COMPARATIVA DE PROTOCOLOS DE
CULTIVO PRIMARIO DE CÉLULAS
UROTELIALES
PROFESORA: VICTORIA MORENO MANZANO
ASIGNATURA: CULTIVOS CELULARES
ALUMNOS: GONZALO DOCAMPO DAMEÁ, JOSÉ GARCÍA MARTÍNEZ
3º BIOTECNOLOGÍA
1
TÍTULO
Comparativa de protocolos de cultivo primario de células uroteliales
ABSTRACT
Las células uroteliales son células especializadas que cubren la superficie interior del
tracto urinario, incluyendo la pelvis renal, la vejiga, los uréteres, la uretra superior y
los conductos centrales de la próstata. Se compararon cinco métodos para el
establecimiento de cultivos uroteliales porcinos primarios: un método de explante de
tejido y cuatro métodos enzimáticos que utilizan colagenasa II, dispasa II,
combinación de dispasa II y tripsina, y tripsina sola. El número promedio de células
aisladas, morfología celular, éxito del cultivo establecido, número medio de células
desde el primer pase, expresión de p63 y pancitoqueratina, la caracterización del
crecimiento de células uroteliales y el envejecimiento se analizaron durante el cultivo
in vitro. Él método que utiliza dispasa II fue el método más eficiente y reproducible
para el aislamiento y cultivo de células uroteliales porcinas en comparación con los
otros métodos probados. Las células uroteliales obtenidas por este método crecieron
considerablemente bien y establecieron cultivos con alta eficiencia, lo que nos
permitió obtener una gran cantidad de células con morfología normal. La
contaminación con fibroblastos en este método fue la más baja. La utilización de un
método adecuado para el aislamiento de células uroteliales es un paso crítico en la
regeneración del tracto urinario cuando se utilizan técnicas de ingeniería de tejidos.
En resumen, este estudio demostró que al utilizar el método descrito con dispasa II,
se logró un número adecuado de células, demostrando que este método es el más
útil para regeneración de tejidos.
INTRODUCCIÓN
Son células epiteliales muy especializadas que poseen ciertas características
particulares, impartiendo roles funcionales importantes en el sistema urinario.
Protegen los tejidos musculares subyacentes de los efectos cáusticos de la orina
mientras que se expande con el llenado de la vejiga para ajustar la presión de la orina
y actúan como barrera de permeabilidad. El urotelio multicapa suele estar
estructurado con células superficiales maduras y diferenciadas y otras células basales
menos maduras.
La capa de células basales contiene células madre específicas capaces de
autorrenovarse durante la vida de mamífero y también producen un conjunto de
células maduras para la homeostasis tisular.
El mantenimiento de células basales regenerativas en un cultivo facilita el crecimiento
de células uroteliales in vitro. Estos cultivos son útiles para estudiar la biología y
fisiología del tracto urinario, particularmente para el desarrollo de estrategias de
ingeniería de tejidos en urología.
2
La creación del sustituto in vitro de la pared de la vejiga urinaria requiere un gran
número de células. Por lo tanto, la elaboración de métodos eficientes de aislamiento
y cultivo de células uroteliales es un factor de éxito esencial.
En muchos estudios, no se analizó la regeneración urotelial en la vejiga urinaria echa
por ingeniería tisular, y es por eso por lo que debe intentar resolver la falta de
estandarización del enfoque en cuanto al cultivo primario de células uroteliales y para
ello se realizó un cultivo por el método más recomendado actualmente para
comprobar su eficacia respecto a otro método cuyos datos han sido recogidos
previamente.
En un intento de resolver la falta de una estandarización de enfoque para el
establecimiento de cultivo de células uroteliales primarias, comparamos cinco
técnicas diferentes. Proporcionamos algunas modificaciones a cada método para
obtener condiciones más unificada, que ayudó con una mayor comparación de los
resultados obtenidos. El objetivo de este estudio fue desarrollar un eficiente y
reproducible método para el aislamiento y cultivo de células uroteliales porcinas.
MATERIALES: REACTIVOS E INSTUMENTAL
LISTA DE REACTIVOS E INSTRUMENTAL EMPLEADOS
-
PREPARACIÓN PREVIA DEL TEJIDO
REACTIVOS
INSTRUMENTAL
Medio DMEM/Ham´2 F12 (Dublecco´s Placa Petri
modified Eagle medium, HyClone, USA)
Antibióticos (penicillin 100 U/mL,
streptomycin 100mg/mL, amphotericin B
5mg/mL, Sigma–Aldrich, Germany)
Agua destilada
Solución salina tamponada con fosfato
(PBS, HyClone, USA)
Suero Fetal Bovino 10% (FBS, SigmaAldrich, Germany)
(suplemento de crecimiento)
Antibióticos (penicillin 100 U/ mL,
streptomycin 100 mg/mL, amphotericin
B 5mg/mL, metronidazole 100mg/mL)
(para la prevención del crecimiento)
Medio de cultivo
Vejiga de cerdo macho
Tijeras
Marcadores de sutura
Pipeta gilson
Agua destilada
Guantes
___________
3
-
MÉTODO 1
REACTIVOS
5 mL de CnT-58 (Cellntech, Suiza)
Medio de cultivo
______________
-
MÉTODO 2
REACTIVOS
Solución decapante
Solución salina equilibrada de Hank
[HBSS, Sigma-Aldrich,
Alemania] enriquecido con HEPES [1%,
PAA, Austria]
Solución salina equilibrada de Hank
[HBSS, Sigma-Aldrich,
Alemania] enriquecido con HEPES [1%,
PAA, Austria]
EDTA (9%; químico polaco Reactivos,
Polonia)
Solución II (100 U/mL, Gibco, EE. UU.)
Medio de cultivo
-
INSTRUMENTAL
Tubo cónico
Bisturí
Centrifugadora
Pipeta Gilson
Guantes
Placa Petri
MÉTODO 3
REACTIVOS
Dispasa II (Gibco, USA)
HBSS (2,4 U/mL)
Medio de cultivo
___________
___________
-
INSTRUMENTAL
Placa Petri
Pipeta Gilson
Guantes
INSTRUMENTAL
Bisturí
Centrifugadora
Pipeta Gilson
Guantes
Placa Petri
MÉTODO 4
REACTIVOS
5 mL de dispasa II (Gibco, EE. UU.)
HBSS (2,4 U/mL)
2 ml de solución de tripsina (0,25%,
Biomed, Polonia)/EDTA (0,02 %,
reactivos químicos polacos, Polonia)
Medio de cultivo
_________
INSTRUMENTAL
Bisturí
Centrifugadora
Agitador magnético
Pipeta Gilson
Guantes
4
-
MÉTODO 5
REACTIVOS
Tripsina al 0,25%/EDTA al 0,02%
Medio de cultivo
_____________
_____________
_____________
INSTRUMENTAL
Bisturí
Pipeta Gilson
Placa Petri
Centrifugadora
Guantes
MÉTODOS
-
PREPARACIÓN PREVIA DEL TEJIDO
Se utilizaron 4 cerdos domésticos machos (129 kg). Después de recolectar las vejigas
fueron sumergidas en medio DMEM/Ham´2 F12 (Dublecco´s modified Eagle medium,
HyClone, USA) suplementado con antibióticos (penicillin 100 U/mL, streptomycin
100mg/mL, amphotericin B 5mg/mL, Sigma–Aldrich, Germany).
Cada vejiga fue transferida a una placa Petri y se abrió longitudinalmente con un par
de tijeras y la región del trígono fue cortada y excluida de los siguientes
procedimientos.
A continuación, la vejiga fue transferida a agua destilada 1 minuto y se colocó en un
medio fresco complementado con antibióticos. En condiciones estériles, el urotelio fue
separado del estroma subyacente y la capa de músculo liso. El tejido aislado se cortó
en piezas y se usaron marcadores de sutura para marcar las superficies uroteliales.
Las piezas de tejido obtenidas se lavaron cinco veces en solución salina tamponada
con fosfato (PBS, HyClone, USA), luego se colocaron en el medio DMED/Ham´s F12,
suplementado con Suero Fetal Bovino 10% (FBS, Sigma-Aldrich, Germany) y
antibióticos (penicillin 100 U/ mL, streptomycin 100 mg/mL, amphotericin B 5mg/mL,
metronidazole 100mg/mL)
-
AISLAMIENTO DE CÉLULAS UROTELIALES
Cinco métodos descritos previamente por otros autores (tejido explantes y cuatro
métodos enzimáticos), con unas pocas modificaciones (Tabla S1), se compararon con
el fin de elaborar un método eficiente y reproducible para la aislamiento y cultivo de
células uroteliales porcinas.
Se realizaron un total de 175 aislamientos (35 aislamientos/método). Para excluir una
posible
variabilidad
interindividual,
comparamos
los
rendimientos
de 25 aislamientos de cada vejiga (5 aislamientos/método/vejiga).
5
-
MÉTODO 1
Cada explante (2–3 mm2) se orientó correctamente en una placa Petri, de modo que
el urotelio estaba en el lado inferior. Entonces, los explantes se incubaron sin el medio
de cultivo por 20 min, hasta la fijación. Después de eso, 5 mL de CnT-58
se añadieron al medio (Cellntec, Suiza).
-
MÉTODO 2
Las piezas de tejido (1 1 cm) se incubaron durante 15 h a 4ºC en un tubo cónico que
contiene 5 mL de solución decapante (son soluciones isotónicas utilizadas para
mantener la osmolalidad y el pH en aplicaciones biológicas. Tanto HBSS como EBSS
incluyen glucosa y bicarbonato de sodio para el mantenimiento a corto plazo de las
células fuera del medio de cultivo.) (Solución salina equilibrada de Hank [HBSS,
Sigma-Aldrich, Alemania] enriquecido con HEPES [1%, PAA, Austria], aprotinina de
pulmón bovino [1 KIU- 27,75 ml, Sigma–Aldrich, Alemania] y EDTA [9%; químico
polaco Reactivos, Polonia]). Luego, usando el lado romo de un bisturí, la superficie
urotelial se raspó mecánicamente de la pieza de tejido. La suspensión celular
obtenida después de la centrifugación (350 g, 5 min) se resuspendió en 2 mL de
solución de colagenasa II (100 U/mL, Gibco, EE. UU.). Las células raspadas fueron
digeridas con agitación durante 20 min a 37 C. Después de la inactivación de la
colagenasa, la suspensión celular se centrifugó a 350 g durante 5 min y el sedimento
celular obtenido se resuspendido en el medio de cultivo.
-
MÉTODO 3
Las piezas de tejido (1 x 1 cm) se digirieron durante la noche (15 h) a 4 C en dispasa
II (Gibco, USA) y disuelto en HBSS (2,4 U/mL). Después de la inactivación enzimática,
el urotelio se raspó cuidadosamente con el lado romo de un bisturí y
se descartó el tejido restante. Entonces, aparte de los conglomerados, las células
uroteliales se centrifugaron a 350 g durante 5 min. Después de descartar el
sobrenadante, el sedimento celular se resuspendió en medio de cultivo.
-
MÉTODO 4
Se digirieron trozos de tejido (1 1 cm) con 5 mL de dispasa II (Gibco, EE. UU.) en
HBSS (2,4 U/mL) durante 30 min a 37 C con agitación a baja velocidad. Después de
la inactivación, las células uroteliales se separaron de los tejidos subyacentes
mediante suaves raspados, utilizando el lado romo del bisturí. Después de que se
eliminaran los residuos de las piezas, las células raspadas junto con la solución fueron
centrifugadas. El sedimento obtenido fue digerido con 2 ml de solución de tripsina
(0,25%, Biomed, Polonia)/EDTA (0,02 %, reactivos químicos polacos, Polonia)
durante 15–20 min a 37 C con agitación. Después de la inactivación enzimática y
6
centrifugación de la suspensión celular (350g, 5 min), el sedimento celular se
resuspendió en el cultivo medio.
-
MÉTODO 5
Las piezas de tejido (1 1 cm) se incubaron durante la noche (15 h) a 4°C en tripsina
al 0,25%/EDTA al 0,02%. Después de la activación enzimática, las células uroteliales
se rasparon suavemente y los residuos de tejido se excluyeron
La suspensión celular obtenida se centrifugó durante 5 min a 350g y fue resuspendida
en el medio de cultivo.
ESQUEMA PROTOCOLOS
Preparación previa del tejido
1. Recolectar vejigas de cerdo macho (~129 kg)
2. Se sumergen las vejigas en medio DMEM/Ham´2 F12 suplementado con antibiótico
3. Preparar vejiga y sumergir en agua destilada (1 min)
4. Se coloca la vejiga en un medio fresco con antibióticos.
5. Se separa el urotelio de las demás partes de la vejiga y este se corta en piezas.
6. Ahora, se lavan las piezas se lavan 5 veces en solución salina tamponada con
fosfato y se colocan de nuevo en el medio DMEM/Ham´2 F12, suplementado con
Suero Fetal Bovino 10%
a.
b)
c)
d)
e)
Ilustración 1: Reactivos e instrumental preparación previa del tejido: a) Vejiga
de cerdo macho; b) Medio DMEM/Ham´2 F12; c) Antibióticos (penicillin 100 U/mL,
streptomycin 100mg/mL, amphotericin B 5mg/mL, Sigma–Aldrich, Germany); d)
Solución salina tamponada; e) Suero Fetal Bovino 10%
7
MÉTODO 1
1.Se coloca cada explante en una placa Petri, quedando el urotelio en la parte inferior.
2. Incubar cada explante sin medio durante 20 min.
3.Finalmente, añadir 5 ml de CnT-58 al medio.
a)
b)
Ilustración 2: Reactivos e instrumental método 1: a) Placa Petri; b) CnT-58
(medio)
MÉTODO 2
1. Incubar piezas de tejido durante 15 h a 4 ºC en un tubo cónico con solución
decapante.
2. Separar el urotelio con bisturí.
3. Centrifugar a 350 g durante 5 min.
4. Suspender en 2 ml de Solución II.
5. Centrifugar de nuevo a 350 g durante 5 min.
6. Suspender el sedimento celular obtenido en medio de cultivo (CnT-58).
a)
b)
c)
d)
Ilustración 3: Reactivos e instrumental método 2: a) Tubo cónico; b) Bisturí; c)
Centrifugadora; d) CnT-58 (medio)
8
MÉTODO 3
1. Digerir piezas de tejido durante la noche (15 h) a 4 ºC en dispasa II.
2. Disolver en HBSS (2,4 U/ml)
3. Separar urotelio del resto de la vejiga.
4. Centrifugar células uroteliales a 350 g durante 5 min.
5. Suspender sedimento celular en medio de cultivo.
a)
b)
c)
d)
e)
Ilustración 4: Reactivos e instrumental método 3: a) Dispasa II, b) HBSS (2,4
U/ml), c) Bisturí, d) Centrifugadora, e) CnT-58 (medio)
MÉTODO 4
1. Digerir trozos de tejido 1x1 cm en 5 ml de dispasa II y con HBSS (2,4 U/ml).
2. Agitar durante 30 min a 37 ºC con agitación a baja velocidad.
3. Separar el urotelio con bisturí.
4. Centrifugar urotelio con la solución.
5. Digerir sedimento con tripsina/ EDTA durante 15-20 min a 37 ºC con agitación
lenta.
6. Volver a centrifugar a 350 g durante 5 min.
7. Suspender en medio de cultivo.
a)
b)
c)
d)
e)
Ilustración 5: Reactivos e instrumental método 4: a) Dispasa II, b) HBSS (2,4
U/ml), c) ripsina 0,25%/EDTA al 0,02% d) Centrifugadora, e) CnT-58 (medio)
9
MÉTODO 5
1.Incubar piezas de tejido 15h a 4º en tripsina 0,25%/EDTA al 0,02%
2.Raspar suavemente células uroteliales y excluir residuos
3. Centrifugar suspensión celular obtenida 5 min a 350g
4. Resuspender en el medio de cultivo
a)
b)
c)
Ilustración 6: Reactivos e instrumental método 5: a) tripsina 0,25%/EDTA al
0,02%; b) centrifugadora; c) CnT-58 (medio)
CARACTERIZACIÓN DEL CULTIVO OBTENIDO
-
DENSIDAD DE LA SIEMBRA
Las células aisladas se sembraron a una densidad de 4 x 10 4 células/ cm2 y se
cultivaron en medio de crecimiento CnT-58 (CELLnTEC, Suiza). El medio de cultivo
se cambió cada 2–3 días. Las células se cultivaron en condiciones estándar a 37 C
con 5% CO2 y 98% humedad. Las células cultivadas fueron separadas de la
superficie de crecimiento con el uso de solución de accutase (0,13 mL–1 cm2)
(Sigma-Aldrich, Alemania)
-
TASA DE ÉXITO DEL CULTIVO PRIMARIO
El éxito de establecer un cultivo primario de células uriteliales se definió como las
células que han alcanzado el 75-95% de confluencia sin infecciones simultaneas o
características de envejecimiento celular. La siguiente fórmula fue usada:
10
S – tasa de éxito del método aplicado
nt: nº total de cultivos establecidos
nk: nº cultivos establecido con éxito
-
ANÁLISIS HISTOLÓGICO/CITOLÓGICO
El sedimento celular obtenido después del primer pase fue resuspendido en 100 mL
de ácido algínico (1,5%, Sigma– Aldrich, Alemania). Las gotas de suspensión fueron
cuidadosamente añadidas en la placa de Petri con cloruro de calcio (0,1 M,
Reactivos químicos polacos, Polonia). Las “perlas de alginato” se dejaron en el cloruro
de calcio hasta su gelificación. Entonces fueron fijados con solución de formalina
tamponada (10%). Fragmentos de la pared vesical (1 1 cm) y piezas de tejido de la
vejiga urinaria también se analizaron después de la preparación. Los fragmentos se
fijaron con solución de formalina tamponada (10%).
-
TINCIÓN CON HEMATOXICILINA-EOSINA
La tinción con hematoxilina-eosina se realizó automáticamente en el aparato Shandon
Varistain 24-4 (Thermo científico, EE. UU.).
-
TINCIÓN INMUNOHISTOQUÍMICA/INMUNOCITOQUÍMICA
Los determinantes antigénicos fueron expuestos por calentamiento en el
Target Retrieval Solution buffer (pH ¼ 9, Dako, Dinamarca) en un baño de agua
durante 40 min a 95–99 C. Actividad endógena de la peroxidasa fue inhibida por la
incubación en 3% de H2O2 durante 10 min. La adición de 5% de BSA (Sigma-Aldrich,
Alemania) bloqueó la unión no específica de anticuerpos. Luego, los portaobjetos con
tejido se incubaron con anticuerpos monoclonales contra la proteína p63 (Roche,
Suiza), contra la pancitoqueratina y contra la actina muscular lisa (SMA, Abcam, EE.
UU.). Después de eso, se llevó a cabo una incubación con anticuerpos secundarios
(EinVisionTMþ FLEX anti-Ratón/Conejo HRP, Dako, Dinamarca). Complejos
antígeno- anticuerpos se visualizaron utilizando 83.30 -diaminobenzidine (DAB(þ)
Chromogen, DAB(þ) Substrate Buffer; Dako, Denmark).
Se establecieron los niveles de expresión del marcador analizado sobre la base de la
escala IRS de 5 puntos (puntuación inmunorreactiva) por Remmele (Remmele y
Stegner 1987): (1) <10%; (2) 10–50%; (3) 51–80%; (4) >80% de células positivas.
También tomamos en cuenta la representatividad de 3 puntos de los especímenes
como sigue: (1) baja concentración de células; (2) concentración intermedia de
células; (3) rica concentración de células.
11
CARACTERIZACIÓN DEL CRECIMIENTO DE CÉLULAS UROTELIALES IN
VITRO
Las células uroteliales del primer pase se sembraron en 24 placas de cultivo a la
densidad
de
4
x
104
células/cm2
por
pocillo.
La viabilidad celular se midió utilizando el ensayo MTT y la prueba de exclusión de
azul de triptano.
-
ENVEJECIMIENTO DE LAS CÉLULAS UROTELIALES
El envejecimiento celular se analizó utilizando el Kit de tinción de la b-galactosidasa
según las instrucciones del fabricante (Clontech, EE. UU.). Como control negativo. Se
utilizó la línea celular 3T3-mouse fibroblast (NIH/3T3 es una línea celular de
fibroblastos que se aisló de un embrión NIH/Swiss de ratón. Esta línea celular es muy
sensible a la formación de focos del virus del sarcoma y la propagación del virus de
la leucemia y ha demostrado ser muy útil en los estudios de transfección de ADN)
El porcentaje de envejecimiento celular se calculó mediante el uso del software
Photoshop (Photoshop CC, EE. UU.).
-
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Las comparaciones de los resultados obtenidos se realizaron entre los grupos usando
ANOVA con la prueba post hoc NIR. Los datos fueron analizados por SPSS Statistica
(SPSS, EE. UU.). Se utilizó como medida fiable el nivel de significancia P < 0,05
12
RESULTADOS
-
EFICIENCIA DEL ASILAMIENTO
Los resultados mostraron que con el método 3 se obtuvo el mayor número de células
aisladas (22.9 ± 5.8 × 105 células, P < 0.001), mientras que con el método 2 se obtuvo
el menor número (6.1 ± 1.7 × 105 células). En los métodos 4 y 5 se obtuvieron
17.5 ± 4.0 × 105
y 1.8 ± 4.4 × 105 células respectivamente (P > 0.1)
Se utilizó una tabla para recoger el número de células aisladas en los diferentes
métodos utilizados:
Figura 1
Eficiencia de aislamiento: En esta tabla se recoge el número de células aisladas
obtenidas mediante los cuatro métodos enzimáticos diferentes. Se observó
significancia estadística entre los resultados para los métodos 2 y 3, 2 y 4, 2 y 5, 3
y 4, 3 y 5 (P < 0.001) (a). Cultivo urotelial primario al 2.º día y al último día de cultivo
(b-j, c-k, respectivamente). Método 1 (b y c): Día 2: se observaron varios
conglomerados celulares no adheridos, donde una flecha indica la pequeña colonia
urotelial (b). Día 7: la flecha muestra las células planas y grandes, que son signos
morfológicos de senescencia (c). Método 2 (d y e): Las primeras colonias visibles
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se observaron el segundo día. La flecha indica contaminación con células similares
a fibroblastos (d). El séptimo día, el crecimiento de células de tipo epitelial fue
confluente (e). Método 3 (f y g): el segundo día, las células adheridas cubrieron el
50 % de la superficie de crecimiento (f). El cuarto día, las células de tipo urotelial se
adhirieron correctamente al cultivo (g). Método 4 (h e i): Día 2: la flecha muestra
una célula similar a fibroblastos (h). La monocapa de las pequeñas células
uroteliales no fue visible hasta el día 7. Método 5 (j y k): Día 2: el círculo marcó
células de tipo epitelial. La flecha indica la célula similar a fibroblastos (j). Día 7: las
células en el círculo no son típicamente epitelioides, sino que aparecen como
células empedradas, con un contorno borroso (k). Las imágenes fueron obtenidas
con un microscopio invertido, a 10x aumentos y con una barra de 125 μm.
-
TASA DE ÉXITO DE LOS CULTIVOS PRIMARIOS
Los métodos más efectivos para el establecimiento de un cultivo de células uroteliales
primarias fueron los que utilizaron la dispasa II (Método 3) y la combinación de
dispasa II y tripsina/EDTA (Método 4). Más del 80 % (Método 4) o incluso el 90 %
(Método 3) de los cultivos primarios establecidos mediante estos métodos tuvieron
éxito. Con la tripsina/EDTA (Método 5) se obtuvo una tasa de éxito de alrededor del
50 %. Todos los cultivos establecidos a partir de los explantes de tejido (Método 1)
no tuvieron éxito, de manera similar, como la mayoría de los cultivos primarios
establecidos utilizando la colagenasa II (Método 2). Por ende, las técnicas que utilizan
los explantes de tejido y la digestión con colagenasa II fueron los métodos menos
efectivos en este estudio.
-
FENOTIPO CELULAR
La expresión de la proteína p63 y la pancitoqueratina fue bien visible en todos los
cultivos celulares establecidos. La expresión de pancitoqueratina confirmó el origen
epitelial de las células aisladas, mientras que la expresión de la proteína p63 reveló
la presencia de potenciales células madre uroteliales (células basales). El nivel de
expresión de p63 y pancitoqueratina en las células uroteliales fue comparable entre
todos los métodos (IRS = 6 para p63 e IRS = 12 para pancitoqueratina) con la
excepción del Método 4 en el que se observó una menor expresión de
pancitoqueratina (IRS = 6 para p63 y pancitoqueratina).
14
Figura 2
Fenotipo de las células uroteliales cultivadas. Células uroteliales de cultivos
establecidos mediante el Método 2 (M2), el Método 3 (M3), el Método 4 (M4) y el
Método 5 (M5). Tinción con hematoxilina y eosina (HE). Tinción inmunohistoquímica
con anticuerpos contra la proteína p63 (p63, marrón) y pancitoqueratina
(pancitoqueratina, marrón). Se utilizó un microscopio óptico, a 10x (barra 200 μm)
y ×20 aumentos (solo en las esquinas de los cuadrados en p63).
-
ENVEJECIMIENTO CELULAR
El análisis de la expresión de ß-galactosidasa confirmó la presencia de
envejecimiento celular en el cultivo in vitro (Figura 3). Los porcentajes de células
envejecidas del primer y segundo pase tuvieron valores similares (P > 0.1). El número
de células envejecidas aumentó significativamente después del tercer pase y se
mantuvo en un nivel comparable hasta el quinto pase (Figura 3e). Los fibroblastos de
ratón 3T3 fueron negativos para la expresión de β-galactosidasa, lo que confirmó la
precisión de la prueba realizada (Figura 3d). Las células uroteliales comenzaron a
cambiar su morfología en pasajes posteriores. Las células del quinto pasaje eran
ligeramente más grandes que las células de los pasajes anteriores (Figuras 3a-c). La
tasa de crecimiento también cambió. Antes del primer y segundo paso, las células
alcanzaron la confluencia entre los días 5 y 7. En los siguientes pases, la confluencia
no tuvo lugar hasta el día 9 de cultivo (Figura 3f).
15
Figura 3
Envejecimiento de las células uroteliales.
El ensayo de β-galactosidasa (a–d). Se observa una monocapa de células
uroteliales confluentes después del primer, tercer y quinto pasaje (paneles a-c,
respectivamente). Son visibles las células envejecidas, que desarrollaron el color
verde debido a la tinción con X-Gal (2a–c). Un control negativo de fibroblastos de
ratón 3T3 antes del ensayo con X-Gal (1d) y después de esta tinción (2d). Se utilizó
un microscopio de luz invertida, a 10x aumentos (a–d), con una barra de 125 μm.
En la figura también viene recogido el porcentaje de células envejecidas en los
pasajes 1–5, esto es, la significancia estadística entre los porcentajes promedio de
células envejecidas para los pasajes 1 y 3; 1 y 4; 1 y 5; 2 y 3; 2 y 4; 2 y 5; 3 y 5
[P < 0.05]) (e). El día en que las células alcanzaron la confluencia antes de los
pasajes 1–6 (f).
16
ANÁLISIS HISTOLÓGICO E INMUNOHISTOQUÍMICO DE LA PARED DE LA
VEJIGA URINARIA
La tinción con hematoxilina y eosina de las secciones de la vejiga urinaria confirmaron
la presencia de suaves capas musculares uroteliales de la submucosa y mucosa.
La expresión positiva de la p63 y la pancitoqueratina fue observada en el urotelio de
la vejiga, mientras que la expresión de SMA fue visible en la capa de músculo liso.
En los fragmentos de la pared de la vejiga urinaria, después de la separación
mecánica, la presencia de urotelio y residuos del músculo liso de la vejiga bien
conservados fueron observados
CONCLUSIÓN Y DISCUSIÓN
Varios estudios centrados en el establecimiento de cultivos primarios de células
uroteliales se han llevado a cabo hasta ahora.
Por lo general, solo una técnica, bien enzimática o explante directo, se evalúa en cada
estudio sin una respuesta sobre la efectividad de estos métodos en relación a otras
técnicas propuestas por otros autores.
En el estudio, los cinco protocolos diferentes utilizados para el establecimiento de los
cultivos primarios de células uroteliales se compararon con el fin de desarrollar un
método óptimo, eficiente y repetible.
Se seleccionó el medio Cnt-58, comercialmente disponible y aplicado en todos los
experimentos realizados en este estudio.
El criterio selectivo fue un crecimiento homogéneo de células uroteliales. CnT-58 ha
sido diseñado para células uroteliales y su uso debe limitar el riesgo de contaminación
con fibroblastos. El cultivo celular en este medio no requirió una capa alimentadora o
un medio acondicionado (CnT, Suiza).
Sin embargo, el uso de un medio selectivo aumenta significativamente los costos del
experimento.
En comparación con los otros protocolos, no obtuvimos un gran número de células,
habiendo tenido un largo período de cultivo a partir de tejido de los explantes (Kreft et
al., 2002). Orientar y esparcir bien cada pieza es difícil lo que podría ser la razón del
bajo número de colonias uroteliales. El uso de explantes para el establecimiento de
células uroteliales no fue eficiente en todos intentos.
17
El establecimiento de cultivo usando el Método 2 no tuvo éxito, en la mayoría de los
casos, a pesar del modelo de investigación similar y metodología comparable a la de
otros estudios. (Southgate et al., 2002; Larsson et al., 2014).
El estudio presentado mostró que el dispasa II es el método enzimático más eficiente
para el aislamiento de urotelio porcino. La transferencia de conglomerados uroteliales,
recomendado en el mismo protocolo, resultó ser la mejor manera de resolver
el problema de la contaminación. En este método, se mejoró la adhesión celular al
fondo del recipiente de cultivo en contraste con las otras técnicas donde toda la
suspensión fue centrifugada.
En este estudio obtuvimos 1.8 x 106 células de 1 cm2 de tejido vesical utilizando el
método de tripsina/EDTA. Este resultado no se correspondía con el número de células
aisladas por Lorenz et al. (3.5 105). Otros modelos de investigación (porcino
versus vejiga de oveja) y el uso de tripsina/EDTA, (0,25%/0,02%) en contraste con el
0,3% de tripsina podría ser la razón de los mejores resultados. Varios autores
demostraron la ventaja de la tripsina/ EDTA sobre colagenasa (Kurzrock et al., 2005).
Estos resultados son consistentes con nuestros resultados. Sin embargo,
basado en la tasa de éxito de este método, todavía estaban peor en comparación a
las técnicas usando dispasa II (Método 3) o la combinación de dispasa II y tripsina
(Método 4). Las tasas de éxito más bajas para el Método 5 podría ser causado por la
acción de la tripsina. La tripsina durante un período de tiempo más corto también se
usó en Método 4 (Método 4: 15–20 min, Método 5: toda la noche).
Varios autores sugieren que la digestión enzimática nocturna provoca la muerte
celular (Ludwikowski et al., 1999). Nuestros resultados no confirmaron estos
hallazgos.
En nuestro estudio, los resultados después de una digestión nocturna (Métodos 3 y
5) fueron similares a los resultados después de un corto período de digestión (Método
4). Las células examinadas expresaron proteína p63 y pancitoqueratina, que son
marcadores característicos del urotelio. (Ludwikowski et al., 1999). En el presente
estudio, los resultados obtenidos fueron comparables en la mayoría de los casos,
excepto para el Método 4, donde los resultados fueron peores (Tabla S3, Figura 2).
El Método 3 dio la mejor eficiencia de aislamiento y crecimiento de células uroteliales
in vitro (Tabla S3). Además, era un método repetible en contraste con el método 2
(colagenasa II) y 5 (tripsina/EDTA). Método 4 (dispasa II y tripsina/EDTA) también dio
una alta tasa de éxito, pero los cultivos obtenidos de este protocolo se caracterizaron
por una expresión débil de citoqueratinas (Figura 2).
Se examinó la presencia de células envejecidas en la etapa confluente antes de cada
fase. En más del 10% de la crianza se observaron células en todos los cultivos
probados hasta la quinta fase (Figura 3). Ludwikowski et al. demostró que las células
uroteliales del cerdo y el ser humano se pueden cultivar durante mucho tiempo sin
signos de senescencia. Sin embargo, en su estudio, solo fue analizada la morfología
celular después de cada fase sin medir la actividad b-galactosidasa (Ludwikowski et
al., 1999). En nuestro estudio, si se midió la actividad.
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El método apropiado de aislamiento de células uroteliales es esencial en obtener el
número de células apropiado del fragmento de tejido más pequeño posible. El
presente estudio demostró que el método enzimático con dispasa II fue el método
elegido para el aislamiento de células uroteliales, lo que facilitó la capacidad de lograr
mejores resultados en comparación con los demás métodos probados en este
estudio. Las células uroteliales obtenidas de esta manera podrían ser utilizadas para
la regeneración de tejidos órganos y tejidos del tracto urinario hechos por ingeniería.
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