TEMA 3.1: GENÉTICA BACTERIANA Introducción y el uso de microorganismos como sistemas modelo Los organismos procariotas se clasifican en 2 grupos, eubacterias y arqueas (arqueobacterias), ambos grupos constituidos por organismos haploides. La genética bacteriana nació en el S.XX, después de la genética eucariótica, con el experimento que determinó que las mutaciones se dan de manera preadaptativa. El uso de bacterias y virus como sistemas modelo se debe a varias características que comprenden estos organismos: - - Reproducción asexual rápida y grande Mayoritariamente haploides, por lo que una mutación inducida se puede observar directamente (no existe el concepto de dominancia o recesividad debido a que tendrán un único alelo por gen). Modificación por ingeniería genética - Cultivo fácil en el laboratorio, facilitad para aislar una cepa genéticamente pura (clones) Genomas pequeños, algunos con streamlinging. Tamaño reducido Importancia médica por causar enfermedades y formar parte del microbiota humano Técnicas de cultivo: El crecimiento bacteriano se puede dar en medios líquidos o sólidos: - Líquidos: se inocula el medio con una muestra bacterias, se agita para facilitar su aireación y se medirá el crecimiento por la dispersión de luz. Sólidos: se utiliza el agar en gel y una varilla de vidrio para inocular el medio con una pequeña cantidad de medio líquido. Realización de réplicas de colonias: Hay 2 formas de conseguir placas que contienen colonias idénticas: - - Filtros de terciopelo: Se usa un filtro y se coloca encima de una placa de colonias, se coloca posteriormente en otra placa sin cultivar. Permite obtener una copia exacta de una placa, adicionalmente, se puede colocar en una posición específica para que las diferentes colonias se encuentren en la misma posición en ambas placas. Streaking Genética bacteriana Mutantes: Los distintos mutantes bacterianos se seleccionan en función de fenotipos para distintos caracteres. Un ejemplo de esto es una placa de Petri en la cual se encuentran 2 grupos de bacterias diferentes, aquellos que son capaces de producir un pigmento específico y aquellos que no son capaces de producir dichos pigmentos. - Silvestres protrótrofos: son capaces de sobrevivir en los medios de cultivo mini Mutantes auxótrofos: solo pueden crecer en el medio mini si se encuentra suplementado con algún compuesto que no pueden sintetizar, indica un fallo en el metabolismo bacteriano. Adicionalmente, existen mutantes que crecen en presencia o ausencia de antibióticos, fuentes de carbono, etc… En el primer caso, indicaría la presencia de ARGs y, por tanto, variaciones genotípicas. Los mutantes auxótrofos se pueden detectar por su cultivo en diferentes tipos de medios, cada uno con o sin una biomolécula específica. Para ello, se utilizarían las técnicas de obtención de réplicas de colonias. Por ejemplo, se realiza un cultivo de bacterias en un medio con leucina (contiene tanto las bacterias que son capaces de sintetizar este aminoácido, como los que son incapaces de crearlo), dicho cultivo se puede replicar posteriormente en otros medios. Uno de los medios secundarios no contendrá leucina, lo cual impide el crecimiento de las colonias que son incapaces de sintetizar la leucina; al replicarlas de acuerdo con su posición inicial en el medio primario, se puede determinar qué colonia contiene los mutantes auxótrofos. - Mutantes auxótrofos: leu- - Silvestres protrótrofos: leu+ Genoma: los procariotas son habitualmente haploides, por lo que contiene una única copia de sus cromosomas, los cuales suelen ser circulares (covalentemente cerrados), bicatenarios y localizados en el nucleoide. Adicionalmente, suelen ser de pocas mb ya que no contienen secuencias basura/repetitivas; aquellas procariotas que no son de vida libre suelen presentar streamlinging. - Excepciones: Agrobacterium tumefaciens que presenta 4 cromosomas (3 circulares y 1 lineal). Tiene una gran importancia en la obtención de plantas transgénicas. El cromosoma se encuentra muy compactado en el interior de la célula (aunque no tanto como el cromosoma metafásico), formando bucles gracias a la unión del ADN a proteínas básicas (diferentes a las histonas), esto facilita su superenrollamiento. Los bucles dados presentan alrededor de 40-80 kb, lo cual permite la compactación del cromosoma hasta 10 veces. Este superenrollamiento se facilita por las topoisomerasas, las cuales introducen cortes en las hebras para regular el enrollamiento (aumentándolo o reduciéndolo). El superenrollamiento permite un grado de compactación de hasta 1000 veces mayor que el cromosoma sin bucles. Plásmidos: moléculas pequeñas de ADN circular superenrollado cuya replicación es independiente de la del cromosoma central del nucleoide. Pueden existir pocos plásmidos hasta decenas en función de la especie y sus necesidades. No contienen genes esenciales, sino genes adaptativos que confieren ventajas. Finalmente, constituyen la base de las herramientas fundamentales de la ingeniería genética ya que se pueden utilizar como vectores para la replicación de moléculas de ADN exógeno. Plásmido Col (Killer): Portadores de genes que codifican colicinas (proteínas tóxicas). Las cepas que lo portan son resistentes a la colicina. No puede ser trasmitido por conjugación. Es un tipo de plásmido killer presente en E. coli, permite reducir la competitividad bacteriana ya que aquellas bacterias sin el plásmido mueren. Plásmido F (factor de fertilidad): El plásmido F genera los pili sexuales y es capaz de replicarse, establecer contacto con bacterias cercanas y permite la transferencia de material genético por medio de la conjugación. Se diferencian entre bacterias F+ (donantes) y F- (receptoras) si tienen o no el plásmido. La transferencia de ADN se realiza de la bacteria F+ a la bacteria F- por medio de la conjugación, en la cual se transfiere una hebra del factor. El plásmido se corta por el oriT mediante una endonucleasa, lo cual permite la transferencia de una de las hebras del plásmido a la bacteria receptora. Sirve como molde, por lo que ambas hebras separadas podrán sintetizar su complementaria y, por tanto, ambas bacterias tendrán una copia completa. Se da de manera unidireccional, por lo que la bacteria que aporta genes por medio de la conjugación no recibe ninguna secuencia de material genético de la otra bacteria. Se da de la bacteria F+ hasta la bacteria F-, la cual se convierte en una bacteria F+ al recibir una copia del plásmido. Puede integrarse en el cromosoma bacteriano (episoma), lo cual genera bacterias del tipo Hfr (High frequency of recombination, los sitios de inserción se dan en los elementos IS, uno en el cromosoma y varios en el plásmido, por medio de la recombinación), las cuales se conjugan al igual que las F+, pero que pueden transferir parte del cromosoma bacteriano. Esto ocurre 1/10’000 o 100’000 replicaciones. La cantidad de ADN transferido depende del tiempo de comunicación entre las células bacterianas por las pilis sexuales, además, se puede producir recombinación entre la secuencia transferida y la bacteria receptora en puntos homólogos, cambiando el genotipo del receptor. La bacteria receptora nunca llegará a ser una F+ ya que no suele recibir una copia completa del factor F. Las bacterias que transfieren una secuencia del factor F y otros genes adicionales reciben el nombre de bacterias F’, las cuales son capaces de transferir los genes asociados al factor F a una bacteria F- por medio de la sexducción (unidireccional). Esto hace que la bacteria receptora se convierta en una bacteria merodiploide (diploidía parcial, diploide para las secuencias correspondientes al gen transferido con el factor F). *Gen lac: uso de lactosa como fuente de C. Plásmido R: Son plásmidos que confieren resistencia a antibióticos, suele presentar dos componentes: - Segmento RTF: factor de transferencia, permite la conjugación del plásmido entre diferentes bacterias. En este caso, dicha conjugación no se modula por el plásmido F. Contiene los genes necesarios para la conjugación. Determinantes R: Puede haber uno o más y les dan la resistencia a los distintos antibióticos de forma específica. Cada determinante corresponde a un ARG. Los plásmidos R han evolucionado mucho con la introducción de los antibióticos y el abuso actual de su uso. La transferencia de estos plásmidos R pueden darse entre bacterias de la misma especie y también entre diferentes especies y ha sido documentada en distintos ambientes (poco higiénicos, aguas, suelos, etc.). Genera la gran propagación de estos plásmidos y los ARGs que contiene. Plásmidos de virulencia Intercambio de material genético: reproducción bacteriana (asexual) Las bacterias intercambian material genético entre ellas, lo que permite la generación de genomas nuevos por medio de la recombinación de su material genético. Como consecuencia, se da la diversidad genética a pesar de presentar la reproducción asexual por mitosis. Realizan transferencias horizontales/laterales unidireccionales (no recíproco) de 3 formas. Conjugación: es el paso directo de material genético de una bacteria a otra mediante una conexión física entre ambas, a través de pili sexuales (prolongaciones delgadas de la membrana celular que se asoma por la pared bacteriana). Dichos pili son prolongaciones delgadas de la membrana celular que conectan dos bacterias de manera transitoria. La producción de los pili se da gracias a la presencia de los plásmidos F, un episoma (plásmido integrado en el cromosoma bacteriano, pierde la capacidad de replicarse independientemente ya que se replica cuando el cromosoma en sí se replica). Experimento de Joshua Lerderberg y Edward Tatum: se utilizaron 2 estirpes bacterianas (una incapaz de producir 3 compuestos, otra capaz de producir éstas 3, pero no otras 3 diferentes) para estudiar el mecanismo de conjugación. Al cultivarlas en un medio mínimo, no crecía ninguna colonia puesto que ambas estirpes bacterianas eran incapaces de crecer. No obstante, al mezclar ambas estirpes en un medio líquido y, pasado un tiempo, crecían en medios mínimos al inocular otra placa de Petri. Esto indica un intercambio de genes implicados en las rutas metabólicas de dichos compuestos. Experimento de Davis: se utilizó un tubo en forma de U con un filtro que dejaba el paso del medio, pero no de las bacterias. Al inocular muestras de ambos lados del filtro en placas con un medio mínimo, no crecía ninguna colonia. Esto indica la necesidad de contacto físico entre las 2 estirpes para que se dé el intercambio genético. Transformación: Consiste en la incorporación de ADN exógeno que se encuentra libre en el medio (puede ser bacteriano o de otro origen), al genoma de la bacteria o bien a algún plásmido. Las bacterias capaces de la transformación reciben el nombre de bacterias competentes. Dicha competencia puede incrementarse mediante tratamientos de modificación in vitro (laboratorio) de membranas y paredes bacterianas con diferentes compuestos: cloruro cálcico, cloruro térmico, cloruro eléctrico, choque térmico, campos eléctricos (trata de generar poros en estas estructuras) … El ADN exógeno puede quedar en forma de plásmido. Sin embargo, si la que se introduce presenta secuencias homólogas con el ADN bacteriano, puede incorporarse en el cromosoma mediante la recombinación. La bacteria competente que capta un fragmento de material genético y lo introduce en su interior, recibe el nombre de bacteria transformada (tanto si se incorpora como un plásmido, como si se integra en el cromosoma bacteriano). Transducción: Consiste en la transferencia de ADN con un agente viral como transmisor. Los bacteriófagos pueden ser virulentos (ciclo lítico) o atemperados (ciclo lisogénico). En el caso del último, el bacteriófago integra su material genético en el cromosoma bacteriano, donde la secuencia vírica correspondiente recibe el nombre de profago. - Transducción generalizada: Hace referencia al ciclo lítico, que rompe el material genético de la bacteria. Algunos pueden empaquetar en las cápsides víricas fragmentos de ADN, aunque sean de otro origen. Si el material genético de la bacteria queda encapsulado puede inyectarse en otras bacterias llegando a ser capaz de producir recombinación. Trata de la - generación de bacteriófagos que presentan secuencias de material bacteriano y que, en el caso de realizar el ciclo lisogénico, sean capaces de incorporarlas en otras bacterias. Transducción especializada: Fagos que se reciclan por ciclo lisogénico. La escisión del profago puede ocurrir de manera incompleta, como ocurría con los plásmidos Hfr, llevándose parte del genoma bacteriano. Este será inyectado en otra bacteria y podrá integrarse junto con el profago en la bacteria receptora. Ocurre en el sitio ATT, donde tiene lugar la recombinación debido a que la secuencia del ATT y el profago son homólogos. Solo se transduce lo que está cerca del punto de inserción ATT. Genes: gen gal (utilización de galactosa como fuente de carbono) bio (síntesis de biotina). Diversidad genética por transferencia horizontal: Tiene lugar entre individuos de la misma especie y los de otras, incluso individuos de diferentes grupos taxonómicos: - Entre procariotas y eucariotas: genes procarióticos de la mitocondria y cloroplasto al núcleo. Plásmidos Ti de Agrobacterium tumefaciens a plantas, bacteria Wolbachia a insectos, Elysia chlorotica y la cleptoplastia. Es la base de la diversidad bacteriana y, además, de la propagación de ARGs y nuevos plásmidos de virulencia, se cree que el 17% del genoma de E. coli es el resultado de la transferencia genética, puede llegar hasta el 25% en otras especies. Además, permite el estudio de las relaciones e interacciones génicas/alélicas, la realización de pruebas de complementación y la creación de mapas génicos. Otras aplicaciones consisten en el uso de vectores bacterianos para la clonación de moléculas de ADN recombinantes (por transformación). Se utiliza un plásmido como vector para una secuencia de ADN exógeno por medio de la enzima de restricción (reconoce y corta una secuencia para generar fragmentos con los extremos abiertos que se pueden conectar a otros fragmentos complementarios por un ADN ligasa). Para ello se utiliza E. coli K12 debido a su alto desarrollo genético y el desarrollo de cepas incapaces de crecer fuera del laboratorio (por medio de la inducción de ciertas mutaciones), además de la replicación de muchos bacteriófagos y plásmidos. Otras especies: H. influenzae, Bacillus subtilis, Streptomyces.
