Métodos Citohistoquímicos I - 1º Mini teste – 2019/2020
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Porque é utilizada uma estufa para as lâminas antes da iniciar a coloração?
A utilização da estufa é importante para assegurar a completa secagem do corte, impedir que o
corte se solte da lâmina, que se rompa ou que seja danificado. A temperatura não deve
ultrapassar a temperatura de fusão da parafina e o tempo de secagem é variável, alguns tecidos
podem secar durante 30minutos outros durante mais tempo para obter melhores resultados.
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O que é um corante e quais os tipos que existem. Defina-os.
Os corantes são moléculas compostas por cromogéneos que consistem em grupos cromóforo,
anel aromáticos de composto insaturado, e auxocromo, sendo responsáveis pela cor atribuída
e ligação do cromogéneo à substância a ser corada, respetivamente. É necessária a existência
dos grupos auxocromo, uma vez que o complexo cromogéneo e cromóforo, só por si não têm
capacidade de ligação corante-tecido.
Os corantes dividem-se em dois grupos principais: básico- estabelece ligações com radicais
ácidos dos tecidos; ácidos- estabelece ligações com radicais básicos do tecido.
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Quanto ao grupo auxocromo os corantes podem ser:
Básicos- têm carga positiva e utilizam-se para corar estruturas ácidas;
Ácidos- têm carga negativa e utilizam-se para corar estruturas básicas;
Neutros- utilizados quando a coloração é combinada de corante básico e ácidos;
Indiferentes- são insolúveis em água, mas solúveis em álcool, éter e óleos;
Metacromáticos-quando certos componentes tecidulares se combinam com o corante e
produzem uma cor diferente da original, metacromasia. Esta é perdida quando o corte é
desidratado em álcool após a coloração.
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Indique os tipos de ligações corante-tecido que existem.
Ligações iónicas que envolvem forças eletrostáticas que atraem iões de cargas opostas.
Ligações covalente em que há partilha de eletrões formando moléculas extremamente estáveis.
Ligações de Hidrogénio onde ocorrem ligações intermoleculares nas quais os átomos de
hidrogénio se ligam a átomos de elevada eletronegatividade das moléculas anexas.
Forças de Van der Waals onde ocorre atração intermolecular – dispersão, dipolo-dipolo ou
dipolo-dipolo induzido.
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Quais os tipos de coloração que existem?
Topografica, citologicas, histoquimicas e estruturais.
MIROSLAVA LAMBOVA
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Quais os fatores que influenciam a distribuição dos corantes?
Fatores químicos: pH, forças iónicas das soluções corantes, fixação dos tecidos, concentração e
pureza do corante. Fatores físicos: Absorção dos corantes pelas estruturas, solubilidade do
corante em substâncias do tecido, densidade e permeabilidade das estruturas.
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Defina o que é o mordente.
Uma coloração tem dois meios de ação: direta – afinidade própria dos tecidos para o corante;
indireta – realiza-se uma impregnação do tecido por um composto que vai permitir a ligação
corante-tecido, esse composto denomina-se mordente. Os mordentes podem ser oxidantes
como o oxalato, ácido crómico e permanganato de potássio, ou podem ser sais metálicos, tais
como, alumínio, ferro, tungsténio e chumbo.
Sendo assim, os mordentes vão facilitar a ligação do corante ao tecido, aumentando a
seletividade.
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Que tipo de coloração utiliza um diferenciador e qual a sua função? Que cuidados é
necessário ter?
O diferenciador é utilizado em colorações regressivas, ou seja, a coloração é realizada ate uma
sobrecoloração de todas as estruturas, e, posteriormente é aplicado um diferenciado que tem
por objetivo remover seletivamente o excesso do corante dos tecidos através da quebra
progressiva e especifica das ligações corante-tecido.
É muito importante então ter uma lâmina de controlo numa coloração regressiva, uma vez que
a aplicação de mais ou menos tempo de diferenciador implica mudanças de tonalidades na
coloração que podem ser significativas à nível da interpretação dos resultados.
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Hematoxilina é um corante incolor natural mais utilizado em Histologia. Comente.
A hematoxilina é um corante natural extraído da madeira duma árvore mexicana e não
apresenta coloração. Quando oxidada química ou naturalmente, transforma-se em hemateína,
composto que confere cor, mas não possui capacidade de ligação ao tecido. Para tal, é utilizado
um mordente alumínico, sal de cobre, ferro ou tungsténio, formando a Laca, composto final que
confere cor e possui capacidade de ligação.
Juntamento com a Eosina, H&E é a coloração mais utilizada em histologia porque permite a
visualização de vários constituintes celulares, tais como, núcleos a azul, citoplasma e tecido
conjuntivo a vermelho, rosa ou laranja. Ainda é realizada como coloração de rotina, uma vez
que é suficiente para evidenciar estruturas organizadas ou desorganizadas, detalhadamente
num tecido.
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Como são classificadas as Hematoxilinas e quais os tipos e de um exemplo para cada?
As hematoxilinas são classificadas de acordo com o mordente utilizado, nomeadamente,
alumínio (Gill, Mayer, Harris), ferro (Weigert, Verhoeff) ou tungsténio (Mallory).
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Porque é necessário realizar uma hidratação até água destilada antes da coloração de
hematoxilina? E para a Eosina é necessário hidratar até água destilada?
A Hematoxilina é um corante aquoso, sendo necessário hidratar o corte histológico com
concentrações decrescentes de álcool e água destilada, enquanto que a Eosina é um corante
alcoólico, sendo necessário parar a hidratação no álcool a 96 %, podendo existir protocolos que
avançam até álcool a 70%.
MIROSLAVA LAMBOVA
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Porque é que a hematoxilina alumínica é a mais utilizada em exames de rotina?
A hematoxilina alumínica (Gill, Mayer, Harris) é mais utilizada para exames de rotina do que a
hematoxilina férrica porque a ligação tecido-corante é mais fraca, apresenta alta capacidade de
contraste nuclear, sendo hematoxilina de Gill mais estável para tal. Ainda, como não é sujeita a
posteriores colorações fortemente ácidas é suficientemente ácido-resistente para não sair por
completo nas lavagens. Para exames complementares, quando utilizada colorações fortemente
ácidas é aconselhável a utilização de hematoxilina férrica, uma vez que é resistente a ácidos
fortes porque é tratada com ácidos fortes que evitam a precipitação da laca e mantêm o pH
fortemente ácido.
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Porque são adicionados Floxina e ácido acético glacial à coloração da Eosina?
Adiciona-se floxina +ara intensificar a cor, o ácido acético glaciar para garantir a estabilidade do
pH ideial (4.6-5), melhorando assim a seletividade e obtenção de pelo menos três tonalidades
de eosina, vermelho, rosa e laranja.
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No passo do azulamento, o excesso de cloro na água corrente pode afetar a coloração.
Porque?
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Porque não se podem desidratar as lâminas muito rapidamente após a Eosina?
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Indique 5 componentes que são marcados pelo PAS.
Glicogénio, mucinas neutras e fracamente ácidas, mucoproteínas, fungos e membrana basal.
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Qual o mecanismo de ação do PAS?
O Acido periódico vai oxidar as mucinas e o glicogénio, formando os grupos aldeído que vão se
ligar ao reagente Schiff a partir da Fucsina básica e o ácido sulfuroso, formando coloração
magenta. Posteriormente, a água corrente quente vai facilitar a intensificação da tonalidade e
para contrastar os núcleos utiliza-se Hematoxilina de Mayer. Atribuindo uma cor azul/roxo.
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Porque é que em determinadas situações utiliza-se Amílase antes da técnica PAS?
Existem tecidos que possuem outras moléculas para além do glicogénio livre, sendo necessária
a elaboração de uma lâmina controlo para PAS. Esta lâmina deve ser tratada com amílase
previamente para degradar o glicogénio pertencente aos polissacáridos. Assim, ao corar com
PAS e observar estruturas coradas de magenta serão as mucinas resistentes à amílase, ou seja,
glucoconjugados, nomeadamente, mucinas neutras.
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Porque é que PAS marca fungos?
Os fungos possuem uma cápsula rica em polissacáridos, dos quais faz parte o glicogénio, sendo
marcado pelo PAS de magenta.
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Qual o contra corante que deve ser utilizado para Azul de Alcian. Qual outro pode ser
utilizado?
O contra corante que deve ser utilizado é fast-red ou Mayer´s Carmalum que coram os núcleos
de vermelho. Outro que pode ser utilizado é hematoxilina alumínica que marca os núcleos de
azul, em situações de coloração Azul de Alcian com PAS, uma vez que o contrastante vermelho
pode confundir a interpretação dos resultados devido a coloração magenta do PAS.
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Qual a desvantagem da solução de Azul de Alcian?
Os ácidos nucleicos atraem fortemente corantes do tipo de Azul de Alcian. Para impedir o tal
acontecimento são adicionados grupos solubilizantes de grande tamanho para tornarem fracas
as ligações fosfato no núcleo e favorecerem as ligações aos grupos carboxilo ou sulfato dos
hidratos de carbono.
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Para realizar a distinção de mucinas ácidas de neutras qual ou quais as colorações de
deve utilizar?
Para distinguir mucinas ácidas de neutras pode-se utilizar Azul de Alcian conjugado com PAS.
Consiste numa coloração sequencial, onde o primeiro corante a ser utilizado é o Azul de Alcian
de pH 2.5, uma vez que reage com mucinas forte e fracamente acidas, bloqueando-as
quimicamente para que num segundo passo o PAS possa reagir apenas com as mucinas neutras.
Assim observam-se mucinas acidas de azul vivo e neutras de magenta.
Quando o Azul de Alcian de pH 1 é utilizado, a coloração sequencial não tem ordem de
seguimento, uma vez que o Azul de Alcian pH 1 marca apenas as mucinas fortemente acidas,
permitindo a observação e distinção de apenas mucinas fortemente ácidas.
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Porque é que é necessária a utilização de caixa de incubação na coloração de Orceína?
É necessária a utilização de caixa e coloração na coloração de Orceína para evitar a evaporização
do corante, uma vez que esse é alcoólico, e ainda, ajudar a impregnar melhor no tecido.
Conseguem se obter melhores resultados quando utilizada a caixa de incubação,
nomeadamente, fibras elásticas coradas de castanho-purpura fortemente marcadas.
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Porque é que o fundo na coloração Orceína é muito claro?
Porque não é utilizado um contra-corante após a diferenciação alcoólica.
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Qual o mecanismo de ação da Orceína?
A Orceína é uma coloração aplicada ao tecido conjuntivo, nomeadamente, à pesquisa de fibras
elásticas. Em primeiro lugar, o permanganato de potássio oxida as fibras, quebrando as pontes
dissulfeto, para que o ácido oxálico possa reagir e retirar o excesso do oxidante, nomeadamente,
retirar a pigmentação amarela formada. Posteriormente, aplica-se o corante Orceína e uma
diferenciação de solução alcoólica, podendo obter como resultado final as fibras elásticas
marcadas de castanho-purpura em fundo quase sem marcação.
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Gordon&Sweet como ocorre a afinidade da solução de prata com as fibras reticulares,
sendo que estas não coram por H&E?
As fibras reticulares são oxidadas com permanganato de potássio, posteriormente o ácido
oxálico retira o excesso do oxidante e aplica-se alúmen de ferro, sendo o mordente que irá
preparar as fibras reticulares para a reção com os sais de prata. Adiciona-se uma solução
amoniacal de prata que vai substituir o ferro ligado, reduzindo a formalina em prata metálica.
Adiciona-se uma solução de cloreto de outro para converter a prata metálica em ouro metálico
e aplica-se o tiossulfato de sódio que vai remover a prata não reduzida e o excesso de ouro.
Adiciona-se um contra-corante vermelho neutro (passo opcional).
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Enumere 3 colorações que coram a membrana basal?
H&E, PAS e Metenanina de prata.
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Qual a diferença entre a coloração de Tricrómio de Masson e Van Gieson?
A coloração de Tricrómio de Masson utiliza três ácidos, tais como ácido pícrico, fucsina ácida e
PMA. O ácido pícrico marca os eritrócitos de amarelo, a fucsina ácida marca tecido conjuntivo
(musculo, fibras de colagénio, citoplasma) de vermelho e o PMA vai competir com a fucsina
ácida pelas fibras de colagénio, nomeadamente, retirando a fucsina, permitindo aos corantes
verde luz ou azul de anilina ou de metileno corarem o colagénio de verde ou azul. Os núcleos
serão corados pela hematoxilina férrica de Weigert de negro/roxo, quando realizada uma prépreparação no tecido para evidenciar as fibras elásticas.
A coloração de Van Gieson apenas utiliza dois ácidos: ácido pícrico e fucsina ácida. O ácido
pícrico vai proporcionar um pH ácido necessário para a coloração e corar o músculo, eritrócitos
e citoplasma de amarelo, posteriormente a fucsina ácida cora seletivamente as fibras de
colagénio de vermelho. É utilizada a hematoxilina férrica de Weigert para corar os núcleos de
negro/roxo/azul. Ainda podem ser observadas as fibras elásticas de azul-escuro.
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Porque é que na V.G. não é necessário utilizar um diferenciador para a Hematoxilina?
A nível desta coloração é utilizado o ácido pícrico que realiza a diferenciação da hematoxilina.
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Quais as limitações de V.G?
Lavagens mal efetuadas, uma vez que se verifica formação de artefactos;
Não impregnação dos corantes nos tecidos por má realização da técnica ou as propriedades
químicas dos reagentes perderam a qualidade;
Fraca marcação ou excessiva, devido incumprimento dos tempos do protocolo.
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Em que situações a técnica de T.M. não esta bem realizada?
Quando o tempo do diferenciador não for cumprido, ou seja, é possível visualizar fibras de
colagénio azuis e roxas; quando o PMA não atuou tempo suficiente para retirar a fucsina das
fibras; Quando se visualizam as fibras de colagénio em tonalidades muito claras de azul ou verde
é porque o azul de anilina ou verde luz não estiveram tempo suficiente para impregnar o tecido;
Quando os núcleos estão muito próximos do rosa/roxo claro significa que a hematoxilina pode
estar em más condições devido a suscetibilidade à oxidação ou porque houve perda de
hematoxilina nas lavagens.
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Na coloração Van Gieson porque se usa a hematoxilina férrica?
É utilizada a hematoxilina férrica porque pretende-se distinguir ou identificar fibras elásticas de
fibras de colagénio.
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Porque é necessária uma lavagem rápida (2/3 seg.) antes da aplicação do álcool a 70%
após a coloração de V.G.?
As lavagens pela água destilada têm que ser muito rápidas ou evita-las para que não haja
distúrbios entre os equilíbrios das reações ocorridas entre os corantes, com o objetivo de não
afetar as tonalidades das cores pretendidas.
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Qual a coloração considerada a combinação perfeita, que estruturas são coradas e
quais as cores?
H(alumínica)&E. Cora em diferentes tonalidades, desde o azul ao roxo e do vermelho ao rosa.
Os núcleos são corados pela hematoxilina alumínica de azul e a Eosina cora o citoplasma de uma
grande quantidade de células (perante adequada diferenciação). Eosina Y é a mais utilizada,
sendo solúvel em álcool (satisfatoriamente) e solúvel em água (maior solubilidade).
Diferenciação ocorre após lavagem com água corrente e mais tarde na desidratação nos álcoois.
Qualidade da coloração é tanto maior quanto a intensidade de coloração é elevada e a
diferenciação reduzida. Adição de floxina e de ácido acético glacial melhora a seletividade e
aumenta a intensidade.
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