1. Inleiding biochemie (H1)
2. Nucleotiden en nucleïnezuren (H4)
3. Studie van genen en genomen (H5)
4. Koolhydraten (H11)
5. Lipiden (H12)
6. Proteïnen: samenstelling en structuur (H2)
Inleiding: lading van proteïnen
-
-
-
-
Proteïnen of peptideketens bestaan uit een aaneenschakeling van aminozuren, die
weergegeven worden door een 1- of 3-lettercode (namen, structuren en
lettercodes moeten gekend zijn van de 20 aminozuren)
Aminozuren met een ioniseerbare functionele groep kunnen een lading dragen;
dit kan een positieve lading zijn in geprotoneerde toestand (arginine, histidine,
lysine) of een negatieve in gedeprotoneerde toestand (asparginezuur, cysteïne,
glutaminezuur, tyrosine)
® Van deze 7 aminozuren moeten ook de mogelijke ladingen en pKa’s
gekend zijn
® Of deze aminozuren in ge(de)protoneerde toestand voorkomen, hangt af
van de pH; bij een extreem zuur milieu (pH = 0) zijn alle groepen
geprotoneerd en bij een extreem basisch milieu (pH = 14) zijn alle groepen
gedeprotoneerd
Elk vrij aminozuur heeft ook een amino- en carboxylgroep, die beide ioniseerbaar
zijn; bij lage pH zijn beide groepen geprotoneerd (à positieve lading op
aminogroep, geen lading op carboxylgroep) en bij hoge pH zijn beide groepen
gedeprotoneerd (à geen lading op aminogroep, negatieve lading op
carboxylgroep)
® Rond pH 7 komt het aminozuur voor met een positieve lading op de
aminogroep en een negatieve lading op de carboxylgroep (zwittervorm)
® Als er een peptidebinding tussen 2 aminozuren gevormd wordt, zijn deze
groepen niet meer ioniseerbaar (enkel aan het begin en einde van de
peptideketen zullen er nog een ioniseerbare amino- en carboxylgroep zijn)
Wanneer de pH gekend is, zijn ook alle ladingen gekend en moeten deze enkel
nog opgeteld worden om de netto lading van een peptide/proteïne te weten
1
-
-
Bv. keten Ser-Lys-His bij pH = 12 (hierbij is het eerste aminozuur, dus serine, het
aminozuur met de vrije aminogroep, en het laatste, histidine, het aminozuur met
de vrije carboxylgroep):
o Serine is polair, maar niet ioniseerbaar à geen lading
o Lysine en histidine dragen wel een ioniseerbare zijketen; bij pH = 12 komen
beide in gedeprotoneerde vorm voor à beide geen lading
o De eindstandige amino- en carboxylgroep zijn ook beide gedeprotoneerd
à de aminogroep heeft geen lading, de carboxylgroep heeft lading -1
® Netto lading = -1
Samengevat is het stappenplan:
o 1. 1- of 3-lettercode ontcijferen
o 2. Ioniseerbare groepen bepalen
o 3. N-begin en C-uiteinde in rekening nemen
o 4. Kijken naar pH en lading afleiden per ioniseerbare groep
o 5. Ladingen optellen
6.1.
-
-
-
-
Aminozuren als bouwstenen van proteïnen
Proteïnen zijn veelzijdige moleculen: kunnen optreden als enzymen, staan in voor
opslag en transport van zuurstof, leveren kracht, geven zenuwimpulsen door,
spelen een cruciale rol als hormonen en hormoonreceptoren en bij het
immuunsysteem (antilichamen), controleren groei en differentiatie…
De bouwstenen van proteïnen zijn aminozuren, die bestaan uit een 𝛼koolstofatoom waarop een aminogroep, een carboxylgroep, een waterstofatoom
en een variabele zijketen zitten
® De variabele zijketen bepaalt het type aminozuren en de eigenschappen
hiervan
® Het 𝛼-koolstofatoom is het chiraal centrum van de 𝛼aminozuren; alle 20 natuurlijk voorkomende 𝛼aminozuren zijn L-isomeren (aminozuur zo plaatsen
dat de R-groep naar boven, de aminogroep naar
beneden en de carboxylgroep naar boven wijst à als
het H-atoom links staat, is het aminozuur een Lisomeer, anders is het een D-isomeer)
Aminozuren in oplossing bij neutrale pH zijn zwitterionen:
dipolaire ionen met een positieve lading op de amino- en een negatieve lading
op de carboxylgroep
® pH < 3: protonatie
® pH > 8/9: deprotonatie
De 20 aminozuren verschillen in grootte, vorm, lading, polair of hydrofoob karakter
en chemische reactiviteit; op basis van de eigenschappen van de zijketen (R)
worden ze in groepen opgedeeld:
2
-
-
o Hydrofobe aminozuren
o Polaire aminozuren
o Positief geladen aminozuren
o Negatief geladen aminozuren
Zie p. 33-36 voor de structuren van de aminozuren in de verschillende groepen
® Het eenvoudigste hydrofobe alifatische aminozuur, glycine, is niet chiraal
® Proline = speciaal hydrofoob alifatisch aminozuur: geen vrije aminogroep
want deze is gebonden aan het 𝛼-koolstofatoom ter vorming van een
pyrroolring
® Tryptofaan en fenylalanine zijn hydrofobe aromatische aminozuren
® Threonine (polair niet-ioniseerbaar aminozuur) heeft 2 chirale centra
Zie p. 36 voor de ioniseerbare groepen (met pKa) en de aminozuren met 1- en 3lettercodes
Naast de 20 te kennen aminozuren komen er nog meer dan 200 voor in de natuur,
meestal precursoren van algemene aminozuren of chemisch gemodificeerde
afgeleiden (sommige aminozuren worden pas gemodificeerd na incorporatie in
een polypeptide)
6.2.
-
-
-
-
Primaire structuur (aminozuursequentie)
De primaire structuur is de opeenvolging van aminozuren of aminozuursequentie:
aminozuren worden gekoppeld door een peptidebinding (= amidebinding) ter
vorming van een polypeptideketen of proteïne
® Deze binding wordt gevormd door condensatie van de 𝛼-carboxyl van 1
aminozuur met de 𝛼-amino van een ander aminozuur (à verlies van 𝐻# 𝑂)
Een proteïne wordt in een bepaalde richting gevormd en afgelezen: beginnend
bij N en eindigend bij C
De massa van proteïnen wordt uitgedrukt in de eenheid “dalton”: 1 aminozuur =
110 g/mol = 110 Da
Tussen de ketens kan cross linking ontstaan: vorming van een disulfidebrug tussen
2 cysteïnes (sterk bepalend voor de uiteindelijke eiwitstructuur)
® Deze sterke zwavelbruggen ontstaan door een oxidator en kunnen door
een reductor weer gebroken worden
® Ook tussen cysteïnes uit dezelfde keten kan een disulfidebrug gevormd
worden
De peptidegroep bestaat uit 6 atomen, gelegen in 1 vlak: de C uit de
carboxylgroep en de N uit de aminogroep + de O op deze C en de H op deze N
+ de 𝛼-koolstofatomen van de 2 aminozuren
De peptidebinding tussen C en N heeft een dubbele bindingskarakter: er is geen
rotatie mogelijk (à beperkte wissel tussen cis- en trans-configuratie, waarbij cis
meestal minder gunstig is omwille van sterische hinder; bij proline zijn cis en trans
even ongunstig)
3
-
-
-
Figuur A: binnen de kader is 1 aminozuur weergegeven, dat links en rechts
gebonden is met het vorige en volgende aminozuur; binnen het aminozuur is
rotatie mogelijk tussen:
o N en C𝛼 (draaihoek 𝜙)
o C𝛼 en C (draaihoek 𝜓)
De verschillende rotatiemogelijkheden
worden weergegeven in het Ramachandran
diagram
® Op
de
x-as
worden
de
mogelijkheden voor draaihoek 𝜙
weergegeven
® Op de y-as worden de mogelijkheden voor draaihoek 𝜓 weergegeven
® In het lichtgroen worden alle mogelijke combinaties van draaihoeken 𝜙 en
𝜓 weergegeven
® In het donkergroen worden de meest stabiele combinaties van draaihoeken
𝜙 en 𝜓 weergegeven
Slechts een beperkt aantal combinaties is toegestaan, te wijten aan de rigiditeit
van de peptidebinding
6.3.
Secundaire structuur (𝛼-helix, 𝛽-plaat, bochten en lussen)
6.3.1. 𝛼-helix
-
-
-
De 𝛼-helix wordt gevormd door een waterstofbinding tussen de -C=O-groep van
aminozuur i met het amidewaterstof van aminozuur i + 4
® Hierbij treedt de -C=O-groep dus op als waterstofacceptor
De waterstofbindingen lopen bijna parallel aan de lengteas van de helix à
stabilisatie
Per draai van de helix zijn er 3,6 aminozuren en de lengte van de keten totdat een
volledige draai is gemaakt (“spoed”) is 0,54 nm (5,4 Å) à de toename per
aminozuur is 0,15 nm (1,5 Å)
De meeste 𝛼-helices van proteïnen zijn rechtsdraaiend
De 𝛼-helix is de stabielste secundaire structuur, maar voor bepaalde aminozuren
kan deze problemen opleveren à komen voor als 𝛽-plaat
4
6.3.2. 𝛽-plaat
-
-
-
De 𝛽-plaat bestaat uit verschillende 𝛽-strengen die zij aan zij gerangschikt zijn
® 𝛽-strengen zijn bijna volledig uitgestrekte
polypeptideketens die gestabiliseerd worden
door H-bruggen tussen -C=O en -NH op
naburige strengen
De 𝛽-strengen in een plaat kunnen parallel of
antiparallel lopen
® In
antiparallele
𝛽-platen
staan
waterstofbruggen bijna loodrecht op de
strengen à stabieler dan parallelle strengen,
die vervormde H-bindingen opleveren
Zijketens in 𝛽-platen zitten alternerend boven en
onder het vlak gevormd door de 𝛽-strengen
De toename per aminozuur is 0,35 nm (3,5 Å)
De 𝛽-strengen buigen in rechtsdraaiende richting
6.3.3. Draai – lus
-
-
-
Lussen en draaien verbinden 𝛼-helices en 𝛽-platen zodat een peptideketen zich
kan vouwen tot een compacte structuur; ze kunnen aan het oppervlak van
proteïnen in interactie treden met andere proteïnen en moleculen
Een 𝛽-draai (omgekeerde draai) verbindt verschillende antiparallelle 𝛽-strengen;
vaak wordt er een H-brug gevormd tussen -C=O van aminozuur i en -NH van
aminozuur i + 3
® Naast 𝛽-draaien kunnen er ook Ω-lussen voorkomen
Voorbeeld 1: 𝛼-keratine
® Structuurproteïne aanwezig in wol en haar
® Bestaat uit 2 rechtsdraaiende 𝛼-helices die in elkaar gedraaid zijn met
behulp van een linksdraaiende supercoil
® Kan tot 1000 Å lang zijn (0,1 𝜇m)
® Leu is per 7 aminozuren aanwezig (na 2 draaien: bij 𝛼-keratine zijn er 3,5
aminozuren per winding i.p.v. 3,6 à iets compacter); dit is een hydrofoob
alifatisch aminozuur, zodat er zwakke hydrofobe Van der Waals krachten
kunnen optreden tussen leucine-residu’s
® De zwakke Van der Waals bindingen zijn makkelijk te breken à eigenschap
van wol: uitrekbaar tot 2x de lengte (door te wassen) doordat de bindingen
breken in waterige omgeving en de 𝛼-helices uitrekken
® In haar en wol komt ook cross linking voor tussen cysteïneresidu’s, maar in
(relatief) weinige mate à flexibeler dan hoornen, klauwen, hoeven… waar
meer cross linking voorkomt
5
-
Voorbeeld 2: collageen
® Structuurproteïne aanwezig in huid, beenderen, tanden, kraakbeen
® Bestaat uit 3 linksdraaiende 𝛼-helices die in een rechtsdraaiende supercoil
zitten
® Kan tot 3000 Å lang zijn (0,3 𝜇m)
® Bij collageen zijn er 3 aminozuren per winding i.p.v. 3,6 (of 3,5) à nog
compacter
® Bepaalde aminozuren worden regelmatig herhaald:
o Proline: vaak naast glycine; zorgt ervoor dat de keten een
linksdraaiende spiraal wordt
o Glycine: komt om de 3 aminozuren voor; zorgt ervoor dat de 3
linksdraaiende spiralen in elkaar draaien tot een drievoudige
rechtsdraaiende spiraal
o Hydroxyproline: meestal naast proline; de OH-groep heeft een sterk
stabiliserend effect door H-bruggen
® Glycine (het kleinste aminozuur) komt voor aan de binnenkant
® De pyrrolidonringen van (hydroxy)proline komen vooraan de buitenkant
® Scheurbuik is een ziekte die ontstaat door een gebrek aan vitamine C
(afgeleide van ascorbinezuur), het co-enzym van prolylhydroxylase, dat
ervoor zorgt dat proline wordt omgezet in hydroxyproline
6.4.
-
-
Tertiaire structuur (3D-structuur)
De tertiaire structuur is de vouwing van de polypeptideketen in een dichtgepakte
3D-structuur
® Wordt gestabiliseerd door niet-covalente interacties tussen zijketens (bv.
hydrofobe effecten)
® Zorgt voor thermodynamisch stabiele proteïnen met een goede verdeling
van hydrofobe en hydrofiele aminozuren in de polypeptideketen
Voorbeeld 1: myoglobine
® 𝑂# -drager in het spierweefsel
® Globulair proteïne (bolvormig; typisch voor wateroplosbare proteïnen)
® 1 keten van 153 aminozuren, waarvan 70% deel uitmaakt van een helix
® Genesteld in het compacte proteïne zit een heemgroep met hierin een
ijzerion
® Inwendig in het proteïne zitten hydrofobe aminozuren (val, leu, meth, phe),
vanbuiten zitten geladen aminozuren: myoglobine komt voor in een waterig
milieu (ook 1 polair aminozuur binnenin: his, belangrijk voor de 𝑂# -binding)
6
-
-
-
-
Voorbeeld 2: bacteriorhodopsine
® Membraanoverspannend proteïne dat bijna uitsluitend bestaat uit 7
transmembranaire helices
® Zet lichtenergie om naar een protonentransport, waarbij ATP vrijkomt
® De aminozuursequentie bestaat uit verschillende opeenvolgende
hydrofobe aminozuren met daartussen steeds een polair aminozuur à
teken dat het om 𝛼-helices gaat
Voorbeeld 3: porine
® Membraanoverspannend proteïne met antiparallele 𝛽-strengen die een 𝛽plaat vormen in de vorm van een cilinder (vormt een porie à “porine”)
® Omgekeerde verdeling van (a)polaire aminozuren: polaire vanbinnen, nietpolaire vanbuiten (?)
® Kanaalproteïne bij bacteriën
® De aminozuursequentie bestaat afwisselend uit hydrofobe en polaire
aminozuren à teken dat het om 𝛽-strengen gaat
Voorbeeld 4: prostaglandine-𝐻# -synthase
® Membraangebonden (niet overspannend) enzym;
arachidonzuur is het hydrofoob substraat, dat perfect
past in het hydrofoob kanaal gevormd door hydrofobe
zijketens van prostaglandine-𝐻# -synthase
® Hormoon
dat
gesynthetiseerd
wordt
vanuit
arachidonzuur en vooral wordt geproduceerd bij
ontstekingen, pijn, koorts…; aspirine en ibuprofen
blokkeren het hydrofoob kanaal door acetylering van
serine (nodig voor de vorming) en remmen zo
ontstekingsreacties
Een motief is een bepaalde tertiaire structuur die regelmatig voorkomt, bv. helixlus-helix, een supercoil, een bundel…
Domeinen zijn onafhankelijk gevouwen, compacte eenheden in proteïnen
Men kan de aanwezigheid van transmembranaire helices voorspellen aan de hand
van de aminozuursequentie door zich de vraag te stellen of een residu van de
aminozuurketen liever in een polaire fase (buiten het membraan) of apolaire fase
(binnen het membraan) voorkomt
® Experiment: men laat de aminozuren van glycoforine A één voor één door
het membraan gaan en meet de energie die vrijkomt wanneer ze van
binnen het membraan (hydrofoob) naar buiten het membraan (hydrofiel)
gaan; hydrofobe aminozuren hebben een positieve Δ𝐺 (à de reactie kan
niet spontaan opgaan), hydrofiele een negatieve (à de reactie kan wel
spontaan opgaan)
® Dit experiment klopt niet altijd: bv. porine zou niet aangeduid worden als
membraanoverspannend, maar is dit wel
7
-
Een membraan wordt overspannen door een polypeptide van zo’n 20 aminozuren
à mogelijk om de dikte van een membraan te schatten
® Bv. als de aminozuursequentie in een 𝛼-helix gevouwen is: per aminozuur
verlengt de helix met 1,5 Å, dus dit geeft een membraandikte van 1,5*20 =
30 Å of 3 nm
6.5.
-
-
De quaternaire structuur is de organisatie van meerdere subeenheden of
polypeptideketens (identiek of verschillend) in een eiwit
® Niet alle proteïnen hebben een quaternaire structuur, maar vele wel (bv.
humaan hemoglobine, de proteïnemantel van virussen)
® De subeenheden worden samengehouden door veel zwakke, nietcovalente interacties (bv. hydrofobe, elektrostatische)
Samengevat zijn er 2 types proteïnen:
o Globulaire proteïnen
® Meestal wateroplosbaar, compact, sferisch
® Vanbinnen hydrofoob, aan het oppervlak hydrofiel
® Hiertoe behoren enzymen, dragereiwitten en regulatorische eiwitten
o Vezelachtige proteïnen
® Belangrijk voor mechanische structuur
® Vaak geassembleerd in lange kabels of draden
® Bv. 𝛼-keratines (belangrijkste component van haar en nagels) en
collageen (belangrijkste component van pezen, huid, beenderen en
tanden)
6.6.
-
-
Quaternaire structuur (subeenheden)
Aminozuursequentie bepaalt de 3D-structuur
Experiment: aan het proteïne ribonuclease werden de denaturerende stoffen urea
en guanidinium chloride (breken niet-covalente bindingen) en 𝛽-mercaptoethanol
(breekt S-S-bindingen) toegevoegd à het proteïne ontvouwde zich en was niet
meer werkzaam: het was gedenatureerd
® Verhitting van proteïnen heeft een gelijkaardig effect
Sommige proteïnen kunnen na denaturatie weer renatureren, waardoor ze ook
weer biologisch actief worden
® In het experiment gebeurde dit door een klein beetje 𝛽-mercaptoethanol
toe te voegen, wat ervoor zorgde dat indien er nieuwe maar foutieve S-Sbindingen werden gevormd, deze werden afgebroken zodat uiteindelijk de
juiste S-S-bindingen gevormd konden worden (ureum mag niet worden
toegevoegd, want dit zal er net voor zorgen dat de verkeerde S-Sbindingen gevormd worden)
8
-
-
-
-
-
-
Proteïnen vouwen zich dus automatisch als de omstandigheden goed zijn
(afwezigheid van denaturerende stoffen), maar hoe vouwen ze zich en wat bepaalt
deze vouwing?
Men heeft vastgesteld dat bepaalde aminozuren zich in meerdere of mindere mate
in bepaalde secundaire structuren bevinden en dit aangeduid met een relatieve
frequentie-index:
o Over het algemeen gaat de voorkeur naar een 𝛼-helix
o Gly heeft geen voorkeur: past overal, maar vooral in een lus
o Val en Ile zijn vertakte aminozuren à passen niet goed in een 𝛼-helix
(sterische hinder), dus gaat de voorkeur naar een 𝛽-plaat
o Pro past niet goed in een 𝛼-helix of 𝛽-plaat en komt dus vooral voor in een
lus
® Soms heeft eenzelfde peptidesequentie een verschillende configuratie in
verschillende proteïnen door de invloed van andere, verder gelegen
aminozuren
De opeenvolging van aminozuren bepaalt dus de secundaire structuur, en de
combinatie van alle secundaire structuren zal aanleiding geven tot de uiteindelijke
3D-structuur
De in vivo vouwing van proteïnen wordt gedreven doordat natieve (= juist
gevouwen) proteïnen in opgevouwen toestand energetisch gunstiger en dus
stabieler zijn à proteïnen kunnen spontaan vouwen totdat deze lage-energie
conformatie bereikt is
® Dit is een coöperatief proces: “alles of niets” (vanaf dat een bepaalde
concentratie aan denaturerende stof aanwezig is, zal het percentage
gedenatureerd proteïne heel snel stijgen)
® Het smeltpunt voor proteïnen is dat punt waarop de helft van alle
aanwezige proteïnen volledig gedenatureerd is, terwijl de andere helft nog
volledig intact is (?)
® Het vouwingsproces (wat dus eigenlijk de omzetting is van gedenatureerd
naar opgevouwen proteïne) gebeurt extreem snel: de natieve conformatie
wordt bereikt in minder dan 1 seconde
® De vouwing gebeurt progressief: van een reeds stabieler intermediair naar
een stabiel proteïne (niet at random!)
Volgens het nucleatie-condensatiemodel zal proteïnevouwing starten vanaf
bepaalde regio’s; eenmaal deze regio’s hun meest optimale vouwing hebben (dus
met de minste energie), zullen andere regio’s stap voor stap hun meest optimale
vouwing aannemen
Nadat een proteïne gevouwen is, kan het nog gemodificeerd worden:
o Covalente modificaties
® Bv. toevoeging van acetyl op het 𝑁𝐻# -uiteinde (à meer resistent tegen
degradatie) of toevoeging van suikers op aminozuren (à meer
hydrofiel)
9
-
o Chemische herrangschikkingen
o Splitsing van inactieve precursoren
Soms leidt proteïnevouwing tot neurologische afwijkingen, bv. Alzheimer,
Parkinson, Huntington, BSE (Bovine Spongiform Encephalopathy: dolle
koeienziekte), Creutzfeldt-Jacob disease (bij mensen), scrapie (bij schapen)…
® Deze misvouwingen gaven aanleiding tot het ontstaan van aggregaten
(“amyloïde plaques”): 𝛼-helices worden in proteïnen omgezet tot 𝛽-platen,
die zich groeperen tot grote aggregaten, wat de omzetting nog meer
bevordert
® Deze aggregaten zullen normale moleculen aantasten en omzetten tot
amyloïde plaques; de aggregaten zijn resistent tegen stoffen die normale
proteïnen degraderen
7. Studie van de proteïnen (H3)
7.1.
-
-
-
Purificatie van proteïnen om hun functie te ontrafelen
Opzuiveren (= purificatie) van proteïnen is de eerste stap in het bestuderen van
hun functie
Startsituatie: een intacte cel of stukje weefsel waaruit met een purificatieschema
(= fractionatieschema) stap voor stap verschillende fracties worden bereid
® Fractionatie is een proces waarbij een bepaalde hoeveelheid mengsel
wordt gescheiden in meerdere kleine hoeveelheden (“fracties”)
Doel: een zuiver proteïne bekomen
® Of dit gelukt is, kan bepaald worden mbv. een geschikte detectietest
(“assay”)
Purificatieschema:
o 1. Bereiding van een ruw extract (“fractionate”)
o 2. Verder opzuiveren met verschillende
scheidingstechnieken
(op
basis
van
oplosbaarheid, grootte, lading, affiniteit voor
andere moleculen)
7.1.1. Keuze van detectietest (kwalitatief, kwantitatief)
-
Er moet een detectietest gekozen worden die specifiek het beoogde proteïne zal
aantonen
In het geval van enzymen is de detectietest gebaseerd op de reactie die het enzym
katalyseert in de cel: een goedgekozen substraat wordt (dankzij katalyse door het
enzym) omgezet in een makkelijk op te sporen product
® Bv. lactaat en 𝑁𝐴𝐷1 worden mbv. lactaat dehydrogenase omgezet in
pyruvaat en NADH (en 𝐻1 ); NADH is makkelijk aan te tonen
10
-
De enzymactiviteit die door de detectietest gemeten wordt, wordt uitgedrukt als
specifieke activiteit: 𝑠𝑝𝑒𝑐𝑖𝑓𝑖𝑒𝑘𝑒 𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑒𝑖𝑡 =
-
=>?@ABCDEFED=ED (E> A=>HI=J,E>LMBCDE=)
DODBJ= PMOD=ï>=CO>C. (E> A=>HI=J,E> LMBCDE=)
Tijdens de purificatie zal de specifieke activiteit stijgen, totdat een maximum
bereikt wordt
7.1.2. Bereiden van celextract: differentiële centrifugatie
-
-
-
Men start met een intacte cel waarvan het celmembraan kapot wordt gemaakt; dit
ongezuiverde celextract wordt vervolgens afgecentrifugeerd, eerst op lage
snelheid à de zwaardere partikels slaan neer (het “pellet”) , de lichtere blijven in
suspensie (het “supernatans”)
Met het supernatans voert men opnieuw een centrifugatie uit, ditmaal op iets
hogere snelheid à ook lichtere partikels slaan neer, en enkel de nóg lichtere
blijven in suspensie
Men bekomt fracties met steeds dalende dichtheid, maar dit is nog maar een ruwe
scheiding (fractionate)
7.1.3. Purificatie van proteïnen: scheidingstechnieken
-
-
Het is noodzakelijk om nog verder te scheiden, met minstens 1 van de 4
scheidingstechnieken (op basis van oplosbaarheid, grootte, lading, affiniteit voor
andere moleculen)
Scheiding op basis van oplosbaarheid (uitzouten van proteïnen):
o Naarmate de zoutconcentratie stijgt, daalt de oplosbaarheid van het
proteïne à principe: neerslaan van ongewenste proteïnen (door hoge
zoutconcentratie) terwijl de gewenste in oplossing blijven
o De kritische concentratie (concentratie waarbij het proteïne neerslaat?) is
afhankelijk van het proteïne
o De hoge zoutconcentratie van de oplossing kan vervolgens verwijderd
worden dmv. dialyse: je neemt een dialysezakje (met semipermeabel
membraan), legt hier onderin een knoopje in, giet de oplossing in het zakje
en legt ook bovenaan een knoopje, waarna je het zakje in een geschikte
bufferoplossing legt à kleine moleculen (zoals zout) kunnen doorheen het
membraan en zullen naar buiten diffunderen, tot 𝑐STED=> A=ASMBB> =
𝑐SE>>=> A=ASMBB> ; door regelmatig de buffer te verversen, zullen uiteindelijk
bijna alleen de grotere moleculen in het dialysezakje overblijven
o De bekomen fracties kan men verder opzuiveren mbv. chromatografie (op
basis van grootte, lading, affiniteit voor een bepaalde chemische groep…)
11
-
-
-
-
-
Scheiding op basis van grootte (gelfiltratie):
o Men gebruikt een gelmatrix met poriën van gekende grootte,
waardoorheen de te scheiden moleculen zullen migreren door de
zwaartekracht
o Bovenaan op de gel wordt het mengsel aangebracht; kleine moleculen
zullen migreren in de interne poriën van de gel, grote moleculen kunnen
dit niet en zullen migreren langs de korrels à de grootste moleculen
verlaten als eerste de kolom, daarna volgen de kleinere
o De fracties van verschillende volumen worden apart opgevangen
Scheiding op basis van lading (ionenuitwisselingschromatografie):
o Men spreekt van kation- of anionuitwisselingschromatografie, afhankelijk
van of de kolom negatief respectievelijk positief geladen is
o Kationen/anionen zetten zich vast op de negatief/positief geladen kolom;
het is de bedoeling om deze weer uit de kolom vrij te krijgen, wat kan door
andere kationen/anionen in overmaat toe te voegen (= elutie)
Scheiding
op
basis
van
affiniteit
voor
chemische
groepen
(affiniteitschromatografie):
o Moleculen blijven achter op een kolom waarvoor ze affiniteit vertonen (bv.
metaalbindende proteïnen op een kolom met metaal, suikerbindende
proteïnen op een kolom waarop glucose zit)
o Voorbeeld: een kolom voorzien van glucosestaartjes wordt gebruikt om
concanavaline (C-type lectine dat op suiker bindt) op te zuiveren; na de
eerste stap is het proteïne gebonden, in een tweede stap wordt geëlueerd
met een competitor (glucose) om het gebonden concanavaline vrij te
maken
In deze voorbeelden migreren de mengsels doorheen de kolom door de
zwaartekracht, maar vaak wordt chromatografie uitgevoerd met lange,
dichtgepakte kolommen uit fijne materialen à hoge druk nodig om het mengsel
te doen migreren
® Deze techniek noemt men HPLC: High Performance Liquid
Chromatography (hoge druk vloeistofchromatografie)
Het grafisch resultaat van een chromatografische scheiding noemt men een
chromatogram
7.1.4. Controle van de efficiëntie van de purificatie
-
Als het op te zuiveren proteïne een enzym is, zal tijdens de purificatie de specifieke
activiteit stijgen
Wanneer het op te zuiveren proteïne geen enzym is, zal men de totale proteïneinhoud in de verschillende weerhouden fracties visualiseren dmv. gelelektroforese
® Gelelektroforese is een techniek waarbij geladen (bio)moleculen bewegen
in een elektrisch veld
12
-
® De scheiding gebeurt door het zeefeffect van de gelmatrix; de poriegrootte
kan worden aangepast door de gelconcentratie aan te passen
Verticale gelelektroforese of SDS-PAGE (polyacrylamide gelelektroforse):
o Negatief geladen proteïnen migreren naar de positieve pool onderaan;
voor de migratiesnelheid geldt 𝑣 =
-
-
UV
L
(E = elektrisch veld, q = lading), met
𝑓 = 6𝜋𝜂𝑟 (𝜂 = viscositeit, r = straal van het deeltje)
o De gel die hierbij gebruikt wordt, is polyacrylamide; moleculen van
verschillende groottes zullen met verschillende snelheden door de gel
migreren onder invloed van het elektrisch veld
o Sommige proteïnen hebben een positieve lading à om ervoor te zorgen
dat toch alle proteïnen naar dezelfde pool migreren, gebruikt men SDS
(natrium dodecyl sulfaat), een anionisch detergent dat alle niet-covalente
bindingen breekt waardoor alle proteïnen ontvouwen tot hun primaire
structuur; aangezien er 1 SDS bindt per 2 aminozuren, krijgen alle proteïnen
eenzelfde ladingsdichtheid
® Om de zwavelbruggen te breken (die wel covalent zijn), wordt
mercapto-ethanol of dithiothreitol toegevoegd
® De negatieve lading van elk proteïne is proportioneel met de grootte
ervan à scheiding op basis van grootte
o Na scheiding worden de proteïnen gekleurd met Coomassie blue à zullen
waar te nemen zijn als een bandenpatroon in de gel, met onderaan de
kleinste en bovenaan de grootste proteïnen
o Als het proteïne zuiver is, zal er maar 1 bandje zijn
o Ook de grootte van het proteïne kan bepaald worden, aangezien deze
omgekeerd evenredig is met de migratiesnelheid
Iso-elektrisch focusseren (IEF):
o Scheiden van proteïnen op basis van hun iso-elektrisch punt (de pH waarbij
het proteïne een nettolading van 0 heeft, zodat het niet meer zal kunnen
migreren in de gel)
o Het iso-elektrisch punt verschilt van proteïne tot proteïne naargelang het
aantal zure en basische aminozuren
o Er wordt eerst een pH-gradiënt aangelegd over de gel door poly-amfolyten
(die protonen kunnen opnemen en afgeven) zich te laten schrikken onder
invloed van een elektrisch veld, waarna men men het proteïnemengsel
aanbrengt à als het elektrisch veld wordt aangelegd, zullen de proteïnen
migreren (positieve/negatieve proteïnen naar de negatieve/positieve pool)
totdat ze elk hun iso-elektrisch punt bereikt hebben
Vaak wordt IEF gecombineerd met SDS-PAGE aangezien proteïnen met eenzelfde
iso-elektrisch punt niet per se eenzelfde grootte hebben à tweedimensionale
gelelektroforese (2D GE)
13
7.1.5. Evaluatie van de purificatie
-
Men meet eerst bij aanvang van de zuivering de totale hoeveelheid proteïne (A)
[
en de enzymactiviteit (B), waarna men ook de specifieke activiteit berekent (\)
[
-
® Stel dat in het begin A = 15.000 mg en B = 150.000 units (b1), zodat \ = 10
units/mg (c1)
® De opbrengst en het purificatieniveau zijn nu respectievelijk 100% en 1
Na uitzouting meet men opnieuw A en B en bekomt bv. dat nu A = 4.600 mg en
B = 138.000 units (b2), zodat
C#
[
\
S#
= 30 units/mg (c2) à de opbrengst (S]) en het
zuiverheidsniveau (C]) kunnen nu ook berekend worden en zijn respectievelijk gelijk
aan 92% en 3
-
-
Stap voor stap zal de totale hoeveelheid proteïne afnemen, maar de specifieke
activiteit en zuiverheid zullen toenemen, totdat een maximum bereikt wordt à
gevisualiseerd mbv. gelelektroforese zullen er elke stap steeds minder bandjes zijn
en zal het bandje dat het op te zuiveren proteïne voorstelt dikker worden (omdat
de concentratie ervan toeneemt)
Bij een goede purificatie is er dus:
o Een goede zuiverheid
o Een goede opbrengst
14
7.1.6. Recombinant-DNA-technologie om proteïnen op te
zuiveren
-
-
-
Hoe men te werk gaat:
o 1. Het DNA dat het proteïne codeert klonen
o 2. De DNA-sequentie van dit stukje DNA bepalen
o 3. Via de genetische code de aminozuursequentie bepalen
Probleem: posttranslationele modificaties worden niet gedetecteerd (doordat ze
na translatie worden toegevoegd, zitten ze niet in het DNA), maar ze zijn vaak
essentieel voor de functie van het proteïne
Mogelijkheden van recombinant-DNA-technologie:
o Grote hoeveelheden proteïnen bekomen in gastheerorganismen (door het
stukje DNA dat dit proteïne codeert in te bouwen in het organisme)
o Proteïnen merken met een tag (bv. een histidinestaartje aan een proteïne
laten aanbouwen door in het DNA de codonsequenties toe te voegen van
een opeenvolging van enkele histidines)
® Wordt gebruikt in affiniteitschromatografie
o Aminozuursequenties wijzigen (= genetische manipulatie)
7.2.
-
-
-
Immunologische technieken
Een antilichaam (Ab) is een immunoglobuline (globulair proteïne: oplosbaar in het
bloed) dat geproduceerd wordt als antwoord op de aanwezigheid van een
antigen; het is zeer specifiek en heeft een hoge affiniteit
® Antilichamen bestaan uit 2 lange en 2 korte peptideketens, die door
disulfidebruggen verbonden zijn
® De plaatsen waar de korte en lange ketens gebonden zijn, zijn de plaatsen
die antigenen kunnen herkennen
® De groep aminozuren van het antigen die herkend wordt door het
antilichaam, noemt men de antigenische determinant of epitoop
De immunologische technieken zijn gebaseerd op het aanmaken van een
antilichaam tegen een specifiek antigen; deze antilichamen worden geproduceerd
door proefdieren die ingespoten worden met het proteïne
® Het dier zal een heterogeen mengsel van verschillende antilichamen
produceren die elk een verschillende bindingsaffiniteit voor het antigen
hebben en die elk zullen binden aan een verschillend epitoop; dit zijn
polyklonale antilichamen (moeilijker bruikbaar in biochemische studies)
Monoklonale antilichamen herkennen maar 1 type epitoop à hoe te maken?
® Men wilde een homogeen mengsel van monoklonale antilichamen
verkrijgen, maar cellen die dit produceren zijn kortlevend
® Oplossing: kortlevende Ab-cellen fuseren met multiple myelomacellen, een
type kankercel die ongecontroleerd blijft delen en dus onsterfelijk is
15
-
® Dus: bv. een muis wordt ingespoten met een antigen à enkele weken later
worden Ab-producerende cellen uit de milt geïsoleerd en gefuseerd met
myelomacellen, zodat ze blijven leven à de cellen die antilichamen met de
gewenste specificiteit aanmaken, worden geselecteerd en vermeerderd (in
vitro/in vivo) à monoklonale antilichamen worden geproduceerd
Antilichamen (polyklonaal, monoklonaal) worden gebruikt voor:
o Opzuivering van “zeldzame” proteïnen (proteïnen die in kleine
hoeveelheden voorkomen) via affiniteitschromatografie, waarbij een kolom
gecoat is met antilichamen die reageren met het gewenste proteïne
o Detectie van proteïnen mbv. ELISA, Western blotting
o Kwantificatie van proteïnen mbv. ELISA
o Visualisatie van proteïnen in de cel mbv. fluorescente merkers
7.2.1. Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)
-
-
-
Men maakt gebruik van antilichamen waarop een enzym covalent is gebonden om
een antilichaam/antigen te detecteren
® Dit enzym is goed op te sporen met een reactie waarbij gekleurd product
wordt gevormd; de kleurintensiteit is evenredig met de hoeveelheid
enzymgebonden antilichaam, zodat dit ook een kwantitatieve methode is
Indirecte ELISA:
o Men wil een specifiek antilichaam aantonen
o Men vertrekt van een microtiterplaat waarvan de putjes gecoat zijn met het
antigen dat met het gewenste antilichaam zal reageren en voegt dan het te
onderzoeken staal toe
o Als het antilichaam aanwezig is, zal dit met het antigen binden; andere
antilichamen zullen niet binden
o Na een wasstap om alle niet-gebonden antilichamen te verwijderen, voegt
men het enzymgebonden antilichaam toe, dat met het specifiek antilichaam
zal binden (als dit aanwezig is)
o Vervolgens voegt men substraat toe, dat door het enzym wordt omgezet in
gekleurd product; de kleurintensiteit is evenredig met de hoeveelheid
specifiek antilichaam
Sandwich ELISA:
o Men wil een specifiek antigen aantonen
o Men vertrekt van een microtiterplaat waarvan de putjes gecoat zijn met het
antilichaam dat met het gewenste antigen zal reageren en voegt dan het te
onderzoeken staal toe
o Als het antigen aanwezig is, zal dit met het antilichaam binden
o Na wassen wordt het monoklonaal enzymgebonden antilichaam
toegevoegd, dat met het specifiek antigen zal binden
o Vervolgens voegt men substraat toe; kleurintensiteit ~ hoeveelheid antigen
16
7.2.2. Western blotting
-
Western blotting wordt gebruikt om een specifiek proteïne op te sporen
Werkwijze:
o Er wordt een SDS-PAGE uitgevoerd om een proteïnemengsel te scheiden
op basis van grootte
o Daarna wordt een afdruk gemaakt op een nitrocellulosemembraan, dat in
een vloeistof wordt gedompeld waarin het antilichaam aanwezig is dat zal
reageren met het gewenste proteïne
o Als het proteïne aanwezig is, zal dit met het antilichaam binden
o Na wassen om niet-gebonden proteïnen te verwijderen, wordt het
membraan overgebracht naar een vloeistof met een tweede antilichaam,
dat bv. gemerkt is met een fluorescente merker en zal binden aan het eerste
antilichaam (?)
o Na nog een wasstap wordt het membraan belicht, om aan te tonen waar
het fluorescente bandje zich bevindt; op deze manier kan 1 specifiek
proteïne aangetoond worden in een gel
7.2.3. Fluorescente merkers
-
Fluorescente merkers dienen ter visualisatie van proteïnen
Men kan bv. gebruikmaken van antilichamen gemerkt met een fluorescente groep,
die gedetecteerd kan worden met een fluorescentiemicroscoop, maar ook van
antilichamen gemerkt met goudpartikeltjes, die gedetecteerd kunnen worden met
een elektronenmicroscoop
7.3.
Identificatie van proteïnen
7.3.1. Bepaling van aminozuursamenstelling van proteïne
-
Men wil de aminozuursamenstelling van korte peptiden bepalen; veronderstel bv.
als onbekend peptide Ala-Gly-Asp-Phe-Arg-Gly
3 stappen:
o 1. Hydrolyse: alle peptidebindingen worden gehydrolyseerd en we
bekomen een mengsel van 6 aminozuren
o 2. Scheiding en identificatie van de verschillende aminozuren via
chromatografie
o 3. Kwantificatie van de verschillende aminozuren na
reactie met ninhydrin (de aangeduide OH-groepen
reageren met de aminegroep van aminozuren; enkel
proline heeft geen vrije aminegroep en zal dus niet
gedetecteerd worden)
17
-
-
De afbeelding toont het chromatogram na een kationuitwisselingschromatografie;
er zijn 5 pieken, wat wijst op 5 verschillende aminozuren, waarvan 1 dubbel zo veel
voorkomt (hogere piek)
® Men kan bepalen om welke aminozuren
het gaat ahv. de pH waarbij ze de kolom
verlaten (?); het negatief geladen Asp
verlaat de kolom als eerste, het positief
geladen Arg als laatste
® Met deze techniek kan niet bepaald
worden in welke volgorde de aminozuren
voorkomen
Tegenwoordig gebruikt men in plaats van ninhydrin eerder gevoeligere merkers,
zoals fluorescamine
7.3.2. Bepaling van aminozuursequentie van proteïne
-
-
3 stappen:
o Merken van het N-terminaal aminozuur (labeling)
o Milde hydrolyse van het proteïne zodat enkel het N-terminaal aminozuur
wordt afgesplitst
o Identificatie van gemerkte aminozuren via chromatografie
® De eerste 2 stappen worden meerdere malen herhaald, waarna dus alle
gemerkte aminozuren worden geïdentificeerd
® Dit proces wordt de Edman degradatie genoemd
Probleem: de verwijdering van het N-terminaal aminozuur is nooit volledig à het
staal wordt bij elke ronde meer en meer onzuiver à tot 50 aminozuren is de
sequentiebepaling nog doenbaar, maar hierna niet meer
® Oplossing: proteïnen van meer dan 50 aminozuren fragmenteren in kleinere
peptiden en van deze elk apart de aminozuursequentie bepalen
® Het fragmenteren van proteïnen kan op een chemische of een
enzymatische manier (enzymatisch mbv. trypsine, dat splitst na Lys, of
chymotrypsine, dat splitst na Trp)
18
8. Ligandbinding door hemoglobine (H7)
Inleiding
-
-
-
-
Een ligand is een molecule of ion dat een vrij elektronenpaar heeft om een binding
te vormen met een metaalion; dit metaalion zal hemoglobine zijn karakteristieke
kleur en magnetische eigenschappen geven
Hemoglobine is een globulair, bolvormig proteïne met een heemgroep; het is
wateroplosbaar en bestaat uit vele 𝛼-helices
In aerobe omstandigheden (aanwezigheid van zuurstof) kan 15x meer energie uit
glucose gehaald worden dan in anaerobe omstandigheden
Eéncelligen absorberen zuurstof rechtstreeks uit de omgeving; gewervelden
hebben een vaatstelsel om zuurstof op de juiste plaatsen te brengen
Zuurstoftransport bij gewervelden gebeurt in het bloed mbv. rode bloedcellen die
hemoglobine bevatten; in spierweefsel wordt zuurstof opgeslagen mbv.
myoglobine
® In de buurt van de heemgroep van hemoglobine (waarop zuurstofbinding
plaatsgrijpt) zitten 2 belangrijke histidines, die een essentiële rol spelen bij
de zuurstofbinding
Hemoglobine, myoglobine en leghemoglobine zijn alledrie zuurstofbindende
globinen met een gelijkaardige 3D-structuur, maar er zijn grote verschillen als
zuurstoftransporter: bij hemoglobine kan 90% van de gebonden zuurstof makkelijk
afgegeven worden, bij myglobine maar 7%
® Leghemoglobine is aanwezig bij de stikstoffixerende vlinderbloemigen en
zal hier zuurstof binden, zodat het de activiteit van de zuurstofgevoelige
nitrogenase niet vermindert
8.1.
-
Myoglobine
Myoglobine is een proteïne dat uit 1 subeenheid bestaat; de keten bestaat uit 153
aminozuren, waarvan 70% in een 𝛼-helix zit
Middenin de heemgroep van myoglobine zit een 𝐹𝑒 #1 -ion; deze heemgroep en
het ion zorgen voor de rode kleur van bloed en spierweefsel
® 𝐹𝑒 #1 is met 6 liganden gebonden: 4 keer met stikstof in de heemgroep,
een vijfde keer met proximaal histidine 93 (histidine dat in de nabijheid van
de ring aanwezig is en waarvan het N-atoom een binding vormt met 𝐹𝑒 #1 )
en een zesde keer met 𝑂#
® 𝐹𝑒 #1 is te groot om in het vlak van de heemgroep te passen, maar wanneer
het gebonden is met zuurstof als zesde ligand zal er een herschikking van
de elektronen van zuurstof zijn zodat 𝐹𝑒 #1 kleiner wordt en wel binnen de
heemgroep past
19
-
Eens zuurstof gebonden is, is het belangrijk dat er
geen superoxide-ion ontstaat (partiële transfer van
elektronen van 𝐹𝑒 #1 naar 𝑂# zodat er 𝐹𝑒 `1 ontstaat):
o Superoxide is schadelijk
o 𝑂# kan enkel binden aan 𝐹𝑒 #1 , niet aan 𝐹𝑒 `1 à myoglobine met een 𝐹𝑒 `1 ion (= metmyoglobine) kan geen 𝑂# binden
® Oplossing: distaal histidine 64 (ligt iets verderaf; 𝐻1 -donor) vormt een Hbrug met zuurstof, waardoor het zuurstof ook als zuurstof zal vrijkomen, en
niet als superoxide (?)
8.2.
-
-
Hemoglobine A (HbA): adult hemoglobine
Hemoglobine bestaat uit 4 subeenheden (of uit 2 identieke dimeren, 𝛼] 𝛽] en 𝛼# 𝛽# ,
elk met 2 subeenheden) met dezelfde 𝛼-helixstructuren als myoglobine, maar het
is een veel efficiëntere 𝑂# -drager dan myoglobine (90% VS 7%; zie eerder)
® Tussen 𝛼] en 𝛽] en 𝛼# en 𝛽# zijn er sterke interacties, tussen 𝛼] en 𝛽# en 𝛼#
en 𝛽] zijn er geleidende interacties (zoutbruggen die gemakkelijk gebroken
kunnen worden) en tussen 𝛼] en 𝛼# en 𝛽] en 𝛽# zijn er zwakke interacties
Elk van de 4 ketens van hemoglobine draagt een heemgroep
Zuurstof-bindingscurve myoglobine VS hemoglobine (A):
o Op de x-as staat de zuurstofdruk, uitgedrukt in torr (1 torr = 1 mmHg)
o Op de y-as staat de verzadigingsgraad van myoglobine met zuurstof
o Myoglobine: bij zeer lage zuurstofdruk (𝑝𝑂# = 2 torr) is er al 50% verzadiging
(𝑃bc ) à myoglobine heeft een zeer sterke affiniteit voor zuurstof
o Hemoglobine: pas bij een zuurstofdruk van 26 torr is er 50% verzadiging à
hemoglobine heeft een veel lagere affiniteit voor zuurstof
® De zuurstof-bindingscurve van hemoglobine is een sigmoïde curve
(coöperatieve binding): dit toont aan dat de binding/afgifte van 𝑂# op
1 subeenheid de binding/afgifte van 𝑂# op de andere subeenheden
vergemakkelijkt
® Fysiologische betekenis: als er weinig 𝑂# aanwezig is, zal hemoglobine
dit gemakkelijk afgeven aan de weefsels die het nodig hebben (bv.
spieren in beweging); als er veel 𝑂# aanwezig is, zal hemoglobine dit
gemakkelijk opnemen (bv. in de longen) à hemoglobine is een ideale
𝑂# -transporter
A.
B.
20
-
-
Nog wat verder de fysiologische betekenis van de coöperatieve binding (B):
o Als je vertrekt vanuit de longen met 𝑝𝑂# = 100 torr, dan geldt zowel voor
myoglobine als hemoglobine dat er 98% verzadiging is (dus 98% van de
zuurstofbindingsplaatsen is bezet met zuurstof)
o Wanneer deze moleculen in een situatie komen met 𝑝𝑂# = 20 torr, dan is er
bij myoglobine nog 91% verzadiging en bij hemoglobine nog maar 32% à
er is respectievelijk 7% en 66% van de initeel gebonden 𝑂# afgegeven
o Hemoglobine is dus de ideale 𝑂# -transporter: er wordt veel 𝑂# opgenomen
in de longen wanneer de zuurstofdruk hoog is, en er wordt veel 𝑂#
afgegeven aan spieren in beweging
o Myoglobine bindt te sterk aan 𝑂# om een goede 𝑂# -transporter te zijn
o De onderste curve toont hemoglobine indien er geen coöperatieve binding
zou optreden; in dit geval zou er pas bij veel hogere 𝑝𝑂# een verzadiging
van 100% bereikt worden en zou slechts 38% van de mogelijke 𝑂# bindingsplaatsen bijdragen tot 𝑂# -transport
En nog wat verder de fysiologische betekenis (C):
o In rust: als je vertrekt met 𝑝𝑂# = 100 torr en gaat
naar 𝑝𝑂# = 40 torr, dan daalt de verzadiging van
hemoglobine van 98% naar 77% à bij een daling
van 60 torr wordt 21% van de 𝑂# afgegeven
o In beweging: als je vertrekt met 𝑝𝑂# = 40 torr en
gaat naar 𝑝𝑂# = 20 torr, dan daalt de verzadiging
van hemoglobine van 77% naar 32% à bij een
daling van 20 torr wordt 45% van de 𝑂# afgegeven C.
o Er is dus een zeer steile daling in de 𝑂# -verzadigingsgraad van rust naar
activiteit; 𝑂# zal met de grootste nood aan de weefsels worden
overgedragen
8.2.1. De 𝑂# -binding verandert de quaternaire structuur
-
-
Wanneer er geen 𝑂# aan hemoglobine gebonden is, spreken we van
desoxyhemoglobine; dit molecule bevindt zich in het T-stadium (tense), een meer
rigide structuur door sterke subeenheidinteracties
Wanneer 𝑂# bindt aan hemoglobine (à “oxyhemoglobine”), draait het bovenste
dimeer (𝛼] 𝛽] ) 15° t.o.v. het onderste dimeer (𝛼# 𝛽# ); dit molecule bevindt zich in
het R-stadium (relaxed), een stabielere toestand waarbij de 4 subeenheden beter
in elkaar passen en de holte die bij het T-stadium aanwezig was, verdwijnt, en
waarbij de 𝑂# -bindingsplaatsen 𝑂# met een hogere affiniteit kunnen binden
® De binding van 1 𝑂# met 1 subeenheid zal dus de bindingsaffiniteit op de
andere plaatsen beïnvloeden door de overgang van T naar R
21
8.2.2. Geconcerteerd en sequentieel model van 𝑂# -binding op
hemoglobine
-
-
Er zijn verschillende modellen om uit te leggen hoe de coöperativiteit gebeurt bij
omzetting van T naar R; we bespreken er 2
Geconcerteerd (= gezamenlijk) model (Monod-Wyman-Changeux):
o De omzetting van T naar R gebeurt in alle subeenheden tegelijk à alle
subeenheden van het molecule bevinden zich ofwel in het T- ofwel in het
R-stadium
o Er is een evenwicht tussen de moleculen in T en in R
o Als aan een molecule geen 𝑂# gebonden is, heeft het T-stadium de
voorkeur; ook wanneer er 1 𝑂# gebonden is, ligt het evenwicht dichter bij T
dan bij R (maar wel al een stuk minder)
o Als er 2 moleculen 𝑂# gebonden zijn, is er een evenwicht tussen het T- en
R-stadium
o Vanaf 3 moleculen 𝑂# verschuift het evenwicht eerst geleidelijk, en dan sterk
(bij 4 moleculen 𝑂# ) naar het R-stadium
o In de afbeelding zien we dat de 𝑂# -bindingscurve voor het R-stadium heel
hoog ligt (à bindt 𝑂# sterk; vergelijkbaar met de curve van myoglobine)
terwijl de 𝑂# -bindingscurve voor het T-stadium heel laag ligt (à bindt 𝑂#
zwak); de eigenlijke curve van hemoglobine ligt ertussen en volgt die van
het T-stadium bij lage 𝑝𝑂# (à 𝑂# wordt slecht gebonden, of beter: goed
afgegeven) en die van het R-stadium bij hoge 𝑝𝑂# (à 𝑂# wordt goed
gebonden)
Sequentieel (= opeenvolgend) model:
o De binding van 𝑂# op 1 plaats verandert de conformatie van deze ene
subeenheid (gaat van T naar R) à het molecule kan gemengd bestaan uit
subeenheden in T of in R
o De conformatieverandering van deze ene subeenheid induceert
veranderingen in de naburige subeenheden en doet zo de bindingsaffiniteit
van de andere plaatsen toenemen, maar dit zonder een volledige conversie
van T naar R
22
-
De eigenlijke werking van de coöperatieve zuurstofbinding door hemoglobine ligt
tussen de 2 modellen in
® Het geconcerteerde model sluit het beste bij de werkelijkheid aan wanneer
er veel 𝑂# gebonden is: het geeft aan dat hemoglobine, wanneer er 3 𝑂# moleculen gebonden zijn, praktisch altijd in het R-stadium is
® Het sequentieel model sluit het beste bij de werkelijkheid aan wanneer er
weinig of geen 𝑂# gebonden is: het evenwicht ligt dan naar het T-stadium
8.2.3. Structuurverandering aan de heemgroep heeft effect op
𝛼] 𝛽] − 𝛼# 𝛽# -interface
-
Bij 𝑂# -binding wordt proximaal histidine 93 naar de heemgroep getrokken, dat
deel uitmaakt van een 𝛼-helix die een rol speelt bij het contact van dimeer 𝛼] 𝛽]
met dimeer 𝛼# 𝛽# à de 𝛼-helix verschuift ook, waardoor het contactoppervlak
tussen de dimeren verandert
8.2.4. De rol van 2,3-bisfosfoglyceraat in de zuurstofaffiniteit
van hemoglobine
-
-
2,3-BPG (structuur kennen!) zorgt ervoor dat het T-stadium
(desoxystadium) van hemoglobine gestabiliseerd wordt
totdat er voldoende 𝑂# gebonden is voor omzetting naar R
® Eigenlijk is het T-stadium instabiel en zet
hemoglobine liever om naar het R-stadium, maar dan zou 𝑂# te sterk
gebonden zijn voor goede zuurstofoverdracht; 2,3-BPG voorkomt dus dat
er (te vroeg) wordt overgegaan op het R-stadium door het T-stadium te
stabiliseren, waardoor 𝑂# minder sterk bindt met hemoglobine
De bindingsplaats van 2,3-BPG op HbA is in de holte die aanwezig is in het Tstadium; aangezien 2,3-BPG 5 negatieve ladingen heeft, zijn bij de binding positief
geladen aminozuren bij betrokken (His 2, His 143 en Lys 82)
® Bij overgang van T naar R verdwijnt de holte, waardoor 2,3-BPG vrijkomt en
het stabiliserend effect verdwijnt, zodat 𝑂# makkelijk en stevig gebonden
wordt
® 2,3-BPG is dus een allosterische effector: het speelt een rol op een andere
plaats van het proteïne (nl. de bindingsplaatsen van 𝑂# ) dan de plaats
waarop het zelf bindt (nl. de holte in het T-stadium)
® Het bloed heeft een pH van ongeveer 7, maar in de holte zal de pH iets
lager zijn à His komt voor in positieve vorm
23
-
-
Op de 𝑂# -bindingscurve van zuiver hemoglobine (geen
binding met 2,3-BPG) zien we dat er bij overgang van 𝑝𝑂# =
100 torr naar 𝑝𝑂# = 20 torr slechts 8% van de 𝑂# afgegeven
wordt à zonder 2,3-BPG is hemoglobine een slechte 𝑂# transporter
Foetaal hemoglobine (HbF) ziet er anders uit dan HbA: in
plaats van 2 𝛽-ketens zijn er 2 𝛾-ketens, die voor 72%
identiek zijn met de 𝛽-ketens, maar een belangrijk verschil is dat His 143 is
vervangen door het ongeladen Ser 143 à de affiniteit voor 2,3-BPG daalt zodat
de affiniteit voor 𝑂# stijgt à voordeel: 𝑂# van het moederbloed (met hemoglobine
in het T-stadium) wordt makkelijk overgedragen naar het foetaal bloed (met
hemoglobine in het R-stadium)
8.2.5. CO-vergiftiging
-
-
CO is een geurloos, kleurloos gas dat ontstaat bij onvolledige verbranding (bv.
van een slechtwerkende gasboiler) en 200x sterker met hemoglobine bindt dan 𝑂#
De binding van 1 CO op 1 subeenheid zal de 𝑂# -bindingscurve naar links
verschuiven en het tetrameer naar R omzetten, waardoor de 𝑂# op de andere 3
subeenheden zodanig sterk gebonden blijft op hemoglobine dat het niet meer
aan de weefsels kan worden afgegeven
Behandeling (indien op tijd): hyperbare 𝑂# -therapie
® Hierbij probeert men met hoge 𝑂# -concentraties CO te verdrijven
8.3.
-
Bohr-effect: in vloed van de pH op 𝑂# -binding
Wanneer hemoglobine van een toestand van 100 torr in de longen vertrekt, kan
er aan de weefsels bij 20 torr 66% van de gebonden 𝑂# worden afgegeven bij een
pH van 7,4, en 77% bij een pH van 7,2 à er wordt dus meer 𝑂# afgegeven bij
lagere pH, wat goed is omdat spieren die intense arbeid leveren verzuren (à pH
daalt) en veel 𝑂# nodig hebben om dit tegen te gaan
® Bepaalde groepen zijn belangrijk bij dit pH-effect, nl. his, lis, asp en de
terminale 𝛼-carboxylgroep: in desoxyhemoglobine vormt de 𝐶𝑂𝑂g -groep
van 𝛽] his146 (terminaal aminozuur) een zoutbrug met 𝛼# lys40, waardoor
𝛽] his146 in positie zit om een zoutbrug te vormen met 𝛽] asp94, indien
𝛽] his146 geprotoneerd is (dit is het geval bij lage pH) à hierdoor wordt het
T-stadium gestabiliseerd, zodat 𝑂# makkelijker vrijgegeven wordt
® Hetzelfde geldt ook wanneer 𝛽] vervangen wordt door 𝛽# en 𝛼# door 𝛼]
24
-
-
-
Ook 𝐶𝑂# , dat door actieve spieren geproduceerd wordt, heeft een invloed op de
zuurstofbinding; het effect kan op 2 manieren verklaard worden:
o Eerste mechanisme: 𝐶𝑂# komt in de rode bloedcellen terecht en reageert
hier met water ter vorming van 𝐻# 𝐶𝑂` , dat gedeprotoneerd wordt (à 𝐻1
en 𝐻𝐶𝑂`g ); door de vorming van 𝐻1 daalt de pH, waardoor het T-stadium
gestabiliseerd wordt en 𝑂# makkelijker wordt afgegeven
o Tweede mechanisme: 𝐶𝑂# reageert met een vrije eindstandige aminegroep
ter vorming van een carbamaat; dit is een negatief geladen component die
dmv. zoutbruginteracties het T-stadium zal stabiliseren, waardoor 𝑂#
makkelijker wordt afgegeven
𝐶𝑂# en 𝐻1 zijn allosterische effectors: ze hebben invloed op de 𝑂# -binding, maar
binden zelf op een andere plaats
𝐶𝑂# -transport van weefsels naar longen:
o 𝐶𝑂# wordt geproduceerd door spieren in beweging en komt vervolgens in
de bloedbaan terecht; het is een neutraal molecule en kan makkelijk door
het celmembraan van rode bloedcellen migreren
o Binnenin de rode bloedcellen reageren 𝐶𝑂# en water mbv. het enzym
koolzuuranhydrase tot 𝐻1 en 𝐻𝐶𝑂`g ; 𝐻𝐶𝑂`g verlaat de rode bloedcellen (met
uitwisseling van een 𝐶𝑙 g -ion) en komt in de bloedbaan terecht
® 𝐶𝑂# kan ook reageren met hemoglobine ter vorming van carbamaat,
maar dit is minder belangrijk (gebeurt in mindere mate)
® Door de vorming van 𝐻1 daalt de pH à 𝑂# wordt makkelijker wordt
afgegeven
o Via het bloed komt 𝐻𝐶𝑂`g in de longen, waar het weer in de rode
bloedcellen migreert (met uitwisseling van een 𝐶𝑙 g -ion) en hier weer wordt
omgezet in 𝐶𝑂# (en water)
® Bij deze omzetting verhoogt de pH à 𝑂# (dat ingeademd wordt) wordt
makkelijker opgenomen
o 𝐶𝑂# transporteert weer uit de rode bloedcellen en wordt afgegeven in de
longen, waarna het uitgeademd wordt
25
8.4.
Ziekten door genmutatie in hemoglobine
8.4.1. Sikkelcelanemie
-
-
-
Bij sikkelcelanemie is de vorm van rode bloedcellen afwijkend (nl. in de vorm van
een sikkel)
Het ioniseerbare, negatief geladen glu 6 in de 𝛽-subeenheid van hemoglobine is
bij sikkelcelanemie vervangen door het hydrofobe val 6; de gemuteerde vorm van
hemoglobine noemt men hemoglobine S (HbS) en resulteert in een sterk
verminderde oplosbaarheid van desoxyhemoglobine à gevolgen:
o Slechtere bloedsomloop door bloedklonters
o Risico op bloedinfectie
o Bloedarmoede
In desoxyHb (dat in het T-stadium is) liggen de aminozuren phe 85 en leu 88 aan
de buitenzijde van het molecule; deze kunnen met val 6 een hydrofoob pad
vormen, waardoor aggregatie kan optreden van 14 moleculen hemoglobine à er
wordt 1 slecht oplosbare vezel gevormd
In oxyHb (dat in het R-stadium is) liggen phe 85 en leu 88 binnenin het molecule,
waardoor er geen aggregatie kan optreden à weinig verschil
Sikkelcellen ontstaan dus wanneer rode bloedcellen door zuurstofarme capillairen
passeren, aangezien ze dan in de desoxytoestand zijn en kunnen aggregeren
Sikkelcelanemiepatiënten hebben 2 allelen HbS; mensen met 1 allel HbB en 1 allel
HbS hebben aanleg voor sikkelcelanemie, maar zijn resistent tegen malaria à
evolutionair voordeel
8.4.2. Thalassemie
-
-
Bij thalassemie is er een onevenwichtige productie van 1 van de
hemoglobineketens
2 soorten:
o 𝛼-thalassemie: er worden onvoldoende 𝛼-ketens geproduceerd à
hemoglobine H met 4 𝛽-ketens, wat leidt tot een veel te sterke 𝑂# -binding
en geen coöperativiteit
o 𝛽-thalassemie: er worden onvoldoende 𝛽-ketens geproduceerd à 𝛼-ketens
vormen onoplosbare aggregaten
Er zijn 4 genen voor de productie van 𝛼-ketens en 2 genen voor de productie van
𝛽-ketens à 𝛽-thalassemie komt vaker voor
® Aangezien er meer genen zijn voor de productie van 𝛼-ketens moet er een
systeem zijn om te vermijden dat de 𝛼-ketens bij productie zouden
precipiteren, wanneer de 𝛽-ketens nog niet geproduceerd zijn: AHSP (𝛼hemoglobine stabiliserend proteïne), dat een complex vormt met de 𝛼keten totdat een 𝛽-keten is gevormd
26
9. Basisconcepten van metabolisme (H15)
Inleiding
-
-
2 essentiële vragen die aan bod zullen komen:
o Hoe extraheert een cel energie en reducerende kracht uit zijn omgeving?
® Oxidatiereacties voor afbraak, reductiereacties voor opbouw
o Hoe synthetiseert een cel de bouwblokken voor zijn macromoleculen en
dan de macromoleculen?
4,5 miljard jaar geleden: vorming aarde; 3,5 miljard jaar geleden: ontstaan microorganismen
2 miljard jaar geleden: vorming van zuurstof (zeer goede elektronenacceptor) à
aerobe ademhaling werd mogelijk
Het metabolisme (of “intermediair metabolisme”) is een geïntegreerd en
gecoördineerd netwerk van chemische reacties; er zijn veel gemeenschappelijke
motieven
tussen
de
metabolismes
van
verschillende
organismen
(gemeenschappelijke voorouder):
o Gebruik van een gemeenschappelijke munteenheid voor energie (ATP)
o Herhaaldelijk voorkomen van een beperkt aantal geactiveerde
intermediairen
o Een 100-tal centraal staande moleculen in alle levensvormen
o Een beperkt aantal types reacties (bv. redoxreacties)
o Gemeenschappelijke manieren om metabole reactiewegen te reguleren
9.1.
-
-
-
Metabolisme is samengesteld uit vele gekoppelde reacties
Energie is noodzakelijk voor:
o Mechanisch werk (beweging), ook binnen cellen
o Actief transport van moleculen en ionen (moeten opgenomen/afgegeven
worden door onze cellen)
o Synthese van biomoleculen uit precursoren
Energie wordt gehaald uit de omgeving
® Fototrofen (fotosynthetische organismen) gebruiken zonlicht om
eenvoudige moleculen om te zetten tot meer complexe, energierijke
brandstof
® Chemotrofen (bv. dieren) bekomen chemische energie door oxidatie van
voedsel dat geproduceerd wordt door fototrofen
Alle metabole reactiewegen (bv. lipidenmetabolisme, nucleotidenmetabolisme,
suikermetabolisme…) zijn onderling afhankelijk: de activiteit is gecoördineerd en
wordt gereguleerd door gevoelige communicatiesystemen (o.a. allosterische
enzymen)
27
-
-
-
Metabolieten zijn kleine moleculen die voorkomen als intermediairen/eindpunten
in de afbraak en synthese van polymeren
Metabolisme bestaat uit energieleverende en energievereisende reacties:
o Katabole reacties breken moleculen af met vorming van kleinere moleculen
(“katabolisme”)
® Hierbij wordt energie vrijgezet
® Suikers, vetten à 𝐶𝑂# + 𝐻# 𝑂 + bruikbare energie
o Anabole reacties synthetiseren moleculen voor het behoud van cellen, hun
groei en reproductie (“anabolisme”)
® Hierbij wordt energie verbruikt
® Bruikbare energie + eenvoudige precursoren à complexe moleculen
Algemeen principe van metabolisme: biosynthetische pathways (anabolisme?) en
degradatieve pathways (katabolisme?) zijn bijna altijd gescheiden
® Energetische redenen
® Hierdoor is de controle van metabolisme eenvoudiger
Specifieke pathways kunnen opgebouwd worden uit individuele reacties à 2
voorwaarden:
o De individuele reacties moeten specifiek zijn: er wordt 1 specifiek product
of set van producten gevormd uit de reagentia (rol van enzymen: maken
zeer specifieke reacties mogelijk)
o Het globaal pakket van reacties moet thermodynamisch gunstig zijn: de
verandering in vrije energie Δ𝐺 moet negatief zijn
® Δ𝐺 bepaalt de spontaniteit van de reactie (als Δ𝐺 < 0 gaat de reactie
spontaan op), niet de snelheid
[u][w]
® Stel de reactie 𝐴 + 𝐵 ⇌ 𝐶 + 𝐷, dan is Δ𝐺 = Δ𝐺 °o + 𝑅𝑇 ln [\][[] met Δ𝐺 °o
de standaard vrije energie (reagentia en producten bij 1 M, pH = 7, T =
298 K), een constante die wordt bepaald door de aard van de reagentia
en terug te vinden is in tabellen
o
® Als de reactie in evenwicht is, is Δ𝐺 = 0, zodat Δ𝐺 °o = −𝑅𝑇 ln 𝐾=V
met
o
𝐾=V
=
-
-
[u][w]
=𝑒
[\][[]
yz{°|
}~
De vrije energieverandering voor een reeks van chemisch gekoppelde reacties is
gelijk aan de som van de vrije energieveranderingen van de individuele reacties
à als een reactie thermodynamisch ongunstig is (Δ𝐺 > 0) kan deze gedreven
worden door een thermodynamisch gunstige reactie (Δ𝐺 < 0) waaraan deze
gekoppeld
® Bv. 𝐴 ⇌ 𝐵 + 𝐶 met Δ𝐺 °o = +21 𝑘𝐽/𝑚𝑜𝑙 en 𝐵 ⇌ 𝐷 met
Δ𝐺 °o = −34 𝑘𝐽/𝑚𝑜𝑙, zodat de globale reactie 𝐴 ⇌ 𝐶 + 𝐷
met Δ𝐺 °o = −13 𝑘𝐽/𝑚𝑜𝑙 toch opgaat
Enzymen versnellen reacties door de vorming van de
transitietoestand te faciliteren: ze verminderen de activatieenergie
28
9.2.
ATP is de universele munt van vrije energie in biologische
systemen
9.2.1. ATP-hydrolyse is exergonisch
-
-
-
Structuur van ATP kunnen herkennen (niet tekenen)
ATP koppelt energieleverende reactiewegen (katabolisme)
met energievereisende reactiewegen (anabolisme)
Vrije energie afkomstig van de oxidatie van metabole
brandstoffen en de transformatie van lichtenergie wordt opgeslagen onder de
vorm van ATP (adenosine trifosfaat); ATP functioneert als donor van vrije energie
in energievereisende processen zoals beweging, actief transport of biosynthese
® De ATP-ADP cyclus is de fundamentele wijze van energie-uitwisseling in
biologische systemen
De actieve vorm van ATP is vaak een complex van ATP met 𝑀𝑔#1 of 𝑀𝑛#1
ATP is een energierijk molecule omwille van zijn trifosfaateenheid, die 2
fosfoanhydridebindingen bevat
ATP-hydrolyse
(𝐴𝑇𝑃 + 𝐻# 𝑂 ⇌ 𝐴𝐷𝑃 + 𝑃E
of
𝐴𝑇𝑃 + 𝐻# 𝑂 ⇌ 𝐴𝑀𝑃 + 𝑃𝑃E )
is
exergonisch: er wordt een grote hoeveelheid energie vrijgezet in de hydrolyse van
de fosfoanhydridebindingen van ATP
® Een thermodynamisch ongunstige reactie kan omgezet worden in een
thermodynamisch gunstige reactie door ze te koppelen aan de hydrolyse
van een voldoende aantal ATP-moleculen in een nieuwe reactie
Sommige biosynthesereacties worden gedreven door hydrolyse van andere
nucleoside trifosfaten (guanosine trifosfaat (GTP), uridine trifosfaat (UTP) of
cytidine trifosfaat (CTP) die worden omgezet in respectievelijk GDP, UDP en CDP
of GMP, UMP en CMP); deze nucleoside trifosfaten worden gevormd uit
nuceloside monofosfaten mbv. ATP:
o 1. 𝑁𝑀𝑃 + 𝐴𝑇𝑃 ⇌ 𝑁𝐷𝑃 + 𝐴𝐷𝑃 (enzym nucleoside monofosfaat kinase nodig)
o 2. 𝑁𝐷𝑃 + 𝐴𝑇𝑃 ⇌ 𝑁𝑇𝑃 + 𝐴𝐷𝑃 (enzym nucleoside difosfaat kinase nodig)
® ATP is dus de primaire energiedrager; ook 𝑁𝐴𝐷1 , 𝐹𝐴𝐷 en co-enzym A zijn
afgeleid van ATP
9.2.2. ATP-hydrolyse
drijft
chemische
reacties
door
verschuiving van het evenwicht van gekoppelde reacties
-
-
°o
Stel de reactie 𝐴 ⇌ 𝐵 met Δ𝐺 = +16,7 𝑘𝐽/𝑚𝑜𝑙 à
o
𝐾=V
=𝑒
yz{°|
}~
[[]
= 1,15 ∗ 10g` = [\]
à er wordt maar 1,15 molecule B geproduceerd voor 1000 moleculen A: erg
weinig à reactie koppelen aan ATP-hydrolyse
Voor de hydrolyse van ATP is Δ𝐺 °o = −30,5 𝑘𝐽/𝑚𝑜𝑙 à als we de reacties koppelen
krijgen we 𝐴 + 𝐴𝑇𝑃 + 𝐻# 𝑂 ⇌ 𝐵 + 𝐴𝐷𝑃 + 𝑃E met Δ𝐺 °o = −13,8 𝑘𝐽/𝑚𝑜𝑙
29
-
[[]
o
Voor de gekoppelde reactie is 𝐾=V
= 2,67 ∗ 10# = [\] ∗
dat
-
-
[\w•][•• ]
[\‘•]
= 1 hebben we dat
[[]
[\]
[\w•][•• ]
[\‘•]
à als we aannemen
= 2,67 ∗ 10# , zodat de reactie nu wel kan
opgaan
Onder cellulaire condities is voor ATP-hydrolyse Δ𝐺 = −50,2 𝑘𝐽/𝑚𝑜𝑙 à in dit geval
o
zal 𝐾=V
niet stijgen met factor 10b maar 10’
o
® Als er dan n moleculen ATP zijn, zal 𝐾=V
zelfs stijgen met een factor van 10>’
Door de kracht van ATP zijn zelfs de meest ongunstige reacties mogelijk in een cel
A en B kunnen moleculen zijn maar ook eiwitten (die bv. van conformatie moeten
veranderen om actief te worden) of ionen
9.2.3. De fosforyltransferpotentiaal is een belangrijke vorm van
cellulaire energietransformatie
-
-
De transfer van de fosforylgroep van ATP is een algemene manier van
energiekoppeling à vraag: waarom is ATP een efficiënte fosforyldonor?
® Antwoord:
o De resonantiestabilisatie van 𝛾-P is lager dan van 𝑃E (𝑃E is stabieler
wegens meer resonantievormen)
o De elektrostatische repulsie van ATP is hoger (4 negatieve ladingen die
elkaar afstoten)
o Bij hydrolyse wordt de entropie verhoogd (2 moleculen in plaats van 1)
o ADP en 𝑃E worden gestabiliseerd door hydratatie (worden omgeven
door een watermantel)
ATP is een intermediaire energierijke verbinding (de fosforyltransferpotentiaal
neemt een intermediaire plaats in; zie tabel) à kan zowel fosfaten afstaan (aan
minder energierijke moleculen) als opnemen (van meer energierijke moleculen) à
efficiënte drager van fosforylgroepen
® ATP kan dus worden aangemaakt door een fosfaatgroep te ontvangen van
een energierijkere verbinding; deze vorm van fosforylatie noemen we
substraatfosforylatie
30
9.2.4. Voorbeeld: ATP-bron bij inspanning
-
-
-
We hebben in ons lichaam maar een beperkte hoeveelheid ATP; bv. bij een sprint
is alle ATP binnen de seconde opgebruikt
® We moeten dus nieuwe ATP kunnen aanmaken
Eerst wordt er ATP aangemaakt mbv. creatine fosfaat, dat zijn fosfaat overdraagt
aan ADP ter vorming van ATP (𝑐𝑟𝑒𝑎𝑡𝑖𝑛𝑒 𝑓𝑜𝑠𝑓𝑎𝑎𝑡 + 𝐴𝐷𝑃 ⇌ 𝐴𝑇𝑃 + 𝑐𝑟𝑒𝑎𝑡𝑖𝑛𝑒)
® Deze ATP zal ook vlug opgebruikt zijn
Dan wordt er overgeschakeld op anaeroob metabolisme, dat gedurende een
aantal minuten dominant aanwezig zal zijn
Na een tijdje wordt anaeroob metabolisme minder belangrijk: aeroob
metabolisme wordt dominant
® Vaak is er ook een combinatie van aeroob en anaeroob metabolisme
Intermezzo I: een zeer korte samenvatting
-
Biochemische reacties worden mogelijk gemaakt:
o Thermodynamisch door koppeling met ATP-hydrolyse
o Kinetisch door enzymen die de activatie-energie verlagen
Intermezzo II: andere rollen van ATP
-
-
De ATP-concentratie is in veel cellen veel hoger dan de 𝐾“ van ATP-bindende
enzymen à ATP zou nog andere rollen vervullen in de cel
ATP is een hydrotroop (stof die de oplosbaarheid van andere organische stoffen
verhoogt)
® ATP is een amfifatisch molecule (heeft zowel een hydrofoob als polair deel),
maar de hydrofobe component (adenine) is te klein voor zelf-aggregatie (à
ATP is perfect oplosbaar)
Experimenten tonen aan dat ATP helpt om cellulaire eiwitten die in hoge
concentraties aanwezig zijn in oplossing te houden en zo te voorkomen dat er
proteïne-aggregaten gevormd worden
31
9.3.
-
-
De oxidatie van koolstofbrandstoffen is een belangrijke bron
van cellulaire energie
ATP is de belangrijkste directe donor van vrije energie, maar kan het niet stockeren
voor lange termijn; koolstofbrandstoffen kunnen dit wel
Enkele cijfers:
o 1 molecule ATP wordt binnen de minuut geconsumeerd
o De totale hoeveelheid ATP in het lichaam is ongeveer 100 g
o Een mens in rust verbruikt 40 kg ATP in 24 uur
o Een lopende mens verbruikt 60 kg ATP in 2 uur (0,5 kg/min)
® Deze verbruikte ATP moet geregenereerd worden à ATPADP cyclus waarbij ADP weer tot ATP wordt omgezet door
oxidatie van brandstofmoleculen
We halen de meeste energie uit vetten
ATP is een bouwsteen van RNA, maar niet van DNA
9.3.1. Vrije energie uit de oxidatie van 1-C stoffen
-
1-C stoffen zijn bv. methaan, methanol, formaldehyde, mierenzuur, 𝐶𝑂# …
In aerobe organismen is de uiteindelijke elektronacceptor bij de oxidatie van
koolstof 𝑂# en het oxidatieproduct is 𝐶𝑂# (meest geoxideerde vorm van C)
Hoe meer gereduceerd koolstof is, hoe meer vrije energie er kan worden vrijgezet
9.3.2. Oxidatie van de meer complexe brandstofmoleculen
-
-
Oxidatie gebeurt koolstof per koolstof
® Vetten zijn meer efficiënt dan glucose (en aminozuren)
De energie die gehaald wordt uit koolstofoxidatie wordt gebruikt voor:
o De vorming van componenten met een hoge fosforyltransferpotentiaal
o De vorming van een ionengradiënt
® Beide leiden uiteindelijk tot de vormingen van ATP
Er zijn dus 2 manieren om de energie die vrijgesteld wordt uit de oxidatie van
koolstof om te vormen tot ATP
Manier 1: koppeling van koolstofoxidatie aan ATP-synthese via verbindingen met
hoge fosforyltransferpotentiaal:
o GAP wordt geoxideerd tot 3-fosfoglyceraat à er komt veel energie vrij
(Δ𝐺 ≪ 0), die moet worden gekoppeld aan ATP à methode: werken met
een intermediair (dus niet rechtstreeks GAP oxideren tot 3PG)
o GAP reageert met 𝑁𝐴𝐷1 en 𝐻𝑃𝑂•#g en wordt geoxideerd tot 1,3bisfosfoglyceraat; hierbij worden er 2 elektronen afgegeven aan 𝑁𝐴𝐷1 , dat
reduceert tot NADH
o De fosfaat van 1,3-BPG wordt overgedragen op ADP ter vorming van ATP
32
-
Manier 2: ATP-synthese drijven met ionengradiënten:
o Bij de oxidatie van een koolstofbron tot 𝐶𝑂# ontstaat een ionengradiënt
over de membraan
o Protonen gaan doorheen de membraan naar buiten en worden hier
gestockeerd
o Mbv. een enzym worden de protonen weer naar binnen gebracht en
gebruikt om ATP aan te maken
9.3.3. Fosfaten hebben een prominente rol in biochemische
processen
-
-
-
Fosfaatesters zijn thermodynamisch onstabiel maar kinetisch stabiel (à ideaal?)
® Negatieve lading verhindert hydrolyse in afwezigheid van enzymen à
enzymen (kinases, fosfatases) zijn noodzakelijk voor de hydrolyse
® DNA is zeer stabiel dankzij de fosfaatruggengaat
Fosfaten worden ook toegevoegd aan metabolieten die anders doorheen het
membraan zouden diffunderen
® Bv. glucose wordt actief opgenomen in de cel en hier omgezet tot
glucosefosfaat; als dit niet zou gebeuren, zou het weer uit de cel migreren
Er is geen goed alternatief voor fosfaten: geen andere ionen hebben de
chemische eigenschappen van fosfaat
® Citraat is ook negatief geladen, maar onvoldoende à hydrolyse treedt wel
spontaan op
® Arsenaat lijkt op fosfaat, maar er treedt wel spontane hydrolyse op (als
fosfaat zou vervangen worden door arsenaat zou dit toxisch zijn)
® Silicaat maakt onoplosbare producten
33
9.3.4. Overzicht van processen van energieomzetting
-
3 stappen:
o 1. We nemen macromoleculen (voedsel) op en breken dit af tot hun
bouwstenen; de bouwstenen worden opgenomen door de darmcellen
(vertering)
® Er is geen recuperatie van bruikbare energie
o 2. In de cellen worden de bouwstenen verder afgebroken tot enkele
eenvoudige moleculen die een sleutelrol spelen in metabolisme
® Er wordt een kleine hoeveelheid ATP gegenereerd
o 3. ATP wordt geproduceerd na de volledige oxidatie van de acetyleenheid
van acetylco-enzym A tot 𝐶𝑂# (citroenzuurcyclus en oxidatieve fosforylatie)
9.4.
Metabole reactiewegen bevatten veel weerkerende motieven
9.4.1. Geactiveerde dragermoleculen (“carriers”)
-
-
ATP is een geactiveerde drager van fosforylgroepen: als fosforyldonor kan het
endergonische reacties drijven, de conformatie van eiwitten veranderen, als
signaal voor eiwitactiviteit dienen…
Het gebruik van geactiveerde dragers is een weerkerend motief in biochemie; veel
van deze carriers werken als co-enzym
® Veel van de carriers zijn afgeleid van vitaminen
9.4.1.1. Geactiveerde elektronendragers voor oxidatie van
brandstoffen (katabolisme)
-
-
-
Bij de oxidatie van brandstoffen komen elektronen vrij; deze worden tijdelijk
gestockeerd in elektronendragers (treden op als elektronenacceptors) en daarna
afgegeven aan 𝑂#
2 soorten moleculen die kunnen optreden als geactiveerde elektronendragers
voor oxidatie van brandstoffen:
o Pyridine nucleotiden (nicotinamide adenine dinucleotide: NADH in
gereduceerde vorm, 𝑁𝐴𝐷1 in geoxideerde vorm)
o Flavines (flavine adenine dinucleotide: 𝐹𝐴𝐷𝐻# in gereduceerde vorm, FAD
in geoxideerde vorm) (later ook FMN)
® Beide kunnen herkennen
𝑁𝐴𝐷1 accepteert 2 elektronen en 1 𝐻1 à wordt NADH
® Dit is equivalent met een hydride-ion
FAD accepteert 2 elektronen en 2 𝐻1 à wordt 𝐹𝐴𝐷𝐻#
34
9.4.1.2. Geactiveerde elektronendragers
biosynthesereacties (anabolisme)
-
-
voor
reductieve
In biosynthese: precursoren meer geoxideerd dan producten à nood aan een
reducerende kracht (naast ATP)
De moleculen die kunnen optreden als geactiveerde elektronendragers voor
reductieve biosynthesereacties zijn ook pyridine nucleotiden, maar dan
nicotinamide adenine dinucleotide fosfaat: NADPH in gereduceerde vorm,
𝑁𝐴𝐷𝑃1 in geoxideerde vorm
® 𝑁𝐴𝐷𝑃1 ziet er precies hetzelfde uit als 𝑁𝐴𝐷1 maar dan met een
fosforylgroep op de plaats van de R-groep; deze fosforylgroep is een
merker die enzymen toelaat een onderscheid te maken tussen hoge
potentiaal elektronen voor anabolisme en katabolisme
Bv. bij de vetzuursynthese treedt NADPH op als elektronendonor
9.4.1.3. Geactiveerde carrier van 2-C fragmenten
-
-
Geactiveerde dragers van 2-C fragmenten zijn belangrijk zowel in anabolisme als
katabolisme (bv. vetzuuroxidatie en synthese van membraanlipiden)
Het molecule dat optreedt als geactiveerde drager van 2-C fragmenten is coenzym A, een drager van acylgroepen in een thioesterbinding; deze acylgroep kan
makkelijk overgedragen worden
® Structuur kunnen herkennen
® Bv. 𝑎𝑐𝑒𝑡𝑦𝑙 𝐶𝑜𝐴 + 𝐻# 𝑂 ⇌ 𝑎𝑐𝑒𝑡𝑎𝑎𝑡 + 𝐶𝑜𝐴 + 𝐻1
De reden dat het een thioesterbinding is en niet een zuurstofesterbinding is dat
thioesters thermodynamisch onstabieler zijn dan zuurstofesters (minder
resonantievormen) à er kan meer energie worden vrijgezet
® Acetyl CoA heeft een hoge acteylgroeptransferpotentiaal
® De geactiveerde acetylgroep is te vergelijken met de geactiveerde
fosforylgroep in ATP
35
9.4.1.4. Besluit
-
Het gebruik van geactiveerde carriers illustreert 2 belangrijke aspecten van
metabolisme:
o Geactiveerde carriers zijn kinetisch stabiel: ze reageren slechts zeer traag in
afwezigheid van specifieke katalysatoren, ondanks de grote
thermodynamische drijfkracht
® NADH, NADPH en 𝐹𝐴𝐷𝐻# reageren traag met 𝑂#
® ATP en acetyl CoA reageren traag met 𝐻# 𝑂 (hydrolysatie)
® Dit is noodzakelijk om enzymen toe te laten de flow van energie en
reducerend vermogen te controleren
o De uitwisseling van geactiveerde groepen in metabolisme is terug te
voeren tot een beperkt aantal verschillende carriers
9.4.2. Beperkt aantal types van reacties
-
Er zijn 6 verschillende reactiemechanismen:
o Oxidatie-reductie reacties: uitwisseling van elektronen
o Ligatie reacties met ATP-splitsing: vorming van covalente bindingen
gekoppeld aan ATP-splitsing
o Isomerisatie reacties: herschikking van atomen ter vorming van isomeren
o Groep-transfer reacties: transfer van functionele groepen van 1 molecule
naar een ander
o Hydrolytische reacties: splitsing van een binding door additie van water,
vaak afbraak van grote moleculen tot kleinere (bv. hydrolyse van eiwitten)
o C-C-splitsing verschillend van hydrolyse of oxidatie: additie of verwijdering
van groepen om enkele/dubbele bindingen te vormen; wanneer 𝐻# 𝑂 of 𝐶𝑂#
geproduceerd worden, wordt een dubbele binding gevormd
9.4.3. Weerkerende regulatiemechanismen
-
-
Metabole reactiewegen zijn gereguleerd op 3 manieren:
o Hoeveelheid enzym
o Activiteit enzym
o Substraten
Hoeveelheid enzym:
o De aanmaak en afbraak van enzym worden gereguleerd
o Transcriptie is de belangrijkste manier om de hoeveelheid enzym te
controleren
o Kan zeer snel gaan (bv. in E. coli: lactose induceert binnen
seconden/minuten de transcriptie van het lac operon)
36
-
Katalytische activiteit:
o De katalytische activiteit van enzymen moet gereguleerd kunnen worden
zodat bv. als er iets mis is, het enzym inactief kan worden gemaakt
o 2 manieren van regulatie: allosterische inhibitie en covalente modificatie
o Reversibele allosterische inhibitie: vaak zal het eindproduct van de
biosynthese reactieweg de eerste stap inhiberen (“feedback inhibitie”); dit
gebeurt onmiddellijk
o Reversibele covalente modificatie: vaak fosforylatie van enzymen waardoor
deze geactiveerd/gedeactiveerd worden
o Daarnaast worden ook veel enzymen gecontroleerd door de energiestatus
van de cel
® De index van energiestatus van een cel is de energielading;
—
˜
[\‘•]1 [\w•]
energielading = [\‘•]1[\w•]1[\“•]
® Als energielading = 0 is er enkel AMP aanwezig (geen energie); als
energielading = 1 is er enkel ATP aanwezig (veel energie)
® Meestal heeft een cel een energielading tussen de 0,9 en 0,95; in
actieve spieren is de energielading kleiner dan 0,7
® Er zijn 2 pathways, nl. een ATP-verbruikende en
een ATP-genererende pathway; als we in het
evenwichtspunt zitten (waar de 2 curves snijden)
en er dan een reactie uitgevoerd wordt die ATP
verbruikt, zal de energielading dalen doordat we
naar links verschuiven op de ATP-verbruikende
pathway, maar ook snel weer stijgen doordat we op de ATPgenererende pathway naar rechts verschuiven à de energielading is
gebufferd
® Een alternatieve index van energiestatus van een cel is de
[\‘•]
fosforylatiepotentiaal; fosforylatiepotentiaal = [\w•]1[• ]
-
•
Controle van de toegang tot substraten:
o Compartimentalisatie (bv. vetzuur oxidatie gebeurt in de mitochondriën,
vetzuur synthese gebeurt in het cytoplasma): verhoogt de regulatie en
flexibiliteit
® Enkel bij eukaryoten is er compartimentalisatie
o Controle van flux van substraten (bv. als glucose heel traag de cel
binnenkomt, zal er een lage flux zijn in de afbraak van glucose; als glucose
massaal wordt opgenomen, zal er een hoge flux zijn)
37
9.5.
-
-
Hoe zijn de complexe metabole reactiewegen geëvolueerd?
ATP, NADH, 𝐹𝐴𝐷𝐻# , CoA… hebben allemaal een ADP-eenheid à verklaring:
initieel was er op aarde een RNA-wereld, waarbij RNA zowel katalysator als
informatiedrager was; ATP, NADH, 𝐹𝐴𝐷𝐻# , CoA… zijn geëvolueerd uit deze
vroege RNA katalysatoren
Nu hebben eiwitten de rol van RNA als katalysator overgenomen
Zie laatste slide voor eventuele examenvragen!
10.
Biokatalysatoren – enzymkinetiek (H8)
10.1. Enzymen zijn sterke en specifieke katalysatoren
-
-
-
Bijna alle enzymen zijn proteïnen, maar bv. de ribozymen zijn RNA
De moleculen waarop enzymen inwerken zijn substraten; de moleculen die
gevormd worden zijn producten
Enzymen zijn biokatalysatoren die het bereiken van het reactie-evenwicht (dus de
reactiesnelheid) versnellen
® Dit doen ze door substraten in optimale positie voor reactie te brengen of
door stabilisatie van de transitietoestand
Enzymatische reacties verlopen 10` tot 10]™ keer sneller dan dezelfde nietgekatalyseerde reacties
Enzymen vertonen hoge specificiteit ten opzichte van hun substraten: ze kunnen
enkel specifieke substraten omzetten en andere (soms gelijkaardige) niet of veel
minder à afhankelijk van het substraat zal er een ander enzym met een andere
specificiteit nodig zijn
® Sommige enzymen vertonen stereospecificiteit: ze kunnen slechts 1 stereoisomeer van het substraat omzetten
® Door deze reactiespecificiteit kunnen enzymen productopbrengsten
bekomen van 100% en worden er nauwelijks nutteloze bijprodcuten
gevormd
® Sommige enzymen (bv. papaïne, dat gebruikt wordt als veelsvermalser) zijn
niet substraatspecifiek
De plaats waar de enzymreactie plaatsgrijpt wordt de actieve plaats genoemd
Enzymen worden meestal genoemd naar het substraat en eindigen op -ase
10.1.1. Cofactoren
-
Sommige enzymen hebben cofactoren nodig om actief te zijn à dit kunnen zijn:
o Essentiële ionen (meestal metaalionen) die zwak gebonden zijn:
“activatorionen”
38
-
o Essentiële ionen (meestal metaalionen) die sterk gebonden zijn: “metalloenzymen”
o Co-enzymen (organische moleculen) die zwak gebonden zijn:
“cosubstraten”
o Co-enzymen (organische moleculen) die sterk gebonden zijn: “prostetische
groep”
Co-enzymen zijn vaak afgeleid van vitaminen
10.1.2. Enzymclassificatie: EC-classificatie
-
-
Er zijn 6 enzymklassen:
o 1.
Oxidoreductasen
(dehydrogenasen):
katalyseren
oxidatiereductiereacties
® 1 substraat treedt op als oxidator, het andere als reductor
® Bv. lactaat dehydrogenase, dat de redoxreactie tussen L-lactaat
(reductor) en 𝑁𝐴𝐷1 (oxidator) katalyseert
o 2. Transferasen: katalyseren groeptransferreacties
® Bv. alanine transaminase, dat de transfer van de aminegroep van Lalanine naar 𝛼-ketoglutaraat katalyseert; hierbij wordt L-alanine
omgezet in pyruvaat en 𝛼-ketoglutaraat in L-glutamaat
o 3. Hydrolasen: katalyseren hydrolysereacties met water als acceptor van de
getransfereerde groep
® Bv. pyrofosfatase, dat de hydrolyse van pyrofosfaat katalyseert en zo
ketenverlenging mogelijk maakt
o 4. Lyasen: katalyseren substraatlysis, waarbij een dubbele binding wordt
gevormd in een niet-hydrolytische eliminatie
® Niet-hydrolytisch wil zeggen dat er geen water nodig is
® Synthasen katalyseren de additie van een dubbele binding:
omgekeerde reactie van een lyase
® Bv. pyruvaat decarboxylase
o 5. Isomerasen: katalyseren isomerisatiereacties
® Bv. alanine racemase, dat de omzetting van L-alanine naar D-alanine
katalyseert
o 6. Ligasen (synthetasen): katalyseren ligatie of verbinding van 2 substraten
® Ligasen vereisen chemische energie (ATP)
® Bv. glutamine synthetase, dat L-glutamaat en ammonium verbindt tot
L-glutamine, met verbruik van ATP
Elk enzym kan eenduidig aangeduid worden met een EC-nummer (EC = enzym
commission); dit nummer bestaat uit 4 cijfers en is gebaseerd op de chemische
reacties die door het enzym gekatalyseerd worden
® Het eerste cijfer geeft de enzymklasse weer (à kan variëren van 1 tot 6)
39
-
® Het tweede cijfer geeft weer waarop het enzym inwerkt (bv. de
elektronendonor bij een klasse 1-enzym, of de groep die getransfereerd
wordt bij een klasse 2-enzym)
® Het derde cijfer geeft verdere toelichting (bv. de elektronenacceptor bij een
klasse 1-enzym)
® Het vierde cijfer is een volgnummer
Voorbeeld: EC 1.1.1.1
® EC 1: het behoort tot de oxidoreductasen
® EC 1.1: de elektronendonor is CH-OH (een alcoholgroep)
® EC 1.1.1: de elektronenacceptor is 𝑁𝐴𝐷1 of 𝑁𝐴𝐷𝑃1
® EC 1.1.1.1: het gaat om een alcohol dehydrogenase
10.2. Thermodynamische eigenschappen van enzymatische reacties:
de Gibbs vrije energie
-
Enzymatische reacties voldoen aan de wetten van de thermodynamica; de
verandering in Gibbs vrije energie (Δ𝐺) bepaalt of de reactie spontaan zal verlopen
® Dit zegt niets over de snelheid van de reactie: thermodynamisch spontane
reacties gaan soms zo traag op dat er in feite geen omzetting is
-
In
-
productconcentratie) zal de reactie niet spontaan opgaan, als [𝐶 ][𝐷 ] > [𝐴][𝐵]
(hoge productconcentratie) zal de reactie wel spontaan opgaan
® Reacties die normaal niet spontaan opgaan kunnen dus spontaan gemaakt
worden door de concentraties aan te passen à dit kan gebeuren door
reacties te koppelen
Enzymen veranderen niets aan het evenwicht, wel aan de snelheid van de reactie
evenwicht
is
[u][w]
Δ𝐺 °o = −𝑅𝑇 ln [\][[]
à
als
[𝐶 ][𝐷 ] < [𝐴][𝐵]
(lage
10.3. Enzymen vergemakkelijken reacties door vorming van de
transitietoestand
-
-
De activatie-energie Δ𝐺 ‡ bepaalt de reactiesnelheid:
deze activatie-energie moet overwonnen worden
voordat de reactie kan opgaan
Enzymen kunnen de activatie-energie verlagen door
substraten te positioneren voor reactie
In de transitietoestand is het substraat geen substraat
meer, maar ook nog geen product
Bij sequentiële reacties zijn er meerdere
transitietoestanden à er worden intermediairen
gevormd
40
10.3.1. Enzym-substraatcomplex
-
-
De eerste stap in enzymatische katalyse is de vorming
van een enzym-substraatcomplex (ES)
Bij stijgende substraatconcentraties terwijl de
enzymconcentratie
constant
blijft,
zal
de
reactiesnelheid toenemen totdat er een maximum
𝑣AB› bereikt wordt: op dit moment zijn alle actieve
plaatsen bezet door substraat
Voorbeeld: enzym cytochroom P450
® Dit enzym katalyseert de inbouw van zuurstof
in substraten
® Het substraat (kamfer) is omgeven door aminozuren van de actieve plaats
van het enzym
® De heemgroep is een cofactor (prostetische groep)
10.3.2. Actieve plaats van enzym
-
Het substraat bindt ter hoogte van de katalytische plaats van het enzym: de actieve
plaats
De actieve plaats van een enzym heeft zeer specifieke eigenschappen à
toegepast op het enzym lysozym:
o De actieve plaats is een 3-dimensionale gleuf
® Lysozym is een proteïne bestaande uit 1 polypeptideketen met 129
aminozuren; slechts 6 aminozuren spelen een belangrijke rol in de
substraatbinding en deze liggen verspreid over de keten à er is een
3D gleuf die de 6 aminozuren in de buurt van het substraat brengt
o De actieve plaats neemt een klein deel in van het enzymvolume
® De meeste aminozuren van een enzym staan niet in contact met het
substraat à functie van andere aminozuren: regulatorische plaats of
kanalen om het substraat naar de actieve plaats te brengen
o De actieve plaats heeft een unieke micro-omgeving
® Water wordt meestal uitgesloten uit de actieve plaats omdat een nietpolaire omgeving gewenst is
® Bepaalde polaire aminozuren in de niet-polaire omgeving hebben
speciale eigenschappen voor substraatbinding of katalyse
o Er is een zwakke binding met het substraat
® Na reactie moet het omgezette substraat makkelijk weer kunnen
vrijkomen à de binding mag niet te sterk zijn
o De specificiteit is afhankelijk van de specifieke schikking van atomen in de
actieve plaats
41
® Sleutel-slot model: de actieve plaats van het enzym is complementair
met het substraat; er zijn veel bindingen op korte afstand (doorgaans
Van der Waals-interacties)
® Induced fit model: de actieve plaats van het enzym wordt
complementair met het substraat na binding met het substraat
10.4. Michaelis-Menten enzymkinetiek
-
-
-
-
Wanneer een enzym met een substraat reageert, wordt er een enzymsusbtraatcomplex gevormd; dit ES-complex kan ofwel terugreageren tot enzym
en substraat, ofwel verderreageren tot product, waarbij het enzym opnieuw
vrijkomt
® 𝐸 + 𝑆 ⇌ 𝐸𝑆 → 𝐸 + 𝑃
® De reactie 𝐸 + 𝑆 → 𝐸𝑆 gebeurt met snelheidsconstante 𝑘] , de reactie 𝐸𝑆 →
𝐸 + 𝑆 met snelheidsconstante 𝑘g] en de reactie 𝐸𝑆 → 𝐸 + 𝑃 met
snelheidsconstante 𝑘# = 𝑘CBD
Zowel de dissociatie van het ES-complex als de vorming van het product hebben
een eerste-orde reactiesnelheid: 𝑣 = 𝑘g] [𝐸𝑆] en 𝑣 = 𝑘# [𝐸𝑆] zodat de eenheid van
𝑘g] en 𝑘# 𝑠 g] is
De vorming van het ES-complex heeft een tweede-orde reactiesnelheid: 𝑣 =
𝑘] [𝐸 ][𝑆] zodat de eenheid van 𝑘] 𝑠 g] is
Na een tijdje zal er een steady state bereikt worden, waarbij de snelheid waarmee
het ES-complex gevormd wordt (met snelheidsconstante 𝑘] ) gelijk is aan de
snelheid waarmee het afgebroken wordt (met snelheidsconstanten 𝑘g] en 𝑘#
® In deze steady state gaat de Michaelis-Mentenvergelijking op
De Michaelis-Mentenvergelijking is 𝑣c =
¥y— 1¥˜
¥—
FŸ ¡ [¢]
,
£¤ 1[¢]
met 𝑣c de reactiesnelheid en 𝐾“ =
M de Michaelisconstante
® 𝐾“ is onafhankelijk van de enzym- en substraatconcentratie
® Grafisch wordt 𝑣c uitgezet in functie van [𝑆]
® Bij lage substraatconcentratie hebben we een lineaire eerste-orde reactie
F
([𝑆] is verwaarloosbaar t.o.v. 𝐾“ zodat 𝑣c ≈ £Ÿ ¡ [𝑆]); bij hoge
substraatconcentratie
hebben
we
verwaarloosbaar t.o.v. [𝑆] zodat 𝑣c ≈
een
FŸ ¡ [¢]
[¢]
¤
nulde-orde
reactie
(𝐾“
is
= 𝑣AB› )
42
-
Alternatieven voor de Michaelis-Mentenvoorstelling
Burkvoorstelling en de Eadie-Hofsteevoorstelling
® De Lineweaver-Burkvergelijking is
]
]
F
£¤
= §F
uitgezet in functie van [¢]
Ÿ ¡
]
zijn
¨ §[¢]¨ + F
]
Ÿ ¡
de
Lineweaver-
; grafisch wordt
]
F
F
® De Eadie-Hofsteevergelijking is 𝑣 = 𝑣AB› − 𝐾“ [¢]; grafisch wordt 𝑣 uitgezet
F
in functie van [¢]
10.4.1. De betekenis van 𝐾“ en 𝑣AB›
-
F
𝐾“ = [𝑆] waarbij 𝑣O = Ÿ# ¡
Wanneer er geen product gevormd wordt (dus 𝑘# verwaarloosbaar is t.o.v. 𝑘g] ) is
𝐾“ ≈
-
-
-
¥y—
¥—
= 𝐾U¢ , de enzym-substraat dissociatieconstante
𝐾“ drukt in feite de affiniteit uit van het enzym voor het substraat; hoe lager 𝐾“ ,
F
hoe minder substraat er nodig is om Ÿ# ¡ te bekomen en dus hoe efficiënter de
katalyse
𝐾“ -waarden voor enzymen liggen vaak net boven [𝑆], zodat de enzymsnelheid
gevoelig is aan kleine veranderingen in [𝑆]
𝑣AB› bepaalt het “turnover” getal 𝑘CBD (= 𝑘# ) van een enzym (het aantal
substraatmoleculen dat per tijdseenheid wordt omgezet in product door 1
FŸ ¡
enzymmolecule, bij volledige substraatverzadiging van het enzym): 𝑘CBD = [U]
~
10.4.2. Kinetische constanten
-
Een eerste kinetische constante is het “turnover” getal of omzettingsgetal 𝑘CBD , de
eerste-orde snelheidsconstante voor de omzetting van ES-complex naar product
(met vrijzetting van enzym); deze 𝑘CBD is het makkelijkst te meten wanneer het
enzym verzadigd is met substraat
43
-
Een andere kinetische constante is de specificiteitsconstante
¥© ª
,
£¤
een maat voor
de enzymspecificiteit voor verschillende substraten; deze verhouding
¥© ª
£¤
is een
tweede-orde snelheidsconstante voor de reactie 𝐸 + 𝑆 → 𝐸 + 𝑃 bij lage [𝑆] (𝑣c =
¥© ª
[𝐸 ][𝑆])
£¤
® Hoe hoger
-
¥© ª
,
£¤
hoe beter de reactie opgaat
Ook de katalytische efficiëntie 𝐾“ is een kinetische constante
In sommige gevallen wordt de reactiesnelheid gelimiteerd door diffusie van
substraat in de actieve plaats; sommige enzymen bezitten een
specificiteitsconstante
¥© ª
£¤
die de diffusielimiet benaderen (10’ tot 10« 𝑀g] 𝑠 g] )
10.4.3. Biochemische reacties met meerdere substraten
-
-
-
-
Bij geordende sequentiële reacties moeten eerst alle substraten binden aan het
enzym voordat een product wordt gevormd; er is wel een volgorde van binden en
loskomen
Bij niet-geordende sequentiële reacties moeten ook eerst alle substraten binden
aan het enzym voordat een product wordt gevormd, maar er is geen volgorde van
binden en loskomen
Bij dubbele verplaatsing of pingpongreacties worden 1 of meer producten al
vrijgegeven voordat alle substraten gebonden zijn aan het enzym; het enzym is
tijdelijk gemodificeerd (gesubstitueerd intermediair)
Zie slides 8.14-8.16 voor voorbeelden
10.4.4. Allosterische enzymen
-
-
Allosterische enzymen volgen de Michaelis-Mentenkinetiek niet: de grafische
voorstelling van 𝑣c VS [𝑆] is sigmoïdaal (S-vormig)
Allosterische enzymen bestaan vaak uit meerdere subeenheden en bezitten
meerdere actieve plaatsen; door substraatbinding aan 1 subeenheid verandert de
conformatie van deze subeenheid en dat kan de eigenschappen van andere
actieve plaatsen beïnvloeden
® Substraatbinding is een coöperatief proces (zoals de ligandbinding bij
hemoglobine)
Voordeel van allosterische enzymen: door het wijzigen van hun katalytische
eigenschappen kunnen ze direct inspelen op de ogenblikkelijke noden van de cel
10.5. Enzyminhibitie
10.5.1. Omkeerbare enzyminhibitie
44
-
Bij omkeerbare enzyminhibitie komt de inhibitor makkelijk vrij van het enzym
De inhibitieconstante (𝐾E ) is de dissociatieconstante van de reactie 𝐸𝐼 ⇌ 𝐸 + 𝐼:
𝐾E =
-
[U][-]
[U-]
Er zijn 3 soorten omkeerbare enzyminhibitie: competitieve, oncompetitieve en
niet-competitieve inhibitie
Competitieve inhibitie:
o De inhibitor bindt alleen aan het vrij enzym (E), niet aan het ES-complex
o De inhibitor bindt op de actieve plaats waar ook het substraat bindt en gaat
zo in competitie met het substraat (als I gebonden is kan S niet meer binden)
o Door toevoeging van substraat wordt de inhibitie opgegeven à 𝑣AB› blijft
hetzelfde met of zonder inhibitor
o De schijnbare 𝐾“ of 𝐾“BPP (= de 𝐾“ bij aanwezigheid van een inhibitor) zal
hoger liggen dan de “gewone” 𝐾“ doordat er meer substraat nodig is om
FŸ ¡
#
[-]
te bekomen: 𝐾“BPP = 𝐾“ §1 + £ ¨
•
o Competitieve inhibitoren vertonen structurele gelijkenissen met het
substraat
-
Niet-competitieve inhibitie:
o De inhibitor bindt aan het vrij enzym (E) en aan het ES-complex
o De inhibitor bindt niet op dezelfde plaats als het substraat en gaat dus niet
in competitie met het substraat (als I gebonden is kan S ook nog steeds
binden), maar er wordt geen product meer gevormd wanneer de inhibitor
gebonden is
o Inhibitie kan niet opgeheven worden door toevoeging van substraat
o 𝑣AB› daalt bij toevoeging van een inhibitor, maar 𝐾“ blijft hetzelfde
-
Men maakt gebruik van omkeerbare enzyminhibitie bij bv. kankerbestrijding
45
10.5.2. Onomkeerbare enzyminhibitie
-
-
-
-
Bij onomkeerbare inhibitie zit de inhibitor stevig gebonden op het enzym
(covalent)
Er bestaan natuurlijke en synthetische onomkeerbare inhibitoren
Onomkeerbare inhibitoren worden gebruikt om de aminozuurresidu’s ter hoogte
van de actieve plaats van een enzym te identificeren
Reactie van een onomkeerbare inhibitor met een enzym resulteert in verlies van
activiteit
Onomkeerbare enzyminhibitie door een groepspecifiek reagens:
o De sleutel tot de activiteit van serineproteasen is een Ser op de 195e plaats
van de aminozuurketen; men heeft dit ontdekt door het onomkeerbaar te
blokkeren met een groepspecifiek reagens en vast te stellen dat het enzym
inactief werd
® In dit geval werd diisopropyl fosfofluoridaat (DIPF), een organisch
fosfaat, als groepspecifiek reagens gebruikt
o Dergelijke organofosfo-inhibitoren zijn toxisch: ze inhiberen een
serineprotease dat de afbraak van een neurotransmitter regelt à overschot
neurotransmitter à overstimulatie van de spieren, verlamming van
ademhalingsspieren
o Dergelijke organofosforinhibitoren worden gebruikt als insecticiden of voor
enzymonderzoek
Onomkeerbare enzyminhibitie door affiniteitsmerkers:
o Affiniteitsmerkers zijn reagentia om actieve plaatsen te bestuderen; het zijn
substraatanalogen (maar bevatten wel reactieve groepen die covalent
interageren met het enzym) waardoor ze specifieker zijn dan
groepspecifieke reagentia
o Voorbeeld: TPCK bindt aan His op de actieve plaats van chymotrypsine
Onomkeerbare enzyminhibitie door overgangstoestandanalogen:
o Overgangstoestandanalogen worden gebruikt om de tijdelijke
overgangstoestand van het ES-complex te bestuderen; het zijn stabiele
moleculen waarvan de structuur lijkt op de onstabiele overgangstoestand
o Stoffen die de overgangstoestand van een gekatalyseerde reactie
nabootsen zijn zeer effectieve enzyminhibitoren
Onomkeerbare enzyminhibitie door mechanismegebaseerde inhibitie:
o Bij zelfmoordinhibitie participeert het enzym zelf in zijn eigen
onomkeerbare inhibitie; men maakt hiervoor gebruik van gemodificeerde
substraten die zeer specifiek zullen binden op de actieve plaats
o Voorbeeld: monoamine oxidase (MAO) deamineert neurotransmitters zoals
dopamine en serotonine; indien MAO te actief is zal er een tekort aan
neurotransmitters ontstaan, wat kan leiden tot bv. Parkinson (weinig
dopamine) of een depressie (weinig serotonine) à inhibitie van MAO zodat
46
de hoeveelheid neurotransmitters op peil blijft gebeurt mbv. een inhibitor
die onomkeerbaar bindt met FAD (de prostetische groep van MAO); deze
reactie wordt gekatalyseerd door MAO zelf
o Voorbeeld: penicilline, het eerst ontdekte antibioticum, dat bestaat uit een
thiazolidinering, een 𝛽-lactamring en een variabele R-groep, zorgt ervoor
dat transpeptidase een zelfmoordinhibitie uitvoert; transpeptidase is
essentieel voor de cross-linking in peptidoglycaan van de bacteriële
celwand
11.
Biokatalysatoren – katalytische strategieën (H9)
Inleiding
-
-
-
4 klassen van enzymen die de belangrijkste principes van katalyse illustreren:
o Serine protease
o Koolzuuranhydrase
o Restrictie-endonuclease
o Myosinen
Deze enzymen faciliteren de transitietoestand door gebruik te maken van
bindingsenergie tussen substraat en enzym en door een induced fit of andere
specifieke katalytische strategieën
De 4 enzymklassen werken volgens 1 of meerdere basismechanismen van
enzymatische katalyse (zie slides voor meer uitleg):
o Covalente katalyse
o Zuur-base katalyse
o Metaalion katalyse
o Katalyse door benadering
11.1. Serine proteasen: chymotripsine, tripsine, elastase, subtilisine
-
-
-
Serineproteasen versnellen een reactie die anders bijna niet opgaat
Chymotripsine, tripsine en elastase zijn verteringsenzymen die als zymogenen of
pro-enzymen worden gesynthetiseerd en opgeslagen in de pancreas
® Zymogenen worden geactiveerd door selectieve proteolyse
Serineproteasen hebben vaak een gelijkaardige primaire, secundaire en tertiaire
structuur; de substraatspecificiteit wordt bepaald door kleine structurele
verschillen in de S1-holte dicht bij de actieve plaats
Proteasen zijn proteolytische enzymen: ze hydrolyseren proteïnen met behulp van
water
® Thermodynamisch gezien zou de peptidebinding spontaan ontbinden,
maar dit gebeurt zeer traag doordat peptidebindingen stabiel zijn (planair,
47
verschillende resonantievormen) à er is een enzym nodig voor de splitsing
van een peptidebinding
11.1.1. Chymotripsine (EC 3.4.21.1)
-
-
-
-
Chymotripsine behoort tot de klasse van de hydrolasen (3), werkt in op een
peptidebinding (4) en is een serine endopeptidase (21)
® Enkel de klassen moeten gekend zijn, de andere nummers niet
Splitst aan de -CO van aromatische of grote hydrofobe aminozuren
Chymotrypsine behandeld met DIPF verliest activiteit à Ser-195 is essentieel voor
de katalytische activiteit
De reactie gebeurt in 2 stappen:
o 1. Acylatie: de roodomkaderde groep wordt aan
het enzym gehecht; de blauwomkaderde groep
komt vrij (snelheidsbepalende stap)
o 2. Deacylatie: de roodomkaderde groep wordt mbv. water weer van het
enzym gehaald
® Eerst is er dus 𝑅 − 𝑁𝐻# vrijzetting, later pas 𝑅 − 𝐶𝑂𝑂𝐻 vrijzetting
® Men noemt dit katalytisch mechanisme covalente katalyse: een deel van het
substraat wordt tijdelijk covalent gebonden ter hoogte van de actieve
plaats van het enzym, ter vorming van een reactief intermediair
Naast Ser-195 spelen ook His-57 en Asp-102 een belangrijke rol:
o Ser-195 is niet nucleofiel genoeg om de peptidebinding aan te vallen à
wordt nucleofieler gemaakt doordat His-57 (een base katalysator) een
proton van de OH-groep van Ser onttrekt
o His-57 wordt positief geladen doordat het een proton van Ser onttrekt à
wordt gestabiliseerd door Asp-102
® Dit mechanisme is zuur-base katalyse
® Men noemt deze 3 aminozuren ook de katalytische drie-eenheid
Mechanisme van peptidehydrolyse (geldt voor alle serineproteasen) (zie slides!):
o Ser-195 wordt nucleofiel gemaakt door His-57, His-57 wordt gestabiliseerd
door Asp-102
o De OH-groep van Ser voert een nucleofiele aanval uit op de -CO van het
substraat
o Er wordt een tetraëdraal intermediair gevormd waarvan de negatieve
lading wordt gestabiliseerd door H-bruggen in de oxyanion holte
o De binding tussen C en N in het substraat splitst en er wordt 𝐻1
overgedragen van His naar de NH, waardoor de 𝑅 − 𝑁𝐻# -groep vrijkomt
o Water voert een nucleofiele aanval uit op de -CO van het overgebleven
deel substraat
48
-
o Er wordt een tetraëdraal intermediair gevormd waarvan de negatieve
lading wordt gestabiliseerd in de oxyanion holte
o Het overgebleven deel substraat komt los van het enzym: de R-COOHgroep komt vrij en ook het enzym is weer vrij om een nieuw substraat te
ontvangen
Chymotrypsine splitst enkel na aromatische of grote hydrofobe aminozuren; dit
komt door de specificiteitspocket S1 van chymotripsine, een diepe hydrofobe
gleuf waar dit deel van het substraat perfect in past
® Andere proteasen hebben andere gleuven (S2, S3, S1’, S2’, S3’…) om
andere aminozuren te herkennen; sommige proteasen splitsen dus bv. net
voor een aminozuur (aan de -NH-kant) in plaats van net na
11.1.2. Analoge katalytische
hydrolytische enzymen
-
-
mechanismen
bij
andere
Andere serineproteasen werken volgens hetzelfde mechanisme, maar de S1pocket is verschillend à splitsen op een andere plaats
® Trypsine heeft in de gleuf een negatief geladen Asp-189 à splitst na
positief geladen aminozuren
® Elastase heeft een minder diepe gleuf door de aanwezigheid van Val-216
en Val-190 à splitst na kortere aminozuren
Subtilisine heeft dezelfde katalytische drie-eenheid, maar op andere plaatsen
11.1.3. Andere proteasen
-
-
Naast serineproteasen zijn er ook cysteïne-, aspartyl- en metalloproteasen
De actieve plaats bevat een residu (His, Asp of een metaal bij respectievelijk
cysteïne-, aspartyl- en metalloproteasen); dit residu:
o Activeert water of een ander nucleofiel (cysteïne)
o Polariseert de peptide-carbonylgroep
o Stabiliseert het tetraëdraal intermediair
Toepassing: het HIV-protease kan geremd worden door een protease-inhibitor
® Het HIV-protease (een dimeer aspartylprotease) zal virale proteïnen die nog
inactief waren splitsen in hun actieve vorm à als HIV-protease geremd
wordt, blijven de proteïnen inactief
® De inhibitor is een substraatanaloog à bindt op HIV-protease en legt dit
stil
11.2. Koolzuuranhydrase (EC 4.2.1.1.)
-
Koolhydrase behoort tot de klasse van de lyasen/synthasen (4), werkt in op een CO-binding (2) en is een hydrolyase (1)
49
-
Maakt een reactie die al tamelijk snel is nog sneller
De snelheid van een reactie kan voorgesteld
specificiteitsconstante
-
-
-
¥© ª
;
£¤
worden
door
de
hoe hoger deze is, hoe beter het enzym de reactie
versnelt
® Koolzuuranhydrase heeft een hoge specificiteitsconstante
Koolzuuranhydrase zal de reactie van 𝐶𝑂# tot carbonzuur en dan tot een
bicarbonaation katalyseren
Koolzuuranhydrase bevat 𝑍𝑛#1 voor de katalytische activiteit
® Dit ion vormt coördinatiebindingen met 4 neutrale liganden (3x His en 1x
𝐻# 𝑂)
De activiteit van koolzuuranhydrase wordt beïnvloed door de pH: hoe hoger de
pH, hoe hoger de 𝑘CBD (tot een pH van ongeveer 8, waarna de curve afvlakt)
Mechanisme:
o 3 His en 1 𝐻# 𝑂 vormen coördinatiebindingen met 𝑍𝑛#1
o 𝐻# 𝑂 wordt gedeprotoneerd (vergemakkelijkt door 𝑍𝑛#1 ) zodat het een
sterker nucleofiel wordt
o Het substraat (𝐶𝑂# ) wordt zo gepositioneerd ten opzichte van het
koolzuuranhydrase dat de OH-groep zich in de buurt van 𝐶𝑂# bevindt
o De OH-groep voert een nucleofiele aanval uit op 𝐶𝑂# ; de negatieve lading
die ontstaat wordt gestabiliseerd door 𝑍𝑛#1
o Met behulp van water komt 𝐻𝐶𝑂`g vrij, zodat ook de actieve plaats van het
enzym weer vrijkomt
De snelheid van de omgekeerde reactie (protoneren van 𝑍𝑛(𝐻𝑖𝑠)` 𝑂𝐻g ) wordt
gelimiteerd door de protondiffusiesnelheid van 10]] 𝑀g] 𝑠 g] à 𝑘g] kan maar
¥
maximaal 10]] 𝑀g] 𝑠 g] zijn en aangezien 𝐾 = ¥ — = 10g™ 𝑀 volgt hieruit dat 𝑘]
y—
-
maximaal 10• 𝑠 g] kan zijn; de maximale waarde voor 𝑘] is echter 10¯ 𝑠 g]
® Deze hoge hydratatiesnelheid van 𝐶𝑂# vereist de aanwezigheid van een
buffer (het buffersysteem bindt/levert protonen); een bufferconcentratie
vanaf 1 mM is voldoende om de reactie bij 10¯ 𝑠 g] te doen opgaan
® De buffer is echter te groot om op de actieve plaats te passen à histidine
“proton shuttle” nodig die een proton onttrekt aan 𝐻# 𝑂 en deze tijdelijk
opslaat om later af te geven aan de buffer (?)
Koolzuuranhydrase werkt volgens 3 basismechanismen van enzymatische katalyse,
nl. metaalionkatalyse (𝑍𝑛#1 ), zuur-base katalyse (buffer/His) en katalyse door
benadering (positionering van 𝐻# 𝑂 nabij 𝐶𝑂# )
50
11.3. Restrictie-enzymen (EC 3.1.21.4.)
-
-
-
-
-
Restrictie-enzymen of restrictie-endonucleasen behoren tot de hydrolasen (3),
werken in op esterbindingen (1) en zijn ribonucleasen (21)
Herkennen specifieke DNA-sequenties en kunnen DNA dubbelstrenging knippen
ter hoogte van de bindingsplaats of restrictieplaats (knippen dus beide DNAstrengen)
® Om te verhinderen dat een restrictie-enzym eigen DNA zal knippen is er
het restrictie-modificatiesysteem, waarbij eigen DNA beschermd (gemerkt)
wordt door covalente modificatie van specifieke basen aan de
restrictieplaats (bv. methylatie)
Er zijn 2 types restrictie-enzymen:
o Type I: katalyseren zowel de methylatie van eigen gastheer-DNA als het
knippen van ongemethyleerd DNA, op een andere plaats dan de
herkenningssequentie
o Type II: knippen alleen dubbelstrengig DNA ter hoogte van de
ongemethyleerde herkenningssequentie
De meeste restrictie-enzymen herkennen “palindromen” (sequenties waarvan de
complementaire sequentie hetzelfde is)
Restrictie-enzymen bevatten 𝑀𝑔#1 voor de katalytische activiteit
® Dit ion vormt coördinatiebindingen met 6 liganden (3x 𝐻# 𝑂, 2x Asp en 1x
fosfaat)
Er zijn 2 mogelijke mechanismen van de hydrolyse van de fosfodiësterbinding:
o Mechanisme 1: covalent intermediair (zoals bij serineproteasen)
o Mechanisme 2: rechtstreekse hydrolyse (zoals bij aspartyl en
metalloproteasen)
Vraag: welk van deze 2 mechanismen is het juiste?
® Wanneer het nucleofiel aanvalt en de leaving groep vrijkomt, verandert de
stereochemische configuratie; bij mechanisme 1 zijn er 2 nucleofiele
aanvallen waardoor de stereochemie 2 keer verandert en uiteindelijk op het
einde hetzelfde is als in het begin, terwijl er bij mechanisme 2 maar 1
nucleofiele aanval is waardoor de stereochemie op het einde anders zal zijn
dan in het begin
® Men heeft bemerkt dat de stereochemie op het einde anders is dan in het
begin à het juiste mechanisme is mechanisme 2 (rechtstreekse hydrolyse)
51
-
-
EcoRV endonuclease is een restrictie-enzym met herkenningssequentie GATATC
® Veroorzaakt een rechte knip (à blunt ends) tussen T en A (derde en vierde
nucleotide)
® Zit als een klem om het substraat zodat dit goed blijft zitten (is een dimeer)
® De eerste twee basen (G en A) maken direct contact met het enzym via Hbruggen (dit geldt ook voor hun complementaire basen C en T)
® EcoRV bindt zowel cognaat als niet-cognaat DNA
® Wanneer het enzym bindt met cognaat DNA, komt er veel
bindingsenergie vrij door complexvorming van P (tussen T en A) met
𝑀𝑔#1
® Wanneer het enzym bindt met niet-cognaat DNA, komt er minder
bindingsenergie vrij
® Deze hoeveelheid energie die bij binding met cognaat DNA vrijkomt is
nodig om distorsie te krijgen van de centrale T- en A-basen waartussen
geknipt zal worden; door deze distorsie komt de fosfaatgroep van het
DNA tussen A en T dicht bij 𝑀𝑔#1 te liggen zodat er een
coördinatiebinding gevormd kan worden (zonder distorsie kan de
coördinatiebinding niet gevormd worden)
® EcoRV kan dus zowel cognaat als niet-cognaat DNA binden, maar knipt
enkel cognaat DNA met de volledige palindroomsequentie
® Wanneer de tweede base (adenine) gemethyleerd is, kan dit geen Hbruggen vormen met het enzym à het substraat past niet perfect op de
actieve plaats van het enzym, waardoor er geen distorsie en dus ook geen
hydrolyse van het substraat is
Restrictie-enzymen werken volgens 2 basismechanismen van enzymatische
katalyse, nl. metaalionkatalyse (𝑀𝑔#1 ) en katalyse door benadering (distorsie
cognaat-DNA)
11.4. Myosinen (EC 3.6.4.1.)
-
Myosinen behoren tot de klasse van de hydrolasen (3), werken in op een
zuuranhydride (6) en zijn betrokken bij cellulaire beweging (4)
Gebruiken een conformatieverandering om de ATP-hydrolyse te koppelen aan
mechanische arbeid (spierwerking)
® Myosine-ATPasen katalyseren de hydrolyse van ATP ter vorming van ADP
en 𝑃E
® Deze reactie is te vergelijken met de splitsing van de fosfodiësterbinding in
DNA door restrictie-enzymen
52
-
-
-
-
Myosinen zijn uitgerekte structuren met globulaire ATP-ase domeinen à structuur
van het globulair gedeelte:
o Bestaat uit 750 aminozuren
o De actieve plaats is een watergevulde gleuf; hier bindt ATP
o Er wordt ook 𝑀𝑔#1 of 𝑀𝑛#1 gebonden; deze ionen maken geen deel uit
van de actieve plaats van het enzym maar zijn gebonden aan het substraat
zelf
o De binding van ATP en 𝑀𝑔#1 veroorzaken geen conformatieverandering,
maar het ATP-complex blijft stabiel à het enzym is niet in de juiste
conformatie om de reactie te katalyseren à er moet nog een
conformatieverandering optreden
Men heeft mbv. een transitietoestandanaloog de tijdelijke transitietoestand
kunnen vastleggen en vastgesteld dat er bij overgang naar de TT een
conformatieverandering is waarbij 60 aminozuren op het CO-uiteinde verplaatsen
(deze verplaatsing wordt geamplificeerd door de geëlongeerde structuur van
myosine)
® In de transitietoestand: 𝐻# 𝑂 voert een nucleofiele aanval uit op de 𝛾-Pgroep; hierbij wordt het gedeprotoneerd door Ser-236 (zodat het
nucleofieler wordt), terwijl Ser-236 zelf gedeprotoneerd wordt door een O
van de 𝛾-P-groep (ATP dient dus als base om zijn eigen hydrolyse te
bevorderen)
® Wanneer het ATP-ase domein gecomplexeerd wordt met ATP is er een
conformatieverandering: rond de actieve plaats verschuiven enkele
aminozuren zodat 𝐻# 𝑂 goed zijn nucleofiele aanval kan uitvoeren
Vraag: is het mechanisme 1 (covalent intermediair) of mechanisme 2 (rechtstreekse
hydrolyse)?
® Als het gaat om rechtstreekse hydrolyse, zal 𝐻# 𝑂 op een welbepaalde plaats
staan; 𝐻# 𝑂 staat inderdaad meestal op deze plaats, maar soms ook niet à
verklaring: na de aanval van 𝐻# 𝑂 zijn de producten nog steeds gebonden
op de actieve plaats; hier wordt ATP nog enkele keren gehydrolyseerd en
hervormd vooraleer de producten de actieve plaats verlaten
® Dus het is inderdaad mechanisme 2 (rechtstreekse hydrolyse), maar niet de
hydrolyse van ATP maar het vrijkomen van fosfaat uit de actieve plaats is de
snelheidsbepalende stap
Myosinen werken volgens 2 basismechanismen van enzymatische katalyse, nl.
metaalionkatalyse (𝑀𝑔#1 of 𝑀𝑛#1 ) en katalyse door benadering
(conformatieverandering na binding ATP)
53
-
Enzymen die ATP (of GTP) hydrolyseren hebben allemaal een typisch domein: het
P-lus NTP-ase domein
® Dit is een geconserveerd NTP-bindingsdomein dat bestaat uit een centrale
𝛽-plaat omgeven door 2 𝛼-helices en met een karakteristieke P-lus (P =
fosfaatbindend)
® Voorbeelden van proteïnen met een P-lus NTP-ase domein: adenylaat
kinase, de 𝛽-subeenheid van ATP-synthase, de 𝛼-subeenheid van
transducin…
12.
Biokatalysatoren – regulatorische strategieën (H10)
Inleiding: 4 principes van enzymregulatie
-
Enzymactiviteit moet goed geregeld worden, zodat enzymen actief zijn wanneer
nodig en uitgeschakeld wanneer niet; deze enzymregulatie steunt op 4 principes:
o Niet-covalente allosterische controle: allosterische enzymen bezitten een
regulatorische plaats (“allosterische plaats”) waar een inhibitor of activator
kan binden, verschillend van de actieve plaats waar het substraat bindt
® Deze enzymen volgen geen Michaelis-Menten kinetiek, maar zullen
coöperativiteit vertonen: de activiteit op de ene subeenheid van het
enzym heeft invloed op de activiteit van een andere subeenheid door
conformatieveranderingen die ontstaan bij het binden van een
regulator
® Deze enzymen spelen een rol bij signaaltransductie
o Isozymen of iso-enzymen: deze enzymen katalyseren dezelfde reactie maar
zijn kinetisch verschillend (verschillende 𝐾“ , 𝑣AB› )
® Deze enzymen worden in eenzelfde organisme gevormd, maar komen
voor in verschillende weefsels of in andere ontwikkelingsstadia van deze
weefsels
o Omkeerbare covalente modificaties (bv. fosforylaties)
o Onomkeerbare proteolytische activatie: activatie van precursoren of proenzymen of inactivatie door onomkeerbare binding met specifieke
inhibitoren
12.1. Allosterische controle
-
Aspartaattranscarbamoylase (ATCase; EC 2.1.3.2) katalyseert de eerste stap in de
biosynthese van pyrimidine nucleotiden
ATCase bestaat uit verschillende subeenheden: 6 regulatorische en 6 katalytische
(eigenlijk 3 regulatorische dimeren en 2 katalytische trimeren)
Met het bisubstraatanaloog N-fosfonacetyl-aspartaat (PALA) werd de katalytische
plaats van ATCase aangetoond; deze ligt tussen 2 subeenheden, zodat we
54
-
-
-
-
coöperativiteit tussen de verschillende subeenheden kunnen verwachten: binding
van substraat op de ene subeenheid vergemakkelijkt de binding van substraat op
de andere subeenheid
® Per trimeer zijn er 3 katalytische plaatsen waarop substraat kan binden
® Wanneer er geen substraat gebonden is, bevindt het enzym zich in het Tstadium; door substraatbinding wordt het omgezet naar het R-stadium,
waarbij de 2 katalytische trimeren uit elkaar zullen gaan en zullen roteren
en de 3 regulatorische dimeren ook zullen roteren à substraatbinding
wordt makkelijker
Wanneer we de grafiek van de reactiesnelheid in functie van de
substraatconcentratie bekijken, zien we een sigmoïde curve (geen MichaelisMenten voorstelling) à wijst op coöperativiteit
® Wanneer er geen substraat is, wordt de T-stadiumcurve gevolgd; vanaf een
bepaalde hoeveelheid substraat stijgt de
reactiesnelheid heel erg en wordt de Rstadium-curve gevolgd à “homotroop effect”
(effect van substraat op allosterisch enzym)
Het eindproduct van de reactieweg (CTP; een
pyrimidine nucleotide) treedt op als allosterische
inhibitor; deze vorm van regulatie noemt men
feedbackinhibitie of eindproductinhibitie
® CTP is structureel verschillend van de substraten (aspartaat en
carbamoylfosfaat)
® CTP bindt aan de allosterische plaats van ATCase (deze is bij ATCase op de
regulatorische subeenheden, dus op een andere subeenheid dan de
actieve plaats, die op de katalytische subeenheden is) en stabiliseert zo het
T-stadium, waardoor het moeilijk wordt om substraat te binden en om de
omzetting naar het R-stadium te maken
Wanner we nu de curve bekijken van de reactiesnelheid in functie van de
substraatconcentratie, zien we dat deze sigmoïder wordt in aanwezigheid van CTP
(de T-stadium curve wordt langer gevolgd)
® “Heterotroop effect” (effect van niet-substraat op allosterisch enzym)
ATP (een purine nucleotide) maakt de curve daarentegen net minder sigmoïd,
zodat deze meer naar de R-stadium curve neigt en de reactiesnelheid toeneemt
à ATP gaat in competitie met CTP voor binding op de regulatorische subeenheid
à hoge ATP-concentratie verhindert inhibitie door CTP
® Verklaring: meer purine betekent dat er meer pyrimidines gemaakt moeten
worden, aangezien elke purine met een pyrimidine paart à de
reactiesnelheid van ATCase neemt toe
® Andere verklaring: veel ATP betekent veel energie om aan mRNA-synthese
en DNA-replicatie te doen; hier zijn veel bouwstenen zoals pyrimidines voor
nodig à de reactiesnelheid van ATCase neemt toe
55
-
-
De omzetting van T naar R gebeurt volgens het geconcerteerd model: alle
subeenheden zijn ofwel in T ofwel in R
® Binding van substraat verschuift het evenwicht naar het R-stadium, binding
van inhibitor verschuift het evenwicht naar het T-stadium
Biochemisch voordeel van allosterische enzymen: eens de substraatconcentratie
stijgt, is er ook een zeer sterke stijging van de reactiesnelheid
® Bv. voor een Michaelis-Menten enzym moet de hoeveelheid substraat 27
keer groter worden om van een relatieve reactiesnelheid van 0,1 naar een
relatieve reactiesnelheid van 0,8 te gaan; voor een allosterische nzym moet
de hoeveelheid substraat hiervoor maar 2 keer groter worden
® Op deze manier is er een fijne regulatie van de reactiesnelheid mogelijk
12.2. Isozymen
-
-
-
Isozymen zijn enzymen die bij eenzelfde organisme voorkomen en eenzelfde
reactie katalyseren, maar verschillende kinetische parameters en een verschillende
aminozuursequentie hebben; ze worden ook door verschillende genen tot
expressie gebracht
Doordat isozymen verschillende kinetische parameters hebben, hebben ze ook
een verschillende affiniteit t.o.v. substraatconcentraties à dit maakt fijnregeling
van de reactiesnelheid mogelijk bij verschillende substraatconcentraties,
verschillende omstandigheden, verschillende weefsels of verschillende
ontwikkelingsstadia van eenzelfde weefsel
Voorbeeld: lactaat dehydrogenase (LDH; EC 1.1.1.27)
® LDH is een oxydoreductase met een alcoholgroep als elektronendonor en
𝑁𝐴𝐷1 als elektronenacceptor
® Bij de mens komt dit enzym voor onder verschillende isozymen: de H-vorm
(heart; in het hart) en de M-vorm (muscle; in spierweefsel), die elk tetrameer
zijn; een combinatie van H en M is ook mogelijk
® H en M zijn voor 75% identiek, maar hun substraataffiniteit is verschillend:
een tetrameer dat uit 4 identieke H-eenheden bestaat (𝐻• ) heeft een hogere
substraataffiniteit (lagere 𝐾“ ) dan een tetrameer dat uit 4 identieke Meenheden bestaat (𝑀• ) + 𝐻• functioneert beter in een aeroob milieu terwijl
𝑀• beter functioneert in een anaeroob milieu
® In spierweefsel (aanwezigheid van 𝑀• ) gaat de reactie op van rechts naar
links; in het hart (aanwezigheid van 𝐻• ) gaat de reactie op van links naar
rechts
56
-
-
We bekijken het isozymprofiel tijdens de ontwikkeling in het hartweefsel van een
rat:
o Aanvankelijk bestaat het hart van een rattenfoetus uit een tetrameer van 4
M-eenheden, dat liefst anaeroob functioneert en veel substraat nodig heeft
voor efficiënte katalyse
o Bij de geboorte neemt het aantal H-ketens toe
o Bij een volwassen rat bestaat het hartweefsel uit 4 H-ketens die liefst aeroob
functioneren en weinig substraat nodig hebben voor efficiënte katalyse
® Een veranderend isozymprofiel in eenzelfde weefsel laat toe om zich
gemakkelijk aan te passen aan de veranderende omstandigheden tijdens
de ontwikkeling van het weefsel
Niet elk weefsel heeft dezelfde nood om de reactie van LDH uit te voeren à het
isozymprofiel varieert naargelang het weefsel
® Bv. het hart en de nieren bestaan bij voorkeur uit 4 H-ketens, maar de
spieren of lever bestaan bij voorkeur uit 4 M-ketens; nog andere weefsels
zitten er ergens tussenin
12.3. Covalente modificaties
-
-
-
-
Covalente modificaties zijn bv. fosforylatie, acetylatie 𝛾-carboxylatie…
® De meeste covalente modificaties zijn omkeerbaar
Fosforylatie-/defosforylatietiereacties worden uitgevoerd door 2 verschillende
enzymen, die elk een evenwichtsreactie katalyseren maar waarvan het evenwicht
duidelijk in 1 richting ligt
® Proteïne kinase (EC 2.7.11.1 of EC 2.7.10.1 afhankelijk van of het een
seronine/threonine kinase (11) of een tyrosine kinase (10) is) zal een proteïne
fosforyleren; dit kan enkel op aminozuren met een alcoholgroep (ser, thr en
tyr)
® Proteïne fosfatase (EC 3.1.3.14) zal een proteïne defosforyleren
Fosforylatie:
o De meestvoorkomende fosfordonor is ATP; acceptoren zijn ser, thr en tyr
o Onder fysiologische omstandigheden (zoals in een cel) is deze reactie
onomkeerbaar
o Door de fosforylatie krijgt het proteïne 2 negatieve ladingen bij
Defosforylatie:
o Defosforylatie is een hydrolytische reactie waarbij water nodig is
o Ook deze reactie is onomkeerbaar
Fosforylatie en defosforylatie zijn belangrijk om proteïnen te reguleren omdat:
57
-
-
o De vrije energie die door de fosforylatie geleverd wordt groot is à dit kan
het reactie-evenwicht sterk beïnvloeden (waardoor de reactie zo goed als
onomkeerbaar wordt)
o Het proteïne door de fosforylatie 2 extra negatieve ladingen krijgt à dit
kan invloed hebben op bestaande elektrostatische interacties in het
proteïne, of er kunnen nieuwe interacties ontstaan die voor
structuurveranderingen van het enzym kunnen zorgen en zo
substraatbinding en katalytische activiteit kunnen beïnvloeden
o De fosfaatgroep zelf 3 of meer H-bruggen kan vormen en door zijn
tetraëdrische structuur donoren in bepaalde richtingen kan positioneren
Cyclisch adenosine monofosfaat (cAMP) speelt een
belangrijke rol als secundaire boodschapper in bepaalde
signaaltransductiewegen
® Structuur kennen
® De fosfaat op de 5’ van cAMP maakt een cyclische
binding met de hydroxylgroep op de 3’
® cAMP kan proteïne kinase A activeren door te binden
op de regulatorische subeenheid
Regulatie van proteïne kinase A:
o Proteïne kinase A bestaat uit 2 katalytische en 2 regulatorische
subeenheden; de katalytische
subeenheden bestaan uit 2
lobben (een N- en een C-lob)
waartussen de actieve plaats
zich
bevindt
en
de
regulatorische subeenheden
bestaan uit een langgerekte
structuur met aan de ene kant
een R-domein en aan de andere kant 2 cAMP-bindende domeinen
o De langgerekte structuur van de regulatorische subeenheden bevat een
pseudosubstraatsequentie die bestaat uit de aminozuren Arg-Arg-Gly-AlaIle en lijkt op de substraatsequentie van het te fosforyleren proteïnen (ArgArg-X-Ser-Z, met X een klein aminozuur, Z een groot hydrofoob aminozuur
en Ser de fosforylatieplaats) à deze pseudosubstraatsequentie past in de
actieve plaats van de katalytische subeenheid maar zal geen product
opleveren, aangezien Ala niet gefosforyleerd kan worden
o Eerst
is
het
enzym
in
niet-actieve
toestand,
met
de
pseudosubstraatsequentie gebonden in de actieve plaats
o Wanneer er 4 moleculen cAMP binden op de 4 cAMP-bindingsplaatsen,
veroorzaakt
dit
een
conformatieverandering
à
de
pseudosubstraatsequentie komt los uit de actieve plaats, waardoor het
enzym actief wordt en er substraat kan binden en gefosforyleerd worden
58
12.4. Proteolytische activatie
-
-
-
In de cel zijn verschillende enzymen aanwezig als inactieve precursor (het
zymogeen of pro-enzym); deze kunnen gesplitst worden tot actief enzym
® Hiervoor is geen ATP nodig, dus de splitsing is ook mogelijk buiten de cel
Dit is een manier van reguleren die zeer snel kan gebeuren: aangezien het proenzym al aanwezig is, moet er geen gen tot expressie worden gebracht om een
enzym te synthetiseren maar moet het alleen nog in de juiste fragmenten worden
geknipt
® De enzymactivatie gebeurt dus heel snel, wat nodig is bij bepaalde
processen in het lichaam (bv. verteringsenzymen, enzymen die
bloedstolling veroorzaken…)
Proteolytische activatie is onomkeerbaar
12.4.1. Chymotrypsine uit chymotrypsinogeen
-
-
-
Chymotripsine is een verteringsenzym dat vóór activatie in het lichaam aanwezig
is in de vorm van het pro-enzym chymotrypsinogeen; dit pro-enzym wordt
gesynthetiseerd in de pancreas en bestaat uit 1 keten van 245 aminozuren
Chymotrypsinogeen wordt door een ander verteringsenzym (trypsine) gesplitst na
Arg-15, waardoor 𝜋-chymotrypsine gevormd wordt; dit tussenstadium van
chymotrypsine heeft al proteolytische activiteit en zal 2 dipeptides wegknippen,
nl. aminozuren 14-15 (Ser-Arg) en aminozuren 147-148 (Thr-Asn), waardoor 𝛼chymotrypsine gevormd wordt
® 𝛼-chymotrypsine is de actieve vorm (zie hoofdstuk 11) en bestaat uit 3
ketens die onderling verbonden zijn met zwavelbindingen
Vergelijking van de 3D-structuur van chymotrypsine met de 3D-structuur van
chymotrypsinogeen:
o De nieuwe amino-terminale groep van Ile-16 (nadat er hiervoor geknipt is)
verplaatst zich en vormt een ionische binding met Asp-194; dit is nodig om
de specificiteitspocket van chymotrypsine te vormen
o De oxyanion holte is onvolledig in het zymogeen, maar volledig in het
chymotrypsine
® 1 proteolytische splitsing bepaalt dus conformationele veranderingen in
specifieke gebieden van het proteïne
59
12.4.2. Trypsine uit trypsinogeen
-
-
Trypsine is noodzakelijk om chymotrypsinogeen actief te maken en wordt
daarnaast ook gebruikt bij de proteolytische activatie van elastase,
carboxypeptidase en lipase
Vóór activatie is trypsine aanwezig als trypsinogeen; trypsinogeen wordt
geactiveerd door zowel enteropeptidase als door trypsine zelf
Trypsine is dus een gemeenschappelijke activator
12.4.3. Serpins of serine protease inhibitoren
-
-
Aangezien proteolytische activatie onomkeerbaar is, moeten er manieren zijn om
de proteolytische enzymen te stoppen à serpins zijn substraatanalogen die zeer
sterk binden op de actieve plaats van het enzym, waardoor het enzym inactief
wordt
Voorbeeld: pancreas trypsine inhibitor
® Lys-15 van de inhibitor reageert met Asp-189 ter hoogte van de actieve
plaats van trypsine
® Asp-189 is een belangrijk aminozuur in de S1-pocket dat ervoor zorgt dat
trypsine enkel na positief geladen aminozuren zal splitsen; door deze groep
te blokkeren wordt het enzym inactief
12.4.4. Bloedstollingscascade
-
-
Ook bij de bloedstollingscascade spelen proteolytische enzymen een belangrijke
rol
Bloedstolling kan via 2 reactiewegen geïnduceerd worden:
o De intrinsieke reactieweg: door inwendige beschadiging van de
endotheelcellen van de bloedvaten
o De excentrieke reactieweg (meestal): door trauma (verwonding)
Mechanisme van de excentrieke reactieweg (enkel groene en oranje kader
kennen:
o Prothrombine bestaat uit een 𝛾-carboxyglutamaatrijk domein (“Gla”), 2
Kringle domeinen en een katalytisch domein; alle domeinen werken samen
om prothrombine in de inactieve vorm te houden
o Bij membraanbeschadiging komt er 𝐶𝑎#1 vrij; dit wordt gebonden door het
𝛾-carboxyglutamaatrijk domein, waardoor prothrombine aan het
membraan verankerd wordt in de nabijheid van factor Xa (serine protease)
o Factor Xa knipt tussen Arg-274 en Thr-275 en vervolgens tussen Arg-323
en Ile-324, waardoor thrombine gevormd wordt
o Fibrinogeen, dat bestaat uit een langgerekte 𝛼-helix-structuur met aan de
2 uiteinden een 𝛽- en een 𝛾-globulaire eenheid en centraal nog een
60
-
-
-
-
globulaire eenheid, wordt door thrombine omgezet tot fibrine; dit gebeurt
door afsplitsing van fibrinopeptides van de centrale globulaire eenheid
o Verschillende fibrinemoleculen polymeriseren ter vorming van een “soft
clot” fibrine
o De soft clot fibrine wordt nog verder gecross-linked door een geactiveerde
factor XIIIa (transglutaminase; EC 2.3.2.13) tot “hard clot” fibrine
Vitamine K is essentieel bij de bloedstolling: in afwezigheid van vitamine K (of in
aanwezigheid van vitamine K-antagonisten) zal er abnormale prothrombine
gevormd worden, die geen 𝐶𝑎#1 bindt
® Dit komt doordat vitamine K het co-enzym is waarmee glutamaat wordt
omgezet tot 𝛾-carboxyglutamaat
Hemofilie A is een geslachtsgebonden recessieve aandoening waarbij factor VIII
ontbreekt; deze factor (die voorkomt bij de laatste stap in de intrinsieke
reactieweg) stimuleert de activatie van de essentiële factor X uit factor IXa
® Vroeger ondergingen mensen met deze aandoening bloedtransfusie met
geconcentreerd plasma met factor VIII, maar het risico op infecties was
nogal groot
® Tegenwoordig bestaan er recombinante DNA-technieken waarbij het gen
voor factor VIII tot expressie wordt gebracht in celculturen en vervolgens
hieruit gezuiverd wordt
Een precieze regeling van de bloedstolling is noodzakelijk, zodat trombose
(ongewenste bloedstolling) vermeden wordt; alle geactiveerde factoren zijn
kortlevend en worden uiteindelijk verdund in de bloedstroom, verwijderd via de
lever en afgebroken door proteasen
Specifieke inhibitoren van de bloedstolling:
o Tissue factor pathway inhibitor (TFPI): verhindert complexvorming tussen
weefselfactoren VIIa en Xa
o Antithrombin III: veroorzaakt inactivatie van thrombine door
complexvorming, maar ook door inactivatie van XIIa, XIa, IXa en Xa
o Heparine (een anticoagulans of antistollingsmiddel): vergemakkelijkt de
vorming van complexen van antithrombine en van serine protease
(bloedstollende factoren)
61
13.
Glycolyse - deel 1 (H16)
Inleiding
-
-
-
Glycolyse (ook gekend als de Embden-Meyerhof reactieweg) is een proces waarbij
1 glucose wordt omgezet tot 2 pyruvaat en 2 ATP
® Dit is een anaeroob proces: geen zuurstof nodig
Pyruvaat kan verder gemetaboliseerd worden tot:
o Lactaat of ethanol (anaeroob; fermentatie)
o Acetyl CoA (aeroob; volledige verbranding)
® Acetyl CoA wordt nog verder geoxideerd tot 𝐶𝑂# en 𝐻# 𝑂 via de
citroenzuurcyclus en oxidatieve fosforylatie (hierbij wordt veel meer ATP
gegenereerd dan in de glycolyse)
Tenzij we in een uithongeringstoestand zijn, gebruiken onze hersenen enkel
glucose; onze rode bloedcellen gebruiken in eender welke toestand enkel glucose
Reden dat glucose zoveel belangrijker is dan andere monosacchariden
(evolutionair):
o Glucose is 1 van de verschillende monosacchariden die uit formaldehyde
gevormd kunnen worden onder prebiotische condities à brandstof voor
primitieve biochemische systemen
o Monosacchariden in open ketenvorm hebben carbonylgroepen die kunnen
reageren met aminogroepen van proteïnen: “glycosylatie” (nadelig);
glucose komt vooral voor in ringvorm waardoor het een lage neiging heeft
tot niet-enzymatische glycosylatie van proteïnen
13.1. Glycolyse is een energie-conversiepathway in vele organismen
-
-
Glycolyse is gemeenschappelijk in bijna alle soorten cellen, zowel prokaryote als
eukaryote
® Bij eukaryote cellen gebeurt de glycolyse in het cytoplasma
Glycolyse bestaat uit 2 fases die elk uit 5 reacties bestaan
Alle structuren moeten kunnen worden herkend en getekend!
13.1.1. Fase 1 van de glycolyse
13.1.1.1. Reactie 1
62
-
-
-
Eerst wordt glucose gefosforyleerd à reden:
o Wij nemen glucose op uit het bloed mbv. transporters; om te voorkomen
dat glucose ook weer uit de cel migreert met deze zelfde transporters,
wordt het gefosforyleerd
o De fosforylatie faciliteert de vorming van 3C-moleculen met een hoge
fosforyl-transferpotentiaal
Hexokinase transfereert de 𝛾-fosforylgroep van ATP naar de hydroxylgroep op de
C6 van 𝛼-glucose à er wordt glucose 6-fosfaat (G-6P) gevormd
Voor deze reactie is ATP nodig; er is ook een divalent metaalion zoals 𝑀𝑔#1 nodig
voor de activiteit (zoals bij alle kinases)
Hexokinase bindt glucose, waarna het roteert zodat de kloof gelegen tussen de
lobben sluit en glucose “vast komt te zitten” in een apolaire omgeving (induced
fit); nadat ook ATP is gebonden kan de 𝛾-fosforylgroep heel specifiek
getransfereerd worden naar glucose
® Dit mechanisme voorkomt dat ATP gehydrolyseerd zou worden door de
omgeving meer apolair te maken (gunstig voor de reactie tussen de
hydrofiele hydroxylgroep van glucose en de 𝛾-fosforylgroep van ATP) en
water weg te houden van de actieve plaats
® Substraat-geïnduceerde kloofsluiting is een algemene eigenschap van
kinases
Deze reactie is irreversibel
13.1.1.2. Reactie 2
-
-
Fosfoglucose isomerase zet G-6P (een aldose) om tot fructose 6-fosfaat (F-6P; een
ketose)
® Dit is een isomerisatiereactie
Eerst moet de ring geopend worden; het evenwicht van deze reactie ligt naar links
à katalysator nodig
Daarna moet de ring weer gesloten worden
63
13.1.1.3. Reactie 3
-
-
Fosfofructokinase (PFK) katalyseert de transfer van een fosforylgroep van ATP naar
de C1-hydroxylgroep van F-6P à er wordt fructose-1,6-bisfosfaat (F-1,6-BP)
gevormd
PFK (een allosterisch enzym) bepaalt de snelheid van de glycolyse!
PFK vormt een kritische regulator voor glycolyse in de meeste cellen: als PFK
inactief is, stopt de flux doorheen de glycolyse
Deze reactie is irreversibel
Vraag: waarom isomerisatie van G-6P naar F-6P en dan naar F-1,6-BP (en dan
splitsen in 2 3C-moleculen)? Waarom niet G-6P maken en hier een tweede
fosfaatgroep aan hangen (en dan splitsen)?
® Antwoord: als we dit molecule zouden splitsen (aldolsplitsing), zouden we
een 2C- en een 4C-molecule bekomen en niet 2 3C-moleculen; er zouden
dan nog 2 verschillende pathways nodig zijn om deze verder af te breken,
terwijl de 2 3C-moleculen in 1 pathway afgebroken kunnen worden
13.1.1.4. Reactie 4
-
Aldolase breekt het hexose F-1,6-BP in 2 fosfaten, nl. glyceraldehyde-3-fosfaat
(GAP) en dihydroxyaceton fosfaat (DHAP)
® Dit zijn allebei 3C-moleculen
64
13.1.1.5. Reactie 5
-
-
-
DHAP wordt mbv. triose fosfaat isomerase (TPI of TIM) omgezet in GAP
Dit is een isomerisatiereactie
Deze reactie is zuur-base gekatalyseerd
Deze enzymatische reactie is zeer snel (en omkeerbaar)
® We zeggen dat de reactie diffusiegecontroleerd is: de snelheid wordt
beperkt door de diffusiesnelheid
® TPI is een kinetisch “perfect” enzym
Bij evenwicht is er in principe 96% DHAP, maar doordat GAP verwijderd wordt in
de volgende stap gaat de reactie meteen naar rechts
TPI bestaat uit 8 parallelle 𝛽-strengen omgeven door 8 𝛼-helices; centraal is de
actieve plaats (met hierin His en Glu, een basisch en zuur aminozuur), die na
substraatbinding wordt afgesloten door een lus
® De actieve plaats wordt afgesloten om te voorkomen dat een gevaarlijke
nevenreactie zou optreden
Slide met het reactiemechanisme: niet te kennen
13.1.2. Fase 2 van de glycolyse
13.1.2.1. Reactie 6
-
GAP wordt mbv. glyceraldehyde-3-fosfaat dehydrogenase omgezet naar 1,3bisfosfoglyceraat (1,3-BPG)
Een molecule 𝑁𝐴𝐷1 wordt gereduceerd tot NADH
1,3-BPG heeft een hoge fosforyl-transferpotentiaal à de volgende stap gebruikt
de hoogenergetische fosfaat van 1,3-BPG om ATP te vormen uit ADP
65
-
De reactie gebeurt in 2 stappen:
o 1. Oxidatie van het aldehyde tot een carboxylzuur door 𝑁𝐴𝐷1 (∆𝐺 =
−50 𝑘𝐽/𝑚𝑜𝑙)
o 2. Dehydratatie na koppeling van het carboxylzuur aan orthofosfaat met
vorming van acylfosfaat (∆𝐺 = 50 𝑘𝐽/𝑚𝑜𝑙)
® Als de eerste reactie zou optreden, zou er meteen veel warmte worden
vrijgesteld en veel energie verloren gaan à de 2 reacties worden
gekoppeld zodat de tweede reactie ook kan opgaan à covalent
enzymgebonden
thioester
intermediair
als
mechanisme
van
energiekoppeling
-
Structuur van glyceraldehyde 3-fosfaat dehydrogenase:
o Er zit een 𝑁𝐴𝐷1 (co-enzym) in gebonden
o In de actieve plaats is een Cys aanwezig à heeft een SH-groep: belangrijk
voor de vorming van het thioester intermediair
13.1.2.2. Reactie 7
-
Fosfoglyceraat kinase transfereert de fosforylgroep van 1,3-BPG naar ADP
à er worden ATP en 3-fosfoglyceraat (3-PG) gevormd
Deze reactie wordt substraatfosforylatie genoemd: de fosfaatdonor 1,3-BPG
is een substraat met hoge fosforyl-transferpotentiaal
13.1.2.3. Reactie 8
66
-
Fosfoglyceraat mutase katalyseert de transfer van de fosforylgroep van 3-PG van
de C3-positie naar de C2-positie à er wordt 2-fosfoglyceraat (2-PG) gevormd
Voor deze reactie is geen ATP nodig
De reactie gebeurt in 2 stappen:
o Het enzym heeft een fosfaatgroep, gebonden aan His; deze fosfaatgroep
wordt op de C2-positie van 3-PG gezet à er wordt 2,3-bisfosfoglyceraat
gevormd
o Het enzym neemt de fosfaatgroep op de C3-positie van 2,3bisfosfoglyceraat op à er wordt 2-PG gevormd
® Het enzym heeft 2,3-bisfosfoglyceraat nodig in katalytische (lage)
hoeveelheden om een actieve plaats His in gefosforyleerde toestand te
houden
13.1.2.4. Reactie 9
-
2-PG wordt mbv. enolase gedehydrateerd tot fosfoenolpyruvaat (PEP)
Voor deze reactie is geen ATP nodig
PEP is een onstabiel molecule à heeft een zeer hoge fosforyl-transferpotentiaal
13.1.2.5. Reactie 10
-
-
Pyruvaat kinase katalyseert substraatfosforylatie waarbij PEP wordt omgezet tot
pyruvaat in de enolvorm; deze enolvorm wordt snel omgezet in de stabielere
ketovorm
Bij deze reactie wordt ATP gevormd
Dit is een interne oxido-reductie reactie
Deze reactie is irreversibel
67
13.1.3. Algemeen
-
-
De nettoreactie voor de omvorming van glucose tot pyruvaat is 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑒 + 2 𝑃E +
2 𝐴𝐷𝑃 + 2 𝑁𝐴𝐷1 → 2 𝑝𝑦𝑟𝑢𝑣𝑎𝑎𝑡 + 2 𝐴𝑇𝑃 + 2 𝑁𝐴𝐷𝐻 + 2 𝐻1 + 2 𝐻# 𝑂
® Deze omzetting is anaeroob: in geen enkele reactie was 𝑂# nodig
De energie vrijgezet in de anaerobe conversie van glucose tot 2 moleculen
pyruvaat is ongeveer −90 𝑘𝐽/𝑚𝑜𝑙 onder cellulaire condities
13.2. Regeneratie van 𝑁𝐴𝐷 1 door metabolisme van pyruvaat
-
Probleem bij glycolyse: 2 𝑁𝐴𝐷1 worden omgezet tot 2 NADH à moeten opnieuw
worden omgezet tot 2 𝑁𝐴𝐷1
Onder aerobe omstandigheden: pyruvaat wordt geoxideerd tot acetyl CoA, dat
verder geoxideerd wordt tot 𝐶𝑂# in de citroenzuurcyclus
Onder anaerobe omstandigheden zijn er 2 opties (fermentatie):
o Pyruvaat wordt omgezet tot ethanol (gebeurt door micro-organismen; dit
kunnen wij niet)
o Pyruvaat wordt omgezet tot lactaat (melkzuur) (gebeurt door microorganismen, spieren, rode bloedcellen)
13.2.1. Metabolisme van pyruvaat tot ethanol
-
-
De omzetting van pyruvaat tot ethanol gebeurt in 2 stappen:
o Pyruvaat wordt mbv. pyruvaat decarboxylase omgezet tot acetaldehyde
o Acetaldehyde wordt mbv. alcohol dehydragenase omgezet tot ethanol;
hierbij wordt NADH omgezet tot 𝑁𝐴𝐷1
® Hierbij is 𝑍𝑛#1 nodig: dit polariseert de carbonylgroep, zodat de
transfer van 𝐻g van NADH naar dit C-atoom mogelijk wordt
Nettoreactie van de glycolyse + metabolisme van pyruvaat tot ethanol: 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑒 +
2 𝑃E + 2 𝐴𝐷𝑃 + 2 𝐻1 → 2 𝑒𝑡ℎ𝑎𝑛𝑜𝑙 + 2 𝐶𝑂# + 2 𝐴𝑇𝑃 + 2 𝐻# 𝑂
® Netto geen NADH of 𝑁𝐴𝐷1
68
13.2.2. Reductie van pyruvaat tot lactaat: melkzuurfermentatie
-
-
-
Reductie van pyruvaat tot lactaat door
NADH wordt gekatalyseerd door lactaat
dehydrogenase; hierbij wordt NADH
omgezet tot 𝑁𝐴𝐷1
Melkzuurfermentatie wordt uitgevoerd
door:
o Bacteriën
o Type II spiervezels (snelle vezels)
® Probleem: hierbij wordt ATP
gehydrolyseerd à pH-daling van pH 7 tot pH 6,3 à zorgt voor
inactivatie van eiwitten à cel sterft
® Er is een systeem om de pH-daling te stoppen: bij een bepaalde pH
wordt fosfofructokinase (kritische regulator) geïnhibeerd + lactaatproton symporter vervoert protonen en lactaat uit de cel en naar het
bloed
Nettoreactie van de glycolyse + metabolisme van pyruvaat tot lactaat: 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑒 +
2 𝑃E + 2 𝐴𝐷𝑃 → 2 𝑙𝑎𝑐𝑡𝑎𝑎𝑡 + 2 𝐴𝑇𝑃 + 2 𝐻# 𝑂
® Netto geen NADH of 𝑁𝐴𝐷1
13.3. Fermentaties
-
Fermentatie is een ATP-genererend proces waarbij organische moleculen
optreden als zowel elektronendonor als elektronenacceptor
Bij fermentatie is geen zuurstof vereist: anaeroob
Er zijn 2 soorten anaerobe organismen:
o Obligaat anaeroob: kunnen onmogelijk overleven in aanwezigheid van 𝑂#
o Facultatief anaeroob: kunnen functioneren in aan- of afwezigheid van 𝑂#
13.4. Bindingsplaats voor 𝑁𝐴𝐷 1 is gelijkend in vele dehydrogenases
-
Glyceraldehyde 3-fosfaat dehydrogenase, alcohol dehydrogenase en lactaat
dehydrogenase hebben allemaal een gelijkaardige 𝑁𝐴𝐷1 -bindingszone: de
Rossmann fold
® Deze bestaat uit 4 𝛼-helices en 6 parallelle 𝛽-platen
69
13.5. Intrede van fructose en galactose in de glycolyse
-
Glucose is de belangrijkste brandstof in de meeste organismen à strategie:
andere suikers omzetten tot glycolytische intermediairen
Andere suikers:
o Fructose en sucrose (het disaccharide van glucose en fructose): belangrijke
zoetstoffen in voedingswaren en dranken
o Galactose en lactose (het disaccharide van galactose en glucose): in melk
13.5.1. Fructose metabolisme
-
-
In de lever wordt fructose omgezet tot glyceraldehyde 3-fosfaat:
o Fructose wordt door fructokinase gefosforyleerd tot fructose-1-fosfaat
o Fructose-1-fosfaat wordt door fructose-1-fosfaat aldolase gesplitst in
glyceraldehyde en dihydroxyaceton
o Glyceraldehyde wordt door triose kinase gefosforyleerd tot
glyceraldehyde-3-fosfaat
In andere weefsels (vetweefsel) wordt fructose direct gefosforyleerd tot fructose6-fosfaat door hexokinase
Excessieve fructoseconsumptie leidt tot:
o Een vette lever
o Insuline-ongevoeligheid
o Obesitas
® Dit kan leiden tot diabetes type 2
13.5.2. Galactose metabolisme
-
-
Galactose wordt omgezet tot glucose-6-fosfaat:
o Galactose wordt door galactokinase gefosforyleerd tot galactose-1-fosfaat
o Galactose-1-fosfaat ontvangt een uridylgroep van UDP-glucose,
geketalyseerd door galactose-1-fosfaaturidyltransferase à er wordt UDPgalactose en glucose-1-fosfaat gevormd
o UDP-galactose wordt door UDP-galactose-4-epimerase omgezet tot UDPglucose
o Glucose-1-fosfaat wordt in een isomerisatiereactie door fosfoglucomutase
omgezet tot glucose-6-fosfaat
Nettoreactie: 𝑔𝑎𝑙𝑎𝑐𝑡𝑜𝑠𝑒 + 𝐴𝑇𝑃 → 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑒 − 1 − 𝑓𝑜𝑠𝑓𝑎𝑎𝑡 + 𝐴𝐷𝑃 + 𝐻1
70
13.6. Aandoeningen
13.6.1. Lactose-intolerantie
-
-
Lactose-intolerantie is het niet kunnen metaboliseren van het melksuiker lactose
door gebrek aan lactase
Normaal gezien komt lactase enkel tot expressie in baby’s en daarna niet meer;
dit is veranderd toen men aan veeteelt begon te doen (mensen die melk konden
drinken hadden 20% meer vruchtbare nakomelingen à natuurlijke selectie)
In afwezigheid van lactase wordt lactose door darmbacteriën gefermenteerd tot
melkzuur, methaan en 𝐻# à flatulentie en diarree
13.6.2. Galactosemie
-
-
Galactosemie wordt veroorzaakt door een verstoring van het galactose
metabolisme; het kan leiden tot leverziekten, cataract…
Klassieke oorzaak: afwezigheid van galactose-1-fosfaaturidyltransferase waardoor
galactose wordt omgezet tot galactitol, dat in de lens accumuleert
® Aangezien galactitol osmotisch actief is, zal dit zorgen voor diffusie van
water in de lens à cataract
Zie laatste slides voor eventuele examenvragen!
® Efficiëntie in termen van ATP over C =
14.
\B>DBJ \‘•
\B>DBJ u
Signaaltransductie (H14)
14.1. Signaaltransductie: principes
-
-
-
-
1. Signaal: er wordt een extracellulaire primaire boodschapper vrijgegeven; deze
kan het membraan niet passeren
® Bv. hormoon, neurotransmitter, groeifacter
2. Receptor: de primaire boodschapper bindt op een receptor (transmembranair
proteïne); deze binding leidt tot een conformatieverandering, waardoor het
signaal intracellulair wordt doorgegeven
® Dit is de eerste amplificatie van het signaal
3. Secundaire boodschappers: er worden intracellulair secundaire boodschappers
doorgegeven die vrij kunnen diffunderen en cross-talk tussen verschilllende
reactiewegen mogelijk maken (?)
® Dit is de tweede amplificatie van het signaal
4. Respons: er worden effectoren geactiveerd
® Dit zijn voornamelijk enzymen die ge(de)fosforyleerd worden, maar er
kunnen ook pompen en kanalen, transcriptiefactoren… geactiveerd worden
71
-
® Dit is de derde amplificatie van het signaal
5. Terminatie van de signaaltransductie
6. Defecten
14.2. Epinephrine (adrenaline) transductieweg
-
-
-
Fysiologisch effect van epinephrine: vecht-of-vluchtreactie
® Afbraak van glycogeen in de skeletspieren (waarbij energie vrijkomt)
® Versnelde ademhaling en hartritme
® Verminderde bloedtoevoer naar de darmen
® Vergroting van de pupillen voor beter zicht
® Verkorte bloedstollingstijd
® Tijdelijke verbetering van het geheugen
1. Signaal: het signaal epinephrine (een catecholamine) wordt geproduceerd door
het bijniermerg
2. Receptor:
o Epinephrine bindt op een 7-transmembranaire-helix receptor
® Dit betekent dat er 7 helixen aanwezig zijn over het membraan
o Aan de binnenkant van de receptor zit een G-proteïne (guanine-nucleotidebindingsproteïne) dat bestaat uit een 𝛼-, 𝛽- en 𝛾-subeenheid à binding van
epinephrine aan de receptor zorgt voor een conformatieverandering
waarbij de P-lus van de 𝛼-subeenheid opengaat, waardoor GDP, dat aan
het G-proteïne gebonden is, kan vrijkomen en vervangen wordt door GTP;
deze binding van GTP zorgt ervoor dat de 𝛼-subeenheid loskomt van de 𝛽𝛾-subeenheid, waarna (de 𝛼-subeenheid van) het G-proteïne in actieve
vorm is
® De receptor wordt een G-proteïne gekoppelde receptor (GPCR)
genoemd
® Het G-proteïne is dus heterotrimeer (bestaat uit 3 subeenheden); de 𝛼en 𝛾-subeenheid zitten verankerd aan het celmembraan
® Dit is het eerste niveau van amplificatie: 1 signaal op de receptor
activeert meerdere G-proteïnen (nadat het geactiveerde G-proteïne 𝐺´
vrijgekomen is, gaat het signaal weg uit de receptor zodat er weer een
inactief G-proteïne (𝐺´µ¶ ) kan binden, waarna het signaal opnieuw kan
binden en het G-proteïne kan activeren)
3. Secundaire boodschapper: het geactiveerde G-proteïne activeert het enzym
adenylaatcyclase (een transmembranair proteïne), dat ATP omzet in cAMP en 𝑃𝑃E ;
de katalytische domeinen van dit enzym bevinden zich aan de binnenkant van de
cel, zodat het substraat (ATP) zich in het cytoplasma bevindt en ook de producten
(cAMP en 𝑃𝑃E ) naar het cytoplasma worden uitgescheiden
® Dit is het tweede niveau van amplificatie: 1 adenylaatcylase produceert vele
cAMP (cAMP is een secundaire boodschapper)
72
-
-
-
4. Respons:
o 4 moleculen cAMP binden aan proteïne kinase A (PKA), waardoor de
katalytische subeenheden vrijkomen om substraat te fosforyleren (zie
eerder)
® cAMP heeft een korte levensduur: het wordt vrij snel afgebroken tot
fosfodiësterase ter vorming van AMP
o PKA fosforyleert fosforylase kinase (à fosforylase kinase-P), waardoor dit
actief wordt
o Fosforylase kinase-P fosforyleert glycogeen fosforylase (à glycogeen
fosforylase-P), waardoor dit actief wordt
o Glycogeen fosforylase-P initieert de afbraak van glycogeen (𝑔𝑙𝑦𝑐𝑜𝑔𝑒𝑒𝑛> →
𝑔𝑙𝑦𝑐𝑜𝑔𝑒𝑒𝑛>g] + 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑒-1𝑃
o PKA fosforyleert glycogeen synthase, waardoor dit inactief wordt
® Dit is het derde niveau van amplificatie: 1 PKA fosforyleert vele enzymen
5. Terminatie à 3 manieren:
o 1. GTP-hydrolyse: na verloop van tijd zal de fosfaatgroep van GTP
weggehydrolyseerd worden, waardoor GTP wordt omgezet tot GDP; GDP
bindt weer met de 𝛽-𝛾-subeenheid en migreert weer naar de receptor om
een nieuw signaal op te vangen
o 2. Dissociatie: het signaal dissocieert weer weg van de plaats waar het
gebonden is
o 3. Fosforylatie van de receptor en binding van 𝛽-arrestin: de
transmembranaire receptor wordt gefosfyleerd door geactiveerd kinase en
ATP, waardoor het proteïne 𝛽-arrestin erop kan binden; hierdoor kan het
signaal niet meer weg, waardoor de receptor geen G-proteïne meer kan
activeren
® Dit kan dus alleen wanneer er signaal op de receptor gebonden is
6. Defecten:
o Cholera toxine: de bacterie Vibrio cholerae produceert een toxine dat zorgt
voor stabilisatie van de geactiveerde vorm 𝐺´ à het G-proteïne blijft in
actieve vorm, waardoor PKA continu geactiveerd wordt en het
chloridekanaal constant open blijft, wat leidt tot verlies van NaCl en 𝐻# 𝑂 (à
acute diarree)
o Kinkhoest toxine: de bacterie Bordetella pertussis zorgt ervoor dat 𝐺´ geen
activerende maar een inhiberende werking zal uitoefenen op adenylcyclase
o Betablokker: betablokkers binden op de receptor en inhiberen zo
epinephrinebinding à geneesmiddel om hartritmestoornissen op peil te
houden
73
14.3. Angiotensine II transductieweg
-
-
-
-
-
-
Fysiologisch effect van angiotensine II:
o Stimuleert de resorptie van water en 𝑁𝑎1 (extracellulair volume stijgt) à
toename van het dorstgevoel
o De hoeveelheid vocht in het bloed (en dus de totale hoeveelheid bloed)
stijgt, waardoor de bloeddruk toeneemt
o Vernauwing van de bloedvaten, waardoor de bloeddruk stijgt
1. Signaal:
o In de lever wordt de precursor angiotensinogeen geproduceerd, dat
vervolgens door renine (een proteolytisch enzym geproduceerd door de
nieren) wordt omgezet in angiotensine I
o Angiotensine I wordt door angiotensine converterend enzym (ACE), dat
door de nieren en longen wordt geproduceerd, omgezet in het signaal
angiotensine II
2. Receptor: angiontensine II bindt op een 7-transmembranaire-helix receptor,
waarna een G-proteïne wordt geactiveerd (identiek aan stap 2 in de epinephrine
transductieweg)
® Dit is het eerste niveau van amplificatie
3. Secundaire boodschapper:
o Het geactiveerde G-proteïne activeert het transmembranair enzym
fosfolipase C, dat fosfatidylinositol-4,5-bisfosfaat (𝑃𝐼𝑃# ) omzet tot
diacylglycerol (DAG) en inositol-1,4,5-trisfosfaat (𝐼𝑃` )
® DAG blijft in het celmembraan zitten, 𝐼𝑃` kan vrij migreren doorheen
het cytoplasma
o 𝐼𝑃` activeert een calciumkanaal van het endoplasmatisch reticulum à 𝐶𝑎#1
komt vrij in het cytoplasma
® Dit is het tweede niveau van amplificatie: 1 fosfolipase C produceert vele
DAG en 𝐼𝑃` (DAG en 𝐼𝑃` zijn secundaire boodschappers; 𝐶𝑎#1 ook)
4. Respons:
o 𝐶𝑎#1 dat vrijkomt in het cytoplasma activeert, samen met DAG, proteïne
kinase C (oorspronkelijk is dit in oplossing; wanneer het geactiveerd wordt
bindt het aan membraangebonden DAG en aan hydrofiele
fosfolipidenkopjes mbv. calciumionen)
o PKC fosforyleert enzymen à cascade
® De werking van proteïne kinase C (PKC) is gelijkaardig aan die van PKA
(pseudosubstraatsequentie die bindt op de actieve plaats…)
® Dit is het derde niveau van amplificatie: 1 DAG en 1 𝐶𝑎#1 activeren vele
PKC
5. Terminatie: terminatie is mogelijk door 𝐼𝑃` te inactiveren met verschillende
(de)fosforylatiestappen of door DAG te inactiveren door het bv. af te breken tot
vetzuren
74
14.3.1. 𝐶𝑎#1 als centrale boodschapper
-
-
De 𝐶𝑎#1 -concentratie in de cel moet zo laag mogelijk gehouden worden:
o 𝐶𝑎#1 kan precipiteren met anionische groepen (carboxylaten en fosfaten)
o 𝐶𝑎#1 kan in proteïnen (on)gewenste structuurveranderingen veroorzaken
door sterke binding met negatief geladen aminozuren
#1
𝐶𝑎
kan ook optreden als boodschapper met het
regulatorisch proteïne calmodulin
® Calmodulin behoort tot de EF-hand proteïnefamilie
(de EF-hand is een 𝐶𝑎#1 -bindingsmotief)
® 𝐶𝑎#1 activeert calmodulin, dat vervolgens transporters
(𝐶𝑎#1 -ATPase pomp) en calmodulin-afhankelijke
proteïne kinasen activeert à werkwijze:
o Calmodulin bindt met 4 𝐶𝑎#1 en wordt hierdoor een klem die perfect
rond een calmodulin-afhankelijk proteïne kinase (CaM kinase) past
o Omklemming van CaM kinase door calmodulin veroorzaakt een
conformatieverandering waardoor CaM kinase geactiveerd wordt
14.4. Insuline transductieweg
-
-
-
Fysiologisch effect van insuline: na de maaltijd stijgt de glucoseconcentratie in het
bloed, waardoor de 𝛽-cellen van de pancreas insuline vrijzetten; hierdoor wordt
glucose opgenomen in vetcellen/hart/spierweefsel door de glucosetransporter
GLUT-4
® In afwezigheid van insuline zitten deze glucosetransporters in intracellulaire
vesikels; wanneer insuline wordt vrijgezet, promoot het transport van deze
vesikels naar het celmembraan, waar ze versmelten met het membraan en
zorgen voor snelle glucose-opname
® Uiteindelijk wordt het insuline-receptor-complex geïnternaliseerd, insuline
afgebroken en de receptor gerecycleerd
® In spierweefsel wordt glucose opgeslagen als glycogeen, om later gebruikt
te worden in de krebscyclus of om afgebroken te worden tot melkzuur
® In vetcellen wordt glucose gebruikt voor de synthese van triglyceriden
1. Signaal: het signaal insuline wordt door proteolyse gesynthetiseerd uit de
precursor proinsuline
® Insuline bestaat uit 2 polypeptideketens (een 𝛼- en een 𝛽-keten) die met Sbruggen verbonden zijn
2. Receptor:
o Insuline bindt op de 𝛼-subeenheid van een insuline-receptor-dimeer
® De receptor (een homodimeer) bestaat uit een extracellulaire 𝛼subeenheid en een transmembranaire en intracellulaire 𝛽-subeenheid,
verbonden door een S-brug
75
-
-
-
o De 𝛽-subeenheid van de insuline-receptor behoort tot de familie van de
receptor proteïne tyrosine kinasen en heeft dus zelf proteïne kinaseactiviteit à met behulp van ATP fosforyleert de 𝛽-subeenheid 3 tyrosines
in zijn eigen lus, wat zorgt voor een draaiing van de lus
o Op de fosfaatgroep bindt een insuline-receptor-substraat (IRS), dat
fosfoinositide kinase niet zal activeren maar wel zal binden en naar het
membraan zal brengen, waar substraat (membraanlipide) zit
® Dit is het eerste niveau van amplificatie: 1 signaal + receptor activeert
vele IRS
3. Secundaire boodschappers: het enzym fosfoinositide 3-kinase wordt
geactiveerd en zet 𝑃𝐼𝑃# om tot fosfatidylinositol-3,4,5-trisfosfaat (𝑃𝐼𝑃` )
® Dit is het tweede niveau van amplificatie: 1 fosfoinositide 3-kinase
produceert vele 𝑃𝐼𝑃`
4. Respons:
o 𝑃𝐼𝑃` -afhankelijk kinase (PDK1, een ser/thr kinase) wordt geactiveerd
o Het geactiveerde PDK1 activeert Akt1 kinase (een ser/thr kinase)
® Dit is het derde niveau van amplificatie: 1 𝑃𝐼𝑃` -kinase activeert vele kinasen
5. Terminatie:
o Gefosforyleerde proteïnen zijn zeer stabiel à specifieke fosfatasen zijn
nodig voor de terminatie
o Om de tyrosine residu’s te defosforyleren is proteïne tyrosine fosfatase
nodig
o Om de proteïne kinasen PDK1 en Akt1 te defosforyleren is proteïne serine
fosfatase nodig
o Om 𝑃𝐼𝑃` te defosforyleren is lipide fosfatase nodig
14.5. Epidermale groeifactor (EGF) transductieweg
-
-
Fysiologisch effect van EGF: in bepaalde types kanker is er een verhoogde
activiteit van EGF-receptor
® Toepassing: EGF-receptorinhibitoren bij kankerbehandeling
1. Signaal: het signaal EGF bestaat uit 1 polypeptideketen met intramoleculaire
disulfidebruggen; het simuleert de groei van epidermale cellen en epitheelcellen
2. Receptor:
o 2 EGF binden elk op het extracellulaire gedeelte van een EGF-receptormonomeer; hierdoor worden de 2 receptoren dichter naar elkaar toe
getrokken, waarna de dimerisatie-arm van de ene monomeer in de
bindingspocket van de andere komt en er een homodimeer gevormd wordt
o Ook de intracellulaire gedeelten, die een proteïne kinase-domein hebben,
haken bij binding van de 2 monomeren in elkaar
® De extra- en intracellulaire gedeelten zijn verbonden door een
transmembranaire helix
76
-
-
-
o De EGF-receptor behoort tot de familie van de receptor proteïne tyrosine
kinasen en heeft dus zelf proteïne kinase-activiteit à de monomeren
fosforyleren 5 tyrosines op elkaars intracellulaire gedeelte
o Op de fosfaatgroep bindt een growth factor receptor-bound protein 2
(GRb-2) via zijn 𝑆𝐻# -domein, dat Sos-proteïne zal binden via zijn 2
prolinerijke 𝑆𝐻` -domeinen
® SH = sarcoma homology: een geconserveerd domein dat bindt op
fosfotyrosine
® Sos = son of sevenless: een set van genen die coderen voor guaninenucleotide-uitwisselingsfactoren
o Sos-proteïne bindt op Ras (een klein G-proteïne), dat hierdoor geactiveerd
wordt (uitwisseling van GDP door GTP)
® Ras = rat sarcoma
® Dit is het eerste niveau van amplificatie: 2 EGF op de receptoren
produceren vele Ras
3. Secundaire boodschappers:
o Ras bindt aan Raf, wat zorgt voor een conformatieverandering à het
proteïne kinase domein wordt geactiveerd
® Raf = rapidly accelerated fibrosarcoma
o Raf fosforyleert andere proteïne kinasen, nl. de mitose-bevorderende
extracellulaire signaal-regulerende kinasen (MEK)
® Dit is het tweede niveau van amplificatie
4. Respons:
o MEK fosforyleert extracellulair signaal-regulerend kinase (ERK), waardoor
dit actief wordt
® Dit is het derde niveau van amplificatie
o ERK fosforyleert transcriptiefactoren in de kern en proteïne kinasen
® Dit is het vierde niveau van amplificatie
5. Terminatie à 2 manieren:
o Terminatie kan gebeuren mbv. fosfatasen (in dit geval wordt de terminatie
geactiveerd door de signaalcascade zelf):
o Om de tyrosine residu’s van de EGF-receptor en MEK te defosforyleren
is proteïne tyrosine fosfatase nodig
o Om ser- en thr-residu’s van Raf, ERK en MEK te defosforyleren is
proteïne ser, thr fosfatase nodig
o Terminatie kan ook gebeuren door intrinsieke GTPase-activiteit van Ras
® Dit wordt versneld in aanwezigheid van GTPase-activerende proteïnen
® Bij vele types van kanker wordt mutatie in Ras teruggevonden: verlies
aan GTPase activiteit leidt tot permanente Ras-activiteit, wat de
celgroei stimuleert (?)
77
-
-
6. Defecten:
o (Sarcoma) kanker bij kippen: normaal gezien is er een cellulair protooncogen (c-Src: een normaal functionerend proteïne tyrosine kinase)
aanwezig bij kippen, dat een tyr-residu heeft aan het C-einde dat na
fosforylatie bindt met eigen 𝑆𝐻# -domein (hierdoor is het inactief); wanneer
een kip besmet is met het rous sarcoma virus brengt dit virus het viraal Srcproteïne (v-Src: een proteïne tyrosine kinase met 𝑆𝐻# - en 𝑆𝐻` -domeinen)
tot expressie, dat gelijkaardig is aan c-Src maar geen tyr-residu heeft aan
het C-einde à hierdoor is het altijd actief, wat leidt tot ongecontroleerde
celgroei
o Mutatie van Ras-proteïnen: dit leidt tot verlies van GTPase, waardoor Ras
permanent actief is à ongecontroleerde celgroei
o Beschadiging of afwezigheid van tumor-suppressorgenen: sommige
fosfatasen (die nodig zijn voor terminatie) kunnen in dit geval niet gevormd
worden à ongecontroleerde celgroei
Zie lesvideo voor eventuele examenvragen!
15.
Glycolyse en gluconeogenese - deel 2 (H16)
15.1. Regulatie van de glycolyse
-
-
-
Glycolyse heeft een tweeledige rol:
o De afbraak van glucose en vorming van ATP
o Het voorzien van bouwstenen voor biosynthesereacties
® Regulatie is afgesteld op deze 2 aspecten afgesteld
De vrije energieverandering (Δ𝐺) is enkel groot voor stap 1 (hexokinase), stap 3
(fosfofructokinase) en stap 10 (pyruvaat kinase); deze stappen zijn metabolisch
praktisch onomkeerbaar en de enzymen zijn sterk gereguleerd
® Dit zijn de controleplaatsen voor de glycolyse
Voor alle andere stappen ligt Δ𝐺 dicht bij 0 (bijna-evenwicht in cellen); de totale
Δ𝐺 voor de omzetting van glucose naar 2 pyruvaatmoleculen is -90 kJ/mol
De regulatie van deze pathway gebeurt op 3 niveaus:
o Regulatie van de enzymactiviteit door allosterische controle (gebeurt zeer
snel: milliseconden)
o Covalente modificatie, bv. fosforylatie (duurt enkele seconden)
o Transcriptionele controle (duurt enkele uren)
78
15.1.1. Controle van de glycolyse in de spieren
-
De controle van de glycolyse in de spieren gebeurt zodat voldaan wordt aan de
nood voor ATP (wordt voornamelijk aangemaakt om spiercontractie te drijven)
-
Primaire controle is dus de energielading van de cel: de ratio \“•
-
-
-
-
\‘•
® In rust: veel ATP, weinig AMP à inhibitie van de glycolyse; bij oefening:
veel AMP, weinig ATP à stimulatie van de glycolyse
De belangrijkste controle is fosfofructokinase, dat zorgt voor de omzetting van F6P
naar F-1,6-BP
PFK heeft 4 actieve plaatsen en 4 allosterische plaatsen; binding van ATP op de
allosterische plaats vermindert de affiniteit voor F6P,
waardoor er minder fosforylatie zal optreden
® Hogere AMP-concentraties zorgen net voor een
hogere reactiesnelheid
® Een daling van de pH verhoogt de inhibitorische
werking van ATP à op deze manier wordt
spierschade door te hoge niveaus aan protonen
vermeden
Vraag: waarom wordt AMP gebruikt als signaal en niet ADP? à antwoord:
o AMP wordt gevormd in de spieren uit 2 moleculen ADP mbv. het enzym
adenylaat kinase (𝐴𝐷𝑃 + 𝐴𝐷𝑃 → 𝐴𝑇𝑃 + 𝐴𝑀𝑃)
o De pool van ATP, ADP en AMP is constant, met 𝑐\‘• > 𝑐\w• > 𝑐\“• à kleine
veranderingen in ATP-concentratie leiden tot grote veranderingen in AMPconcentratie, zodat de gevoeligheid hoger is
Naast PFK zijn nog 2 reacties irreversibel, nl. hexokinase en pyruvaat kinase
Hexokinase:
o Hexokinase wordt geïnhibeerd door zijn product (glucose-6-fosfaat), zodat
bij hoge concentraties G6P glucose in het bloed blijft
o Inhibitie van fosfofructokinase leidt ook tot inhibitie van hexokinase
o PFK is een belangrijkere controle voor de glycolyse dan hexokinase omdat
G6P in de spieren niet alleen gebruikt wordt in de glycolyse, maar ook voor
de synthese van glycogeen à als de hexokinasereactie gestopt zou
worden, zou ook glycogeensynthese gestopt worden
® G6P is dus niet uniek voor glycolyse; PFK is de eerst irreversibele reactie
die uniek is voor glycolyse
Pyruvaat kinase:
o Pyruvaat kinase regelt de outflow uit de glycolyse: het zorgt voor de
synthese van het laatste product uit de glycolyse (pyruvaat)
o ATP inhibeert pyruvaat kinase allosterisch: vertraagt de glycolyse bij hoge
energielading
o Fructose-1,6-bisfosfaat activeert pyruvaat kinase (dit is een signaal voor een
aankomende hoge flux van intermediairen: feedforward stimulatie)
79
15.1.2. Controle van de glycolyse in de lever
-
-
De lever heeft verschillende functies:
o Behoud van de bloedsuikerspiegel: omzetting tot en stockage van
glycogeen bij hoge glucoseconcentraties en vrijzetting van glucose bij
tekorten
o Gebruik van glucose voor het genereren van reducerende kracht voor
biosyntheses
o Synthese van verschillende biochemische stoffen
® Regulatie is meer complex dan in de spieren
Fosfofructokinase:
o Er is ook regulatie door ATP en lage pH, maar dit is niet zo belangrijk als in
de spieren doordat er weinig plotse veranderingen van ATP zijn en doordat
lactaat normaal niet wordt aangemaakt (wordt eerder omgevormd tot
glucose)
o Glycolyse levert het koolstofskelet voor biosynthesereacties à verhoogde
gehaltes citraat (een indicator van te hoge concentraties aan
biosynthetische precursoren) inhiberen PFK door ATP-inhibitie te
versterken
o Het belangrijkste is de respons van de glycolyse op veranderingen in de
bloedglucoseconcentratie: bij hoge glucoseconcentraties wordt er veel F6P aangemaakt, en uit F-6P wordt (in een reactie gekatalyseerd door
fosfofructokinase 2) het signaalmolecule fructose-2,6-bisfosfaat (F-2,6-BP)
aangemaakt, dat de bloedglucoseconcentratie opvolgt een krachtige
activator is van PFK
® Hoge glucoseconcentraties leiden dus tot hoge F-6Pconcentraties en zo tot hoge F-2,6-BP-concentraties
® F-2,6-BP verhoogt de affiniteit voor F-6P en
vermindert de inhibitorische werking van ATP à
hogere reactiesnelheid
80
-
-
Hexokinase en glucokinase:
o Hexokinase wordt geïnhibeerd door zijn product (glucose-6-fosfaat), net
zoals in de spieren
o Glucokinase is een isozyme van hexokinase, maar wordt niet geïnhibeerd
door G6P à blijft glucose omzetten, ook bij hoge G6P-concentraties
® Glucokinase is enkel werkzaam bij hoge glucoseconcentraties (heeft
een veel lagere affiniteit voor glucose dan hexokinase) en vormt dan
G6P in de lever à wordt gebruikt voor glycogeen-/vetzuursynthese
wanneer glucose overvloedig aanwezig is
® Glucokinase komt ook voor in de 𝛽-cellen van de pancreas; hier leiden
verhoogde niveaus van G6P door glucokinase tot secretie van insuline,
een signaal dat glucose uit het bloed moet gehaald worden voor
stockage als glycogeen of conversie tot vet
Pyruvaat kinase:
o Pyruvaat kinase komt voor in verschillende isozyme vormen in
zoogdierweefsels: L-type in de lever en M-type in de spieren en hersenen
à dit L-type wordt in de lever allosterisch geactiveerd door F-1,6-BP en
geïnhibeerd door ATP (net zoals het M-type in de spieren), maar wordt
daarnaast ook allosterisch geïnhibeerd door alanine
o Het L-type van pyruvaat kinase wordt in de lever ook gereguleerd door de
bloedglucoseconcentratie:
o Bij lage bloedglucoseconcentraties stimuleert glucagon proteïne kinase
A, dat pyruvaat kinase fosforyleert en het omzet tot een minder actieve
vorm à glucose is beschikbaar voor de spieren en hersenen
o Bij hoge bloedglucoseconcentraties wordt pyruvaat kinase door een
fosfatase gedefosforyleerd zodat het voorkomt in een actievere vorm
15.2. Glucose transporters
-
-
Glucose wordt in dierlijke cellen getransporteerd vanuit de bloedbaan door
passief transport met de concentratiegradiënt mee
GLUT is een familie van passieve hexosetransporters die glucosetransport
doorheen het celmembraan vergemakkelijken; deze transporters bestaan uit 12
transmembranaire helices
Glucose is normaal in het bloed aanwezig in concentraties van 4-8 mM
Verschillende transporters:
o GLUT1 en GLUT3 (aanwezig in alle weefsels van zoogdieren) hebben een
𝐾“ van 1 mM à verantwoordelijk voor basale glucose-opname:
transporteren glucose indien het in normale niveaus aanwezig is, maar niet
als de concentratie lager is dan 1 mM
81
o GLUT2 (aanwezig in de lever en 𝛽-cellen van de pancreas) heeft een 𝐾“ van
15-20 mM à kan enkel glucose opnemen als het in hoge concentraties
aanwezig is
® GLUT2 speelt een rol bij de regulatie van insuline
o GLUT4 (aanwezig in de spieren en vetcellen) heeft een 𝐾“ van 5 mM
® Het aantal GLUT4 stijgt snel bij aanwezigheid van insuline
15.3. Kanker en glycolyse
-
-
-
Snelgroeiende kankers bekomen ATP door verhoogde glucose-opname en
glycolyse; ze hebben een aerobe glycolyse, wat betekent dat ze glucose zelfs in
aanwezigheid van zuurstof omzetten tot melkzuur
® Dit wordt het Warburg effect genoemd
Voordelen van aerobe glycolyse voor de tumor:
o Lactaat wordt geproduceerd, wat schade veroorzaakt aan weefsels à
tumorinvasie vergemakkelijkt en het immuunsysteem wordt geïnhibeerd
o G6P is ook een substraat van de pentosefosfaat reactieweg, die
biosynthetische reducerende kracht genereert (NADPH) en samen met de
glycolyse precursoren voor biomoleculen produceert die nodig zijn voor
groei (bv. nucleotiden)
o In snelgroeiende tumoren groeien de tumorcellen sneller dan er
bloedvaten gevormd kunnen worden, wat leidt tot hypoxie (zuurstoftekort)
à aerobe glycolyse reduceert de afhankelijkheid van de cel voor zuurstof
Anaerobe training beïnvloedt de glycolyse op een gelijkaardige manier als kanker:
zorgt voor hypoxie, waardoor de groeifactor HIF-1 wordt geactiveerd, die
bloedvatgroei stimuleert en zorgt voor een verhoogde anaerobe ATP-productie
15.4. Gluconeogenese:
precursoren
-
-
synthese
van
glucose
uit
niet-suiker
Belang van gluconeogenese:
o Behoud van de suikerspiegel is belangrijk: glucose is de primaire
energiebron van de hersenen en de enige energiebron van de rode
bloedcellen
o Glucose is beschikbaar uit lichaamsvloeistoffen (zo’n 20g) en uit glycogeen
(zo’n 190g) maar dit is slechts voldoende voor 1 dag à gluconeogenese is
vooral belangrijk bij langere perioden van vasten of uithongering
Gluconeogenese zet pyruvaat om tot glucose
® Niet-suiker precursoren worden eerst omgezet tot pyruvaat of komen de
pathway binnen bij latere intermediairen zoals oxaalacetaat of DHAP
® De belangrijkste niet-suiker precursoren zijn lactaat, aminozuren en glycerol
82
-
-
-
De belangrijkste plaats voor gluconeogenese is de lever; in mindere mate ook de
nieren
® Weinig in de hersenen en skelet- en hartspier
De gluconeogenese bestaat uit 11 stappen: omzetting van pyruvaat naar
oxaalacetaat gebeurt in 2 keer
Aminozuren kunnen worden opgenomen uit voeding (eiwitten) of verkregen
worden door afbraak van eiwitten in de skeletspieren; er zijn 2 soorten aminozuren:
o Ketogene aminozuren: hieruit kunnen dieren geen glucose maken
o Glucogene aminozuren (bv. glutamaat, aspartaat en alanine): hieruit kunnen
dieren wel glucose maken
® Glutamaat en aspartaat kunnen worden omgezet tot oxaalacetaat;
alanine kan worden omgezet tot pyruvaat
Lactaat wordt geproduceerd in de spieren en kan worden omgezet tot pyruvaat
-
Glycerol wordt verkregen uit de afbraak van triacylglycerolen (aanwezig in
vetcellen) tot glycerol en vetzuren en kan worden omgezet tot DHAP
® Dieren kunnen vetzuren niet converteren tot glucose
-
Gluconeogenese is niet het omgekeerde van glycolyse: er zijn 3 irreversibele
stappen in de glycolyse die bij de gluconeogenese omzeild moeten worden
® De andere stappen zijn wel gemeenschappelijk
® Hierdoor komen bepaalde enzymen die bij de gluconeogenese voorkomen
niet voor bij de glycolyse, nl. pyruvaat carboxylase, fosfoenolpyruvaat
carboxykinase, fructose-1,6-bisfosfatase en glucose-6-fosfatase
Alle enzymen bij de gluconeogenese zijn cytoplasmatisch, behalve pyruvaat
carboxylase (mitochondriën) en glucose-6-fosfatase (ER)
-
83
15.4.1. Conversie van pyruvaat tot fosfoenolpyruvaat
-
Bij de gluconeogenese gebeurt dit in 2 stappen:
o 1. Omzetting van pyruvaat tot oxaalacetaat
o 2. Omzetting van oxaalacetaat tot fosfoenolpyruvaat
15.4.1.1. Stap 1
-
-
-
Stap 1 vindt plaats in de mitochondriën en gebeurt mbv. het enzym pyruvaat
carboxylase
® Dit enzym heeft een covalente prosthetische groep: biotine (een carrier van
geactiveerd 𝐶𝑂# )
® Wordt allosterisch geactiveerd door acetyl CoA
Stap 1 gebeurt eigenlijk in 3 stappen:
o 1. 𝐻𝐶𝑂`g + 𝐴𝑇𝑃 ⇌ 𝐻𝑂𝐶𝑂# − 𝑃𝑂`#g + 𝐴𝐷𝑃 (activatie van 𝐶𝑂# mbv. ATP)
o 2. Biotine-enzym + 𝐻𝑂𝐶𝑂# − 𝑃𝑂`#g ⇌ 𝐶𝑂# -biotine-enzym +𝑃E (binding van
biotine-enzym met geactiveerd 𝐶𝑂# )
o 3. 𝐶𝑂# -biotine-enzym + pyruvaat ⇌ biotine-enzym + oxaalacetaat
(overzetting van 𝐶𝑂# naar pyruvaat)
Pyruvaat carboxylase is een tetrameer: bestaat uit 4 pyruvaat carboxylase-enzymen
en elk monomeer bestaat uit 4 domeinen:
o Biotine carboxylase domein (BC): vormt het carboxyfosfaat (𝐻𝑂𝐶𝑂# − 𝑃𝑂`#g )
en hecht 𝐶𝑂# aan het tweede domein (BCCP)
o Biotine carboxyl carrier proteïne (BCCP): geeft de 𝐶𝑂# door aan het derde
domein (CT) (?)
o Carboxyl transferase domein (CT): geeft de 𝐶𝑂# door aan pyruvaat
o Pyruvaat carboxylase tetramerisatie domein (PT)
84
15.4.1.2. Stap 2
-
-
-
Oxaalacetaat bevindt zich in de mitochondriën en moet dus naar
het cytoplasma getransporteerd worden voor verdere reactie à
wordt eerst tijdelijk omgezet tot appelzuur (malaat) via NADHgekoppeld malaat dehydrogenase, dat dan naar het cytoplasma
gaat en eenmaal in het cytosol opnieuw geoxideerd wordt tot
oxaalacetaat via 𝑁𝐴𝐷1 -gekoppeld malaat dehydrogenase
® De NADH die in de mitochondriën wordt opgenomen komt
dus weer vrij in het cytosol en kan dan gebruikt worden voor
verdere stappen in de gluconeogenese
Oxaalacetaat wordt in het cytosol gedecarboxyleerd en
gefosforyleerd mbv. fosfoenolpyruvaat carboxykinase (PEPCK)
® Dit enzym wordt soms ook fosfoenolpyruvaat carboxylase genoemd
De som van de 2 reacties is 𝑝𝑦𝑟𝑢𝑣𝑎𝑎𝑡 + 𝐴𝑇𝑃 + 𝐺𝑇𝑃 + 𝐻# 𝑂 → 𝑃𝐸𝑃 + 𝐴𝐷𝑃 + 𝐺𝐷𝑃 +
𝑃E + 2𝐻1
PEP wordt in verschillende stappen (omgekeerde van glycolyse) omgezet tot
fructose-1,6-bisfosfaat
15.4.2. Conversie van fructose-1,6-bisfosfaat tot fructose-6fosfaat
-
De omzetting van fructose-1,6-bisfosfaat
gekatalyseerd door fructose-1,6-bisfosfatase
tot
fructose-6-fosfaat
wordt
85
-
Fructose-6-fosfaat wordt in een omkeerbare stap (omgekeerde van glycolyse)
omgezet tot glucose-6-fosfaat
® In de meeste weefsels eindigt de gluconeogense hier: G6P wordt omgezet
naar glycogeen, er is geen export
® In de lever en (minder) in de nier wordt G6P wel omgezet tot glucose, dat
in het bloed wordt vrijgezet voor de bloed-glucose homeostase
® De lever en nier hebben dus 2 functies, nl. opslag van glycogeen en
omzetting van G6P tot glucose
15.4.3. Conversie van glucose-6-fosfaat tot glucose
-
De omzetting van glucose-6-fosfaat tot glucose wordt gekatalyseerd door
glucose-6-fosfatase
Deze reactie gebeurt in het lumen van het endoplasmatisch reticulum: glucose
transporters transporteren G6P van het cytosol naar het lumen van het ER, waar
het bindt aan glucose-6-fosfatase en wordt omgezet tot glucose en 𝑃E ; glucose (en
𝑃E ) worden vervolgens terug naar het cytosol geëxporteerd
15.5. Vergelijking gluconeogenese en glycolyse
-
-
-
Globale reactie gluconeogenese: 2 𝑝𝑦𝑟𝑢𝑣𝑎𝑎𝑡 + 4 𝐴𝑇𝑃 + 2 𝐺𝑇𝑃 + 2 𝑁𝐴𝐷𝐻 +
6 𝐻# 𝑂 → 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑒 + 4 𝐴𝐷𝑃 + 2 𝐺𝐷𝑃 + 6 𝑃E + 2 𝑁𝐴𝐷1 + 2 𝐻1
® Δ𝐺 °o = −48 𝑘𝐽/𝑚𝑜𝑙
Globale reactie van de “omgekeerde” glycolyse (eigenlijk kan de glycolyse niet
omgekeerd
worden):
2 𝑝𝑦𝑟𝑢𝑣𝑎𝑎𝑡 + 2 𝐴𝑇𝑃 + 2 𝑁𝐴𝐷𝐻 + 2 𝐻# 𝑂 → 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑒 +
1
1
2 𝐴𝐷𝑃 + 2 𝑃E + 2 𝑁𝐴𝐷 + 2 𝐻
® Δ𝐺 °o = +90 𝑘𝐽/𝑚𝑜𝑙
De
extra
kost
van
gluconeogenese
is
dus
4
hoge
fosforyltransferpotentiaalmoleculen (ATP/GTP?); deze zijn nodig om ongunstige
reacties in gunstige reacties om te zetten
® Voorbeeld van koppeling van reacties: NTP hydrolyse wordt gebruikt om
ongunstige reacties te bekrachtigen
Zie slide 49 voor eventuele examenvragen!
86
15.6. Regulatie van gluconeogenese en glycolyse
-
-
Glycolyse en gluconeogenese zijn allebei sterk exergonisch en kunnen in principe
gelijktijdig optreden, maar dit zou leiden tot een netto verbruik van 4 NTP’s per
cyclus, wat niet de bedoeling is à de hoeveelheid en activiteit van de enzymen
van beide pathways worden gereguleerd zodat beide pathways niet tegelijkertijd
actief zijn
De glycolysesnelheid wordt ook bepaald door de glucoseconcentratie: de
noodzaak aan energie of bouwstenen
De gluconeogenesesnelheid wordt ook bepaald door de concentraties van nietsuiker precursoren zoals lactaat
15.6.1. Energielading bepaalt of glycolyse/gluconeogenese
meest actief is (lever)
-
-
-
Voor de glycolyse is veel energie nodig, maar weinig bouwstenen
Voor de gluconeogenese zijn voldoende energie en veel bouwstenen aanwezig
De conversie van F6P naar F-1,6-BP (tweede irreversibele reactie in de glycolyse)
wordt gestimuleerd door F-2,6-BP en AMP en geïnhibeerd door ATP, citraat en
𝐻1
De conversie van F-1,6-BP naar F6P (tweede irreversibele reactie in de
gluconeogenese) wordt gestimuleerd door citraat en geïnhibeerd door F-2,6-BP
en AMP
De conversie van PEP naar pyruvaat (derde irreversibele reactie in de glycolyse)
wordt gestimuleerd door F-1,6-BP en geïnhibeerd door ATP en alanine
De conversie van pyruvaat naar PEP (eerste irreversibele reactie in de
gluconeogenese) wordt gestimuleerd door Acetyl CoA en geïnhibeerd door ADP
15.6.2. Balans tussen glycolyse en gluconeogenese in de
lever is gevoelig aan bloedglucoseconcentratie
-
-
Fructose-2,6-bisfosfaat wordt aangemaakt mbv. PFK, een bifunctioneel enzym dat
bestaat uit een kinase domein (fosfofructokinase 2) en een fosfatase domein
(fructose bisfosfatase 2)
F-2,6-BP is een belangrijk signaalmolecule:
o Als de bloedglucoseconcentratie laag is (na een nacht slapen, bij vasten)
wordt het hormoon glucagon aangemaakt, dat proteïne kinase A
stimuleert; hierdoor wordt het kinase domein van PFK inactief terwijl het
fosfatase domein geactiveerd wordt, zodat F-2,6-BP gedefosforyleerd
wordt tot F6P à geen PFK-stimulatie à inhibitie van de glycolyse en
stimulatie van de gluconeogenese à bloedglucoseconcentratie stijgt
87
o Als de bloedglucoseconcentratie hoog is (na een maaltijd) wordt het
hormoon insuline aangemaakt, dat fosfoproteïne fosfatase stimuleert;
hierdoor wordt het fosfatase domein van PFK inactief terwijl het kinase
domein geactiveerd wordt, zodat F6P gefosforyleerd wordt tot F-2,6-BP à
PFK-stimulatie à stimulatie van de glycolyse en inhibitie van de
gluconeogenese à bloedglucoseconcentratie daalt
15.6.3. Substraatcycli amplificeren metabole signalen en
produceren hitte
-
-
-
-
-
Voorbeeld van een substraatcyclus: fosforylatie van F6P tot F-1,6-BP (glycolyse) VS
hydrolyse van F-1,6-BP tot F6P (gluconeogenese)
De 2 reacties in een cyclus kunnen niet tegelijkertijd volledig actief zijn wegens
allosterische controle; toch is er altijd een gelimiteerde hoeveelheid cycling
® Vroeger werd dit aanzien als een imperfectie, maar tegenwoordig wordt
het aanzien als metabolisch belangrijk
Stel: een conversie van A naar B met initiële conversiesnelheid 100 en tegelijkertijd
conversie van B naar A met initiële conversiesnelheid 90
® De netto flux van B is dan 10
Stel dat dan door allosterische controle de heenreactie 20% sneller gaat en de
terugreactie 20% trager à de conversiesnelheden worden dan respectievelijk 120
en 72 en de netto flux verandert van 10 naar 48
® Een verandering van de reactiesnelheden met 20% leidt dus tot een
fluxstijging van 380%
De flux in glycolyse stijgt 1000-voudig bij de start van een intensieve training; dit
is deels te verklaren door substraatcycli
De Cori cyclus: gebruik van lactaat en alanine:
o Melkzuur wordt gevormd in skeletspieren of erythrocyten (rode
bloedcellen); dit is een eindpuntmetaboliet
en moet dus getransporteerd worden à
transport van lactaat via het bloed naar de
lever, waar het door lactaat dehydrogenase
terug wordt omgezet tot pyruvaat en
daarna tot glucose, dat vrijgezet wordt
o Alanine wordt gevormd in de spieren door
gebruik van aminozuren als energiebron: de aminogroep van deze
aminozuren wordt getransfereerd naar pyruvaat (à vorming van alanine)
88
-
Pathwayintegratie gedurende sprint:
o De spiercellen moeten sterk beginnen contraheren en hebben dus veel
energie nodig à glucose en glycogeen worden omgezet tot pyruvaat, dat
vervolgens (voornamelijk) wordt omgezet tot lactaat
o Lactaat komt in het bloed en wordt naar de levercellen getransporteerd,
waar het mbv. lacaat dehydrogenase wordt omgezet tot pyruvaat, dat dan
in de gluconeogenese wordt omgevormd tot glucose
® Tegelijkertijd kunnen de levercellen ook glucose aanmaken uit
aminozuren, glycerol en glycogeen
o Het gesynthetiseerde glucose wordt vrijgesteld in de bloedbaan en kan
dan worden opgenomen in de hartspiercellen, die het omzetten tot 𝐶𝑂#
(werken aeroob); naast glucose kunnen de hartspiercellen ook pyruvaat en
lactaat (à pyruvaat) uit de bloedbaan opnemen en dit ook omzetten tot
𝐶𝑂#
15.6.4. Evolutie
-
-
In de vroege biosfeer was er anaerobe vorming van energie (zuurstof ontstond 2
miljard jaar geleden); glycolyse kan ook in deze omstandigheden optreden en er
evolueerden glycolytische enzymen
® Er waren 4 kinases en 2 isomerases, die geen verwantschap vertoonden à
waren onafhankelijk geëvolueerd
Verwantschap tussen glycolyse en gluconeogenese:
o Glycolyse (metabolisme van hexoses): verschillend in sommige soorten,
afwezig in sommige Archae
o Glycolyse (metabolisme van trioses): de enzymen zijn goed geconserveerd
en 4 enzymen zijn zelfs aanwezig in alle soorten; deze reacties zijn
gemeenschappelijk tussen glycolyse en gluconeogenese en dit is mogelijk
het oudste deel
16.
Citroenzuurcyclus (H17)
Inleiding
-
De citroenzuurcyclus (ook TCA-cyclus of Krebs cyclus) is een amfibole reactieweg
(zowel katabool als anabool)
De cyclus is de finale gemeenschappelijke pathway voor de oxidatie van suikers,
lipiden en aminozuren
Intermediairen van deze cyclus (bv. aminozuren, nucleotidebasen, oxaalacetaat)
zijn startpunten voor vele biosynthese reacties
Enzymen van deze cyclus bevinden zich in de mitochondriën (bij eukaryoten) of
in het cytosol (bij bacteriën)
89
16.1. Het pyruvaatdehydrogenasecomplex koppelt de glycolyse aan
de citroenzuurcyclus
-
-
-
-
-
-
Pyruvaat uit de glycolyse wordt uit het cytosol getransporteerd naar de
mitochondriën via een specifieke transporter en in de mitochondriale matrix
omgezet tot acetyl CoA mbv. het pyruvaatdehydrogenase complex
® Deze omzetting van pyruvaat tot acetyl CoA is een oxidatieve
decarboxylatie
® Dit gebeurt onder aerobe condities
Globale reactie: 𝑝𝑦𝑟𝑢𝑣𝑎𝑎𝑡 + 𝐶𝑜𝐴 + 𝑁𝐴𝐷1 → 𝑎𝑐𝑒𝑡𝑦𝑙 𝐶𝑜𝐴 + 𝐶𝑂# + 𝑁𝐴𝐷𝐻 + 𝐻1
® NADH wordt later nog gebruikt
Het pyruvaatdehydrogenase complex is een multi-enzym complex: bestaat uit 3
enzymen, nl. een pyruvaat dehydrogenase component (E1), een dihydrolipoyl
transacetylase component (E2) en een dihydrolipoyl dehydrogenase component
(E3)
® Elk van deze enzymen heeft een prosthetische groep: respectievelijk TPP
(thiamine pyrofosfaat), lipoamide en FAD
® Er zijn ook nog 2 stoichiometrische cofactoren: CoA en 𝑁𝐴𝐷1
E1 en E2 zijn nodig voor de omzetting tot Acetyl CoA (eerste 3 stappen), E3
katalyseert de regeneratie van lipoamide (vierde stap)
Stap 1 (decarboxylatie van pyruvaat):
o TPP heeft een H-atoom tussen N en S dat veel zuurder is dan de
meeste CH-groepen à dit H-atoom kan worden vrijgezet zodat TPP
wordt omgezet tot een carbanion van TPP
o Het carbanion van TPP kan in een additiereactie gekoppeld worden
met pyruvaat ter vorming van hydroxyethyl-TPP; hierbij wordt 𝐶𝑂#
vrijgezet
® Dit is de snelheidsbepalende stap in de biosynthese van acetyl CoA
Stap 2 (oxidatie en transfer van acetyl naar lipoamide): de geïoniseerde vorm
van hydroxyethyl-TPP bindt met lipoamide ter vorming van acetyllipoamide;
hierbij komt het carbanion van TPP weer vrij
Stap 3 (transfer van acetyl naar co-enzym A): acetyllipoamide bindt met coenzym A ter vorming van acetyl CoA; hierbij komt dihydrolipoamide vrij
90
-
-
-
Stap 4 (regeneratie van lipoamide):
o E3 is een flavoproteïne: een eiwit geassocieerd met FAD of FMN
o Via FAD neemt E3 2 elektronen op, waardoor de disulfidebrug in lipoamide
hersteld wordt; hierbij wordt 𝐹𝐴𝐷𝐻# gevormd
o 𝐹𝐴𝐷𝐻# geeft zijn elektronen door aan 𝑁𝐴𝐷1 à vorming van FAD, NADH
en 𝐻1
® Dit is een ongebruikelijke reactie: normaal geeft NADH elektronen aan
FAD omdat de elektrontransferpotentiaal van FAD normaal lager is dan
die van NADH, maar in dit geval is de elektrontransferpotentiaal
verhoogd door de chemische omgeving
Structuur pyruvaatdehydrogenase complex:
o De kern bestaat uit een holle kubus van E2-eiwitten met elk een lipoamide
arm
o Rond de kern is een omhulsel van E1 en E3
De 4 stappen moeten schematisch gekend zijn
(zoals op de afbeelding)
Structurele
integratie
maakt
de
gecoördineerde katalyse van een complexe
reactie
mogelijk;
nabijheid
van
de
verschillende enzymen:
o Verhoogt de reactiesnelheid
o Minimaliseert de kans tot ongewenste
zijreacties: alle intermediairen blijven
gebonden tijdens de reacties
16.2. De citroenzuurcyclus bestaat uit 8 reacties
16.2.1. Reactie 1: synthese van citraat
-
-
Citraat (= citroenzuur) wordt gevormd uit acetyl CoA en oxaalacetaat via citryl CoA
(een thioester intermediair)
® Citraat is een C6-molecule
Deze reactie wordt gekatalyseerd door citraatsynthase
De hydrolysestap drijft de reactie
91
-
Een ongewenste nevenreactie die kan optreden is de hydrolyse van acetyl CoA;
dit wordt voorkomen doordat katalytische residu’s voor de hydrolyse van
thioesters pas goed geplaatst zijn nadat citryl CoA gevormd is
16.2.2. Reactie 2: isomerisatie van citraat tot isocitraat
-
De OH-groep van citraat is niet optimaal gelokaliseerd voor decarboxylatie à
wordt verplaatst
Eerst is er eliminatie van 𝐻# 𝑂 van citroenzuur ter vorming van cis-aconitaat; daarna
is er specifieke additie van 𝐻# 𝑂 op cis-aconitaat ter vorming van isocitraat
Deze stappen worden allebei gekatalyseerd door aconitase
® Aconitase is een ijzer-zwavel-proteïne of nietheem-ijzer-proteïne; het bezit
een 4Fe-4S-cluster
16.2.3. Reactie 3: oxidatie en decarboxylatie van isocitraat tot
𝛼-ketoglutaraat
-
-
Deze reactie is metabolisch irreversibel
Dit is de eerste van de 4 oxidoreductiereacties in de citroenzuurcyclus
Het hydride-ion van C2 van isocitraat wordt getransfereerd naar 𝑁𝐴𝐷1 (à NADH)
ter vorming van oxalosuccinaat; oxalosuccinaat is onstabiel en wordt snel
gedecarboxyleerd tot 𝛼-ketoglutaraat
Deze reactie wordt gekatalyseerd door isocitraatdehydrogenase
92
16.2.4. Reactie 4: oxidatieve decarboxylatie
ketoglutaraat tot succinyl co-enzym A
-
van
𝛼-
Dit is de tweede oxidatieve decarboxylatiereactie
Deze reactie wordt gekatalyseerd door het 𝛼-ketoglutaraat dehydrogenase
complex, dat net zoals het pyruvaat dehydrogenase complex uit 3 enzymen
bestaat:
o E1: 𝛼-ketoglutaraat dehydrogenase (met TPP)
o E2: succinyltransferase (met lipoamide)
o E3: dihydrolipoyl dehydrogenase (met FAD)
® Dit is hetzelfde als de E3 in het pyruvaat dehydrogenase complex
16.2.5. Reactie 5: vorming van succinaat uit succinyl CoA
-
Succinyl CoA heeft een energierijke thioesterbinding; de vrije energie hierin
(Δ𝐺 °o = −30,5 𝑘𝐽/𝑚𝑜𝑙) wordt meestal opgeslagen als ATP
Dit is de enige reactie in de citroenzuurcyclus waarbij ATP rechtstreeks gevormd
wordt
De reactie is reversibel
Deze reactie wordt gekatalyseerd door succinyl CoA synthetase
16.2.6. Reactie 6: vorming van fumaraat uit succinaat
93
-
-
-
Succinaat moet weer worden omgezet naar het oorspronkelijke C4-molecule
(oxaalacetaat); dit gebeurt in 3 reacties, nl. een oxidatie, een hydratatie en weer
een oxidatie
In de eerste reactie wordt succinaat geoxideerd tot fumaraat; deze reactie is
stereospecifiek (alleen het trans-isomeer wordt gevormd)
Deze reactie wordt gekatalyseerd door succinaatdehydrogenase
® Dit enzym zit als enige ingebed in het binnenste membraan van
mitochondriën (de andere componenten komen voor in de matrix) à
directe associatie met de elektrontransportketen
® Succinaatdehydrogenase bezit verschillende Fe-S-clusters
FAD neemt 2 elektronen op en wordt 𝐹𝐴𝐷𝐻# ; dit moet weer worden omgezet naar
FAD en dat gebeurt via de Fe-S-clusters, die de elektronen van 𝐹𝐴𝐷𝐻#
rechtstreeks naar co-enzym Q brengen
16.2.7. Reactie 7: vorming van L-malaat uit fumaraat
-
-
In de tweede reactie wordt fumaraat gehydrateerd tot malaat; deze reactie is
stereospecifiek (trans-additie van 𝐻1 en 𝑂𝐻g aan de dubbele binding van fumaraat
ter vorming van L-malaat)
Deze reactie wordt gekatalyseerd door fumarase
16.2.8. Reactie 8: vorming van oxaalacetaat uit malaat
-
In de derde reactie wordt malaat geoxideerd tot oxaalacetaat
Deze reactie wordt gekatalyseerd door malaatdehydrogenase
De standaard vrije energie is significant positief (Δ𝐺 °o = 29,7 𝑘𝐽/𝑚𝑜𝑙), maar de
reactie kan toch opgaan doordat oxaalacetaat verder wordt gebruikt door de
citroenzuurcyclus en NADH door de elektrontransportketen, waardoor Δ𝐺
uiteindelijk toch negatief is
94
16.2.9. Algemeen
-
De nettoreactie van de citroenzuurcyclus is 𝑎𝑐𝑒𝑡𝑦𝑙 𝐶𝑜𝐴 + 3 𝑁𝐴𝐷1 + 𝐹𝐴𝐷 + 𝐴𝐷𝑃 +
𝑃E + 2 𝐻# 𝑂 → 2 𝐶𝑂# + 3 𝑁𝐴𝐷𝐻 + 𝐹𝐴𝐷𝐻# + 𝐴𝑇𝑃 + 2 𝐻1 + 𝐶𝑜𝐴
® Belangrijk!
-
De citroenzuurcyclus vindt enkel plaats onder aerobe omstandigheden
Stoichiometrie van de citroenzuurcyclus:
o Voor elke acetyl CoA die de citroenzuurcyclus binnenkomt:
o Worden 2 moleculen 𝐶𝑂# vrijgezet
o Worden 3 moleculen 𝑁𝐴𝐷1 en 1 molecule FAD gereduceerd
o Wordt 1 molecule ADP (of GDP) gefosforyleerd
o Worden 2 moleculen 𝐻# 𝑂 verbruikt
o Oxidatie van elke NADH levert ongeveer 2,5 ATP en oxidatie van elke
𝐹𝐴𝐷𝐻# levert ongeveer 1,5 ATP à volledige oxidatie van 1 acetyl CoA
levert dus ongeveer 10 ATP
16.3. Regulatie van de citroenzuurcyclus en metabolisme
16.3.1. Regulatie van pyruvaat dehydrogenase
-
-
De aanvoer van acetyl CoA wordt gecontroleerd door regulatie van het pyruvaat
dehydrogenase complex
® De decarboxylatie van pyruvaat tot acetyl CoA door pyruvaat
dehydrogenase is irreversibel in dieren
® Dit is een belangrijk controlepunt in metabolisme: strikte controle van
enzymatische activiteit
PDH wordt gereguleerd door allosterische modulatoren:
o Een hoge concentratie van acetyl CoA remt E2
o Een hoge concentratie van NADH remt E3
95
-
-
-
-
PDH wordt ook gereguleerd door covalente reversibele modificatie van E1 (dit is
de belangrijkste vorm van regulatie in eukaryoten):
o De pyruvaat dehydrogenase component is actief in niet-gefosforyleerde
toestand en inactief in gefosforyleerde toestand
o Het enzym pyruvaat dehydrogenase kinase I kan actief PDH fosforyleren
zodat het inactief wordt
o Het enzym pyruvaat dehydrogenase fosfatase kan inactief PDH
defosforyleren zodat het actief wordt
Spieren in rust:
o Er is veel energie: veel NADH, ATP, acetyl CoA
o NADH, ATP en acetyl CoA activeren pyruvaat dehydrogenase kinase I,
waardoor PDH inactief is
Spieren in beweging:
o Er is veel ADP
o ADP en pyruvaat inhiberen pyruvaat dehydrogenase kinase I, waardoor
PDH actief is
o 𝐶𝑎#1 (vrijgezet bij spiercontractie) activeert pyruvaat dehydrogenase
fosfatase, wat er ook voor zorgt dat PDH actief is
Bij personen met fosfatase deficiëntie is PDH inactief à glucose wordt omgezet
tot pyruvaat, maar pyruvaat kan niet worden omgezet tot acetyl CoA, enkel tot
lactaat à dit leidt tot melkzuur acidose (hoge bloedwaarden van lactaat)
® Gevolg: slecht functioneren van weefsels, in het bijzonder het centraal
zenuwstelsel
® Mensen met deze aandoening mogen geen suikers eten
16.3.2. Regulatie van de citroenzuurcyclus
-
-
-
-
Omzetting van isocitraat tot 𝛼-ketoglutaraat mbv. isocitraatdehydrogenase:
o Inhibitie door ATP en NADH
o Stimulatie door ADP
Omzetting van 𝛼-ketoglutaraat tot succinyl CoA mbv. 𝛼-ketoglutaraat
dehydrogenase: inhibitie door ATP, succinyl CoA en NADH
® Dit is de snelheidsbepalende stap van de citroenzuurcyclus
Inhibitie van isocitraatdehydrogenase leidt tot accumulatie van isocitraat à
isocitraat wordt vanuit de mitochondriën getransporteerd naar het cytosol, waar
het fosfofructokinase en zo ook de glycolyse inhibeert
Accumulatie van 𝛼-ketoglutaraat kan gebruikt worden voor de biosynthese van
aminozuren en purines
96
16.4. De citroenzuurcyclus
precursoren
-
-
-
is
een
bron
van
biosynthetische
De citroenzuurcyclus is niet alleen belangrijk voor de synthese van energie, maar
ook voor de synthese van biosynthetische precursoren
Biosynthetische precursoren:
o Citraat: kan getransporteerd worden naar het cytoplasma en hier zorgen
voor vetzuursynthese
o 𝛼-ketoglutaraat: kan worden omgevormd tot glutamaat, dat vervolgens
voor de synthese van andere aminozuren en purines kan zorgen
o Succinyl CoA: kan gebruikt worden voor de synthese van porfyrines,
chlorofyl…
o Oxaalacetaat: kan worden omgezet tot asparaat, dat vervolgens gebruikt
kan worden voor de vorming van andere aminozuren, purines en
pyrimidines
® Oxaalacetaat kan ook worden omgezet tot glucose
Wanneer intermediairen van de citroenzuurcyclus verder reageren tot suikers,
lipiden, aminozuren… wordt de citroenzuurcyclus onderbroken à anaplerotische
reacties vullen de “pool” van intermediairen in de cyclus weer aan
® Een voorbeeld van een anaplerotische reactie is de omzetting van pyruvaat
tot oxaalacetaat of de omzetting van glutamaat tot 𝛼-ketoglutaraat
® Bij hoge energielading gaat oxaalacetaat naar de gluconeogenese, bij lage
energielading gaat oxaalacetaat naar de citroenzuurcyclus
Zie slides voor aandoeningen
16.5. De glyoxylzuurcyclus laat bacteriën en planten toe te groeien
op acetaat
-
-
De glyoxylzuurcyclus is een reactieweg voor de
vorming van glucose uit niet-koolhydraat
precursoren (vetten)
® Dit komt enkel voor bij planten, bacteriën
en gist (niet bij zoogdieren): de meeste
organismen kunnen acetyl CoA niet
converteren tot glucose
® Komt bv. veel voor bij planten met olierijke
zaden (zonnebloemen, komkommer…)
De glyoxylaatcyclus vertrekt van 2C-fragmenten,
bv. acetyl CoA, en zet deze om tot oxaalacetaat,
dat vervolgens in de gluconeogense kan worden
omgezet tot glucose; er komt ook succinaat vrij,
dat ook kan worden omgezet tot oxaalacetaat en dan tot glucose (?)
97
-
Deze cyclus treedt op in glyoxosomen in planten
Nettoreactie: 2 𝑎𝑐𝑒𝑡𝑦𝑙 𝐶𝑜𝐴 + 𝑁𝐴𝐷1 + 2 𝐻# 𝑂 → 𝑠𝑢𝑐𝑐𝑖𝑛𝑎𝑎𝑡 + 2 𝐶𝑜𝐴 + 𝑁𝐴𝐷𝐻 + 3 𝐻1
16.6. Aminozuurafbraak en vetzuurafbraak (H23 en H22)
16.6.1. Aminozuurafbraak
-
-
-
-
Cellulaire eiwitten (die we niet meer nodig hebben of die beschadigd zijn) en
eiwitten uit voeding worden afgebroken tot aminozuren en oligopeptides
(meerdere aminozuren die nog aan elkaar hangen); deze oligopeptides kunnen
vervolgens door peptidasen ook verder worden afgebroken tot aminozuren
De aminozuren komen in de bloedbaan terecht en kunnen gebruikt worden als
bouwstenen, maar ook (indien een overschot aan aminozuren) als energiebron
® In tegenstelling tot suikers en vetten kunnen aminozuren niet worden
gestockeerd à als er te veel aminozuren zijn, worden deze afgebroken (à
energie)
Afbraak van aminozuren (gebeurt voornamelijk in de lever):
o 1. De 𝛼-aminogroep van vele aminozuren wordt door een transaminase
getransfereerd naar 𝛼-ketoglutaraat, ter vorming van glutamaat (bv.
𝑎𝑙𝑎𝑛𝑖𝑛𝑒 + 𝛼-𝑘𝑒𝑡𝑜𝑔𝑙𝑢𝑡𝑎𝑟𝑎𝑎𝑡 ⇌ 𝑝𝑦𝑟𝑢𝑣𝑎𝑎𝑡 + 𝑔𝑙𝑢𝑡𝑎𝑚𝑎𝑎𝑡 of 𝑎𝑠𝑝𝑎𝑟𝑎𝑎𝑡 + 𝛼𝑘𝑒𝑡𝑜𝑔𝑙𝑢𝑡𝑎𝑟𝑎𝑎𝑡 ⇌ 𝑜𝑥𝑎𝑎𝑙𝑎𝑐𝑒𝑡𝑎𝑎𝑡 + 𝑔𝑙𝑢𝑡𝑎𝑚𝑎𝑎𝑡)
o 2. Glutamaat wordt oxidatief gedeamineerd (à wordt terug 𝛼ketoglutaraat), ter vorming van ammonium
® In de meeste landvertebraten wordt ammonium omgezet tot ureum,
dat vervolgens verwijderd wordt door excretie
Globaal hebben we dus 𝛼-𝑎𝑚𝑖𝑛𝑜𝑧𝑢𝑢𝑟 + 𝑁𝐴𝐷1 + 𝐻# 𝑂 ⇌ 𝛼-𝑘𝑒𝑡𝑜𝑧𝑢𝑢𝑟 + 𝑁𝐴𝐷𝐻 +
𝐻1 , met als 𝛼-aminozuur ofwel alanine, ofwel asparaat, ofwel glutamaat
Aminozuren kunnen dus afgebroken worden tot intermediairen van de
citroenzuurcyclus, die vervolgens kunnen worden omgevormd tot glucose
® Dit geldt voor glucogene aminozuren; ketogene aminozuren (leucine,
lysine) kunnen niet worden omgezet tot glucose
98
16.6.2.Vetzuurafbraak
-
-
-
-
-
Vetzuren hebben 4 fysiologische functies:
o Vetzuren zijn energiemoleculen: worden gestockeerd als triacylglycerolen
(neutrale vetten of triglyceriden) in vetcellen
o Vetzuren zijn bouwstenen van fosfolipiden en glycolipiden
o Vetzuren zorgen voor covalente modificatie van eiwitten
o Vetzuurafgeleiden doen dienst als hormonen en intracellulaire
signaalmoleculen
Gedurende rust en matige inspanning zijn vetzuren de belangrijkste energiebron
® Vetzuren bevatten ongeveer 9 kcal/g (suikers en aminozuren 4 kcal/g) +
vetzuren zijn niet-polair binden praktisch geen water (suikers binden 2 g
water per gram glycogeen) à 1 g gehydrateerd vet stockeert 6,75 keer
meer energie dan 1 g gehydrateerd suiker
® Glucose en glycogeen zorgen voor onderhoud van fysiologische functies
gedurende slechts 24 uur; triacylglycerolen gedurende verschillende weken
Triacylglycerolen moeten worden afgebroken om energie vrij te zetten à afbraak
tot glycerol en vrije vetzuren gebeurt in vetweefsel mbv. lipase, waarna glycerol
en de vrije vetzuren via het bloed worden getransporteerd naar energievereisende
weefsels
® Voor dit transport worden ze gebonden aan albumine
Glycerol gaat naar de lever en kan hier ofwel gebruikt worden in de glycolyse (à
pyruvaat) ofwel in de gluconeogenese (à glucose); de vrije vetzuren gaan naar
andere weefsels en worden hier geactiveerd en getransporteerd naar de
mitochondria, waar ze worden afgebroken tot acetyl CoA, dat in de
citroenzuurcyclus gebruikt wordt (à 𝐶𝑂# , 𝐻# 𝑂)
Afbraak van glycerol: zie eerder
Activatie en afbraak van vetzuren:
o De vetzuren worden eerst geactiveerd door acyl CoA synthetase, een
enzym dat zich in het buitenste mitochondriale membraan bevindt
o Na activatie worden de vetzuren opgenomen doorheen de membranen en
verder geoxideerd in de mitochondriale matrix; deze reactieweg wordt de
𝛽-oxidatie reactieweg genoemd en bestaat uit 4 stappen (vergelijkbaar met
de dehydrogenatie van succinaat):
o 1. Oxidatie
o 2. Stereospecifieke hydratatie
o 3. Oxidatie
o 4. Thiolyse
® Zie slides voor meer details!
® De opbrengst is 6,625 ATP/C à meer dan de afbraak van glucose
99
-
Acetyl CoA, verkregen uit vetzuurafbraak, kan wel enkel de citroenzuurcyclus in
komen als er oxaalacetaat aanwezig is, dat bv. uit de afbraak van glucose bekomen
kan worden à acetyl CoA kan enkel de cyclus in komen als vet- en suikerafbraak
gebalanceerd zijn
16.6.2.1. Ketonlichamen worden gevormd uit acetyl CoA
wanneer vetafbraak domineert
-
-
Bij vasten of diabetes wordt oxaalacetaat voornamelijk gebruikt voor de aanmaak
van glucose door gluconeogense à oxaalacetaat is niet/weinig beschikbaar voor
vetzuuroxidatie à acetyl CoA komt niet de citroenzuurcyclus binnen maar wordt
omgevormd tot acetoacetaat en 3-hydroxybutyraat
® Dit zijn ketonlichamen
Acetoacetaat en 3-hydroxybutyraat kunnen diffunderen in het bloed en gebruikt
worden als energiebron door hart en nieren (en hersenen bij uithongering)
16.6.2.2. Hoge
niveaus
levensbedreigend zijn
-
-
van
ketonlichamen
kunnen
Ketosis bij insuline-afhankelijke diabetes:
o Mensen met insuline-afhankelijke diabaets kunnen geen insuline aanmaken
à de lever absorbeert geen glucose en kan bijgevolg geen oxaalazijnzuur
aanmaken voor de afbraak van vetzuren, maar vetcellen blijven wel vetzuren
vrijzetten in het bloed, die dan worden opgenomen door de lever voor de
aanmaak van ketonlichamen
o Een overvloed aan ketonlichamen in het bloed leidt tot sterke acidosis
(verlagen van de bloed-pH), wat levensbedreigend is
Ketogeen dieet:
o Helpt bij kinderen met drug-resistente epilepsie
o Een dieet (rijk in vet en arm in suiker, en met voldoende eiwitten) dat de
vorming van ketonlichamen promoot
o Het lichaam komt in uithongeringsmodus à vetten en ketonlichamen
worden de belangrijkste energiebron
100
17.
Oxidatieve fosforylatie (H18)
Inleiding
-
-
Belang van oxidatieve fosforylatie: een man van 70 kg heeft zo’n 8400 kJ of 2000
kcal per dag nodig, wat overeenkomt met de energie uit 83 kg ATP; in een lichaam
is slechts 250 g ATP aanwezig à elk ATP-molecule wordt zo’n 300 keer per dag
gerecylceerd en dit gebeurt voornamelijk door oxidatieve fosforylatie
Samenvatting oxidatieve fosforylatie:
o Elektronen stromen van NADH of 𝐹𝐴𝐷𝐻# (gevormd in de citroenzuurcyclus)
naar zuurstof
o 4
grote
eitwitcomplexen
vormen
de
ademhalingsketen
of
elektronentransportketen
]
o 𝑁𝐴𝐷𝐻 + # 𝑂# + 𝐻1 → 𝐻# 𝑂 + 𝑁𝐴𝐷1 met Δ𝐺 °o = −220,1 𝑘𝐽/𝑚𝑜𝑙; 𝐴𝐷𝑃 + 𝑃E +
-
-
-
𝐻1 → 𝐴𝑇𝑃 + 𝐻# 𝑂 met Δ𝐺 °o = +30,5 𝑘𝐽/𝑚𝑜𝑙 à in principe kan uit 1 mol
NADH ongeveer 7 mol ATP geproduceerd worden
o De reacties worden gekoppeld via een protonengradiënt
De citroenzuurcyclus en oxidatieve fosforylatie vormen samen de cellulaire
ademhaling
De gereduceerde co-enzymen NADH en 𝐹𝐴𝐷𝐻# komen van:
o Aerobe oxidatie van pyruvaat in de ciroenzuurcyclus
o Oxidatie van vetzuren en aminozuren
Oxidatieve fosforylatie is het proces waarbij NADH en 𝐹𝐴𝐷𝐻# worden geoxideerd
en ATP wordt gevormd; beide processen zijn gekoppeld door protonfluxen
De elektronentransportketen (ETC) is een opeenvolging van enzymcomplexen
ingebed in het binnenste membraan van mitochondriën, waar oxidatie gebeurt
van NADH en 𝐹𝐴𝐷𝐻# ; oxidatie-energie wordt gebruikt om protonen te
transporteren met vorming van een protonengradiënt
ATP-synthase gebruikt de energie van de protonengradiënt om ATP te
produceren
17.1. Oxidatieve fosforylatie vindt plaats in mitochondriën
-
-
-
Mitochondriën zijn ontstaan uit een symbiotische relatie: een grote bacterie heeft
een kleinere bacterie opgenomen en deze twee zijn samen blijven bestaan en
verder geëvolueerd
® Voornaamste voordeel aan deze relatie: oxidatieve fosforylatie
Mitochondriën zijn semi-autonome organellen: hebben hun eigen DNA, maar er
zijn ook veel mitochondriale proteïnen die worden gecodeerd door nucleair DNA
à mitochondriën zijn wel afhankelijk van de gastheercel (en de gastheercel is ook
afhankelijk van mitochondriën voor energievoorziening)
Mitochondriën hebben 2 membranen: een buiten- en een binnenmembraan
101
-
-
Buitenmembraan:
o Permeabel
o Bevat veel kopieën van mitochondriaal porine (VDAC of voltage-dependent
anion channel)
o Speelt een rol in de gereguleerde flux van metabolieten (vooral anionen
zoals fosfaat, chloride, organische anionen…)
Binnenmembraan:
o Impermeabel voor bijna alle ionen en polaire moleculen
o Betrokken bij de elektronentransportketen en ATP-syntahse
o Bevat een grote familie van transporters voor o.a. ATP, pyruvaat en citraat
o De matrix-zijde is negatief geladen, de cytoplasmatische zijde positief
o Cristae verhogen het oppervlak van het binnenmembraan
17.2. Oxidatieve fosforylatie is afhankelijk van elektronentransfer
-
De elektrontransferpotentiaal 𝐸co is een redoxpotentiaal die de neiging weergeeft
van een molecule om elektronen op te nemen of af te staan
Redoxpotentiaal:
]
o Stel de reactie is 𝑋 g + 𝐻1 → 𝑋 + # 𝐻# ; de halfreacties
]
-
-
zijn dan 𝑋 g → 𝑋 + 𝑒 g en 𝐻1 + 𝑒 g → # 𝐻#
o We hebben 2 halfcellen (een halfcel met het koppel
𝑋/𝑋 g en een referentie-halfcel met het koppel
𝐻1 /𝐻# ) die verbonden zijn door een zoutbrug
o De reductiepotentiaal van 𝐻1 /𝐻# is 0 en de
reductiepotentiaal van 𝑋/𝑋 g is negatief à elektronen
stromen van de 𝑋/𝑋 g -halfcel naar de 𝐻1 /𝐻# -halfcel
o Een sterk reducerend agens zoals NADH of 𝐹𝐴𝐷𝐻# heeft een negatieve
redoxpotentiaal à geeft elektronen af
o Een sterk oxiderend agens zoals zuurstof heeft een positieve
redoxpotentiaal à neemt elektronen op
o Het verschil in redoxpotentiaal is belangrijk voor de reactie
Te kennen halfreacties:
o 𝑁𝐴𝐷1 + 2 𝑒 g → 𝑁𝐴𝐷𝐻 + 𝐻1
o 𝐹𝐴𝐷 + 2 𝑒 g → 𝐹𝐴𝐷𝐻#
o 𝐶𝑦𝑡𝑜𝑐ℎ𝑟𝑜𝑜𝑚 𝑏 (+𝐼𝐼𝐼) + 𝑒 g → 𝑐𝑦𝑡𝑜𝑐ℎ𝑟𝑜𝑜𝑚 𝑏 (+𝐼𝐼)
o 𝑈𝑏𝑖𝑞𝑢𝑖𝑛𝑜𝑛𝑒 (𝑔𝑒𝑜𝑥𝑖𝑑𝑒𝑒𝑟𝑑) + 2 𝑒 g → 𝑢𝑏𝑖𝑞𝑢𝑖𝑛𝑜𝑛𝑒 (𝑔𝑒𝑟𝑒𝑑𝑢𝑐𝑒𝑒𝑟𝑑)
o 𝐶𝑦𝑡𝑜𝑐ℎ𝑟𝑜𝑜𝑚 𝑐 (+𝐼𝐼𝐼) + 𝑒 g → 𝑐𝑦𝑡𝑜𝑐ℎ𝑟𝑜𝑜𝑚 𝑐 (+𝐼𝐼)
o 𝐹𝑒 `1 + 𝑒 g → 𝐹𝑒 #1
]
o # 𝑂# + 2 𝐻1 + 2 𝑒 g → 𝐻# 𝑂
De redoxpotentiaal 𝐸co is gerelateerd met de verandering in standaard vrije
energie door Δ𝐺 °o = −𝑛𝐹Δ𝐸co ; hierbij is n het aantal overgedragen elektronen en F
de proportionaliteitsconstante (Faraday) = 96,48 𝑘𝐽 ∗ 𝑚𝑜𝑙 g] ∗ 𝑉 g]
102
-
-
Bv. melkzuurfermentatie: 𝑝𝑦𝑟𝑢𝑣𝑎𝑎𝑡 + 𝑁𝐴𝐷𝐻 + 𝐻1 → 𝑙𝑎𝑐𝑡𝑎𝑎𝑡 + 𝑁𝐴𝐷1
® Halfreacties: 𝑝𝑦𝑟𝑢𝑣𝑎𝑎𝑡 + 2 𝐻1 + 2 𝑒 g → 𝑙𝑎𝑐𝑡𝑎𝑎𝑡 (𝐸co = −0,19 𝑉) en 𝑁𝐴𝐷𝐻 →
𝑁𝐴𝐷1 + 𝐻1 + 2 𝑒 g (𝐸co = +0,32 𝑉)
® Δ𝐺 °o voor de eerste halfreactie is −2 ∗ 96,48 ∗ −0,19 = +36,7 𝑘𝐽/𝑚𝑜𝑙
® Δ𝐺 °o voor de tweede halfreactie is −2 ∗ 96,48 ∗ 0,32 = −61,8 𝑘𝐽/𝑚𝑜𝑙
® De globale Δ𝐺 °o is de som van de Δ𝐺 °o voor de twee halfreacties =
−25,1 𝑘𝐽/𝑚𝑜𝑙
]
Bv. redoxreactie van de oxidatieve fosforylatie: 𝑁𝐴𝐷𝐻 + # 𝑂# + 𝐻1 → 𝐻# 𝑂 + 𝑁𝐴𝐷1
]
-
-
® Halfreacties: # 𝑂# + 2 𝐻1 + 2 𝑒 g → 𝐻# 𝑂 (𝐸co = +0,82 𝑉) en 𝑁𝐴𝐷1 + 𝐻1 +
2 𝑒 g → 𝑁𝐴𝐷𝐻 (𝐸co = −0,32 𝑉)
® De globale Δ𝐺 °o is −220,1 𝑘𝐽/𝑚𝑜𝑙 à veel negatiever dan bij
melkzuurfermentatie
Het potentiaalverschil bij de bovenstaande reactie bedraagt 1,14 V à dit
potentiaalverschil drijft elektronentransport doorheen de keten, wat leidt tot de
vorming van een protonengradiënt
De energie nodig om een proton te transporteren van in de mitochondriale matrix
C
naar buiten de mitochondriën is Δ𝐺 = 𝑅𝑇 ln C˜ + 𝑍𝐹Δ𝑉
—
® 𝑐] is de concentratie binnen de mitochondriën, 𝑐# de concentratie buiten
de mitochondriën
¥¿
® 𝑅 = 8,314 ∗ 10g` AOJ∗£
®
®
®
®
-
𝑇 is de temperatuur in Kelvin
𝑍 is de elektrische lading van de getransporteerde species (hier +1 voor 𝐻1 )
Δ𝑉 = 0,14 𝑉 (de membraanpotentiaal)
C
Δ𝑝𝐻 (𝑝𝐻STED=> - 𝑝𝐻SE>>=> ) = −1,4 of ln C˜ = 3,2
—
Dus de verandering in vrije energie bedraagt +21,8 𝑘𝐽/𝑚𝑜𝑙 voor elk proton dat
getransporteerd wordt
17.3. De ademhalingsketen bestaat uit 4 complexen
103
-
-
-
De 4 eiwitcomplexen zijn:
o NADH-Q oxidoreductase (complex I)
o Succinaat-Q reductase (complex II)
o Q-cytochroom c oxidoreductase (complex II)
o Cytochroom c oxidase (complex IV)
® 3 van deze complexen (complexen I, III en IV) zijn protonenpompen;
complex II kan geen protonen transporteren
® Complexen I, III en IV vormen een supramoleculair complex of respirasoom,
met als doel het snel doorgeven van elektronen, zonder vorming van vrije
intermediairen
Reactieweg NADH:
o NADH geeft eerst elektronen af aan ubiquinone (co-enzym Q); dit wordt
gefaciliteerd door complex I, dat de energie van deze elektronentransport
gebruikt om protonen te pompen
o Ubiquinone geeft elektronen af aan cytochroom c; dit wordt gefaciliteerd
door complex III, dat de energie van deze elektronentransport gebruikt om
protonen te pompen
o Cytochroom c geeft elektronen af aan zuurstof (à 𝐻# 𝑂); dit wordt
gefaciliteerd door complex IV, dat de energie van deze elektronentransport
gebruikt om protonen te pompen
De reactieweg van 𝐹𝐴𝐷𝐻# is hetzelfde, behalve dat de elektronenafgifte aan
ubiquinone gefaciliteerd wordt door complex II, dat geen protonen zal pompen
Er zijn dus 2 elektroncarriers die voorkomen in alle organismen, nl. co-enzym Q of
ubiquinone (een hydrofoob molecule) en cytochroom c (een klein oplosbaar eiwit)
® Zie slide 27 voor meer info over co-enzym Q
17.3.1. Complex I (NADH-Q oxidoreductase)
-
-
Complex I bevat 2Fe-2S- en 4Fe-4S-clusters en kan zo elektronen opnemen door
𝐹𝑒 `1 om te zetten naar 𝐹𝑒 #1 (en afgeven door 𝐹𝑒 #1 om te zetten naar 𝐹𝑒 `1 ); hierbij
is er geen vrijzetting van protonen
Transfereert elektronen van NADH (afkomstig uit de citroenzuurcyclus, uit
vetzuurafbraak of uit het cytoplasma (glycolyse)) naar Q; de reactie is 𝑁𝐴𝐷𝐻 + 𝑄 +
1
1
5 𝐻ABDME›
→ 𝑁𝐴𝐷1 + 𝑄𝐻# + 4 𝐻E>D=MA=ASMBB>MTEAD=
® Er worden dus 4 protonen verplaatst (2 protonen per elektron dat wordt
afgegeven van NADH naar Q)
104
-
Reacties:
o NADH bindt aan complex I en transfereert 2 elektronen naar de
prosthetische groep flavine mononucleotide (FMN), ter vorming van
𝐹𝑀𝑁𝐻# (FMN neemt dus naast elektronen ook protonen op)
o De elektronen worden overgedragen van 𝐹𝑀𝑁𝐻# naar de Fe-S-clusters (een
tweede prosthetische groep)
o De elektronen worden doorgegeven aan co-enzym Q, ter vorming van eerst
𝑄#g en vervolgens 𝑄𝐻# (neemt 2 𝐻1 op uit de matrix), dat diffundeert via
een waterkanaal
o Er worden ook 4 𝐻1 naar buiten gepompt via proton half-kanalen
® De protonen kunnen in en uit de proton half-kanalen gaan doordat 𝑄#g
(voordat het wordt omgezet naar 𝑄𝐻# ) elektrostatisch interageert met
negatief geladen aminozuren, waardoor de horizontale helices (HL op
de afbeelding; verbinden de matrix met de proton half-kanalen) en de
beta hairpin helices (𝛽H op de figuur; verbinden het cytoplasma met de
proton half-kanalen) bewegen; dit leidt tot conformatiewijzigingen van
de verticale kanalen en daardoor ook wijzigingen van de 𝑝𝐾B -waarden
van zure en basische aminozuren à protonen uit de matrix binden aan
de aminozuren en gaan naar de intermembranaire ruimte
17.3.2. Complex II (succinaat-Q reductase)
-
-
Complex II bevat succinaatdehydrogenase, dat succinaat omzet in fumaraat,
waarbij ook 𝐹𝐴𝐷𝐻# gevormd wordt à complex II transfereert elektronen van
𝐹𝐴𝐷𝐻# naar Q met vorming van 𝑄𝐻#
® Deze transfer gebeurt via Fe-S-clusters
Complex II is een integraal membraaneiwit
Draagt niet bij tot de protonengradiënt à minder ATP-vorming
17.3.3. Complex III (Q-cytochroom c oxidoreductase)
-
-
Complex III transfereert elektronen van 𝑄𝐻# naar geoxideerd cytochroom c; de
1
reactie
is
𝑄𝐻# + 2 𝐶𝑦𝑡 𝑐H=O›EÁ==MÁ + 2 𝐻ABDME›
→ 𝑄 + 2 𝐶𝑦𝑡 𝑐H=M=ÁTC==MÁ +
1
4 𝐻E>D=MA=ASMBB>MTEAD=
® Elke cytochroom c kan maar 1 elektron opnemen à 2 nodig per 𝑄𝐻#
® Er worden dus 4 protonen verplaatst (2 protonen per elektron dat wordt
afgegeven van 𝑄𝐻# naar geoxideerd cytochroom c); 2 van deze protonen
komen uit de matrix, 2 komen van 𝑄𝐻# (Q-cyclus)
Complex III is een homodimeer; elk monomeer bevat 11 subeenheden
105
-
-
-
Bevat 2 cytochroomtypes: cytochroom b en cytochroom c1
® Cytochromen zijn elektrontransfererende eiwitten die een prosthetische
heemgroep bevatten
® Cytochroom b bevat heem 𝑏Â en heem 𝑏Ã (L = low affinity, H = high affinity);
cytochroom c1 bevat heem c1
Bevat ook een ijzer-zwavel-eiwit met een 2Fe-2S-center (“Rieske center”), dat
elektronen ontvangt van 𝑄𝐻# en doorgeeft aan cytochroom c1
Het complex heeft 2 bindingsplaatsen voor ubiquinone: 𝑄O en 𝑄E
Q-cyclus – helft 1:
o 𝑄𝐻# bindt aan complex III en geeft 1 elektron door aan cytochroom c1 via
Rieske, dat vervolgens wordt doorgegeven van cytochroom c1 naar
cytochroom c; hierbij worden 2 protonen verplaatst naar de
intermembranaire ruimte
o Het tweede elektron van 𝑄𝐻# wordt doorgegeven aan een ander co-enzym
Q, dat een semiquinone radicaal anion wordt
Q-cyclus – helft 2:
o Er bindt opnieuw een 𝑄𝐻# aan complex III, dat 1 elektron aan cytochroom
c1 geeft dat vervolgens wordt doorgegeven aan cytochroom c; hierbij
worden weer 2 protonen verplaatst naar de intermembranaire ruimte
o Het tweede elektron van 𝑄𝐻# wordt doorgegeven aan het semiquinone
radicaal anion, dat hierdoor 𝑄𝐻# wordt (neemt 2 𝐻1 op uit de matrix), dat
vervolgens diffundeert
17.3.4. Complex IV (cytochroom c oxidase)
-
-
Complex IV bevat 13 subeenheden
Bevat 2 heemgroepen A (heem a en heem a3) en 3 Cu-ionen die kunnen alterneren
tussen 𝐶𝑢1 en 𝐶𝑢#1 en zo elektronen kunnen afgeven/opnemen
® Deze Cu-ionen zijn georganiseerd als 2 Cu-centra: A (𝐶𝑢\ /𝐶𝑢\ ) en B (𝐶𝑢[ )
Katalyseert de koppeling van de oxidatie van gereduceerd cytochroom c aan de
4-elektron reductie van 𝑂# tot 𝐻# 𝑂
® Het complex verzekert volledige reductie van zuurstof, zodat er geen
schadelijke superoxide anionen of peroxiden gevormd kunnen worden
106
-
-
Stappen:
o 2 cytochromen c geven hun
elektronen aan 𝐶𝑢\ /𝐶𝑢\ ; vandaar
worden ze doorgegeven aan
heem a en vervolgens aan heem
a3 en 𝐶𝑢[
o Gereduceerd 𝐶𝑢[ en gereduceerd
Fe in heem a3 binden met 𝑂# , dat
een peroxidebrug vormt waardoor
𝐶𝑢[ en Fe weer geoxideerd
worden
o 2 nieuwe cytochromen c geven weer elektronen af aan 𝐶𝑢\ /𝐶𝑢\ , die
vervolgens via Fe en Cu worden doorgegeven aan zuurstof; er worden ook
2 protonen opgenomen uit de matrix, waardoor de peroxidebrug
doorbroken wordt
o Er worden nog 2 protonen opgenomen, waardoor er 2 moleculen water
worden gevormd
1
De reactie is 4 𝐶𝑦𝑡 𝑐H=M=ÁTC==MÁ + 4 𝐻ABDME›
+ 𝑂# → 4 𝐶𝑦𝑡 𝑐H=O›EÁ==MÁ + 2 𝐻# 𝑂
® 4 ∗ 21,8 = 87,2 𝑘𝐽/𝑚𝑜𝑙, wat minder is dan de vrije energie die beschikbaar
is om zuurstof tot water te reduceren; deze extra energie wordt gebruikt
door cytochroom c oxidase om 4 extra protonen naar de cytoplasmatische
1
zijde te pompen à de globale reactie is 4 𝐶𝑦𝑡 𝑐H=M=ÁTC==MÁ + 8 𝐻ABDME›
+
1
𝑂# → 4 𝐶𝑦𝑡 𝑐H=O›EÁ==MÁ + 2 𝐻# 𝑂 + 4 𝐻E>D=MA=ASMBB>MTEAD=
® Er zijn dus 4 chemische proteïnen die zorgen voor de reductie van zuurstof
tot water en 4 protonen die naar buiten gepompt worden
17.4. Reactieve zuurstof species (ROS) + elektronentransfer zonder
contact
-
Door overdracht van 1 elektron op zuurstof (in plaats van 2) kunnen superoxide
anionen en peroxiden gevormd worden, wat vermeden moet worden
® Zolang het peroxide voorkomt als peroxidebrug is er geen probleem, maar
het mag niet vrijkomen
-
Cytochroom c oxidase is heel efficiënt in het niet vrijzetten van intermediairen,
maar kleine hoeveelheden worden toch gevormd à kunnen celschade
veroorzaken
107
-
-
-
-
-
Tijdens de evolutie zijn 2 enzymen gevormd die cruciaal zijn voor aerobe
organismen:
o Superoxide dismutase katalyseert de zeer snelle
dismutatie
van
2
superoxide
anionen:
g
1
2 •𝑂# + 2 𝐻 → 𝐻# 𝑂# + 𝑂#
o Katalase (een heem eiwit) breekt waterstofperoxide af:
2 𝐻# 𝑂# → 2𝐻# 𝑂 + 𝑂#
® Deze enzymen zijn diffusie gelimiteerd: verwijdering
van de reactieve zuurstof species is gelimiteerd door de
diffusie ervan
Eukaryoten hebben 2 vormen van superoxide dismutase: een Mn-vorm in de
mitochondriën en een Cu- en Zn-afhankelijke vorm in het cytoplasma
Naast superoxide dismutase en katalase beschermen ook vitamine E en vitamine
C (anti-oxidant vitamines) tegen reactieve zuurstof species
Effect van training:
o Training zorgt voor een verhoogd aeroob metabolisme à meer ROS,
waardoor ook de concentratie superoxide dismutase stijgt
o Het effect op langere termijn is meer bescherming: ook tijdens de rust blijft
de concentratie aan superoxide dismutase hoog
ROS komen ook voor in signaaltransductie pathways, waar ze membraankanalen
en transcriptiefactoren reguleren
De groepen waartussen elektronen worden uitgewisseld zitten vaak diep
verborgen in eiwitten op vaste plaatsen à de afstand tussen deze groepen moet
overbrugd worden
Transfer door de ruimte is afhankelijk van de afstand:
o Per 0,8 Å daalt de efficiëntie met een factor 10
o In eiwitten daalt de efficiëntie iets minder snel, nl. met een factor 10 per 1,7
Å à efficiëntere elektronenoverdracht in eiwitten
o De typische afstand tussen prosthetische groepen in eiwitten is 15 Å; de
elektronentransfer gebeurt in minder dan 1 ms (zonder eiwit zou het
ongeveer 1 dag duren)
108
17.5. Een protonengradiënt drijft de synthese van ATP
-
Er zijn 2 belangrijke reacties bij de ATP-synthese die gekoppeld moeten worden:
]
𝑁𝐴𝐷𝐻 + # 𝑂# + 𝐻1 → 𝐻# 𝑂 + 𝑁𝐴𝐷1 (Δ𝐺 °o = −220,1 𝑘𝐽/𝑚𝑜𝑙) en 𝐴𝐷𝑃 + 𝑃E + 𝐻1 →
𝐴𝑇𝑃 + 𝐻# 𝑂 (Δ𝐺 °o = +30,5 𝑘𝐽/𝑚𝑜𝑙)
® Deze koppeling gebeurt onrechtstreeks door het mitochondriaal ATPase of
𝐹] 𝐹c 𝐴𝑇𝑃𝑎𝑠𝑒; dit ATP synthase wordt ook complex V genoemd
® In theorie zouden we
-
-
-
##c,]
`c,b
= 7,2 ATP moeten winnen, maar dat is niet het
geval à vraag: wat is de efficiëntie in de cel?
Elke citroenzuurcyclus levert 3 NADH en 1 𝐹𝐴𝐷𝐻# ; in totaal worden er 3 ∗ 4 𝐻1 +
4 ∗ 4 𝐻1 + 2 ∗ 4 𝐻1 = 36 𝐻1 naar de intermembranaire ruimte gepompt, waardoor
de buitenzijde van het mitochondriale binnenmembraan meer positief is dan de
binnenzijde à chemiosmotische hypothese: deze protonenconcentratiegradiënt
dient als energiereservoir voor ATP-vorming
De ongelijke verdeling van protonen over het membraan zorgt voor een
protondrijvende kracht, aangeduid met pmf of Δ𝑝; er geldt dat Δ𝑝 = Δ𝑝𝐻 + ΔΨ,
waarbij Δ𝑝𝐻 = het verschil in chemische concentratie en ΔΨ = de elektrische
potentiaal over het membraan
® De protonengradiënt is dus zowel een chemische gradiënt als een
ladingsgradiënt à “elektrochemische gradiënt”
® Δ𝑝𝐻 = 1,4 eenheden en ΔΨ = 0,14 V
® Δ𝐺 = 21,8 𝑘𝐽/𝑚𝑜𝑙 (zie eerder)
Dus de benodigdheden voor ATP-synthese zijn:
o Elektronentransport doorheen de elektrontransportketen om een
protonengradiënt te creëren
o Een intact mitochondriaal binnenmembraan om de protonengradiënt te
behouden
o Het membraan-overspannende enzym ATP synthase om de fosforylatie van
ADP te katalyseren, in een reactie die gedreven wordt door de beweging
van 𝐻1 doorheen het binnenmembraan
17.5.1. ATP synthase of complex V is samengesteld uit een
protonenkanaal en een katalytische eenheid
109
-
-
-
-
-
ATP synthase bestaat uit 2 eenheden: 𝐹] en 𝐹c
𝐹] is de katalytische subeenheid
® Bevindt zich in de mitochondriale matrix
® Samengesteld uit 5 types van polypeptideketens: 3 𝛼-subeenheden, 3 𝛽subeenheden, 1 𝛾-subeenheid, 1 𝛿-subeenheid en 1 𝜀-subeenheid
® Zowel de 𝛼- als de 𝛽-subeenheden kunnen nucleotiden binden, maar enkel
𝛽 is katalytisch actief
® De 𝛼- en de 𝛽-subeenheden komen alternerend voor in een hexameer; 𝛾
breekt de symmetrie van het hexameer en zorgt er door te roteren voor dat
elke 𝛽 een verschillende conformatie heeft
® 𝐹] -subeenheden kunnen afgezonderd worden en bezitten dan nog steeds
ATPase activiteit (?)
𝐹c is een membraanoverspannend protonenkanaal
® Overspant het binnenmembraan
® Hydrofoob
® Samengesteld uit 3 types van polypeptideketens: een a-subeenheid, een
𝑏# -subeenheid en 8 tot 14 c-subeenheden (afhankelijk van de soort)
® De c-subeenheden kunnen roteren, maar de andere subeenheden moeten
stationair blijven
𝐹] en 𝐹c zijn op 2 manieren verbonden:
o Door de 𝜀-𝛾 steel
o Door de a-𝑏# - 𝛿 buitenste kolom
De complexen zijn verbonden ter vorming van
dimeren en oligomeren van dimeren (dimeren die
gaan associëren met andere dimeren); dit
voorkomt dat hele complexen zouden gaan roteren
in plaats van enkel de c-subeenheden en
vergemakkelijkt de vorming van gebogen
membraanstructuren (cristae)
® De dimeren zitten aan de tip van de cristae
Protonen worden door de elektrontransportketen naar de intermembranaire
ruimte gepompt en kunnen daarna door ATPase weer naar de matrix
getransporteerd worden
110
17.5.2. Mechanisme van ATP-synthese
-
-
-
-
ATPase kan niet alleen ATP synthetiseren, maar ook hydrolyseren à wanneer ATP
na vorming gebonden blijft aan de katalytische plaats, wordt het weer omgezet
tot ADP en 𝑃E , zodat er ongeveer gelijke aantallen gebonden ADP en ATP
voorkomen à de rol van de protonengradiënt is dus niet de vorming van ATP,
maar eerder de vrijzetting van ATP uit het synthase
De 𝛽-subeenheden van ATPase zijn katalytisch actief en niet-equivalent (door
interactie met 𝛾) à er zijn 3 verschillende actieve plaatsen
Elke 𝛽-subeenheid kan elk van de volgende 3 stappen in de synthese van ATP
vervullen door conformationele verandering:
o Binding van ADP en 𝑃E
o Synthese van ATP
o Vrijzetting van ATP
Verschillende conformaties van de 𝛽-subeenheid:
o L (loose conformation): kan ADP en 𝑃E los binden
o T (tight conformation): kan ATP zeer sterk binden (converteert ADP en 𝑃E tot
ATP)
o O (open conformation): kan adenine nucleotide binden of vrijzetten (zet
ATP vrij)
® L en T zijn gesloten conformaties à zetten geen nucleotide vrij
® De 𝛾-subeenheid roteert tegenwijzerzin
(bekeken vanaf de matrixzijde) en zorgt zo
voor confromatieveranderingen
Mechanisme: ATP zit sterk gebonden in de Tconformatie à wanneer 𝛾 120° draait, verandert
de T-conformatie in de O-conformatie à ATP
komt vrij, zodat de O-conformatie leeg is à ADP
en 𝑃E kunnen weer binden
® Dit gebeurt met alledrie de subeenheden
® Dit mechanisme heeft een efficiëntie van
bijna 100%
17.5.3. Mechanisme van protonenbeweging: beweging van
protonen rondom de c-ring drijft ATP-synthese
-
De c-subeenheden (8 tot 14) bestaan elk uit 2 transmembranaire 𝛼-helices; in het
midden van 1 van deze helices zit een Glu- of Asp-residu (zure aminozuren à
kunnen protonen binden en weer vrijzetten)
111
-
-
-
De a-subeenheid bestaat uit 2 hydrofiele
proton half-kanalen (een cytosolisch en een
matrix half-kanaal) die allebei contact maken
met een c-subeenheid (negatief geladen);
protonen komen binnen via het cytosolisch
half-kanaal en neutraliseren de negatieve
lading à de c-subeenheden kunnen nu
roteren (enkel neutrale c-subeenheden
kunnen roteren), waardoor ook de protonen
mee roteren à er komt een proton terecht in
het matrix half-kanaal, dat vervolgens uit de a-subeenheid naar de matrix migreert
à er zijn opnieuw 2 negatieve ladingen, zodat het proces opnieuw kan beginnen
Doordat de c-subeenheden roteren, zal ook de 𝜀-𝛾 steel mee roteren à er worden
3 moleculen ATP gevormd voor elke volledige rotatie
Elk complex bestaat uit 8-14 c-subeenheden à er zijn ook 8-14 𝐻1 nodig om een
rotatie van 360° te maken
® Bv. gist heeft 10 c-subeenheden à er zijn 10 protonen nodig om 3 ATP aan
te maken, of 3,33 protonen per ATP
® Vertebraten hebben 8 c-subeenheden à er zijn 2,7 protonen nodig per
ATP (ongeveer 3) (dit is het meest efficiënt)
De elektronen van NADH zorgen voor 10 protonen; aangezien er ongeveer 3
protonen nodig zijn per ATP, zouden we verwachten dat er 3,33 ATP-moleculen
gevormd worden, maar in werkelijkheid worden er maar 2,5 ATP-moleculen
gevormd door de elektronen van NADH à verklaring: we moeten ook het
transport van ATP in rekening brengen
® ATP wordt aangemaakt in de matrix, maar is eigenlijk nodig in de
intermembranaire ruimte en het cytoplasma; dit transport van ATP kost ook
een proton, zodat er eigenlijk geen 3 maar 4 protonen nodig zijn per
molecule ATP
® De elektronen van 𝐹𝐴𝐷𝐻# zorgen ook nog voor 1,5 ATP
17.6. Transportsystemen in mitochondriën
-
Er is transport van NADH enerzijds en transport van ATP/ADP anderzijds
17.6.1. Elektronen van cytoplasmatisch NADH gaan de
mitochondriën binnen via shuttles
-
NADH in het cytosol (uit de glycolyse) moet zijn elektronen afgeven aan de
elektrontransportketen (à 𝑁𝐴𝐷1 ), maar NADH en 𝑁𝐴𝐷1 kunnen niet diffunderen
doorheen het binnenste mitochondriale membraan à de elektronen worden
overgedragen eerder dan NADH zelf
112
-
-
-
-
De elektronenoverdracht kan via 2 shuttle systemen gebeuren:
o Glycerol-3-fosfaat shuttle: komt voor in skeletspierweefsel
o Malaat-aspartaat shuttle: komt vooral voor in de lever en hartspierweefsel
Glycerol-3-fosfaat shuttle:
o NADH wordt geoxideerd tot 𝑁𝐴𝐷1 ; de
elektronen en 2 𝐻1 worden overgedragen aan
dihydroxyaceton fosfaat, dat gereduceerd wordt
tot glycerol 3-fosfaat
o Glycerol
3-fosfaat
oxideert
weer
tot
dihydroxyaceton
fosfaat;
de
vrijgekomen
elektronen worden nu aan FAD gegeven, dat
reduceert tot 𝐹𝐴𝐷𝐻#
o 𝐹𝐴𝐷𝐻# kan Q reduceren tot 𝑄𝐻# (wordt hierbij weer FAD); 𝑄𝐻# kan
vervolgens elektronen afgeven aan complex III
o Globale
reactie:
𝑁𝐴𝐷𝐻C@DOPJBIABDEICÈ + 𝐻1 + 𝐹𝐴𝐷AEDOCÈO>ÁMEBBJ →
1
𝑁𝐴𝐷C@DOPBIABDEICÈ
+ 𝐹𝐴𝐷𝐻# AEDOCÈO>ÁMEBBJ
o Dit shuttle systeem laat toe om NADH te “transporteren” in de
mitochondria tegen de concentratiegradiënt in; de kost is 1 ATP (er wordt
dus maar 1,5 ATP gevormd in plaats van 2,5)
Malaat-aspartaat shuttle:
o NADH wordt geoxideerd tot 𝑁𝐴𝐷1 ; de
elektronen worden overgedragen aan
oxaalacetaat, dat gereduceerd wordt tot
malaat
o Malaat gaat via een membraan carrier naar
de matrix en oxideert hier weer tot
oxaalacetaat; de vrijgekomen elektronen
worden aan 𝑁𝐴𝐷1 in de matrix gegeven, dat reduceert tot NADH
o Oxaalacetaat wordt met een transaminatiereactie omgezet tot aspartaat,
dat via een membraan carrier naar de intermembranaire ruimte gaat en hier
weer wordt omgezet tot oxaalacetaat
o Tegelijkertijd is er ook transaminatie van 2 andere moleculen, nl. 𝛼ketoglutaraat (aminogroepacceptor) en glutamaat (aminogroepdonor)
1
o Globale
reactie:
𝑁𝐴𝐷𝐻C@DOPJBIABDEICÈ + 𝑁𝐴𝐷AEDOCÈO>ÁMEBBJ
⇌
1
𝑁𝐴𝐷C@DOPJBIABDEICÈ + 𝑁𝐴𝐷𝐻AEDOCÈO>ÁMEBBJ
® De membraan carriers zijn allebei antiporters
Deze systemen gelden enkel voor NADH uit de glycolyse, niet voor NADH uit de
citroenzuurcyclus (zit al in de matrix)!
113
17.6.2. Opname van ADP in mitochondriën is gekoppeld aan
exit van ATP door een ATP-ADP translocase
-
-
-
-
-
ATP wordt gesynthetiseerd in de matrix van mitochondriën, maar moet dan
getransporteerd worden naar het cytosol; tegelijkertijd moeten ADP en 𝑃E de
matrix binnenkomen à gekoppeld transport
ATP en ADP worden getransporteerd mbv. ADP/ATP carrier systemen genaamd
ATP-ADP translocase; de uitwisseling veroorzaakt een netto verlies van 1
negatieve lading uit de matrix, dus een verlies in protonendrijvende kracht
`g
•g
`g
•g
(𝐴𝐷𝑃C@DOPJBIAB
+ 𝐴𝑇𝑃ABDME›
→ 𝐴𝐷𝑃ABDME›
+ 𝐴𝑇𝑃C@DOPBIAB
)
® Dit systeem is zeer efficiënt: het cytoplasma en de nucleus hebben zelfs
meer ATP dan de mitochondriën zelf
Mechanisme:
o ATP-ADP translocase staat open naar de cytoplasmatische zijde toe; ADP
dat hier aanwezig is bindt in de opening
o Binding van ADP zorgt voor een conformatiewijziging, waardoor ATP-ADP
translocase nu open staat naar de matrix toe
o ADP komt vrij in de matrix en ATP, dat hier aanwezig is, bindt in de opening
o Binding van ATP zorgt voor een conformatiewijziging, waardoor ATP-ADP
translocase nu weer open staat naar de cytoplasmatische zijde toe
o ATP komt vrij in het cytoplasma en ADP kan weer binden
ATP en ADP zijn normaal gecomplexeerd met 𝑀𝑔#1 , maar in dit geval binden ze
zonder 𝑀𝑔#1
15% van de eiwitten van het binnenmembraan zijn ATP-ADP translocase
¼ van de pmf wordt op deze manier verbruikt
Structuur van ATP-ADP translocase:
o Heeft een tripartite structuur
o Bestaat uit 3 tandem herhalingen van een 100 aminozuur-module; elke
tandem herhaling bestaat uit 2 transmembranaire segmenten
o Vormt een wigwamachtige structuur met in het centrum een nucleotide
bindingsplaats waarop ATP en ADP kunnen binden
Er is een gecombineerde werking van ATP/ADP translocase en een fosfaat carrier
die 𝐻# 𝑃𝑂•g in de matrix en 𝑂𝐻g uit de matrix transporteert; netto is er dus influx
van 1 𝐻1 à de kost om ATP van de matrix naar het cytoplasma te transporteren
is 1 proton
® Beide transporters zijn geassocieerd met ATP synthase; samen vormen ze
het ATP synthasoom
® Naast ATP/ADP translocase en de fosfaat carrier zijn er nog verschillende
carriers: in totaal zijn er meer dan 40 carriers in het menselijk genoom
114
17.7. Regulatie van cellulaire respiratie door nood voor ATP
-
-
-
-
Cellulaire ademhaling wordt gedreven door de nood voor ATP
Schattingen:
o 1 NADH levert 10 protonen, 1 𝐹𝐴𝐷𝐻# levert 6 protonen
o 3 𝐻1 zorgen voor de aanmaak van 1 molecule ATP in de matrix
o 1 𝐻1 zorgt ervoor dat het mitochondriaal ATP naar het cytosol wordt
getransporteerd (geldt ook bij vetzuurafbraak!)
o Per molecule NADH kunnen dus 2,5 moleculen ATP worden gemaakt, per
molecule 𝐹𝐴𝐷𝐻# (of per molecule cytoplasmatisch NADH, in het geval van
de glycerol-3-fosfaat shuttle) kunnen 1,5 moleculen ATP worden gemaakt
o In totaal worden er zo’n 30 moleculen ATP gevormd bij de oxidatie van
glucose tot 𝐶𝑂# ; 26 van deze 30 komen door oxidatieve fosforylatie (de
andere 4 door substraatfosforylatie)
o Anaeroob metabolisme van glucose levert maar 2 moleculen ATP
Het aantal ATP-moleculen gevormd in de glycolyse en de citroenzuurcyclus is
perfect geweten door de stoichiometrie van de reacties; het aantal ATP-moleculen
gevormd door oxidatie is minder zeker
Wanneer de malaat-aspartaat shuttle wordt gebruikt, is de opbrengst 32
moleculen ATP (er worden 2 moleculen NADH gevormd bij de glycolyse en deze
leveren elk 2,5 ATP in plaats van 1,5 ATP)
Bij aerobe training stijgt het aantal mitochondriën en bloedvaten in de spieren à
meer ATP-productie door oxidatieve fosforylatie
Zie slide 42 voor samenvattende tabel
17.7.1. De algemene snelheid van oxidatieve fosforylatie
hangt in de eerste plaats af van de cellulaire nood voor ATP
-
-
Elektronentransport (zuurstofconsumptie) is sterk
gekoppeld met de fosforylatie van ADP: enkel als er ADP
aanwezig is gaat zuurstofverbruik (en dus ook de
citroenzuurcyclus) verder
® Dit wordt respiratoire controle of acceptor
controle genoemd
® De hoeveelheid verbruikte zuurstof hangt af van
de hoeveelheid toegevoegde ADP
De synthese van ATP uit ADP en 𝑃E bepaalt dus de flow van elektronen van NADH
en 𝐹𝐴𝐷𝐻# naar zuurstof: elektronen vloeien niet door de elektrontransportketen
naar 𝑂# tenzij ADP simultaan wordt gefosforyleerd tot ATP
® Aangezien de beschikbaarheid van 𝑁𝐴𝐷1 en FAD de snelheid van de
citroenzuurcyclus bepaalt, volgt hieruit ook dat de citroenzuurcyclus niet
kan doorgaan als ADP niet wordt gefosforyleerd tot ATP
115
17.7.2. ATP-synthase kan gereguleerd worden
-
Inhibitory factor 1 (IF1) inhibeert de potentieel hydrolytische activiteit van ATP
synthase; deze inhibitie gebeurt in afwezigheid van 𝑂# (“ischemie”), want anders
zou er hydrolyse van ATP kunnen optreden in de mitochondriën
17.7.3. Gereguleerde
ontkoppeling
van
oxidatieve
fosforylatie met ATP synthese leidt tot warmteproductie
-
-
Wanneer de synthese van ATP niet gekoppeld wordt met de
elektrontransportketen mbv. een protonengradiënt, kan er geen ATP meer
gevormd worden; er worden wel nog steeds protonen opgenomen door het eiwit
UCP-1 of thermogenine, waardoor de protonengradiënt volledig verdwijnt (?)
® Dit creëert warmte à komt voor bij overwinterende dieren, pasgeborenen
en volwassen zoogdieren
Wanneer de lichaamstemperatuur plots daalt, worden vrije vetzuren vrijgezet uit
triacylglycerol stocks à activeren UCP-1 à warmte
Bruin vetweefsel bevat (in tegenstelling tot wit vetweefsel) veel mitochondriën; het
wordt geactiveerd bij koude
® Volwassenen (in het bijzonder vrouwen) hebben bruin vetweefsel
17.7.4. Inhibitie van oxidatieve fosforylatie op verschillende
niveaus
-
Inhibitie van de elektrontransportketen:
o NADH-Q oxidoreductase kan geblokkeerd worden door rotenon (vis- en
insectenverdelger) en amytal (kalmeermiddel) à inhibeert het gebruik van
NADH (maar 𝐹𝐴𝐷𝐻# kan wel nog gebruikt worden)
o Q-cytochroom c oxidoreductase kan geblokkeerd worden door antimycin
A (visverdelger)
o Cytocrhoom c oxidase kan geblokkeerd worden door cyanide (𝐶𝑁 g ), azide
(𝑁`g ) en CO; cyanide en azide reageren met de ferri-vorm van heem a3, CO
inhibeert de ferro-vorm van heem a3
116
-
-
-
Inhibitie van ATP synthase:
o ATP synthase kan geblokkeerd worden door oligomycine (antibioticum) en
dicyclohexylcarbodiimide (DDC), die aan de c-subeenheid binden
waardoor deze niet meer kan roteren
o Als ATP synthase geïnhibeerd wordt, valt ook de elektrontransportketen stil
Ontkoppeling van elektronentransport en ATP synthese:
o Elektronentransport en ATP synthese worden ontkoppeld door DNP en
andere zure aromatische componenten (herbicide en fungicide), die
protonen over het membraan dragen volgens hun concentratiegradiënt à
er wordt geen ATP meer gevormd doordat de
protonengradiënt gedissipeerd is
o Er wordt warmte gevormd
o Milde ontkoppelaars zouden gebruikt kunnen worden als
anti-obesitas middelen
Inhibitie van ATP-export:
o ATP-ADP translocase kan geblokkeerd worden door atractyloside (plant) en
Bongkrekic acid (toxine van bacterie)
o Als ATP-ADP translocase geïnhibeerd wordt, stopt ook de oxidatieve
fosforylatie à bewijs dat ATP-ADP translocase essentieel is
18.
Fotosynthese (H19)
Inleiding
-
-
-
Autotrofe organismen kunnen elektromagnetische straling (licht) omzetten in
chemische energie à fotosynthesereactie: 𝑒𝑛𝑒𝑟𝑔𝑖𝑒 + 6 𝐶𝑂# + 6 𝐻# 𝑂 → 𝐶¯ 𝐻]# 𝑂¯ +
6 𝑂#
® 60% van de fotosynthese gebeurt door algen en bacteriën, 40% door
groene planten
Celademhaling doet het omgekeerde van fotosynthese: 𝐶¯ 𝐻]# 𝑂¯ + 6 𝑂# →
6 𝐶𝑂# + 6 𝐻# 𝑂 + 𝑒𝑛𝑒𝑟𝑔𝑖𝑒 (𝐴𝑇𝑃)
De sleutel in beide processen is het genereren van hoge-energie elektronen
(elektronen met een hoog reducerend vermogen); fotosynthese gebruikt
lichtenergie om elektronen van een lage naar een hoge energietoestand te
brengen
De fotosynthese bestaat uit lichtreacties en donkerreacties:
o Lichtreacties: lichtenergie wordt omgevormd tot reducerend vermogen
(NADPH) en ATP
o Donkerreacties: 𝐶𝑂# wordt gereduceerd (volgend hoofdstuk)
117
18.1. Fotosynthese gebeurt in chloroplasten
-
-
-
-
-
Chloroplasten komen niet voor in alle organismen (bv. niet in bepaalde bacteriën)
Structuur van chloroplasten:
o Ongeveer 5 𝜇𝑚 lang
o Omgeven door 3 verschillende membranen: een
buitenmembraan, een binnenmembraan en een
thylakoïd membraan (dat gevormd is door
afsnoering van het binnenmembraan)
o Bestaat uit 3 verschillende ruimten: een
intermembranaire ruimte, het stroma en een
thylakoïde ruimte
® In het stroma vinden de donkerreacties plaats, in de thylakoïden de
lichtreacties
o Stapels van thylakoïde discussen vormen structuren die grana (enkelvoud:
granum) worden genoemd; deze grana kunnen met elkaar verbonden zijn
via lamellen
Plantencellen hebben 1-100 chloroplasten
In het thylakoïd membraan zijn aanwezig:
o Licht-capterende proteïnen
o Reactiecentra
o Elektrontransportketen
o ATP synthase
Daarnaast zijn in het thylakoïdmembraan ongeveer evenveel lipiden als proteïnen
aanwezig; de lipiden zijn voor 75% galactolipiden, voor 10% sulfolipiden en voor
10% fosfolipiden
Het thylakoïdmembraan en het binnenmembraan zijn niet-permeabel voor de
meeste moleculen en ionen; het buitenmembraan is wel permeabel voor kleine
moleculen en ionen
Het stroma bevat enzymen die NADPH en ATP gebruiken voor de omzetting van
𝐶𝑂# tot suikers
Chloroplasten zijn ontstaan door endosymbiose: opname van een voorloper van
cyanobacteriën door een eukaryote gastheercel à bevatten eigen DNA en
machinerie voor replicatie en expressie (maar ook nog steeds veel proteïnen
gecodeerd door nucleair DNA)
® Chloroplasten in hogere planten en groene algen zijn afgeleid van 1 enkele
symbiotische gebeurtenis, chloroplasten in rode en bruine algen zijn
afgeleid van minstens 2 symbiotische gebeurtenissen
® Gelijkenissen tussen chloroplasten en cyanobacteriën: hebben beide
circulair DNA, 1 startplaats voor DNA-replicatie en genschikking in operons
118
18.2. Lichtabsorptie door chlorofyl induceert elektronentransfer
-
-
-
-
De belangrijkste fotoreceptor in chloroplasten is chlorofyl
a; dit lijkt op heem (is ook tetrapyrrool) maar heeft centraal
een 𝑀𝑔#1 -ion (heem bevat een ijzerion) en bevat een
gereduceerde pyrroolring en een extra 5-C ring
Chlorofyl a heeft zeer sterke absorptiebanden in het
zichtbaar licht; bij deze frequenties is de zonne-energie
output maximaal
® Groen licht wordt niet geabsorbeerd à planten
hebben een groene kleur
Chlorofyl a is een effectieve fotoreceptor door de
geconjugeerde dubbele bindingen: de elektronen zijn niet
gelokaliseerd bij 1 bepaalde atoomkern à bij lichtabsorptie
zijn er elektronentransities van een laag-energetische naar
een hoog-energetische moleculaire orbitaal
® Door deze alternering van dubbele en enkelvoudige
bindingen wordt chlorofyl a ook een geconjugeerd
polyeen genoemd
Bij de meeste moleculen valt een elektron na excitatie weer
terug naar de grondtoestand (met vorming van warmte), maar dit is niet het geval
bij chlorofyl: bij chlorofyl wordt het geëxciteerde elektron doorgegeven aan een
acceptormolecule, dat hierdoor een negatieve lading krijgt (het donormolecule
krijgt een positieve lading); het geëxciteerde elektron heeft nu reducerend
vermogen
® Deze reactie gebeurt in reactiecentra
119
18.2.1. Een
speciaal
ladingsherschikking
-
-
-
paar
chlorofyls
initieert
Rhodopseudomonas viridis is een fotosynthetiserende bacterie; het bacterieel
fotosynthetisch reactiecentrum (homoloog aan dat van planten, maar minder
complex) is samengesteld uit 4 polypeptideketens (eigenlijk niet echt te kennen):
o 2 similaire transmembranaire ketens: L en M, die de kern van het
reactiecentrum vormen
o Een H-keten, die aan de cytoplasmatische zijde van het celmembraan van
de bacterie ligt
o Een C-type cytochroom subeenheid met 4 c-type heemgroepen, dat aan
de buitenzijde van het celmembraan van de bacterie ligt (in de
periplasmatische zone tussen celmembraan en celwand)
L en M: de keten met elektronendragende prosthetische groepen begint met een
speciaal paar (bestaande uit 2 moleculen bacteriochlorofyl) waar elektronen
gecapteerd worden, waarna ze worden doorgegeven via bacteriopheophytin en
uiteindelijk terechtkomen bij chinon
® Bacteriochlorofyl (BChl-b) is similair aan chlorofyl a, maar er is een
absorptieshipt gebeurt naar nabije infrarood tot golflengten van 1000 nm;
het special paar (P960 genoemd, omdat het maximaal absorbeert bij een
golflengte van 960 nm) bestaat uit 2 BChl-b
® Bacteriopheophytin (BPh) is ongeveer hetzelfde als BChl-b, maar bevat 2
𝐻1 in het centrum in plaats van 2 𝑀𝑔#1
Elektronenketen in fotosysnthetiserend bacterieel reactiecentrum:
o Een elektron van P960 wordt geëxciteerd onder invloed van licht
o Na excitatie wordt het elektron zeer snel overgedragen via BChl-b naar BPh,
waardoor P960 verandert naar 𝑃9601 en BPh naar 𝐵𝑃ℎg
o Ofwel kan het elektron terugvallen naar 𝑃9601 , ofwel kan het elektron
verder doorgegeven worden aan 𝑄\ (ubichinon); aangezien de afstand
tussen 𝐵𝑃ℎg en 𝑄\ heel klein is, zal dit sneller gebeuren, en bovendien is
𝑃9601 een sterk oxidans, waardoor het een elektron zal ontvangen van
cytochroom c en weer gereduceerd wordt tot P960
o 𝑄\g geeft het elektron verder door aan 𝑄[ (ook een ubichinon), dat
tegelijkertijd ook een proton opneemt à 𝑄\g wordt weer 𝑄\
o Cytochroom c neemt weer een elektron op en geeft dit door via P960, BChlb en BPh aan 𝑄\ , waarna het ook (met opname van een proton) wordt
doorgegeven aan 𝑄[ à 𝑄[ wordt 𝑄𝐻# , dat terechtkomt in de quinone pool
® In 1 cyclus komen dus 2 elektronen en 2 protonen terecht in 𝑄𝐻# ; 𝑄𝐻# heeft
een hoger reducerend vermogen dan de elektronen die oorspronkelijk in
cytochroom c aanwezig waren
® De elektronen van 𝑄𝐻# komen uiteindelijk weer terecht bij cytochroom 𝑐#
120
18.3. Fotosynthese in groene planten gebeurt via 2 fotosystemen
-
-
Groene planten hebben 2 fotosystemen, die fotosysteem I (PS I) en fotosysteem II
(PS II) worden genoemd
® Elektronen starten met PS II
® Hebben elk verschillende absorptiegolflengten
en dus verschillende speciale paren: P680 voor
PS II en P700 voor PS I
De elektronenflow is in tegenstelling tot bij bacteriën
(meestal) niet cyclisch maar gaat van PS II naar PS I via
het cytochroom bf-complex (een membraangebonden
complex dat homoloog is aan complex III uit de oxidatieve fosforylatie: zorgt voor
een protonengradiënt)
18.3.1. Fotosysteem II transfereert elektronen van water naar
plastichinon en genereert een protonengradiënt
-
-
Fotosysteem II bestaat uit meer dan 20 transmembranaire subeenheden
PS II katalyseert de elektronenoverdracht van water naar plastochinon (Q), dat
gereduceerd wordt tot plastochinol (𝑄𝐻# ): 2 𝑄 + 2 𝐻# 𝑂 → 𝑂# + 2 𝑄𝐻#
® 𝑄𝐻# is een sterker reductans dan 𝐻# 𝑂, dus PS II drijft de reactie in een
thermodynamisch stroomopwaartste richting à om deze reactie te doen
opgaan is er lichtenergie nodig
® Bij bacteriën zijn de elektronen dus afkomstig van cytochroom c dat
geoxideerd wordt, bij groene planten van 𝐻# 𝑂
Elektronenflow in PS II:
o Een elektron van P680 (dat chlorofyl a bevat?) wordt geëxciteerd onder
invloed van licht en doorgegeven, waardoor P680 verandert naar 𝑃6801
o 𝑃6801 is een sterk oxidans en zal elektronen onttrekken van water, dat
gebonden is aan het wateroxiderend centrum of Mn-centrum; er wordt 1
elektron per keer onttrokken en dit viermaal (aangezien er 2 𝐻# 𝑂 nodig zijn
om 1 𝑂# te bekomen en hierbij dus 4 elektronen worden uitgewisseld)
121
o De elektronen worden overgedragen via pheophytin naar plastochinon (𝑄\ )
en dan naar een uitwisselbaar plastochinon (𝑄[ ); 𝑄[ kan maar 2 elektronen
opnemen, dus er zijn er 2 nodig
o Er worden ook 4 protonen opgenomen door de 2 𝑄[ à 2 𝑄𝐻# , die uit het
complex kunnen migreren
-
-
Er zijn 4 fotonen nodig om 1 molecule 𝑂# te genereren
® Eigenlijk zijn er in de eerste cyclus maar 3 fotonen nodig; dit komt doordat
er al 1 elektron aan 𝑄[ is afgegeven (bij de omzetting van P680 naar 𝑃6801 )
Fotosysteem II, dat het thylakoïd membraan overspant, draagt bij tot de
protonengradiënt:
o Het katalyseert de omzetting van 2 𝐻# 𝑂 naar 𝑂# en 4 protonen, die in het
thylakoïd lumen komen à pH van het thylakoïd lumen daalt
o Er worden ook 4 protonen onttrokken uit het stroma, die worden
opgenomen door de 2 𝑄[ à pH van het stroma stijgt
® De chinonreductie is dus aan de zijde van het stroma, de wateroxidatie is
aan de zijde van het lumen
18.3.2. Het cytochroom bf-complex koppelt PS II en PS I
-
-
De elektronen van 𝑄𝐻# worden via het cytochroom bf-complex doorgegeven naar
plastocyanine (Pc), een Cu-houdend proteïne in het thylakoïd lumen: 𝑄𝐻# +
1
2 𝑃𝑐 (𝐶𝑢#1 ) → 𝑄 + 2 𝑃𝑐 (𝐶𝑢1 ) + 2 𝐻DÈ@JB¥OïÁ
JTA=>
® Er komen dus 2 protonen van 𝑄𝐻# terecht in het thylakoïd lumen, en
daarnaast worden er ook nog 2 protonen uit het stroma naar het thylakoïd
lumen gebracht (zie Q-cylus) à protonengradiënt
Cytochroom bf en complex III zijn similair: bevatten homologe eiwitten
122
18.3.3. Fotosysteem I gebruikt lichtenergie om gereduceerd
ferredoxine te genereren, een krachtig reductans
-
-
-
PS I katayseert de elektronenoverdracht van plastocyanine naar ferredoxine, dat
gereduceerd wordt: 𝑃𝑐 (𝐶𝑢1 ) + 𝐹𝑑O› → 𝑃𝑐 (𝐶𝑢#1 ) + 𝐹𝑑M=Á
® Ferredoxine is een sterker reductans dan plastocyanine, dus PS I drijft de
reactie in een thermodynamisch stroomopwaartse richting à om deze
reactie te doen opgaan er lichtenergie nodig
Elektronenflow in PS I:
o Een elektron van P700 wordt geëxciteerd onder invloed van licht en
doorgegeven via chlorofyl (plaats 𝐴c ) naar chinon (plaats 𝐴] ), waardoor
P700 verandert naar 𝑃7001
o Het elektron wordt via 3 4FE-4S-centra verder doorgegeven naar
ferredoxine, dat gereduceerd wordt
o 𝑃7001 wordt geneutraliseerd door elektronentransfer van gereduceerd
plastocyanine
Ferredoxine:
o Oplosbaar proteïne in het stroma
o Bevat een 2Fe-2S-centrum, waar een hoogenergetisch elektron
gestockeerd kan worden
o Draagt elektron over naar ferredoxine-𝑁𝐴𝐷𝑃1 reductase
18.3.4. Ferredoxine-𝑁𝐴𝐷𝑃1 reductase vormt 𝑁𝐴𝐷𝑃1 om tot
NADPH
-
-
-
-
Ferredoxine-𝑁𝐴𝐷𝑃1 reductase bevat een prosthetische groep FAD; deze neemt
een proton op en een elektron van gereduceerd
ferredoxine ter vorming van 𝐹𝐴𝐷𝐻• (een
semiquinone intermediair)
𝐹𝐴𝐷𝐻• neemt een tweede proton op en een
tweede elektron van nog een molecule
gereduceerd ferredoxine ter vorming van
𝐹𝐴𝐷𝐻#
𝐹𝐴𝐷𝐻# reageert met 𝑁𝐴𝐷𝑃1 ter vorming van
NADPH en een proton
® NADPH is een belangrijk molecule bij biosynthesereacties
Zie slide 41 voor een samenvattend schema
123
18.4. De protonengradiënt over het thylakoïdmembraan drijft ATPsynthese
-
-
-
Experiment om aan te tonen dat chloroplasten ATP kunnen synthetiseren in het
donker als er een artificiële pH-gradiënt wordt aangelegd over het
thylakoïdmembraan:
o 1. Onderdompeling van chloroplast (heeft een pH van 7) in buffer met pH
4 à na enkele uren werd de pH van de chloroplast ook 4
o 2. Snel overbrengen van chloroplast (met pH 4) naar buffer met pH 8 en
aanwezigheid van ADP en 𝑃E
o Vaststelling: na overplaatsing werd er ATP gevormd uit de aanwezige ADP
en 𝑃E à bevestiging van de hypothese dat ATP-synthese wordt gestuurd
door protondrijvende kracht
Ter hoogte van het thylakoïdmembraan is dus een pmf; deze is bijna volledig te
wijten aan het pH-verschil (van 3,5)
® Bij mitochondriën is de pmf samengesteld uit een chemische en een
elektrische potentiaal; bij chloroplasten is er geen elektrische potentiaal
doordat het thylakoïdmembraan vrij permeabel is voor 𝐶𝑙 g en 𝑀𝑔#1 en het
transport van deze ionen de elektrische gradiënt (veroorzaakt door lichtgeïnduceerde transfer van 𝐻1 ) neutraliseert (dus 𝐶𝑙 g beweegt in dezelfde
richting als 𝐻1 , 𝑀𝑔#1 in de tegenovergestelde richting)
® De Δ𝐺-waarde van de pmf is wel ongeveer
hetzelfde als bij mitochondriën (-20 kJ/mol)
De ATP-synthase van chloroplasten (𝐶𝐹] -𝐶𝐹c ) is
vergelijkbaar met de ATP-synthase van mitochondriën
(𝐹] -𝐹c ) en prokaryoten; het zal protonen van het thylakoïd
lumen naar het stroma pompen, waar vervolgens uit ADP
en 𝑃E ATP gevormd wordt (hierbij wordt ook weer 𝐻# 𝑂
gevormd)
18.4.1. Cyclische fotofosforylatie leidt tot de productie van
ATP in plaats van NADPH
-
-
Meestal is de elektronenflow niet cyclisch; wanneer er echter al voldoende NADPH
gevormd is maar er nog steeds ATP nodig is, zal er toch cyclische fotofosforylatie
optreden waarbij er enkel protonen gepompt worden en er geen omzetting meer
is van 𝑁𝐴𝐷𝑃1 naar NADPH
® Dit gebeurt dus als de NADPH/𝑁𝐴𝐷𝑃1 -ratio hoog is
Gereduceerd ferredoxine (gevormd in PS I) draagt geen elektronen over aan
ferredoxine-𝑁𝐴𝐷𝑃1 reductase maar geeft ze door aan het cytochroom bfcomplex, dat protonen in het thylakoïd lumen zal pompen; deze protonen zullen
vervolgens naar ATP-synthase stromen voor productie van ATP
124
18.4.2. Stoichiometrie van de lichtreacties
-
-
-
-
Reacties in de fotosystemen:
o PS II absorbeert 4 fotonen en levert 1 𝑂# vanuit 2 𝐻# 𝑂; er worden ook 4
protonen aan het stroma onttrokken en er komen 4 protonen terecht in het
thylakoïd lumen
o In de Q-cyclus van cytochroom bf worden 2 𝑄𝐻# geoxideerd tot 2 Q; er
worden ook nog eens 4 protonen aan het stroma onttrokken en er komen
8 protonen terecht in het thylakoïd lumen
o PS I absorbeert 4 fotonen en levert 4 gereduceerde Fd vanuit 4
gereduceerde Pc, waarna er uiteindelijk 2 NADPH gevormd worden; er
worden ook nog eens 2 protonen aan het stroma onttrokken
1
1
® Globaal: 2 𝐻# 𝑂 + 2 𝑁𝐴𝐷𝑃1 + 10 𝐻IDMOAB
→ 𝑂# + 2 𝑁𝐴𝐷𝑃𝐻 + 12 𝐻JTA=>
De 12 𝐻1 in het thylakoïd lumen vloeien naar ATP-synthase, dat bestaat uit 12
subeenheid-III componenten in 𝐶𝐹c (dus er zijn 12 𝐻1 nodig om 3 ATP aan te
1
maken) à globaal: 3 𝐴𝐷𝑃`g + 3 𝑃E#g + 3𝐻1 + 12 𝐻JTA=>
→ 3 𝐴𝑇𝑃•g + 3 𝐻# 𝑂 +
1
12 𝐻IDMOAB
De totale reactie is dan 2 𝑁𝐴𝐷𝑃1 + 3 𝐴𝐷𝑃`g + 3 𝑃E#g + 𝐻1 → 𝑂# + 2 𝑁𝐴𝐷𝑃𝐻 +
3 𝐴𝑇𝑃•g + 𝐻# 𝑂
® Absorptie van 8 fotonen leidt dus tot 1 𝑂# , 2 NADPH en 3 ATP (dus 2,7
fotonen per ATP)
Als er cyclische fotofosforylatie optreedt zullen de 4 fotonen die geabsorbeerd
1
worden door PS I 8 𝐻JTA=>
opleveren in cytochroom bf; deze protonen leveren 2
ATP, zodat er slechts 2 fotonen nodig zijn per molecule ATP (maar er wordt wel
geen NADPH geproduceerd)
125
18.5. Bijkomende pigmenten leiden energie naar de reactiecentra
-
-
-
-
-
-
Chlorofyl a alleen is onvoldoende:
o Heeft een absorptie gap tussen 450 en 650 nm
o De densiteit van chlorofyl a in het speciaal paar is niet heel hoog: vele
fotonen worden niet gecapteerd
Er zijn dus bijkomende pigmenten nodig voor fotonabsorptie en energietransfer
naar de reactiecentra (niet elektronentransfer; dit gebeurt alleen vanaf het speciaal
paar) à deze pigmenten zijn:
o Chlorofyl b: absorbeert licht tussen 450 en 500 nm
o Carotenoïden: absorberen licht tussen 400 en 500 nm
® Carotenoïden beperken ook schade ten gevolge van fotochemische
reacties bij fel zonlicht (hierbij kan zuurstof omgezet worden tot ROS)
® Planten beperken ook ROS-schade door gebruik te maken van nietfotochemische quenching, waarbij lichtenergie wordt vrijgezet als hitte
Een elektron wordt geëxciteerd en valt dan terug naar de grondtoestand; de
energie die hierbij vrijkomt wordt doorgegeven aan een acceptormolecule,
waardoor een elektron van dit molecule geëxciteerd wordt
® Dit proces wordt resonantie-energietransfer genoemd: overdracht van
energie door elektromagnetische interacties door de ruimte
® Een stijging van de afstand met factor 2 leidt tot een vermindering van
energietransfer met factor 2¯ = 64
Licht dat geabsorbeerd wordt door bijkomende pigmenten wordt dus via
resonantie-energietransfer
door
een
“lichtantenne”
gekanaliseerd naar het reactiecentrum; in het reactiecentrum
gebeurt dan scheiding van lading (doorgeven van elektronen)
De antenne of het light-harvesting complex is een geordend
proteïne-pigment complex; dit complex zorgt voor een hogere
efficiëntie door:
o Een veel groter absorptie-oppervlak
o Een complementair absorptiecentrum van bijkomende
pigmentmoleculen (nl. chlorofyl b en carotenoïden)
Zie slides 61-66
126
19.
De Calvin cyclus en de pentosefosfaatweg (H20)
Inleiding
-
-
Fotosynthesereactie: 6 𝐶𝑂# + 12 𝐻# 𝑂 → 𝐶¯ 𝐻]# 𝑂¯ + 5 𝐻# 𝑂 + 6 𝑂#
De fotosynthese bestaat uit 2 fasen:
o Fase 1 (direct licht-afhankelijk): omzetting van licht in chemische energie
® ATP via fotofosforylatie
® Reducerend vermogen (NADPH) voor biosyntheseprocessen
o Fase 2 (licht-onafhankelijk): biosynthese van suikers
® Omvorming van 𝐶𝑂# tot suikers
® Verbruik van ATP en NADPH via de Calvin cyclus (of “Calvin-Benson
cyclus”)
We bespreken nu fase 2
19.1. De Calvin cyclus synthetiseert hexosen uit 𝐶𝑂# en water
-
-
De Calvin cyclus bestaat uit 3 fasen:
o 1. Fixatie van 𝐶𝑂# door ribulose 1,5-bisfosfaat ter vorming van 2 moleculen
3-fosfoglyceraat
o 2. Reductie van 3-fosfoglyceraat ter vorming van hexoses
o 3. Regeneratie van ribulose 1,5-bisfosfaat (anders zou het geen cyclus maar
een lineaire reactieweg zijn)
De reacties vinden plaats in het stroma van de chloroplast (ATP en NADPH zijn
hier aanwezig via de lichtreacties)
127
19.1.1. Fase 1: 𝐶𝑂# -fixatie door rubisco
-
-
-
-
Deze reactie is de snelheidsbepalende stap in de hexosesynthese
Sterk exergonisch (Δ𝐺 °o = −51,9 𝑘𝐽/𝑚𝑜𝑙),
Wordt gekatalyseerd door ribulose 1,5-bisfosfaat carboxylase/oxygenase
(“rubisco”)
® Dit enzym is gelokaliseerd aan het oppervlak van het thylakoïdmembraan
(aan de stromazijde)
® Zeer trage werking: slechts 3 reacties per seconde (mogelijk traagste enzym
op aarde)
® Er is een hoge enzymconcentratie vereist (ongeveer 16% van alle
chloroplastproteïnen is rubisco) à de concentratie van het enzym is veel
hoger dan de concentratie 𝐶𝑂#
Structuur van rubisco:
o Bestaat uit 8 grote (L) en 7 kleine (S) subeenheden à samen 𝑆’ 𝐿’
o De actieve plaats is in de grote subeenheid
𝑀𝑔#1 heeft een essentiële rol in de katalyse:
o Een molecule 𝐶𝑂# bindt aan de lysine zijketen van rubisco ter
vorming van carbamaat (dit is een ander molecule 𝐶𝑂# als dat
aan ribulose 1,5-bisfosfaat bindt)
® Hierbij wordt ook een proton afgesplitst à gebeurt het
best onder alkalische condities (net zoals de 𝐶𝑂# -fixatie)
® Carbamaatvorming wordt versneld door rubisco-activase
o 𝑀𝑔#1 bindt aan de zuurstofmoleculen van 𝐶𝑂# en stabiliseert
zo de negatieve lading à rubisco wordt geactiveerd
Stappen in de reactie:
o Ribulose 1,5-bisfosfaat bindt aan 𝑀𝑔#1 via zijn ketogroep en de naburige
OH-groep
o Deprotonatie van ribulose 1,5-bisfosfaat leidt tot de vorming van het
reactieve enodiolaat intermediair
o Het enodiolaat intermediair bindt met 𝐶𝑂# ter vorming van een onstabiel
ketozuur: 2-carboxy-3-keto-D-arabinitol 1,5-bisfosfaat
® Dit intermediair is gecoördineerd met 𝑀𝑔#1 via 3 groepen
o 𝐻# 𝑂 wordt toegevoegd aan het ketozuur; het intermediair dat gevormd
wordt is onstabiel en splitst in 2 moleculen 3-fosfoglyceraat
128
-
-
-
-
Rubisco-activase is essentieel voor de activiteit van rubisco: in afwezigheid van 𝐶𝑂#
(dus als er geen carbamaat gevormd is) bindt rubisco zeer sterk met ribulose 1,5bisfosfaat, wat de activiteit van rubisco inhibeert à rubisco activase gebruikt ATP
om het gebonden substraat vrij te zetten en de vorming van het carbamaat te
versnellen
® Er is dus ATP nodig, en dit wordt gevormd in de lichtreacties à de
lichtreacties zijn nodig opdat rubisco geactiveerd kan worden
Een probleem met rubisco is dat het niet heel specifiek is: het reactieve enodiolaat
intermediair kan ook met 𝑂# reageren in plaats van 𝐶𝑂# , wat leidt tot de vorming
van slechts 1 molecule 3-fosfoglyceraat en 1 molecule fosfoglycolaat
® Vandaar de “o” (oxygenase) in rubisco
De relatieve reactiesnelheid van carboxylase ten opzichte van oxygenase bedraagt
ongeveer 4 bij 25°C (dus 4 keer meer carboxylase dan oxygenase, wat weinig is);
dit wordt bepaald door:
o De concentratie aan 𝑂# in het stroma: deze is 25 keer hoger dan de 𝐶𝑂# concentratie
o De hogere affiniteit van rubisco voor 𝐶𝑂# : 𝐾“ (𝐶𝑂# ) is 60 keer kleiner dan
𝐾“ (𝑂# )
o De 𝐶𝑂# /𝑂# -specificiteit die daalt bij stijgende temperatuur à hoe warmer,
hoe meer oxygenatie tov. carboxylatie en hoe meer fosfoglycolaat er
gevormd wordt
o Het feit dat carbamaat enkel vormt in aanwezigheid van 𝐶𝑂# , waardoor
exclusieve oxygenatie (als 𝐶𝑂# afwezig is) vermeden wordt
Welke reactie plaatsgrijpt (carboxylatie/oxygenatie) hangt af van de concentraties
van de 2 gassen op de reactieplaats in de chloroplast
Redenen voor gebrekkig rubisco:
o Bij het ontstaan van de fotosynthese was de atmosfeer 𝐶𝑂# -rijk en 𝑂# -arm;
nu is het omgekeerd
o De specificiteit van het enzym nam wel toe, maar dit ging ten koste van zijn
omzettingssnelheid à rubisco werkt zeer traag
o 𝐶𝑂# en 𝑂# zijn moeilijk te onderscheiden op basis van chemische
eigenschappen à passen beide in het substraatkanaal
129
-
Oplossingen:
o 𝐶• -planten concentreren 𝐶𝑂# op de plaats waar rubisco carboxylatie
optreedt, waardoor de oxygenatiereactie sterk afneemt; dit gebeurt mbv.
PEP carboxylase
o Fotorespiratie in planten kan ervoor zorgen dat fosfoglycolaat nog omgezet
wordt tot 3-fosfoglyceraat: 2 𝐶# → 𝐶` + 𝐶] (𝐶𝑂# )
® “Salvage pathway” (“recuperatieweg”)
® Zuurstof wordt verbruikt en 𝐶𝑂# wordt vrijgezet zonder productie van
ATP of NADPH à op deze manier kan tot 25% van de gefixeerde 𝐶𝑂#
verloren gaan (zeer veel)
-
Bij deze eerste (snelheidsbepalende) fase van de Calvin cyclus zijn enkele
belangrijke vereisten:
o Aanwezigheid van ATP
o Alkalische condities
o Aanwezigheid van voldoende 𝐶𝑂#
Fase
2:
vorming
hexosefosfaatverbindingen
19.1.2.
-
-
3-P-glyceraat wordt omgevormd tot hexose monofosfaten
via reacties van de gluconeogenese (met als enige verschil
dat NADPH gebruikt wordt in plaats van NADH); een
belangrijk enzym hierbij is glyceraldehyde 3-fosfaat (GAP)
dehydrogenase
® Dit enzym komt voor in chloroplasten en is specifiek
voor NADPH (niet NADH)
De hexose monofosfaten worden gestockeerd onder de
vorm van zetmeel of sucrose
In deze fase worden energie (ATP) en reducerend vermogen
(NADPH) uit de lichtreacties verbruikt voor de synthese van suikers
19.1.3.
-
van
Fase 3: regeneratie van de 𝐶𝑂# -acceptor
Ribulose 1,5-bisfosfaat is een C5-suiker; dit moet aangemaakt worden uit een C6suiker en een C3-suiker à gebeurt in 3 stappen
130
-
-
-
-
-
-
-
-
In de eerste stap wordt een 2C-eenheid (𝐶𝑂 − 𝐶𝐻# 𝑂𝐻) getransfereerd van een
ketose naar een aldose; deze reactie wordt gekatalyseerd door een transketolase
® Dit transketolase vereist thiaminepyrofosfaat (TPP)
Hier is n = 6 en m = 3; we vertrekken dus van een C6-ketose (frucose-6-fosfaat) en
een C3-aldose (glyceraldehyde-3-fosfaat) en bekomen hieruit een C4-aldose
(erythrose) en een C5-ketose
In de tweede stap wordt het C3-molecule dihydroxyaceton fosfaat (DHAP)
getransfereerd naar een aldose; deze reactie wordt gekatalyseerd door een
aldolase
® Dit aldolase is specifiek voor DHAP maar niet voor het aldose (accepteert
verschillende aldehydes)
Hier is n = 4; we vertrekken dus van een C4-aldose (dit is het C4-aldose dat
bekomen werd in de eerste stap) en een C3-ketose (DHAP) en bekomen hieruit
een C7-ketose (sedoheptulose)
In de derde stap wordt een 2C-eenheid getransfereerd
van het C7-ketose naar glyceraldehyde-3-fosfaat; deze
reactie wordt gekatalyseerd door een transketolase
We vertrekken dus van een C7-ketose (sedoheptulose)
en een C3-aldose (GAP) en bekomen hieruit 2 C5moleculen
De gevormde C5-moleculen worden eerst in isomerisatiereacties omgezet naar
ribulose 5-fosfaat; ribulose 5-fosfaat moet vervolgens omgezet worden naar
rubisco en hiervoor is 1 molecule ATP nodig per molecule rubisco
Globale reactie: fructose 6-P + 3 glyceraldehyde 3-P + DHAP + 3 ATP à 3 ribulose
1,5-bisfosfaat + 3 ADP
131
19.1.4.
-
-
-
-
-
Stoichiometrie van de omvorming van 𝐶𝑂# tot suikers
Er zijn 3 cycli nodig (dus fixatie van 3 moleculen 𝐶𝑂# ) voor de netto synthese van
1 triose; voor de netto synthese van 1 suiker (uit 2 triosen) zijn dus 6 cycli nodig
(fixatie van 6 moleculen 𝐶𝑂# )
De globale reactie is 6 𝐶𝑂# + 18 𝐴𝑇𝑃 + 12 𝑁𝐴𝐷𝑃𝐻 + 12 𝐻# 𝑂 → 𝐶¯ 𝐻]# 𝑂¯ +
18 𝐴𝐷𝑃 + 18 𝑃E + 12 𝑁𝐴𝐷𝑃1 + 6 𝐻1 à voor 6 cycli zijn er 18 moleculen ATP en 12
moleculen NADPH nodig, zodat:
o Er per molecule 𝐶𝑂# 3 ATP en 2 NADPH nodig zijn
o Er per triose 9 ATP en 6 NADPH nodig zijn
o Er per hexose (uit 2 triosen) 18 ATP en 12 NADPH nodig zijn
Ribulose 1,5-bisfosfaat komt niet voor in de globale reactie: heeft een katalytische
rol als regenereerbare acceptor voor 𝐶𝑂# (te vergelijken met de rol van
oxaalacetaat in de citroenzuurcyclus)
De geproduceerde C6-suikers (fructose 6-fosfaat, glucose 6-fosfaat, glucose 1fosfaat) worden opgeslagen in de vorm van zetmeel of scurose
Zetmeel (amylose):
o Plantaardige tegenhanger van glycogeen in dieren
o Polymeer van glucose, maar minder vertakt dan glycogeen (minder 𝛼-1,6glycosidische bindingen)
o De geactiveerde precursor is ADP-glucose, niet UDP-glucose
o Wordt gesynthetiseerd en opgeslagen in chloroplasten
Sucrose:
o Dimeer van glucose en fructose (à disaccharide)
o Fructose 6-fosfaat reageert met UDP-glucose (geactiveerd glucose?) tot
sucrose
o Wordt gesynthetiseerd in het cytoplasma (à triose fosfaten (niet hexose
fosfaten!) worden door een fosfaat translocator getransporteerd over het
chloroplastmembraan in ruil voor fosfaat)
o Suikerbiet, suikerriet
132
19.2. De activiteit van
omgevingscondities
-
-
-
de
Calvin
cyclus
is
afhankelijk
van
Bij overgang van donker naar licht verplaatsen licht-gedreven pompen protonen
van het stroma naar het thylakoïd lumen à de pH in het stroma stijgt van 7 naar
8: alkalische condities, wat gunstig is voor de carbamaatvorming
Doordat protonen van het stroma naar het lumen getransporteerd worden,
ontstaat er een elektrisch veld; om dit elektrisch veld te compenseren, zullen
𝑀𝑔#1 -ionen vanuit het thylakoïd lumen naar het stroma migreren à 𝑀𝑔#1 concentratie in het stroma stijgt à 𝑀𝑔#1 bindt aan het carbamaat waardoor
rubisco geactiveerd wordt
Naast 𝑀𝑔#1 en alkalische condities zijn ook hoge concentraties aan ATP, NADPH
en 𝐹𝑑M=Á belangrijk; ATP is belangrijk voor de werking van rubisco-activase,
NADPH en 𝐹𝑑M=Á zijn belangrijk voor de werking van andere enzymen:
o De lichtreacties leiden tot elektronentransfer van water naar ferredoxine en
NADPH
o Gereduceerd ferredoxine kan zijn elektronen overdragen aan thioredoxine
à gereduceerd thioredoxine activeert vele biosynthese-enzymen zoals
chloroplast ATP-synthase + inhibeert verschillende degradatieve enzymen
o NADPH is een signaalmolecule en activeert 2 biosynthese-enzymen:
fosforibulokinase en glyceraldehyde 3-fosfaat dehydrogenase
19.3. De pentosefosfaatweg genereert NADPH en synthetiseert C5suikers
-
-
Fotosynthetische organismen kunnen NADPH aanmaken in de lichtreacties; vele
niet-fotosynthetische organismen (en niet-fotosynthetische weefsels in planten)
hebben echter ook NADPH nodig, bv. voor vetzuursynthese of nucleotidesynthese
à wordt aangemaakt in de pentosefosfaatweg
® Deze pentosefosfaatweg vindt plaats in het cytoplasma
® Glucose wordt geoxideerd ter vorming van NADPH voor biosynthesen en
oxidatieve stress
® Pentosen worden gevormd voor nucleotiden (DNA, RNA, co-enzymen) en
afgebroken
® Ook andere suikers (C4, C6, C7) worden gevormd
De pentosefosfaatweg bestaat uit 2 delen:
o Een oxidatieve fase waarbij NADPH wordt gegenereerd
o Een niet-oxidatieve fase waarbij gefosforyleerde suikers worden
omgevormd
133
19.3.1. Fase 1: oxidatie van glucose 6-P
-
-
Eerst wordt glucose 6-P gedehydrogeneerd door glucose 6-fosfaat
dehydrogenase; hierbij wordt 6-fosfoglucono-𝛿-lacton gevormd
® Deze stap is quasi-irreversibel en is de snelheidsbepalende stap voor de
oxidatieve fase
® Dit is een redoxreactie: het C1-atoom wordt geoxideerd en 𝑁𝐴𝐷𝑃1 wordt
gereduceerd
® Glucose 6-fosfaat dehydrogenase heeft een zeer hoge specificiteit voor
𝑁𝐴𝐷𝑃1 (𝐾“ (𝑁𝐴𝐷𝑃1 ) is zo’n 1000 keer kleiner dan 𝐾“ (𝑁𝐴𝐷1 )), maar bij lage
niveaus van 𝑁𝐴𝐷𝑃1 (wat meestal het geval is) is het enzym weinig actief à
wanneer de 𝑁𝐴𝐷𝑃1 -concentratie laag is, zal de reactie niet opgaan
Vervolgens wordt het lacton gehydrolyseerd door lactanose; hierbij wordt 6fosfogluconaat gevormd
Tenslotte wordt 6-fosfogluconaat oxidatief gedecarboxyleerd door 6fosfogluconaat dehydrogenase; hierbij wordt ribulose 5-fosfaat gevormd
De nettoreactie van de oxidatieve fase is 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑒 6 − 𝑓𝑜𝑠𝑓𝑎𝑎𝑡 + 2 𝑁𝐴𝐷𝑃1 +
𝐻# 𝑂 → 𝑟𝑖𝑏𝑢𝑙𝑜𝑠𝑒 5 − 𝑓𝑜𝑠𝑓𝑎𝑎𝑡 + 2 𝑁𝐴𝐷𝑃𝐻 + 2 𝐻1 + 𝐶𝑂#
19.3.2. Fase 2: interconversies van gefosforyleerde suikers
-
Een eerste conversie is de omzetting van ribulose 5-fosfaat tot ribose 5-fosfaat
door fosfopentose isomerase
® Ribose 5-fosfaat is een van de bouwstenen van nucleotiden à belangrijk
voor RNA, DNA, ATP, NADH, FAD, co-enzym A
® Ook afgeleiden van ribose 5-fosfaat worden gevormd
134
-
-
Over het algemeen is NADPH meer nodig dan
ribose 5-P à de overmaat aan ribose 5-P wordt in
3 reacties door transketolase en transaldolase
geconverteerd tot glyceraldehyde 3-fosfaat (een
C3-molecule) en fructose 6-fosfaat (een C6molecule), die vervolgens in de gluconeogenese
kunnen worden omgevormd tot glucose 6-fosfaat
(of ze kunnen verder afgebroken worden tot
pyruvaat)
® Op deze manier worden de pentosefosfaatweg en de glycolyse gekoppeld
door 3 reacties
® In de afbeelding zijn de C6, C5 en C1 van de oxidatieve fase respectievelijk
glycose 6-fosfaat, ribulose 5-fosfaat en 𝐶𝑂#
® Let op: in de laatste reactie gaat een C2-eenheid van de C5 naar de C4
De nettoreactie van de niet-oxidatieve fase is 3 𝑟𝑖𝑏𝑜𝑠𝑒 5 − 𝑓𝑜𝑠𝑓𝑎𝑎𝑡 →
2 𝑓𝑟𝑢𝑐𝑡𝑜𝑠𝑒 6 − 𝑓𝑜𝑠𝑓𝑎𝑎𝑡 + 𝑔𝑙𝑦𝑐𝑒𝑟𝑎𝑙𝑑𝑒ℎ𝑦𝑑𝑒 3 − 𝑓𝑜𝑠𝑓𝑎𝑎𝑡
19.3.3. Overzicht van de pentosefosfaatreactieweg
-
De globale reactie van de pentosefosfaatweg is 3 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑒 6 − 𝑓𝑜𝑠𝑓𝑎𝑎𝑡 +
6 𝑁𝐴𝐷𝑃1 + 3 𝐻# 𝑂 → 6 𝑁𝐴𝐷𝑃𝐻 + 6 𝐻1 + 3 𝐶𝑂# + 2 𝑓𝑟𝑢𝑐𝑡𝑜𝑠𝑒 6 − 𝑓𝑜𝑠𝑓𝑎𝑎𝑡 +
𝑔𝑙𝑦𝑐𝑒𝑟𝑎𝑙𝑑𝑒ℎ𝑦𝑑𝑒 3 − 𝑓𝑜𝑠𝑓𝑎𝑎𝑡
In deze reactieweg worden belangrijke intermediairen gevormd die nodig zijn voor
biosynthesereacties
19.4. Metabolisme van glucose 6-P door de pentosefosfaatweg wordt
gecoördineerd met de glycolyse
-
-
-
Glucose 6-fosfaat kan gemetaboliseerd worden in zowel de glycolyse als de
pentosefosfaatweg à op welke manier gebeurt de verdeling van dit metaboliet?
De dehydrogenatie van glucose 6-P is irreversibel en snelheidsbepalend à dient
als controlepunt voor het oxidatief gedeelte à als er veel 𝑁𝐴𝐷𝑃1 aanwezig is, zal
de pentosefosfaatweg actief zijn; de niet-oxidatieve fase wordt voornamelijk
gereguleerd door de beschikbaarheid van de substraten
NADH en NADPH zijn niet uitwisselbaar
® NADH participeert in de synthese van ATP; het wordt aangemaakt in de
glycolyse en de citroenzuurcyclus en verbruikt in de oxidatieve fosforylatie
® NADPH is een reducerend agens; het wordt aangemaakt in de lichtreacties
en verbruikt in de Calvin cyclus en de pentosefosfaatweg
In de cel is
[Ê\w Ë ]
≈ 1000 en
[Ê\wÃ]
[Ê\w• Ë ]
[Ê\w•Ã]
≈ 0,01 à de pentosefosfaatweg is weinig
actief in een klassieke cel, behalve als er NADPH nodig is
135
-
-
-
-
De flow van glucose 6-P is afhankelijk van de noodzaak voor NADPH, ribose 5-P
en ATP
Situatie 1: er is meer nood aan ribose 5-P dan aan NADPH
® Bv. bij sneldelende cellen: hebben veel pentosesuikers nodig voor de
aanmaak van DNA, RNA…
® De oxidatieve fase is in dit geval niet nodig
® De niet-oxidatieve fase zal optreden, maar in de omgekeerde richting:
glucose 6-P wordt in de glycolyse omgevormd tot glycolyse intermediairen,
waaruit dan ribose 5-P gevormd wordt (2 C6 + C3 à 3 C5)
® Globale reactie: 5 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑒 6 − 𝑓𝑜𝑠𝑓𝑎𝑎𝑡 + 𝐴𝑇𝑃 → 6 𝑟𝑖𝑏𝑜𝑠𝑒 5 − 𝑓𝑜𝑠𝑓𝑎𝑎𝑡 +
𝐴𝐷𝑃 + 𝐻1 (4 van deze 5 moleculen glucose 6-fosfaat leveren 4 C6moleculen, het vijfde levert 2 C3-moleculen)
Situatie 2: er is evenveel nood aan ribose 5-P als aan NADPH
® De niet-oxidatieve fase wordt in dit geval beperkt: er zijn geen
interconversies tot andere gefosforyleerde suikers
® De oxidatieve fase zal optreden: er worden 2 moleculen NADPH en 1
molecule ribose 5-fosfaat gevormd
® Globale
reactie:
𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑒 6 − 𝑓𝑜𝑠𝑓𝑎𝑎𝑡 + 2𝑁𝐴𝐷𝑃1 + 𝐻# 𝑂 → 𝑟𝑖𝑏𝑜𝑠𝑒 5 −
𝑓𝑜𝑠𝑓𝑎𝑎𝑡 + 2 𝑁𝐴𝐷𝑃𝐻 + 2 𝐻1 + 𝐶𝑂#
Situatie 3: er is meer nood aan NADPH dan aan ribose 5-P
® Bv. in vetweefsel
® De oxidatieve fase zal optreden: er wordt NADPH gevormd
® De niet-oxidatieve fase zal ook optreden: ribose 5-fosfaat en alle afgeleiden
hiervan worden omgevormd tot glucose 6-fosfaat, dat vervolgens gebruikt
kan worden voor bijkomende NADPH-vorming via de oxidatieve fase
® Er is dus een volledige oxidatie tot 6 moleculen 𝐶𝑂# à 6 cycli nodig (?)
® Globale reactie: 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑒 6 − 𝑓𝑜𝑠𝑓𝑎𝑎𝑡 + 12 𝑁𝐴𝐷𝑃1 + 7 𝐻# 𝑂 → 12 𝑁𝐴𝐷𝑃𝐻 +
12 𝐻1 + 𝑃E + 6 𝐶𝑂#
Situatie 4: er is zowel NADPH als ATP nodig
® De oxidatieve fase zal optreden: er wordt NADPH gevormd
® De niet-oxidatieve fase zal ook optreden: ribose 5-fosfaat en afgeleiden
worden omgevormd tot fructose 6-fosfaat en glyceraldehyde 3-fosfaat, die
vervolgens in de glycolyse verder worden afgebroken tot pyruvaat, met
vrijkomen van ATP (en NADH); pyruvaat wordt nog verder geoxideerd tot
𝐶𝑂# in de citroenzuurcyclus, ook met vorming van ATP
® Globale
reactie:
3 𝑔𝑙𝑢𝑐𝑜𝑠𝑒 6 − 𝑓𝑜𝑠𝑓𝑎𝑎𝑡 + 6𝑁𝐴𝐷𝑃1 + 5 𝑁𝐴𝐷1 + 5 𝑃E +
8 𝐴𝐷𝑃 → 5 𝑝𝑦𝑟𝑢𝑣𝑎𝑎𝑡 + 3 𝐶𝑂# + 6 𝑁𝐴𝐷𝑃𝐻 + 5 𝑁𝐴𝐷𝐻 + 8 𝐴𝑇𝑃 + 2 𝐻# 𝑂 +
8 𝐻1
136