Estudio de la reacción de Hill sobre cloroplastos de rúgula (Eruca
vesicaria ssp. Sativa)
Derly Johana Diaz Ruiz & César Rodríguez Rodríguez
Laboratorio de Bioquímica
Departamento de Química, Facultad de Ciencias, Universidad Nacional de Colombia, Bogotá, Colombia.
Profesores:
Nohora Angélica Vega Castro & Edgar Antonio Reyes Montaño
Introducción
Los cloroplastos (más específicamente los tilacoides)
son los organelos en donde se lleva a cabo la
fotosíntesis en la fase lumínica, lugar donde suceden
las reacciones de transferencia de electrones donde la
luz solar que es absorbida transfiere su energía a un
electrón presente en la clorofila, la cual obtiene sus
electrones del agua generando oxígeno como
subproducto; en la cadena de transporte de electrones
también se produce la síntesis de NADPH+H+ (poder
reductor) y ATP, estos últimos serán utilizados
posteriormente por el estroma en la fase oscura para la
síntesis de carbohidratos. (1)
Teniendo presente la importancia de los cloroplastos
en el proceso fotosintético estos han sido bastante
estudiados, en 1937 Hill comprobó experimentalmente
la capacidad reductora de los cloroplastos en presencia
de luz, pues se demostró que iluminando cloroplastos
aislados se catalizaba la reducción de un oxidante con
desprendimiento de oxígeno. Esta reacción se conoce
como la reacción de Hill:
𝐻2 𝑂 + 𝑂𝑥. + 𝑐𝑙𝑜𝑟𝑜𝑝𝑙𝑎𝑠𝑡𝑜𝑠 + 𝑙𝑢𝑧 → 𝑂𝑥 ∙ 𝐻2 +
1
𝑂
2 2
Los oxidantes pueden variar según las condiciones en
las que se trabaje, por ejemplo, la reacción en los
organismos capaces de realizar fotosíntesis
específicamente en los cloroplastos se utiliza NADP:
1
𝐻2 𝑂 + 𝑁𝐴𝐷𝑃 + 𝑐𝑙𝑜𝑟𝑜𝑝𝑙𝑎𝑠𝑡𝑜𝑠 + 𝑙𝑢𝑧 → 𝑁𝐴𝐷𝑃𝐻 + 𝐻 + + 𝑂2
2
En la parte experimental se pueden usar compuestos
coloreados como benzoquinona o el 2,6-diclorofenol
indofenol (DCPIP) que es azul en estado oxidado y se
decolora al reducirse. (2)
La reacción de Hill puede ser inhibida/afectada por el
tratamiento con calor y/o lavado de los cloroplastos
con Tris (trisaminometano), la ausencia o disminución
en la intensidad lumínica (3), presencia de herbicidas
que afectan el transporte de electrones en el
fotosistema II como la atrazina (2-cloro-4-etilamino-6isopropilamino-s-triazina) y el diuron (3-(3,4diclorofenil)-1,1-dimetilurea) (4).
Metodología (5)
Preparación de soluciones (realizada por los
profesores):
→ La solución 1 corresponde a un buffer fosfatos 100
mM (pH 7,3), sorbitol o sacarosa 400 mM y MgCl
o KCl 5 mM
→ La solución 2 corresponde a un buffer fosfatos 20
mM (pH 7,3) y MgCl o KCl 5 mM
→ La solución 3 corresponde a un buffer fosfatos 50
mM (pH 7,3), sorbitol o sacarosa 100 mM y MgCl
o KCl 5 mM
→ Solución de DCPIP (2,6-diclorofenolindofenol)
3mM, tomada de frasco oscuro.
→ Solución de herbicida Atrazina 0,6 mM.
*Todas las soluciones fueron preparadas de la manera
descrita en la guía de trabajo.
Extracción de cloroplastos (Durante todo el proceso
se trabajó a bajas temperaturas):
→ Se retiraron los tallos, venas grandes y las partes
no saludables de las hojas.
→ Lavado del material vegetal con agua destilada y
dejar escurrir en papel secante.
→ Se pesaron 21,632 g de la muestra.
→ El material vegetal fue licuado por 30-60 segundos
con 80 mL de solución 1 previamente enfriada.
Evitar la ruptura total del material vegetal
→ Se filtró la suspensión a través de dos capas de
gasa, este se recolectó en un vaso de precipitado
dispuesto en un baño de hielo. En la parte final de
la filtración se exprimió la gasa ligeramente para
recoger la mayor cantidad de filtrado posible.
→ El extracto se centrifugó a 3000 rpm por 5 minutos
a 4°C.
→ Se retiró el sobrenadante y se dejó decantar
→ Se conservó el pellet, pues es la fracción rica en
cloroplastos.
→ El pellet fue resuspendido en 1-2 mL de la solución
2 previamente enfriada. Evitar la formación de
burbujas.
→ Se llevó la suspensión a 25 mL en un balón aforado
con la solución 2 fría.
→ Se centrifugó a 8000 rpm por 5 minutos, a 4°C en
tubos de plástico debidamente equilibrados.
→ Se resuspendió el pellet en 1-2 mL de la solución
3 previamente enfriada y llevar a 10 mL en un
balón aforado con la misma solución.
→ Por último, se etiquetó la suspensión de
cloroplastos y se mantuvo en un baño de hielo,
para su posterior observación en el microscopio a
10X y 40X.
Reacción de Hill (se trabajó a temperatura ambiente):
→ En un tubo de ensayo se adicionaron 4,9 mL de la
solución 3 y 100 µL de la solución DCPIP, se
mezcló, se rotuló como tubo de reacción.
→ En un tubo de ensayo diferente, limpio y seco,
seadicionaron 5 mL de la solución 3, este se rotuló
como blanco.
→ Se cubrió cada tubo con papel aluminio para
proteger de la luz.
→ Se adicionaron 100 µL de la suspensión de
cloroplastos al tubo rotulado como blanco y se le
midió la absorbancia a 600 nm
→ Al tubo rotulado como tubo de reacción se le
adicionaron 100 µL de la suspensión de
cloroplastos y se le midió la absorbancia a 600 nm.
A partir de este momento el experimento se llevó
a cabo en la celda del espectrofotómetro.
→ La celda se expuso a la luz de una lampara de luz
blanca a una distancia constante de 25 cm
→ Se determinó la absorbancia a 600 nm en
intervalos de 2 minutos hasta observar la
desaparición del color azul característico.
Reacción de Hill evaluando efecto del color (se trabajó
a temperatura ambiente)
**Solución de cloroplastos se mantuvo en baño de
hielo durante todo el experimento
→ Se cubrió la entrada de luz de una caja con papel
celofán azul.
→ En un tubo de ensayo se adicionaron 4,9 mL de
solución 3 junto con 100 µL de la solución DCPIP,
los cuales fueron homogeneizados y alejados de la
luz con un papel aluminio.
→ Se adicionaron 100 µL de la suspensión de
cloroplastos (procurando homogeneizar la
solución) y se midió la Absorbancia a 600 nm. A
partir de este momento el experimento se llevó a
cabo en la celda del espectrofotómetro.
→ La celda se expuso a la luz con el filtro azul a una
distancia de 25 cm en intervalos de 2 minutos hasta
observar la desaparición del color azul
característico.
→ Se repitió este proceso con papeles celofán de
color rojo y verde. Tomando datos de absorbancia
en función del tiempo.
Tabla 1. Proporciones de reactivos para cada ensayo de
reacción de Hill evaluando filtro de luz
Tubo
Blanco
Hill
Rojo
Azul
Solución 3 (mL)
5,0
4,9
4,9
4,9
Solución DCPIP (µL)
---100
100
100
Suspensión cloroplastos
100
100
100
100
(µL)
Verde
4,9
100
100
Inhibición de la reacción de Hill por el herbicida
Atrazina y oscuridad (se trabajó a temperatura
ambiente):
→ Se adicionaron 100 µL de la solución de
cloroplastos al tubo rotulado como blanco y
homogeneizar y medir la absorbancia a 600 nm.
→ Al tubo 1 se le adicionó la suspensión de
cloroplastos como indica la tabla 2.
→ Se midió absorbancia a 600 nm evitando el
contacto con la luz
→ Se conservó la solución en la celda y se expuso a
la luz blanca a una distancia de 25 cm. Además, se
determinó la absorbancia cada 2 minutos hasta
completar el tiempo de la reacción de Hill
→ Al tubo 2 se le efectuaron las mismas mediciones
→ El tubo 3 no va a ser iluminado, por lo que se dejó
la celda dentro del espectrofotómetro, leyendo su
absorbancia cada 2 minutos.
Por otro lado, al utilizar una longitud de onda de
emisión específica, como en el caso del filtro de luz
roja se observa que la velocidad de reacción es menor
y disminuye antes de los 360 segundos donde la
absorbancia permanece aproximadamente constante,
al disminuir la longitud de onda de la luz emitida a la
que está expuesta la reacción (del rojo a verde a azul)
la energía aumenta, sin embargo, la velocidad de
reacción disminuye manteniéndose constante en 600 s
(verde) y 720 s (azul). Lo que puede interpretarse como
que longitudes de onda bajas disminuyen la velocidad
de reacción, pero aumentan la eficiencia del proceso al
producir más DCPIP reducido.
Las longitudes de onda usadas en el experimento
concuerdan con las longitudes de onda a las cuales la
fotosíntesis presenta mayor eficiencia (rojo y azul),
pues la longitud de onda del verde es absorbida en su
mayoría por los carotenoides (encargados de disipar el
exceso de energía adquirido en forma de calor) (6).
Tabla 2. Proporciones de reactivos para cada ensayo de
reacción de Hill evaluando inhibidores
Tubo
Solución 3 (mL)
Solución DCPIP (µL)
Solución herbicida (µL)
Etanol 96% (µL)
Suspensión cloroplastos
(µL)
Blanco
5,0
---200
----
1
4,9
100
200
----
2
4,9
100
---200
3
4,9
100
--------
100
100
100
100
Resultados y discusión
Gráfica 1. Seguimiento de la reacción de Hill realizada con
diferentes filtros de luz. Absorbancia a 600 nm vs tiempo (s)
Reacción de Hill evaluando efecto del color
La velocidad de reacción de Hill se ve favorecida
cuando se emplea luz blanca (suma de todas las
longitudes de onda presentes en el espectro visible),
esto se debe a la presencia de pigmentos fotosintéticos
en las plantas como la clorofila a y b, las cuales
absorben energía en forma de luz entre 400-480 nm
(azul) y 630-700 nm (rojo) que es transformada en
energía química aprovechada por los cloroplastos en el
proceso de fotosíntesis o en este caso por la solución
de DCPIP la cual se reduce y pierde su coloración azul
inicial.(6)
La diferencia de absorbancias denota los cambios en el
avance de la reacción, pero cuando se veía a simple
vista todos tenían el aspecto observado en la imagen 1,
donde se pasaba de un color azulado a un verde claro
con el DCPIP reducido por la presencia de cloroplastos
y tilacoides en el medio.
Inhibición de la reacción de Hill por el herbicida
Atrazina, etanol y oscuridad
Imagen 1. Comparación del sistema de reacción antes (izquierda)
y después (derecha) de la exposición a los diferentes filtros de luz.
Lo anterior denota que los cloroplastos extraídos se
encontraban íntegros pues llevaron a cabo la reacción
de reducción del DCPIP exitosamente, (demostrando
su capacidad reductora) además en las imágenes 2 y 3
se encuentran los cloroplastos aislados, observados
mediante el microscopio con un objetivo de 10X y 40X
respectivamente.
La segunda serie de experimentos (gráfica 2) evaluó la
susceptibilidad de los cloroplastos y tilacoides en
solución a distintos inhibidores químicos y
ambientales. En el primer caso se evidencia que el
efecto de la ausencia de luz genera una inhibición total
de la fotosíntesis en su fase lumínica (3), y en este caso
específico no permite la formación de un DCPIP
reducido, al no tener la energía necesaria para generar
la transferencia de electrones.
Gráfica 2. Seguimiento de la reacción de Hill. Absorbancia a 600
nm vs tiempo (s)
Imagen 2. Cloroplastos extraídos de rúcula observados en el
microscopio con objetivo de 10X.
El efecto de inhibidores químicos como la atrazina
genera un efecto similar al observado por la ausencia
de luz con la diferencia que en este caso la atrazina
forma una unión con la membrana de los tilacoides en
el fotosistema II interrumpiendo el transporte de
electrones y con ello el proceso redox (4). En el caso
del etanol es posible que al ser una sustancia
susceptible a reducirse genere una competencia con el
DCPIP, lo que disminuye la velocidad de la reacción,
sin embargo, con la variación total de absorbancia
medida experimentalmente, la afinidad del DCPIP por
el fotosistema II es mayor respecto al etanol.
En la imagen 4 se puede observar el efecto de la
atrazina en la reacción donde no ocurre cambio de
color (reducción del DCPIP) luego de 10 minutos,
mientras que en condiciones normales antes de 5
minutos ya había ocurrido la reacción deseada.
Imagen 3. Cloroplastos extraídos de rúcula observados en el
microscopio con objetivo de 40X.
Referencias
[1] Alberts B, Johnson A, Lewis J, et al. Molecular
Biology of the Cell. 4th edition. New York: Garland
Science;
2002.
Chloroplasts
and
Photosynthesis. Available
from:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK26819/
Imagen 4. Comparación del resultado de la reacción después
(izquierda) de la exposición a los diferentes filtros de luz con el
resultado de la reacción inhibida con Atrazina (derecha).
Conclusiones
Al exponer los cloroplastos junto con un sustrato en el
que se permita la reacción de Hill a longitudes de onda
específicas (rojo, verde, azul), se obtienen distintas
eficiencias y velocidades de reacción respecto a la luz
blanca, siendo las longitudes de onda de absorción más
importantes las correspondientes al azul (400-480 nm),
donde la clorofila a tiene mayor eficiencia en el
proceso de excitación electrónica, el rojo aumenta la
velocidad de reacción disminuyendo la eficiencia y el
verde aumenta la eficiencia pero no toda la energía
captada es aprovechada en el proceso de reducción, ya
que en las diferentes longitudes de onda se estimulan
distintos pigmentos (clorofila a, clorofila b,
carotenoides) con funciones diferentes.
La reacción de Hill ocurre en el fotosistema II de la
fase lumínica lo que conlleva que al aislarse de la luz
la reacción no proceda pues no ocurre un transporte de
electrones por lo cual se dificulta la reducción del
DCPIP, adicionalmente la inhibición con Atrazina se
lleva a cabo por unión del herbicida con los tilacoides
en el fotosistema II, por lo que sin importar si la
reacción estaba en ausencia o presencia de luz la
reducción no ocurriría, pues la Atrazina captaría los
electrones interrumpiendo el transporte.
Con la reacción de Hill (in vitro) es posible estudiar y
hacer una comparación con los procesos que ocurren
en organismos vivos (in vivo), estudiando las
condiciones óptimas que se deben tener en cuenta para
favorecer o impedir el transporte de electrones en la
fotosíntesis en las plantas
[2] J. Fernandez and C. Sancho, Estudio comparativo
de la inhibición que produce el CMU sobre la
fotofosforilación, fotocarboxiiación y reacción de Hill
en cebada (Hordeum vulgare L.), 1ra ed. Madrid: Junta
de Energía Nuclear, 1977.
[3]Satoh, Kazuhiko, Sakae Katoh, y Atusi Takamiya.
«Light and Dark Rate-Determining Steps in Electron
Transport Reactions in Spinach Chloroplasts». Plant
and Cell Physiology 13, n.o 5 (octubre de 1972): 88597.
https://doi.org/10.1093/oxfordjournals.pcp.a074800.
[4] Allen, Mary Mennes, Anne C. Turnburke, Emily A.
Lagace, y Katherine E. Steinback. «Effects of
Photosystem II Herbicides on the Photosynthetic
Membranes of the Cyanobacterium Aphanocapsa
6308». Plant Physiology 71, n.o 2 (1 de febrero de
1983): 388-92. https://doi.org/10.1104/pp.71.2.388.
[5] Vega N.A. & Reyes E.A. (2021). Laboratorio de
Bioquímica. Universidad Nacional de Colombia.
Facultad de Ciencias. Departamento Química. 21-27.
[6] Khan Academy. (18 de 05 de 2021). Obtenido de
https://www.khanacademy.org/science/biology/photo
synthesis-in-plants/the-light-dependent-reactions-ofphotosynthesis/a/light-and-photosynthetic-pigments