Amminoacidi e Proteine
• Nel 1902, Emil Fischer propose che le proteine fossero lunghe
catene amminoacidiche legate da legami ammidici che egli chiamò
legami peptidici
•
Le proteine sono biomolecole di enorme importanza .
– Strutturale
: pelle, ossa, capelli
(Collagene/ cheratina)
– Catalitica : enzimi
(Ossidoreduttasi, Idrolasi, Isomerasi, etc)
– Muscoli
– Trasporto
: Miosina e Actina
: Emoglobina
– Ormonale : Insulina, Ossitocina, HG ormone
Valore proteico degli alimenti
Alimenti di origine animale  proteine di alta qualità con
composizione di a.a. vicina a proteine umane (ad alto valore
biologico), maggiore digeribilità per proteine globulari che
fibrose.
Cereali e legumi  proteine meno disponibili perché legate a
polisaccaridi o in presenza di fattori antinutrizionali (moderato
valore biologico). Cereali scarsi in lisina e legumi in metionina
Frutta e ortaggi  a basso tenore proteico (3%) con
composizione in a.a. essenziali deficitaria. Anche se in eccesso
rispetto ai fabbisogni calorici, non riescono a coprire quelli
proteici
Le proteine alimentari si trovano in quasi tutti gli alimenti, ne sono
privi oli, zucchero e bevande alcoliche.
Struttura di un a-amminoacido
Tutti gli amminoacidi contengono un gruppo amminico
ed una funzione carbossilica legate ad un carbonio
centrale detto carbonio a, Ca.
a
R CH COOH
NH2
R = residuo in cui
differiscono gli aa.
AA: carbonio a ibridato sp3, con 4 sostituenti diversi, chirale
(presente nelle due forme enantiomere, indicate con D e L)
Nelle proteine troviamo solo L-a-amminoacidi.
Dal punto di vista biochimico, gli aa si dividono in:
- essenziali: devono essere introdotti con la dieta, non sintetizzabili
dall’organismo
(Phe, Val, Thr, Try, Ile, Met, Leu, Lys, His*, Arg*)
- non essenziali: l’organismo è in grado di sintetizzarli.
I composti formati da L-a-amminoacidi si dividono in:
• oligopeptidi
• peptidi
• proteine
(2-20 aa)
(20-100 aa)
(100- diverse migliaia di aa)
In natura esistano più di 300 amminoacidi, soltanto 20 sono
incorporati nelle proteine dei mammiferi poiché sono gli unici
codificati dal DNA
I 20 Amminoacidi
A.A. alifatici
A. A. ciclici
Glicina (Gly)
Alanina (Ala)
Valina (Val)
Leucina (Leu)
Isoleucina (Ile)
Prolina (Pro)
A. A. basici
A. A. con catene laterali contenenti gruppi ossidrilici o zolfo
Serina (ser)
Cisteina (Cys)
Treonina (Thr)
Metionina (Met)
Istidina (His) Lisina (Lys) Arginina (arg)
A. A. aromatici
A. A. acidi e le loro ammidi
Fenilalanina (Phe)
Tirosina (Tyr)
Triptofano (Trp)
Acido aspartico (Asp) Ac glutammico (Glu) Asparagina (Asn) Glutammina (Gln)
Caratteristiche Acido- Base
Ione dipolare
Carbossilato
(basico)
-
Gruppo
alchilammonio
(acido)
Stereochimica del carbonio a
COOH
H
a
NH2 C H
N
H
R
Serie sterica L
C
Ca
O
R
COOH
CHO
HO
O H
H
H
CH2 OH
L-(-) -gliceraldeide
H2N
C
COOH
H
R
L-amminoacido naturale
H2N
H
R
proiezione di Fische
di un L-amminoacido
IONE DIPOLARE o ZWITTERIONE
Quando un amminoacido viene sciolto in H2O diventa uno ione dipolare
(zwitterione)
R CH COOH
Valore teorico
R CH COO-
NH
.. 2
NH3+
pKa --COOH ~ 4.76
pKa –NH3+ ~ 10.6
H
pKa ~ 9,5 H +
N
H
H
pKa ~2
O H
Ca
R
-
C
O
Valore sperimentale
La forma
zwitterionica è la
struttura corretta di
un amminoacido a
pH neutro
Alto punto di fusione (si decompongono a circa 200- 250°C)
Le proprietà acido-base degli
amminoacidi
Il termine zwitterione si usa per indicare una struttura ionica dipolare in
cui il gruppo amminico è presente in forma protonata come ione ammonio
ed il carbossile, in forma deprotonata, come anione carbossilato.
Gli a.a. sono composti anfoteri, nel senso che si possono comportare sia
da acidi, cedendo un protone ad una base forte, che da basi,
accettando un protone da un acido forte
Equilibri per un a.a. con un solo gruppo amminico ed un solo
carbossile
RCHCOOH
OHH+
NH3
a.a. a pH acido
RCHCOONH3
ione dipolare
a pH neutro
OHH+
RCHCOONH2
a.a. a pH basico
PUNTO ISOELETTRICO
IONE DIPOLARE : è la specie predominante al pH in cui il numero
delle cariche positive eguaglia il numero delle cariche negative (carica
netta 0)
Il PUNTO Isoelettrico (P.I.) corrisponde al pH dell’amminoacido in
cui è massima la concentrazione dello Ione Dipolare
P.I. = pKa COOH
+ pKa NH3+
2
Ogni amminoacido ha un punto isoelettrico diverso
INTEGRATORI di AA
A.A. alifatici
 BCAA
BCAA
(Branched Chain AminoAcids)
 Creatina
PEPTIDI
– peptide: è il nome dato a un polimero costituito da un numero
relativamente basso di unità monomeriche; la classificazione
avviene in base al numero di unità amminoacidiche della catena
– dipeptide: è costituito da due unità amminoacidiche
– tripeptide: è costituito da tre unità amminoacidiche
– polipeptide: contiene più di 12 unità
– proteina: una macromolecola con peso molecolare di 5000 g/mol
o più, costituita da una o più catene polipeptidiche
Serina
Estremità
N-terminale
+ Alanina
Serilalanina
Estemità
C-terminale
Legame ammidico
• Per convenzione, il primo amminoacido scritto a
sinistra ha il gruppo -NH3+ libero e l’ultimo scritto a
destra ha un gruppo -CO2- libero
Amminoacido
N-terminal
N-terminale
amino acid
Legame
peptide
peptidico
bonds
O
O
Amminoacido
C-terminal
C-terminale
amino
acid
+
H3 NCHC- NHCHC- NHCHCO 2
CH2 OH CH2
C 6 H5
Ser-Phe-Asp
CH2 CO 2
-
STRUTTURA del LEGAME PEPTIDICO
Il legame peptidico (ammidico) è un ibrido di due
strutture limiti di risonanza
Ca
C
••
H
(1)
-
C
N
Ca
O
••
••
O
••
••
••
+
Ca
N
Ca
H
(2)
Sei atomi appartenenti al legame
peptidico giacciono nello stesso piano
Cisteina/cistina
Cisteina
Cistina
• La formazione di questi ponti disolfuro gioca un
ruolo importante nel mantenere la struttura
terziaria delle proteine
• Si possono formare ponti disolfuro intramolecolari
ed intermolecolari
Proteine
I QUATTRO livelli della struttura di una proteina
INSULINA
Struttura Primaria:
•Struttura Primaria: rappresenta la sequenza lineare
amminoacidica letta dall’amminoacido N-terminale a quello Cterminale.
La determinazione della struttura primaria prevede:
1. Analisi Quali-quantitativa degli amminoacidi
2. Determinazione della sequenza
STRUTTURA SECONDARIA
Rappresenta il “ripiegamento” o conformazione degli aa in regioni
localizzate di un peptide o di una proteina.
Sono possibili due strutture secondarie:
 a-elica
foglietto ripiegato o di tipo b
…..Vincolo…..
a-elica
FOGLIETTO RIPIEGATO o di tipo b
b Sheet
Stabilizzata da legami H
intercatena tra N-H / C=O
-Orientazione antiparallela.
-Buoni ponti–H
-Più stabile
Struttura Terziaria:
Struttura terziaria: ripiegamento della struttura secondaria dovuto alla
formazione di legami fra i residui R degli aa del filamento (a ponte
d’idrogeno, interazioni idrofobiche, legami ionici, legami covalenti tipo ponti
disolfuro -S-S-, interazioni dipolo-dipolo).
Ogni proteina deve assumere una struttura tridimensionale precisa
correlata alla sua funzione.
collagene
mioglobina
costituisce la componente
principale della matrice
extracellulare e dei tessuti
connettivi (le cartilagini e le ossa)
Proteina contenente eme,
presente nel citoplasma delle
fibre muscolari dei Vertebrati
Riserva di Ossigeno
Fibroina (seta)
Riassumendo….
Struttura
primaria
Struttura
secondaria
Struttura
terziaria
DENATURAZIONE
Alterazione irreversibile della struttura secondaria e
terziaria.
1- Per variazione di pH
2- Con il calore
3- Formazione di schiume
4- Azione chelante con ioni Metallici
Struttura Quaternaria
Eme
Emoglobina : 4
catene polipeptidiche
Struttura quaternaria: solo nelle proteine formate da più catene
polipeptidiche, con propria struttura tridimensionale, e che
rappresenta la disposizione di una catena rispetto all’altra.
Determinazione della sequenza
ANEMIA FALCIFORME
Ac. Glutammico
Valina
La SOSTITUZIONE dell’Acido glutammico con la Valina nella struttura primaria
determina una alterazione della struttura secondaria, terziaria e quaternaria.
Determinazione della struttura primaria di
peptidi e proteine
Analisi Qualitativa : Analisi e Identificazione degli
amminoacidi presenti
-
Idrolisi acida. E' il metodo più usato per l'idrolisi totale dei
peptidi allo scopo di analizzare gli amminoacidi
Condizioni standard: HCl acquoso 6M 110°C, 24 ore
Segue la separazione e l’analisi (Analizzatore automatico)
• Analisi Quantitativa degli amminoacidi presenti
• Determinazione della sequenza degli amminoacidi
presenti
METODI ENZIMATICI: Specificità degli enzimi idrolitici
Endopeptidasi
Sito della scissione
- Tripsina
Lys, Arg
- Chimptripsina
Phe, Trp, Tyr
“
“
- Clostripaina
Arg
“
“
- Pepsina
Asp, Glu, Leu, Phe, Trp, Tyr
- Termolisina
Leu, Ile, Val estremità amminica
estremità –COOH
Val-Phe-Leu-Met-Tyr-Pro-Gly-Trp-Cys-Glu-Asp-Ile-Lys-Ser-Arg-His
chimotripsina
tripsina
“
Se il peptide possiede 50 - 60 residui, può essere sequenziato partendo
dalla porzione N-terminale e impiegando METODI CHIMICI (Metodo di
Sanger oppure Edman).
Se la proteina contiene diverse centinaia di aa, viene idrolizzata per
ottenere dei frammenti sufficientemente brevi da poter essere
sequenziati individualmente. Poi, partendo dalla sequenza dei tratti
sovrapposti si ricostruisce la struttura primaria della proteina intatta
Le proteine possono essere scisse impiegando:
Metodi ENZIMATICI
Metodi CHIMICI
METODI DI INDAGINE
- Sequenziamento C-terminale (metodo enzimatico)
- Sequenziamento N-terminale (metodo Chimico)
- Sequenziamento attraverso Spettrometria di Massa
Identificazione dell’amminoacido C-terminale
L'identificazione dell'amminoacido C-terminale di una sequenza
amminoacidica viene effettuata impiegando un enzima, la carbossipeptidasi,
in grado di idrolizzare il legame peptidico a partire esclusivamente dall'unità
C-terminale
C-terminale
Il sito attivo della carbossipeptidasi
accoglie l’amminoacido C-terminale
Metodi CHIMICI
Sequenziamento e Determinazione dell’estremità
N-terminale
Metodo di SANGER
1-fluoro-2,4-dinitrobenzene
Degradazione di EDMAN
Fenilisotiocianato /
Isotiocianato di fenile
Degradazione di SANGER
FDNB
+
(Marcatura)
1-fluoro-2,4-dinitrobenzene
NO2
H3C
NO2
2.
(Idrolisi con
HCl 6N)
NO2
+
NO2
Aminoacido N-terminale marcato
+ HF
Degradazione di Edman
fenilisotiocianato
PTH-Alanina
Peptide accorciato di 1 unità
Degradazione di Edman
Vantaggi:
Procedura automatizzata
Limiti:
Apparecchiature costose
Peptide intatto
Primo
step
Secondo
step
Si riescono a determinare
solo 40 - 50 AA in
sequenza.
Per questo motivo la proteina
da sequenziare è scissa in
frammenti più piccoli.
Per ciascun peptide ottenuto
si procede alla determinazione
della sequenza. Mediante il
principio della sovrapposizione
dei peptidi si arriva alla
definizione della sequenza
della proteina
Proteina
Idrolisi acida
Idrolisi enzimatica
Analisi quantitativa e
qualitativa degli aa
Peptidi
Determinazione aa. N-terminale
Determinazione ponti disolfuro
Determinazione aa.
N-terminale
Tagli specifici con metodi enzimatici
Ricostruzione della sequenza
Determinazione
ponti disolfuro
O
R
O
R1