UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA
SUB-ÁREA DE QUÍMICA ORGÂNICA
SEPARAÇÃO DOS PIGMENTOS EXTRAÍDOS DA FOLHA DE
BETERRABA POR CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA
PREPARATIVA
Material de apoio às aulas práticas das disciplinas
de Cromatografia (CQ019)
Responsável: Prof. Luiz Pereira Ramos
Apoio: Angelita Nepel e Kahlil Salomé
Curitiba, Paraná
2014
Procedimento experimental para a prática de CCDP
Prof. Luiz Ramos, DQUI/UFPR
0
1. OBJETIVO

Separar pigmentos vegetais usando a técnica de cromatografia em camada delgada
preparativa (CCDP).
2. EXPERIMENTAL
2.1. Material
2.1.1. Amostra: folhas de beterraba.
2.1.2. Vidraria: almofariz, pipeta de Pasteur, béqueres de 25 ou 50 mL (4), bastão de
vidro, proveta de 25 mL, funil simples, papel de filtro, banho-maria, capilares, espátula, cubas
cromatográficas de diferentes tamanhos e cromatoplacas de 20 x 5 cm e de 5 x 5 cm.
2.1.3. Solvente para extração das folhas: diclorometano.
2.1.4. Fase móvel para CCD e CCDP: mistura de hexano e acetato de etila (2:1, v/v).
2.1.5. Fase estacionária para CCD e CCDP: sílica-gel G 60.
2.2. Procedimento para extração dos pigmentos
Triture em um almofariz cerca de 3,0 g de folhas de beterraba. Transfira para um béquer
de 50 mL e adicione 10 mL de diclorometano. Agite bem com o bastão de vidro e deixe em
maceração por 5 minutos. Dê preferência à recuperação de um extrato orgânico verde, em
detrimento a um extrato violáceo que pode se formar em função da presença de água e de
pigmentos hidrossolúveis oriundos das nervuras das folhas. Filtre o extrato com auxílio de um
chumaço de algodão ou uma folha de papel de filtro. Colete o filtrado e concentre o mesmo em
banho-maria localizado na capela até mais ou menos 2 mL, condição em que o mesmo assume
uma coloração verde escura. Então, divida o volume obtido em dois frascos. Use um para a
cromatografia preparativa em camada delgada (CCDP) e reserve o outro para a prática de
cromatografia em coluna, que será realizada noutra data.
2.3. Separação dos pigmentos por CCD
Selecione uma cromatoplaca de 5 x 5 cm e marque com cuidado a frente de progressão
do solvente e a linha de aplicação da amostra. Ao fazê-lo, assegure-se que a linha de aplicação
da amostra não está muito baixa e que o traçado da frente de progressão da fase móvel
aproveite ao máximo a área disponível para a separação cromatográfica. Geralmente, uma área
útil de 5,0 a 5,5 cm atende aos objetivos da separação.
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Com o auxílio de um capilar, aplique a amostra concentrada sobre a linha de aplicação
da cromatoplaca (linha imaginária). Use dois pontos de aplicação que deverão estar
equidistantes entre si e das paredes da cromatoplaca. Aplique, com o auxílio de um capilar
previamente selecionado, concentrações distintas do extrato em cada ponto (sugere-se uma
aplicação no da esquerda e três aplicações no da direita, embora isto dependa da concentração
em que a sua amostra se encontre). Depois disto, transfira a cromatoplaca já preparada para a
cuba cromatográfica, tomando cuidado ao inserir a mesma no seu interior. Lembre-se que a
cuba deverá estar fechada durante todo o processo de evolução cromatográfica. Sem tocar a
cuba em nenhum momento, observe como as bandas progridem na superfície da sílica e fique
atento à evolução da frente de progressão da fase móvel.
Quando a fase móvel atingir a demarcação superior (ou sua frente de progressão),
destampe cuidadosamente a cuba cromatográfica e retire a cromatoplaca, deixando a mesma
secar em ambiente arejado, preferencialmente dentro da capela. Feito isto, determine
criteriosamente a migração relativa (Rf) de cada banda de eluição, procurando observar quantos
componentes foram separados e se a migração foi homogênea ao longo de toda a banda.
Variações neste sentido deverão ser explicadas e/ou discutidas no relatório. O resultado final
deverá ser semelhante ao apresentado na Figura 1, onde se vê a cromatoplaca do extrato da
beterraba analisado em concentrações distintas, revelando assim a presença de componentes
como o -caroteno, a xantofila e as clorofilas A e B cujas estruturas estão apresentadas na
Figura 2.
Figura 1. CCD em cromatoplacas de 5 x 5 cm do extrato em DCM das folhas de beterraba.
2.4. Separação dos pigmentos por CCDP
Selecione uma cromatoplaca de 20 x 5 cm e marque com cuidado a frente de progressão
do solvente e a linha de aplicação da amostra. Ao fazê-lo, assegure-se que a linha de aplicação
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da amostra não esteja muito baixa e que a posição do traçado da frente de progressão da fase
móvel aproveite ao máximo a área disponível para a separação cromatográfica.
R = H, β-caroteno
R = OH, xantofila
R = CH3, Clorofila A
R = CHO, Clorofila B
Figura 2. Estrutura dos principais pigmentos das folhas de beterraba.
Com o auxílio de um capilar, aplique a amostra concentrada sobre a linha de aplicação
da cromatoplaca, formando uma faixa contínua conforme demonstrado na Figura 3. Faça o
possível para que a linha de aplicação seja a mais homogênea possível. Depois disto, transfira a
cromatoplaca já preparada para a cuba cromatográfica, tomando cuidado ao inserir a mesma no
seu interior. Lembre-se que a cuba deverá estar fechada durante todo o processo de evolução
(ou corrida) cromatográfica. Sem tocar na cuba em nenhum momento, observe como as bandas
progridem na superfície da sílica e fique atento à evolução da frente de progressão da fase
móvel. Lembre-se também de registrar o tempo total de análise, desde a transferência da
cromatoplaca para o interior da cuba cromatográfica até o momento de sua retirada (vide
abaixo).
Quando a fase móvel atingir a demarcação superior (ou a linha demarcada para a sua
progressão), destampe cuidadosamente a cuba cromatográfica e retire a cromatoplaca do seu
interior, deixando a mesma secar em ambiente arejado, preferencialmente dentro da capela de
exaustão. Feito isto, determine criteriosamente a migração relativa (Rf) de cada banda de
eluição, procurando observar quantos componentes foram separados e se a migração foi
homogênea ao longo de toda a banda. Variações neste sentido deverão ser explicadas e/ou
discutidas em seu relatório.
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Figura 3. Cromatoplacas de CCD preparativa com a linha de aplicação da amostra antes da corrida
cromatográfica (à esquerda) e depois de concluído o processo de eluição (à direita).
A próxima etapa refere-se à remoção de um componente da superfície da cromatoplaca.
Selecione uma das bandas de acordo com as orientações do professor responsável e remova-a
cuidadosamente com auxílio de uma espátula. Esta remoção deverá ser feita por raspagem e a
sílica contendo o pigmento deverá ser recebida em um béquer de 50 mL. Feita a remoção,
adicione uma mistura de hexano e acetato de etila (1:1, v/v) e deixe em contato por alguns
minutos sob agitação. Transcorrido esse tempo, filtre a suspensão através de algodão ou papel
de filtro acomodado em um funil de vidro. Lave o resíduo com o mesmo solvente, se
necessário, e concentre o filtrado límpido em banho-maria até um volume mínimo,
preferencialmente sem deixar secar.
Finalmente, com o componente extraído já concentrado, analise o produto isolado em
uma cromatoplaca de 5 x 5 cm, utilizando cuba de vidro apropriada. Neste sentido, siga todas
as orientações que já recebeu em aulas anteriores para fazer a corrida cromatográfica contra a
mesma fase móvel utilizada na cromatografia preparativa. O resultado final deverá ser
semelhante ao apresentado na Figura 3, onde se vê a cromatoplaca do extrato da beterraba à
esquerda e a cromatoplaca do componente isolado por cromatografia preparativa à direita, com
a amostra isolada em evidência. Faça todas as medidas necessárias nesta cromatoplaca e
registre os resultados no seu relatório, procurando discutir todas as observações práticas que
pode fazer ao longo da realização da prática.
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Figura 3. CCD em cromatoplacas de 5 x 5 cm do extrato bruto (à esquerda) e de uma fração isolada
por cromatografia preparativa (à direita).
Segundo a literatura especializada, vegetais como a beterraba e o espinafre são ricos em
pigmentos naturais e antioxidantes como o -caroteno (amarelo-alaranjado), a xantofila (várias
tonalidades de amarelo, as feofitinas A e B (pigmentos acinzentados derivados das clorofilas A
e B pela substituição do íon Mg2+ por dois átomos de hidrogênio), clorofila A (azul esverdeado
intenso), clorofila B (verde) e várias formas de xantofilas (pigmentos amarelos). Em geral,
todos estes pigmentos são bastante sensíveis à luz e ao aquecimento e por isto os seus extratos
deverão ser manuseados com cuidado.
Como sugestão, registre os resultados das cromatoplacas na forma de tabela como as
apresentadas logo a seguir, que poderá ser montada para os dois sistemas cromatográficos
(CCDP e CCD). A indexação da cor e do Rf com o seu respectivo pigmento dependerá de uma
pequena revisão bibliográfica, onde a avaliação da estrutura destes componentes poderá
auxiliar na elucidação do poder eluotrópico da fase móvel. Outra opção interessante é
fotografar as suas cromatoplacas, se possível, de modo a ilustrar o seu relatório. O relatório
relativo a esta prática deverá ser entregue ao professor responsável na próxima aula prática da
disciplina.
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
COLLINS, C. H; BRAGA, G. L; BONATO, P. S.; Fundamentos de cromatografia, Editora
Unicamp, 1ª Edição, 2006.
GRIFFIN, G.W.; QUACH, H.T.; STEEPER, R.L.; J. Chem. Ed., 81 (2004), 385-387.
FONSECA, S. F.; GONÇALVES, C. C. S.; Química Nova na Escola, 20 (2004), 55-58.
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Tabela 1. Resultados obtidos na separação cromatográfica em CCD dos pigmentos extraídos em
diclorometano da folha de beterraba.
Cor da banda
Pigmento
da (cm)
ds (cm)
Rf
Tabela 2. Resultados obtidos na separação cromatográfica por CCP preparativa dos pigmentos
extraídos em diclorometano da folha de beterraba.
Cor da banda
Pigmento
da (cm)
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ds (cm)
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Rf
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