DEPARTAMENTO CIENCIAS DE LA SALUD
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LABORATORIO DE GENETICA HUMANA
MANUAL DE PRECEDIMIENTOS
PROCEDIMIENTO PARA MEDIR LA ACTIVIDAD DE
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GLUTATIÓN PEROXIDASA (GPX) EN MUESTRAS
BIOLÓGICAS.
1. Objetivo
Describir el procedimiento para medir la actividad de Glutatión peroxidasa (Gpx) en
muestras biológicas.
2. Alcance
El presente procedimiento es aplicable para muestras obtenidas a partir de cultivos
celulares.
3. Definiciones.
Kit de ensayo de glutatión peroxidasa (colorimétrico) (ab102530), GPx reduce el
hidroperóxido de cumeno mientras oxida el GSH a GSSG. El GSSG generado se reduce a
GSH con el consumo de NADPH por GR. La disminución de NADPH (medida fácilmente a
340 nm) es proporcional a la actividad de GPx. El ensayo se puede utilizar para medir todas
las peroxidasas dependientes de glutatión en plasma, lisados
de eritrocitos,
homogeneizados de tejidos y lisados de células con una sensibilidad de detección de ~0,5
mU/ml de GPx en las muestras.
La familia de enzimas glutatión peroxidasa (GPx) juega un papel importante en la protección
de los organismos contra el daño oxidativo. GPx convierte el glutatión reducido (GSH) en
glutatión
oxidado
(GSSG)
mientras
reduce
los
hidroperóxidos
lipídicos
a
sus
correspondientes alcoholes o peróxido de hidrógeno libre a agua. Se han encontrado varias
isoenzimas en diferentes localizaciones celulares y con diferente especificidad de sustrato.
Los niveles bajos de GPx se han correlacionado con trastornos relacionados con los radicales
libres
4. Responsables:
Líder del Laboratorio.
5. Descripción del Procedimiento:
Preparación de la curva estandar
Preparación de la muestra
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BIOLÓGICAS.
Agregue la mezcla de reacción e incubar a temperatura ambiente durante 20
min.
Mida la densidad óptica OD 340nm
Agregar hidroperóxido de cumeno
Mida la densidad óptica (OD340nm) en un modo cinético
Consideraciones:

Almacene el kit a + 4 ° C en la oscuridad.

Los componentes reconstituidos son estables durante 2 meses, excepto la
solución de trabajo enzimática que es estable durante 3 semanas.

Coloque los componentes en alícuotas en volúmenes de trabajo antes de
almacenarlos a la temperatura recomendada.
6. Preparación de reactivos:
Compuesto
Preparación
Cantidad
por kit
Tampón
de
ensayo
de
50 ml
Almacenam
Almacenam
iento antes
iento antes
preparación
preparación
Listo para usar como se suministra. Calentar a
-20°C*
temperatura ambiente antes de usar.
glutatión
peroxidasa
1 vial
NADPH(Liofiliza
Reconstituir con 500 µL de dH2O para obtener una
4°C o -
solución estándar de NADPH de 40 mM. Estándar de
20°C*
alícuota para que tenga suficiente para realizar el
do)
número deseado de ensayos. Almacene a -20 °C
-20°C
durante 1 mes o a 4 °C durante 1 semana
1 vial
Glutatión
reductasa
Diluya con 220 µL de tampón de ensayo. Alícuota
4°C o -
de enzima para que tengas suficiente para realizar
20°C*
el número deseado de ensayos. Almacenar a -20°C
por 1 mes oa 4ºC por 1 semana. Mantener en hielo
durante el uso.
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Reconstituir con 220 µL de tampón de ensayo. Haga
4°C o -
Glutatión (GSH;
alícuotas de GSH para que tenga suficiente para
20°C*
liofilizado)
realizar el número deseado de ensayos. Almacenar a
1 vial
-20°C por 1 mes oa 4ºC por 1 semana
Diluir con 1,25 ml de tampón de ensayo. Alícuota para
4°C o -
Hidroperóxido
que tenga suficiente para realizar el número deseado
20°C*
de cumeno
de ensayos. tienda en - 20°C durante 1 mes oa 4ºC
1 vial
durante 1 semana
Reconstituir con 100 µL de tampón de ensayo.
4°C o -
Control positivo
Control positivo en alícuotas para que tenga
20°C*
de
suficiente para realizar el número deseado de
1 vial
glutatión
peroxidasa
ensayos Almacene a -20 °C durante 1 mes o a 4 °C
(liofilizado)
durante 1 semana. Mantener en hielo durante el
uso.
7. Materiales requeridos, no suministrados
Estos materiales no están incluidos en el kit, pero serán necesarios para utilizar correctamente
este ensayo:

Agua MilliQ u otro tipo de agua bidestilada (ddH2O)

Lector de microplacas colorimétricas: equipado para leer OD 340 nm

Placa de 96 pocillos: placas transparentes para ensayo colorimétrico

Microcentrífuga

Pipetas y puntas de pipeta

Agitador orbital
8. Preparación de estándar

Prepare siempre un nuevo conjunto de estándares para cada uso.

La solución estándar diluida es inestable y debe usarse dentro de las 4 horas.

Prepare el estándar de NADPH 1 mM diluyendo 25 µL de la solución estándar de NADPH
40 mM en 975 µL de dH2o

Con el estándar de NADPH 1 mM, prepare la dilución de la curva estándar como se describe
en la tabla en una microplaca o tubos de microcentrífuga:
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# estandar
V. de estándar
Tapón de
V. final
Terminar
ul
ensayo
estándar de
(NADPH) en bien
pozo ul
1
0
300
100
0 nmol/pocillo
2
60
240
100
20 nmol/pocillo
3
120
180
100
40nmol/pocillo
4
180
120
100
60nmol/pocillo
5
240
60
100
80nmol/pozo
6
300
0
100
100nmol/pocillo
Cada dilución tiene suficiente cantidad de estándar para configurar lecturas duplicadas
(2x100ul)
9. Preparación de muestras:
Información general de la muestra:

Mantenga las enzimas, los componentes termolábiles y las muestras en hielo durante el
ensayo.

Asegúrese de que todos los tampones y soluciones estén a temperatura ambiente antes
de comenzar el experimento.

Las muestras que generan valores superiores al estándar más alto deben diluirse aún más
en los tampones de dilución de muestra apropiados.

Evite la formación de espuma o burbujas al mezclar o reconstituir los componentes.

Evite la contaminación cruzada de muestras o reactivos cambiando las puntas entre las
adiciones de muestra, estándar y reactivo.

Asegúrese de que las placas estén correctamente selladas o cubiertas durante los pasos
de incubación.

Asegure la eliminación completa de todas las soluciones y tampones de los tubos o placas
durante los pasos de lavado.

Asegúrese de tener el tipo correcto de placa para su método de detección elegido.

Asegúrese de que el bloque de calor/baño de agua y el lector de microplacas estén
encendidos.

Recomendamos realizar varias diluciones de su muestra para garantizar que las lecturas
estén dentro del rango de valores estándar.
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
Le recomendamos que utilice muestras frescas. Si no puede realizar el ensayo al mismo
tiempo, le sugerimos que complete el paso de preparación de la muestra antes de
almacenar las muestras. Alternativamente, si eso no es posible, le sugerimos que congele
rápidamente las células o el tejido en nitrógeno líquido después de la extracción y almacene
las muestras inmediatamente a -80 °C. Cuando esté listo para analizar sus muestras,
descongélelas en hielo. Sin embargo, tenga en cuenta que esto podría afectar la estabilidad
de sus muestras y que las lecturas pueden ser más bajas de lo esperado
 Muestras de células (adherentes o en suspensión):
o
Cosechar la cantidad de células necesarias para cada ensayo (recomendación
inicial 2 x 10 6 células).
o
Lave las células con PBS frio
o
Resuspender las células en 200ul de tampón de ensayo frio
o
Homogenice las células rápidamente pipeteando hacia arriba y hacia abajo
varias veces, en hielo.
o
Centrifugar 15 minutos a 4°C a 10 000 g usando una microcentrífuga fría
para eliminar cualquier material insoluble
o
o
Recoja el sobrenadante y transferirlo a un tubo limpio
Mantener en hielo.
10. Procedimiento de ensayo y detección
o
Equilibre todos los materiales y reactivos preparados a temperatura ambiente justo
antes de su uso y agite suavemente.
o
Prepare las muestras por duplicado y en diluciones óptimas para que las
lecturas se ajusten a las lecturas de la curva estándar.
o
Configure los pozos de reacción
Pocillos estándar= diluciones estándar de 100 ul
Pocillos de muestra = 2 muestras de 50 ul (ajuste volumen a 50 ul/ pocillo con
tapón de ensayo).
Pocillos de control de reactivos = 50ul de tampón de ensayo
Mezcla de reacción:
Componente
Calorimétrico
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Tampón de ensayo
33
Solución de NADPH
3
40 mM
Solución GR
2
Solución GSH
2
1. Mezcle suficientes reactivos para el número de ensayos (muestras, control
positivo y control de reactivos) que se van a realizar. Prepare una mezcla
maestra de Reaction Mix para garantizar la consistencia.
2. Agregue 40 µL de mezcla de reacción a la muestra, control(es) positivo(s) y
pocillos de control de reactivo.
3. Mezcle bien e incube a temperatura ambiente durante 15 minutos para eliminar
todo el GSSG de las muestras.
NOTA : Mida la DO 340 nm antes de agregar hidroperóxido de cumeno . Si la
OD a 340 nm es inferior a 1,0, agregue más NADPH para asegurarse de que
haya suficiente NADPH en el sistema de reacción. 1 µL de NADPH 40 mM dará
~0.5 OD a 340 nm
1
2
3
4
5
6
A
Stand Stand
Samp. Samp Ctr +
B
Stand Stand
Samp
Samp
C
Stand Stand
Samp
Samp
D
Stand Stand
Samp
Samp
E
Stand Stand
Samp
Samp
F
Stand Stand
Samp
Samp
7
8
9
Ctrl+
blnc
Blnc
10
11
12
G
H
4. Agregue 10 µL de solución de hidroperóxido de cumeno, solo a los pocillos de muestra,
control positivo y control de reactivo, para iniciar la reacción de glutatión peroxidasa
(GPx). Mezclar bien.
5. Salida de medida (A1) en un lector de microplacas a OD340 nm en T1.
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6. Incubar a 25ºC durante 5 min (o más si la actividad GPx es bajo). Proteger de la luz.
7. Salida de medida (A2) en un lector de microplacas a OD340 nm en T2
NOTA: si un 1 la lectura es demasiado baja (<0.7), significa que hay demasiado
GPx o demasiado GSSG en la muestra. Es posible que deba diluir las muestras
o eliminar el GSSG de su muestra mediante métodos, como la diálisis de la
muestra o el uso de filtros giratorios (ab93349) para eliminar el GSSG.
NOTA: Imprescindible leer A. 1 y A2 en el rango lineal de la reacción. Será más
preciso si lee la cinética de la reacción. Luego elige A 1 y A2 en el rango lineal
de la reacción
11. Análisis de datos

Las muestras que produzcan señales mayores que las del estándar más alto deben diluirse
más en un tampón apropiado y volver a analizarse, luego multiplicar la concentración
encontrada por el factor de dilución apropiado.

Por razones estadísticas, recomendamos que cada muestra se analice con un mínimo de
dos repeticiones (duplicados).
o
Promedie la lectura duplicada para cada estándar y muestra.
o
Restar el valor medio de absorbancia del blanco (estándar # 1) de todas las lecturas
estándar y de muestra. Esta es la absorbancia corregida.
o
Grafique los valores de absorbancia corregidos para cada estándar en función de la
concentración final de NADPH.
o
Dibuje la mejor curva suave a través de estos puntos para construir la curva
estándar. La mayoría de los programas de lectura de placas o Excel puede trazar
estos valores y ajustar la curva. Calcule la ecuación de la línea de tendencia en
función de los datos de su curva estándar (utilice la ecuación que proporcione el
ajuste más preciso).
o
Extrapolar lecturas de muestra de la curva estándar trazada usando la siguiente
ecuación:
∆𝐴340𝑛𝑚 = ((𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝐴1 − 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 𝐴2) − (𝑟𝑒𝑎𝑐𝑡𝑖𝑣𝑜 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝐴1 − 𝑟𝑒𝑎𝑐𝑖𝑡𝑣𝑜 𝑐𝑜𝑛𝑡𝑟𝑜𝑙 𝐴2))

Aplicar el ∆𝐴340𝑛𝑚 a la curva estándar de NAPDH para obtener la cantidad B de NADPH
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𝐵=(

∆𝐴340𝑛𝑚 − 𝑖𝑛𝑡𝑒𝑟𝑐𝑒𝑝𝑐𝑖𝑜𝑛
)
𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒
Concentración de Gpx en las muestras de prueba se calcula como (nmol/min/ml=mU/ml)
𝐺𝑃𝑥 𝐴𝑐𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡𝑦 = (
𝐵
)∗𝐷
(𝑇2 − 𝑇1) ∗ 𝑉
Donde:
B = cantidad de NADPH que disminuyó entre T1y T2 (en nmol).
T1= Hora de la primera lectura (A1) (minutos).
T2= Hora de la segunda lectura (A2) (minutos).
V = Volumen de muestra pretratada añadida al pocillo de reacción (ml).
D = Factor de dilución de la muestra.
Definición de unidad: Una unidad se define como la cantidad de enzima que provocará la
oxidación de 1,0 µmol de NADPH a NADP.+ bajo las condiciones del kit de ensayo por minuto a
25°
12. Fuente:
Glutathione Peroxidase Assay Kit (Colorimetric) ab102530. Versión 11 Última actualización 11 de
abril de 2019.
13. ANEXOS.
No aplica
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PROCEDIMIENTO PARA LA EXTRACCIÓN DE DNA – KIT WIZARD
GENOMIC DNA PURIFICATION (PROMEGA)
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