2021.10.06 Brandi-Dulmin Professoressa Rindi Cos’è la microbiologia? E’ lo studio di organismi troppo piccoli per essere chiaramente visibili ad occhio nudo (cioè, microrganismi). Questi organismi sono relativamente semplici nella loro architettura e mancano di cellule differenziate e di tessuti. Le categorie in cui i microrganismi sono divisi sono 4: batteri, virus, funghi e protozoi. I batteri sono procarioti, non hanno né nucleo né organuli. I funghi o miceti, così come i protozoi, sono eucarioti. I virus sono strutture non cellulari. LA BATTERIOLOGIA I batteri sono comparsi circa 4 miliardi di anni fa. Tutti gli organismi viventi sono divisibili in tre grandi regni: bacteria, archea e eukarya, secondo un’analisi genetica dell’RNA ribosomiale. Gli archea comprendono organismi procarioti che non hanno interesse per l’uomo. CENNI STORICI Le esperienze fondamentali della microbiologia risalgono all'800 grazie a Louis Pasteur e Robert Koch, i quali furono i primi a classificarli come responsabili di malattie. Tuttavia anche prima di questo periodo sono emerse alcune evidenze sull’esistenza dei batteri: Anthony Van Leeuwenhoeck, un commerciante di stoffe appassionato di lenti, realizzò un microscopio molto rudimentale che gli permise di vedere i da lui chiamati “animalcules”, che si dimostrarono in seguito essere batteri. Li riportò tramite disegni su carta, senza sapere cosa fossero. In seguito si cominciò a introdurre il concetto di microrganismi come responsabili di malattie, confermato appunto dagli esperimenti di Koch e di Pasteur, il quale formulò a tal proposito vaccini per l’antrace, il colera e la rabbia. Pasteur, tramite una serie di esperimenti, confermò la correlazione tra presenza di batteri ed insorgenza di patologia nell’uomo. In questo periodo, trovarono un vasto campo di applicazione le attività biochimiche e metodi all’avanguardia di coltivazione dei microrganismi, vennero perfezionate le tecniche di microscopia e sviluppati i primi vaccini. Koch stabilì la correlazione tra la presenza di batteri (in particolare Bacillus antrachis) e le malattie infettive (l’antrace). Nacque in questo modo la microbiologia medica. Grazie ai suoi studi sul Mycobacterium tubercolosis ricevette il Nobel per la medicina nel 1905. Koch elaborò quattro postulati, ancora oggi validi, che ci permettono di associare a ogni malattia infettiva una causa batterica. 1. Il microrganismo deve essere presente in tutti i casi della malattia e assente negli individui sani; 2. Il microrganismo in questione deve essere isolato e cresciuto in coltura pura; 3. La stessa malattia deve essere provocata dall’infezione sperimentale con il microrganismo isolato inoculato in un’ospite sana; 4. Lo stesso microrganismo deve essere re isolato dall’ospite infettato sperimentalmente. Nel 1910 iniziò l’era della chemioterapia, quando il chimico Paul Ehrlich scoprì la prima sostanza antibatterica (contro le spirochete della sifilide). Nel 1928 Alexander Fleming scoprì l’esistenza della penicillina. Durante un lavoro svolto su batteri, casualmente la coltura batterica si contaminò con una muffa (penicillium), che rilasciò sostanze con attività antibatterica nella piastra di coltura. Lui osservò che vicino alla muffa non crescevano i batteri. Gli antibiotici sono sostanze ad attività antibatterica a loro volta prodotte dal metabolismo di altri microrganismi. L A CELLULA BATTERICA Presenta una struttura semplice, quella procariotica. All’interno del citoplasma non osserviamo organuli né compartimentalizzazione, è presente soltanto DNA batterico superavvolto a formare una 2021.10.06 Brandi-Dulmin Professoressa Rindi struttura non circondata da membrana detta nucleoide; i ribosomi, essenziali per la sintesi proteica e dei corpuscoli detti granuli d’inclusione con funzione di contenere materiale di riserva. Il citoplasma è racchiuso da un doppio strato, la membrana citoplasmatica, e da una parete rigida, struttura fondamentale per la vita delle cellule batteriche. Può essere presente una struttura esterna, la capsula, in determinate tipologie batteriche. Altra struttura accessoria è il flagello, se presente ne permette la locomozione e ci consente di distinguere i batteri mobili dai batteri immobili. CLASSIFICAZIONE DEI BATTERI Consideriamo tre principali criteri: 1. proprietà tintoriali I batteri, per essere osservati al microscopio, sono trattati con coloranti cui rispondono in modo differente secondo la loro composizione chimica. Procedimento: su un vetrino da microscopio è posta la colonia batterica che viene a esso fissata tramite l’uso di calore. Successivamente si passa alla colorazione, si lascia asciugare e infine si passa all’osservazione al microscopio ottico a risoluzione 100x a immersione, ponendo uno strato di olio tra la lente e il vetrino in modo da avere un potere di risoluzione migliore. COLORAZIONE DI GRAM La colorazione più importante in batteriologia è senza dubbio quella di Gram, che permette di classificare i batteri in due gruppi: i gram+ e i gram-. I batteri sono trattati con un primo colorante, il cristalvioletto che è fatto agire per un minuto, in modo che penetri al loro interno. Le cellule assumeranno una colorazione blu-violetta. Con una soluzione iodurata si fissa il composto, il quale viene poi trattato con alcol e acetone che hanno potere decolorante. Dopo questa fase, osserviamo che alcuni batteri rimarranno colorati in blu-viola: questi batteri resistenti prendono il nome di gram+. La resistenza alla decolorazione è dovuta alla composizione chimica della loro parete. I batteri gram-, con parete differente, sono decolorati e sono quindi trasparenti, con lo scopo di osservarli vengono quindi ricolorati con la safranina, colorante rosso. Quindi la colorazione di gram ci permette di distinguere i batteri in due tipologie a seconda dello spessore e della composizione della loro parete. - GRAM+ → VIOLA GRAM - → ROSSO COLORAZIONE DI ZIEHL-NEELSEN Utilizzata per colorare e osservare micobatteri, con composizione della parete differente rispetto ai gram+/-. Questa è molto ricca di cere e di lipidi che la rende particolarmente resistente alla decolorazione alcool-acido. Il primo colorante utilizzato è la fucsina fenicata, in grado di penetrare nei batteri; successivamente alla fissazione con il calore si decolora con alcool-acido. In questo modo si evidenziano i micobatteri, che rimangono colorati in rosso. Questi saranno messi in evidenza aggiungendo una colorazione di contrasto, il blu di metilene, che permane sullo sfondo. 2021.10.06 Brandi-Dulmin 2. morfologia, in altre parole classificazione in base alla forma Professoressa Rindi - Cocchi: batteri di forma sferica. Se si formano catenelle di cocchi rotondeggianti si parla di streptococchi, se formano ammassi non regolari simili a grappoli si parla di stafilococchi, mentre se rimangono aggregati a piccoli gruppi (prevalentemente coppie) si parla di diplococchi; - Bacilli: batteri di forma cilindrica. Possono rimanere aggregati a formare delle catene, in tal caso parliamo di streptobacilli. Un esempio sono gli enterobatteri, una grande famiglia ad habitat intestinale, molti dei quali caratterizzano la flora batterica commensale nell’uomo; - cocco-bacilli: forma intermedia tra le due precedenti, bacilli di esigua lunghezza; -Forma a spirale/virgola: appartengono a questa classe i vibrioni, batteri gram- dalla tipica forma a virgola come ad esempio il vibrio colera responsabili del colera. Questi batteri, nel caso in cui abbianouna lunghezza maggiore e spiralforme, prendono il nome di spirilli. Tra questi è noto il treponema pallidum, causativo della sifilide. Se le spirali sono molto sottili si parla di spirochete; - Batteri sporigeni: due sono i batteri d’interesse medico, bacillus e clostridium, i quali hanno un corredo genetico che permette loro di andare incontro, nel loro ciclo vitale, a una trasformazione reversibile da cellula vegetativa a spora. Quest’ultima conferisce ai batteri la capacità di sopravvivere a condizioni molto sfavorevoli. Le cellule vegetative possono essere osservabili con la colorazione di gram, in particolare le due specie citate appartengono ai gram+, a differenza della spora, che risulta trasparente. Ad esempio, le ferite da incidente stradale in cui oltre alla lacerazione si ha la contusione sono ottimali per la proliferazione delle spore del clostridium thetani. N.B. Le spore batteriche non c’entrano niente con le spore fungine! 3. caratteri metabolici, in particolare il loro rapporto con l’ossigeno - aerobi stretti o obbligati, che richiedono l’ossigeno per crescere e svilupparsi; - anaerobi obbligati, che non solo non crescono, ma addirittura vengono degradati dai prodotti tossici derivanti dal metabolismo dell’ossigeno (come il clostridium thetani che non sopravvivono nell’ambiente se non sottoforma di spora); - aerobi/anaerobi facoltativi, categorie intermedie traggono due estremi citati, che possono crescere sia in assenza sia alla presenza di ossigeno (meglio se in ambiente addizionato del 5-10% di CO2, condizione di microaerofilia). Questi criteri possono essere combinati tra loro per poter identificare con precisione un’unica specie batterica. Procedo inizialmente mettendo in atto la colorazione di gram e osservandone la forma. Successivamente ne si sperimentano le condizioni di vita in presenza di ossigeno. La nomenclatura dei batteri è la classica binomiale in cui a ciascun organismo sono attribuiti due nomi (in origine in latino), in cui il primo nome indica il genere e il secondo la specie. Es. ESCHERICHIA (nome derivante dallo scienziato che identificò il genere batterico) coli (si riferisce all’habitat del batterio, il colon). Es. STAPHILOCOCCUS (tutti i batteri appartenenti a questo genere hanno questa morfologia, cioè disposizione a grappolo) aureus (le colonie su terreno solido hanno colore dorato). 2021.10.06 Brandi-Dulmin Professoressa Rindi Nella tabella troviamo indicati i principali batteri con azione patogena nei confronti dell’uomo. Altri batteri di interesse medico, non inclusi in tabella, sono: - Micoplasmi: gli unici batteri privi di parete (non si evidenziano ovviamente mediante colorazione di gram), di piccole dimensioni, minori addirittura dei virus; Rickettsie e Clamidie: sono parassiti endocellulari obbligati (simili ai virus), devono quindi penetrare nell’ospite per potersi replicare. Treponemi (Spirochete):sono batteri che non si colorano tramite gram in quanto la dimensione e lo spessore ridotti non sono compatibili con il potere di risoluzione del microscopio. Sono dotati di attivo movimento per torsione del corpo batterico.
