coadjuvante cresce no Brasil e no mundo, devido às suas
propriedades favoráveis para o tratamento da doença descompressiva e da embolia
aérea (BENNETT et al., 2012; LAMBERTSEN, 2008; MOON; GORMAN, 2008; THOM,
1989), das doenças isquêmicas periféricas (RODRIGUES JUNIOR; MARRA, 2004;
THOM, 1987), das lesões actínicas (APRILLI et al., 2011; BENNETT et al., 2005), na
cicatrização de feridas, no pré e pós-operatório das mais diversas especialidades
(ESKES et al., 2013; RODRIGUEZ et al., 2008; WU; MARSTON; ARMSTRONG,
2010). Além delas, seu emprego é importante na atividade de mergulho, tanto com o
uso de equipamentos autônomos de circuito fechado como no emprego de misturas
gasosas em mergulhos profundos (MOON, 2009; MOON et al., 2009).
Dentro deste contexto, é atribuído às espécies reativas do oxigênio (ERO) a
promoção do mecanismo de toxicidade pelo oxigênio (CLARK, 2008). As ERO
também servem como moléculas sinalizadoras nas cascatas e vias de transdução,
para uma variedade de fatores de crescimento, citocinas e hormônios (ALLEN; BALIN,
1989; CALABRESE et al., 2007; HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2015; MAULIK, 2002;
USHIO-FUKAI; ALEXANDER, 2004), podendo gerar tanto efeitos positivos quanto
negativos, dependendo de sua concentração e localização intracelular (FORMAN,
2016; HALLIWELL, 1994; SHARAN; ODYUO; PURKAYASTHA, 2011).
As ERO são gerados como subprodutos naturais do metabolismo aeróbico e
incluem o superóxido (O2•-), o peróxido de hidrogênio (H2O2), o ácido hipocloroso
(HClO) e o radical hidroxila (HO•) (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2015).
Considerando que seja breve a exposição à hiperóxia em protocolos clínicos
de terapia com oxigênio hiperbárico (aproximadamente 2 h/dia), os estudos mostram
que as defesas antioxidantes naturais são adequadas, de modo que o estresse
bioquímico relacionado com o aumento de ERO é reversível (DENNOG et al., 1996;
NARKOWICZ; VIAL; MCCARTNEY, 1993; ROTHFUSS; RADERMACHER; SPEIT,
2001). Estes antioxidantes enzimáticos incluem a superóxido dismutase, a catalase,
as peroxidases e as redutases dependentes da glutationa e de tioredoxina. Atuando
em conjugação com estas enzimas, estão os antioxidantes não enzimáticos como as
vitaminas C e E, tioredoxina, glutationa, ácido úrico e β-caroteno (BRIEGER et al.,
2012; RABÊLO et al., 2010; RIBEIRO et al., 2005; VALKO et al., 2007). Porém, é de
se esperar que nos momentos nos quais a exposição ao gás oxigênio fosse maior,
14
como ocorre no ambiente hiperbárico, essas defesas naturais fossem sobrepujadas e
o efeito da intoxicação aparecesse.
Além disso, apesar de todo o avanço no conhecimento da fisiopatologia da
intoxicação pulmonar pelo oxigênio, poucas formas de profilaxia ou de tratamento
foram registradas com a eficácia necessária. Entre elas, a quercetina (HAYASHI et
al., 2012), glutamina (PERNG et al., 2010), e a adrenomedulina (TAO et al., 2012)
atenuaram a lesão pulmonar induzida pela hiperóxica normobárica.
Por fim, entre as inúmeras investigações realizadas acerca do assunto,
poucos estudos avaliaram os efeitos patológicos de ambos os regimes de hiperóxia,
comparando-os lado a lado e em condições experimentais uniformes em murinos.
Portanto, não há um método padronizado ou modelo experimental fidedigno para se
realizar uma análise comparando as eventuais terapias.
15
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
"Se eu vi mais longe, foi por estar sobre
ombros de gigantes."
Isaac Newton
2.
Revisão bibliográfica, 17
2.1.
Os caminhos que levaram à descoberta do oxigênio, 17
2.2.
O emprego do oxigênio e a descoberta de sua toxidez, 21
2.3.
O oxigênio como poluente e ferramenta evolutiva, 25
2.4.
Fatores que influenciam a toxicidade do oxigênio, 29
2.5.
Suscetibilidade à intoxicação pelo oxigênio, 30
2.6.
Intoxicação pulmonar, 34
2.7.
Toxicidade pelo oxigênio e seus efeitos na mecânica respiratória, 36
2.8.
Relação entre a intoxicação pulmonar e o SNC, 43
2.9.
O papel das espécies reativas do oxigênio, 47
2.10.
O resultado final: inflamação e morte celular, 53
16
17
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Os caminhos que levaram à descoberta do oxigênio
A noção de que parte da atmosfera importa muito para a vida é extremamente
antiga. Muitas culturas empregaram a expressão “sopro de vida” para explicar essa
relação. A mais antiga referência é encontrada em manuscritos sumérios, os primeiros
a manterem registros em língua escrita (cerca de 3000 a.C.), que para explicarem o
mito da criação, estabeleciam que: “pelo bem das coisas boas nos seus redis, ao
Homem foi dada a respiração” (WOOLLEY, 1965).
Da mesma forma, Contenau se refere a uma inscrição na estátua do Príncipe
Gudea (2200 a.C.), com as palavras “generosamente dotado com o sopro da vida”
(CONTENAU, 1938).
Já o faraó herético Akhenaton (1350 a.C.), que reverenciava o sol, escreveu as
seguintes frases em seu Grande Hino a Aton: “Quem dá o sopro para animar a todos
que ele faz” (PRITCHARD, 2011; WOOLLEY, 1965), o que é compatível com a ideia
egípcia sobre a vida como um episódio passivo. Esta filosofia está refletida no texto O
segredo do médico: conhecimento do movimento do coração e conhecimento do
coração, possivelmente escrito entre 1600-1550 a.C., como ilustrado pela citação: “O
sopro da vida entra pela orelha direta, e o sopro da morte entra pela orelha esquerda”
(SIGERIST, 1967).
De certo, este conceito foi amplamente difundido na antiguidade. No Velho
Testamento, no livro do Gênesis, capítulo 2, versículo 7, “E formou o Senhor Deus o
homem do pó da terra, e soprou em suas narinas o fôlego da vida; e o homem foi feito
alma vivente”, potencialmente escrito no décimo século a.C. (SPEISER, 1964).
Igualmente, o indiano Rig Veda (1500-1000 a.C.), o documento mais antigo da
literatura hindu, contém a seguinte frase: “doador do sopro vital” (ELIADE, 1974), o
que pode ser ideia comum ao “chi” chinês (PERKINS JR., 1964).
Similarmente, os gregos antigos viam o ar como um componente fundamental
da natureza e sua relação com o aparecimento, manutenção e extinção do fogo como
a explicação para a vida. Tanto que a palavra arcaica grega pneuma, inicialmente
cunhada por Anaximenes (445 a.C.) e posteriormente, revivida por Diógenes (435
a.C.), carregava tanto a definição para ar ou sopro de vida quanto para alma, espírito
ou fogo inato. Termo aquele que se mesclava com outro termo grego anemas, origem
18
do verbete latino anima, que significa alma. Interessante notar que a palavra animal
deriva desta fonte (SKINNER, 1970).
Não obstante, a ideia de que a vida é análoga ao fogo foi prevalente também
por muito tempo. Este conceito está presente nas obras de diversos pensadores
antigos, tais como Francis Bacon que dizia “a vida, como uma chama, eventualmente
morreria” ou Paracelso e Descartes que pensavam que a vida seria como o fogo sem
a luz (HALL, 1975).
Somado à superstição, o conhecimento incipiente sobre a química do
aquecimento (combustão) de materiais, como o mercúrio, levando ao aparecimento
de um sólido vermelho, o óxido de mercúrio, conforme a Equação 1, só viria a ser
compreendido por Paul Eck von Sulzbach no século XV, que observou o aumento do
peso do óxido de mercúrio em relação ao mercúrio inicial (PARTINGTON, 1962).
2𝐻𝑔 + 𝑂2 → 2𝐻𝑔𝑂
(1)
Entretanto, apenas em 1673, quando Robert Boyle realizou experiências com
a combustão do óxido de chumbo e com óxido de mercúrio, foi que a ciência esbarrou
no descobrimento do oxigênio (PARTINGTON, 1962). De acordo com Fulton, Boyle
foi quem mais se aproximou da descoberta do oxigênio antes de Priestley e Lavoisier
(FULTON, 1932).
Além disso, diversos experimentos foram levados a cabo no século XVII para
demostrar que certos metais, quando aquecidos, ganhavam peso. O metal aquecido
era chamado de calx e o processo denominado calcinação. Nos dias de hoje, chamase o calx de óxido e o processo de oxidação (PARTINGTON, 1962).
Paralelamente, Boyle em trabalho conjunto com Robert Hooke demonstraram
que submetendo um animal ou uma vela ao vácuo parcial, levava o animal a morte e
a chama a ser extinta. A partir de 1664, Hooke passou a se dedicar ao estudo do
comportamento de animais em ambientes pressurizados e verificou que um
camundongo permanecia bem a uma pressão de 8 bar (7,8 atm ou 800 kPa)
(GILBERT, 1981; HARSCH, 2006). Por fim, em 1667, Boyle observou que um
camundongo vivia mais tempo em ar comprimido a 2 bar (1,97 atm ou 200 kPa) do
que no ar ambiente (MCKIE, 1953).
Algum tempo depois, em 1667, Johann Joachim Becher teorizou no seu
Physica subterranea, que todas as substâncias eram compostas de três tipos de
19
“terras”. Uma delas, a terra pinguis (literalmente terra gordurosa) dava à substância
qualidades combustíveis e se perdia durante a queima. Esta ideia de perda de algum
material para o fogo parecia até razoável, já que o fogo pode consumir grandes
quantidades de matéria e deixar somente pequena quantidade residual, como cinzas
(LEICESTER, 1971).
Mas foi com George Ernest Stahl (1697) que a ideia foi popularizada e
rebatizada, conforme segue (CHANG, 2002):
Mas também, de acordo com a maneira razoável de falar, é o fogo corpóreo,
o material essencial ao fogo, a verdadeira base do movimento do fogo em
todos os componentes inflamáveis... De todas essas várias condições,
entretanto, eu acreditei que possa se dar um nome, como o primeiro, único,
básico, princípio inflamável... E, entretanto, escolhi o nome grego flogisto, no
alemão Brennlich [inflamável]... Ele é principalmente encontrado em materiais
gordurosos... O carvão e o betume estão cheios dele; o enxofre, não de fato
no peso, mas no número de suas melhores partículas, é completamente
possuída dele. Não ao menos é encontrado em todos os metais, inflamáveis,
incompletos e chamados imaturos (STAHL, 1697).
Hoje se sabe que a teoria do flogisto não é correta. No entanto, foi uma teoria
bem-sucedida, que persistiu quase um século, sendo importante base para o
desenvolvimento da química orgânica, inorgânica e até fisiológica, pois se baseava
na reversibilidade das reações químicas. Conceito até então desconhecido
(LEICESTER, 1971; ROTHSCHUH, 1972).
Durante a primeira metade do século XVIII, diversos cientistas estiveram
próximos da descoberta do gás oxigênio. (PARTINGTON, 1962). Não obstante, entre
1771 e 1774, uma série de experimentos iria mudar a história da química do oxigênio.
Durante este período, dois químicos demonstraram independentemente os conceitos
de oxigênio e respiração, o que traz controvérsia até os dias de hoje
(SEVERINGHAUS, 2002).
Entre 1771-1772, em Uppsala, o farmacêutico sueco Carl Wilhelm Scheele
alegou a geração de um gás dando-lhe o nome de "fogo aéreo". Em setembro de
1774, descreve as experiências em carta ao químico francês Antoine Lavoisier (17431794), contudo, só as publica em 1777, devido a um atraso no prelo (SCHEELE,
1777).
20
Simultaneamente, Joseph Priestley, clérigo inglês, realizou uma série de
experimentos com gases respiratórios. Suas conclusões e resultados foram
publicados no Experiments and observations on different kinds of air, incluindo no
frontispício (figura 1) o equipamento utilizado por ele (PRIESTLEY, 1775a).
Figura 1. Material usado por Priestley para a descoberta do gás oxigênio. Gravura retirada do
frontispício do seu Experiments and observations on different kinds of air (PRIESTLEY, 1775a).
Em outubro de 1774, durante viagem à França, Priestley reproduz a mesma
experiência para diversos cientistas, dentre eles Lavoisier. Já em março de 1775,
endereçou carta a sir John Pringle, Presidente da Real Sociedade de Londres para o
Melhoramento do Conhecimento Natural, que a leu em sessão, gerando um
documento que cita relevante descobrimento (PRIESTLEY, 1775b).
Descrito inicialmente por Priestley como "ar puro", o gás produzido pelo
aquecimento de óxido de mercúrio fazia com que uma vela queimasse como "uma flor
notavelmente vigorosa" e permitia que um rato sobrevivesse por muito mais tempo do
que em "ar comum". Priestley tentou respirar o ar puro sem nenhum efeito aparente
(PRIESTLEY, 1775a). Defensor do conceito do flogisto, Priestley logo renomeou seu
"ar puro" para "ar deflogisticado". Ele acreditava que seus experimentos confirmavam
a teoria do flogisto, ou seja, que o óxido de mercúrio removia o flogisto do ar,
permitindo que as velas queimassem mais, ou que os animais respirassem por mais
tempo, antes que o ar ficasse saturado dele (IHDE, 1980; WEST, 2014). Estas
21
descobertas incitaram Lavoisier a pesquisar o novo elemento, levando-o a batizá-lo,
como oxigênio (do grego: oxys, ácido e gennao, eu produzo)2, porque considerava,
erroneamente, que todas as substâncias originadas de uma oxidação originavam
ácidos, nos quais o oxigênio se encontrava obrigatoriamente presente (SÉGUIN;
LAVOISIER, 1789). Lavoisier passou a maior parte de uma década em experimentos
para esclarecer a química do oxigênio e suas publicações derrubaram a teoria
convencional do flogisto, causando uma revolução na química (PARTINGTON, 1962).
Consequentemente, coube a Priestley, por muito tempo, os louros pela
descoberta desse gás, mas ele próprio já alertava sobre os riscos do que denominou
de “ar puro”:
...embora o ar deflogisticado possa ser muito útil como um medicamento,
pode não ser tão apropriado para nós no estado normal e saudável do corpo;
pois uma vela se queima muito mais depressa no ar mais difuso do que no ar
comum, assim poderíamos, como podemos dizer, viver muito rápido e os
poderes animais serem esgotados muito cedo, neste tipo de ar puro (BEAN,
1945).
Lavoisier confirmou as impressões de Priestley ao afirmar que a atmosfera
terrestre continha substâncias necessárias à vida animal na Terra, mas ao mesmo
tempo, foi o primeiro a salientar possíveis efeitos tóxicos do oxigênio em seus
experimentos com cobaias (IHDE, 1980).
2.2. O emprego do oxigênio e a descoberta de sua toxicidade
Tão logo o oxigênio foi descoberto, pesquisadores começaram a respirar o gás
isolado. Os próprios Scheele e Priestley testaram o oxigênio puro. Scheele detalha,
na seção 90 do seu relato (SCHEELE, 1777): “Eu comecei a respirar o ar [oxigênio]
do balão. Isso aconteceu de forma tranquila e eu fui capaz de realizar quarenta
respirações, até que começou a se tornar difícil para mim”.
Já Priestley descreveu sua experiência como:
A sensação dele [oxigênio] em meus pulmões não foi sensivelmente diferente
daquela do ar comum; mas eu julguei que meu peito me parecia mais leve e
Em seu Tratado, Lavoisier derivou a palavra oxigênio do grego, como relata: “Nós demos à parte
respirável do ar o nome de oxigênio [oxygène], derivando-a de duas palavras gregas: oxys, ácido,
ginomae, eu produzo” (LAVOISIER, 1789). No entanto, ginomae de fato significa “eu nasci” ou “eu
nasço” em francês. Partington assinala que gennao deveria ser usado ao invés de ginomae. A grafia,
oxygine, foi provavelmente oriunda da forma grega ginomae. A forma oxygine foi então mudada para
oxygène, possivelmente devido ao fato de que o sufixo “gine” não ocorra no francês para os derivativos
gregos, onde quer que o sufixo gène ocorra (PARTINGTON, 1962).
2
22
fácil, por algum tempo depois. Poder-se-ia dizer que, em breve, este ar puro
pode se tornar um elegante artigo de ostentação. Até então, somente dois
camundongos e eu tivemos o privilégio de respirá-lo (PRIESTLEY, 1775a).
Em 1780, Jan Ingen-Housz se submeteu às propriedades medicinais do
oxigênio. Como registrado em carta à Real Sociedade, descreve um estado de euforia
e vigor aumentado, inclusive atribuindo a melhora no apetite e no regime de sono
(INGEN-HOUSZ, 1780). Além deste último, o inglês Thomas Beddoes também
respirou o gás purificado e relata que, “aos meus pulmões, ele [oxigênio] parece
bebida alcoólica aplicada ao palato” (BEDDOUS, 1794).
Houve aqueles que nada testemunharam. Sir Humprey Davy, quando ainda era
empregado de Beddoes na famosa Instituição Pneumática de Bristol, declarou: “Ao
respirar oito ou dez quartos [de oxigênio]3, pelos primeiros dois ou três minutos eu não
percebi efeito algum” (DAVY, 1800).
No entanto, os primeiros relatos das consequências da exposição ao oxigênio
puro foram dados pelo próprio Scheele. Inicialmente, a maioria dos relatos de
toxicidade foi relacionado à exposição de plantas (PRIESTLEY, 1777; SCHEELE,
1777), além deles, Ingen-Housz também notou o efeito deletério em ervilhas
colocadas com uma atmosfera rica em oxigênio (INGEN-HOUSZ, 1779). Observações
mais recentes corroboraram esses achados em atmosferas hiperóxicas entre 1 a
5 atm (10-500 kPa) (GALSTON; SIEGEL, 1954; TURNER; QUARTLEY, 1956).
Do mesmo modo, foi Priestley quem realizou os primeiros experimentos com
animais. Partindo da hipótese de que os camundongos não sobreviveriam no oxigênio
puro, até que este estivesse empobrecido, observou uma sobrevida aumentada,
proporcional ao ar ambiente e erroneamente conclui: “Este experimento me satisfez
totalmente, já que não era nada no ar deflogisticado [oxigênio] o motivo pelo qual os
ratos não podiam viver nele” (PRIESTLEY, 1781). De fato, camundongos fêmeas
sobrevivem a um fluxo constante de oxigênio puro a 2 ata por alguns dias, com uma
média de 111,3±1,4 horas (n= 347) (GERSCHMAN; GILBERT; CACCAMISE, 1958).
Concomitantemente, Lavoisier ampliou os estudos de toxicidade pelo oxigênio
utilizando cobaias (Cavia porcellus). Além de relatar o sofrimento dos animais ao final
do experimento, descreve os dados de necropsia pontuando alterações em diversos
3
Um quarto imperial ou britânico equivale a 1,136 litros.
23
órgãos, dentre eles, o ingurgitamento cardíaco e severo infiltrado hemático nos
pulmões (LAVOISIER, 1785). Além destes achados, a importância da remoção do gás
carbônico foi experimentalmente demonstrada por Lavoisier e Édouard Séguin, que
colocaram um álcali (para absorção do dióxido de carbono), o que permitiu a sobrevida
de cobaias durante dias no oxigênio puro (SÉGUIN; LAVOISIER, 1789). Como
esperado, logo após a descoberta do oxigênio, a terapia com o gás foi introduzida na
Inglaterra. Beddous, em publicação de 1794, intitulada Considerations on the
medicinal use and production of factitious airs, pode ser considerada o início da terapia
por inalação (BEDDOUS, 1794). Beddous tratou todos os tipos de doenças com
oxigênio, incluindo condições díspares como a tuberculose ganglionar, hanseníase e
a poliomielite. Tais indicações indiscriminadas o levaram a diversas falhas e Beddous
morreu inconformado.
Entretanto, foi apenas com os resultados de investigações pioneiras como as
de John B. S. Haldane, Archibald Vivian Hill, Joseph Barcroft, Schak A. S. Krogh,
Lawrence J. Henderson e Yandell Henderson, que a terapia com o oxigênio atingiu
uma base fisiológica confiável e reconhecida (SACKNER, 1975).
Concomitantemente, a utilização do hiperbarismo foi se desenvolvendo.
Nathaniel Henshaw (1662) foi o pioneiro no uso de câmaras que pudessem aumentar
a pressão no seu interior com fins terapêuticos, embora à época o oxigênio ainda não
houvera sido descoberto (ASADAMONGKOL; ZHANG, 2014; SHERIDAN; SHANK,
1999).
Em 1870, Paul Bert inicia as primeiras pesquisas com oxigênio hiperbárico
levando-o a descrever a intoxicação cerebral pelo oxigênio. Em seu famoso trabalho
intitulado La Pression Barométrique, delineava as primeiras bases fisiológicas da
oxigenoterapia hiperbárica, mas também alertava sobre o risco da toxicidade pelo
oxigênio ao nível do sistema nervoso central (SNC) (BERT, 1878).
Em 1899, James Lorrain Smith, ao tentar determinar o menor nível de hiperóxia
suficiente para produzir o efeito Paul Bert em ratos, descobriu a ocorrência de
manifestações pulmonares, sobretudo de uma dispneia progressiva levando à morte
na ausência de sintomas neurológicos, após exposições contínuas a pressões
parciais de oxigênio entre 0,47 e 3,6 atm (48-364 kPa) (LORRAIN SMITH, 1899).
24
Até os dias atuais, a intoxicação do SNC e dos pulmões é denominada de efeito
Paul Bert e efeito Lorrain Smith, respectivamente, em uma justa homenagem aos seus
descobridores.
Em 1933, realiza-se a primeira exposição experimental com oxigênio a 4 ata
(405 kPa) em voluntários masculinos. Após alguns minutos, dois indivíduos
apresentam fasciculação dos músculos faciais, seguido de convulsão tipo grande mal
em um e síncope, no outro (BEHNKE et al., 1934). No entanto, apenas na década de
1950, é que o uso do oxigênio hiperbárico com propósitos terapêuticos se torna
realidade (BOEREMA et al., 1959; LAMBERTSEN et al., 1953).
A banalização das indicações da OHB levou ao descrédito pela classe médica
e ao abandono da técnica por décadas. No entanto, a partir do trabalho de Penrod
(1956) foram confirmadas que as alterações morfológicas evidentes a nível pulmonar
tinham como agente causador o oxigênio (PENROD, 1956), porém sem um
mecanismo bioquímico responsabilizado.
É desse mesmo período a demonstração de que cerca de 2% do consumo de
oxigênio mitocondrial gera o aparecimento do peróxido de hidrogênio (H2O2), mas
foram Rebecca Gerschman e Daniel Gilbert, em trabalho seminal de 1954, os
primeiros a desenhar um paralelo entre os efeitos do oxigênio e da radiação ionizante,
em que propuseram que os efeitos deletérios do oxigênio seriam causados pela
produção de espécies reativas do oxigênio (ERO) (BOVERIS; CHANCE, 1973;
CHANCE; WILLIAMS, 1956; GERSCHMAN et al., 1954).
Com o advento da ventilação mecânica e a utilização de câmaras hiperbáricas,
o efeito tóxico do oxigênio se tornou bastante evidente. No entanto, descobriu-se que
pressões parciais de oxigênio de até 0,5 atm (50 kPa) não produzem qualquer efeito
tóxico, o que atualmente é considerado o limite para o uso do oxigênio sem restrição,
quanto ao tempo de exposição (DE MARTINO et al., 1996).
A utilidade da inalação de oxigênio a pressões parciais acima daquelas
encontradas no ar ambiente normal já foi bem estabelecida nos campos da terapia
com oxigênio (BOEREMA; BRUMMELKAMP; MEIJNE, 1964; HILL, 1972; SHI et al.,
2016; THOM, 2011), do mergulho (MOON; GORMAN, 2008; TETZLAFF et al., 2005)
e da medicina aeroespacial (HUNDEMER et al., 2012; JERSEY et al., 2010; WEBB;
PILMANIS, 2011).
O oxigênio a pressões atmosféricas (1 atm ou 101,3 kPa) ou menos é um
importante agente terapêutico adjunto no tratamento de insuficiência respiratória ou
25
circulatória graves resultantes de condições como enfisema, insuficiência cardíaca
congestiva, edema pulmonar e pneumonia. O oxigênio a pressões maiores do que
1 atm é benéfico no tratamento do envenenamento por monóxido de carbono
(BUCKLEY et al., 2011; WEAVER et al., 2002), gangrena gasosa (HILL, 1972;
WEAVER, 2008; YANG et al., 2013), doença descompressiva (BENNETT et al., 2012;
NAKAYAMA et al., 2003; TIBBLES; EDELSBERG, 1996), embolia gasosa e como
tratamento adjunto da radioterapia no tratamento de neoplasias. Outras condições
médicas nas quais o oxigênio em altas pressões pode eventualmente ser provado
como útil inclui a insuficiência arterial, doença coronária (BENNETT; LEHM; JEPSON,
2011), como adjuvante para a cirurgia cardíaca (ALEX et al., 2005; BAUMGARTNER
et al., 2001; ZISER et al., 1999) e queimaduras severas (CONSELHO FEDERAL DE
MEDICINA, 1995; SOCIEDADE BRASILEIRA DE MEDICINA HIPERBÁRICA, 2015).
2.3. O oxigênio como poluente e ferramenta evolutiva
O gás oxigênio (O2) desafia qualquer classificação e pode ser considerado o
elixir da vida e ao mesmo tempo, seu maior algoz.
O elemento oxigênio nos cerca como uma molécula diatômica, dos quais mais
de 99% são formados pelo isótopo oxigênio-16, porém há traços de oxigênio-17 e
oxigênio-18
(ABELE, 2002; LANE, 2011; LYONS, 2007; LYONS; REINHARD;
PLANAVSKY, 2014).
Exceto por algumas espécies anaeróbicas e aerotolerantes, todos os
organismos necessitam de O2 para manter uma produção eficiente de energia,
utilizando-o como um aceptor final na cascata de transporte de elétrons, tanto na
mitocôndria de eucariontes, quanto na membrana celular de diversas bactérias. Essa
dependência, esconde sua real natureza. A de um gás tóxico, reativo e mutagênico
(HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2015; RIBEIRO et al., 2005).
Desde o início da colonização do planeta, todo o processo evolucionário partiu
da necessidade de adaptação a ele, tamanha sua importância e reatividade (ABELE,
2002; HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2015; LANE, 2016). Felizmente para os seres
vivos, bem no início, não havia O2. Há quatro bilhões de anos, ele existia apenas em
uma parte por milhão na atmosfera do planeta. Primeiro, porque não é um gás
produzido pela atividade vulcânica, principal geradora dos gases da nossa atmosfera
primitiva, e depois, porque mesmo se existisse em pequenas quantidades, seria
26
destruído pela radiação solar (DIETRICH; TICE; NEWMAN, 2006; HOLLAND, 2006;
KUMP; BARLEY, 2007; LANE, 2011; LYONS, 2007; RAMOS; LEITÃO, 1991).
Deve ser recordado que as radiações solares de maior energia, em particular
as do espectro do ultravioleta longínquo (com comprimento de onda entre 122 nm e
200 nm), não atingem atualmente a superfície da Terra porque são absorvidas pela
atmosfera, em particular pelo ozônio (O3) da estratosfera. Até aquele momento, estas
barreiras ainda não estavam formadas (RAMOS; LEITÃO, 1991).
O mecanismo inicial que conduziu à formação do oxigênio molecular foi
provavelmente a fotólise do vapor d’água e do dióxido de carbono (CO 2) na alta
atmosfera, ambos oriundos da incessante atividade vulcânica na era Eoarqueana
(compreendida entre três bilhões e 850 milhões de anos atrás, aproximadamente),
seguido pelo escape de átomos de hidrogênio para o espaço (BRINKMANN, 1969;
JEANS, 1916). A quantidade de O2 permaneceu baixa na atmosfera devido à captura
deste elemento por íons de ferro (Fe2+) dissolvidos nos oceanos primitivos, servindo
como um eficiente mecanismo de remoção deste gás (HART, 1978; KUMP; BARLEY,
2007; LYONS, 2007) e ajudando a evitar a química de Fenton.
Além disso, segundo a teoria abiogenética, proposta independentemente por
Oparin (1924) e Haldane (1929), a vida teria surgido em uma atmosfera rica em
hidrogênio (H2), metano (CH4), amônia (NH3) e vapor d’água. Unidos por reações
químicas e catalisados pela energia proveniente do sol e de descargas elétricas. A
partir daí, formaram-se compostos mais e mais complexos, culminando com o
aparecimento de aminoácidos, glicídios e de outros compostos orgânicos. O
surgimento da vida, inicialmente anaeróbica, unicelular e procariótica era apenas
questão de tempo (HALDANE, 1991; OPARIN, 1936).
Devido às características químicas do O2 como potente agente oxidante, sua
presença em grande quantidade, impediria a própria permanência de outros gases na
atmosfera, entre eles o metano e a amônia, portanto, impossibilitando o surgimento
da vida na Terra (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2015).
Outra teoria, não totalmente excludente, é a de que a vida teria surgido ou se
desenvolvido em fontes termais, longe assim da necessidade de energia luminosa e
do O2. Pesquisas apontam para a via de Wood-Ljungdahl ou via da acetil Coenzima
A como reação primordial para geração de energia, sendo o hidrogênio (H2) o doador
de elétrons, o dióxido de carbono (CO2) como aceptor e o substrato para a biossíntese.
Essa simples reação de assimilação do carbono, por ser uma reação exergônica por
27
natureza (ΔG = -131 kJ/mol), impulsionaria os prótons (H+) através da membrana,
causando uma diferença de potencial quimiosmótico, levando assim, ao aparecimento
da força motriz protônica necessária para fosforilação do ADP em ATP (LANE; ALLEN;
MARTIN, 2010; MARTIN et al., 2008; MARTIN; RUSSELL, 2007; MITCHELL, 1961,
1972, 1979; ORGEL, 1999).
Felizmente as fontes termais equiparam as primeiras células com todas as
ferramentas necessárias para uma maior produção de energia – o gradiente de
prótons, a condução eletrônica pelos grupos de ferro-enxofre (Fe-S), e membranas
carregadas eletricamente. Quando as primeiras células procarióticas emergiram,
estas eram as ferramentas à mão. Sem elas, a vida multicelular não existiria. Com
elas, o segundo ato pôde ser iniciado: a fotossíntese (LANE, 2011).
A evolução da fotossíntese abrange bilhões de anos e as interfaces entre o
surgimento da vida, a geologia e a atmosfera do nosso planeta. Embora, de certa
forma assustadora, essa interdependência complexa fornece um quadro fantástico
para se verificar as hipóteses de como a fotossíntese surgiu e se desenvolveu. Além
disso, podemos consultar as testemunhas vivas nos organismos atuais, os projetos
bem-sucedidos de inovações metabólicas presentes desde o início da vida, dentro de
seus genomas, incluindo como viver na luz e no ar (ALBERTS et al., 2008).
Com o aparecimento dos primeiros seres fotossintetizantes, por volta de 3,2 a
2,4 bilhões de anos atrás, na era Neoarqueana, primeiramente representados pelas
cianobactérias (classicamente chamadas de algas azuis), além da saturação das
reservas de ferro (Fe2+) e ao amadurecimento do ciclo do ozônio (O 3), o O2 começou
a se acumular, possibilitando à vida sair do mar e colonizar a terra (BROCKS et al.,
1999; BUICK, 2008; CHAWLA; LAVANIA, 2001; HOLLAND, 2006; LATIFI; RUIZ;
ZHANG, 2009; OPARIN, 1936).
As cianobactérias, produtoras de oxigênio, combinaram-se com um organismo
eucariótico primordial em um processo chamado endosimbiose para dar origem a
todos os eucariotas fotossintéticos atuais. Esses organismos oxigenados utilizam um
centro reativo de quinona (tipo-Q) ou um aglomerado de ferro-enxofre (tipo-Fe-S) para
gerar ATP e equivalentes da redução de elétrons a fim de direcionar a fixação do
carbono (HOHMANN-MARRIOTT; BLANKENSHIP, 2011; KOONIN; ARAVIND, 2002;
LANE, 2009).
Ainda assim, os níveis crescentes de O2 interpuseram alguns problemas. Como
os primeiros seres vivos apareceram e se desenvolveram em uma atmosfera
28
composta basicamente por N2 e CO2, eles eram anaeróbios. Com a elevação da
quantidade de O2 atmosférico, a maioria das espécies existentes pereceu, episódio
conhecido como o Evento da Grande Oxigenação ou Holocausto do Oxigênio. Apesar
de ainda existirem nos dias de hoje, estes remanescentes são espécimes que
buscaram adaptação permanecendo em ambientes onde o O 2 está ausente, já que
seu crescimento é limitado e muitas vezes impedido pelos níveis atuais de O2 (21%)
(CANFIELD; ROSING; BJERRUM, 2006).
Outros
organismos,
ao
contrário,
passaram
a
desenvolver
defesas
antioxidantes para se protegerem contra a toxicidade do O2. Tanto substituindo
enzimas menos eficientes contra o dano oxidativo ou desenvolvendo novas. Graças a
essas estratégias, permitiu-se o aparecimento de organismos que fossem capazes de
utilizá-lo para um processo mais eficiente de produção de energia, como um aceptor
final na cadeia de transporte de elétrons. Outro efeito, foi a utilização de moléculas
contendo O2 (óxido nítrico - NO e H2O2) como sinalizadoras, ganhando importância
com a evolução das células, sua compartimentalização e a reunião em aglomerados
multicelulares (DAHL et al., 2010; JELTSCH, 2013; LATIFI; RUIZ; ZHANG, 2009;
RAYMOND; SEGRÈ, 2006).
Embora algumas dessas defesas sejam enzimáticas (catalases, superóxido
dismutase [SOD] e peroxidases) e outras são não-enzimáticas (glutationa, vitamina A,
C, E, carotenóides, etc.), é intrigante que os íons Mn ligados à SOD2 e aos análogos
proteicos da SOD em bactérias, mitocôndrias e cloroplastos os defendam contra os
efeitos nocivos do O2 atmosférico, ao passo que os íons Mn ligados aos reagentes de
Hill presentes nos mesmos cloroplastos produzam todo o O2 atmosférico da Terra
(ARCHIBALD, 2003).
Quando o equilíbrio entre os níveis de oxidantes e a produção de antioxidantes
se perde, os organismos têm de enfrentar um ambiente com desbalanço oxidativo que
gera uma variedade de danos que vão desde, por exemplo, morte celular em bactérias
a patologias graves em organismos superiores (FORMAN, 2016).
Outro grande paradoxo da biologia dos seres vivos aeróbicos, o oxigênio, como
substância essencial à manutenção da vida desses seres, também é o responsável
direto pelo seu desgaste natural, com consequente envelhecimento e morte
(FORMAN, 2016). Sem ele fatalmente morremos, mas sua presença induz a uma série
de reações químicas que apesar de estritamente necessárias à produção adequada
de energia para suprir os inúmeros processos metabólicos essenciais à vida aeróbica,
29
são reações de combustão, de queima, de oxidação, que obrigatoriamente produz
metabólitos deletérios, os quais ocasionam, em última análise, a morte celular se não
combatidos
(FRIDOVICH,
1978).
Viver
aerobiamente
significa
balancear
constantemente esses dois processos: produzir energia com o auxílio do oxigênio,
mas combater ao mesmo tempo os restos desta produção.
2.4. Fatores que influenciam a toxicidade do oxigênio
As respostas do organismo às pressões elevadas de oxigênio são afetadas por
uma variedade de fatores, por exemplo, a pressão parcial do oxigênio (ppO2), níveis
de CO2, concentração de íons hidrogênio (H+), temperatura, pressão atmosférica total
e características individuais, tais como, genética e alimentação (GOTTLIEB, 1981).
No entanto, a característica principal da intoxicação pelo O2 é sua relação direta
com dois fatores, que somados configuram a dose de O2 empregada. São eles: 1) a
concentração de O2 nos tecidos, que possui uma relação direta com sua pressão
parcial (ppO2) e 2) o tempo de exposição a essa concentração (DE MARTINO et al.,
1996). Esses dois fatores possuem praticamente uma relação hiperbólica retangular
típica entre si, na qual quanto maior a pressão de O 2 empregada, menor o tempo
necessário para que apareçam os sinais de intoxicação (BEAN, 1965; CLARK, 2008;
JAIN, 2009).
Outras manifestações de intoxicação demonstraram o mesmo tipo de relação
hiperbólica, dentre elas o aparecimento de hemólise (MASLOVA; KLIMOVA, 2014;
MENGEL et al., 1964, 1965), de convulsões (BEHNKE et al., 1934; DONALD, 1947a,
1947b), lesão pulmonar histológica (CLARK; LAMBERTSEN, 1971a; VAN OOIJ et al.,
2013), diminuição da capacidade vital (CLAIREAUX, 1975; THOM, 1989; VAN OOIJ
et al., 2013), como também a taxa de mortalidade elevada (GERSCHMAN; GILBERT;
CACCAMISE, 1958; JAMIESON; CHANCE, 1966).
Como previamente discutido, o oxigênio é uma droga e deve ser vista
farmacologicamente (GOTTLIEB, 1971). Portanto, não só os fatores de pressão do
oxigênio e os fatores que influenciam estes últimos, mas também a entrada e a
distribuição in vitro e in vivo, devem ser analisadas.
Além desses, outros fatores também influenciam a toxicidade do O 2, sobretudo
a suscetibilidade individual, tecidual ou celular (BEAN, 1965; CLARK; LAMBERTSEN,
1971a; CLARK; WHELAN, 1999). O aporte de oxigênio para os tecidos depende de
vários fatores, que incluem o débito cardíaco, o teor de hemoglobina no sangue e a
30
capacidade dos pulmões em oxigená-lo. Nem todo o O2 transportado pelo sangue é
liberado nos tecidos. A quantidade de O2 que é, de fato, extraída do sangue pelos
tecidos corresponde à diferença entre o teor de O2 do sangue arterial e o teor de O2
do sangue venoso multiplicada pelo débito cardíaco. Em condições normais, a
hemoglobina deixa os pulmões com saturação de O2 de 94%, mas apenas cerca de
30% dessa saturação são na verdade utilizados pelos tecidos. A hipotermia, o
relaxamento dos músculos esqueléticos e o aumento do débito cardíaco reduzem o
consumo de O2. De modo inverso, a diminuição do débito cardíaco, a anemia, a
hipertermia e os exercícios físicos aumentam o consumo de O2 (KOEPPEN;
STANTON, 2010).
No entanto, além da oferta efetiva de O2 aos tecidos, a intoxicação pelo
oxigênio também depende da quantidade de O2 consumida por esse tecido, ou seja,
da sua taxa metabólica, que ainda influenciará a densidade capilar funcional, pois
existe uma relação estreita entre a taxa metabólica desenvolvida pelo tecido e o fluxo
sanguíneo que atinge o tecido neste instante, e, portanto, variável (GUYTON;
COLEMAN; GRANGER, 1972). Por conseguinte, fatores que alterem o metabolismo
também terão influência direta sobre a intoxicação pelo oxigênio. Dessa forma, a
presença de substâncias estimulantes ou depressoras do metabolismo, de agentes
anestésicos ou do CO2, o estado metabólico do indivíduo e de cada tecido, bem como
a ação neuroendócrina, constituem fatores importantes, muitas vezes determinantes
da presença ou não de intoxicação clínica do O2 (BEAN, 1965).
2.5. Suscetibilidade à intoxicação pelo Oxigênio
Comprovadamente,
existe
uma
diferença
interespecífica
frente
à
suscetibilidade na intoxicação pelo oxigênio, que pode ser facilmente demonstrada
pela grande variação nos tempos de sobrevida das espécies à exposição ao O2 a
1 ata (100 kPa). Cães, por exemplo, têm um tempo de sobrevida variando entre 39
e 88 horas, ao passo que, para os sapos, esse tempo sobe para acima de 1600 horas.
Em ratos estaria em torno de 72 horas, mas variando entre 57 e 81 horas para ratos
adultos com peso médio de 250 g (CLARK; LAMBERTSEN, 1971a).
Da mesma forma, a suscetibilidade variada ocorre ao nível dos indivíduos da
mesma espécie, como por exemplo, entre camundongos expostos a 100% de O2 a
3 ata, onde foi demonstrado um tempo de sobrevida variando entre 9 a 21 horas, de
acordo com a linhagem (HILL; OSTERHOUT; O’FALLON, 1968).
31
Evidentemente, todas as células de um organismo respirando tensões elevadas
de oxigênio estarão expostas, em maior ou menor grau, ao excesso de O 2 e, portanto,
passíveis de serem intoxicadas. Considerando a imposição dos fatores acima
mencionados, pode-se
esperar que os diferentes órgãos
viessem a
ter
suscetibilidades diferentes.
Dentre todos os órgãos e sistemas, o SNC é o que apresenta maior
suscetibilidade ao O2, o que o torna sensível precocemente às tensões elevadas de
oxigênio (DICKENS, 1946a; MACDOUGALL; COUPLAND, 1967; STADIE; RIGGS;
HAUGGAARD, 1945a, 1945b). Também, dentro de um mesmo órgão, verificam-se
suscetibilidades diferentes entre os diversos tipos celulares. É o caso do pulmão, em
que, curiosamente, são as células endoteliais (e não as epiteliais) as mais sensíveis
à intoxicação ao O2, sendo lesadas funcional e estruturalmente antes das demais
(CLARK;
LAMBERTSEN,
1971a;
HARABIN;
HOMER;
BRADLEY,
1984).
Similarmente, ambos os pneumócitos reagem de maneira diferente à exposição
intensa ao O2, pois enquanto o tipo I demonstra maior suscetibilidade à intoxicação,
chegando à morte celular, o tipo II responde com hipertrofia e hiperplasia, como uma
resposta do epitélio na tentativa de recompor o revestimento alveolar lesado (CLARK;
LAMBERTSEN, 1971a). Tais diferenças na suscetibilidade entre os diversos tipos
celulares, parecem estar relacionadas com a maquinaria enzimática específica de
cada célula, aos prováveis sítios de formação de ERO, bem como à capacidade de
defesa antioxidante inerente a cada uma delas. Ainda, entre células de um mesmo
tecido, aquelas que estiverem próximas da extremidade arterial do capilar receberão
uma dose mais alta de O2 em relação àquelas situadas na extremidade venosa e, com
certeza, estarão mais sujeitas à intoxicação (CLARK, 2008).
Entretanto, já foram relatados efeitos tóxicos do O 2 também nas hemácias,
causando hemólise (MASLOVA; KLIMOVA, 2014; MENGEL et al., 1964, 1965), no
aparelho visual levando à diminuição do campo visual, ao descolamento e destruição
de células da retina e cegueira (CLARK, 2008; CLARK; WHELAN, 1999; NICHOLS;
LAMBERTSEN, 1969); no fígado (SCHAFFNER; FELIG, 1965; STADIE; RIGGS;
HAUGGAARD, 1945b), nos rins (HESS; MENZEL, 1971), todos apresentando lesão
celular; nos testículos, com diminuição da espermatogênese (CARVALHO et al., 2002)
e mais recente, ao nível dos corpos carotídeos, com perda da resposta ventilatória à
hipóxia (ARIELI; KEREM; MELAMED, 1988; LAHIRI et al., 1987), além de aumento
do volume da hipófise (BEAN, 1945), da tireóide (EDSTRÖM; RÖCKERT, 1962) e das
32
suprarrenais (BEAN, 1945; EDSTRÖM; RÖCKERT, 1962). Apesar de ter uma elevada
taxa metabólica, mas ao mesmo tempo possuir mecanismos locais poderosos de
autorregulação do fluxo sanguíneo, a intoxicação clínica do SNC só se manifesta
acima de um limiar de tensão arterial de 2 ata (200 kPa) de O2. Até atingir esse limite,
os pulmões são os órgãos principalmente afetados (CLARK; LAMBERTSEN, 1971a).
Em ambos os casos, a continuidade da exposição ao O 2, na presença de
sintomatologia clínica de intoxicação, levará o indivíduo indubitavelmente à morte
(CLARK; LAMBERTSEN, 1971a).
Outro fator importante na suscetibilidade aos efeitos tóxicos é a idade, visto que
indivíduos jovens são menos suscetíveis à intoxicação cerebral (BEAN, 1965). Além
disso, camundongos expostos a 2, 4 e 6 ata (202, 405 e 607 kPa) de O2 demostraram
uma consistente redução do tempo de sobrevida entre 20 e 90 dias de idade (BERRY;
FITCH; SCHATTE, 1977), enquanto ratos imaturos não apresentaram convulsões até
18 dias em O2 a alta pressão, provavelmente devido à imaturidade das glândulas
suprarrenais (BEAN, 1965). Em outros estudos, os pulmões de ratos imaturos também
se mostraram mais resistentes, embora não totalmente imunes à intoxicação pelo O2;
em contrapartida, esses animais apresentaram fibroplasia retrolental, assim como
camundongos (PATZ; EASTHAM, 1957; SPERLING, 1970). Nessa enfermidade
vascular, o estímulo hipóxico para proliferação normal dos vasos sanguíneos da retina
é abolido na vigência da oxigenoterapia (CAMPBELL, 1951; FORTES FILHO et al.,
2011; PATZ, 1957). No retorno à pressão atmosférica, no entanto, a queda relativa da
pressão de O2 funciona como potente estímulo hipóxico, desencadeando extensa
neovascularização ao nível da retina que pode levar a cegueira permanente (DE
MARTINO et al., 1996).
Com o advento da maturidade há uma inversão dessa relação e a retina tornase mais resistente à intoxicação pelo oxigênio, ao passo que os pulmões se tornam
mais vulneráveis (BEAN, 1965). Entretanto, a retina de animais adultos não é
totalmente isenta de intoxicação e foi observado que uma permanente perda parcial
da visão acompanha quadros de paralisia motora permanente em ratos e frangos
expostos repetidamente ao O2 a 4,5 ata (455,9 kPa) (BEAN, 1945). Exposições a altas
pressões de O2 também provocaram distúrbios visuais severos, embora não
permanentes, no homem (CLARK, 1993).
Em relação a diferença entre os sexos, fêmeas demonstram ser mais tolerantes
à exposição ao oxigênio. Foi observado maior tempo de sobrevida de fêmeas de ratos
33
expostas a 5 ata (506,6 kPa) e de fêmeas de camundongos expostas a 2, 4 e 6 ata
(202, 405 e 607 kPa), respectivamente (BARRY; CRAPO, 1985; WOOD; WATSON;
STACEY, 1966). Nesse último estudo, tanto as fêmeas em idade pré-puberal quanto
sexualmente maduras foram mais resistentes do que seus correlatos machos,
indicando que a presença ou ausência de esteróides sexuais não seria a causa da
diferença de suscetibilidade entre os sexos. Entretanto, em trabalho mais recente,
demonstrou-se que não só as ratas expostas a 5 ata (506 kPa) de O2 apresentaram
um tempo maior de latência ao aparecimento de convulsões, como também a
administração de estradiol subcutâneo aos machos adrenalectomizados protegeu-os
de novas convulsões (TROY; FORD, 1972).
Por outro lado, indivíduos da mesma espécie, sexo e idade, expostos
conjuntamente à mesma concentração de O2, reagem de forma diferente aos efeitos
tóxicos do O2, devido à susceptibilidade individual. Por exemplo, o limiar de 3,0 ata
(303,9 kPa) do O2 para intoxicação do SNC foi baseado em estudos realizados com
adultos jovens, mergulhadores da Marinha dos EUA, expostos por 2 a 3 horas a estas
condições (BEAN, 1945). Entretanto, para outros autores, o limiar de 2,8 ata (283,7
kPa) seria mais seguro, pois apesar de 80% dos casos expostos à OHB terem
demonstrado sinais clínicos de intoxicação do SNC apenas após 2 horas a 3,4 ata
(344,5 kPa) e outros, a 2,8 ata (283,7 kPa) (BEAN, 1945; CLARK, 1993; CLARK;
LAMBERTSEN, 1971a).
Por isso, um limiar seguro de exposição ao O2 é difícil de ser estabelecido,
mesmo entre indivíduos treinados, nos quais fatores sabidamente relevantes como
descanso físico e mental prévio à exposição ou seu estado emocional, nem sempre
são controláveis (BEAN, 1965).
A influência destes fatores está provavelmente relacionada ao fato de as
alterações do metabolismo e das condições do meio também interferirem com a
intoxicação do O2. Foi verificado que a hipotermia diminui e a hipertermia aumenta a
toxidez, enquanto o teor de umidade do ambiente também interfere, pois tanto
umidades relativas baixas (menores que 20%) ou extremamente elevadas (acima de
90%) aumentam a toxicidade do O2, quando estudado o tempo de sobrevida
(HULPIEU; COLE, 1944). No entanto, em relação a este quesito, outros autores
discordam, pois não se demonstrou diferença entre o tempo de latência dos ratos em
34
condições úmidas e secas em trabalhos mais recentes (ARIELI; MOSKOVITZ, 2001;
LIN; JAMIESON, 1993).
Além disso, como citado previamente, os níveis hormonais são potentes
moduladores da intoxicação, pois a administração de extratos tireoidianos ou tiroxina
isolada resultou no aumento importante da toxicidade do O2 em animais
experimentais, ao passo que a tireoidectomia teve um efeito preventivo (BEAN, 1965).
A administração de corticosteroides também promoveu agravamento das lesões
tóxicas do O2, tanto em pulmões, em exposições a O2 puro na pressão atmosférica
(BEAN; SMITH, 1952), quanto no SNC e dos pulmões sob oxigenoterapia hiperbárica
(OHB) (BEAN, 1961, 1965; BEAN; JOHNSON, 1955). Contrariamente, a
hipofisectomia (BEAN; SMITH, 1952) e a adrenalectomia (BEAN, 1965) conferiram
proteção à ação tóxica do O2 em altas tensões, assim como o uso de agentes
bloqueadores simpáticos periféricos (BEAN, 1965).
Por conta de tudo isso, pode-se afirmar que fatores neuroendócrinos estão
intimamente relacionados à intoxicação pelo oxigênio e podem ser a causa da grande
variação individual encontrada na suscetibilidade e imprevisibilidade da reação ao
excesso de O2 respirado, ao se relacionarem com o estado emocional e
temperamental dos indivíduos a serem expostos. Com isso, parece claro que qualquer
fator de estresse metabólico, físico ou emocional altera a suscetibilidade individual e
predispõe ao desenvolvimento mais precoce de intoxicação pelo oxigênio.
2.6. Intoxicação pulmonar
O oxigênio é potencialmente tóxico para todas as células vivas (HUBER;
DRATH, 1981), portanto, é um processo progressivo que se espera que ocorra em
todas as células do organismo expostas às tensões elevadas de oxigênio (CLARK;
LAMBERTSEN, 1971a). Nesse processo, deve-se esperar pela ocorrência de efeitos
adversos, cuja ordem de aparecimento nos diferentes tipos celulares dependerá das
diferentes suscetibilidades, bem como das diferentes doses empregadas do gás, seja
pela duração da exposição, seja pelas diferentes pressões de oxigênio, que ainda
podem ser modificadas pela influência de vários fatores atuando sobre a taxa de
desenvolvimento da intoxicação pelo O2 (BEAN, 1945). Portanto, a ausência de
alterações morfológicas demonstráveis num determinado grupo específico de células
não deve significar uma resistência inata das mesmas, pois, com o decorrer do
35
processo, inevitavelmente haverá evolução para a destruição celular (CLARK;
LAMBERTSEN, 1971a).
Na pressão e tempo de exposição empregados em oxigenoterapia normo ou
hiperbárica, os órgãos mais susceptíveis são os pulmões e o SNC (CLARK;
LAMBERTSEN, 1971a). Nas exposições superiores a 0,5 ata (50,6 kPa) já é possível
o
aparecimento
de
lesão
pulmonar
hiperóxica
(CLARK,
1988;
CLARK;
LAMBERTSEN, 1971a, 1971b). No caso do SNC, as primeiras manifestações
neurológicas ocorrem apenas a pressões parciais de O2 acima de 2,0 ata (202,6 kPa),
cuja vulnerabilidade individual das células neuronais, em conjunto com o elevado
suprimento sanguíneo tecidual e altas taxas metabólicas, o tornariam também um alvo
importante da toxicidade ao oxigênio (DONALD, 1947b, 1947a). Estudos com
voluntários a 2 ata (202,6 kPa) permitiram avaliar a evolução clínica e as alterações
funcionais da intoxicação pulmonar. Os primeiros sintomas apareceram entre 2 e 6
horas e consistiram de irritação traqueal e dor retroesternal. Uma a duas horas após
sobrevém a tosse. Sintomas mais graves como dispneia e tosse paroxística aparecem
somente após 8 a 10 horas de exposição contínua, associados a hipertermia e roncos
difusos durante ausculta (CLARK; LAMBERTSEN, 1971a).
Mesmo assim, após uma exposição aguda, mas suficiente para causar edema
intersticial e interalveolar com diminuição da capacidade vital ou principalmente, em
exposições com doses mais elevadas, com diminuição da capacidade de difusão
alveolar-arterial, algo indicativo de uma maior gravidade, o retorno ao ar atmosférico
muitas vezes se dá de maneira difícil. Frequentemente se observa a presença de
dispneia, em virtude da diminuição provável da ventilação e de um gradiente de
difusão insuficiente, durante a respiração novamente com ar ambiente (BEAN;
JOHNSON, 1952). Mas também pela possibilidade da ocorrência de alterações
enzimáticas intracelulares irreversíveis provocadas pelo excesso de oxigênio e pela
produção de ERO (CRAPO; TIERNEY, 1974).
2.7. Toxicidade pelo oxigênio e seus efeitos na mecânica respiratória
A respiração é um processo cíclico, envolvendo trabalho mecânico dos
músculos respiratórios para a movimentação do sistema respiratório (SR). Dois
componentes constituem o SR: o pulmão e a parede torácica. Como parede torácica
subentendem-se todas as estruturas em movimento durante o ciclo respiratório, à
exceção dos pulmões. A pressão motriz, gerada pela contração muscular durante a
36
inspiração, precisa vencer forças de oposição, tais como: a) forças elásticas dos
tecidos pulmonares e parede torácica (BATES, 2009); b) forças resistivas resultantes
do fluxo de gás pelas vias aéreas e movimentação das moléculas constituintes do
tecido pulmonar e dos tecidos da parede torácica (D’ANGELO et al., 1994); c) forças
viscoelásticas dos tecidos pulmonares e da parede torácica (FUNG, 1981); d) forças
plastoelásticas responsáveis pela histerese (HILDEBRANDT, 1970); e) forças
inerciais (dependem da massa dos tecidos e dos gases) (MEAD, 1961); f) forças
gravitacionais (incluídas nas forças elásticas) (HOLLAND et al., 1968); e g) forças de
distorção da parede torácica. Contudo, durante a respiração basal, considera-se as
forças inerciais e de distorção da parede como desprezíveis (RODARTE; REHDER,
1986).
A elasticidade é uma propriedade da matéria que permite ao corpo retornar à
sua forma original após ter sido deformado por uma força sobre ele aplicada. Um corpo
perfeitamente elástico como uma mola, obedecerá à lei de Hooke, ou seja, a variação
de comprimento é diretamente proporcional à força aplicada, até que seu limite
elástico seja atingido, de modo que, quanto maior a pressão motriz, maior o volume
de gás inspirado. A inclinação da curva volume-pressão ou a relação entre a variação
de volume gasoso mobilizado (∆V) e a pressão motriz necessária para manter o
sistema respiratório insuflado é conhecida como complacência do sistema respiratório
(Crs). Logo, Crs = ∆V/Pel,rs, onde Pel,rs corresponde à pressão elástica do sistema
respiratório (BATES; MILIC-EMILI, 1991; ZIN, 1990; ZIN; ROCCO; FAFFE, 2012).
Cabe ressaltar que, ao invés de complacência, utiliza-se mais amiúde a variável
elastância. Esta corresponde ao inverso da complacência (Ers = 1/Crs), ou seja,
representa a relação entre a variação de pressão e o volume mobilizado resultante. O
cálculo da elastância do sistema respiratório apresenta vantagens, já que as
elastâncias do pulmão (EL) e da parede torácica (Ew) são adicionadas diretamente:
Ers = EL + Ew, enquanto se somam os inversos das complacências: 1/Crs = 1/CL +
1/Cw (ZIN, 1990).
Dois fatores respondem pelo comportamento elástico do pulmão. Um deles é
representado pelos componentes elásticos do tecido pulmonar (fibras elásticas e
colágenas). Além das propriedades elásticas dos tecidos pulmonares, os pulmões
ainda apresentam um importante fator a contribuir para as suas características
elásticas: a tensão superficial exercida pelas moléculas recobrindo a zona de troca
gasosa. Existe tensão superficial em uma interface ar-líquido porque as moléculas do
37
líquido são atraídas com maior intensidade para o interior do próprio líquido do que
para a fase gasosa acima deste. A tensão superficial tem a propriedade importante de
gerar pressão no interior de uma bolha. A relação entre a tensão superficial na parede
e a pressão desenvolvida dentro da bolha de sabão é dada pela Lei de Laplace. Essa
lei afirma que, para cada superfície da bolha, a pressão (P) é proporcional ao dobro
da tensão (T) desenvolvida pelo raio (r), ou, para ambas as superfícies, P = 4T/r
(BATES, 2009; FUNG, 1981; HARWOOD; RICHARDS, 1985).
Considerando-se dois alvéolos de diferentes tamanhos conectados através de
uma via aérea comum, e com tensão superficial semelhante, pode-se depreender,
com base na Lei de Laplace, que a pressão no alvéolo menor seria maior do que no
alvéolo maior. Desta forma, os alvéolos menores esvaziar-se-iam nos maiores,
resultando em alvéolos colapsados e ductos alveolares hiperinsuflados (BATES,
2009). Contudo, isso não ocorre nos pulmões normais, pois a tensão superficial do
surfactante, líquido de composição protéica e, principalmente, fosfolipídica secretado
pelos pneumócitos tipo II, é consideravelmente menor do que a da solução salina que
recobre as mucosas pulmonares. Dessa forma, há um equilíbrio entre os alvéolos
maiores e menores, com mesma pressão mantida em seus interiores (BATES, 2009;
HARWOOD; RICHARDS, 1985).
Durante a movimentação do SR, quando ocorre fluxo de gás, elemento
adicional ao elástico precisa ser vencido pela pressão motriz: a resistência. A
resistência do sistema respiratório (Rrs) pode ser calculada dividindo-se Pres,rs por
fluxo aéreo. Pres,rs representa a pressão resistiva do sistema respiratório, ou seja, a
pressão necessária para vencer seus componentes resistivos. Semelhantemente à
complacência, e pelas mesmas razões, a resistência do sistema respiratório se
subdivide em seus componentes pulmonar e de parede (BATES, 2009; WEST, 2012).
A resistência pulmonar pode ser subdividida em dois subcomponentes: a
resistência das vias aéreas (Raw), que depende do fluxo de ar no interior dos pulmões,
e a resistência tecidual (Rtis), determinada pelas perdas energéticas geradas pela
viscosidade (atrito) pertinente à movimentação do pulmão. A resistência das vias
aéreas pode ser influenciada pela geometria da árvore traqueobrônquica, pelo volume
pulmonar, pela complacência das vias aéreas, pela densidade e viscosidade do gás
inspirado e pela musculatura lisa dos brônquios. A resistência tecidual depende da
velocidade do deslocamento, o que é importante tanto durante a inspiração como na
expiração. A resistência da parede torácica também sofre influência das perdas
38
energéticas geradas pela viscosidade pertinente à movimentação das moléculas que
constituem os tecidos da parede torácica (BATES, 2009).
Além dos componentes elásticos e resistivos, o sistema respiratório apresenta,
também, propriedades viscoelásticas, tanto no tecido pulmonar quanto na parede
torácica. A viscoelasticidade foi descrita a partir do comportamento de fios de seda.
Esse tipo de material obedece à lei da proporcionalidade entre a força aplicada e o
alongamento resultante (Lei de Hooke), porém apenas por um curto período de tempo
após a aplicação da força. Quando se mantém a carga por um tempo prolongado, o
alongamento passa a aumentar continuamente. Este fenômeno está presente em
vários tecidos animais (FURMANSKI et al., 2012). Substâncias viscoelásticas, quando
mantidas sob deformação constante, apresentam queda da tensão, chamada de
relaxamento de tensão (stress relaxation), ou simplesmente, relaxamento, quando o
corpo é estirado. Por outro lado, sob tensão constante, o corpo tende a se deformar
continuamente com o decorrer do tempo, fenômeno chamado creep (FUNG, 1981).
Ressalte-se que esta deformação não é irreversível, mas sim reprodutível, podendo
ser repetida, desde que seja precedida por um período de tempo onde o material
permaneça em condições de repouso, a fim de apagar a memória do evento anterior.
A viscoelasticidade permite o intercâmbio de energia (pressão) entre o componente
elástico e o resistivo. Por exemplo, durante uma pausa inspiratória, a energia potencial
(pressão) acumulada no componente elástico pode ser dissipada sob a forma de calor
pelo componente resistivo (BATES, 2009).
A mecânica do SR, na visão clássica, é incorporada no modelo linear de
compartimento único mostrado na figura 2, consistindo de um conduto resistivo ao
fluxo (com resistência Raw) servindo a único compartimento elástico (com elastância,
E).
Figura 2. Modelo de compartimento único de mecânica do sistema respiratório, com resistência (R t) e
elastância (E). Este modelo é governado pela Equação 2.
39
A equação do movimento que descreve este modelo é a seguinte:
𝑃𝑡 = 𝐸𝑉𝑡 + 𝑅𝑉𝑡̇ + 𝑃0
(2)
onde Pt é a pressão na entrada do modelo, 𝑉̇ t é o fluxo de gás no modelo, Vt é o
volume de gás no compartimento elástico, P0 é a pressão aplicada em repouso (por
exemplo, pressão expiratória final positiva) e t é o tempo. A equação 2 normalmente
fornece uma descrição muito precisa do sistema respiratório, se ele for perturbado por
um 𝑉̇ senoidalmente oscilante (BARNAS et al., 1993). Os parâmetros R e E são
prontamente determinados pelo ajuste da equação 2 para os registros de Pt, 𝑉̇ t e Vt.
No entanto, os valores de R e E obtidos desta forma variam acentuadamente
com a frequência com que o sistema respiratório é oscilado. Essa dependência de
frequência de R e E pode ser particularmente acentuada na faixa de frequências
respiratórias normais e é causada pela viscoelasticidade dos tecidos respiratórios,
juntamente com quaisquer heterogeneidades regionais de função mecânica que
possam estar presentes em todo o pulmão (SIMILOWSKI; BATES, 1991).
Consequentemente, a simples determinação de R e E em uma única frequência, não
constitui uma caracterização completa da mecânica respiratória. Consideravelmente,
mais informações são obtidas quando se mede R e E em um intervalo de frequências.
Tal caracterização é incorporada na impedância de entrada respiratória (Zin) (PESLIN;
FREDBERG, 2011). A maneira usual de determinar Zin consiste em perturbar o
sistema respiratório com uma onda de 𝑉̇ t na forma de uma banda larga que contém
muitas frequências diferentes simultaneamente. A Zin é então determinada em cada
uma das frequências envolvidas, usando a transformada de Fourier, para converter
os sinais P e 𝑉̇ no domínio do tempo em suas representações equivalentes no domínio
da frequência. A Zin é uma função complexa de frequência (𝑓), com uma parte real,
𝑅(𝑓), e um imaginário, 𝑋(𝑓), assim
𝑍𝑖𝑛 (𝑓) = 𝑅(𝑓) + 𝑖𝑋(𝑓)
(3)
onde 𝑖 é a raiz quadrada positiva de −1. 𝑅(𝑓) é geralmente denominada de
resistência, porque não é nada mais do que o valor de R que seria obtido se a equação
3 fosse ajustada aos dados obtidos oscilando senoidalmente o sistema respiratório
40
com f. 𝑋(𝑓) é denominado de reatância e é o equivalente ao valor de E que seria
obtido através da equação 2, dividido por −2f. 𝑋(𝑓) contém contribuições negativas
de estruturas elásticas no sistema respiratório e contribuições positivas das estruturas
compostas por massa (isto é, aquelas que têm inércia). Em um 𝑓 muito baixo, apenas
as estruturas elásticas contribuem significativamente e, assim, 𝑋(𝑓) é negativo. À
medida que o 𝑓 aumenta, as estruturas inerciais assumem importância crescente até
dominar e o 𝑋(𝑓) tornar-se positivo. O valor de 𝑓 no qual os componentes elásticos e
inertes são iguais e opostos (isto é, quando 𝑋(𝑓) é zero) é chamado de frequência de
ressonância. Mesmo o 𝑍𝑖𝑛 (𝑓) , no entanto, não apresenta uma caracterização
completa da mecânica respiratória, porque a teoria acima se aplica somente se o
sistema respiratório se comportar dinamicamente como um sistema linear. Na
realidade, isso nunca é o caso. E se a amplitude na qual o sistema respiratório é
perturbado se torna grande o suficiente, o comportamento mecânico não-linear pode
se tornar significativo. Por exemplo, se o 𝑉̇ ˙é grande, então turbulência pode ocorrer
nas vias aéreas e a queda de pressão resistiva se tornará mais dependente do
quadrado do 𝑉̇ do que o 𝑉̇ em si (RODARTE; REHDER, 2011). Da mesma forma, se
o V for grande, os tecidos do pulmão e da parede torácica podem ficar excessivamente
distendidos e a E dependerá positivamente do V (BERSTEN, 1998; WAGERS et al.,
2002). Além disso, a magnitude de 𝑍𝑖𝑛 (𝑓) é aumentada se uma parte do pulmão se
torna atelectásica e é reduzida se uma arfada for dada antes da medição (ALLEN et
al., 2002).
De posse desse conhecimento, já se sabe que os efeitos do O2 sobre a
mecânica pulmonar se tornam mais marcantes, concomitantemente com o aumento
da gravidade da intoxicação pelo gás. Quando estudos são realizados em animais
expostos continuamente a uma ppO2 tóxica, severa disfunção da mecânica pulmonar
deveria ser esperada, conforme a morte se aproximasse. Observações feitas nestes
estudos terminais não se relacionam quantitativamente com estudos no homem
durante fases mais precoces e reversíveis de intoxicação pulmonar pelo oxigênio.
Comparações diretas entre efeitos funcionais no homem e nos animais requerem,
portanto, comparações do mesmo grau de exposição tóxica (ARKOVITZ et al., 1997a;
CLARK; LAMBERTSEN, 1971a; PETÁK et al., 2001).
O amortecimento tecidual ou resistência tecidual (G) pode ser conceituada
como a perda de energia para aquecer o tecido pulmonar durante uma manobra de
41
oscilação forçada. Está intimamente relacionado à resistência do tecido e aumentará
com a contração do músculo liso das vias aéreas, nos casos de hiper-reatividade
brônquica (HARTNEY; ROBICHAUD, 2013).
Já a elastância tecidual (H) pode ser definida como o armazenamento de
energia no tecido pulmonar durante uma manobra de oscilação forçada. Reflete o
recuo elástico do pulmão (ou rigidez dos tecidos) que permite o seu retorno a uma
forma inicial após uma deformação (HARTNEY; ROBICHAUD, 2013). Os tecidos dos
pulmões e da parede torácica são constituídos por fibras elásticas, cartilagens, células
epiteliais e endoteliais, glândulas, nervos, vasos sanguíneos e linfáticos, os quais
possuem propriedades elásticas (WEST, 2012; ZIN; ROCCO; FAFFE, 2012).
Inicialmente, a medição direta da mecânica pulmonar em camundongos foi
realizada por um punhado de laboratórios, que desenvolveram equipamentos
personalizados, sensíveis o suficiente para detectar alterações no pulmão do
camundongo (BATES; IRVIN, 2003; TAKEDA et al., 1997). Mais recentemente,
sistemas comerciais tornaram-se disponíveis, permitindo a uma ampla gama de
pesquisadores medir mudanças na mecânica do sistema respiratório.
Em seguida, com o aparecimento das medições invasivas, usando oscilações
forçadas e modelos matemáticos avançados, surgem técnicas que permitem o
particionamento da resposta respiratória nas vias aéreas e da mecânica dos tecidos
pulmonares parenquimatosos. A caracterização adequada das propriedades
mecânicas dos pulmões em pequenos animais se tornou essencial desde o
surgimento de modelos murinos na ciência respiratória. Quando realizadas usando a
técnica de oscilação forçada (FOT), uma técnica também usada em seres humanos,
essas medidas fornecem uma abordagem poderosa, integrativa e translacional para
estudar mudanças fisiológicas significativas (ALBLOOSHI et al., 2017; MCGOVERN
et al., 2013; NAKANO et al., 2016; SHALABY et al., 2010; THAMRIN; SLY; HANTOS,
2005).
Neste contexto, alterações na mecânica pulmonar que acompanham a
sintomatologia consistem de diminuição da complacência pulmonar dinâmica, da
capacidade inspiratória, do volume de reserva inspiratório, da capacidade de difusão
ao monóxido de carbono e principalmente da capacidade vital forçada (CVF), que para
os autores, constitui-se no melhor índice de intoxicação pulmonar. Eles observaram,
ainda, uma correlação entre os sinais clínicos e a diminuição da capacidade vital,
obtendo uma sequência de curvas hiperbólicas que lhes permitiram estabelecer
42
índices de tolerância pulmonar ao oxigênio, avaliados pela diminuição da CVF em
função da pressão parcial e do tempo de exposição ao O2 (dose). Diminuições de até
15% da CVF são reversíveis e ocorrem entre seis e 11 horas de exposição (CLARK;
LAMBERTSEN, 1970; GILBERT, 1981).
Além disso, mudanças nas propriedades elásticas do pulmão são uma
manifestação precoce da intoxicação pelo O2 no homem. A complacência dinâmica
pulmonar foi diminuída em cerca de 15% nos indivíduos que respiraram a 2 atm
(202,6 kPa) por 6 a 11 h (FISHER et al., 1968) e pelo dobro disso, nos que respiraram
a 0,98 atm (99,2 kPa) por 30 a 48 h (CALDWELL et al., 1966). Também foi encontrada
complacência pulmonar diminuída em cães (PAUTLER et al., 1966; SMITH; LEHAN;
MONKS, 1963), coelhos (ROSENGREN, 1967) e ratos (BECKMAN; WEISS, 1969)
após exposição prolongada de 0,79 a 2 atm (80-202,6 kPa) de O2. Em homens
normais, respirar oxigênio em repouso, particularmente com um pulmão a baixo
volume, pode ser acompanhado pela redução na complacência pulmonar que é
causado por atelectasia de absorção, ao invés de toxicidade química ao oxigênio e é
rapidamente reversível por uma inspiração profunda (BURGER; MACKLEM, 1968;
BURGER; MEAD, 1969).
Possíveis mecanismos para a redução da complacência pulmonar durante a
intoxicação por oxigênio incluem atelectasia, edema pulmonar e congestão,
estreitamento assimétrico das vias aéreas, diminuição do surfactante alveolar e
mudança das propriedades dos elementos teciduais elásticos do pulmão. Atelectasia,
edema pulmonar e congestão vascular foram responsabilizadas como prováveis
causas da diminuição da complacência na intoxicação pulmonar precoce pelo
oxigênio no homem (CLARK; LAMBERTSEN, 1971b; FISHER et al., 1968; PUY et al.,
1968). Nenhuma outra evidência a favor ou contra para que haja outros possíveis
mecanismos implicados foi encontrada. A redução na complacência pulmonar
observada em ratos após exposição de 0,98 a 1 atm (99,2-101 kPa) de O2 para 60 a
66 h foi considerada como sendo causada por uma diminuição no surfactante, com
uma pequena contribuição do aumento da rigidez tecidual (BECKMAN; WEISS, 1969).
O desenvolvimento de intoxicação pulmonar grave em cães respirando oxigênio a 1
ou 2 atm (202,6 kPa) foi acompanhado por marcada diminuição, tanto da
complacência pulmonar quanto da atividade surfactante (CLARK; LAMBERTSEN,
1971a). As alterações patológicas encontradas nos estágios mais tardios da
intoxicação pulmonar pelo oxigênio em animais (AIKAWA et al., 1956; BUTLER, 2004;
43
FUJIWARA; ADAMS; SETO, 1964; HEMINGWAY; WILLIAMS, 1952; JAMIESON;
VAN DEN BRENK, 1962; JOHNSON; BEAN, 1957; KARSNER, 1916; KISTLER;
CALDWELL; WEIBEL, 1967; LORRAIN SMITH, 1899; VAN DEN BRENK; JAMIESON,
1962a) e no homem (FUSON et al., 1965; KNOWLES; BLENNERHASSETT, 1967;
NASH;
BLENNERHASSETT;
PONTOPPIDAN,
1967;
NORTHWAY;
ROSAN;
PORTER, 1967) sugerem que muitas ou todas as mudanças no pulmão possam
contribuir para diminuir a complacência.
Precoce, mas proeminente intoxicação pulmonar pelo oxigênio no homem
exposto ao oxigênio a 2 atm (202,6 kPa) não está associado a aumentos na
resistência nas vias aéreas ou resistência pulmonar total (FISHER et al., 1968). Essas
observações são consistentes com a ausência de alterações significativas na taxa de
fluxo expiratório nos mesmos indivíduos (CLARK; LAMBERTSEN, 1971b) e em
homens expostos a 0,98 atm (99,2 kPa) de O2 (CALDWELL et al., 1966). No entanto,
é provável que a exposição contínua a uma ppO2 tóxica, eventualmente, produza uma
obstrução importante das vias aéreas secundária à formação de edema ou a outros
mecanismos.
2.8. Relação entre a intoxicação pulmonar e o SNC
Em teoria, quando se respira O2 puro a pressões acima 2 ata (202,6 kPa), há
risco de intoxicação do SNC (DE MARTINO et al., 1996; DONALD, 1947b, 1947a),
embora esse limite possa sofrer alterações de um indivíduo para o outro, como visto
previamente. De qualquer maneira, manifestações de intoxicação do SNC com
pressões de O2 abaixo de 2,8 ata (283,7 kPa) são consideradas raras (BITTERMAN,
2004).
Na ausência de um melhor índice de toxicidade, a ocorrência de cerca 10% de
sintomas neurológicos após exposições a pressões parciais de oxigênio de 2,8-4 ata
(283,7– 405,3 kPa) foi usado para descrever a tolerância do SNC ao oxigênio no
homem (CLARK, 1993; DONALD, 1947a, 1947b). Nenhum efeito neurológico
proeminente foi observado em homens normais respirando O2 a 2 ata (202,6 kPa) por
até 12hs (CLARK; LAMBERTSEN, 1971a). Apesar da ausência de convulsões a 2 ata
quando submetidos a hiperóxia, quedas reversíveis na atividade elétrica retiniana,
como resposta a um flash de luz, foram observadas consistentemente, tendo até
valores superiores a queda de CVF, que também foi utilizada como parâmetro de
intoxicação (CLARK et al., 1991; CLARK, 1988).
44
Acima desse valor, além da ação direta do excesso de O2 sobre as células
nervosas, há a participação do CO2 acumulado a nível central, bem como dos
mecanismos de controle do fluxo sanguíneo cerebral. Com isso, tanto a ppO2 quanto
a ppCO2 encontrar-se-ão elevadas centralmente e agirão de maneira sinergética,
diferente da ação antagônica fisiológica, normalmente observada entre ambos.
Consequentemente, o efeito excitatório sobre o simpático prevalecerá. Passa-se,
então, de uma fase de inibição simpática para outra, de ativação e descarga simpática
generalizada, com efeitos desastrosos sobre o próprio SNC e sobre os pulmões,
agravando a intoxicação de ambos (BEAN, 1961).
O efeito tóxico do O2 sobre o SNC é bem conhecido. Em 1878, Paul Bert
descreveu a ocorrência de convulsões, tipo grande-mal, de aparecimento súbito, em
modelos experimentais de animais expostos ao oxigênio hiperbárico acima de 3,0 ata
(303,9 kPa) (BERT, 1878). Posteriormente, este efeito foi descrito também no homem
(DONALD, 1947b, 1947a). Semelhante às convulsões provocadas por eletrochoque
(MARSHALL; LAMBERTSEN, 1961), puderam ser inibidas totalmente por agentes
anestésicos, como clorofórmio (BERT, 1878), pentobarbital sódico, alfa-cloralose,
propileno-glicol e a associação destes dois últimos (BEAN; ZEE, 1966).
Além do efeito tóxico direto sobre o SNC, a inalação de O 2 a pressões acima
de 3 ata leva também à intoxicação pulmonar, caracterizada basicamente por edema
hemorrágico intersticial e alveolar, com o aparecimento de hemácias intactas no
líquido edematoso preenchendo os alvéolos (CLARK, 1993). No entanto, o
mecanismo causador não parece ser uma ação direta do oxigênio sobre o parênquima
pulmonar, como observado em tensões mais baixas de O 2 e insuficientes para
provocar intoxicação do SNC. Neste caso, o edema pulmonar seria decorrente de uma
hipertensão venosa e capilar pulmonar, consequente a uma hipertensão arterial
importante, por sua vez decorrente da forte estimulação simpática, muito embora a
ação direta do O2 sobre as células também deva contribuir, mas de forma pequena
(BEAN; ZEE, 1966; DEMCHENKO et al., 2011).
Sua origem reside, provavelmente, no aumento da ppCO2 central. Foi
comprovado que o aumento da ppCO2 central é forte estimulante das vias excitatórias
do centro vasomotor, levando à estimulação simpática generalizada e liberação
maciça de adrenalina, com consequente aumento importante da pressão arterial (PA)
(RASMUSSEN et al., 1978), situação que pode ocorrer em casos de queda acentuada
do fluxo sanguíneo cerebral e acúmulo do CO2 metabolicamente produzido
45
(GUYTON; COLEMAN; GRANGER, 1972; HALL, 2011). No caso da OHB, o aumento
da ppCO2 central se deve a uma ineficiência da capacidade de transporte de CO2 pelo
sangue venoso por causa do excesso de oxiemoglobina, o mesmo ocorrendo com sua
capacidade tampão (BEAN; LIGNELL; COULSON, 1971; SHAW; BEHNKE; MESSER,
1934).
Embora essa queda de transporte de CO2 de cerca de 2/3 possa ser
considerada pequena e insuficiente para ocasionar qualquer efeito tóxico ou alteração
de pH substancial (SHAW; BEHNKE; MESSER, 1934), sua combinação com tensões
elevadas de oxigênio provou-se muito tóxica. Enquanto apenas elevadas ppCO2 no
ar inspirado podem levar ao aparecimento de convulsões, acima de 200 mmHg e
queda da PA, acima de 100 mmHg (SHAW; BEHNKE; MESSER, 1934), estes sinais,
típicos da intoxicação isolada do O2 a fortes pressões parciais, foram relatados de
maneira mais precoce e intensa com misturas contendo CO2, produzindo valores de
PaCO2 bem menores, entre 50 e 60 mmHg, ou mesmo com valores subnormais, já a
partir de 19 mmHg em camundongos (MARSHALL; LAMBERTSEN, 1961) e ao redor
de 30 mmHg em cães (SHAW; BEHNKE; MESSER, 1934).
Corroborando esses resultados, foi observado que quanto maior a PaCO2,
menor o tempo de exposição necessário para que ocorra intoxicação pelo O 2, havendo
uma nítida potencialização do efeito tóxico de ambos (MARSHALL; LAMBERTSEN,
1961; SHAW; BEHNKE; MESSER, 1934). Esses dados confirmaram a relativa
ineficiência da capacidade tampão do sangue na vigência de OHB elevada, a qual,
apesar de cursar com um conteúdo venoso de CO2 diminuído, a ppCO2 central se
eleva e o pH cai (MARSHALL; LAMBERTSEN, 1961).
Na gênese da estimulação simpática generalizada observada nessas
situações, é bem provável a participação, direta ou não, do hipotálamo, pois em ratos,
a injeção de aconitina no hipotálamo provocou uma hipertensão arterial sustentada e
um aumento acentuado da pressão venosa pulmonar, na ausência de oxigênio
elevado, o mesmo ocorrendo com a injeção intravenosa de adrenalina nesses animais
(WOOD; SEAGER; FERRELL, 1964). Na mesma direção dessa hipótese, também foi
registrada uma pressão venosa pulmonar elevada na exposição à hiperóxia
hiperbárica (WOOD; PERKINS, 1970). Bean e Zee (1966) também observaram que
todos os ratos que exibiram lesão pulmonar pós-exposição à hiperóxia hiperbárica
elevada (6 ata ou 607,9 kPa) também tiveram convulsões, apesar de que nem todos
os que convulsionaram, desenvolveram lesões pulmonares, atribuindo tal fato à
46
severidade e duração das crises. Por outro lado, vários agentes anestésicos utilizados
atenuaram ou aboliram totalmente as manifestações convulsivas da intoxicação pelo
O2, bem como as alterações pulmonares observadas nos animais não tratados com
anestésicos e expostos à OHB. Os autores chegaram à conclusão que há uma forte
relação entre o edema pulmonar e as convulsões apontando para um componente
neurogênico importante, possivelmente decorrente de uma maciça descarga
simpática associada ao componente somático das convulsões (BEAN; ZEE, 1966).
O fato de animais submetidos a OHB acima de 3 ata, pré-tratados com
anfetamina ou L- Dopa, ou expostos a uma mistura de O2 elevado contendo CO2 não
excessivamente alto, apresentarem uma redução do tempo de aparecimento das
lesões, tanto pulmonares (BEAN, 1961; BEAN; LIGNELL; COULSON, 1971; WOOD;
PERKINS, 1970) quanto do SNC (MARSHALL; LAMBERTSEN, 1961; SHAW;
BEHNKE; MESSER, 1934) e no tempo de sobrevida, também sustenta essa ideia.
Assim como a presença de agentes anestésicos, reduzindo a excitabilidade do
SNC, ou o uso de agentes bloqueadores simpáticos, diminuindo a resposta simpática
e evitando uma elevação da PA, todos prevenindo ou postergando o aparecimento de
edema pulmonar, também dão suporte a esta hipótese. Os resultados obtidos com o
tampão tris (hidroximetil-aminometano) reforçam quanto ao papel do CO2 na gênese
das lesões pulmonares. Esta substância, sabidamente eficiente contra o aumento da
PaCO2 e da acidose tecidual in vivo e a consequente redução da estimulação
simpática decorrente da hipercapnia (NAHAS; LIGOU; MEHLMAN, 1960), demonstrou
que protege contra os efeitos tóxicos da hiperóxia hiperbárica, tanto cerebral,
atenuando ou inibindo o aparecimento e a gravidade das convulsões, quanto ao
desenvolvimento do edema pulmonar (BEAN, 1961).
Evidentemente, a inclusão do eixo hipófise-adrenal e hipófise-tireóide na
ativação hipotalâmica já seria esperado, pois já havia sido demonstrado que tanto a
hipofisectomia quanto a adrenalectomia atenuam as lesões pulmonares induzidas
pela hiperóxia, não só de origem neurogênica, sob pressões elevadas acima de 3 ata
(BEAN; JOHNSON, 1952), mas também nas lesões pulmonares submetidas à
hiperóxia hiperbárica acima de 90% da pressão atmosférica (BEAN; SMITH, 1952).
Enquanto que a administração de cortisona levou ao aparecimento de um maior
número de lesões em animais normais e diminuiu o efeito protetor da hipofisectomia
sobre a intoxicação pulmonar pelo O2 (BEAN; JOHNSON, 1952). Entretanto, a
ablação de quaisquer dos órgãos endócrinos não impediu a instalação de lesões
47
tóxicas pulmonares, embora em menor grau, nos casos em que a exposição ao O 2 se
prolongou suficientemente (BEAN; SMITH, 1952). Dessa forma, tanto a corticotrofina
quanto os corticoesteróides adrenais não são essenciais ao desenvolvimento da
toxicidade pulmonar pelo O2, embora tenham um efeito contributivo importante.
Similarmente, a tireoidectomia demonstrou efeito atenuante sobre a intoxicação pelo
O2 (BEAN, 1965).
Por fim, Demchenko e col. em estudo mais recente sugere que a lesão
pulmonar aguda pela hiperóxia hiperbárica é causada por um aumento abrupto e
substancial da pressão vascular pulmonar, produzindo barotrauma em capilares e
levando à transudação de líquido, proteína plasmática e células sanguíneas para os
espaços aéreos intersticiais e alveolares pulmonares. Seus achados mostraram que
um fator-chave no dano pulmonar é o fluxo simpático aumentado, mediado pelo SNC,
que deprime a função do ventrículo esquerdo (VE), levando ao desenvolvimento
súbito de edema pulmonar cardiogênico. Os autores propuseram, que a disfunção do
VE, a hipertensão pulmonar e a insuficiência capilar na OHB possam ser atribuídas
ao efeitos diretos da excitação simpática mediada pelo SNC e da liberação de
catecolaminas no miocárdio e na vasculatura cardiopulmonar (DEMCHENKO et al.,
2011), inclusive com relatos de caso em humanos (OBIAGWU et al., 2015).
2.9. O papel das espécies reativas do oxigênio
Os radicais livres são átomos ou moléculas com um ou mais elétrons
desemparelhados no seu orbital externo e que se formam quando há quebra
homolítica de uma ligação covalente. Devido à presença de tais elétrons não
pareados, os radicais são altamente reativos e podem interagir com importantes
componentes celulares, como a membrana celular ou o DNA, tanto nuclear quanto
mitocondrial, levando ao dano da função celular ou até mesmo a morte da mesma
(CIENCEWICKI; TRIVEDI; KLEEBERGER, 2008). Os radicais livres podem ser
encontrados em grande quantidade na natureza associados aos átomos de oxigênio,
nitrogênio, hidrogênio, carbono, enxofre, sendo classificados em função do átomo
portador dos elétrons desemparelhados (figura 3)(VASCONCELOS et al., 2007).
Existem, contudo, outras moléculas altamente reativas e potencialmente
tóxicas para o organismo, as quais, por não conterem elétron desemparelhado nos
seus orbitais, não se encaixam na definição de radical livre. Apesar de não serem
verdadeiros radicais, estas moléculas, que incluem o peróxido de hidrogênio (H2O2) e
48
o ácido hipocloroso (HClO), são potenciais geradoras de radicais livres, e, por esta
razão, as suas repercussões orgânicas, fisiológicas ou tóxicas, devem ser igualmente
consideradas. (HALLIWELL, 1991; LEE; KOO; MIN, 2004; PRYOR, 1986; SHAN; AW;
JONES, 1990). Logo, ao invés de radicais livres, passou-se a utilizar a denominação
de espécies reativas, para englobar além dos radicais, essas moléculas. Como em
sua grande maioria, tais espécies são derivadas do metabolismo do O2, normalmente
utiliza-se o termo espécies reativas de oxigênio (ERO) (FERREIRA; MATSUBARA,
1997).
ESPÉCIES REATIVAS DO OXIGÊNIO
Radicais
Não-radicais
O2•-
superóxido
H2O2
peróxido de hidrogênio
OH•
hidroxila
HClO-
hipoclorato
RO2•
peroxila
O3
ozônio
RO•
alcoxila
1
HO2•
hidroperoxila
O2
oxigênio singleto
ONOO-
peroxinitrito
Figura 3. Espécies reativas de oxigênio, radicais e não radicais, potencialmente sintetizadas nos
organismos que utilizam o oxigênio como aceptor de elétrons. Retirado de Ferreira e col., 2006
(FERREIRA; FERREIRA; DUARTE, 2006).
Devido ao elevado potencial de toxicidade do oxigênio e à sua grande utilização
pelos organismos aeróbios, torna-se necessário que esses estejam suficientemente
munidos de uma diversidade de sistemas antioxidantes para proteger as suas células
dos efeitos nocivos das ERO (BANERJEE et al., 2003; EVANS, 2000; LAMBERTUCCI
et al., 2007).
Um antioxidante é, por definição, qualquer substância que, quando presente
em baixas concentrações relativas à dos potenciais substratos oxidáveis, atrasa
significativamente, ou inibe, a oxidação desses substratos pelas ERO (DRÖGE, 2002;
HALLIWELL, 1991; HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2015; SIES, 1997). Essas
substâncias possuem a capacidade de fornecer elétrons/átomos de hidrogênio às
ERO sem se transformarem em moléculas instáveis. Os mecanismos de defesa
antioxidante nos diferentes tecidos compreendem sistemas enzimáticos e não
enzimáticos (GOLDFARB, 1999) e podem ser classificados em função da sua
localização orgânica (antioxidantes intracelulares e extracelulares) e da sua origem,
seja da dieta (antioxidantes exógenos), ou da síntese endógena (antioxidantes
endógenos). No interior da célula, a eliminação dos compostos reativos, constitui um
49
pré-requisito para a sobrevivência celular, sendo normalmente efetuada por: 1)
sistemas enzimáticos, tais como a superóxido dismutase (SOD), a catalase, a
glutationa peroxidase (GPx) e a glutationa redutase (GR); 2) sistemas nãoenzimáticos, tais como glutationa reduzida (GSH), coenzima Q (CoQ), ácido úrico,
vitamina E (alfa- tocoferol), vitamina C (ácido ascórbico), flavonóides, carotenóides,
proteínas de transporte de metais de transição, transferrina e ceruloplasmina
(BECKMAN; AMES, 1998). Desses, os agentes que apresentam um papel mais
preponderante dentro dos sistemas intracelulares de defesa antioxidante são a SOD,
a catalase e a GPx (FORONJY et al., 2006; LEE; KOO; MIN, 2004; MORENO et al.,
2005). Em situações de produção exagerada de ERO, cada uma dessas enzimas
possui a capacidade de catalisar reações que conduzem à produção de espécies
menos reativas (FERREIRA; FERREIRA; DUARTE, 2006).
Todavia, as ERO: radical superóxido (O2•-), hidroxila (OH•) e hidroperoxila
(HO2•) são os que possuem uma maior relevância biológica, não só devido à sua
elevada toxicidade, mas, também, pelo fato de serem os mais prevalentes nos
2O2•- + e- + 2H+
H2O2 + O2
SOD
2H2O2
Catalase
H2O2 + 2GSH
2H2O + O2
2H2O + GSSG
GPx
Figura 4. Reações catalisadas pelas enzimas antioxidantes (SOD- superóxido dismutase e GPxglutationa peroxidase, GSH e GSSG- formas reduzida e oxidada da glutationa).
organismos vivos que utilizam o oxigênio como fonte de energia. A nível celular, o
oxigênio é propenso a formar espécies reativas por uma redução monovalente gradual
para formar O2•-, um ânion extremamente reativo. O O2•- tem um elétron
desemparelhado e, comparado com O2, é relativamente instável (CHANDEL;
BUDINGER, 2007). Uma reação de dismutação pode resultar na formação de H2O2 e
oxigênio a partir da reação do O2•- com a água. Esta reação pode ocorrer
espontaneamente ao longo do tempo, porém é eficientemente catalisada pela enzima
superóxido dismutase, SOD (figura 4).
As células de mamíferos têm três isoenzimas SOD, a citosólica (Cu,Zn-SOD ou
SOD1), a mitocondrial (Mn-SOD ou SOD2) e uma forma extracelular da Cu,Zn-SOD
ou (EC-SOD ou SOD3). A SOD1 está localizada no espaço intermembranar
50
mitocondrial, no núcleo e no citosol. A SOD2 está localizada na matriz mitocondrial e
dismuta alguns dos ânions superóxidos gerados pela cadeia respiratória mitocondrial.
A EC-SOD é secretada extracelularmente e está ligada a polissacarídeos sulfatados
nas superfícies celulares (CHANDEL; BUDINGER, 2007; FERREIRA; FERREIRA;
DUARTE, 2006; HALLIWELL, 1991; HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2015). Além disso,
a atividade total da SOD é percebida principalmente no fígado, rim, eritrócitos,
cérebro, coração e pâncreas (FERREIRA; FERREIRA; DUARTE, 2006; HALLIWELL;
GUTTERIDGE, 2015).
Além da SOD, outras duas enzimas são importantes no metabolismo REDOX,
a catalase e a glutationa peroxidase (GPx). A catalase é uma enzima presente na
maioria dos organismos aeróbios e é responsável pela conversão do H2O2 intracelular
em água e oxigênio, estando a maior parte da atividade dessa enzima localizada nos
peroxissomas. Na maioria dos animais, a catalase está presente em praticamente
todos os órgãos, estando particularmente concentrada no fígado e nos eritrócitos. O
encéfalo, o coração e os músculos esqueléticos contêm pequenas quantidades desta
enzima. Algumas organelas como mitocôndria e retículo endoplasmático contêm
também alguma atividade da catalase, embora muito reduzida (FERREIRA;
FERREIRA; DUARTE, 2006; HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2015). Adicionalmente, a
GPx é considerada a enzima mais importante para a oxidação do H2O2 à água. A GPx
dos mamíferos tem maior afinidade pelo H2O2 do que a catalase, o que significa que
em concentrações baixas de H2O2, a GPx apresenta um papel muito mais ativo na
sua remoção celular. Apresenta-se sob quatro formas: GPx 1 ou clássica, encontrada
no citosol de todas as células do corpo; a GPx 2 ou gastrointestinal, especifica do trato
gastrointestinal; GPx 3 ou plasmática ou extracelular, encontrada no fluido do
revestimento interno do pulmão e no leite materno, além do plasma em mamíferos, e
a GPx 4, que atua sobre peróxidos de resíduos de ácidos graxos na membrana e
lipoproteínas (BAST; HAENEN; DOELMAN, 1991). O seu correto funcionamento está
dependente da presença de selênio (nutriente antioxidante) na sua constituição e da
disponibilidade de H2O2 e de outros hidroperóxidos, utilizando a GSH como doador de
elétrons, formando a glutationa oxidada (GSSH) e água. Este funcionamento atribui à
GPx um papel importante na proteção celular das membranas lipídicas, proteínas e
ácidos nucléicos contra as ERO (FERREIRA; FERREIRA; DUARTE, 2006;
HALLIWELL, 1991).
51
Entretanto, além dessa potencial ação nefasta sobre a integridade e
funcionalidade celular, as espécies reativas também têm sido responsabilizadas pela
regulação de importantes mecanismos fisiológicos, tais como: sinalização celular,
regulação da expressão de alguns genes, mediação de reações inflamatórias e
potencialização dos mecanismos de defesa orgânica, uma vez que fazem parte do
arsenal de armas letais leucocitárias (DRÖGE, 2002; HALLIWELL; GUTTERIDGE,
2015; HII; FERRANTE, 2007; PRYOR, 1986).
O balanço redox em líquidos biológicos, organelas, células ou tecidos é
determinado pela presença de pares redox responsáveis pelo fluxo de elétrons. Esses
sofrem frequentes permutas entre o estado reduzido e o oxidado (VASCONCELOS et
al., 2007). Cabe ressaltar que reações de redução implicam em ganho de elétrons, e
as de oxidação em perda. Portanto, quando no metabolismo ocorre uma redução do
O2, este ganhará um elétron, formando o O2•-, considerado instável por possuir
número ímpar de elétrons na última camada. As ERO são encontradas em todos os
sistemas biológicos. As fontes geradoras são: cadeia de transporte de elétrons da
mitocôndria,
retículo
endoplasmático
e
nicotinamida-adenina
dinucleotídeo
(NADH/NADPH) oxidase associada à membrana. Durante esse processo são
formados intermediários reativos, como O2•-, HO2• e OH•- e o H2O2. Este apesar de
não ser um radical livre, pela ausência de elétrons desemparelhados na última
camada, é um metabólito do oxigênio extremamente deletério, uma vez que participa
da reação que produz o OH•-, é capaz de atravessar camadas lipídicas, pode reagir
com a membrana eritrocitária e com proteínas ligadas ao ferro, mostrando-se
altamente tóxico para as células. A reatividade das ERO é neutralizada com a entrada
de quatro elétrons no processo de redução do O2 (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2015).
Múltiplos estudos demonstraram que a hiperóxia pode estimular a produção de
O2•- pela mitocôndria (AHMAD et al., 2015; ARITA et al., 2004; CAMPIAN et al., 2004;
FREEMAN; CRAPO, 1981; GARDNER et al., 1995; GARDNER; NGUYEN; WHITE,
2006; GUIDOT et al., 1993; HO et al., 1998; JACKSON et al., 1999; KUWANO et al.,
2017; LI et al., 2004; MOCKETT et al., 2003; MUTLU et al., 2012; SANDERS et al.,
1993; TURRENS et al., 1982; TURRENS; FREEMAN; CRAPO, 1982). Por exemplo,
em estudo seminal, Freeman e Crapo relataram que a exposição de fatias de pulmão
ou mitocôndrias isoladas preparadas de homogenatos de pulmão tiveram taxas
aumentadas de consumo de O2 em 95%, comparadas com 15% de oxigênio na
52
presença de cianeto, um inibidor da citocromo oxidase, sugerindo uma fonte
mitocondrial da ERO (FREEMAN; CRAPO, 1981). Do contrário, vários grupos de
investigadores relataram que a NADPH oxidase é necessária para geração de
oxidantes durante hiperóxia (CHOWDHURY et al., 2005; PAPAIAHGARI et al., 2006;
PARINANDI et al., 2015; WANG et al., 2004, 2006; ZHANG et al., 2003).
Já foi há muito reconhecido que a exposição à hiperóxia leva a uma queda no
metabolismo de células e tecidos (GARDNER; NGUYEN; WHITE, 2006; SCHOONEN
et al., 1990). Em células de ovário de hamster chineses expostos a hiperóxia por 24 h
ou mais, Schoonen e col. (1990) descobriram que a taxa de consumo de oxigênio foi
substancialmente menor do que em células mantidas em normóxia (SCHOONEN et
al., 1990). Em mitocôndrias isoladas, eles verificaram significante redução do
suprimento de elétrons na cadeia de transporte eletrônica do ciclo do ácido cítrico e
uma taxa reduzida de transporte de elétrons. A redução na geração de ATP da
oxidação fosforilativa foi parcialmente deslocada pela glicólise aumentada; no entanto,
os níveis de estado estacionário de ATP foram siginificativamente reduzidos. White e
seus colegas forneceram dados sobre o mecanismo subjacente a essa observação.
Eles relataram que a aconitase, uma enzima da matriz mitocondrial responsável pela
(des)hidratação do citrato para isocitrato no início do ciclo do ácido cítrico, foi inativada
pela exposição à hiperóxia (GARDNER et al., 1995; GARDNER; NGUYEN; WHITE,
2006). Entretanto, a superexpressão de Mn-SOD não preveniu a inativação da
aconitase induzida pela hiperóxia em células isoladas. Acredita-se que o ânion
superóxido oxide o aglomerado [4Fe-4S]2+ da aconitase para formar um aglomerado
[3Fe-4S]1+ inativo. Essa reação libera Fe2+ e H2O2, que podem sofrer uma reação de
Fenton, criando um radical hidroxila na matriz que poderia resultar em danos ao DNA
mitocondrial. Aconitase é reativada pela oxidação sequencial do aglomerado [3Fe4S]1+ para [3Fe – 4S]0, seguido pela inserção de ferro ferroso de um conjunto sensível
à deferoxamina (GARDNER et al., 1995). Esses achados suportam a hipótese de que
a exposição à hiperóxia resulta na inativação da aconitase, limitando o suprimento de
elétrons à cadeia de transporte eletrônica e, assim, minimizando a geração de ERO.
A diminuição resultante nos níveis de ATP pode sinalizar para outras vias, talvez
através da ativação da proteína quinase B (Akt) (AHMAD et al., 2004). Não está claro,
no entanto, se a inibição do transporte de elétrons mitocondrial durante a hiperóxia é
responsável pela redução no consumo de energia celular ou se é uma diminuição
primária na utilização de ATP subjacente a esta observação.
53
Durante a exposição hiperóxica, a geração de ROS resulta na ativação da via
de morte celular dependente de mitocôndria através da ativação das vias proteínicas
quinase ativadas por mitógenos e das proteínas Bap-2 proapoptóticas Bax ou Bak,
com subsequente permeabilização da membrana mitocondrial e morte celular.
(AHMAD et al., 2015; BARAZZONE; WHITE, 2000; BUCCELLATO et al., 2004; HE et
al., 2005; ILIZAROV et al., 2001; LI et al., 1997, 2003; LU et al., 2002; MANTELL et
al., 1999; PETRACHE et al., 1999; RAY et al., 2003; ROMASHKO et al., 2003; SCOTT
BUDINGER et al., 2002; WANG et al., 2003; WARD et al., 2000; ZHANG et al., 2003).
A administração de antioxidantes e a superexpressão de Mn-SOD na matriz
mitocondrial impedem a morte celular induzida pela hiperóxia, implicando superóxido
gerado pela matriz nessa via (ILIZAROV et al., 2001; KOO et al., 2004).
2.10. O resultado final: inflamação e morte celular
Os conceitos predominantes de patogênese da toxicidade do oxigênio
pulmonar e tolerância hiperóxica evoluíram nas últimas duas décadas. O possível
papel da inflamação na compactação ou propagação do dano durante a exposição
hiperóxica subletal foi reconhecido (BENSON et al., 2003; CHOO-WING et al., 2007;
INAMOTO et al., 1991).
Nosso entendimento dos mecanismos de tolerância foi reforçado quando se
descobriu que as citocinas, como o fator de necrose tumoral (TNF) e interleucina 1
(IL-1), quando administradas juntas por via intravenosa (WHITE et al., 1987) ou
individualmente pela via intratraqueal (CAPELLIER et al., 1996; TSAN et al., 1990;
TSAN; LEE; WHITE, 1991), induzem tolerância à hiperóxia. Esses tratamentos
também foram associados à indução da Mn-SOD pulmonar. No entanto, essas
citocinas podem induzir outras citocinas, principalmente IL-6 e numerosas outras
proteínas. Assim, os mecanismos de proteção induzidos por citocinas têm sido
amplamente explorados, mas não totalmente compreendidos (Tabela 1).
O estudo de Ward e colaboradores (WARD et al., 2000) aponta para um
possível papel da IL-6 e das proteínas da fase aguda, como o inibidor tecidual de
metaloproteinases na resposta protetora. Também foi notado, que a proteína antiapoptótica Bcl-2 foi induzida em resposta à expressão de IL-6 transgênica,
aumentando a ideia de um papel potencialmente importante da apoptose neste
modelo animal de lesão pulmonar hiperóxica letal (WARD et al., 2000; ZHANG et al.,
2008).
54
Tabela 1. Regulação das citocinas durante hiperóxia.
Citocina
Indução
TNF
Efeito na lesão pulmonar
Protetivo*
Lesivo†
Agindo em sinergia IL-8
IL-1
Protetivo*
?
Superexpressão protetiva
IL-6
Proteção
IL-8
Lesivo
IL-11
Superexpressão protetiva
?
?
?
?
Lesivo
?
Lesivo
Proteção*
?
?
Protetivo
IGF,
IGFR,
IGR-BP
PDGFG-CSF
GM-CSF
VEGF
KGF
=
Protetivo†
Referência
(WHITE et al., 1987)
(TSAN et al., 1990)
(JENSEN et al., 1992)
(ALLEN et al., 2000)
(TSAN; LEE; WHITE, 1991)
(WARNER et al., 1998)
(JENSEN et al., 1992)
(WHITE et al., 1987)
(JOHNSTON et al., 1998)
(COALSON et al., 1999)
(WARD et al., 2000)
(LI et al., 2019)
(DEFORGE et al., 1993)
(JOSEPH et al., 2008)
(WAXMAN et al., 1999)
(CHETTY et al., 2008)
(CAZALS et al., 1994)
(HAN et al., 1996b)
(HAN et al., 1996a)
(HAN et al., 1998)
(KIM et al., 2012)
(FABISIAK; EVANS; KELLEY, 1989)
(FREEMAN et al., 1996)
(STURROCK et al., 2012)
(MANISCALCO et al., 1997)
(KLEKAMP; JARZECKA; PERKETT, 1999)
(ESQUIBIES et al., 2008)
(PANOS et al., 1995)
(YAO et al., 2013)
Fator de necrose tumoral, TNF; interleucina, IL; fator de crescimento derivado de plaquetas, PDGF; fator de
crescimento semelhante à insulina, IGF; fator estimulador de colônias granulocitárias, G-CSF; fator estimulador de
colônias granulócito-Macrófago, GM-CSF; fator de crescimento endotelial vascular, VEGF; fator de crescimento de
queratinócitos, KGF. * Protetor quando dado antes. † Após a injúria.
Essa discussão deve ser introduzida dizendo-se que a disfunção celular
significativa, sem dúvida, precede a morte celular nesses modelos e que intervenções
precoces apropriadas podem prevenir essa disfunção e a morte subsequente. Entre
essas possíveis intervenções terapêuticas, seria a indução de respostas protetoras,
como a resposta de fase aguda, que, entre outros efeitos, pode modular o equilíbrio
protease-antiprotease e também a homeostase de metais como o ferro, que por sua
vez pode modulam o dano dependente de radicais livres. Além disso, os mesmos
autores sugerem que a modulação direta dos processos de morte celular também
podem influenciar no resultado; isto é, mudanças específicas em proteínas da família
Bcl-2 e/ou outros fatores de crescimento ou sobrevivência anti-apoptóticos também
poderiam ser suficientes para proporcionar proteção (WARD et al., 2000).
55
As células epiteliais são cruciais para manter a integridade da barreira alvéolocapilar, e seu dano causa extravasamento nesse local. Em modelos animais, a morte
de células endoteliais e epiteliais parece ser uma característica essencial do dano
alveolar induzido pelo oxigênio em estágio terminal (CRAPO, 1986).
Até o momento, dois mecanismos distintos de morte celular foram
reconhecidos: necrose e apoptose. A necrose está associada ao rompimento da
membrana celular, resultando em uma perda do citoplasma e, finalmente, uma
degradação nuclear aleatória. A apoptose ocorre em uma célula com membrana
plasmática íntegra, e a degeneração de DNA é o resultado da ativação de
endonucleases específicas (DUVALL; WYLLIE, 1986). Apoptose e necrose foram
comumente consideradas processos diferentes e mutuamente exclusivos (DUVALL;
WYLLIE, 1986). Esta afirmação, que pode ser verdadeira in vitro, não foi demonstrada
de forma convincente in vivo. Há evidências de que os eventos intracelulares que
levam à apoptose e necrose podem ocorrer sequencialmente. Na etapa inicial, há um
colapso do potencial de membrana mitocondrial e perda de glutationa celular. Nesse
estágio, a intervenção farmacológica na forma de inibidores de caspases pode
prevenir a morte celular. Em um segundo passo, há ruptura da membrana plasmática
(necrose) (FUJITA et al., 1998). Permanece a possibilidade de que a apoptose e a
necrose possam ocorrer simultaneamente de maneira exclusiva dentro de uma
população celular ou sequencialmente na mesma célula (necroptose) (LEE et al.,
2012).
A morte de células alveolares é difícil de avaliar in vivo, principalmente porque
a distinção entre células alveolares tipo I, células endoteliais e células intersticiais é
muito difícil por microscopia óptica. Mesmo por microscopia eletrônica, quando a lesão
celular está presente a distinção entre esses tipos de células é difícil. Além disso, o
estudo da morte celular durante a lesão pulmonar é complexo porque o processo
destrutivo e a fase reparadora podem ocorrer simultaneamente. No entanto, vários
estudos recentes focalizaram a importância da apoptose na toxicidade do oxigênio.
Até o momento, os pesquisadores demonstraram que essa lesão está associada a
características de necrose celular e apoptose (ABELE, 2002; ALMZAIEL et al., 2015;
BARAZZONE et al., 1998; CALVERT et al., 2003; CAO et al., 2016; KAZZAZ et al.,
2002; LI et al., 2009; WEE et al., 2015).
A apoptose pode ser desencadeada por diferentes vias responsáveis pela
ativação da caspase. As vias da caspase são bem caracterizadas na modulação da
56
apoptose. As caspases podem ser ativadas via apoptótica intrínseca (mediada por
mitocôndrias) ou extrínseca (mediada por receptor de morte) (BARKER et al., 2006;
CHANDEL; BUDINGER, 2007; GRIVICICH; REGNER; DA ROCHA, 2007; LEE et al.,
2012; SALVESEN, 1999; SAVILL; GREGORY; HASLETT, 2003; TAYLOR; CULLEN;
MARTIN, 2008). A via apoptótica intrínseca apresenta liberação mitocondrial do
citocromo c e inicia a ativação da cascata da caspase através da caspase-9 e
caspase-3. Este caminho também envolve proteínas Bcl-2. A via apoptótica extrínseca
é ativada por receptores de morte na membrana plasmática, como Fas/CD95,
formando posteriormente o complexo sinalizador de indução de morte envolvendo
FADD e iniciando a cascata de caspases através da caspase-8 (GRIVICICH;
REGNER; DA ROCHA, 2007; LEE et al., 2012; SAVILL; GREGORY; HASLETT, 2003;
TAYLOR; CULLEN; MARTIN, 2008).
Estes incluem a ativação de membros da superfamília do TNF (receptor de
TNF, Fas, CD40) localizados na membrana plasmática - alguns dos quais contêm um
domínio de morte. Vias adicionais para a apoptose incluem a retirada de fatores de
crescimento e/ou insultos diretos à membrana plasmática (inanição, estresse,
estresse oxidativo), que envolvem diferentes proteínas intracelulares e enzimas. A
exposição à hiperóxia pode ser semelhante ao estresse oxidativo in vitro (BRIGHAM,
1986); aumenta os níveis de ERO, o que, entre seus efeitos deletérios, pode provocar
cisão da fita de DNA, peroxidação lipídica das membranas celulares e ativação de
vários genes cujos produtos estão envolvidos na inflamação e morte celular
(FREEMAN; CRAPO, 1982; JANSSEN et al., 1993). Evidências crescentes sugerem
que as ERO e o estresse oxidativo são atores importantes na reação em cadeia,
levando à morte celular (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2015). Uma variedade de
eventos celulares chave se concentra nas mitocôndrias, incluindo a liberação de
ativadores de caspases, mudanças no potencial transmembrana, alteração no status
de redução da oxidação, e participação de proteínas da família Bcl-2, que podem estar
associadas às mitocôndrias. Embora a inibição de caspases não iniba completamente
a morte celular causada por certos agentes, proteínas anti-apoptóticas como Bcl-2 e
Bcl-XL podem manter a sobrevivência celular em face de tais agentes (GREEN;
REED, 1998). Como as mitocôndrias são grandes geradoras de ROS e podem abrigar
proteínas da família Bcl-2, elas provavelmente desempenham um papel importante no
controle de processos que culminam na morte celular como resultado da hiperóxia
(HIRSCH et al., 1998; KROEMER; ZAMZAMI; SUSIN, 1997; TSCHOPP et al., 1998).
57
Três mecanismos mitocondriais inter-relacionados são provavelmente responsáveis
pelo controle da morte ou vida celular: (1) o rompimento do transporte de elétrons e
liberação mitocondrial do citocromo c, resultando na perda de sua função e diminuição
da produção de ATP, (2) liberação de proteínas ativadoras de caspase, tais como
membros da familia Bcl-2 e algumas pró-caspases, e (3) alteração do estado redox
celular. No entanto, a regulação fina das caspases pela família Bcl-2 não é
completamente entendida, exceto que depende do tipo de célula e da disponibilidade
do citocromo c (GREEN; REED, 1998). A família Bcl-2 compreende membros pró e
anti-apoptóticos, e estes podem atuar a montante de várias caspases e de disfunção
mitocondrial (CHAO; KORSMEYER, 1998). Durante a exposição à hiperóxia, o RNA
mensageiro de Bax e Bcl-X é fortemente regulado para cima, dentro do pulmão,
levantando a questão se essas moléculas são protetoras ou deletérias neste modelo
(BARAZZONE et al., 1998). Moléculas como Bax (agonista da morte) e Bcl-2
(antagonista da morte) atuam em competição, e sua abundância relativa e
dimerização podem determinar a morte celular ou a sobrevivência celular. Mais uma
vez Ward e colaboradores, demostrando que a superexpressão de IL-6 em
camundongos transgênicos pode modificar o nível basal da proteína Bcl-2 sem alterar
o nível de proteína Bax, sugerindo que o equilíbrio entre essas moléculas é importante
in vivo (WARD et al., 2000). A importância da apoptose na determinação do resultado
da lesão alveolar também foi demonstrada pela administração de agentes envolvidos
na morte celular programada, como o anticorpo monoclonal anti-CD40 L, ou pela
superexpressão de IL-11 em células de Clara (ADAWI et al., 1998; WAXMAN et al.,
1999). Esses dois estudos enfatizam não somente a importância potencial da via que
leva à apoptose, mas também os tipos de células que devem ser protegidas da
apoptose. De fato, camundongos knockout para p53 ou camundongos nulos para Fas
não apresentam proteção durante a exposição à hiperóxia (BARAZZONE et al., 1998).
O fator de crescimento dos queratinócitos (KGF) mostrou proteger contra danos
alveolares durante a exposição à hiperóxia (PANOS et al., 1995; WU et al., 1998; YAO
et al., 2013). No entanto, os mecanismos de proteção do KGF não são totalmente
compreendidos. Em células epiteliais cultivadas, o KGF pode aumentar o reparo do
DNA (WU et al., 1998). Durante a exposição à hiperóxia, a apoptose diminuída não
pôde ser detectada in vivo ou in vitro após o tratamento com KGF (BARAZZONE et
al., 1998; BUCKLEY et al., 1998). Uma descoberta dos estudos de Waxman e
associados e Ward e colaboradores é a importância potencial das células de Clara na
58
manutenção da integridade da membrana alvéolo-capilar (WARD et al., 2000;
WAXMAN et al., 1999). Seria interessante determinar se o aumento da expressão de
IL-6 ou IL-11 em CCL10 pode modificar Bcl-2 apenas nessas células e entender o
papel exato das células de Clara na manutenção do volume da barreira alvéolocapilar. Também seria interessante saber se a expressão específica de células de
Clara permite a distribuição distal de IL-6 e/ou altera a expressão de Bcl-2 em células
adjacentes, tais como células epiteliais do tipo I e II e células endoteliais. Outra
possibilidade seria se o epitélio bronquiolar em camundongos, constituído
principalmente por células de Clara, pudesse participar da gênese do epitélio alveolar
durante a diferenciação das células de Clara (REYNOLDS; MALKINSON, 2010;
ROKICKI et al., 2016). Embora as células de Clara sejam um progenitor do epitélio
bronquiolar, nenhuma evidência suporta um papel para elas na gênese do epitélio
respiratório mais distal. Ainda é possível que outros efeitos sobre a função das células
de Clara neste modelo possam afetar o resultado na lesão pulmonar hiperóxica em
camundongos (MANGO et al., 1998).
59
JUSTIFICATIVA
“A única justificativa para algo inútil é que seja
profundamente admirado.”
Oscar Fingal O'Flahertie Wills Wilde
3.
Justificativa, 61
60
61
3 JUSTIFICATIVA
A informação que descreve a tolerância do pulmão humano à toxicidade do
oxigênio é essencial para o uso seguro e eficaz em pressões parciais aumentadas
nos campos de oxigenoterapia, mergulho e medicina aeroespacial.
No entanto, por motivos óbvios, os estudos de intoxicação pulmonar pelo
oxigênio no homem normal foram e são necessariamente limitados aos estágios
iniciais e reversíveis da toxicidade progressiva e fatal.
Em contraste a isso, as manifestações patológicas da intoxicação grave pelo
oxigênio geralmente têm sido estudadas em animais que morreram, ou que estão
perto da morte, causados pelos efeitos tóxicos do oxigênio.
A fim de relacionar os efeitos do oxigênio sobre a função pulmonar no homem
às alterações patológicas encontradas em animais experimentais, é necessário
identificar os efeitos estruturais e morfológicos iniciais da intoxicação por oxigênio nos
pulmões dos animais. No entanto, ainda carecemos de tabelas que relacionam lesão
com exposição e que nos ajude a prever de forma reprodutível.
Portanto, faz-se mister desenvolver um modelo de lesão pulmonar em
camundongos submetidos ao ambiente hiperóxico e hiperbárico, tanto do ponto de
vista funcional e morfológico, como pela avaliação do perfil de redox e de estímulo
apoptótico.
62
63
OBJETIVOS
“Simplicidade
é
o
último
degrau
da
sabedoria.”
Victor-Marie Hugo
4.
Objetivos, 65
64
65
4 OBJETIVOS
Validar um modelo de lesão pulmonar desenvolvido em uma câmara
hiperbárica experimental para pequenos animais submetidos ao ambiente hiperóxico
e hiperbárico.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Para tal, buscou-se:
1. Estabelecer as curvas de sobrevida e de concentração letal mediana (CL50) de
acordo com a pressão de exposição ao oxigênio hiperbárico;
2. Identificar os efeitos na mecânica ventilatória em camundongos submetidos ao
ambiente com oxigênio hiperbárico;
3. Quantificar o grau de lesão tecidual e de apoptose induzidos pelo modelo
proposto, verificando se há alterações nas características anatomopatológicas
do tecido pulmonar; e
4. Comparar o nível do dano oxidativo dos camundongos submetidos ao ambiente
com oxigênio hiperbárico com aqueles expostos ao oxigênio normobárico.
66
67
MATERIAIS E MÉTODOS
“Para fazer bem as coisas é necessário:
primeiro, o amor; segundo, a técnica.”
Antoni Gaudí i Cornet
5.
Materiais e métodos, 69
5.1.
Animais, 69
5.2.
Considerações éticas, 69
5.3.
Desenho da pesquisa, 69
5.4.
Oxigenação hiperbárica, 72
5.5.
Coleta de dados, 75
5.5.1.
Mecânica pulmonar, 75
5.5.2.
Análise anatomopatológico, 76
5.5.3.
Análise do estado redox, 78
5.5.4.
Apoptose, 82
5.6.
Análise Estatística, 83
68
6.
69
5 MATERIAIS E MÉTODOS
5.1. Animais
Para atender aos objetivos supracitados da pesquisa, 95 camundongos
albinos inbred (Mus musculus) da linhagem BALB/c, machos, adultos, com idades
entre 5-8 semanas (média de 49 ± 7 dias), pesando entre 25 a 30 g (média de
28,12±1,7 g), provenientes do CEMIB – Centro Multidisciplinar para Investigação
Biológica na Área da Ciência em Animais de Laboratório – UNICAMP, que durante um
período de adaptação de cinco dias, foram mantidos em caixas esterilizadas para
roedores, no máximo com oito animais por caixa, enriquecidas ambientalmente,
forradas com maravalha, em estantes ventiladas com controle estrito de temperatura
(28±2 ºC), umidade relativa do ar (aproximadamente 70%) e ciclo claro-escuro (12
horas), com oferta de dieta sólida comercial e água filtrada ad libitum.
5.2. Considerações éticas
O projeto foi submetido à avaliação e aprovação pelo Comitê de Ética no
Uso de Animais (CEUA), do Centro de Ciências da Saúde, UFRJ, sob o número de
protocolo 016/2017 e adendo A05/18 (anexos A e B). Todos os animais receberam os
cuidados em acordo aos Principles of Laboratory Animal Care formulados pela
Sociedade Nacional de Pesquisa Médica dos EUA e com o Guide for the Care and
Use of Laboratory Animals, elaborado pela Academia Nacional de Ciências dos EUA
(GARBER et al., 2011) e resoluções do Conselho Nacional de Controle de
Experimentação Animal do Ministério de Ciência, Tecnologia e Inovação –
CONCEA/MCTI.
Por fim, com a intenção de se evitar o sofrimento desnecessário dos animais,
foi utilizado como critério de ponto final a escala de expressão facial para
camundongos descrita previamente por Langford et al., 2010 (LANGFORD et al.,
2010). Ao alcançar, em qualquer momento o somatório de 8 nesta escala, o
experimento foi interrompido e foi realizada a eutanásia sob sedação/anestesia por
exsanguinação.
5.3. Desenho da pesquisa
A pesquisa foi realizada em três fases distintas, conforme demonstrado na
figura 5.
70
Figura 5. Desenho da pesquisa.
Na primeira fase de experimentação, 45 animais foram distribuídos de forma
aleatória em cinco grupos (n = 9 animais cada grupo). Cada um desses grupos foi
exposto a 100% de oxigênio submetido às pressões de 1, 1,5, 2, 2,5, e 3 ata
(equivalentes a 101,3, 151,9, 202,6, 253,3 e 303,9 kPa, respectivamente) com o
objetivo de determinar o período de exposição necessário ao aparecimento de lesão
pulmonar significativa. Ao final, as curvas de sobrevida presuntiva e a concentração
letal mediana (CL50) foram calculadas para cada pressão de exposição. A sobrevida
presuntiva foi definida como a dose de exposição ao oxigênio que levou à amostra
exibir sintomas clínicos tais que obrigaram a uma eutanásia humanitária (critério de
ponto final). Com os tempos obtidos de sobrevida para cada pressão, a CL50 foi
calculada subsequentemente utilizando-se o cálculo probit de acordo com BLISS e
FINNEY (BLISS, 1934; FINNEY, 1952), demonstrado no apêndice B.
Na segunda fase, 25 camundongos foram distribuídos aleatoriamente em
grupos, assim denominados, conforme mostrado na figura 6:
1) OHB: composto por 20 animais, distribuídos de forma também aleatória em
subgrupos de acordo com as condições de pressão anteriormente descritas (1,5, 2,
2,5, e 3ATA) (5 animais/subgrupo), mantidos em uma câmara hiperbárica ventilada
continuamente com oxigênio puro, pelos tempos correspondentes a 50% da CL50
calculada para a respectiva pressão, com o objetivo de se avaliar a lesão pulmonar e
manter a mortalidade inferior a 5%; e
71
2) ONB: composto por 5 animais, mantidos em uma câmara hiperbárica
ventilada continuamente com oxigênio puro a 1 ata, pelos tempos correspondentes a
50% da CL50 obtida para a respectiva pressão, a fim de se avaliar os efeitos da
hiperóxia normobárica.
Camundongos BALB/c
Grupos
Subgrupos
n = 25
ONB
OHB
n=5
n = 20
1 ATA
1,5 ATA
2 ATA
2,5 ATA
3 ATA
n=5
n=5
n=5
n=5
n=5
Figura 6. Distribuição dos camundongos nos grupos do estudo na segunda fase. OHB: animais
submetidos ao ambiente hiperbárico com oxigênio a 100% durante o período de tempo correspondente
a 50% da CL50 daquela pressão atmosférica; ONB: animais submetidos ao ambiente normobárico
ventilado com oxigênio a 100%. durante o período de tempo correspondente a 50% da CL 50 daquela
pressão atmosférica. ATA: Atmosfera absoluta.
Na terceira fase do estudo, 20 camundongos foram distribuídos aleatoriamente
em grupos assim denominados, conforme mostrado na figura 7:
1) 3ATA: composto por 5 animais, mantidos em uma câmara hiperbárica,
ventilada continuamente com 100% de oxigênio a 3 ata, pelo tempo correspondente
a 50% da sua CL50 obtida na primeira fase do estudo, com o objetivo de se avaliar a
lesão pulmonar em sua fase aguda;
2) HIPEROX: composto por 5 animais, mantidos em uma câmara hiperbárica,
ventilada continuamente com 100% oxigênio a 1 ata, pelo mesmo tempo do grupo
acima, a fim de servir de controle para a hiperóxia;
Camundongos BALB/c
Grupos
n = 20
3ATA
HIPEROX
HIPERBAR
CRTL
n=5
n=5
n=5
n=5
Figura 7. Distribuição dos camundongos nos grupos do estudo na terceira fase. 3ATA: animais
submetidos ao ambiente hiperbárico com oxigênio a 100% durante o período de tempo correspondente
a 50% CL50 de 3 ata (303,97 KPa); HIPEROX: animais submetidos ao ambiente normobárico ventilado
com 100% oxigênio durante o mesmo período de tempo do grupo OHB; HIPERBAR: animais
submetidos ao ambiente hiperbárico (3 ata) ventilado com ar ambiente durante mesmo período de
tempo dos grupos acima; CRTL: animais expostos ao ar ambiente sob pressão ambiental, durante
mesmo período de tempo dos grupos acima. ATA: Atmosfera Absoluta.
72
3) HIPERBAR: composto por 5 animais, que foram expostos ao ar ambiente
(O2 21%, N2 78% a 303,97 KPa ou 3 ata, equivalente a uma ppO2 de 0,63 ata) pelo
mesmo tempo dos grupos acima, como controle para determinar se há alguma
contribuição de pressão por si só na lesão pulmonar; e
4) CRTL: composto por 5 animais, que foram mantidos no interior da mesma
câmara hiperbárica, no entanto, sob condições padrão de pressão: 101,3 KPa (1 ata),
pelo mesmo tempo dos grupos acima. Este grupo tem como função, determinar a
higidez e normalidade da amostra.
5.4. Oxigenação hiperbárica
Os animais do estudo foram expostos à atmosfera hiperóxica-hiperbárica de
acordo com seu subgrupo, em uma câmara hiperbárica para animais de pequeno
porte (Metalpier, Itaboraí, RJ) (Figura 8).
A câmara é feita de alumínio escovado e possui um volume interno de 47,4 L
(0,05m3). Possui uma válvula de admissão de ar que se liga por mangueiras à fonte
de gases. A jusante da válvula de admissão, há um manômetro calibrado para
pressões internas da câmara de 0 a 7 ata. A saída de ar do interior da câmara é
regulada por outra válvula, a qual está conectado o analisador de gases.
Figura 8. Câmara hiperbárica para pequenos animais com sistema de vigilância instalado por câmera
IV e monitor de vídeo.
73
Durante a permanência na câmara hiperbárica, os animais foram mantidos em
gaiolas individuais de acrílico fenestrado (Figura 9), permitindo, desta forma, que
fossem expostos igualmente aos efeitos da atmosfera hiperóxica hiperbárica ou
hiperóxica normobárica. Antes da pressurização, oxigênio a 100% foi usado para
“lavar” a câmara por 10 minutos, a fim de se retirar todo o ar ambiente residual,
buscando-se diminuir a participação de gás nitrogênio no ar respirado.
Figura 9. Caixa em acrílico fenestrada para manutenção dos animais no interior da câmara.
O oxigênio foi então pressurizado lentamente durante 5 minutos até alcançar a
pressão ambiental relativa ao seu subgrupo. O conteúdo de oxigênio foi monitorado
continuamente por um analisador portátil de oxigênio O2DII (Analox Ltd., North
Yorkshire, RU) e mantido maior do que 98,5%.
A concentração de CO2 foi restrita a valores inferiores a 0,1% por meio da
utilização de um sistema artesanal de depuração contendo cal sodada (hidróxido de
cálcio, Brasmed, Paulínia, SP, Brasil). O dispositivo conta com uma ventoinha elétrica
alimentada por um sistema de 12V que força a passagem do ar interno da câmara
pelo filtro de cal sodada conforme esquema e foto da figura 10.
O controle ambiental foi mantido a uma temperatura interna de 28±1 ºC e
umidade de 60±20%.
74
b
.
c.
d
.
a
.
e
.
B
A
Figura 10. Depurador artesanal de CO2. A. Esquema tridimensional de um sistema de depuração
artesanal de CO2, com suas partes separadas. a. ventoinha 12V; b. caixa de suporte da ventoinha; c.
funil; d. mola com as esferas de cal sodada no seu interior; e. recipiente plástico perfurado. B.
Dispositivo de purificação após seu uso, mostrando que é capaz de reter até a umidade do interior da
câmara.
Findo o período de pressurização, a câmara foi descomprimida ao longo de 5
minutos até alcançar a pressão ambiental normal.
Os animais do grupo HIPERBAR foram expostos na mesma câmara
hiperbárica, a uma pressão ambiente de 3 ata, respirando ar ambiente (O2 21%, N2
78% a 303,97 KPa ou 3 ata, equivalente a uma ppO2 de 0,63 ata).
Durante a permanência na câmara hiperbárica, foi obedecido estritamente o
ciclo claro-escuro ao qual os animais vinham sendo submetidos no período de
adaptação, sendo a fase escura considerada como preferencial para a exposição,
buscando-se aproveitar o animal em seu maior nível de atividade. Desta forma, foi
ofertada dieta sólida comercial e água filtrada ad libitum durante todo o período de
exposição.
Todos os animais experimentais foram continuamente monitorados durante
todo o período de exposição na câmara hiperbárica para pequenos animais por meio
de câmera de vídeo Hikvision 700TVL, com lente de 12 mm, distância focal F1.8, de
1/3” de diâmetro com CCD infravermelho, mantida em invólucro à prova de explosão,
em aço inox SUS304/SUS316 e vidro temperado. Foram registrados em ficha própria
(apêndice A) os seguintes parâmetros: perfil do mergulho, escala de expressão facial
para camundongos, evidências de toxicidade no SNC (agitação, rigidez, movimentos
de limpeza excessivos, salivação, tremores e convulsões) e padrão respiratório
anômalo.
75
5.5. Coleta dos dados
Imediatamente depois de retirados da câmara, os animais dos protocolos II e
III foram encaminhados para coleta de amostras conforme o fluxo demonstrado na
figura11:
Anestesia
Anatomopatológico
Hematoxilina-Eosina
Imunohistoquímica
Apoptose
Mecânica pulmonar
Geração de ROS
Atividade redox
Enzimas Antioxidantes
Grupamentos tiol
Figura 11. Fluxo de coleta de amostras.
5.5.1. Mecânica pulmonar
Imediatamente depois da retirada do animal da câmara hiperbárica, os animais
foram pesados (balança Filizola, modelo BR, Indústrias Filizola SA, São Paulo, Brasil),
anestesiados com xilazina (10 mg/kg de peso corpóreo, i.p.), e quetamina (100 mg/kg
de peso corpóreo, i.p.). Essa dose foi suficiente para manter o animal em plano
anestésico (supressão do reflexo córneo-palpebral e outros reflexos nociceptivos) por
uma hora. As medidas de mecânica pulmonar não duraram mais do que 15 minutos
para cada animal. Foi, então, realizada traqueostomia com a introdução de uma
cânula que se ajustasse firmemente à traqueia.
Em seguida, os animais foram relaxados com brometo de pancurônio
(0,1 mg/kg, i.v.) e após, conectados a um sistema de ventilação oscilatório para
pequenos animais (FlexiVent, Scireq, Montreal, QC, Canadá), em um módulo FX1,
para serem ventilados em uma frequência de 150 ciclos/min. A parede anterior do
tórax foi então removida cirurgicamente, como descrito previamente (SALDIVA et al.,
1992). Ao longo de todo o procedimento, o animal foi mantido em decúbito dorsal
horizontal, sobre superfície aquecida (33-37 ºC).
Após um período de estabilização em condições de linha de base, a mecânica
pulmonar foi medida pelas seguintes manobras: (a) foi utilizado um grupo de
76
perturbações chamadas prime-8 que corresponde às oscilações forçadas de banda
larga com 8 segundos de duração, induzindo frequências entre 0,5 a 19,75 Hz
aplicadas à via aérea do animal e (b) uma insuflação profunda (deep inflation) foi
aplicada para inflar ao máximo os pulmões até uma pressão de 30 cmH2O, a fim de
abrir as áreas fechadas e padronizar o volume pulmonar. Os pulmões foram deixados
equilibrar a essa pressão durante um período de 3 segundos e o volume corrigido pela
compressão do gás foi lido como a capacidade inspiratória (CI) do animal (DEVOS et
al., 2017). Esta Técnica de Oscilação Forçada (TOF) de banda larga foi analisada
ajustando o modelo de fase constante à impedância de entrada respiratória calculada
a partir dos dados experimentais P8 (HANTOS et al., 1992a).
A TOF de banda larga, também referida como a técnica de oscilação forçada
de baixa frequência mede a resposta do espécime a um sinal que contém uma ampla
gama de frequências, abaixo e acima da frequência de respiração do indivíduo. Os
resultados avaliados foram a resistência newtoniana (Rn), o amortecimento ou
resistência tecidual (G), a elastância tecidual (H) e a histeresividade (η), que é a
relação do amortecimento tecidual pela elastância tecidual (HANTOS et al., 1992b).
Após um primeiro grupo de perturbações, foi realizada uma manobra de
recrutamento até a capacidade inspiratória (CI), uma pressão de cerca de 30 cmH2O
e depois desinflados para determinar a CVM. Em cada animal, as mesmas manobras
foram repetidas até que cinco medições aceitáveis fossem registradas (coeficiente de
determinação ≥ 0,90) antes e depois da manobra de hiperinsuflação pulmonar. A
média de pelo menos cinco medidas aceitáveis foi calculada.
5.5.2. Análise anatomopatológica
Após a análise dos parâmetros ventilatórios, foi realizada uma laparotomia
ampla seguida por heparinização (1000 UI), clampeamento da traqueia ao nível da
carina no final da expiração, para que o volume pulmonar se mantenha ao nível da
capacidade residual funcional, e eutanásia do espécime por exsanguinação rápida
(seção da aorta e cava abdominais). Em seguida, os pulmões foram removidos en
bloc. O pulmão esquerdo foi submerso em uma solução de formaldeído a 10 % em
tampão de fosfato de Millonig (10 mL de HCHO, 900 mL de H2O, 18,6 g de NaH2PO4,
4,2 g de NaOH) ainda com volume correspondente à capacidade residual funcional.
Após fixação, o tecido foi embebido em parafina e fatias de 4 μm de espessura foram
obtidas por meio de um micrótomo, para posteriormente serem coradas com
77
hematoxilina e eosina (HE), para verificação da estrutura alveolar e contagem celular
(JUNQUEIRA; COSSERMELLI; BRENTANI, 1978).
Em aumento de 200x, nas lâminas coradas com HE, foram avaliados dez
campos aleatórios e não coincidentes por lâmina. Foi quantificada a fração de área
ocupada por alvéolos normais, colapsados e hiperinsuflados (WEIBEL; KISTLER;
SCHERLE, 1966), onde o número de pontos que caíam em área de alvéolos normais,
colapsados ou hiperinsuflados, respectivamente, foi dividido pelo total de pontos
contados em cada campo analisado e expresso sob a forma de percentual (Figura
12).
Figura 12. Quantificação dos parâmetros morfométricos. Representação esquemática do retículo com
100 pontos e 50 linhas utilizado para quantificação dos alvéolos normais, colapsados ou hiperinsuflados
em um aumento de 200x.
Em aumento de 1000x, nas lâminas coradas com HE, foram avaliados dez
campos aleatórios e não coincidentes por lâmina para a quantificação de células
polimorfonucleares [PMN (neutrófilos + eosinófilos)] no tecido pulmonar. A área do
retículo neste aumento corresponde a 10.000 µm2. A quantidade de PMN foi expressa
em número de células/µm2 no tecido pulmonar (descontando-se as células dos
espaços aéreos). Para tal, foi computado o número de pontos que caíam sobre o
tecido pulmonar, e, em seguida, no mesmo campo foi contabilizado o número total de
células (WEIBEL; KISTLER; SCHERLE, 1966) (figura 13). As lâminas foram
codificadas e examinadas às cegas por dois investigadores, que desconheciam a
78
origem do material a ser examinado, apenas ao final de todas as medições o
responsável pelo estudo decodificou a origem do material.
Figura 13. Quantificação da celularidade. Representação esquemática do reticulo com 100 pontos e
50 linhas utilizado para quantificação de células polimorfonucleares no tecido pulmonar em um aumento
de 1000x.
5.5.3. Análise do estado REDOX
Processamento do tecido pulmonar para medida da geração de H2O2
A totalidade do pulmão direito foi homogeneizado em 2 ml de tampão fosfato
de sódio 50 mM; pH 7,2 contendo sacarose 0,25 M; ditiotreitol 0,5 mM; etileno glicol
tetra ácido (EGTA) 1 mM e uma mistura de aprotinina 0,5 mg/ml e fluoreto de
fenilmetilsulfonil (PMSF) 0,2 mM. Após este processo, o homogenato foi centrifugado
a 100.000 g, 35 minutos a 4°C, em ultra centrífuga L8-80M, BECKMAN. O precipitado
foi ressuspenso em 0,5 mL de tampão fosfato de sódio 50 mM; pH 7,2, contendo
sacarose 0,25 M; cloreto de magnésio 2 mM e uma mistura de aprotinina 5 mg/ml e
34,8 mg de PMSF. As amostras obtidas foram armazenadas a 20ºC para posterior
medida da atividade de geração de H2O2 pela enzima oxidase dual, segundo a
literatura (MÜHLBAUER et al., 2010).
No presente estudo foi avaliada a geração de ERO através de ensaios de
geração de peróxido de hidrogênio (H2O2) pela NADPH oxidase, que no pulmão,
existe em abundância sob as formas NOX2, NOX4 e DUOX1/2. Para isto, utilizamos
centrifugações fracionadas: uma ultracentrifugação do pellet a 100.000g (P100.000),
79
para que fosse observada a atividade da NOX4, presente na fração microssomal; e
outra centrifugação do sobrenadante 3.000g (P3.000), que preserva a membrana
plasmática, onde são encontradas DUOX e NOX2 no pulmão.
Dosagem da atividade geradora de H2O2
A geração de H2O2 foi quantificada pelo método Amplex Red/HRP (Molecular
Probes, Inc. Eugene, OR, EUA), que detecta o acúmulo de produtos oxidados
fluorescentes. As frações particuladas dos tecidos foram incubadas em tampão fosfato
de sódio 150 mM, pH 7,4; contendo superóxido dismutase (100 U/ml; Sigma),
peroxidase de raiz forte (0,5 U/ml; F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Suíça), Amplex
red (50 µM; Molecular Probes, Inc. Eugene, OR, EUA), 1 mM de EGTA, na presença
ou na ausência de CaCl2 (0,5 mM) e a fluorescência emitida foi medida imediatamente
no leitor de microplacas (Victor3, Perkin Elmer, Waltham, MA, EUA) utilizando os
comprimentos de onda de excitação em 530 nm e emissão em 595 nm. Para
determinação da atividade específica da DUOX, a atividade geradora de H 2O2 obtida
na presença de cálcio foi subtraída da atividade na ausência de cálcio (FORTUNATO
et al., 2010). O resultado desta subtração relacionado à concentração de proteína na
amostra.
Análises espectrofotométricas relacionadas à homeostase redox
Preparo do homogenato
Cada 100 mg de tecido foi homogeneizado em 900 µL de tampão (Tris-HCl
10mM, NaCl 0,9% (p/v), pH 7.4, utilizando o homogeneizador ultra-turrax (Jamke &
Kunkel IKA – Labortechnik Alemanha) a temperatura de 4 oC, posteriormente, foram
centrifugadas por 10 minutos na velocidade de 720g a 4oC e o sobrenadante utilizado
na medida das atividades enzimáticas. A dosagem de proteínas de cada amostra foi
realizada pelo método de Bradford (BRADFORD, 1976).
As atividades das diversas enzimas foram determinadas através de medidas
de absorção de luz utilizando um espectrofotômetro GBC 920 UV-Vis (GBC Scientific
Equipament, Austrália). Além disso, alíquotas desses homogenatos também foram
utilizadas para a quantificação de grupamentos tióis no espectofotômetro (UV-1800
Spectophotometer, Shimadzu Coorporation, Kyoto, Japan). Todos os ensaios das
atividades enzimáticas foram conduzidos na temperatura fisiológica dos animais
80
(37oC) e expressas em unidades (micromoles de substrato consumido oxidado ou
reduzido, conforme o caso, por minuto) por miligrama de proteína.
Determinação da atividade da catalase
A atividade da catalase foi mensurada através da degradação de peróxido de
hidrogênio (H2O2) do meio, utilizado para a formação de água e oxigênio, conforme
descrito por Aebi (AEBI, 1984). O controle experimental consistiu na avaliação da
diminuição da absorção de luz em 240 nm do meio de reação: tampão fosfato de
potássio 50 mM pH 7.0; triton X-100 0,002%; EDTA 0,1 mM; peróxido de hidrogênio
15 mM, sendo o volume final da reação de 1 mL, durante cerca de 1,5 minutos. Em
seguida foi adicionado homogenato de pulmão (aproximadamente 80 µg de proteína)
e a absorção de luz continuou sendo acompanhado por mais 2,5 minutos. A atividade
da catalase foi obtida através da diferença entre a taxa de diminuição da absorbância,
com e sem amostra. Foi calculada através da quantidade de H 2O2 consumido por
minuto, utilizando o coeficiente de extinção molar do H2O2 (43,6 M-1/cm). A atividade
da enzima foi expressa em unidades (micromoles de H2O2 consumido por minuto) por
miligrama de proteína.
Determinação da atividade da superóxido dismutase (SOD)
A atividade total da SOD foi determinada conforme o método descrito
anteriormente (CRAPO et al., 1977). Neste método, o superóxido (O2•-) gerado a partir
de um sistema xantina-xantina oxidase (X-XO), reduz o citocromo C gerando um
aumento na absorção de luz em 550 nm. A adição de homogenato, contendo SOD,
dismuta o O2•- em peróxido de hidrogênio (H2O2) impedindo que o citocromo C seja
reduzido. O meio de reação foi composto por tampão fosfato de potássio 50 mM (pH
8.0) e EDTA 0,1 mM, contendo cianeto de potássio 0,01 mM; citocromo C 0,02 mM e
xantina 0,05 mM, o volume final da reação foi de 1 mL. A reação do controle foi
disparada adicionando xantina oxidase (concentração final 8 mU/mL) ao meio de
reação, avaliando a redução do citocromo C através do aumento da absorção de luz
em 550 nm por cerca de 1,5 minutos. Em seguida foi adicionado cerca de 10 µg de
proteína da amostra e a redução do citocromo C continuou sendo mensurada por mais
3,5 minutos. A atividade da SOD foi obtida através da diferença da diminuição da
redução de citocromo C, observada quando o homogenato foi adicionado ao sistema
X-XO. A diminuição de 50% da taxa de redução do citocromo C representou uma
81
unidade de SOD. A atividade total da SOD foi expressa em unidade por miligrama de
proteína.
Determinação da atividade da glutationa peroxidase (GPx)
A atividade da GPx foi mensurada pela conversão do peróxido em água
oxidando a glutationa (GSH) em glutationa oxidada (GSSG). A GSSG é reduzida a
GSH pela enzima glutationa redutase (GR), à custa da oxidação do NADPH em NADP
(FLOHÉ; GÜNZLER, 1984). A diminuição da absorção de luz em 340 nm promovida
pela oxidação de NADPH foi avaliada durante 5 minutos no meio de reação, que serviu
de controle do experimento. A composição do meio da reação consistiu em: tampão
fosfato de potássio 100 mM, EDTA 1 mM (pH 7.0), NADPH 0,15 mM, glutationa
reduzida (GSH) 0,5 mM, glutationa redutase (GR) 240 U/mL e hidroperóxido de tercbutil 600 nM, sendo o volume de cada reação de 1 mL. Em seguida, foi adicionado
homogenato de pulmão (aproximadamente 50 µg de proteína) e a oxidação do
NADPH foi monitorada por 5 minutos. A atividade da GPx foi calculada subtraindo a
taxa de oxidação do NADPH obtida, com e sem homogenato (obtida através de
regressão linear). O coeficiente de extinção milimolar do NADPH (6,22 mM-1/cm) foi
utilizado na determinação da atividade da GPx e esta foi expressa em unidades por
miligrama de proteína. Uma unidade representará 1 micromol de NADPH oxidado por
minuto.
Determinação dos níveis de grupamentos tióis
A quantificação do conteúdo total de grupamentos tióis tecidual foi feita através
de ensaio espectrofotométrico, avaliando a quantidade de luz absorvida em 412 nm,
conforme descrito por Sedlak & Lindsay (SEDLAK; LINDSAY, 1968). Nesse método
os grupamentos tióis reduzidos presentes no homogenato, interagem com o reagente
de Ellman (5,5’-dithio-bis-(2-ácido nitrobenzóico) ou DTNB) reduzindo-o e gerando um
produto de coloração amarelada, capaz de ser lido em espectofotômetro. Quanto
maior absorção de luz, maior a quantidade (moles) de DTNB reduzido, refletindo a
maior a quantidade de tióis reduzidos no homogenato (FORTUNATO et al., 2013).
O controle experimental de cada amostra consistiu no meio de reação sem
adição de DTNB (150 µL de TRIS 200 mM + EDTA 20 mM pH 8.2; 150 µg de proteína;
avolumar para 1 mL com metanol absoluto). Esta absorbância foi subtraída
posteriormente dos valores obtidos nos eppendorfs contendo meio de reação com
82
DTNB (150 µL de TRIS 200 mM + EDTA 20 mM pH 8.2; cerca de 150 µg de proteína;
10 µL de DTNB 10 mM - diluído em metanol absoluto em um volume de1 mL). O meio
de reação com e sem DTNB foi incubado por 15 minutos em temperatura ambiente
(25ºC). Em seguida foram centrifugados a 3000g por 15 minutos em temperatura
ambiente. O sobrenadante foi utilizado para estimar o conteúdo de tiol tecidual,
através da quantidade de luz absorvida em 412 nm. O coeficiente de extinção molar
do DTNB (13600 M-1/cm) foi utilizado para calcular a quantidade de moles de DTNB
reduzidos em cada amostra. O conteúdo celular de tiol foi expresso em nanomoles de
DTNB reduzido/miligrama de proteína.
5.5.4. Apoptose
A imunohistoquímica para caspase-3 ativada foi feita utilizando a caspase-3
ativa-biotinilada (Clone C92-605, catálogo 550557 e diluição 1:20) anticorpo
monoclonal de coelho (BD Biosciences, New Jersey, EUA), tal como recomendado
pelo fabricante. Lâminas embebidas em parafina foram desparafinadas e hidratadas.
A imunocoloração foi realizada de acordo com uma técnica de peroxidase de
estreptavidina-biotina, pela incubação com solução de Estreptavidina-Horseradish
peroxidase
(HRP)
(Vector
Laboratories,
Burlingame,
Califórnia,
EUA).
A
imunorreatividade foi visualizada após incubação com preparado recente de 3,3’diaminobenzidina (Dako Dinamarca, Glostrup, Dinamarca). As lâminas foram contra
coradas com hematoxilina de Harris. A peroxidase endógena de tecido pulmonar foi
bloqueada com 3% de peróxido de hidrogênio, durante 15 minutos no escuro, antes
da exposição aos anticorpos primários. Os controles negativos foram realizados pela
omissão do anticorpo primário. As lâminas foram cobertas com Entellan (Merck,
Darmstadt, Alemanha) e analisadas por microscopia óptica (CHAVES et al., 2009).
As avaliações do número de células em apoptose por imunohistoquímica
(caspase-3 ativada) foram realizadas utilizando imagens de alta qualidade capturadas
obtidas por meio de um sistema de análise de imagem composta de uma câmera
digital (Evolution, Media Cybernetics, Silver Spring, MD, EUA) acoplado a um
microscópio de luz (Eclipse 400, Nikon, Tokyo, Japão) e o programa Image-Pro Plus
Software 4.5.1 (Media Cybernetics, Rockville, MD, EUA). Em cada grupo, 25
fotomicrografias de alta resolução foram obtidas utilizando ampliação de 400x a partir
de áreas que contêm a maior quantidade de células (hot spot), e os núcleos reativos
para a caspase-3 clivada foram contados manualmente em todas as imagens
83
captadas. Os núcleos reativos foram considerados como aqueles que tiveram a cor
acastanhada independente da intensidade. Células negativas permaneceram na
tonalidade azulada devido à coloração pela hematoxilina de Harris. A razão entre a
quantidade de células positivas e o total de células foi calculado para cada um dos 20
campos microscópicos. A mediana, a amplitude interquartil (25-75%), e a interdecil
(10-90%) foram calculadas a partir destas 25 razões para caspase-3 clivada. As
lâminas foram avaliadas às cegas por dois investigadores que desconhecem a origem
do material a ser examinado. As lâminas foram codificadas e examinadas apenas ao
final de todas as medições.
5.6. Análise estatística
Para cada protocolo, foram realizados testes de acordo a característica da
amostra.
Inicialmente, os dados vitais (peso e idade) dos animais foram submetidos à
verificação de sua distribuição pelo teste da normalidade de D’Agostino e Pearson.
Para a análise da curva de sobrevida, foi aplicado o Teste do logrank de MantelCox seguindo por um teste do qui-quadrado.
Para o protocolo II, foi testada a normalidade dos dados pelo teste de
Kolmogorov-Smirnov com correção de Lilliefors e a homogeneidade de variâncias pelo
teste da mediana de Levene. Quando ambas as condições foram satisfeitas, foi
aplicado o ANOVA unidirecional, seguido do teste Tukey para comparações múltiplas.
Quando uma das condições acima não foi satisfeita, foi utilizado o ANOVA não
paramétrico de Kruskal-Wallis, seguida pelo teste de Dunn.
O teste t não pareado foi utilizado para comparar cada grupo de exposição
separadamente com o grupo de controle ou entre si.
Os valores finais são expressos como média ± erro padrão da média (EPM).
Em todos os testes, o nível de significância considerado foi de 5% (p<0,05).
Para a realização dos testes estatísticos foi utilizado o software comercial
GraphPad Prism v.6.01 (GrapHHAd Software, Inc. San Diego, CA).
84
85
RESULTADOS
“Fazer, todos os dias, as mesmas coisas
e esperar resultados diferentes é a maior
prova de insanidade.”
Albert Einstein
6
Resultados, 87
6.1
Protocolo I, 87
6.1.1
Curva de Sobrevida Presuntiva, 87
6.1.2
Concentração Letal Mediana, 89
6.2
Protocolo II, 90
6.2.1
Mecânica Pulmonar, 90
6.2.2
Análise anatomopatológica, 91
6.2.2.1 Análise Qualitativa, 91
6.2.2.2 Análise Quantitativa, 93
6.2.3
Atividade redox, 94
6.2.3.1 Geração de H2O2, 94
6.2.3.2 Atividade de enzimas antioxidantes, 95
6.2.3.3 Medidas de estresse oxidativo – tiol, 96
6.2.4
Apoptose, 97
6.2.4.1 Análise qualitativa, 97
6.2.4.2 Análise quantitativa, 98
6.3
Protocolo III, 99
6.3.1
Mecânica Pulmonar, 99
6.3.2
Análise anatomopatológica, 100
6.3.2.1 Análise Qualitativa, 100
6.3.2.2 Análise Quantitativa, 102
6.3.3
Atividade redox, 103
6.3.3.1 Geração de H2O2, 103
6.3.3.2 Atividade de enzimas antioxidantes, 104
6.3.3.3 Medidas de estresse oxidativo – tiol, 105
6.3.4
Apoptose, 106
6.3.4.1 Análise qualitativa, 106
6.3.4.2 Análise quantitativa, 107
86
87
6 RESULTADOS
6.1. PROTOCOLO I
6.1.1. Curvas de Sobrevida Presuntiva
No intuito de se avaliar o comportamento tóxico do oxigênio e desenvolver uma
curva de sobrevida presuntiva para dela se extrair a CL50, 45 camundongos (nove por
grupo) foram submetidos ao primeiro protocolo de experimento.
Obteve-se uma mortalidade significativa e proporcional à pressão ambiental de
exposição. A mortalidade nos grupos foi analisada através do teste D’Agostino e
Pearson que resultou em uma mortalidade com distribuição normal. No entanto, a
mortalidade entre os grupos mostrou uma diferença estatisticamente significante (p<
0,01). Os valores de sobrevida dos camundongos do experimento estão mostrados
na tabela 2.
Tabela 2. Tempo de sobrevida dos camundongos expostos à atmosfera com oxigênio a 100% em
diferentes pressões ambientais absolutas (tempo em min).
Grupos
Animal
1
1 ATA
1,5 ATA
2,5 ATA
3 ATA
2884
2 ATA
Tempo (min)
1432
4688
2
3
4
5
6
7
8
9
3444
4581
3846
4110
4189
4527
4597
4670
904
730
3032
2732
2650
2228
2220
1165
1175
1975
1520
1505
840
792
1007
750
680
732
961
967
713
629
617
364
406
408
701
525
401
263
144
364
325
390
Média ± EPM
4295 ± 144
2229 ± 230,1
1029 ± 118,5
663 ± 80,4
427 ± 64,5
Os valores representam o tempo em minuto para cada animal. A média é apresentada acompanhada pelo Erro
Padrão da Média (EPM). ATA, Atmosfera Absoluta.
Na figura 14, são apresentadas as curvas de sobrevida presuntiva dos
camundongos submetidos às diferentes pressões atmosféricas absolutas em um
ambiente com oxigênio a 100%. Foi possível ajustar uma equação polinomial de
terceira ordem com um desvio quadrático próximo de um (R2 = 0,9994), conforme
mostrada a seguir:
𝑦 = −490,67𝑥 3 + 4228𝑥 2 − 12467𝑥 + 13035
(2)
88
9000
y = -490,67x3 + 4228x2 - 12467x + 13035
R² = 0,9994
Tempo de sobrevida (min)
8000
7000
6000
5000
4000
3000
2000
1000
0
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
Pressão Parcial do O2 (ata)
Figura 14. Curva de distribuição do tempo de sobrevida presuntiva em ambiente hiperóxico. O gráfico
mostra (marcadores) o decréscimo da taxa de sobrevida dos camundongos submetidos a diferentes
níveis de pressão ambiental, inalando oxigênio puro (100%). O tempo de sobrevida está expresso em
minutos. Atmosfera Absoluta - ata. Curva tracejada representa a curva de tendência ajustada a uma
equação polinomial de terceiro grau com seu respectivo desvio quadrático (R2) (área do gráfico). No
gráfico menor, os mesmos valores plotados com o desvio padrão assinalado.
Na figura 13, são apresentadas as curvas de sobrevida presuntiva estimada
pelo método não paramétrico de Kaplan-Meier dos camundongos submetidos a
diferentes níveis de pressão ambiental mantidos inalando oxigênio puro (100%). Os
animais expostos a 3 ata apresentaram a maior taxa de mortalidade em menor tempo
(curva marrom). A mortalidade entre todos os grupos se mostrou proporcional ao
tempo de exposição e com diferença estatisticamente significante (p < 0,01, teste de
log-rank [Mantel-Cox]). O mínimo de sobrevida presuntiva foi obtido no grupo 3ATA,
com 144 minutos (2h24min). Já o tempo máximo de sobrevida foi alcançado no grupo
1ATA, com a duração de 4.688 minutos (78h8min). Por fim, nota-se que o maior
aumento da taxa de sobrevida presuntiva ocorreu entre o grupo de 1,5ATA e 1ATA,
com 412 minutos sem animais mortos, podendo ser visualizado tanto da figura 14
acima, quanto na figura 15, a seguir.
89
1 ATA
100
S o b r e v id a ( % )
1 .5 A T A
2 ATA
2 .5 A T A
3 ATA
50
0
0
20
40
60
80
100
T e m p o (h )
Figura 15. Curvas de sobrevida presuntiva estimada pelo método não paramétrico de Kaplan-Meier
dos camundongos submetidos a diferentes níveis de pressão ambiental inalando oxigênio puro (100%).
Todos os grupos foram diferentes quando comparados entre si (p<0,0001, teste de log-rank [MantelCox]), demonstrando relação direta entre o maior tempo de sobrevida e a pressão ambiental a qual os
animais foram submetidos. ATA, atmosfera absoluta. n de cada grupo = 9.
6.1.2. Concentração Letal Mediana
Utilizando-se os resultados das curvas de sobrevida, obteve-se a estimativa
dos parâmetros de uma distribuição de tolerâncias individuais culminando com uma
dose letal mediana (CL50). Estes valores foram encontrados realizando-se uma análise
probit (FINNEY, 1952).
Com os valores da CL50 obtidos, doses intermediárias foram tituladas até que
a mortalidade não ultrapassasse 2% e fosse suficiente para obter-se efeito, sem uma
mortalidade elevada. Testou-se 80% da CL50, porém a mortalidade continuava alta,
passando em seguida para 60% da CL50. No entanto, apenas com 50% da CL50 foi
obtida mortalidade aceitável em todos os grupos. Na Tabela 3, apresenta-se a CL50,
em horas de exposição, obtida após análise probit das tolerâncias individuais de cada
grupo, como também seu intervalo confiança (IC) de 95%. Com o uso de 50% desta
dose, permitiu-se a observação da intoxicação dos animais, sem uma mortalidade
elevada.
90
Tabela 3. CL50 e tempo de exposição.
Grupos
1ATA
1,5ATA
2ATA
2,5ATA
3ATA
CL50 (h)
70,3
33,1
15,2
9,7
5,9
IC de 95% (h)
67,6-73,2
28,7-38,2
13,3-17,4
8,3-11,3
4,9-7,2
50% CL50 (h)
35,2
16,6
7,6
4,8
3,0
35h12min
16h36min
7h36min
4h48min
3h
Tempo de exposição
CL50: concentração letal mediana; IC: Intervalo de Confiança; ATA: atmosfera absoluta.
Fonte: fichas de registro do estudo.
6.2. PROTOCOLO II
6.2.1. Mecânica Pulmonar
Na figura 14 estão representados os valores dos parâmetros da mecânica
respiratória pela técnica de oscilação forçada (TOF) de banda larga. São mostrados
os valores em formato gráfico da resistência newtoniana (Rn) (figura 16-A), resistência
tecidual (G) (figura 14-B), elastância tecidual (H) (figura 14-C) e histeresividade (η
(figura 14-D) após serem medidos usando uma perturbação prime-8. São mostradas
as médias de cada grupo experimental e do grupo controle. As medidas foram
realizadas após a exposição dos animais a 50% da CL50 para cada pressão ambiental.
Houve diferença estatisticamente significativa entre os grupos 1ATA e os demais
grupos no parâmetro Resistência Tecidual (G) e entre o 1ATA e o CTRL no parâmetro
de Elastância tecidual (H).
91
A.
B.
p = 0 .0 0 0 7
p = 0 .0 0 5
p = 0 .0 0 7
10
1 .0
p = 0 .0 2
p = 0 .0 2
8
80
L
R
A
T
T
C
3
2
2
,5
A
A
A
,5
1
1
T
A
T
A
A
T
C
D.
2
3
T
R
A
A
A
,5
A
2
,5
1
T
T
A
T
T
A
T
A
1
C.
T
0
L
0 .0
A
2
A
0 .2
A
4
A
0 .4
6
A
G (c m H 2 O /m L )
0 .6
A
R n (c m H 2 O .s /m L )
0 .8
0 .2 0
p = 0 .0 0 9
L
R
C
T
T
A
3
A
2
,5
A
2
A
A
T
A
T
T
A
A
1
T
C
T
R
A
A
3
A
2
,5
T
T
A
A
2
,5
1
T
T
A
T
A
1
,5
0 .0 0
L
0
A
0 .0 5
A
20
A
0 .1 0
1
40
A
 ( G /H )
0 .1 5
A
H (c m H 2 O /m L )
60
Figura 16. Parâmetros da mecânica respiratória pela técnica de oscilação forçada de banda larga
(TOF). A. A Resistência das Vias Aéreas centrais (Rn), B. resistência tecidual (G), C. elastância do
tecido (H) e D. histeresividade dos tecidos (η), que representa a relação G/H foram medidos usando
uma perturbação prime-8. Os valores representam a média e o erro padrão da média (n=5/grupo). As
diferenças entre os grupos são indicadas por linhas horizontais, sobre as quais podem ser encontrados
os respectivos valores de p (<0,05, ANOVA).
6.2.2. Análise Anatomopatológica
Visando fundamentar os achados funcionais e avaliar o comprometimento
tecidual seguido à oxigenação hiperbárica nas diferentes pressões de exposição,
foram realizadas análises qualitativas e quantitativas no tecido pulmonar.
6.2.2.1.
Análise Qualitativa
A figura 17 apresenta cortes histológicos da região dorsal pulmonar esquerda
representativos de um animal por grupo, incluindo o grupo controle (CTRL). Pode-se
notar que a exposição ao ambiente com oxigênio hiperbárico provocou inflamação do
parênquima pulmonar, evidenciada pela presença de infiltrado celular, espessamento
de septo por edema alveolar, colapso alveolar, hepatização e desestruturação do
parênquima pulmonar nos grupos com maior tempo de exposição (1ATA, 1,5ATA e 2
ATA), porém mais sutis nos demais grupos (2,5ATA e 3ATA). Observam-se nos
92
pulmões áreas de colapso e consolidações, predominantemente, nos grupos com
maior tempo de exposição (1ATA e 1,5ATA), já no grupo 3ATA apresenta parênquima
mais próximo ao normal, a zona de transição entre as áreas de consolidação e normal,
sofre alto estresse mecânico, podendo ocorrer rupturas de septos alveolares. Essas
alterações estruturais importantes não foram visualizadas no grupo CTRL.
Figura 17. Fotomicrografias de parênquima pulmonar esquerdo (200x) coradas com hematoxilinaeosina. Grupo 1ATA, 1,5ATA, 2ATA, 2,5ATA e 3ATA representam os grupos expostos ao oxigênio puro
em ambiente hiperbárico com pressões ambientais assinaladas no nome do grupo. CTRL, grupo
controle. Círculo, colapso alveolar; seta azul, espessamento septal; seta preta, infiltrado celular; estrela,
área hepatizada.
93
6.2.2.2. Análise Quantitativa
As figuras 18 e 19 apresentam as análises histológicas quantitativas do
parênquima pulmonar dos animais dos grupos 1ATA, 1,5ATA, 2ATA, 2,5ATA e 3ATA
comparando-os com o grupo CTRL.
A análise quantitativa da morfometria do parênquima alveolar revelou um maior
percentual de áreas colapsadas e consequente redução das áreas normais nos
grupos expostos à atmosfera normobárica (1ATA) em comparação com o grupo 2ATA.
A lv é o lo s c o la p s a d o s ( % )
Não houve diferença entre os demais grupos (figura 16).
100
p = 0 ,0 1
80
60
40
20
C
T
R
T
A
3
A
2
,5
L
A
A
T
A
T
A
2
,5
1
1
A
A
T
T
A
A
0
Figura 18. Fração de área de alvéolos colapsados no parênquima pulmonar. Os valores representam
a média e o erro padrão da média (n=5/grupo). As diferenças entre os grupos são indicadas por linhas
horizontais, sobre as quais podem ser encontrados os respectivos valores de p (<0,05, ANOVA).
Adicionalmente, foi contabilizada a quantidade de células inflamatórias
polimorfonucleares (PMN) nos alvéolos e septos alveolares, que se mostrou maior nos
grupos com maior tempo de exposição ao oxigênio hiperbárico em comparação ao
grupo CTRL (figura 19). As análises de morfometria e densidade de superfície foram
medidas a partir de um corte histológico do pulmão esquerdo de cada animal,
transversal, a altura da região média.
94
p = 0 ,0 0 0 9
p = 0 ,0 0 8
p = 0 ,0 2
p = 0 ,0 1
p = 0 ,0 2
2
c é lu la s P M N ( x 1 0 /µ m )
0 .0 1 0
3
0 .0 0 8
0 .0 0 6
0 .0 0 4
0 .0 0 2
C
T
R
T
A
3
A
2
,5
L
A
A
T
A
T
A
2
,5
1
1
A
A
T
T
A
A
0 .0 0 0
Figura 19. Células polimorfonucleares (PMN). Os valores representam a média e o erro padrão da
média (n=5/grupo). As diferenças entre os grupos são indicadas por linhas horizontais, sobre as quais
podem ser encontrados os respectivos valores de p (<0,05, ANOVA).
6.2.3. Homeostase redox
No intuito de avaliar a presença de estresse e dano oxidativos após exposição
à hiperóxia hiperbárica com diferentes pressões ambientais, foram realizadas a
quantificação da produção de peróxido de hidrogênio (H2O2), a atividade das enzimas
antioxidantes catalase, superóxido dismutase (SOD) e glutationa peroxidase (GPx),
bem como demonstração de estresse oxidativo demonstrado pelo a formação de
pontes dissulfeto (-SS-) nas proteínas portadoras de grupamento tiol (-SH).
6.2.3.1. Geração de H2O2
A figura 20 apresenta a geração de H2O2 total na ausência e na presença de
cálcio, para a determinação da atividade específica da DUOX. Não foram observadas
alterações significativas no tecido pulmonar ao comparamos os grupos entre si e com
o CTRL.
95
B.
R
A
C
3
A
T
T
A
T
A
,5
2
A
,5
1
1
L
-1 0
CTRL
A
3ATA
T
2 ,5 A T A
A
2ATA
T
1 ,5 A T A
-5
A
1ATA
0
A
0
5
2
20
10
A
40
15
T
60
n m o l H 2 O 2 /h /m g p r o t e ín a
n m o l H 2 O 2 /h /m g p r o te ín a
A.
Figura 20. Geração de H2O2 do pulmão dos animais expostos a diferentes condições de hiperóxia
hiperbárica comparadas com o grupo CTRL. A. Geração de H2O2 sem adição de cálcio. Os valores
representam a média e o erro padrão da média (n=5/grupo). B. Geração de H2O2 por DUOX dependente
de cálcio. Os valores representam a mediana (segmento de reta), quartis 25 e 75 (box) e limite de 5 e
95% (barras) de cada grupo (5 animais por grupo).
6.2.3.2. Atividade de enzimas antioxidantes
Visando avaliar o equilíbrio entre oxidantes e antioxidantes nos tecidos após
exposição à hiperóxia hiperbárica, foram realizados ensaios bioquímicos para medida
da atividade das enzimas antioxidantes e de marcadores de dano oxidativo.
A figura 21 apresenta a atividade das enzimas antioxidantes no pulmão. Em
relação à atividade da Catalase e da GPx não encontramos diferenças entre os grupos
de hiperóxia e o controle. No entanto, a atividade da SOD foi maior nos grupos com
maior valor de pressão ambiental em relação ao controle. Os grupos 2,5ATA e 3ATA
foram diferentes estatisticamente em relação CTRL.
Já os grupos com maiores tempos de exposição, porém com menor pressão
ambiental (1ATA e 1,5ATA) apresentaram uma atividade bem diversa dos demais
grupos.
96
B.
1 .0
0 .4
0 .2
300
m g p r o te ín a /m in
A tiv id a d e d e G P x
0 .6
 m o l N A D P H o x id a d o /
400
0 .8
(U /m g p r o te ín a )
A tiv id a d e d a C a ta la s e
A.
200
100
0
0 .0
1ATA
1 .5 A T A
2ATA
2 .5 A T A
3ATA
1ATA
CTRL
C.
1 .5 A T A
2ATA
2 .5 A T A
3ATA
CTRL
p = 0 ,0 4
25
p = 0 ,0 2
p = 0 ,0 0 0 9
p = 0 ,0 0 3
(U /m g p r o te ín a )
A tiv id a d e d a S O D
20
p = 0 ,0 0 1
p = 0 ,0 4
15
10
5
0
1ATA
1 ,5 A T A
2ATA
2 ,5 A T A
3ATA
CTRL
Figura 21. Atividade das enzimas antioxidantes. A. Catalase. B. Glutationa peroxidase (GPx). C.
Superóxido Dismutase (SOD). Os valores representam a média e o erro padrão da média (n=5/grupo).
As diferenças entre os grupos são indicadas por linhas horizontais, sobre as quais podem ser
encontrados os respectivos valores de p (<0,05, ANOVA). U, unidade. NADPH, fosfato de dinucleotídeo
de nicotinamida e adenina.
6.2.3.3. Níveis de grupamento tiol livre
Para avaliar a ocorrência de dano oxidativo foram quantificados os níveis de
grupamento tiol reduzido. A figura 22 representa a quantificação dos grupamentos tióis
reduzidos nos homogenatos de pulmão. O grupo 1 ATA evidenciou menor quantidade
de formação de grupamentos tiol quando comparado com os grupos 2ATA e 2,5ATA,
sendo esta diferença estatisticamente significante. Não houve diferença entre os
demais grupos.
 m o l D T N B r e d u z id a /m g p r o te ín a
97
0 .2 0
p = 0 ,0 0 2
p = 0 ,0 4
0 .1 5
0 .1 0
0 .0 5
0 .0 0
1AT A
1 ,5 A T A
2AT A
2 ,5 A T A
3AT A
C T RL
Figura 22. Quantificação dos grupamentos tióis no homogenato pulmonar. Os valores representam a
média e o erro padrão da média (n=5/grupo). As diferenças entre os grupos são indicadas por linhas
horizontais, sobre as quais podem ser encontrados os respectivos valores de p (<0,05, ANOVA).
6.2.4. Apoptose
Visando fundamentar os achados funcionais e avaliar o comprometimento
tecidual seguido à oxigenação hiperbárica nas diferentes pressões de exposição,
foram realizadas análises qualitativas e quantitativas no tecido pulmonar a fim de
verificar se houve estímulo à apoptose celular.
6.2.4.1.
Análise Qualitativa
A figura 23 apresenta cortes histológicos do pulmão esquerdo corados para
imuno-histoquímica da caspase-3 ativada (+Casp3) representativos de um animal por
grupo, incluindo o grupo controle (CTRL). O grupo CTRL mostra fraca
imunoreatividade para a Caspase-3 enquanto os grupos 1ATA, 1,5ATA e 3ATA
mostram grande sensibilidade à imunomarcação para caspase-3.
98
Figura 23. Fotomicrografias de parênquima pulmonar esquerdo, aumento de 400x coradas com
hematoxilina de Harris e com imuno-histoquímica para caspase-3 ativada. Grupo 1ATA, 1,5ATA, 2ATA,
2,5ATA e 3ATA representam os grupos expostos ao oxigênio puro, em ambiente hiperbárico, com
pressões ambientais assinaladas no nome do grupo. CTRL, grupo controle. Os núcleos castanhos
foram considerados como imunorreagentes para a caspase-3 ativada.
6.2.4.2.
Análise Quantitativa
A figura 24 apresenta os valores das células positivas para imuno-histoquímica
da caspase-3 ativada (+Casp3), demonstrando que os pulmões dos animais do grupo
1ATA, 1,5ATA e 3ATA apresentaram maior número de células positivas que os
animais dos grupos CTRL, 2ATA e 2,5ATA.
99
p = 0 .0 0 0 6
p = 0 .0 3
p = 0 .0 0 0 3
0 .3
p = 0 .0 2
p = 0 ,0 0 0 0 0 0 6
C a s p a s e - 3 a t iv a d a
( c é l u la s p o s i t i v a s / t o t a i s
p = 0 ,0 0 0 0 0 0 7 p = 0 ,0 0 0 0 0 0 1
p = 0 .0 0 4
p = 0 .0 0 2
0 .2
0 .1
L
A
R
T
C
A
3
2
,5
T
T
A
A
T
A
2
,5
1
1
A
A
T
T
A
A
0 .0
Figura 24. Quantificação da expressão de caspase-3 ativada. Grupo 1ATA, 1,5ATA, 2ATA, 2,5ATA e
3ATA representam os grupos expostos ao oxigênio puro, em ambiente hiperbárico, com pressões
ambientais assinaladas no nome do grupo. CTRL, grupo controle. Os valores representam a média e o
erro padrão da média (n=5/grupo). As diferenças entre os grupos são indicadas por linhas horizontais,
sobre as quais podem ser encontrados os respectivos valores de p (<0,05, ANOVA).
6.3 PROTOCOLO III
6.3.1. Mecânica Pulmonar
Na figura 25 estão representados os valores dos parâmetros da mecânica
respiratória pela técnica de oscilação forçada (TOF) de banda larga. São mostrados
os valores em formato gráfico da resistência newtoniana (Rn), resistência tecidual (G),
elastância tecidual (H) e histeresividade (η) após serem medidos usando uma
perturbação prime-8.
Os parâmetros são mostrados para cada animal individual dos grupos
experimentais e dos animais do grupo controle. As medidas foram realizadas após a
exposição dos animais a 50% da CL50 para cada pressão ambiental. Foi observado
uma maior resistência de vias aéreas nos grupos 3ATA e HIPEROX em relação ao
CTRL e esta diferença foi estatisticamente significante. Além disso, a resistência
tecidual foi maior no grupo 3ATA quando comparado aos outros grupos. Não foram
observadas alterações nos parâmetros elastância e histeresividade.
100
A.
B.
4
p = 0 ,0 0 1
1 .0
p = 0 ,0 0 0 1
p = 0 ,0 1 8 2 7
p = 0 .0 3
p = 0 ,0 4
3
G (c m H 2 O /m L )
R n (c m H 2 O .s /m L )
0 .8
0 .6
0 .4
2
1
0 .2
T
A
C
B
R
R
E
H
IP
E
IP
R
R
X
T
A
3
C
E
IP
H
H
H
O
A
L
T
A
B
R
R
E
IP
R
R
X
O
A
T
A
3
C.
D.
0 .1 5
20
0 .1 0
R
T
IP
E
C
B
A
R
R
X
O
A
T
A
3
R
H
H
IP
E
C
T
A
B
R
R
E
IP
H
R
R
X
O
T
A
3
E
0 .0 0
IP
0
H
0 .0 5
L
10
L
 (G /H )
30
A
H (c m H 2 O /m L )
L
0
0 .0
Figura 25. Parâmetros da mecânica respiratória pela técnica de oscilação forçada de baixa frequência
(TOF). A. A resistência das vias aéreas centrais (Rn); B. resistência tecidual (G); C. elastância do tecido
(H); D. histeresividade dos tecidos G/H (η), foram medidos usando uma perturbação prime-8. Os
valores representam a média e o erro padrão da média (n=5/grupo). As diferenças entre os grupos são
indicadas por linhas horizontais, sobre as quais podem ser encontrados os respectivos valores de p
(<0,05, ANOVA).
6.3.2. Análise Anatomopatológica
Visando fundamentar os achados funcionais e avaliar o comprometimento
tecidual seguido à oxigenação hiperbárica nas diferentes pressões de exposição,
foram realizadas análises qualitativas e quantitativas no tecido pulmonar.
6.3.2.1
Análise Qualitativa
A figura 26 apresenta os cortes histológicos do pulmão esquerdo
representativos de um animal por grupo, incluindo o grupo controle (CTRL). Pode-se
notar que a exposição ao ambiente hiperóxico normobárico (HIPEROX) provocou
inflamação do parênquima pulmonar, evidenciada pela presença de infiltrado celular,
espessamento de septo por edema alveolar, colapso alveolar, hepatização e
101
desestruturação do parênquima pulmonar. Já os grupos 3ATA e HIPERBAR
apresentam parênquima mais próximo ao normal. Essas alterações estruturais
importantes não foram visualizadas no grupo CTRL.
Figura 26. Fotomicrografias de parênquima pulmonar esquerdo (200x) coradas com hematoxilinaeosina. 3ATA, representa o grupo exposto ao oxigênio puro com pressões ambientais de 3 ata.
HIPEROX, representa o grupo exposto a hiperóxia normobárica. HIPERBAR, representa o grupo
exposto a normóxia hiperbárica, CTRL, representa o grupo que não foi submetido a alterações
ambientais. Círculo, colapso alveolar; seta azul, espessamento septal; seta preta, infiltrado celular;
estrela, área hepatizada.
6.3.2.2. Análise Quantitativa
102
As figuras 27 e 28 apresentam as análises histológicas quantitativas do
parênquima pulmonar dos animais dos grupos 3ATA, HIPEROX, HIPERBAR
comparando-os com o grupo CTRL. Não houve diferença na análise quantitativa da
morfometria do parênquima pulmonar em relação às áreas colapsadas nos grupos
expostos à atmosfera hiperóxica hiperbárica em comparação com os grupos
HIPEROX, HIPERBAR e CTRL. Adicionalmente, foi contabilizada a quantidade de
células inflamatórias polimorfonucleares (PMN) nos alvéolos e septos alveolares, que
se mostrou maior nos grupos expostos a hiperóxia normobárica em comparação ao
grupo HIPERBAR e CTRL (figura 26). O grupo 3ATA apresentou uma maior
quantidade de PNM em relação ao grupo HIPERBAR. Portanto, os grupos expostos
ao oxigênio apresentaram uma migração celular mais proeminente. As análises de
morfometria e densidade de superfície foram medidas a partir de um corte histológico
A lv é o lo s c o la p s a d o s ( % )
do pulmão esquerdo de cada animal, transversal, a altura da região média.
80
60
40
20
L
R
C
T
R
A
B
R
E
IP
H
H
IP
E
3
R
A
O
T
X
A
0
Figura 27. Fração de área de alvéolos colapsados no parênquima pulmonar. Os valores representam a média e o
erro padrão da média (n=5/grupo). 3ATA, representa o grupo exposto ao oxigênio puro com pressões ambientais
de 3 ata. HIPEROX, representa o grupo exposto a hiperóxia normobárica. HIPERBAR, representa o grupo exposto
a normóxia hiperbárica, CTRL, representa o grupo que não foi submetido a alterações ambientais.
103
p = 0 ,0 4
p = 0 ,0 0 9
0 .0 0 8
2
C é lu la s P M N ( x 1 0 /µ m )
p = 0 ,0 0 0 4
3
0 .0 0 6
0 .0 0 4
0 .0 0 2
L
C
T
R
A
B
R
E
IP
H
H
IP
E
3
R
A
T
O
A
X
R
0 .0 0 0
Figura 28. Células polimorfonucleares (PMN). Os valores representam a média e o erro padrão da média
(n=5/grupo). As diferenças entre os grupos são indicadas por linhas horizontais, sobre as quais podem ser
encontrados os respectivos valores de p (<0,05, ANOVA). 3ATA, representa o grupo exposto ao oxigênio puro com
pressões ambientais de 3 ata. HIPEROX, representa o grupo exposto a hiperóxia normobárica. HIPERBAR,
representa o grupo exposto a normóxia hiperbárica, CTRL, representa o grupo que não foi submetido a alterações
ambientais.
6.3.3. Homeostase REDOX
No intuito de avaliar o estado redox após exposição à hiperóxia hiperbárica
entre o grupo 3ATA e os grupos controles (HIPEROX, HIPERBAR e CTRL), foram
realizadas a quantificação da produção de peróxido de hidrogênio (H2O2), a atividade
das enzimas antioxidantes catalase, superóxido dismutase (SOD) e glutationa
peroxidase (GPx), bem como a demonstração de dano oxidativo demonstrado pelo a
formação de pontes dissulfeto (-SS-) nas proteínas portadoras de grupamento tiol (SH).
6.3.3.1. Geração de H2O2
A figura 29 apresenta a geração de H2O2 total, na ausência e na presença de
cálcio, para a determinação da atividade específica da DUOX. Adicionalmente aos
achados anteriores, não observamos diferenças significativas na geração de H2O2 no
tecido pulmonar dos animais de todos os grupos.
104
A.
B.
10
n m o l H 2 O 2 /h / m g p r o t e ín a
40
20
5
0
-5
L
T
C
R
E
IP
R
R
A
B
R
A
3
H
H
E
CTRL
IP
H IP E R B A R
O
H IP E R O X
T
3ATA
X
-1 0
0
A
n m o l H 2 O 2 /h /m g p r o te ín a
60
Figura 29. Geração de H2O2 do pulmão dos animais expostos a hiperóxia hiperbárica comparada com
os grupos HIPEROX, HIPERBAR e CTRL. A. Geração de H2O2 sem adição de cálcio. Os valores
representam a média e o erro padrão da média (n=5/grupo). B. Geração de H2O2 por DUOX dependente
de cálcio. Os valores representam a mediana (segmento de reta), quartis 25 e 75 (box) e limite de 5 e
95% (barras) de cada grupo (5 animais por grupo). 3ATA, representa o grupo exposto ao oxigênio puro
com pressões ambientais de 3 ata. HIPEROX, representa o grupo exposto a hiperóxia normobárica.
HIPERBAR, representa o grupo exposto a normóxia hiperbárica, CTRL, representa o grupo que não foi
submetido a alterações ambientais.
6.3.3.2 Atividade de enzimas antioxidantes
Visando avaliar o equilíbrio entre oxidantes e antioxidantes sofrido pelos tecidos
após exposição à hiperóxia hiperbárica, foram realizados ensaios bioquímicos para
medida da atividade das enzimas antioxidantes e de marcadores de dano oxidativo.
A figura 30 apresenta a atividade das enzimas antioxidantes no pulmão. Em
relação à atividade da catalase e da GPx não foi diferente nos grupos de hiperóxia e
o controle.
No entanto, a atividade da SOD se mostrou maior nos grupos que foram
expostos ao ambiente hiperbárico, independente da exposição a normóxia ou
hiperóxia. Os grupos 3ATA, HIPEROX e HIPERBAR foram diferentes estatisticamente
em relação CTRL. As demais enzimas, não mostraram atividade diferente entre os
grupos.
105
A.
B.
400
0 .4
m g p r o te ín a /m in
A tiv id a d e d e G P x
0 .6
 m o l N A D P H o x id a d a /
0 .8
(U /m g p r o te ín a )
A tiv id a d e d a C a ta la s e
1 .0
300
200
100
0 .2
0
3 ATA
0 .0
3 ATA
H IP E R O X
H IP E R B A R
H IP E R O X
H IP E R B A R
CTRL
CTRL
C.
25
p = 0 ,0 0 0 0 0 1
p = 0 ,0 0 0 0 0 9
p = 0 ,0 0 0 0 0 4
(U /m g p r o te ín a )
A tiv id a d e d a S O D
20
15
10
5
0
3 ATA
H IP E R O X
H IP E R B A R
CTRL
Figura 30. Atividade das enzimas antioxidantes. A. Atividade da catalase. B. Atividade da glutationa
peroxidase (GPx). C. Atividade da superóxido dismutase (SOD). Os valores representam a média e o
erro padrão da média (n=5/grupo). As diferenças entre os grupos são indicadas por linhas horizontais,
sobre as quais podem ser encontrados os respectivos valores de p (<0,05, ANOVA). 3ATA, representa
o grupo exposto ao oxigênio puro com pressões ambientais de 3 ata. HIPEROX, representa o grupo
exposto a hiperóxia normobárica. HIPERBAR, representa o grupo exposto a normóxia hiperbárica,
CTRL, representa o grupo que não foi submetido a alterações ambientais. U, unidade. NADPH, Fosfato
de dinucleotídeo de nicotinamida e adenina.
6.3.3.3. Medidas de estresse oxidativo – tiol
Para avaliar a ocorrência de dano oxidativo foram quantificados os níveis de
grupamento tiol reduzido e de carbonilação de proteínas. A figura 31 representa a
quantificação dos grupamentos tióis reduzidos nos homogenatos de pulmão. Não
houve diferença significativa entre os grupos quando comparados com o grupo 3ATA.
 m o l D T N B r e d u z id a /m g p r o te ín a
106
0 .2 0
0 .1 5
0 .1 0
0 .0 5
0 .0 0
3 AT A
H IP E R O X
H IP E R B A R
C T RL
Figura 31. Medidas do dano oxidativo pela quantificação dos grupamentos tióis no homogenato
pulmonar. Os valores representam a média e o erro padrão da média (n=5/grupo).
6.3.4. Apoptose
Visando fundamentar os achados funcionais e avaliar o comprometimento
tecidual seguido à oxigenação hiperbárica nas diferentes pressões de exposição,
foram realizadas análises qualitativas e quantitativas no tecido pulmonar, a fim de
verificar se houve estímulo à apoptose celular.
6.3.4.1.
Análise Qualitativa
A figura 32 apresenta cortes histológicos do pulmão esquerdo corados para
imuno-histoquímica da caspase-3 ativada (+Casp3) representativos de um animal por
grupo, incluindo o grupo controle (CTRL). O grupo CTRL mostra fraca
imunoreatividade para a Caspase-3 enquanto os grupos 3ATA, HIPEROX e
HIPERBAR mostram grande sensibilidade à imunomarcação para caspase-3.
107
Figura 32. Fotomicrografias de parênquima pulmonar esquerdo, aumento de 400x coradas com
hematoxilina de Harris e com imuno-histoquímica para caspase-3 ativada. 3ATA, representa o grupo
exposto ao oxigênio puro com pressões ambientais de 3 ata. HIPEROX, representa o grupo exposto à
hiperóxia normobárica. HIPERBAR, representa o grupo exposto à normóxia hiperbárica, CTRL, representa
o grupo controle. Os núcleos castanhos foram considerados como imunoreagentes para a caspase-3
ativada.
6.3.4.2.
Análise Quantitativa
A figura 33 apresenta os valores das células positivas para imuno-histoquímica
da caspase-3 ativada (+Casp3), demonstrando que os pulmões dos animais do grupo
3ATA e HIPERBAR apresentaram maior número de células positivas que os animais
dos grupos CTRL e HIPEROX. O grupo CTRL mostra fraca imunoreatividade para a
Caspase-3.
108
p = 0 .0 0 0 1
0 .3
C a s p a s e - 3 a t iv a d a
( c é lu la s p o s it iv a s /to ta is
p = 0 .0 0 3
p = 0 .0 0 9
0 .2
0 .1
L
R
R
C
T
A
B
R
E
IP
H
H
IP
E
3
R
A
O
T
X
A
0 .0
Figura 33. Quantificação da expressão de caspase-3 ativada. Os valores representam a média e o erro
padrão da média (n=5/grupo). As diferenças entre os grupos são indicadas por linhas horizontais, sobre
as quais podem ser encontrados os respectivos valores de p (<0,05, ANOVA). 3ATA, representa o
grupo exposto ao oxigênio puro com pressões ambientais de 3 ata. HIPEROX, representa o grupo
exposto a hiperóxia normobárica. HIPERBAR, representa o grupo exposto a normóxia hiperbárica,
CTRL, representa o grupo que não foi submetido a alterações ambientais.
109
DISCUSSÃO
“A Natureza não faz nada inutilmente.”
Aristóteles
7.
Discussão, 111
110
111
7 DISCUSSÃO
O presente estudo mostra como foi possível validar um modelo de lesão
pulmonar pelo uso de uma câmara hiperbárica experimental para pequenos animais
em camundongos submetidos ao ambiente hiperóxico e hiperbárico. Acima de tudo,
os resultados dos experimentos desta pesquisa revelaram que a sobrevida de
camundongos em um ambiente hiperóxico hiperbárico é diretamente proporcional à
pressão parcial do gás, que nesse estudo, corresponde à pressão ambiental total da
câmara.
Além disso, demonstrou-se que o impacto do tempo de exposição é mais
importante do que a pressão parcial de O2 a que se submeteram os animais.
Configurando-se, portanto, como o resultado mais surpreendente e importante desta
investigação e será discutido em detalhes mais a diante. Alia-se a esses dados, a
confirmação do incremento do estresse oxidativo desencadeado pela exposição ao
ambiente hiperóxico hiperbárico, que aparentemente se torna mais lesivo conforme a
exposição evolui. Portanto, após as reservas antioxidantes serem sobrepujadas pelo
surgimento das ERO, culminando com o dano tecidual e evoluindo para o óbito do
animal, corroborado pelos achados histopatológicos.
Além do mais, em relação ao desenho da pesquisa, optou-se pelo
desenvolvimento de uma padronização coerente e clara, que permitisse prever o
efeito esperado pela exposição ao oxigênio hiperbárico. Para tal, o estudo se dividiu
em três fases, onde se utilizou o conhecimento de uma fase anterior para aprimorar o
raciocínio da próxima. O ponto de partida foi o encontro de uma curva de tolerância
ao gás, de acordo com cada pressão escolhida, que fosse compatível com o objetivo
da investigação.
A determinação da tolerância ao oxigênio em um animal ou no homem, exige a
informação que descreva a taxa de desenvolvimento da toxidez ao oxigênio na ordem
dos limites tóxicos de ppO2 inspirada. Esta relação entre a ppO2 inspirada e a duração
da exposição necessária para produzir o efeito tóxico foi estudada por muitos
investigadores. Embora alguns destes experimentos não estivessem diretamente
preocupados com a toxidez pulmonar pelo oxigênio, eles demonstram princípios
gerais que podem ser aplicados para todas as formas de tolerância ao mesmo. Os
índices de toxicidade usados nos vários estudos incluíram: 50% de inativação da
112
respiração de porções de cérebro de rato (DICKENS, 1946b, 1946a); bloqueio de
condução em nervo isolado de gato (PEROT JR.; STEIN, 1959); aparecimento de
convulsões em camundongos (MARSHALL; LAMBERTSEN, 1961; PIZZARELO;
SHIRCLIFFE, 1968; PREKLADOVIZKII, 1936), ratos (KIDD, 1967), coelhos
(HEDERER; ANDRÉ, 1940; PREKLADOVIZKII, 1936) e gatos (PREKLADOVIZKII,
1936) e hemólise em camundongos (MENGEL et al., 1964, 1965). Porém, a
mortalidade foi o indicador mais utilizado, desde protozoários (WILLIAMS; BEECHER,
1944), passando pela Drosophila (FENN, 1967; FENN; HENNING; PHILPOTT, 1967;
WILLIAMS; BEECHER, 1944), até chegar aos camundongos (DICKENS, 1946a,
1946b; GERSCHMAN; GILBERT; CACCAMISE, 1958; HILL; OSTERHOUT;
O’FALLON, 1968; MARSHALL; LAMBERTSEN, 1961; THOMPSON; AKERS, 1970),
ratos (ARIELI; MOSKOVITZ, 2001; JAMIESON, 1966; THOMPSON; NIELSEN;
AKERS, 1970) e coelhos (HEDERER; ANDRÉ, 1940).
Nesse sentido, buscou-se na literatura o melhor marcador de intoxicação pelo
gás oxigênio que possibilitasse vislumbrar o impacto da sua influência, que fosse
reprodutível e facilmente observável. Ao final dessa averiguação, optou-se pela
análise da sobrevida como sendo o fator ligado ao prognóstico da irreversibilidade de
lesões. Acresce-se que a sobrevida em nosso estudo, quando transformada em uma
curva, descreveu a trajetória de uma equação polinomial do terceiro grau (equação 2).
Esta equação possibilita calcular qualquer ponto na curva que poderia prever a
mortalidade com algum grau de certeza, desde que mantidos as mesmas condições
da pesquisa.
Não é inédita a ideia de obter-se uma curva ou fórmula que preveja a tolerância
ao O2. Gershman e colaboradores alcançaram curva semelhante à nossa com valores
muito próximos (GERSCHMAN; GILBERT; CACCAMISE, 1958). A possível causa da
diferença entre os dois estudos, pode advir da linhagem dos camundongos
empregados (BALB/c vs CFW, suíço de Webster), pois como já descrito, há diferenças
entre as variedades quanto a tolerância ao O2 (HILL; OSTERHOUT; O’FALLON,
1968).
Outra tentativa de prever o impacto da exposição ao O2 utilizou mergulhadores
da Marinha dos EUA, em trabalho seminal e amplo. Nele, os autores utilizaram a
Capacidade Vital (CV) como indicador de início, severidade e taxa de
desenvolvimento da intoxicação. Juntamente com as curvas de tolerância, o Dr.
Christian J. Lambertsen e colegas do Instituto de Medicina Ambiental da Universidade
113
da Pensilvânia desenvolveram o atual método de rastreamento da toxicidade
pulmonar por oxigênio na forma da dose tóxica pulmonar unitária (unit pulmonary toxic
dose, UPTD) e a dose tóxica pulmonar cumulativa (cumulative pulmonary toxic dose,
CPTD) (CLARK; LAMBERTSEN, 1970, 1971b, 1971a). A UPTD é mais comumente
referida na comunidade de mergulho como a unidade de toxicidade do oxigênio
(oxygen toxicity unit - OTU). Uma UPTD (ou OTU) é o grau de toxicidade pulmonar ao
oxigênio produzido pela respiração de O2 a 100%, continuamente, a uma pressão de
1 ata por 1 minuto. O cálculo da CPTD (equação 4) converte qualquer exposição
contínua de oxigênio (ppO2 acima de 0,5 ata) e combinação de tempo a ser expressa
como UPTD (ou OTU). O cálculo da CPTD é realizado para cada segmento do perfil
de mergulho e os resultados (expressos como OTU) são somados para produzir o
número total de OTU do mergulho:
0,5
𝑂𝑇𝑈 = 𝑡𝑥 (𝑝𝑝𝑂
)
−5
6
2 −0,5
(4)
onde tx é o tempo de exposição, ppO2 é a constante e -5/6 um expoente  0,8333.
Por conseguinte, transformar o O2 em uma droga e tratá-lo como tal é mais do
que aconselhável. O oxigênio é um dos agentes terapêuticos mais utilizados na
medicina moderna, portanto, é um fármaco no verdadeiro sentido da palavra, com
ações bioquímicas e fisiológicas específicas, além de apresentar uma gama distinta
de doses efetivas e efeitos adversos bem definidos em altas doses (BITTERMAN,
2009; LANE, 2016).
Por isso, foi instituído neste trabalho o conceito de concentração letal mediana
(CL50), baseada nas curvas de sobrevida presuntivas obtidas. Com elas, titulou-se as
doses computadas em uma análise probit para se obter a duração da exposição para
cada profundidade que seria suficiente para levar ao óbito metade da amostra. No
entanto, a proposta inicial de utilizar-se 80% da CL50 não foi adequada. Obteve-se
elevada mortalidade e os animais sobreviventes estavam tão debilitados que
rapidamente apresentavam os critérios de ponto final estabelecidos. Buscou-se em
seguida 60% da CL50, ainda com mortalidade inadmissível. Por fim, conseguiu-se
obter uma quantidade aceitável de sobrevida com 50% da CL50 e os experimentos
prosseguiram.
114
O teste de DL50 foi introduzido por Trevan em 1927 para padronização biológica
de drogas potentes e potencialmente perigosas, como extratos de digitálicos, insulina
e toxina da difteria (TREVAN, 1927). Para este propósito, alta precisão era essencial,
e isso exigia um número relativamente grande de animais. Nos anos desde a sua
introdução, o teste de DL50 foi usado para avaliar a toxicidade aguda de uma ampla
variedade de substâncias químicas incluindo drogas, pesticidas, produtos químicos
industriais, cosméticos e aditivos alimentares. Soma-se a isso, nos últimos anos, o
teste de DL50 tem sido amplamente criticado como um desperdício de recursos,
especialmente em relação ao grande número de animais utilizados. Por esse motivo,
muitos investigadores mostraram que informações adequadas sobre a dose letal de
uma substância podem ser obtidas usando muito menos animais do que o exigido
pelos métodos clássicos de DL50 (LORKE, 1983; MÜLLER; KLEY, 1982; SCHÜTZ;
FUCHS, 1982; WEIL; CARPENTER; SMYTH, 1953; ZBINDEN; FLURY-ROVERSI,
1981).
Além do mais, a DL50 não é uma constante e muitas variáveis influenciam a sua
estimativa. Para a maioria das finalidades é apenas necessário caracterizar a DL50
dentro de um espectro de magnitude (por exemplo, de 50 a 500 mg/kg). Se existe uma
probabilidade razoável de exposição substancial do material por exposição dérmica
ou por inalação, estudos agudos de absorção dérmica e por inalação podem ser
realizados. Quando os animais são expostos a substâncias químicas no ar que
respiram ou na água em que eles vivem (como os peixes), a concentração letal
mediana (CL50) é geralmente determinada por um tempo conhecido de exposição, isto
é, a concentração química no ar ou na água que causa a morte de 50% dos animais
(KLAASSEN; WATKINS III, 2015).
Na pesquisa bibliográfica realizada, não se encontrou trabalhos utilizando a
DL50 ou CL50 do O2 em camundongos para titular e padronizar a dose do gás
administrado. Apesar disso, em outros animais se observou estudos com metodologia
parecida. Em todos, o tamanho da amostra foi similar, variando entre 10-15 por grupo.
Em um destas pesquisas, Demchenko e colaboradores, em 2007, desenvolveram
raciocínio semelhante, no entanto, utilizando ratos machos da variedade SpragueDawley. A curva de sobrevida mostra valores muito próximos aos obtidos no presente
estudo, porém a fórmula de tendência utilizada foi a de uma curva exponencial. No
entanto, seu coeficiente de determinação R2 foi bem menor que o obtido por nossa
curva polinomial de 3º grau (figura 34) (DEMCHENKO et al., 2007).
115
Figura 34. Análise de Sobrevivência de estudo de Demchenko e colaboradores. Ratos que se moviam livremente
e pareados por idade foram expostos à hiperóxia normobárica [98% O2 a 1 atmosfera absoluta (ata)] ou hiperóxia
hiperbárica (99% O2 a 1,5, 2,0, 2,5 e 3 ata). A taxa de sobrevida versus tempo foi plotada para cada exposição
(n = 10–12, cada grupo). Inserção: à medida que a ppO2 inspirada aumenta, o tempo de exposição necessário
para 50% de mortalidade (DL50) diminui exponencialmente. Retirada de DEMCHENKO et al., 2007).
Com a concentração calculada, o protocolo II foi levado a cabo com 50% desta
CL50. O objetivo era dar a mesma dose tóxica para todos os grupos, independente da
profundidade de exposição que se encontravam e verificar a previsibilidade da fórmula
e seu poder de estimar a mortalidade para cada pressão parcial do gás.
Nossos dados confirmaram que a exposição à hiperóxia hiperbárica reduziu
substancialmente a sobrevida de animais e esta foi impactada de forma diretamente
proporcional à profundidade (pressão ambiental) de exposição.
A maioria dos animais mortos neste protocolo apresentaram dispneia crescente
e redução progressiva da atividade motora global e que, por questões éticas, tiveram
o experimento interrompido (eutanásia humanitária), antes do desenlace, a fim de
poupá-los de sofrimento desnecessário. Portanto, foram computados com a
terminologia mortalidade presumida. Este comportamento poderia levar a pequenos
erros de medição do tempo de sobrevida, que foram minimizados com a utilização de
critérios de ponto final (mais objetivos e menos sujeitos a tendenciosidade) e
observação rigorosa do espécime na câmara por meio de uma câmera de alta
definição. Finalmente, as curvas de sobrevida e a estatística aplicada provaram que a
amostragem se distribuiu de forma normal padrão e com valores compatíveis em todas
as profundidades empregadas.
116
No entanto, em trabalhos prévios, a sobrevida de camundongos mostrou-se
bem maior do que no universo amostral da pesquisa atual (7,1±1 h a 3 ata, 100% O2).
Em trabalho realizado na década de 60, Hill e col. obtiveram uma taxa de sobrevida
para camundongos BALB/c de 19,1±2,4 h a 3 ata, 100% O2 (HILL; OSTERHOUT;
O’FALLON, 1968). O motivo da diferença pode estar relacionado à metodologia
empregada, pois a sobrevida daquele estudo foi levada a cabo até a cessação dos
movimentos respiratórios, o que neste trabalho, por motivos éticos, buscou-se evitar.
No entanto, outro fator merece discussão: a faixa etária utilizada nos dois estudos. Os
autores utilizaram animais com 11 semanas de idade, ligeiramente mais velhos e
desta forma, mais suscetíveis à intoxicação pulmonar (BEAN, 1965; CLARK;
LAMBERTSEN, 1971a).
Em relação à idade, sabe-se que a prematuridade foi associada ao aumento da
tolerância ao oxigênio em mamíferos e não mamíferos (BEAN, 1945; COALSON et
al., 2004; FAULKNER; BINGER, 1927; GERSH; WAGNER, 1945; PATZ et al., 1953;
SMITH et al., 1932a, 1932b; WEISS; WRIGHT, 1965; WILLIAMS; BEECHER, 1944).
Em trabalhos anteriores, o aumento da resistência à hiperóxia em ratos prematuros
pode ser parcialmente atribuído à ausência de resposta significativa do eixo
hipotálamo-pituitária-adrenal (HHA) (BEAN; JOHNSON, 1952; BEAN; SMITH, 1952).
Respostas significativas ao estresse hiperóxico foram observadas em ratos adultos,
mas não em animais de 2 dias de idade. Aos 10 dias de idade, a reação ao estresse
ainda era insignificante; aos 21 dias, foi igual a resposta de adultos, no entanto, menos
intensa (TIISALA, 1962). A origem da resposta ao estresse em prematuros identificada
no eixo HAP, pode ser principalmente causada pela persistência de hormônios
adrenocorticotróficos maternos circulantes ou devido a sua administração exógena
(KINKEAD et al., 2008; TERRANEO; SAMAJA, 2017).
Por outro lado, a hipofisectomia de ratos antes de exposições repetidas entre
5,8 a 7,1 atm de O2 promoveu marcada proteção contra os efeitos pulmonares da
intoxicação pelo O2 (BEAN, 1952; BEAN; JOHNSON, 1952). O dano pulmonar e a
mortalidade foram significativamente menores nos ratos hipofisectomizados quando
comparados aos animais normais em exposições com duração igual ou inferior. Os
animais protegidos tiveram um início mais tardio, incidência menor e gravidade
diminuída das convulsões. Esse efeito protetor é parcialmente revertido pela
administração de hormônio adrenocorticotrófico (BEAN, 1952).
117
Embora esses achados não apoiem a ideia de que os pulmões de mamíferos
jovens sejam mais sensíveis aos oxidantes inalatórios que os pulmões adultos, eles
estão de acordo com um estudo de hiperóxia em camundongos que relataram
neonatos como sendo mais resistentes à lesão pulmonar induzida por hiperóxia do
que os adultos (CHOO-WING et al., 2007). Tem sido postulado que esta tolerância à
toxicidade do oxigênio é transitória, uma vez que leva mais tempo para os pulmões
neonatais
montarem
uma
resposta,
possivelmente
devido
ao
atraso
no
desenvolvimento respiratório. No entanto, ainda é mal compreendida a real origem
desta diferença (JOBE; KALLAPUR, 2010; KEENEY et al., 1995).
Em um pequeno grupo de animais, houve a presença de espasmos tônicoclônicos que precediam e/ou produziam sua morte, invariavelmente, quando de sua
retirada da câmara. Esse achado foi descrito por alguns autores em relação ao efeito
da intoxicação sobre corpos carotídeos (LEITE, 2006). Esse autor relata que a
despeito de todo comprometimento pulmonar, caracterizado pela diminuição da
complacência, de aparecimento relativamente precoce (CLARK; LAMBERTSEN,
1971a), a manutenção da normalidade gasométrica até poucas horas antes da morte,
seguida de uma súbita falência respiratória, sugerem que os mecanismos
responsáveis pela ventilação normal já não se fazem mais presentes (LEITE, 2006).
Em 1987, Lahiri e colaboradores foram os primeiros a descrever a perda da
resposta ventilatória à hipóxia por parte dos corpos carotídeos de gatos expostos à
respiração prolongada de O2 puro na pressão atmosférica (1 ata) (LAHIRI et al., 1987).
Um dos papéis dos quimiorreceptores periféricos parece ser justamente o de
sustentar a ventilação quando os mecanismos centrais não se encontram mais
presentes, como numa situação de hipercapnia severa, a qual, sabidamente deprime
os centros respiratórios do tronco cerebral (MARSHALL; LAMBERTSEN, 1961). No
entanto, as lesões significativas dos corpos carotídeos descritas, em tensões de
oxigênio mais elevadas, parecem sugerir que nessa situação, também o
funcionamento dos corpos carotídeos pode se encontrar prejudicado e a sua resposta
quimiorreflexa ao CO2 possa também estar alterada. Com isso, o aumento da PaCO2
não estimularia os reflexos ventilatórios adequados, provocando a queda acentuada
do pH a níveis críticos, culminando com a morte. Portanto, lesões estruturais
significativas dos corpos carotídeos poderiam ser uma das possíveis explicações para
a súbita falência respiratória observada em situações de intoxicação avançada pelo
oxigênio (LEITE, 2006).
118
Matalon e col. (1982) observaram uma tendência de queda da frequência
cardíaca nas primeiras 40 horas de exposição e do débito cardíaco até 60 horas de
exposição em carneiros submetidos a hiperóxia normobárica. Ambos os parâmetros
cardiocirculatórios, aumentaram posteriormente com o aumento da PaCO2. Ao longo
de todo experimento a PaO2 esteve acima de 200 mmHg. Para os autores, houve uma
redistribuição do fluxo sanguíneo a nível pulmonar, desviando-o de áreas
atelectásicas para áreas melhor ventiladas e mantendo uma relação ventilaçãoperfusão suficiente para sustentar uma oxigenação adequada, dada a ausência de
hipertensão pulmonar (MATALON; NESARAJAH; FARHI, 1982). Harabin e col. (1984)
trabalhando com cães expostos às mesmas condições, por outro lado, não
observaram a queda da frequência cardíaca, embora o débito cardíaco tenha
diminuído progressivamente em 48 horas. Após o que houve aumento significativo da
frequência cardíaca e queda acentuada do débito. Nestes animais, houve um aumento
da PaCO2 apenas algumas poucas horas antes da morte. Também foi verificada uma
queda acentuada do excesso de base (BE) na fase terminal coincidente com uma
PaO2 acima de 200 mmHg que, segundo os autores, seria decorrente de uma acidose
metabólica consequente a uma redistribuição do fluxo, já que o débito cardíaco
diminuiu ao longo de todo experimento. Com isso, os autores concluíram que as
alterações circulatórias precederam a queda da capacidade funcional pulmonar de
trocas gasosas (perda da capacidade de difusão). Apenas ao final, horas antes da
morte, a PaO2 atingiu valores abaixo de 150 mmHg (HARABIN; HOMER; BRADLEY,
1984).
Além disso, em cães, o dietilbarbiturato de sódio inibe apenas parcialmente os
movimentos tônico-clônicos das extremidades e concentrando o efeito convulsivo na
cabeça, pescoço e tronco, principalmente sobre a inspiração, tendo sido inclusive
empregado o termo “respiração convulsiva” (SHAW; BEHNKE; MESSER, 1934). O
animal
desenvolve
arfadas
inspiratórias
progressivamente
mais
intensas,
acompanhadas de momentos de apneia cada vez mais longos, conforme a convulsão
progride, até que o período convulsivo seja finalizado pela falência respiratória. Ainda
nesses experimentos, foram observadas, além de convulsões típicas, uma flutuação
importante da pressão arterial com tendência à queda, não observada normalmente
nos animais sob respiração a ar ambiente ou mesmo com O2 puro a 1 ata. A queda
da pressão arterial parece anteceder o período convulsivo, podendo-se constituir em
um sinal da iminência do surgimento de uma convulsão. Entretanto, durante o período
119
convulsivo, há uma abrupta e importante elevação da PA de 50 mmHg ou mais. Após
a convulsão, a hipotensão continua se a exposição ao O 2 hiperbárico se prolongar e
caso atinja valores inferiores a 50 mmHg, torna-se irreversível, sobrevindo a morte em
poucos minutos por falência respiratória e cardiocirculatória. A primeira ocorre antes
da segunda, pois a PA continua a cair mesmo após o centro respiratório ter sido
completamente paralisado. Mas a falência do centro cardiocirculatório é apenas uma
questão de tempo (SHAW; BEHNKE; MESSER, 1934). Além das alterações
hemodinâmicas, espasmos e contrações persistentes também acompanham o quadro
pós-convulsivo, se a exposição ao O2 continuar (WATTEL; GUIEU; MATHIEU, 1990).
No entanto, se a pressão parcial de O2 é diminuída antes da hipotensão severa se
instalar, o quadro é totalmente revertido. Uma recuperação completa foi verificada,
tanto em animais quanto no homem (SHAW; BEHNKE; MESSER, 1934). Outros
autores verificaram com muito mais frequência a presença de uma taquicardia
precedendo a crise convulsiva, ao invés da queda da PA (WATTEL; GUIEU;
MATHIEU, 1990).
Os mecanismos envolvidos em todas as manifestações centrais da intoxicação
pelo oxigênio parecem diretamente ligados ao efeito tóxico direto do O 2 sobre os
centros respiratórios e cardiocirculatórios, bem como sobre a atividade elétrica e as
reações enzimáticas intracelulares, difusamente por todo SNC (MARSHALL;
LAMBERTSEN, 1961).
A ação protetora de alguns agentes anestésicos, atenuando ou inibindo o
aparecimento de convulsões, dá suporte ao efeito direto do O 2 sobre o metabolismo
cerebral, uma vez que sabidamente esses agentes agem diminuindo a excitabilidade
do SNC e o metabolismo cerebral como um todo (BEAN, 1965; WOOD; PERKINS,
1970). Entretanto, já foi relatado que anestesias com pentobarbital sódico podem ter
efeitos paradoxais e aumentar o efeito tóxico da OHB sobre o SNC, levando a
paralisias motoras permanentes em exposições de curta duração a 3 ata, semelhante
às observadas em exposições repetidas de animais não anestesiados a 4,5 ata
(BEAN, 1965).
Embora esteja claro que as convulsões causadas pelo oxigênio estão
associadas a proeminentes influências neurais e hormonais nos pulmões, a
contribuição relativa desses efeitos indiretos para o desenvolvimento de intoxicação
pulmonar por oxigênio em níveis subconvulsivos de hiperóxia ainda não é conhecida.
Uma vez que nenhuma célula viva de mamífero é imune aos efeitos tóxicos do
120
oxigênio, todos os órgãos e tecidos do corpo devem ser gradualmente e
progressivamente expostos a tensões tóxicas de oxigênio. O significado prático deste
princípio geral, é obscurecido por grandes variações na "dose de oxigênio",
suscetibilidade e capacidade de compensação ou recuperação nos locais de ação
locais. Os efeitos diretos da toxicidade do oxigênio sobre o metabolismo celular e
função das glândulas endócrinas não são bem entendidos. A avaliação desses efeitos
diretos e suas potenciais influências na intoxicação por oxigênio pulmonar é uma área
importante para pesquisas futuras.
Apesar da extensa investigação na última década, o papel dos fenômenos de
atividade superficial na patogênese da intoxicação pulmonar por oxigênio ainda é
controverso. A maioria das pesquisas descobriu que a atividade da superfície do
material de revestimento alveolar está diminuída nos pulmões expostos ao oxigênio,
mas é incerto se isso ocorre como efeito direto da toxicidade ou apenas como
consequência secundária dos efeitos concomitantes da intoxicação pulmonar.
Mecanismos potenciais para redução da concentração de surfactante no
envenenamento por oxigênio incluem inativação, a formação de substâncias
inibitórias, diminuição da síntese e ruptura física do filme de revestimento alveolar por
edema pulmonar. É possível que mais de uma dessas ações possa ocorrer
simultaneamente. Em qualquer caso, a função reduzida de surfactante provavelmente
contribui para as alterações patológicas encontradas nos pulmões durante os estágios
terminais da intoxicação por oxigênio.
Tanto o sistema nervoso central quanto os efeitos pulmonares da intoxicação
por oxigênio são marcadamente potencializados em animais expostos a níveis
convulsivos de hiperóxia pela adição de pressões parciais normalmente inócuas de
dióxido de carbono ao gás inspirado (BEAN; ZEE, 1966; JAMIESON, 1966; VAN DEN
BRENK; JAMIESON, 1962a). O aumento do envenenamento por oxigênio pulmonar
nessas condições parece estar relacionado ao aumento da intensidade dos fatores
neurogênicos e endócrinos associados à potencialização concomitante de convulsões
de oxigênio. Quando a ppO2 inspirada é elevada a níveis extremos durante a
respiração de oxigênio, as convulsões são inibidas e o dano pulmonar é mínimo ou
ausente (BEAN; ZEE, 1966). Essas influências protetoras provavelmente estão
relacionadas
aos efeitos
narcóticos
do
dióxido
de
carbono.
Contudo,
o
desenvolvimento da intoxicação fatal do sistema nervoso central é acelerado pelas
interações de hiperóxia e hipercapnia, mesmo quando as convulsões são inibidas.
121
Estudos sobre as influências de dióxido de carbono sobre os efeitos tóxicos do
oxigênio à pressão atmosférica não são conclusivos (BEAN; ZEE, 1966).
Experimentos adicionais serão necessários para determinar se a potencialização de
intoxicação por oxigênio pulmonar por hipercapnia está relacionada apenas ao
aumento da toxicidade por oxigênio no sistema nervoso central ou para outras formas
mais diretas de interação no pulmão também.
Embora se saiba agora que a retenção endógena de dióxido de carbono
durante a exposição à hiperóxia não exerce o papel causal proeminente que foi
anteriormente atribuído a ela, é claro que os fatores acidobásicos contribuem para o
desenvolvimento das síndromes de intoxicação do sistema nervoso central e
pulmonar. A falha na redução da hemoglobina enquanto se respira oxigênio a alta
pressão prejudica o transporte de dióxido de carbono e causa o acúmulo de dióxido
de carbono nos tecidos. Os resultantes graus relativamente modestos de hipercapnia
e acidose parecem modificar os efeitos tóxicos do oxigênio nos pulmões, mas o
mecanismo pelo qual isso ocorre não é conhecido. Não há evidências conclusivas
para uma interação direta entre toxicidade de oxigênio e hipercapnia. Na ausência de
tais evidências, deve-se considerar que a intoxicação por oxigênio pode ocorrer por
outros efeitos da hipercapnia e da acidose, como alterações no tônus vascular, nas
atividades simpática e vagal (CLARK; LAMBERTSEN, 1971a).
Além de uma maior suscetibilidade a atelectasias alveolares e hipoxemia, a
remoção total de gás inerte dos pulmões parece não exagerar as manifestações
pulmonares da toxicidade pelo oxigênio. A maioria dos pesquisadores descobriu que
a taxa de desenvolvimento de intoxicação por oxigênio pulmonar é apenas uma
função do ppO2 inspirada, independentemente da presença ou ausência de pequenas
concentrações de gás inerte. Quando o oxigênio é respirado junto com os níveis
narcóticos de gás inerte, no entanto, os efeitos pulmonares e centrais da toxicidade
do oxigênio são definitivamente melhorados. Isso está relacionado não apenas à
influência do gás inerte na intoxicação por oxigênio, mas também à influência
separada e possivelmente aditiva do aumento das tensões de oxigênio na narcose de
gás inerte. Nestas condições, os efeitos tóxicos do oxigênio são provavelmente
potencializados pela elevação da ppCO2 cerebral, associada à narcose do gás inerte
e ao comprometimento da ventilação alveolar pelo aumento da densidade do gás. A
existência de muitos mecanismos potenciais de intoxicação pulmonar por oxigênio
fornece os meios para uma variabilidade acentuada nas interações entre esses
122
mecanismos. Por exemplo, a influência da interação neuroendócrina é muito mais
proeminente em níveis convulsivos de hiperóxia do que durante a respiração de
oxigênio a 1,0 atm. A proeminência relativa de outros fatores de influência também
pode ser alterada em diferentes tensões de oxigênio e durações de exposição. Como
a taxa de desenvolvimento dos efeitos letais da intoxicação pulmonar por oxigênio
varia em ampla escala em diferentes espécies animais e indivíduos, uma variabilidade
similar deve ser esperada em relação aos mecanismos dominantes responsáveis por
esses efeitos letais. É concebível que muitos resultados aparentemente inconsistentes
obtidos em diferentes experimentos possam ser explicados pelas interrelações das
múltiplas influências diretas e indiretas que contribuem para a síndrome total da
intoxicação pulmonar (CLARK; LAMBERTSEN, 1970, 1971a).
No entanto, vislumbrou-se que o grupo 1ATA (101,3 kPa) apresentou na
mecânica ventilatória um padrão restritivo com valores de resistência ou
amortecimento tecidual (tissue damping ou G) superiores aos outros grupos
estudados e muito superior ao grupo controle. Uma explicação para esse achado é o
óbvio acúmulo de infiltrado polimorfonuclear e edema no interstício pulmonar com o
extravasamento de líquido para o interior dos alvéolos, facilmente identificável nas
lâminas de histopatologia (figura 15 e 16). Além disso, o Grupo 1ATA apresentou uma
alta elastância tecidual (tissue elastance ou H) apenas com relação ao Grupo CTRL,
resultado esse possivelmente decorrente da processo inflamatório descrito acima,
mas principalmente pela interferência do oxigênio sobre a camada surfactante do
alvéolo, o que pode ter contribuído para o maior grau de atelectasia dos grupos com
maior tempo de exposição ao oxigênio (TANKERSLEY et al., 1993).
As medições de FOT são tipicamente obtidas através da análise de sinais de
pressão e volume adquiridos em reação a uma forma de onda de fluxo de ar oscilatório
de pequena amplitude predefinida (também referida como perturbação ou sinal de
entrada) aplicada na abertura das vias aéreas do indivíduo (BATES; IRVIN, 2003). Em
sua forma mais simples, uma perturbação FOT seria uma forma de onda sinusoidal
única em uma frequência bem definida (OOSTVEEN et al., 2003). Perturbações mais
complexas tipicamente consistem em uma superposição de uma seleção de formas
de onda de frequência específicas (mutuamente primárias) cobrindo um amplo
espectro. A decomposição dos sinais de entrada e saída multifrequência nos seus
constituintes utilizando a transformada de Fourier permite o cálculo da impedância de
entrada do sistema respiratório (Zin), isto é, a função de transferência entre os sinais
123
de entrada e saída, em todas as frequências incluídas na perturbação (BATES, 2009).
Portanto, o TOF permite a avaliação simultânea da mecânica respiratória em uma
faixa de frequência em uma única manobra (BATES, 2009; OOSTVEEN et al., 2003).
Ajustar modelos matemáticos avançados, por exemplo, o Modelo de Fase
Constante (HANTOS et al., 1992b), aos dados de impedância permite particionar a
resposta nos parâmetros dependentes das vias aéreas (centrais e periféricas) e do
parênquima pulmonar (BATES; IRVIN, 2003; HANTOS et al., 1992b). Como muitos
fatores que influenciam a resposta fisiológica (por exemplo, frequência respiratória,
volume corrente, volume pulmonar, vias aéreas superiores, esforços de respiração
espontânea, tempo de mensuração) são controlados e padronizados pelo sistema de
medida e procedimentos experimentais (BATES; IRVIN, 2003), a técnica é capaz de
gerar medições precisas e reprodutíveis, desde que seja realizada corretamente
(OOSTVEEN et al., 2003).
Independentemente do método utilizado, as mudanças nas propriedades
elásticas do pulmão são uma manifestação precoce na intoxicação pelo O2 em
humanos. A complacência pulmonar dinâmica esteve reduzida em cerca de 15% dos
casos expostos ao O2 a 2 atm por 6 a 11 h. (FISHER et al., 1968) e em cerca do dobro
desta quantidade em outros respirando O2 a 0,98 atm por 30 a 48 h (CALDWELL et
al., 1966). Achado semelhante ocorreu em cães (PAUTLER et al., 1966; SMITH;
LEHAN; MONKS, 1963), coelhos (ROSENGREN, 1967) e ratos (BECKMAN; WEISS,
1969) mantidos em condições similares.
Em homens normais, respirar oxigênio em repouso, particularmente a um
volume pulmonar baixo, pode ser acompanhado por uma redução na complacência
pulmonar que é causada mais pela atelectasia de absorção, do que pela toxicidade
química direta do oxigênio, e é rapidamente reversível após inspiração profunda
(BURGER; MACKLEM, 1968; BURGER; MEAD, 1969).
Possíveis mecanismos para a redução da complacência pulmonar durante o
intoxicação pelo oxigênio além das atelectasias, incluem o edema pulmonar e a
congestão, o estreitamento assimétrico das vias aéreas, a diminuição do surfactante
alveolar e a alteração das propriedades retráteis dos elementos elásticos do tecido
pulmonar (CLARK; LAMBERTSEN, 1971a).
A intoxicação pulmonar precoce, porém proeminente, no homem exposto ao O2
a 2 atm não esteve associada ao aumento acentuado da resistência das vias aéreas
124
ou da resistência pulmonar total (FISHER et al., 1968). Informação similar ao obtido
com os nossos resultados.
O conhecimento do efeito da tensão elevada de oxigênio no sistema surfactante
pulmonar é importante para compreensão da patogênese da intoxicação pelo
oxigênio. Apesar deste assunto ter recebido considerável atenção, alguns resultados
ainda são inconsistentes. Muitos investigadores relataram que a hiperóxia induz à
redução da atividade surfactante pulmonar. Além desse fato, o surfactante pulmonar
é secretado por células epiteliais alveolares especializadas, pneumócitos granulares
ou tipo II, que são sabidamente mais resistentes à intoxicação pelo O2 (GUTHMANN
et al., 2005).
Em resumo, a síndrome total de intoxicação pulmonar pelo oxigênio é causada
por múltiplos fatores interagindo que incluem efeitos tóxicos diretos sobre os tecidos
pulmonares e outros efeitos indiretos relacionados às ações tóxicas de oxigênio a
nível extrapulmonar. Os resultados experimentais estabeleceram conclusivamente
que prolongada exposição à hiperóxia na ausência de influências indiretas pode
severamente danificar o pulmão. Efeitos diretos da intoxicação pelo oxigênio, que
parecem estar relacionadas ao aumento das tensões de oxigênio na pequena
circulação como também no gás alveolar, deve ser considerado como tendo um papel
proeminente na patogênese da intoxicação pulmonar pelo O2. Tanto no pulmão, como
no cérebro ou em qualquer outro órgão, o efeito tóxico direto do oxigênio deve originar
a inativação de enzimas essenciais, ação das ERO e a interrupção concomitante do
metabolismo celular. As mudanças bioquímicas que foram demonstradas nos
pulmões de animais intactos expostos à hiperóxia e provavelmente outras alterações
metabólicas, ainda desconhecidas, representam o efeito letal de intoxicação pelo
oxigênio sobre as células pulmonares.
Superpostos aos efeitos diretos da intoxicação pulmonar celular pelo oxigênio
estão outros efeitos desfavoráveis que estão relacionados com o desenvolvimento da
intoxicação no SNC e são particularmente óbvios após a ocorrência de convulsões.
Convulsões induzidas por drogas e injúrias mecânicas na cabeça são também
associadas com alterações patológicas e funcionais nos pulmões semelhantes às que
acompanham a intoxicação pelo oxigênio. Os efeitos pulmonares associados às três
formas de dano cerebral são mediados presumivelmente pelas vias HHA e simpatoadrenomedular.
125
Existem muitas evidências indiretas que sugerem que a inativação de enzimas
e cofatores pelo oxigênio molecular envolve a formação intermediária de ERO e do
óxido nítrico. Possíveis mecanismos para a formação desses intermediários e as
evidências de seu papel na toxicidade do oxigênio têm sido amplamente discutidos
em várias revisões (ALLEN; DEMCHENKO; PIANTADOSI, 2009; CHANDEL;
BUDINGER, 2007; GERSCHMAN et al., 1954; GILBERT, 1981; GILBERT;
GERSCHMAN; FENN, 1955; HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2015; HARIJITH et al.,
2016; HAUGAARD, 1968; MANTELL et al., 1999; SCOTT BUDINGER et al., 2002).
Além disso, muitas semelhanças foram observadas entre os efeitos tóxicos do
oxigênio e os efeitos biológicos da irradiação (FENN et al., 1957; GERSCHMAN et al.,
1954; GERSCHMAN; GILBERT; CACCAMISE, 1958; WEISS; LANDAUER, 2009). A
irradiação de camundongos (GERSCHMAN et al., 1954) e Drosophila (THOMAS JR.;
BAXTER; FENN, 1966) imediatamente antes ou durante a exposição à hiperóxia
aumenta acentuadamente a taxa de desenvolvimento de intoxicação pelo oxigênio.
Várias drogas que efetivamente toleram a irradiação também fornecem proteção
significativa contra o envenenamento por oxigênio em ratos e camundongos expostos
a 5-6 atm de O2 (GERSCHMAN et al., 1954; GERSCHMAN; GILBERT; CACCAMISE,
1958). Além disso, as propriedades radioprotetoras de muitas dessas drogas são
reduzidas ou abolidas pela exposição simultânea a pressões de oxigênio aumentadas
(VAN DEN BRENK; MOORE, 1959). No entanto, Van den Brenk e Jamieson
sugeriram que a analogia da intoxicação pelo oxigênio e o dano pela radiação é
apenas superficial (VAN DEN BRENK; JAMIESON, 1962b).
Em relação a atividade REDOX, foi verificado aumento da atividade da SOD e
promoção da produção de grupamentos tióis no modelo empregado. Apenas a SOD,
apresentou elevação de sua atividade nos grupos 2,5 e 3ATA, o que pode significar
um maior estímulo a sua produção ou uma atividade aumentada e/ou preservada nos
grupos mais exigidos durante o estresse oxidativo.
No entanto, a SOD avaliada pela metodologia empregada identifica a enzima
total, soma das três formas de SOD em mamíferos, a SOD contendo Cu e Zn (CuZnSOD), SOD contendo o Mn (Mn-SOD) e SOD extracelular secretada (EC-SOD)
(CARLSSON et al., 1995).
As outras enzimas antioxidantes avaliadas, catalase e glutationa peroxidase
não se modificaram em ambos os protocolos. No entanto, sabe-se que em condições
normais, existe um estado de equilíbrio entre a geração e a eliminação de ERO. No
126
desequilíbrio oxidativo causado pela hiperóxia, principalmente hiperbárica, no entanto,
esse equilíbrio é perturbado e um aumento no nível de ERO pode resultar em lesão
celular.
Portanto avaliações de dano celular são importantes para relacionar a lesão
pulmonar pela hiperóxia hiperbárica ao desequilíbrio REDOX. Neste estudo,
utilizamos apenas um método de quantificação de dano oxidativo, a dosagem de
grupamentos tióis. Apesar de ter tido uma queda nos animais expostos por mais tempo
ao ambiente hiperóxico-hiperbárico, não se é capaz de criar hipóteses, fruto de um
comportamento paradoxal em nossa amostra e da reduzida especificidade quando
empregado isolado. Sugere-se futuras pesquisas onde se possa relacionar com outros
marcadores de dano oxidativo e a participação das frações de SOD mitocondrial.
A superprodução de ERO durante a hiperóxia levantou a questão de como os
sistemas antioxidantes endógenos respondem à exposição hiperóxica. Muita atenção
tem sido focada nas enzimas antioxidantes clássicas, incluindo a SOD, catalase e
GPx, que poderiam desempenhar um papel crucial na resposta ao estresse oxidativo,
promovendo o metabolismo do ERO (KEENEY et al., 1992; MCCORD, 1993). Em
animais adultos, as atividades dessas enzimas respondem diferentemente à hiperóxia
em várias espécies, e não há uma simples dose-resposta ao O2.
Apesar dos valores absolutos dos índices de comprometimento mecânico e
inflamatório vistos de 1,5 ata para cima terem sido significativamente menores do que
o observado em 1 ata, as taxas em que estes sinais aparecem são claramente
aumentados na hiperóxia hiperbárica. Além disso, os níveis de SOD e expressão de
caspase-3 ativada a 3 ata foram expressivamente maiores do que aqueles
encontrados nos outros grupos e no CTRL, apesar do tempo de exposição muito
menor. Portanto, os processos patológicos subjacentes na hiperóxia normobárica são
acelerados pela hiperóxia hiperbárica, processos adicionais devem entrar em ação ou
ambos.
A ideia de que a patologia pulmonar na hiperóxia pode estar relacionada à
excitação simpática é apoiada por várias investigações iniciais, e a epinefrina
endógena figura como um dos agentes implicados (BEAN; JOHNSON, 1955;
JAMIESON; VAN DEN BRENK, 1962; JOHNSON; BEAN, 1957). Alterações
morfológicas nos pulmões de animais que exibem convulsões na hiperóxia hiperbárica
também foram descritas (KISTLER; CALDWELL; WEIBEL, 1967), igualmente,
alterações na inflamação pulmonar e na bioquímica (DEMCHENKO et al., 2007). Além
127
disso, edema pulmonar e congestão foram relatados em animais subsequentes às
convulsões induzidas pelo oxigênio hiperbárico, e essas alterações foram prevenidas
quando as convulsões foram inibidas, por exemplo, pelos barbitúricos ou pelo GABA
(BEAN; ZEE; THOM, 1966; JAMIESON; CASS, 1967; WOOD; STACEY; WATSON,
1965). Além disso, a correlação direta entre o número de convulsões sofridas por ratos
e a gravidade do dano pulmonar, tanto macroscópico quanto microscópico, também
foram relatadas (PATEL; GOWDEY, 1964). Assim, embora evidências circunstanciais
apontem para a mediação do SNC na lesão pulmonar pelo oxigênio hiperbárico,
nenhum mecanismo foi esclarecido.
Foi demonstrado anteriormente que a pressão por si só não é um fator
significativo na toxicidade pulmonar da hiperóxia hiperbárica. Em um experimento
elegante descrito por Penrod em 1958 (PENROD, 1958), brônquios de gatos foram
cateterizados separadamente e o oxigênio foi fornecido para um pulmão e gás inerte,
não ar, para o outro, durante uma exposição a 5 ata por 7 h. O pulmão suprido com
gás inerte permaneceu inalterado, enquanto o pulmão exposto ao oxigênio mostrou
"considerável dano macro e microscópico" (PENROD, 1958). Os efeitos primários e
secundários da pressão na lesão pulmonar também foram examinados de outras
maneiras. Por exemplo, a questão de se o dano pulmonar no oxigênio hiperbárico
poderia ser causado ou exacerbado pelo aumento da densidade do gás respiratório
foi estudado por Bergø e Tyssebotn em 1991 (BERGØ; TYSSEBOTN, 1991). Esses
pesquisadores relataram que nenhuma mudança significativa no fluxo sangüíneo
pulmonar ocorreu em ratos respirando gases normóxicos a 5 vezes a densidade do ar
(BERGØ; TYSSEBOTN, 1991).
A visão predominante tem sido a de que a hiperóxia normo e hiperbárica
danificam os pulmões pelo mesmo mecanismo: produção de ERO ou ERN. E como a
taxa de produção de espécies reativas é mais intensa sob condições hiperbáricas, o
dano é acelerado. Há evidências convincentes de estudos normobáricos de que as
ERO, ERN e várias citocinas, produzidas no pulmão, induzem dano celular por
oxidação de proteínas, peroxidação de lipídios de membrana e quebra de fitas de DNA
(HESSE et al., 2004; HORINOUCHI et al., 1996; KOBAYASHI et al., 2001; PEPPERL
et al., 2001; SHEA et al., 1996). Há também evidências de que o ON desempenhe
especificamente um papel no desenvolvimento da toxicidade pulmonar induzida pelo
oxigênio normobárico (ARKOVITZ et al., 1997b; CUCCHIARO et al., 1999; STEUDEL
et al., 1999; TAYLOR; CARRAWAY; PIANTADOSI, 1998).
128
Ainda permanece uma questão em aberto sobre até que ponto as ERN são
agentes de lesão pulmonar na hiperóxia a 1 ata. Futuros trabalhos com uso de
inibidores de NOS ou usando camundongos NOS-knockout podem responder a estas
questões.
Em geral, nossos achados são difíceis de conciliar com a idéia de que os
processos patológicos na lesão pulmonar normobárica e hiperbárica são os mesmos.
Camundongos expostos a 2,5 ou 3 ata mostram um padrão de dano pulmonar
diferente do observado em 1 ata. A diferença mais notável nas lesões pulmonares na
exposição ao O2 de 2 ata ou acima foi a menor quantidade de células inflamatórias e
menor quantidade de colapso alveolar no tecido pulmonar. Além disso, apenas
pequenas alterações na mecânica pulmonar foram identificadas nos animais expostos
ao O2 a 3 ata, quando comparados com o controle, muito menos do que após 35 h de
oxigênio normobárico. Apesar disso, o dano oxidativo e a indução de apoptose foram
maiores após 4 horas a 2,5 ata do que após 35 horas em 1 ata. Isto se deveu em parte
a uma mudança no padrão inflamatório, visto após a exposição, principalmente nas
pressões ambientais mais baixas. Muito menos células inflamatórias foram
encontradas no histopatologia após 2,5 ata em comparação com 1 ata (figura 17), as
fotomicrografias indicam que a quantidade total de células e debris intra-alveolares é
muito maior a 1 ata, consistente com mais dano a células epiteliais e endoteliais, bem
como com a presença de componentes celulares e exsudatos proteicos após um
insulto mais prolongado.
Igualmente, já se sabe que a inibição sistêmica de NOS protege contra lesão
pulmonar hiperbárica e previne convulsões, sugerindo uma relação entre o
desenvolvimento de intoxicação do SNC e o pulmonar pelo O2 (DEMCHENKO et al.,
2008). Além disso, os efeitos dos inibidores da NOS não seletivos, tais como, o
cloridrato de N-omega-Nitro-L-arginina metil ester (L-NAME) ou seletivos, como o 7nitroindazol
(7-NI)
na
toxicidade
pulmonar
por
oxigênio
não
diferiram
significativamente. Esses achados implicam o NO na lesão pulmonar aguda e
sugerem que a nNOS desempenha um papel prevalente no desenvolvimento de
toxicidade pulmonar a 3 ata de O2. Esses efeitos são consistentes com o papel
principal do NO derivado da NOS endotelial (eNOS) na alteração do fluxo sangüíneo
cerebral antes da toxicidade do O2 do SNC e do NO derivado da nNOS na aceleração
das crises de oxigênio através da amplificação do desequilíbrio excitatório-inibitório
129
da neurotransmissão no cérebro (DEMCHENKO et al., 2002; DEMCHENKO;
PIANTADOSI, 2006).
Como a nNOS é expressa no pulmão, vasculatura, músculo e em outros
lugares, não apenas no tecido neuronal, a inibição específica dessa isoforma de NOS
não estabelece uma conexão exclusiva com o SNC. No entanto, Vaughan e
colaboradores mostraram que “virtualmente todo o NO exalado no pulmão de coelhos
é produzido pela eNOS, que está presente em todas as vias aéreas, alvéolos e vasos
” (VAUGHAN et al., 2003). Portanto, o efeito conspícuo observado após a inibição
seletiva da nNOS provavelmente envolve fontes extrapulmonares significativas. de
NO. Achados prévios, de que as convulsões potencializam a lesão pulmonar e que a
vagotomia a atenua, fornecem evidência adicional e forte para o envolvimento do
SNC. No entanto, esses achados, apesar de impressionantes, podem não ser
exclusivos da hiperóxia hiperbárica (DEMCHENKO et al., 2007).
A observação de que a vagotomia impede a lesão da hiperóxia hiperbárica
característica implica um sinal do cérebro no desenvolvimento desta patologia. Os
mecanismos ou possíveis modos de lesão pulmonar podem envolver vias neuronais
mediadas por NO e alterações hemodinâmicas centrais do SNC. O trabalho de
Grandpierre e colegas em 1957 mostrou que a transecção vagal também atenua a
lesão pulmonar na hiperóxia normobárica (GRANDPIERRE; GROGNOT; SENELAR,
1956). Portanto, não se exclui a possibilidade de que eventos no cérebro tenham um
papel na lesão pulmonar induzida por oxigênio em condições normobáricas e
hiperbáricas. Mas o fato de que as histopatologias são distintas e que as convulsões
(mais comuns a partir de 3 ata) resultam em danos pulmonares mais graves,
sustentam a hipótese de que o SNC desempenha um papel mais importante no dano
pulmonar na hiperóxia hiperbárica.
A resposta bifásica a níveis crescentes de hiperoxia mostrado pela
característica mais inflamatória a 1 ata e com maior desequilíbrio redox e crescente
estímulo apoptótico a 2,5 e 3 ata, sugere que pelo menos dois processos patológicos
estão em ação. O primeiro envolve efeitos dependentes do tempo que são menos
desenvolvidos à medida que a duração da exposição hiperóxica diminui de 1 a 1,5
para 2 ata. O segundo processo sobrevém à medida que a pressão do oxigênio
aumenta, por exemplo, em 2,5 ata, o nível mais baixo de hiperóxia em que convulsões
130
da toxicidade do SNC foram observadas em nosso estudo piloto, podem elucidar esta
via de ação. É provável que a fonte de NO que potencializa a lesão pulmonar em
condições normobáricas seja diferente daquela responsável pelo caráter distinto da
lesão pulmonar hiperbárica.
Embora os mecanismos específicos pelos quais o NO neuronal causa lesão
pulmonar na hiperoxia hiperbárica não foram avaliados no presente estudo, dados de
outros autores implicam que a modulação do NO das vias adrenérgicas/colinérgicas
mediadas pelo SNC leva à lesão pulmonar (DEMCHENKO et al., 2011). A inervação
pulmonar é complexa e inclui não apenas fibras autonômicas adrenérgicas e
colinérgicas, mas também sistemas não-adrenérgicos não-colinérgicos (NANC), que
desempenham funções defensivas, regulatórias e imunomoduladoras (KAKUYAMA;
VALLANCE; AHLUWALIA, 1998; KUBOTA et al., 1988; LIU et al., 1992a, 1992b;
PARK et al., 2000; SCOTT; CRAIG; MCCORMACK, 1996). No cérebro, o sistema
NANC inibitório envolvendo NO se opõe à vasoconstrição cerebral (TODA;
OKAMURA, 2003), mas no pulmão, a nNOS não parece ser importante para a função
normal, uma vez que camundongos knockout para nNOS têm vasodilatação
dependente do endotélio normal (FAGAN et al., 1999).
Apesar da adrenalina e norepinefrina serem os principais neurotransmissores
envolvidos na regulação da via aérea pulmonar e função
vascular, os
neurotransmissores NANC, incluindo o peptídeo intestinal vasoativo (VIP) e o NO,
também parecem ser importantes. Estudos imuno-histoquímicos mostraram a
existência de nNOS em terminais nervosos que suprem vasos pulmonares e vias
aéreas inferiores (FISCHER et al., 1993; KOBZIK et al., 1993).
Além disso, estudos mais recentes sugerem que a lesão pulmonar aguda na
hiperóxia hiperbárica é causada por um aumento abrupto e substancial da pressão
vascular pulmonar, produzindo barotrauma em capilares e levando à transudação de
líquido, proteína plasmática e células sanguíneas para os espaços aéreos intersticiais
e alveolares pulmonares. Esses achados mostram que um fator-chave no dano
pulmonar na hiperóxia hiperbárica é o fluxo simpático maciço, mediado pelo SNC, que
deprime a função do VE, levando ao desenvolvimento súbito de edema pulmonar
cardiogênico (DEMCHENKO et al., 2011).
Em resumo, demonstramos que, conforme a hiperóxia aumenta dos níveis
normobáricos para os níveis hiperbáricos, as respostas pulmonares mudam de lesão
inflamatória direta para lesão não inflamatória, provavelmente mediada pelo SNC, e
131
embora as diferenças entre a toxicidade do oxigênio normárico e hiperbárico sejam
qualitativas e não absolutas, o efeito direto do oxigênio no pulmão predomina na
hiperóxia normobárica, enquanto o estresse oxidativo e estímulo apoptótico
prevalecem nas condições hiperbáricas. À medida que o equilíbrio entre esses dois
mecanismos muda, o padrão da lesão muda, mas nunca há uma condição na qual um
ou outro efeito esteja totalmente ausente. O primeiro desenvolve-se lentamente e,
como toda a superfície do pulmão está exposta diretamente ao ambiente hiperóxico
por muitas horas, a resposta inflamatória é difusa com a destruição da barreira alvéolocapilar, edema, troca gasosa prejudicada, insuficiência cardiorespiratória. e morte. No
entanto, nas exposições hiperbáricas, o dano pulmonar se desenvolve mais
rapidamente e é pressagiado por eventos no cérebro (convulsões). Essa lesão mais
aguda é causada por mecanismos extrapulmonares nos quais o NO derivado da
nNOS pode vincular a uma ppO2 elevada no cérebro e acelerar a lesão pulmonar por
vias autonômicas centrais.
132
133
CONCLUSÕES
“A vida não é nada mais do que um
elétron procurando um lugar para
descansar.”
Albert von Szent-Györgyi Nagyrápolt
8.
Conclusões, 124
134
135
8 CONCLUSÕES
1. O presente estudo mostra a validade de uma modelo de lesão pulmonar
desenvolvido em uma câmara hiperbárica experimental para pequenos
animais submetidos ao ambiente hiperóxico e hiperbárico.
2. Estabeleceu-se uma curva de sobrevida proporcional à pressão ambiental
de exposição, além disso, demonstrou-se que o impacto do tempo de
exposição é mais importante do que a pressão parcial do gás oxigênio (O2)
a que se submeteram os animais.
3. A mecânica pulmonar foi alterada apenas no grupo 1ATA, devido a maior
quantidade de alvéolos colapsados e uma maior presença de infiltrado
polimorfonuclear.
4. Houve maior expressão de caspase-3 ativada no grupo 3ATA, portanto
sugestivo de uma indução da cascata apoptótica pelo modelo proposto,
principalmente devido a ação da hiperóxia hiperbárica com maiores valores
de pressão parcial.
5. Foi observado um aumento da atividade de SOD no pulmão. Isto sugere um
mecanismo de defesa pulmonar ativo contra os ERO produzidos durante o
estresse oxidativo imposto. Não se pode, todavia, afirmar qual a origem do
processo. Em relação ao dano oxidativo, os resultados são inconclusivos,
portanto, faz-se necessário agregar outros métodos de detecção mais
acurados.
6. Por fim, observou-se que o padrão da lesão pulmonar muda conforme a
exposição migra pelo espectro hiperóxico normobárico para o hiperóxico
hiperbárico, acompanhado de uma resposta bimodal, tanto na atividade
antioxidante quanto no estímulo apoptótico.
136
137
PERSPECTIVAS FUTURAS
“O futuro dependerá daquilo que fazemos
no presente.”
Mohandas Karamchand “Mahatma” Gandhi
9
Perspectivas futuras, 139
138
139
9 PERSPECTIVAS FUTURAS
Analisar os efeitos da hiperóxia hiperbárica em câmara experimental, após
exposição subcrônica, em diferentes pressões parciais de oxigênio e com a doses
subletais, em camundongos saudáveis.
Identificar os mecanismos de lesão envolvidos na intoxicação, pelo estudo da:
- Mecânica pulmonar, com e sem controle do eixo HAP;
- Histologia pulmonar e cerebral em diferentes níveis pressóricos;
- Estresse e dano oxidativos no pulmão e no cérebro por meio de ensaios bioquímicos,
identificando-se qual subtipo de SOD elevou-se durante a exposição e pela utilização
de outros métodos de detecção do dano oxidativo.
140
141
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
“Quanto
mais
aumenta
nosso
conhecimento, mais evidente fica nossa
ignorância.”
John Fitzgerald Kennedy
Referências Bibliográficas, 143
142
143
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABELE, D. Toxic oxygen: the radical life-giver. Nature, v. 420, n. 6911, p. 27, 2002.
ADAWI, A. et al. Disruption of the CD40-CD40 ligand prevents an oxygen-induced
respiratory distress syndrome. American Journal of Pathology, v. 152, p. 651–657,
1998.
AEBI, H. Catalase in vitro. Methods in Enzymology, v. 105, p. 121–126, 1984.
AHMAD, A. et al. Elevated expression of hexokinase II protects human lung epitheliallike A549 cells against oxidative injury. American Journal of Physiology-Lung
Cellular and Molecular Physiology, v. 283, n. 3, p. L573–L584, 2015.
AHMAD, S. et al. Extracellular ATP-mediated Signaling for Survival in Hyperoxiainduced Oxidative Stress. Journal of Biological Chemistry, v. 279, n. 16, p. 16317–
16325, 2004.
AIKAWA, J. K. et al. Pulmonary lesions in experimental oxygen poisoning: Studies with
I131-Labeled γ-Globulin and Albumin. A.M.A. Journal of Diseases of Children, v.
91, n. 6, p. 614, 1 jun. 1956.
ALBERTS, B. et al. Molecular biology of the cell. 5th. ed. New York: Garland
Science, 2008.
ALBLOOSHI, A. et al. Is forced oscillation technique the next respiratory function test
of choice in childhood asthma. World Journal of Methodology, v. 7, n. 4, p. 129–138,
2017.
ALEX, J. et al. Pretreatment with hyperbaric oxygen and its effect on
neuropsychometric dysfunction and systemic inflammatory response after
cardiopulmonary bypass: A prospective randomized double-blind trial. Journal of
Thoracic and Cardiovascular Surgery, v. 130, n. 6, p. 1623–1630, 2005.
ALLEN, B. W.; DEMCHENKO, I. T.; PIANTADOSI, C. A. Two faces of nitric oxide:
implications for cellular mechanisms of oxygen toxicity. Journal of Applied
Physiology, v. 106, n. 2, p. 662–667, 2009.
ALLEN, G. et al. Transient mechanical benefits of a deep inflation in the injured mouse
lung. Journal of Applied Physiology, v. 93, n. 5, p. 1709–1715, 2002.
ALLEN, G. L. et al. Hyperoxia synergistically increases TNF-α-induced interleukin-8
gene expression in A549 cells. American Journal of Physiology - Lung Cellular and
Molecular Physiology, v. 278, n. 2 22-2, p. 253–260, 2000.
ALLEN, R. G.; BALIN, A. K. Oxidative influence on the develpment and differentiation:
an overview of a free radical theory of development. Free Radical Biology &
Medicine, v. 6, n. 6, p. 631–661, 1989.
ALMZAIEL, A. J. et al. Hyperbaric oxygen enhances neutrophil apoptosis and their
clearance by monocyte-derived macrophages. Biochemistry and Cell Biology, v. 93,
p. 405–416, 9 jun. 2015.
APRILLI, R. R. et al. The effect of hyperbaric oxygenation on the distal intestine of rats
subjected to ionizing radiation. Undersea and Hyperbaric Medicine, v. 38, n. 6, p.
503–507, 2011.
144
ARCHIBALD, F. Oxygen toxicity and the health and survival of eukaryote cells: A new
piece is added to the puzzle. Proceedings of the National Academy of Sciences of
the United States of America, v. 100, n. 18, p. 10141–10143, 2003.
ARIELI, R.; KEREM, D.; MELAMED, Y. Hyperoxic exposure affects the ventilatory
response to hypoxia in awake rats. Journal of Applied Physiology, v. 64, n. 1, p.
181–186, jan. 1988.
ARIELI, R.; MOSKOVITZ, Y. Humidity does not affect central nervous system oxygen
toxicity. Journal of Applied Physiology, v. 91, p. 1327–1333, 2001.
ARITA, Y. et al. Superoxide dismutase moderates basal and induced bacterial
adherence and interleukin-8 expression in airway epithelial cells. American Journal
of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology, v. 287, n. 6, p. L1199–
L1206, 2004.
ARKOVITZ, M. S. et al. Decreased pulmonary compliance is an early indicator of
pulmonary oxygen injury. Journal of Surgical Research, v. 67, n. 2, p. 193–198,
1997a.
ARKOVITZ, M. S. et al. Differential effects of hyperoxia on the inducible and
constitutive isoforms of nitric oxide synthase in the lung. Shock, v. 7, n. 5, p. 345–350,
1997b.
ASADAMONGKOL, B.; ZHANG, J. H. The development of hyperbaric oxygen therapy
for skin rejuvenation and treatment of photoaging. Medical Gas Research, v. 4, n. 1,
p. 1–6, 2014.
BANERJEE, A. K. et al. Oxidant, antioxidant and physical exercise. Molecular and
Cellular Biochemistry, v. 253, p. 307–312, 2003.
BAO, X. C. et al. Protective role of peroxisome proliferator-activated receptor β/δ in
acute lung injury induced by prolonged hyperbaric hyperoxia in rats. Respiratory
Physiology and Neurobiology, v. 199, p. 9–18, 2014.
BARAZZONE, C. et al. Oxygen toxicity in mouse lung: pathways to cell death.
American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, v. 19, n. 4, p. 573–
581, 1998.
BARAZZONE, C.; WHITE, C. W. Mechanisms of cell injury and death in hyperoxia.
Role of cytokines and Bcl-2 family proteins. American Journal of Respiratory Cell
and Molecular Biology, v. 22, n. 5, p. 517–519, 2000.
BARKER, G. F. et al. DNA damage induced by hyperoxia. American Journal of
Respiratory Cell and Molecular Biology, v. 35, n. 3, p. 277–288, 2006.
BARNAS, G. M. et al. Effect of lung volume on lung resistance and elastance in awake
subjects measured during sinusoidal forcing. Anesthesiology, v. 78, p. 1082–1090,
1993.
BARRY, B. E.; CRAPO, J. D. Patterns of Accumulation of Platelets and Neutrophils in
Rat Lungs during Exposure to 100% and 85% Oxygen. American Review of
Respiratory Disease, v. 132, n. 3, p. 548–555, 1985.
BAST, A.; HAENEN, G. R. M. M.; DOELMAN, C. J. A. Oxidants and antioxidants: state
of the art. The American Journal of Medicine, v. 91, n. Supplement 3C, p. S2–S13,
1991.
145
BATES, J. H. T. Lung mechanics: an inverse modeling approach. New York:
Cambridge University Press, 2009.
BATES, J. H. T.; IRVIN, C. G. Measuring lung function in mice: the phenotyping
uncertainty principle. Journal of Applied Physiology, v. 94, n. 4, p. 1297–1306, 2003.
BATES, J. H. T.; MILIC-EMILI, J. The flow interruption technique for measuring
respiratory resistance. Journal of Critical Care, v. 6, n. 4, p. 227–238, 1991.
BAUMGARTNER, R. W. et al. Microembolic signal counts increase during hyperbaric
exposure in patients with prosthetic heart valves. Journal of Thoracic and
Cardiovascular Surgery, v. 122, n. 6, p. 1142–1146, 2001.
BEAN, J. W. Effects of oxygen at increased pressure. Physiological Reviews, v. 25,
n. 1, p. 1–147, 1945.
BEAN, J. W. The hypophysis as a determinant in the reaction of the mammal to oxygen
at high pressure. American Journal of Physiology-Legacy Content, v. 170, n. 3, p.
508–517, 1952.
BEAN, J. W. Tris buffer, CO2 , and sympatho-adrenal system in reactions to O2 at
high pressure. American Journal of Physiology-Legacy Content, v. 201, n. 4, p.
737–739, 1961.
BEAN, J. W. Factors influencing clinical oxygen toxicity. Annals of the New York
Academy of Sciences, v. 117, n. 2, p. 745–755, 1965.
BEAN, J. W.; JOHNSON, P. C. Influence of hypophysis on pulmonary injury induced
by exposure to oxygen at high pressure and by pneumococcus. American Journal of
Physiology-Legacy Content, v. 171, n. 2, p. 451–458, 1952.
BEAN, J. W.; JOHNSON, P. C. Epinephrine and neurogenic factors in the pulmonary
edema and CNS reactions induced by O2 at high pressure. American Journal of
Physiology-Legacy Content, v. 180, n. 2, p. 438–444, 1955.
BEAN, J. W.; LIGNELL, J.; COULSON, J. Regional cerebral blood flow, O2, and EEG
in exposures to O2 at high pressure. Journal of Applied Physiology, v. 31, n. 2, p.
235–242, 1971.
BEAN, J. W.; SMITH, C. W. Hypophyseal and Adrenocortical Factors in Pulmonary
Damage Induced by Oxygen at Atmospheric Pressure. American Journal of
Physiology-Legacy Content, v. 172, n. 1, p. 169–174, 1952.
BEAN, J. W.; ZEE, D. Influence of anesthesia and CO2 on CNS and pulmonary effects
of O2 at high pressure. Journal of Applied Physiology, v. 21, n. 2, p. 521–526, 1966.
BEAN, J. W.; ZEE, D.; THOM, B. Pulmonary changes with convulsions induced by
drugs and oxygen at high pressure. Journal of Applied Physiology, v. 21, n. 3, p.
865–872, 1966.
BECKMAN, D. L.; WEISS, H. S. Hyperoxia compared to surfactant washout on
pulmonary compliance in rats. Journal of Applied Physiology, v. 26, n. 6, p. 700–
709, 1969.
BECKMAN, K. B.; AMES, B. N. The free radical theory of aging matures.
Physiological Reviews, v. 78, n. 2, p. 547–581, 1998.
BEDDOUS, T. A familiar explanation of the principles on which benefit may be
146
expected from factitious airs in various diseases. In: Considerations on the
medicinal use and production of factitious airs and the manner of obtaining them
in large quantities. Bristol: Bulgin and Rosser, 1794. v. Ip. 9–48.
BEEHLER, C. C. Oxygen and the eye. Survey of Ophthalmology, v. 9, p. 549–560,
1964.
BEEHLER, C. C. et al. Retinal detachment in adult dogs resulting from oxygen toxicity.
Archives of Ophthalmology, v. 71, n. 5, p. 665–670, 1964.
BEHNKE, A. R. et al. The effect of oxygen on man at pressures from 1 to 4
atmospheres. American Journal of Physiology-Legacy Content, v. 110, n. 3, p.
565–572, 1934.
BEHNKE, A. R.; FORBES, H. S.; MOTLEY, E. P. Circulatory and visual effects of
oxygen at 3 atmospheres pressure. American Journal of Physiology-Legacy
Content, v. 114, n. 2, p. 436–442, 1935.
BENNETT, M. H. et al. Hyperbaric oxygen therapy for late radiation tissue injury.
Cochrane Database of Systematic Reviews, n. 5, p. CD005005, 2005.
BENNETT, M. H. et al. Recompression and adjunctive therapy for decompression
illness. Cochrane Database of Systematic Reviews, n. 5, p. CD005277, 2012.
BENNETT, M. H.; LEHM, J. P.; JEPSON, N. Hyperbaric oxygen therapy for acute
coronary syndrome. Cochrane Database of Systematic Reviews, n. 8, p. CD004818,
2011.
BENSON, R. M. et al. Hyperbaric oxygen inhibits stimulus-induced proinflammatory
cytokine synthesis by human blood-derived monocyte-macrophages. Clinical and
Experimental Immunology, v. 134, n. 1, p. 57–62, 2003.
BERGØ, G. W.; TYSSEBOTN, I. Respiratory frequency and distribution of cardiac
output in rats breathing gas with different densities. Scandinavian Journal of Clinical
and Laboratory Investigation, v. 51, n. 1, p. 59–66, 1991.
BERRY, S.; FITCH, J. W.; SCHATTE, C. L. Influence of sex and age on the
susceptibility of mice to oxygen poisoning. Aviation, Space, and Environmental
Medicine, v. 48, n. 1, p. 37–9, jan. 1977.
BERSTEN, A. D. Measurement of overinflation by multiple linear regression analysis
in patients with acute lung injury. European Respiratory Journal, v. 12, n. 3, p. 526–
532, 1998.
BERT, P. La Pression Barometrique: recherches de Physiologie Expérimentale.
Paris: Typographie Lahure, 1878.
BITTERMAN, H. Bench-to-bedside review: Oxygen as a drug. Critical Care, v. 13, n.
1, p. 205, 2009.
BITTERMAN, N. CNS oxygen toxicity. Undersea and Hyperbaric Medicine, v. 31, n.
1, p. 63–72, 2004.
BLISS, C. I. The method of probits. Science, v. 79, n. 2037, p. 38–39, 1934.
BLISS, C. I. The calculation of the dosage‐mortality curve. Annals of Applied
Biology, v. 22, n. 1, p. 134–167, 1935.
BOEREMA, I. et al. Life without blood. Journal of Cardiovascular Surgery, v. 13, p.
147
133–146, 1959.
BOEREMA, I.; BRUMMELKAMP, W. H.; MEIJNE, N. G. Clinical Application of
Hyperbaric Oxygen. Amsterdam: Elsevier, 1964.
BOVERIS, A.; CHANCE, B. The mitochondrial generation of hydrogen peroxide.
General properties and effect of hyperbaric oxygen. The Biochemical Journal, v. 134,
n. 3, p. 707–716, 1973.
BRADFORD, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram
quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical
Biochemistry, v. 72, p. 248–254, 1976.
BRIEGER, K. et al. Reactive oxygen species: from health to disease. Swiss Medical
Weekly, v. 142, p. w13659, 2012.
BRIGHAM, K. L. Role of free radicals in lung injury. Chest, v. 89, n. 6, p. 859–863,
1986.
BRINKMANN, R. T. Dissociation of water vapor and evolution of oxygen in the
terrestrial atmosphere. Journal of Geophysical Research, v. 74, n. 23, p. 5355–
5368, 1969.
BROCKS, J. J. et al. Archean molecular fossils and the early rise of eukaryotes.
Science, v. 285, n. 5430, p. 1033–1036, 1999.
BUCCELLATO, L. J. et al. Reactive Oxygen Species are required for hyperoxiainduced Bax activation and cell death in alveolar epithelial cells. Journal of Biological
Chemistry, v. 279, n. 8, p. 6753–6760, 2004.
BUCKLEY, N. A. et al. Hyperbaric oxygen for carbon monoxide poisoning. Cochrane
Database of Systematic Reviews, n. 4, p. CD002041, 2011.
BUCKLEY, S. et al. Apoptosis and DNA damage in type 2 alveolar epithelial cells
cultured from hyperoxic rats. American Journal of Physiology-Lung Cellular and
Molecular Physiology, v. 274, n. 5, p. L714–L720, 1998.
BUICK, R. When did oxygenic photosynthesis evolve? Philosophical Transactions
of the Royal Society B: Biological Sciences, v. 363, n. 1504, p. 2731–2743, 2008.
BURGER, E. J.; MACKLEM, P. Airway closure: demonstration by breathing 100
percent O2 at low lung volumes and by N2 washout. Journal of Applied Physiology,
v. 25, n. 2, p. 139–148, 1968.
BURGER, E. J.; MEAD, J. Static properties of lungs after oxygen exposure. Journal
of Applied Physiology, v. 27, n. 2, p. 191–197, 1969.
BUTLER, F. K.; HAGAN, C. Ocular complications in Hyperbaric Oxygen Therapy.
First Edit ed. New York: Elsevier Inc., 2008.
BUTLER JR., F. K.; HAGAN, C.; MURPHY-LAVOIE, H. Hyperbaric oxygen therapy
and the eye. Undersea & Hyperbaric Medicine, v. 35, n. 5, p. 333–387, 2008.
BUTLER, W. P. Caisson disease during the construction of the Eads and Brooklyn
Bridges: A review. Undersea and Hyperbaric Medicine, v. 31, n. 4, p. 445–459, 2004.
BYFIELD, G.; BUDD, S.; ELIZABETH HARTNETT, M. The role of supplemental
oxygen and JAK/STAT signaling in intravitreous neovascularization in a ROP rat
148
model. Investigative Ophthalmology and Visual Science, v. 50, n. 7, p. 3360–3365,
2009.
CALABRESE, V. et al. Nitric oxide in the central nervous system: neuroprotection
versus neurotoxicity. Nature Reviews Neuroscience, v. 8, n. 10, p. 766–775, 2007.
CALDWELL, P. R. et al. Changes in lung volume, diffusing capacity, and blood gases
in men breathing oxygen. Journal of Applied Physiology, v. 21, n. 5, p. 1477–1483,
set. 1966.
CALVERT, J. W. et al. Effect of hyperbaric oxygen on apoptosis in neonatal hypoxiaischemia rat model. Journal of Applied Physiology, v. 95, n. 5, p. 2072–2080, 2003.
CAMPBELL, K. Intensive oxygen therapy as a possible cause of retrolental fibroplasia;
a clinical approach. The Medical journal of Australia, v. 2, n. 2, p. 48–50, 14 jul.
1951.
CAMPIAN, J. L. et al. Oxygen tolerance and coupling of mitochondrial electron
transport. Journal of Biological Chemistry, v. 279, n. 45, p. 46580–46587, 2004.
CANFIELD, D. E.; ROSING, M. T.; BJERRUM, C. Early anaerobic metabolisms.
Philosophical Transactions of the Royal Society of London, v. 361, n. 1474, p.
1819–1836, 2006.
CAO, Y. et al. MicroRNA-15a/16 regulates apoptosis of lung epithelial cells after
oxidative stress. Molecular Medicine, v. 22, n. 1, p. 1, 2016.
CAPELLIER, G. et al. Tolérance et résistance à la toxicité pulmonaire de l’oxygène
normobare. Réanimation Urgences, v. 5, n. 5, p. 623–636, 1996.
CAPELLIER, G. et al. Oxygen toxicity and tolerance. Minerva Anestesiologica, v. 65,
n. 6, p. 388–392, 1999.
CARLSSON, L. M. et al. Mice lacking extracellular superoxide dismutase are more
sensitive to hyperoxia. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, v.
92, p. 6264–6268, 1995.
CARVALHO, O. F. DE et al. Efeito oxidativo do óxido nítrico e infertilidade no macho.
Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial, v. 38, n. 1, p. 33–38, 2002.
CAZALS, V. et al. Insulin-like growth factors, their binding proteins, and transforming
growth factor-β 1 in oxidant-arrested lung alveolar epithelial cells. Journal of
Biological Chemistry, v. 269, n. 19, p. 14111–14117, 1994.
CHANCE, B.; WILLIAMS, G. R. The respiratory chain and oxidative phosphorylation.
In: NORD, F. F. (Ed.). . Advances in Enzymology - and Related Areas of Molecular
Biology. New York, NY: Interscience Publishers, 1956. v. 17p. 65–134.
CHANDEL, N. S.; BUDINGER, G. R. S. The cellular basis for diverse responses to
oxygen. Free Radical Biology and Medicine, v. 42, n. 2, p. 165–174, 2007.
CHANG, K.-M. Fermentation, phlogiston and matter theory: chemistry and natural
philosophy in Georg Ernst Stahl’s Zymotechnia Fundamentalis. Early Science and
Medicine, v. 7, n. 1, p. 31–64, 2002.
CHAO, D. T.; KORSMEYER, S. J. BCL-2 family: regulators of cell death. Annual
Review of Immunology, v. 16, n. 1, p. 395–419, 1998.
CHAVES, J. C. et al. Hyperbaric oxygen therapy protects the liver from apoptosis
149
caused by ischemia-reperfusion injury in rats. Microsurgery, v. 29, p. 578–583, 2009.
CHAWLA, A.; LAVANIA, A. Oxygen Toxicity. Medical Journal Armed Forces India,
v. 57, n. 2, p. 131–133, 2001.
CHETTY, A. et al. The role of IL-6 and IL-11 in hyperoxic injury in developing lung.
Pediatric Pulmonology, v. 43, p. 297–304, 2008.
CHOO-WING, R. et al. Developmental differences in the responses of IL-6 and IL-13
transgenic mice exposed to hyperoxia. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, v. 293,
n. 1, p. L142-50, 2007.
CHOWDHURY, A. K. et al. Src-mediated tyrosine phosphorylation of p47phox in
hyperoxia-induced activation of NADPH oxidase and generation of reactive oxygen
species in lung endothelial cells. Journal of Biological Chemistry, v. 280, n. 21, p.
20700–20711, 2005.
CIENCEWICKI, J.; TRIVEDI, S.; KLEEBERGER, S. R. Oxidants and the pathogenesis
of lung diseases. Journal of Allergy and Clinical Immunology, v. 122, p. 456–468,
2008.
CLAIREAUX, A. E. The effect of Oxygen on the lung. Journal of Clinical Pathology,
v. 9, n. Suppl.9, p. 75–80, 1975.
CLARK, J. et al. Comparison of human visual and pulmonary responses to continuous
and intermittent oxygen exposure at 2.0 ata in predictive studies V and VI. Undersea
Biomedical Research, v. 18, p. 86, 1991.
CLARK, J. M. Pulmonary limits of oxygen tolerance in man. Experimental Lung
Research, v. 14, n. sup1, p. 897–910, 1988.
CLARK, J. M. Oxygen toxicity. In: BENNETT PB; ELLIOT, D. (Eds.). . The physiology
and medicine of diving. London: W.B. Saunders Co., 1993. p. 121–169.
CLARK, J. M. Oxygen toxicity. In: NEUMAN, T. S.; THOM, S. R. (Eds.). . Physiology
and Medicine of Hyperbaric Oxygen Therapy. Philadelphia, PA: Saunders, 2008. p.
527–562.
CLARK, J. M.; LAMBERTSEN, C. J. Pulmonary oxygen tolerance in man and
derivation of pulmonary oxygen tolerance curves. Philadelphia, PA: Institute for
Environmental Medicine. University of Pennsylvania Medical Center, 1970.
CLARK, J. M.; LAMBERTSEN, C. J. Pulmonary oxygen toxicity: a review.
Pharmacological Reviews, v. 23, n. 2, p. 37–133, 1971a.
CLARK, J. M.; LAMBERTSEN, C. J. Rate of development of pulmonary O2 toxicity in
man during O2 breathing at 2.0 ATA. Journal of Applied Physiology, v. 30, n. 5, p.
739–752, 1971b.
CLARK, J. M.; WHELAN, H. Oxygen toxicity. In: KINDWALL, E. P.; WHELAN, H. T.
(Eds.). . Hyperbaric Medicine Practice. 2nd. ed. Flagstaff: Best Publishing Company,
1999. p. 69–82.
CLARKE, G. M.; SANDISON, A. T.; LEDINGHAM, I. M. Acute pulmonary oxygen
toxicity: a pathophysiological study at 1 and 2 atmospheres absolute (ATA) in
spontaneously breathing anaesthetized dogs. British Journal of Anaesthesia, v. 41,
n. 6, p. 558–559, 1969.
150
COALSON, J. J. et al. Neonatal chronic lung disease in extremely immature baboons.
American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, v. 160, n. 4, p. 1333–
1346, 1999.
COALSON, J. J. et al. A baboon model of bronchopulmonary dysplasia. Experimental
and Molecular Pathology, v. 37, n. 3, p. 335–350, 2004.
CONSELHO FEDERAL DE MEDICINA. Resolução CFM no1457/95Brasil, 1995.
CONTENAU, G. La médecine en Assyrie et en Babylonie. Paris: Librairie, 1938.
CRAPO, J. D. et al. The failure of aerosolized superoxide dismutase to modify
pulmonary oxygen toxicity. American Review of Respiratory Disease, v. 115, n. 6,
p. 1027–1033, 1977.
CRAPO, J. D. Morphologic changes in pulmonary oxygen toxicity. Annual Review of
Physiology, v. 48, p. 721–731, 1986.
CRAPO, J. D.; TIERNEY, D. F. Superoxide dismutase and pulmonary oxygen toxicity.
American Journal of Physiology, v. 226, n. 6, p. 1401–1407, 1974.
CUCCHIARO, G. et al. Inducible nitric oxide synthase in the lung and exhaled nitric
oxide after hyperoxia. American Journal of Physiology - Lung Cellular and
Molecular Physiology, v. 277, p. 636–644, 1999.
D’ANGELO, E. et al. Chest wall interrupter resistance in anesthetized paralyzed
humans. Journal of Applied Physiology, v. 77, n. 2, p. 883–887, 1994.
DAHL, T. W. et al. Devonian rise in atmospheric oxygen correlated to the radiations of
terrestrial plants and large predatory fish. Proceedings of the National Academy of
Sciences of the United States of America, v. 107, n. 42, p. 17911–17915, 2010.
DAVY, H. Researches, chemical and philosophical, chiefly concerning nitrous
oxide and its respiration. Bristol: J. Johnson, 1800.
DE MARTINO, G. et al. Toxic Effects of Oxygen. In: ORIANI, G.; MARRONI, A.;
WATTEL, F. (Eds.). . Handbook on Hyperbaric Medicine. Milano: Springer Milan,
1996. p. 59–80.
DEFORGE, L. E. et al. Regulation of interleukin 8 gene expression by oxidant stress.
Journal of Biological Chemistry, v. 268, n. 34, p. 25568–25576, 1993.
DEMCHENKO, I. T. et al. Regulation of the brain’s vascular responses to oxygen.
Circulation Research, v. 91, n. 11, p. 1031–1037, 2002.
DEMCHENKO, I. T. et al. Similar but not the same: normobaric and hyperbaric
pulmonary oxygen toxicity, the role of nitric oxide. American Journal of Physiology.
Lung Cellular and Molecular Physiology, v. 293, p. L229–L238, 2007.
DEMCHENKO, I. T. et al. Contributions of nitric oxide synthase isoforms to pulmonary
oxygen toxicity, local vs. mediated effects. American Journal of Physiology. Lung
Cellular and Molecular Physiology, v. 295, n. 5, p. 1203–1214, 2008.
DEMCHENKO, I. T. et al. Autonomic activation links CNS oxygen toxicity to acute
cardiogenic pulmonary injury. American journal of physiology. Lung cellular and
molecular physiology, v. 300, n. 1, p. L102-11, 2011.
DEMCHENKO, I. T.; PIANTADOSI, C. A. Nitric oxide amplifies the excitatory to
inhibitory neurotransmitter imbalance accelerating oxygen seizures. Undersea and
151
Hyperbaric Medicine, v. 33, n. 3, p. 169–174, 2006.
DENNOG, C. et al. Detection of DNA damage after hyperbaric oxygen (HBO) therapy.
Mutagenesis, v. 11, n. 6, p. 605–609, 1996.
DEVOS, F. C. et al. Forced expiration measurements in mouse models of obstructive
and restrictive lung diseases. Respiratory Research, v. 18, n. 1, p. 1–14, 2017.
DICKENS, F. The toxic effects of oxygen on brain metabolism and on tissue enzymes:
2. Tissue enzymes. The Biochemical Journal, v. 40, n. 1, p. 171–187, 1946a.
DICKENS, F. The toxic effects of oxygen on brain metabolism and on tissue enzymes.
The Biochemical Journal, v. 40, n. 1, p. 145–171, 1946b.
DIETRICH, L. E. P.; TICE, M. M.; NEWMAN, D. K. The co-evolution of life and Earth.
Current Biology, v. 16, n. 11, p. R395–R400, 2006.
DONALD, K. W. Oxygen poisoning in man. British Medical Journal, v. 1, n. 4507, p.
712–717, 1947a.
DONALD, K. W. Oxygen poisoning in man II. British Medical Journal, v. 1, n. 4507,
p. 712–717, 1947b.
DRÖGE, W. Free radicals in the physiological control of cell function. Physiological
Reviews, v. 82, p. 47–95, 2002.
DUVALL, E.; WYLLIE, A. H. Death and the cell. Immunology Today, v. 7, n. 4, p.
115–119, 1986.
EDSTRÖM, J.-E.; RÖCKERT, H. The effect of oxygen at high pressure on the histology
of the Central Nervous System and sympathetic and endocrine cells. Acta
Physiologica Scandinavica, v. 55, n. 2–3, p. 255–263, 1962.
ELIADE, M. Gods, goddesses, and myths of creation: a thematic source book of
the history of religions. New York: Harper & Row, 1974.
ELIZABETH HARTNETT, M. The effects of oxygen stresses on the development of
features of severe retinopathy of prematurity: Knowledge from the 50/10 OIR model.
Documenta Ophthalmologica, v. 120, n. 1, p. 25–39, 2010.
ESKES, A. et al. Hyperbaric oxygen therapy for treating acute surgical and traumatic
wounds. Cochrane Database of Systematic Reviews, n. 12, p. CD008059, 2013.
ESQUIBIES, A. E. et al. VEGF attenuates hyperoxic injury through decreased
apoptosis in explanted rat embryonic lung. Pediatric Research, v. 63, n. 1, p. 20–25,
2008.
EVANS, W. J. Vitamin E, vitamin C, and exercise. American Journal of Clinical
Nutrition, v. 72, n. Supplement, p. S647–S652, 2000.
FABISIAK, J. P.; EVANS, J. N.; KELLEY, J. Increased Expression of PDGF-B (c-sis)
mRNA in Rat Lung Precedes DNA Synthesis and Tissue Repair during Chronic
Hyperoxia. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, v. 1, n.
3, p. 181–189, 1989.
FAGAN, K. A. et al. Relative contributions of endothelial, inducible, and neuronal NOS
to tone in the murine pulmonary circulation. American Journal of Physiology - Lung
Cellular and Molecular Physiology, v. 277, p. 472–478, 1999.
152
FAULKNER, J. M.; BINGER, C. A. L. Oxygen poisoning in cold blooded animals.
Journal of Experimental Medicine, v. 45, p. 865–872, 1927.
FENN, W. O. et al. Mutagenic effects of high oygen tensions on Escherichia coli.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America, v. 43, n. 12, p. 1027–1032, 1957.
FENN, W. O. Interactions of oxygen and inert gases in Drosophila. Respiration
Physiology, v. 3, n. 2, p. 117–129, 1967.
FENN, W. O.; HENNING, M.; PHILPOTT, M. Oxygen Poisoning in Drosophila.pdf.
Journal of General Physiology, v. 50, 1967.
FERREIRA, A. L. A.; MATSUBARA, L. S. Radicais livres: conceitos, doenças
relacionadas, sistema de defesa e estresse oxidativo. Revista da Associação
Médica Brasileira, v. 43, n. 1, p. 61–68, 1997.
FERREIRA, F.; FERREIRA, R.; DUARTE, J. A. Stress oxidativo e dano oxidativo
muscular esquelético: influência do exercício agudo inabitual e do treino físico.
Revista Portuguesa de Ciência Desportiva, v. 7, n. 2, p. 257–275, 2006.
FINNEY, D. J. Probit Analysis: a statistical treatment of the sigmoid response
curve. 2nd. ed. Cambridge: Cambridge University Press, 1952.
FISCHER, A. et al. Nitric oxide synthase in guinea pig lower airway innervation.
Neuroscience Letters, v. 149, n. 2, p. 157–160, 1993.
FISHER, A. B. et al. Effect of oxygen at 2 atmospheres on the pulmonary mechanics
of normal man. Journal of Applied Physiology, v. 24, n. 4, p. 529–536, 1968.
FISHER, R. A. The case of zero survivors in probit assays, Appendix to Bliss
(1935)Annals of Applied Biology, 1935.
FLOHÉ, L.; GÜNZLER, W. A. Assays of glutathione peroxidase. Methods in
Enzymology, v. 105, p. 114–120, 1984.
FORMAN, H. J. Redox signaling: An evolution from free radicals to aging. Free
Radical Biology and Medicine, v. 97, p. 398–407, 2016.
FORONJY, R. F. et al. Speroxide dismutase expression attenuates cigarette smokeor elastase-generated emphysema in mice. American Journal of Respiratory and
Critical Care Medicine, v. 173, p. 623–631, 2006.
FORTES FILHO, J. B. et al. Prevention of retinopathy of prematurity. Arquivos
Brasileiros de Oftalmologia, v. 74, p. 217–221, 2011.
FORTUNATO, R. S. et al. Functional consequences of dual oxidase-thyroperoxidase
interaction at the plasma membrane. The Journal of Clinical Endocrinology and
Metabolism, v. 95, n. 12, p. 5403–5411, 2010.
FORTUNATO, R. S. et al. Sexual Dimorphism of Thyroid Reactive Oxygen Species
Production Due to Higher NADPH Oxidase 4 Expression in Female Thyroid Glands.
Thyroid, v. 23, n. 1, p. 111–119, 2013.
FREEMAN, B. A.; CRAPO, J. D. Hyperoxia increases oxygen radical production in rat
lungs and lung mitochondria. Journal of Biological Chemistry, v. 256, n. 21, p.
10986–10992, 1981.
FREEMAN, B. A.; CRAPO, J. D. Biology of disease: free radicals and tissue injury.
153
Laboratory Investigation, v. 47, n. 5, p. 412–426, 1982.
FREEMAN, B. D. et al. Controlled trials of rG-CSF and CD11b-directed MAb during
hyperoxia and E. coli pneumonia in rats. Journal of Applied Physiology, v. 80, n. 6,
p. 2066–2076, 1996.
FRIDOVICH, I. The biology of oxygen radicals. Science, v. 201, n. 4359, p. 875–880,
1978.
FUJITA, M. et al. Endothelial cell apoptosis in lipopolysaccharide-induced lung injury
in mice. International Archives of Allergy and Immunology, v. 117, n. 3, p. 202–8,
1998.
FUJIWARA, T.; ADAMS, F. H.; SETO, K. Lipids and surface tension of extracts of
normal and oxygen-treated guinea pig lungs. The Journal of Pediatrics, v. 65, n. 1,
p. 45–52, 1964.
FULTON, J. F. Robert Boyle and his influence on thought in the seventeenth century.
Isis, v. 18, n. 1, p. 77–102, 1932.
FUNG, Y. C. Biomechanics: mechanical properties of living tissues. New York:
Springer-Verlag, 1981.
FURMANSKI, J. et al. Viscoelasticity. In: Mechanics of Biomaterials. Cambridge:
Cambridge University Press, 2012. p. 208–240.
FUSON, R. L. et al. Clinical Hyperbaric Oxygenation with Severe Oxygen Toxicity.
New England Journal of Medicine, v. 273, n. 8, p. 415–419, 1965.
GALSTON, A. W.; SIEGEL, S. M. Antiperoxidative action of the cobaltous ion and its
consequences for plant growth. Science, v. 120, n. 3130, p. 1070–1071, 1954.
GARBER, J. C. et al. Guide for the care and use of laboratory animals. 8th. ed.
Washington, DC: National Academies Press, 2011.
GARDNER, P. R. et al. Superoxide radical and iron modulate aconitase activity in
mammalian cells. Journal of Biological Chemistry, v. 270, n. 22, p. 13399–13405,
1995.
GARDNER, P. R.; NGUYEN, D. D.; WHITE, C. W. Aconitase is a sensitive and critical
target of oxygen poisoning in cultured mammalian cells and in rat lungs. Proceedings
of the National Academy of Sciences, v. 91, n. 25, p. 12248–12252, 2006.
GERSCHMAN, R. et al. Oxygen poisoning and X-irradiation: a mechanism in common.
Science, v. 119, n. 3097, p. 623–626, 1954.
GERSCHMAN, R.; GILBERT, D. L.; CACCAMISE, D. Effect of various substances on
survival times of mice exposed to different high oxygen tensions. American Journal
of Physiology, v. 192, n. 3, p. 563–571, 1958.
GERSH, I.; WAGNER, C. E. Metabolic factors in oxygen poisoning. American Journal
of Physiology-Legacy Content, v. 144, n. 2, p. 270–277, 1945.
GILBERT, D. L. Oxygen and living processes: an interdisciplinary approach. New
York, NY: Springer-Verlag, 1981.
GILBERT, D. L.; GERSCHMAN, R.; FENN, W. O. Effects of Fasting and X-Irradiation
on Oxygen Poisoning in Mice. American Journal of Physiology-Legacy Content, v.
154
181, n. 2, p. 272–274, 1955.
GOLDFARB, A. H. Nutritional antioxidants as therapeutic and preventive modalities in
exercise-induced muscle damage. Canadian Journal of Applied Physiology, v. 24,
n. 3, p. 249–266, 1999.
GOTTLIEB, S. F. Effect of hyperbaric oxygen on microorganisms. Annual Review of
Microbiology, v. 25, n. 1, p. 111–152, 1971.
GOTTLIEB, S. F. Oxygen toxicity in unicellular organisms. In: GILBERT, D. L. (Ed.). .
Oxygen and living processes. An interdisciplinary approach. New York: SpringerVerlag, 1981. p. 401.
GRANDPIERRE, R.; GROGNOT, P.; SENELAR, R. Modifications des lesions
pulmonaires provoque par l’inhalation d’oxygene apres section d’un nerf
pneumogastrique. Journal of Physiology (Paris), v. 48, p. 564–565, 1956.
GREEN, D. R.; REED, J. C. Mitochondria and apoptosis. Science, v. 281, n. 5381, p.
1309–1312, 1998.
GRIVICICH, I.; REGNER, A.; DA ROCHA, A. B. Morte Celular por Apoptose. Revista
Brasileira de Cancerologia, v. 53, n. 3, p. 335–343, 2007.
GUIDOT, D. M. et al. Absence of electron transport (Rho0 state) restores growth of a
manganese-superoxide dismutase-deficient Saccharomyces cerevisiae in hyperoxia:
evidence for electron transport as a major source of superoxide generation in vivo.
Journal of Biological Chemistry, v. 268, n. 35, p. 26699–26703, 1993.
GUTHMANN, F. et al. Inhibition of TNFalpha in vivo prevents hyperoxia-mediated
activation of caspase 3 in type II cells. Respiratory Research, v. 6, n. 10, p. 10, 2005.
GUYTON, A. C.; COLEMAN, T. G.; GRANGER, H. J. Circulation: Overall Regulation.
Annual Review of Physiology, v. 34, n. 1, p. 13–44, 1972.
HALDANE, J. B. S. The origin of life. The Rationalist Annual (1929). In: On being the
right size and other essays. Oxford: Oxford University Press, 1991.
HALL, J. E. Guyton & Hall. Tratado de Fisiologia Médica. Traducao Alcides Marinho
Junior et al. Rio de Janeiro: Elsevier, 2011.
HALL, T. S. History of General Physiology - 600 B.C. to A.D. 1900. From presocratic times to the enlightenment. Chicago: University of Chicago, 1975. v. 1.
HALLIWELL, B. Reactive oxygen species in living systems: source , biochemistry, and
role in human disease. The American Journal of Medicine, v. 91, n. Supplement 3C,
p. S14–S22, 1991.
HALLIWELL, B. Free radicals, antioxidants, and human disease: Curiosity, cause, or
consequence? Lancet, v. 344, n. 8924, p. 721–724, 1994.
HALLIWELL, B.; GUTTERIDGE, J. M. C. Free radicals in biology and medicine. 5th
Ed. ed. Oxford: Oxford University Press, 2015.
HAN, R. N. et al. Insulin-like growth factor-I and type I insulin-like growth factor receptor
in 85% O2-exposed rat lung. American Journal of Physiology-Lung Cellular and
Molecular Physiology, v. 271, n. 1, p. L139–L149, 1996a.
HAN, R. N. N. et al. Changes in structure, mechanics, and insulin-like growth factorrelated gene expression in the lungs of newborn rats exposed to air or 60% oxygen.
155
Pediatric Research, v. 39, p. 921–929, 1996b.
HAN, R. N. N. et al. Insulin-like growth factor binding proteins in air- And 85% oxygenexposed adult rat lung. American Journal of Physiology, v. 274, p. L647–L656,
1998.
HANTOS, Z. et al. Mechanical impedances of lungs and chest wall in the cat. Journal
of Applied Physiology, v. 73, n. 2, p. 427–433, 1992a.
HANTOS, Z. et al. Input impedance and peripheral inhomogeneity of dog lungs.
Journal of Applied Physiology, v. 72, n. 1, p. 168–178, 1992b.
HARABIN, A. L.; HOMER, L. D.; BRADLEY, M. E. Pulmonary oxygen toxicity in awake
dogs: metabolic and physiological effects. Journal of Applied Physiology, v. 57, n.
5, p. 1480–1488, 1984.
HARIJITH, A. et al. Hyperoxia-induced p47 phox activation and ROS generation is
mediated through S1P transporter Spns2 , and S1P / S1P 1 & 2 signaling axis in lung
endothelium. v. 2, n. 23, p. 337–351, 2016.
HARSCH, V. Robert Hooke, inventor of the vacuum pump and the first altitude
chamber (1671). Aviation, Space, and Environmental Medicine, v. 77, n. 8, p. 867–
869, 2006.
HART, M. H. The evolution of the atmosphere of the earth. Icarus, v. 33, n. 1, p. 23–
39, 1978.
HARTNEY, J. M.; ROBICHAUD, A. Assessment of airway hiperresponsiveness in
mouse models of allergic lung disease using detailed measurements of respiratory
mechanics. In: ALLEN, I. C. (Ed.). . Mouse Models of Allergic Disease: Methods
and Protocols, Methods in Molecular Biology. 1st. ed. New York: Springer, 2013.
v. 1032p. 205–217.
HARWOOD, J. L.; RICHARDS, R. J. Lung surfactant. Molecular Aspects of
Medicine, v. 8, n. 5, p. 423–514, 1985.
HAUGAARD, N. Cellular mechanisms of oxygen toxicity. Physiological Reviews, v.
48, n. 2, p. 311–365, 1968.
HAYASHI, Y. et al. Quercetin protects against pulmonary oxidant stress via heme
oxygenase-1 induction in lung epithelial cells. Biochemical and Biophysical
Research Communications, v. 417, n. 1, p. 169–174, 2012.
HAYES, A. W.; KRUGER, C. L. (EDS.). Hayes’ Principles and Methods of
Toxicology. 6th. ed. [s.l.] CRC Press, 2014.
HE, C. H. et al. Bcl-2-related protein A1 is an endogenous and cytokine-stimulated
mediator of cytoprotection in hyperoxic acute lung injury. Journal of Clinical
Investigation, v. 115, n. 4, p. 1039–1048, 2005.
HEDERER, C.; ANDRÉ, L. De l’intoxication par les hautes pressions d’oxygéne.
Bulletin de l’Academie Nationale de Medicine (Paris), v. 123, p. 294–308, 1940.
HEMINGWAY, A.; WILLIAMS, W. L. Pulmonary edema in oxygen poisoning.
Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. Society for
Experimental Biology and Medicine (New York, N.Y.), v. 80, n. 2, p. 331–4, 1952.
HESS, R. T.; MENZEL, D. B. Effect of dietary antioxidant level and oxygen exposure
156
on the fine structure of the proximal convoluted tubules. Aerospace medicine, v. 42,
n. 6, p. 646–649, 1971.
HESSE, A. K. et al. Proinflammatory role of inducible nitric oxide synthase in acute
hyperoxic lung injury. Respiratory Research, v. 5, p. 1–9, 2004.
HII, C. S.; FERRANTE, A. Regulation of the NADPH oxidase activity and anti-microbial
function of neutrophils by arachidonic acid. Archivum Immunologiae et Therapiae
Experimentalis, v. 55, p. 99–110, 2007.
HILDEBRANDT, J. Pressure-volume data of cat lung interpreted by a plastoelastic,
linear viscoelastic model. Journal of Applied Physiology, v. 28, n. 3, p. 365–372,
1970.
HILL, G. B. Hyperbaric oxygen exposures at 3 and 4 atmospheres absolute pressure
for experimental gas gangrene: succinate protection against oxygen toxicity.
Antimicrobial Agents and Chemotherapy, v. 2, n. 5, p. 384–389, 1972.
HILL, G. B.; OSTERHOUT, S.; O’FALLON, W. M. Variation in response to hyperbaric
oxygen among inbred strains of mice. Experimental Biology and Medicine, v. 129,
n. 3, p. 687–689, 1968.
HIRSCH, T. et al. Caspases: enemies within. Science, v. 281, p. 1312–1317, 1998.
HO, Y. S. et al. Transgenic models for the study of lung antioxidant defense: enhanced
manganese-containing superoxide dismutase activity gives partial protection to B6C3
hybrid mice exposed to hyperoxia. American Journal of Respiratory Cell and
Molecular Biology, v. 18, n. 4, p. 538–547, 1998.
HOHMANN-MARRIOTT, M. F.; BLANKENSHIP, R. E. Evolution of Photosynthesis.
Annual Review of Plant Biology, v. 62, n. 1, p. 515–548, 2011.
HOLLAND, H. D. The oxygenation of the atmosphere and oceans. Philosophical
Transactions of the Royal Society of London. B, Biological Sciences, v. 361, p.
903–915, 2006.
HOLLAND, J. et al. Regional distribution of pulmonary ventilation and perfusion in
elderly subjects. Journal of Clinical Investigation, v. 47, n. 1, p. 81–92, 1968.
HORINOUCHI, H. et al. TNF alpha gene and protein expression in alveolar
macrophages in acute and chronic hyperoxia-induced lung injury. American Journal
of Respiratory Cell and Molecular Biology, v. 14, n. 6, p. 548–555, 1996.
HUBER, G. L.; DRATH, D. B. Pulmonary Oxygen Toxicity. In: GILBERT, D. L. (Ed.). .
Oxygen and living processes. An interdisciplinary approach. New York: SpringerVerlag, 1981. p. 273–342.
HULPIEU, H.; COLE, V. The effect of humidity and temperature on oxygen toxicity.
Journal of Laboratory and Clinical Medicine, v. 29, p. 1134–1138, 1944.
HUNDEMER, G. L. et al. Altitude decompression sickness incidence among U-2 pilots:
1994-2010. Aviation Space and Environmental Medicine, v. 83, n. 10, p. 968–974,
2012.
HYDE, R. W.; RAWSON, A. J. Unintentional Iatrogenic Oxygen Pneumonitis—
Response to Therapy. Annals of Internal Medicine, v. 71, n. 3, p. 517–528, 1969.
IHDE, A. J. Priestley and Lavoisier. In: KIEFT, L.; WILLEFORD, B. R. (Eds.). . Joseph
157
Priestley. Scientist, theologian and Metaphysician. Cranbury, New Jersey:
Associated University Presses, 1980. p. 62–91.
ILIZAROV, A. M. et al. Overexpression of manganese superoxide dismutase protects
lung epithelial cells against oxidant injury. American Journal of Respiratory Cell and
Molecular Biology, v. 24, n. 4, p. 436–441, 2001.
INAMOTO, Y. et al. Effect of hyperbaric oxigenation on macrophage function in mice.
Biochemical and Biophysical Research Communications, v. 31, n. 2, p. 1–19,
1991.
INGEN-HOUSZ, J. Experiments upon vegetables, discovering their great power
of purifying the common air in the sun-shine, and of injuring it in the shade and
at night. To which is joined, a new method of examining the accurate degree of
salubrity of the atmosphere. London: P. Elmsly, 1779.
INGEN-HOUSZ, J. On the degree of salubrity of the common air at sea, compared with
that of the sea-shore, and that of places far removed from the sea. In a Letter from
John Ingen Housz, M. D. F. R. S. to Sir John Pringle, Bart. F. R. S. Dated Paris, Jan.
22, 1780. Philosophical Transactions of the Royal Society of London, v. 70, p.
354–377, 1780.
INSTITUTO NACIONAL DE METROLOGIA QUALIDADE E TECNOLOGIA. Sistema
Internacional de Unidades: SI. 8a. ed. Duque de Caxias: INMETRO/CICMA/SEPIN,
2012.
JACKSON, R. M. et al. Survival, lung injury, and lung protein nitration in heterozygous
MnSOD knockout mice in hyperoxia. Experimental Lung Research, v. 25, p. 631–
646, 1999.
JAIN, K. K. Oxygen toxicity. In: Textbook of hyperbaric medicine. 5th Upd Ex ed.
Cambridge: Hogrefe Publishing, 2009. p. 47–58.
JAMIESON, D. The effect of anaesthesia and CO2 on survival time and lung damage
in rats exposed to high pressure oxygen. Biochemical Pharmacology, v. 15, n. 12,
p. 2120–2122, 1966.
JAMIESON, D.; CASS, N. CNS and pulmonary damage in anesthetized rats exposed
to hyperbaric oxygen. Journal of Applied Physiology, v. 23, n. 2, p. 235–242, 1967.
JAMIESON, D.; CHANCE, B. Effect of High-Pressure Oxygen on the Steady State of
Cytochromes in Rat-Liver Mitochondria. Biochemical Journal, v. 100, p. 254–262,
1966.
JAMIESON, D.; VAN DEN BRENK, H. Pulmonary damage due to high pressure
oxygen breathing in rats. 3. Quantitative analysis of fluid changes in rat lungs.
Australian Journal of Experimental Biology and Medical Science, v. 40, n. 4, p.
309–314, 1962.
JANSSEN, Y. M. et al. Cell and tissue response to oxidative damage. Laboratory
Investigation, v. 69, p. 261–274, 1993.
JEANS, J. The dynamical theory of gases. 2nd. ed. Cambridge: Cambridge
University Press, 1916.
JELTSCH, A. Oxygen, epigenetic signaling, and the evolution of early life. Trends in
Biochemical Sciences, v. 38, n. 4, p. 172–176, 2013.
158
JENSEN, J. C. et al. Role of tumor necrosis factor in oxygen toxicity. Journal of
Applied Physiology, v. 72, n. 5, p. 1902–1907, 1992.
JERSEY, S. L. et al. Severe neurological decompression sickness in a U-2 pilot.
Aviation Space and Environmental Medicine, v. 81, n. 1, p. 64–68, 2010.
JOBE, A. H.; KALLAPUR, S. G. Long term consequences of oxygen therapy in the
neonatal period. Seminars in Fetal and Neonatal Medicine, v. 15, n. 4, p. 230–235,
2010.
JOHNSON, P. C.; BEAN, J. W. Effect of sympathetic blocking agents on the toxic
action of O2 at high pressure. American Journal of Physiology-Legacy Content, v.
188, n. 3, p. 593–598, 1957.
JOHNSTON, C. J. et al. Inflammatory and epithelial responses in mouse strains that
differ in sensitivity to hyperoxic injury. Experimental Lung Research, v. 24, n. 2, p.
189–202, 1998.
JOSEPH, A. et al. Superoxide dismutase attenuates hyperoxia-induced interleukin-8
induction via AP-1. Free Radical Biology and Medicine, v. 45, n. 8, p. 1143–1149,
2008.
JUNQUEIRA, L. C.; COSSERMELLI, W.; BRENTANI, R. Differential staining of
collagens type I, II and III by Sirius Red and polarization microscopy. Archivum
Histologicum Japonicum, v. 41, n. 3, p. 267–274, 1978.
KAKUYAMA, M.; VALLANCE, P.; AHLUWALIA, A. Endothelium-dependent sensory
NANC vasodilatation: Involvement of ATP, CGRP and a possible NO store. British
Journal of Pharmacology, v. 123, n. 2, p. 310–316, 1998.
KALLET, R. H.; MATTHAY, M. A. Hyperoxic acute lung injury. Respiratory Care, v.
58, n. 1, p. 123–141, 2013.
KARSNER, H. T. The pathological effects of atmospheres rich in oxygen. The Journal
of Experimental Medicine, v. 23, n. 1, p. 149–170, 1916.
KAZZAZ, J. A. et al. Cellular oxygen toxicity: oxidant injury without apoptosis. Journal
of Biological Chemistry, v. 271, n. 25, p. 15182–15186, 2002.
KEENEY, S. E. et al. The effect of hyperoxic exposure on antioxidant enzyme activities
of alveolar type II cells in neonatal and adult rats. Pediatric Research, v. 31, n. 5, p.
441–444, 1992.
KEENEY, S. E. et al. Comparison of pulmonary neutrophils in the adult and neonatal
rat after hyperoxia. Pediatric Research, v. 38, n. 6, p. 857–863, 1995.
KIDD, G. H. Lung changes resulting from prolonged exposure to 100 percent oxygen
at 550 mm Hg. Aerospace Medicine, v. 8, p. 918–923, 1967.
KIM, T. H. et al. Effect of insulin-like growth factor blockade on hyperoxia-induced lung
injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, v. 47, n. 3, p.
372–378, 2012.
KINKEAD, R. et al. Neonatal maternal separation and enhancement of the inspiratory
(phrenic) response to hypoxia in adult rats: Disruption of GABAergic neurotransmission
in the nucleus tractus solitarius. European Journal of Neuroscience, v. 27, n. 5, p.
1174–1188, 2008.
159
KISTLER, G. S.; CALDWELL, P. R. B.; WEIBEL, E. R. Development of fine structural
damage to alveolar and capillary lining cells in oxygen-poisoned rat lungs. The Journal
of Cell Biology, v. 33, p. 605–628, 1967.
KLAASSEN, C. D.; WATKINS III, J. B. (EDS.). Casarett & Doull’s Essentials of
Toxicology. 3rd. ed. New York: McGraw-Hill Medical, 2015.
KLEKAMP, J. G.; JARZECKA, K.; PERKETT, E. A. Exposure to hyperoxia decreases
the expression of vascular endothelial growth factor and its receptors in adult rat lungs.
American Journal of Pathology, v. 154, n. 3, p. 823–831, 1999.
KNOWLES, J. H.; BLENNERHASSETT, J. B. Case 7-1967 — Progressive Pulmonary
Disability Following Chest Injuries. New England Journal of Medicine, v. 276, n. 7,
p. 401–411, 1967.
KOBAYASHI, H. et al. Antiinflammatory properties of inducible nitric oxide synthase in
acute hyperoxic lung injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular
Biology, v. 24, n. 4, p. 390–397, 2001.
KOBZIK, L. et al. Nitric oxide synthase in human and rat lung: immunocytochemical
and histochemical localization. American Journal of Respiratory Cell and Molecular
Biology, v. 9, n. 4, p. 371–377, 1993.
KOEPPEN, B. M.; STANTON, B. A. (EDS.). Berne & Levy Physiology. 6th, updat.
ed. Philadelphia, PA: Mosby Elsevier, 2010.
KOO, H. et al. Effects of transgene expression of superoxide dismutase and
glutathione peroxidase on pulmonary epithelial cell growth in hyperoxia. American
Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology, v. 288, n. 4, p.
L718–L726, 2004.
KOONIN, E. V; ARAVIND, L. Origin and evolution of eukaryotic apoptosis: the bacterial
connection. Cell Death and Differentiation, v. 9, n. 4, p. 394–404, 2002.
KROEMER, G.; ZAMZAMI, N.; SUSIN, S. A. Mitochondrial control of apoptosis: an
overview. Immunology Today, v. 18, n. 1, p. 44–51, 1997.
KUBOTA, E. et al. Autonomic innervation of pulmonary artery: evidence for a
nonadrenergic noncholinergic inhibitory system. Experimental Lung Research, v. 14,
n. 3, p. 349–358, 2 jan. 1988.
KUMP, L. R.; BARLEY, M. E. Increased subaerial volcanism and the rise of
atmospheric oxygen 2.5 billion years ago. Nature, v. 448, n. 7157, p. 1033–1036,
2007.
KUWANO, K. et al. Attenuation of bleomycin-induced pneumopathy in mice by a
caspase inhibitor. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular
Physiology, v. 280, n. 2, p. L316–L325, 2017.
LAHIRI, S. et al. Carotid body chemosensory function in prolonged normobaric
hyperoxia in the cat. Journal of Applied Physiology, v. 62, n. 5, p. 1924–1931, 1987.
LAMBERTSEN, C. J. et al. Oxygen Toxicity. Effects in man of oxygen inhalation at 1
and 3.5 atmospheres upon blood gas transport, cerebral circulation and cerebral
metabolism. Journal of Applied Physiology, v. 5, n. 9, p. 471–486, 1953.
LAMBERTSEN, C. J. Extension of Oxygen Tolerance in Man: Philosophy and
160
Significance. Experimental Lung Research, v. 14, n. sup1, p. 1035–1058, 2008.
LAMBERTUCCI, R. H. et al. Effects of aerobic exercise training on antioxidant enzyme
activities and mRNA levels in soleus muscle from young and aged rats. Mechanisms
of Ageing and Development, v. 128, p. 267–275, 2007.
LANE, N. Biodiversity: on the origin of bar codes. Nature, v. 462, p. 272–274, 2009.
LANE, N. The evolution of oxidative stress. In: Principles of Free Radical
Biomedicine. New York: Nova Science Publishers Inc., 2011. v. 1p. 1–17.
LANE, N. Oxygen: the molecule that made the world. Revised Ed ed. Oxford:
Oxford University Press, 2016.
LANE, N.; ALLEN, J. F.; MARTIN, W. How did LUCA make a living? Chemiosmosis in
the origin of life. BioEssays, v. 32, n. 4, p. 271–280, 2010.
LANGFORD, D. J. et al. Coding of facial expressions of pain in the laboratory mouse.
Nature Methods, v. 7, n. 6, p. 447–449, 2010.
LATIFI, A.; RUIZ, M.; ZHANG, C. C. Oxidative stress in cyanobacteria. FEMS
Microbiology Reviews, v. 33, n. 2, p. 258–278, 2009.
LAVOISIER, A.-L. Sur les altérations qui arrivent à l’air dans plusieurs circonstances
où se trouvent les hommes réunis en société. Mémoires de la Société de Medicine.
Histoire de la Société de Médecine, v. 5, n. 1782–1783, p. 569–582, 1785.
LEE, E. W. et al. The roles of FADD in extrinsic apoptosis and necroptosis. BMB
Reports, v. 45, n. 9, p. 496–508, 2012.
LEE, J.; KOO, N.; MIN, D. B. Reative oxygen species, aging, and antioxidative
nutraceuticals. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, v. 3, p.
21–33, 2004.
LEICESTER, H. M. The historical background of chemistry. New York: Dover
Publications, 1971.
LEITE, M. S. Alterações estruturais de corpos carotídeos de ratos expostos à
hiperoxigenação hiperbárica. [s.l.] Universidade de São Paulo, 2006.
LI, H. et al. Loss of interleukin-6 enhances the inflammatory response associated with
hyperoxia‐induced lung injury in neonatal mice. Experimental and Therapeutic
Medicine, p. 3101–3107, 2019.
LI, J. et al. Mitochondrial metabolism underlies hyperoxic cell damage. Free Radical
Biology and Medicine, v. 36, n. 11, p. 1460–1470, 2004.
LI, J. S. et al. Hyperbaric oxygen preconditioning reduces ischemia-reperfusion injury
by inhibition of apoptosis via mitochondrial pathway in rat brain. Neuroscience, v. 159,
n. 4, p. 1309–1315, 2009.
LI, Y. et al. Nuclear factor-kappaB is activated by hyperoxia but does not protect from
cell death. Journal of Biological Chemistry, v. 272, n. 33, p. 20646–20649, 1997.
LI, Y. et al. Inhibition of c-Jun N-Terminal Kinase Pathway Improves Cell Viability in
Response to Oxidant Injury. American Journal of Respiratory Cell and Molecular
Biology, v. 29, n. 6, p. 779–783, 2003.
LIN, Y.; JAMIESON, D. Effect of humidity on hyperoxic toxicity. Journal of Applied
161
Physiology, v. 75, n. 5, p. 1980–1983, 1993.
LIU, S. F. et al. Endothelium-dependent nonadrenergic, noncholinergic neural
relaxation in guinea pig pulmonary artery. Journal of Pharmacology and
Experimental Therapeutics, v. 260, n. 2, p. 541 LP – 548, 1992a.
LIU, S. F. et al. Role of nitric oxide and guanosine 3′,5′‐cyclic monophosphate in
mediating nonadrenergic, noncholinergic relaxation in guinea‐pig pulmonary arteries.
British Journal of Pharmacology, v. 107, n. 3, p. 861–866, 1992b.
LORKE, D. A new approach to practical acute toxicity testing. Archives of
Toxicology, v. 54, n. 4, p. 275–287, 1983.
LORRAIN SMITH, J. The pathological effects due to increase of oxygen tension in the
air breathed. The Journal of Physiology, v. 24, n. 1, p. 19–35, 1899.
LU, Y. et al. Activated Akt protects the lung from oxidant-induced injury and delays
death of mice. The Journal of Experimental Medicine, v. 193, n. 4, p. 545–550, 2002.
LYONS, T. W. Oxygen’s rise reduced. Nature, v. 448, n. 7157, p. 1005–1006, 2007.
LYONS, T. W.; REINHARD, C. T.; PLANAVSKY, N. J. The rise of oxygen in Earth’s
early ocean and atmosphere. Nature, v. 506, n. 7488, p. 307–315, 2014.
MACDOUGALL, J. D. B.; COUPLAND, R. E. Organ culture under hyperbaric oxygen.
Experimental Cell Research, v. 45, p. 385–398, 1967.
MANGO, G. W. et al. Clara cell secretory protein deficiency increases oxidant stress
response in conducting airways. American Journal of Physiology-Lung Cellular
and Molecular Physiology, v. 275, n. 2, p. L348–L356, 1998.
MANISCALCO, W. M. et al. Hyperoxic injury decreases alveolar epithelial cell
expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in neonatal rabbit lung.
American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, v. 16, n. 5, p. 557–
567, 1997.
MANTELL, L. L. et al. Hyperoxia-induced cell death in the lung - The correlation of
apoptosis, necrosis, and inflammation. Annals of the New York Academy of
Sciences, v. 887, p. 171–180, 1999.
MARSHALL, J. R.; LAMBERTSEN, C. J. Interactions of increased pO2 and pCO2
effects in producing convulsions and death in mice. Journal of Applied Physiology,
v. 16, n. 1, p. 1–7, 1961.
MARTIN, W. et al. Hydrothermal vents and the origin of life. Nature Reviews
Microbiology, v. 6, n. 11, p. 805–814, 2008.
MARTIN, W.; RUSSELL, M. J. On the origin of biochemistry at an alkaline
hydrothermal vent. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. B,
Biological Sciences, v. 362, n. 1486, p. 1887–1925, 2007.
MASLOVA, M. N.; KLIMOVA, V. K. Repeated effect of hyperbaria on rat blood system.
Journal of Evolutionary Biochemistry and Physiology, v. 50, n. 6, p. 515–521,
2014.
MATALON, S.; NESARAJAH, M. S.; FARHI, L. E. Pulmonary and circulatory changes
in conscious sheep exposed to 100% O2 at 1 ATA. Journal of Applied Physiology,
v. 53, n. 1, p. 110–116, 1982.
162
MAULIK, N. Redox regulation of vascular angiogenesis. Antioxidants & redox
signaling, v. 4, n. 5, p. 783–4, 2002.
MCCORD, J. M. Human disease, free radicals, and the oxidant/antioxidant balance.
Clinical Biochemistry, v. 26, n. 5, p. 351–357, 1993.
MCGOVERN, T. K. et al. Evaluation of respiratory system mechanics in mice using the
Forced Oscillation Technique. Journal of Visualized Experiments, n. 75, p. e50172,
2013.
MCKIE, D. Fire and flamma vitalis: Boyle, Hooke and Mayow. In: Science, Medicine
and History: Essays on the Evolution of Scientific Thought and Medical Practice
Written in Honour of Charles Singer. New York: Oxford University Press, 1953. v. 1.
MEAD, J. Mechanical Properties of Lungs. Physiological Reviews, v. 41, n. 2, p. 281–
330, 1961.
MENGEL, C. E. et al. Effects of in vivo Hyperoxia on Erythrocytes 1. Hemolysis in Mice
Exposed to Hyperbaric Oxygenation. Experimental Biology and Medicine, v. 116, n.
2, p. 259–261, 1964.
MENGEL, C. E. et al. Effects of in vivo hyperoxia on erythrocytes. II. Hemolysis in a
human after exposure to oxygen under high pressure. Blood, v. 25, n. 5, p. 822–829,
1965.
MITCHELL, P. Coupling of phosphorylation to electron and hydrogen transfer by a
chemi-osmotic type of mechanism. Nature, v. 191, p. 144–148, 1961.
MITCHELL, P. Chemiosmotic coupling in energy transduction: a logical development
of biochemical knowledge. Journal of Bioenergetics, v. 3, n. 1–2, p. 5–24, 1972.
MITCHELL, P. Keilin’s respiratory chain concept and its chemiosmotic consequences.
Science, v. 206, n. 4423, p. 1148–1159, 1979.
MOCKETT, R. J. et al. Ectopic expression of catalase in Drosophila mitochondria
increases stress resistance but not longevity. Free Radical Biology & Medicine, v.
34, n. 2, p. 207–217, 2003.
MOON, R. E. et al. Pulmonary gas exchange in diving. Journal of Applied
Physiology, n. 85, p. 668–677, 2009.
MOON, R. E. Adjuntive therapy for decompression illness: a review and update. Diving
and Hyperbaric Medicine, v. 39, n. 2, p. 81–87, 2009.
MOON, R. E.; GORMAN, D. F. Decompression sickness. In: NEWMAN, T. S.; THOM,
S. R. (Eds.). . Physiology and Medicine of Hyperbaric Oxygen Therapy. First Edit
ed. [s.l.] Saunders/Elsevier, 2008. p. 283–319.
MORENO, I. et al. Antioxidant enzyme activity and lipid peroxidation in liver and kidney
of rats exposed to microcystin-LR administered intraperitoneally. Toxicon, v. 45, p.
395–402, 2005.
MÜLLER, H.; KLEY, H. Retrospective study on the reliability of an “approximate LD50”
determined with a small number of animals. Archives of Toxicology, v. 51, p. 189–
196, 1982.
MUTLU, G. et al. Potential genetic therapies for Acute Lung Injury. Current Gene
Therapy, v. 4, n. 4, p. 487–495, 2012.
163
NAHAS, G. G.; LIGOU, J. C.; MEHLMAN, B. Effects of pH changes on O 2 uptake and
plasma catecholamine levels in the dog. American Journal of Physiology-Legacy
Content, v. 198, n. 1, p. 60–66, 1960.
NAKANO, S. et al. Perioperative evaluation of respiratory impedance using the forced
oscillation technique: A prospective observational study. BMC Anesthesiology, v. 16,
n. 1, p. 2–7, 2016.
NAKAYAMA, H. et al. Decompression sickness and recreational scuba divers.
Emergency medicine journal : EMJ, v. 20, n. 4, p. 332–334, 2003.
NARKOWICZ, C. K.; VIAL, J. H.; MCCARTNEY, P. W. Hyperbaric Oxygen Therapy
Increases Free Radical Levels in the Blood of Humans. Free Radical Research, v.
19, n. 2, p. 71–80, 1993.
NASH, G.; BLENNERHASSETT, J. B.; PONTOPPIDAN, H. Pulmonary lesions
associated with oxygen therapy and artificial ventilation. New England Journal of
Medicine, v. 276, n. 7, p. 368–374, 1967.
NEUMAN, T. S.; THOM, S. R. Physiology and Medicine of Hyperbaric Oxygen
Therapy. [s.l.] Elsevier Health Sciences, 2008.
NICHOLS, C. W.; LAMBERTSEN, C. J. Effects of High Oxygen Pressures on the Eye.
New England Journal of Medicine, v. 281, n. 1, p. 25–30, 1969.
NORTHWAY, W. H.; ROSAN, R. C.; PORTER, D. Y. Pulmonary Disease Following
Respirator Therapy of Hyaline-Membrane Disease. New England Journal of
Medicine, v. 276, n. 7, p. 357–368, 1967.
OBIAGWU, C. et al. Acute pulmonary edema secondary to hyperbaric oxygen therapy.
Oxford Medical Case Reports, v. 2015, n. 2, p. 183–184, 2015.
OOSTVEEN, E. et al. The forced oscillation technique in clinical practice: methodology,
recommendations and future developments. European Respiratory Journal, v. 22,
n. 6, p. 1026–1041, 2003.
OPARIN, A. I. The Origin of Life. Traducao Sergius Morgulis. 1938. ed. New York:
The Macmillan Company, 1936.
ORGEL, L. E. Are you serious, Dr Mitchell? Nature, v. 402, n. 6757, p. 17, 1999.
PANOS, R. J. et al. Intratracheal instillation of keratinocyte growth factor decreases
hyperoxia-induced mortality in rats. Journal of Clinical Investigation, v. 96, n. 4, p.
2026–2033, 1995.
PAPAIAHGARI, S. et al. Hyperoxia stimulates an Nrf2-ARE transcriptional response
via ROS-EGFR-PI3K-Akt/ERK MAP kinase signaling in pulmonary epithelial cells.
Antioxidants & Redox Signaling, v. 8, n. 1 & 2, p. 43–52, 2006.
PARINANDI, N. L. et al. Hyperoxia-induced NAD(P)H oxidase activation and regulation
by MAP kinases in human lung endothelial cells. American Journal of PhysiologyLung Cellular and Molecular Physiology, v. 284, n. 1, p. L26–L38, 2015.
PARK, J. IL et al. Endothelium-dependent sensory non-adrenergic non-cholinergic
vasodilatation in rat thoracic aorta: involvement of ATP and a role for NO. Journal of
Pharmacy and Pharmacology, v. 52, n. 4, p. 409–416, 2000.
PARTINGTON, J. R. The history of chemistry. New York: St. Martin’s Press, 1962.
164
v. 3
PATEL, Y. J.; GOWDEY, C. W. Effects of single and repeated exposures to oxygen at
high pressure on normal rats. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology,
v. 42, n. 2, p. 245–264, 1964.
PATZ, A. et al. Oxygen studies in retrolental fibroplasia. II. The production of the
microscopic changes of retrolental fibroplasia in experimental animals. American
Journal of Ophthalmology, v. 36, n. 11, p. 1511–1522, 1953.
PATZ, A. The role of oxygen in retrolental fibroplasia. Pediatrics, v. 19, n. 3, p. 504–
524, 1957.
PATZ, A.; EASTHAM, A. B. Oxygen studies in retrolental fibroplasia. VI. The effect of
concentration and duration of exposure to oxygen on the immature mouse eye.
American journal of ophthalmology, v. 44, p. 110–115, out. 1957.
PAUTLER, S. et al. Pulmonary oxygen toxicity at one ATA. Acta anaesthesiologica
Scandinavica. Supplementum, v. 24, p. 51–56, 1966.
PENROD, K. E. Nature of pulmonary damage produced by high oxygen pressures.
Journal of Applied Physiology, v. 9, n. 1, p. 1–4, 1956.
PENROD, K. E. Lung damage by oxygen using differential catheterization (abstract).
Federation Proceedings, v. 17, p. 123, 1958.
PEPPERL, S. et al. Hyperoxia upregulates the NO pathway in alveolar macrophages
in vitro: role of AP-1 and NF-κB. American Journal of Physiology - Lung Cellular
and Molecular Physiology, v. 280, p. 905–913, 2001.
PERKINS JR., J. F. Historical development of respiratory physiology. In: Handbook
of Physiology - Section 3: Respiration. Washington, DC: [s.n.]. v. Ip. 1–62.
PERNG, W.-C. et al. Glutamine attenuates hyperoxia-induced acute lung injury in
mice. Clinical and Experimental Pharmacology and Physiology, v. 37, n. 1, p. 56–
61, 2010.
PEROT JR., P. L.; STEIN, S. N. Conduction block in mammalian nerve produced by
O2 at high pressure. American Journal of Physiology, v. 197, n. 6, p. 1243–1246,
1959.
PESLIN, R.; FREDBERG, J. J. Oscillation Mechanics of the Respiratory System. In:
Comprehensive Physiology. Hoboken, NJ, USA: John Wiley & Sons, Inc., 2011.
PETÁK, F. et al. Hyperoxia-induced changes in mouse lung mechanics: forced
oscillations vs. barometric plethysmography. Journal of applied physiology
(Bethesda, Md. : 1985), v. 90, n. 6, p. 2221–30, 2001.
PETRACHE, I. et al. Mitogen-activated protein kinase pathway mediates hyperoxiainduced apoptosis in cultured macrophage cells. The American journal of
physiology, v. 277, n. 3, p. L589-95, 1999.
PITTMAN, R. N. Regulation of Tissue Oxygenation. San Rafael (CA): Morgan &
Claypool Life Sciences, 2011. v. 3
PIZZARELO, D. J.; SHIRCLIFFE, A. C. Protection against hyperbaric oxygen toxicity
after feeding N,N-diphenyl-p-phenylene diamine. Experientia, v. 24, n. 2, p. 188–189,
1968.
165
PREKLADOVIZKII, S. I. Toxic effect of high oxygen tension on the animal organism.
Fiziol. Zh. S.S.S.R. im. I.M. Sechenova, v. 20, p. 518–533, 1936.
PRIESTLEY, J. Experiments and observations on different kinds of air. London,
England: J. Johnson, 1775a.
PRIESTLEY, J. An account of further discoveries in air. Philosophical Transactions,
n. 1624, p. 384–394, 1775b.
PRIESTLEY, J. Experiments and observations on different kinds of air. London,
England: J. Johnson, 1777. v. III
PRIESTLEY, J. Experiments and observations relation to various branches of
natural philosophy; with a continuation of the observations on air. Birmingham:
Pearson and Rollason, 1781. v. II
PRITCHARD, J. B. The hymn to the Aton. In: PRITCHARD, J. B. (Ed.). . The Ancient
near East: an anthology of texts and pictures. Traducao John A. Wilson. Princeton,
NJ: [s.n.]. p. 324.
PRYOR, W. A. Oxy-radicals and related species: their formation, lifetimes, and
reactions. Annual Review of Physiology, v. 48, p. 657–667, 1986.
PUY, R. J. et al. Alterations in the pulmonary capillary bed during early O2 toxicity in
man. Journal of Applied Physiology, v. 24, n. 4, p. 537–543, 1968.
RABÊLO, L. A. et al. Desbalanço redox: NADPH oxidase como um alvo terapêutico
no manejo cardiovascular. Arquivos Brasileiros de Cardiologia, v. 94, n. 5, p. 684–
693, 2010.
RAMOS, J. J. M.; LEITÃO, L. A atmosfera da Terra. Boletim SPQ, v. 44/45, p. 53–66,
1991.
RASMUSSEN, J. P. et al. Cardiac function and hypercarbia. Archives of Surgery, v.
113, n. 10, p. 1196, 1 out. 1978.
RAY, P. et al. Inducible expression of keratinocyte growth factor (KGF) in mice inhibits
lung epithelial cell death induced by hyperoxia. Proceedings of the National
Academy of Sciences, v. 100, n. 10, p. 6098–6103, 2003.
RAYMOND, J.; SEGRÈ, D. The effect of oxygen on biochemical networks and the
evolution of complex life. Science, v. 311, p. 1764–1768, 2006.
REYNOLDS, S. D.; MALKINSON, A. M. Clara cell: progenitor fot he brochiolar
eepithelium. International Journal of Biochemistry and Cell Biology, v. 42, n. 1, p.
1–4, 2010.
RIBEIRO, S. M. R. et al. A formação e os efeitos das espécies reativas de oxigênio no
meio biológico. Bioscience Journal, v. 21, n. 3, p. 133–149, 2005.
RODARTE, J. R.; REHDER, K. Dynamics of respiration. In: MACKLEN, P. T. .; MEAD,
J. (Eds.). . The respiratory system. Mechanics of breathing. Bethesda, Maryland:
The American Physiological Society, 1986. v. 3p. 131–144.
RODARTE, J. R.; REHDER, K. Dynamics of Respiration. In: Comprehensive
Physiology. Hoboken, NJ, USA: John Wiley & Sons, Inc., 2011.
RODRIGUES JUNIOR, M.; MARRA, A. R. Quando indicar a oxigenoterapia
166
hiperbárica? Revista da Associação Médica Brasileira, v. 50, n. 3, p. 240, 2004.
RODRIGUEZ, P. G. et al. The role of oxygen in wound healing: A review of the
literature. Dermatologic Surgery, v. 34, n. 9, p. 1159–1169, 2008.
ROKICKI, W. et al. The role and importance of club cells (Clara cells) in the
pathogenesis of some respiratory diseases. Kardiochirurgia i Torakochirurgia
Polska, v. 13, n. 1, p. 26–30, 2016.
ROMASHKO, J. et al. MAPK pathways mediate hyperoxia-induced oncotic cell death
in lung epithelial cells. Free Radical Biology and Medicine, v. 35, n. 8, p. 978–993,
2003.
ROSENGREN, K. Hyaline membrane disease. A radiological investigation in rabbits.
Acta radiologica: diagnosis, p. Suppl 262:1-64, 1967.
ROTHFUSS, A.; RADERMACHER, P.; SPEIT, G. Involvement of heme oxygenase-1
(HO-1) in the adaptive protection of human lymphocytes after hyperbaric oxygen
(HBO) treatment. Carcinogenesis, v. 22, n. 12, p. 1979–1985, 2001.
ROTHSCHUH, K. E. History of Physiology. Huntington, NY: Krieger Pub Co, 1972.
SACKNER, M. Oxygen therapy. A history of oxygen usage in chronic obstructive
pulmonary disease. American review of respiratory disease, v. 110, n. 6 Pt 2, p. 25–
34, 1975.
SALDIVA, P. H. et al. Alveolar pressure measurement in open-chest rats. Journal of
Applied Physiology, v. 72, n. 1, p. 302–306, 1992.
SALVESEN, G. S. Programmed cell death and the caspases. APMIS, v. 107, n. 1, p.
73–79, 1999.
SANDERS, S. P. et al. Hyperoxic sheep pulmonary microvascular endothelial cells
generate free radicals via mitochondrial electron transport. Journal of Clinical
Investigation, v. 91, n. 1, p. 46–52, 1993.
SAVILL, J.; GREGORY, C.; HASLETT, C. Eat me or die. Science, v. 302, n. 5650, p.
1516–1517, 2003.
SCHAAL, S. et al. Lenticular oxygen toxicity. Investigative Ophthalmology and
Visual Science, v. 44, n. 8, p. 3476–3484, 2003.
SCHAFFNER, F.; FELIG, P. Changes in hepatic structure in rats produced by
breathing pure oxygen. Journal of Cell Biology, v. 27, p. 505–517, 1965.
SCHEELE, C. W. Chemische abhandlung von der luft und dem feuer. Uppsala &
Leipzig: Verlag, 1777.
SCHNEIDER-ORELLI, O. Entomologisches Praktikum. Aarau: Sauerländer, 1947.
SCHOONEN, W. G. E. J. et al. Respiratory failure and stimulation of glycolysis in
Chinese hamster ovary cells exposed to normobaric hyperoxia. The Journal of
Biological Chemistry, v. 265, n. 19, p. 11118–11124, 1990.
SCHÜTZ, E.; FUCHS, H. A new approach to minimizing the number of animals used
in acute toxicity testing and optimizing the information of test results. Archives of
Toxicology, v. 51, n. 3, p. 197–220, 1982.
SCOTT BUDINGER, G. R. et al. Hyperoxia-induced apoptosis does not require
167
mitochondrial reactive oxygen species and is regulated by Bcl-2 proteins. Journal of
Biological Chemistry, v. 277, n. 18, p. 15654–15660, 2002.
SCOTT, J. A.; CRAIG, I.; MCCORMACK, D. G. Nonadrenergic noncholinergic
relaxation of human pulmonary arteries is partially mediated by nitric oxide. American
Journal of Respiratory and Critical Care Medicine, v. 154, n. 3, p. 629–632, 1996.
SEDLAK, J.; LINDSAY, R. H. Estimation of total, protein-bound, and nonprotein
sulfhydryl groups in tissue with Ellman’s reagent. Analytical Biochemistry, v. 25, p.
192–205, 1968.
SÉGUIN, A. J. F.; LAVOISIER, A.-L. Premier mémoire sur la respiration des animaux.
Mémoires de l’Académie des Sciences, p.185. In: Mémoires sur la respiration et la
transpiration des animaux (1920). Paris: Gauthiers-Villars, 1789. p. 31–51.
SEVERINGHAUS, J. W. Priestley, the furious free thinker of the enlightenment, and
Scheele, the taciturn apothecary of Uppsala. Acta Anaesthesiologica Scandinavica,
p. 2–9, 2002.
SHALABY, K. H. et al. Combined forced oscillation and forced expiration
measurements in mice for the assessment of airway hyperresponsiveness.
Respiratory Research, v. 11, n. 82, 2010.
SHAN, X.; AW, T. Y.; JONES, D. P. Glutathione-dependent protection against
oxidative injury. Pharmacology and Therapeutics, v. 47, p. 61–71, 1990.
SHARAN, R. N.; ODYUO, M. M.; PURKAYASTHA, S. Oxygen free radicals and their
biomedical implications: a mini review. Mini-Reviews in Organic Chemistry, v. 8, n.
4, p. 372–376, 2011.
SHAW, L. A.; BEHNKE, A. R.; MESSER, A. C. The role of carbon dioxide in producing
the symptoms of oxygen poisoning. American Journal of Physiology-Legacy
Content, v. 108, n. 3, p. 652–661, 1934.
SHEA, L. M. et al. Hyperoxia activates NF-kappaB and increases TNF-alpha and IFNgamma gene expression in mouse pulmonary lymphocytes. The Journal of
Immunology, v. 157, n. 9, p. 3902 LP – 3908, 1996.
SHERIDAN, R. L.; SHANK, E. S. Hyperbaric oxygen treatment: a brief overview of a
controversial topic. Journal of Trauma, v. 47, n. 2, p. 426–435, 1999.
SHI, S. et al. Normobaric oxygen treatment in acute ischemic stroke: a clinical
perspective. Medical Gas Research, v. 6, n. 3, p. 147, 2016.
SIES, H. Oxidative stress: oxidants and antioxidants. Experimental Physiology, v.
82, p. 291–295, 1997.
SIGERIST, H. E. A history of medicine. I. Primitive and Archaic Medicine. New
York: Oxford University Press, 1967.
SIMILOWSKI, T.; BATES, J. H. T. Two-compartment modelling of respiratory system
mechanics at low frequencies: Gas redistribution or tissue rheology? European
Respiratory Journal, v. 4, n. 3, p. 353–358, 1991.
SKINNER, H. A. The origin of medical terms. 2nd Revise ed. New York: Hafner
Publishing Co Ltd, 1970.
SMITH, B. Y. F. J. C. et al. Bodily changes and development of pulmonary resistance
168
in rats living under compressed air conditions. The Journal of Experimental
Medicine, v. 56, n. 1, p. 63–78, 1932a.
SMITH, C. W.; LEHAN, P. H.; MONKS, J. J. Cardiopulmonary manifestations with high
O2 tensions at atmospheric pressure. Journal of Applied Physiology, v. 18, n. 5, p.
849–853, 1963.
SMITH, F. J. C. et al. Morphological changes in the lungs of rats living under
compressed air conditions. Journal of Experimental Medicine, v. 56, n. 1, p. 79–89,
1932b.
SOCIEDADE BRASILEIRA DE MEDICINA HIPERBÁRICA. Diretrizes SQ & E
Segurança e Qualidade e Ética. São Paulo: [s.n.].
SPEISER, E. A. Genesis: introduction, translation, and notes. New York: Anchor
Bible, Doubleday, 1964.
SPERLING, D. R. Hyperbaric oxygen toxicity in newborn and developing mice.
Journal of Applied Physiology, v. 29, n. 4, p. 471–474, 1970.
STADIE, W. C.; RIGGS, B. C.; HAUGGAARD, N. Oxygen poisoning. III. The effect of
high oxygen pressures upon the metabolism of brain. Journal of Biological
Chemistry, v. 160, n. 2, p. 191–208, 1945a.
STADIE, W. C.; RIGGS, B. C.; HAUGGAARD, N. Oxygen poisoning. IV . The effect of
high oxygen pressures upon the metabolism of liver, kidney, lung, and muscle tissue.
Metabolism Clinical And Experimental, v. 160, n. 1, p. 209–216, 1945b.
STAHL, G. E. Zymotechnia fundamentalis. In: LEICESTER, H. M.; KLICKSTEIN, H. S.
(Eds.). . A Sourcebook in Chemistry (1952). Cambridge: Harvard University Press,
1697. p. 209–211.
STEUDEL, W. et al. Expression of nitric oxide synthase isoforms (NOS II and NOS III)
in adult rat lung in hyperoxic pulmonary hypertension. Cell and Tissue Research, v.
295, n. 2, p. 317–329, 1999.
STURROCK, A. et al. GM-CSF provides autocrine protection for murine alveolar
epithelial cells from oxidant-induced mitochondrial injury. American Journal of
Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology, v. 302, n. 3, p. 343–351,
2012.
TAKEDA, K. et al. Development of eosinophilic airway inflammation and airway
hyperresponsiveness in mast cell-deficient mice. The Journal of Experimental
Medicine, v. 186, n. 3, p. 449–454, 1997.
TANKERSLEY, C. G. et al. Hypercapnic ventilatory responses in mice differentially
susceptible to acute ozone exposure. Journal of Applied Physiology, v. 75, n. 6, p.
2613–2619, 1993.
TAO, W. et al. Attenuation of hyperoxia-induced lung injury in rats by adrenomedullin.
Inflammation, v. 35, n. 1, p. 150–157, 2012.
TAYLOR, J. L.; CARRAWAY, M. S.; PIANTADOSI, C. A. Lung-specific induction of
heme oxygenase-1 and hyperoxic lung injury. American Journal of Physiology Lung Cellular and Molecular Physiology, v. 274, p. 582–590, 1998.
TAYLOR, R. C.; CULLEN, S. P.; MARTIN, S. J. Apoptosis: controlled demolition at the
cellular level. Nature Reviews Molecular Cell Biology, v. 9, n. 3, p. 231–241, 2008.
169
TERRANEO, L.; SAMAJA, M. Comparative response of brain to chronic hypoxia and
hyperoxia. International Journal of Molecular Sciences, v. 18, n. 9, 2017.
TETZLAFF, K. et al. Lung function in military oxygen divers: A longitudinal study.
Aviation Space and Environmental Medicine, v. 76, n. 10, p. 974–977, 2005.
THAMRIN, C.; SLY, P. D.; HANTOS, Z. Broadband frequency dependence of
respiratory impedance in rats. Journal of applied physiology (Bethesda, Md. :
1985), v. 99, n. 4, p. 1364–1371, 2005.
THOM, S. R. Hyperbaric oxygen therapy in septicemia. Journal of Hyperbaric
Medicine, v. 2, n. 3, p. 141–146, 1987.
THOM, S. R. Hyperbaric oxygen therapy. Journal of Intensive Care Medicine, v. 4,
n. 2, p. 58–74, 1989.
THOM, S. R. Hyperbaric oxygen: its mechanisms and efficacy. Plastic and
Reconstructive Surgery, v. 127, n. SUPPL. 1 S, p. 131–141, 2011.
THOMAS JR., J. J.; BAXTER, R. C.; FENN, W. O. Interactions of oxygen at high
pressure and radiation in Drosophila. The Journal of General Physiology, v. 49, n.
3, p. 537–549, 1966.
THOMPSON, R. E.; AKERS, T. K. Influence of sodium pentobarbital on mice poisoned
by oxygen. Aerospace Medicine, v. 41, n. 9, p. 1025–1027, 1970.
THOMPSON, R. E.; NIELSEN, T. W.; AKERS, T. K. Synergistic oxygen-inert gas
interactions in laboratory rats in a hyperbaric environment. Aerospace Medicine, v.
41, n. 12, p. 1388–1392, 1970.
TIBBLES, P. M.; EDELSBERG, J. S. Review articles. The New England Journal of
Medicine, v. 334, n. 25, p. 1642–1648, 1996.
TIISALA, R. Endocrine response to hyperoxia and hypoxia in the adult and newborn
rat. An experimental study with radioactive phosphorus. Annales Academiae
Scientiarum Fennicae. Ser. A.5, Medica, v. 95, p. 1–141, 1962.
TODA, N.; OKAMURA, T. The pharmacology of nitric oxide in the peripheral nervous
system of blood vessels. Pharmacological Reviews, v. 55, n. 2, p. 271–324, 2003.
TREVAN, J. W. Error of Determination of Toxicity. Proceedings of the Royal Society
(London), v. 101, n. B, p. 483–514, 1927.
TROY, S. S.; FORD, D. H. Hormonal protection of rats breathing oxygen at high
pressure. Acta Neurologica Scandinavica, v. 48, n. 2, p. 231–242, 1972.
TSAN, M. F. et al. Tracheal insufflation of tumor necrosis factor protects rats against
oxygen toxicity. Journal of Applied Physiology, v. 68, n. 3, p. 1211–1219, 1990.
TSAN, M. F.; LEE, C. Y.; WHITE, J. E. Interleukin 1 protects rats against oxygen
toxicity. Journal of Applied Physiology, v. 71, n. 2, p. 688–697, 1991.
TSCHOPP, J. et al. The fight of viruses against apoptosis. Current Opinion in
Genetics and Development, v. 8, n. 1, p. 82–87, 1998.
TURNER, E. R.; QUARTLEY, C. E. Studies in the respiratory and carbohydrate
metabolism of plant tissues: VIII. An inhibition of respiration in peas induced by “oxygen
poisoning”. Journal of Experimental Botany, v. 7, n. 3, p. 362–371, 1956.
170
TURRENS, J. F. et al. The effect of hyperoxia on superoxide production by lung
submitochondrial particles. Archives of Biochemistry and Biophysics, v. 217, n. 2,
p. 401–410, 1982.
TURRENS, J. F.; FREEMAN, B. A.; CRAPO, J. D. Hyperoxia increases H2O2 release
by lung mitochondria and microsomes. Archives of Biochemistry and Biophysics,
v. 217, n. 2, p. 411–421, 1982.
USHIO-FUKAI, M.; ALEXANDER, R. W. Reactive oxygen species as mediators of
angiogenesis signaling. Role of NAD(P)H oxidase. Molecular and Cellular
Biochemistry, v. 264, n. 1/2, p. 85–97, 2004.
VALKO, M. et al. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and
human disease. International Journal of Biochemistry and Cell Biology, v. 39, n.
1, p. 44–84, 2007.
VAN DEN BRENK, H. A. S.; JAMIESON, D. Pulmonary damage due to high pressure
oxygen breathing in rats. I. Lung weight, histological and radiological studies. The
Australian journal of experimental biology and medical science, v. 40, p. 37–49,
1962a.
VAN DEN BRENK, H. A. S.; JAMIESON, D. Studies of mechanisms of chemical
radiation protection in vivo. International Journal of Radiation Biology and Related
Studies in Physics, Chemistry and Medicine, v. 4, n. 4, p. 379–402, 1962b.
VAN DEN BRENK, H. A. S.; MOORE, R. Effect of High Oxygen Pressure on the
Protective Action of Cystamine and 5-Hydroxytryptamine in Irradiated Rats. Nature, v.
183, n. 4674, p. 1530–1531, 1959.
VAN OOIJ, P. J. A. M. et al. Assessment of pulmonary oxygen toxicity: relevance to
professional diving; a review. Respiratory Physiology and Neurobiology, v. 189, n.
1, p. 117–128, 2013.
VASCONCELOS, S. M. L. et al. Espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio,
antioxidantes e marcadores de dano oxidativo em sangue humano: principais métodos
analíticos para sua determinação. Química Nova, v. 30, n. 5, p. 1323–1338, 2007.
VAUGHAN, D. J. et al. Contributions of nitric oxide synthase isozymes to exhaled nitric
oxide and hypoxic pulmonary vasoconstriction in rabbit lungs. American Journal of
Physiology - Lung Cellular and Molecular Physiology, v. 284, p. 834–843, 2003.
WAGERS, S. et al. Nonlinearity of respiratory mechanics during bronchoconstriction
in mice with airway inflammation. Journal of Applied Physiology, v. 92, p. 1802–
1807, 2002.
WANG, X. et al. Necrotic cell death in response to oxidant stress involves the activation
of the apoptogenic caspase-8/bid pathway. Journal of Biological Chemistry, v. 278,
n. 31, p. 29184–29191, 2003.
WANG, Y. et al. Adenovirus-Mediated Transfer of the SOCS-1 Gene to Mouse Lung
Protects Against Hyperoxic Injury. American Journal of Physiology - Lung Cellular
and Molecular Physiology, v. 286, p. L1188–L1193, 2004.
WANG, Y. et al. Transgenic mice overexpressing peroxiredoxin 6 show increased
resistance to lung injury in hyperoxia. American Journal of Respiratory Cell and
Molecular Biology, v. 34, n. 4, p. 481–486, 2006.
171
WARD, N. S. et al. Interleukin-6-induced protection in hyperoxic acute lung injury.
American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, v. 22, n. 5, p. 535–
542, 2000.
WARNER, B. B. et al. Functional and pathological effects of prolonged hyperoxia in
neonatal mice. American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular
Physiology, v. 275, n. 1, p. L110–L117, 1998.
WATTEL, F.; GUIEU, J.; MATHIEU, D. Toxicité de l’oxygène hyperbare sur le système
nerveux. In: WATTEL, F.; MATHIEU, D. (Eds.). . Oxygenotherapie hyperbare et
réanimation. Paris: Masson, 1990. p. 8–15.
WAXMAN, A. B. et al. Targeted lung expression of interleukin-11 enhances murine
tolerance of 100% oxygen and diminishes hyperoxia-induced DNA fragmentation.
Chest, v. 101, p. 1970–1982, 1999.
WEAVER, L. et al. Hyperbaric Oxygen for Acute Carbon Monoxide Poisoning. The
New England Journal of Medicine, v. 347, n. 14, p. 1057–1067, 2002.
WEAVER, L. Critical care of patients needing hyperbaric oxygen therapy. In:
NEWMAN, T. S.; THOM, S. R. (Eds.). . Physiology and Medicine of Hyperbaric
Oxygen Therapy. First Edit ed. New York: Saunders/Elsevier, 2008. p. 117–129.
WEBB, J. T.; PILMANIS, A. A. Fifty years of decompression sickness research at
brooks AFB, TX: 1960-2010. Aviation Space and Environmental Medicine, v. 82, n.
SUPPL1, p. 1–25, 2011.
WEE, H.-Y. et al. Hyperbaric oxygen effects on neuronal apoptosis associations in a
traumatic brain injury rat model. The Journal of Surgical Research, v. 197, n. 2, p.
382–389, 2015.
WEIBEL, E. R.; KISTLER, G. S.; SCHERLE, W. F. Practical stereological methods for
morphometric cytology. The Journal of Cell Biology, v. 30, n. 1, p. 23–38, 1966.
WEIL, C. S.; CARPENTER, C. P.; SMYTH, H. F. Specifications for Calculating. The
Median Effective Dose. American Industrial Hygiene Association Quarterly, v. 14,
n. 3, p. 200–206, 1953.
WEISS, H. S.; WRIGHT, R. A. Biological effects of prolonged exposure of small
animals to unusual gaseous enviroments. 1492–5. ed. Columbus: National
Aeronautics and Space Administration, 1965.
WEISS, J. F.; LANDAUER, M. R. History and development of radiation-protective
agents. International Journal of Radiation Biology, v. 85, n. 7, p. 539–573, 2009.
WEST, J. B. Respiratory Physiology. The Essentials. 9th. ed. Baltimore: Lippincott,
Williams & Wilkins, 2012.
WEST, J. B. Joseph Priestley, oxygen, and the Enlightenment. American Journal of
Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology, v. 306, n. 2, p. L111–L119,
2014.
WHITE, C. W. et al. Recombinant tumor necrosis factor/cachectin and interleukin 1
pretreatment decreases lung oxidized glutathione accumulation, lung injury, and
mortality in rats exposed to hyperoxia. Journal of Clinical Investigation, v. 79, n.
June, p. 1868–1873, 1987.
172
WILLIAMS, C. M.; BEECHER, H. K. Sensitivity of Drosophila to poisoning by oxygen.
American Journal of Physiology-Legacy Content, v. 140, n. 4, p. 566–573, 1944.
WISPE, J. R.; ROBERTS, R. J. Molecular basis of pulmonary oxygen toxicity. Clinical
in Perinatology, v. 14, n. 3, p. 651–666, 1987.
WOOD, C. D.; PERKINS, G. F. Factors influencing hypertension and pulmonary
edema produced by hyperbaric O2. Aerospace Medicine, v. 41, n. 8, p. 869–972,
1970.
WOOD, C. D.; SEAGER, L. D.; FERRELL, G. Influence of autonomic blockade on
aconitine induced pulmonary edema. Experimental Biology and Medicine, v. 116, n.
3, p. 809–811, 1964.
WOOD, J. D.; STACEY, N. E.; WATSON, W. J. Pulmonary and central nervous system
damage in rats exposed to hyperbaric oxygen and protection therefrom by gammaaminobutyric acid. Canadian Journal of Physiology and Pharmacology, v. 43, n. 3,
p. 405–410, 1965.
WOOD, J. D.; WATSON, W. J.; STACEY, N. E. A comparative study of hyperbaric
oxygeninduced and drug-induced convulsions with particular reference to gammaaminobutyric acid metabolism. Journal of Neurochemistry, v. 13, n. 5, p. 361–370,
maio 1966.
WOOLLEY, L. The Beginnings of Civilization. History of Mankind: Cultural and
Scientific Development series. London: Mentor, 1965. v. I, part 2
WU, K. I. et al. Keratinocyte growth factor promotes alveolar epithelial cell DNA repair
after H2O2 exposure. American Journal of Physiology-Lung Cellular and
Molecular Physiology, v. 275, n. 4, p. L780–L787, 1998.
WU, S. C.; MARSTON, W.; ARMSTRONG, D. G. Wound care: The role of advanced
wound healing technologies. Journal of Vascular Surgery, v. 52, n. Supplement, p.
59S-66S, 2010.
YANG, Z. et al. Interventions for treating gas gangrene. Cochrane Database of
Systematic Reviews, n. 12, p. CD010577, 2013.
YAO, L. et al. Protection against hyperoxia-induced lung fibrosis by KGF-induced
MSCs mobilization in neonatal rats. Pediatric Transplantation, v. 17, n. 7, p. 676–
682, 2013.
ZBINDEN, G.; FLURY-ROVERSI, M. Significance of the LD50-test for the toxicological
evaluation of chemical substances. Archives of Toxicology, v. 47, n. 2, p. 77–99,
1981.
ZHANG, Q. et al. Hyperbaric oxygen attenuates apoptosis and decreases inflammation
in an ischemic wound model. Journal of Investigative Dermatology, v. 128, n. 8, p.
2102–2112, 2008.
ZHANG, X. et al. Reactive oxygen species and extracellular signal-regulated kinase
1/2 mitogen-activated protein kinase mediate hyperoxia-induced cell death in lung
epithelium. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology, v. 28, n.
3, p. 305–315, 2003.
ZIN, W. A. Métodos e técnicas para a monitorização das propriedades elásticas e
resistivas dos pulmões e da parede torácica na insuficência respiratória aguda. Jornal
173
de Pneumologia, v. 16, n. 2, p. 91–96, 1990.
ZIN, W. A.; ROCCO, P. R. M.; FAFFE, D. S. Mecânica respiratória. In: Fisiologia
Margarida de Melo Aires. 4a. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2012. p. 621–
630.
ZISER, A. et al. Hyperbaric oxygen therapy for massive arterial air embolism during
cardiac operations. Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery, v. 117, n. 4,
p. 818–821, 1999.
174
175
APÊNDICES
Apêndice A: Ficha de Registro de Compressão
176
Apêndice B: Cálculo probit de acordo com BLISS e FINNEY (BLISS, 1935;
FINNEY, 1952).
Em análise de dados de sensibilidade, particularmente em ensaios de doseresposta, o método mais utilizado é o probit para os casos em que a susceptibilidade
de cada indivíduo é considerada como uma variável aleatória com distribuição normal.
O cálculo probit foi proposto por Bliss (1934) e Fisher (1935) (BLISS, 1934; FISHER,
1935).
Em resumo, realizou-se a conversão das doses para log(10) da dose x, em
seguida, converteu-se a mortalidade para proporções. As proporções foram corrigidas
para o controle da mortalidade, se fosse superior a 10%, usando-se a fórmula de
Schneider-Orelli (1947) (SCHNEIDER-ORELLI, 1947):
𝑀𝑜𝑟𝑡𝑎𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑐𝑜𝑟𝑟𝑖𝑔𝑖𝑑𝑎 (𝑝) =
% 𝑚𝑜𝑟𝑡𝑎𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑡𝑟𝑎𝑡𝑎𝑑𝑜𝑠 − % 𝑚𝑜𝑟𝑡𝑎𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝐶𝑇𝑅𝐿
× 100
100 − % 𝑚𝑜𝑟𝑡𝑎𝑙𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝐶𝑇𝑅𝐿
Após, converteu-se as proporções corrigidas (p) para probits empíricos (y).
Uma curva dose-resposta foi desenhada usando o log(10) da dose (x) e os probits
empíricos (y) e a equação de regressão foi derivada. Os probits empíricos menores
que 1 e maiores de 7 foram ignorados, pois têm pouca ou nenhuma significância na
estimativa de CL (HAYES; KRUGER, 2014).
(𝑥 − 𝜇)
𝑠
𝑦 = 5 +
A partir da equação da curva e das doses log(10), os probits esperados (Yi)
foram derivados. A partir dos probits esperados (Yi), a proporção esperada de
mortalidade seguida pelo número esperado de animais foi derivada. A mortalidade
original (observada) e a mortalidade derivada (esperada) foram usadas para calcular
o teste do qui-quadrado com (número de doses log usadas -2) graus de liberdade.
Quando o teste do qui-quadrado não foi significativo, indicava um bom ajuste de curva.
O valor de Z foi derivado usando a fórmula:
𝑍 =
1
(√2𝜋)
∞
2
∫ 𝑒 −1/2 (𝑌𝑖− 5)
𝑥
177
Onde, Yi é o probit esperado.
Os coeficientes de ponderação (W) foram derivados usando a fórmula:
𝑊 =
𝑍2
𝑃 × 𝑄
Onde, P é a proporção esperada e Q = 1 - P.
Os coeficientes ponderados foram usados para calcular o erro padrão:
𝐸𝑃 =
𝜎
√𝑛𝑊
Onde σ = desvio padrão (1/inclinação), n = número de animais em cada grupo
e W = coeficiente de ponderação.
Os probits de trabalho (Yw) foram derivados da equação de regressão pela
seguinte fórmula:
𝑌𝑤 = 𝑌𝑖 − (𝑃⁄𝑍) − 𝑝⁄𝑍
Onde, Y = probits esperados, P = proporção esperada e p = proporção
observada
Os valores de CL são derivados da curva desenhada usando probits de
trabalho e doses log. O antilog da dose correspondente ao respectivo valor probit.
Os intervalos de confiança fiduciais de 95% foram calculados usando-se a
fórmula:
𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑣𝑎𝑙𝑜𝑠 𝑓𝑖𝑑𝑢𝑐𝑖𝑎𝑖𝑠 = 𝑎𝑛𝑡𝑖𝑙𝑜𝑔 (𝑙𝑜𝑔 𝑑𝑎 𝑑𝑜𝑠𝑒 ± 1,96 𝐸𝑃)
178
179
ANEXOS
Anexo A: Parecer da Comissão de Ética no Uso de Animais: 16/2017
180
Anexo B: Adendo ao parecer da Comissão de Ética no Uso de Animais: A05/18016-2017